JP2010174107A - Method for producing ternary complex and antigenic protein/cpg oligonucleotide/beta-1,3-glucan-based ternary complex - Google Patents
Method for producing ternary complex and antigenic protein/cpg oligonucleotide/beta-1,3-glucan-based ternary complex Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010174107A JP2010174107A JP2009017093A JP2009017093A JP2010174107A JP 2010174107 A JP2010174107 A JP 2010174107A JP 2009017093 A JP2009017093 A JP 2009017093A JP 2009017093 A JP2009017093 A JP 2009017093A JP 2010174107 A JP2010174107 A JP 2010174107A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucan
- ternary complex
- antigen protein
- cpg oligonucleotide
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Abstract
Description
本発明は、医薬組成物の技術分野に属し、特に、免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いられ得る三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体に関するものである。 The present invention belongs to the technical field of pharmaceutical compositions, and in particular, a method for producing a ternary complex that can be used for the prevention and treatment of Th2 cell-related diseases by regulating the balance of Th1 cells and Th2 cells in the immune system, and an antigen The present invention relates to a protein / CpG oligonucleotide / β-1,3-glucan ternary complex.
非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG DNAまたはCpG ODNと略記）は脊椎動物の免疫システムを活性化することが知られており（非特許文献１−３）、その活性化の初期段階は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、マクロファージ、及びB-細胞によるCpG DNAの細胞認識である。認識されたCpG DNAはエンドサイトーシス経路を通って輸送されるが、その間にファゴソーム様小胞体でトール様受容体9（TLR9）と呼ばれるパターン認識受容体によって認識される（非特許文献４）。このTLR9による認識は、IL-6、TNF−α、IL-12等のサイトカイン産生を誘導するための引き金となり、Th1細胞への分化を促進させる。これらのサイトカインはナチュラルキラー（NK）細胞、樹状細胞等を活性化し（非特許文献５−８）、最終的にIFN−γを産出する。したがって、事実上、CpG DNAとTLR9との相互作用は先天的及び適応型の免疫システムに橋架けしていることになる。最近、CpG DNAと抗原を直接化学結合することによって、効率的な薬理効果が発揮できることが明らかになっている。 Oligonucleotides containing unmethylated CpG sequences (abbreviated as CpG DNA or CpG ODN) are known to activate the vertebrate immune system (Non-Patent Documents 1-3), and the initial stage of activation is Cell recognition of CpG DNA by antigen presenting cells, especially dendritic cells, macrophages, and B-cells. Recognized CpG DNA is transported through the endocytic pathway, during which it is recognized by the phagosome-like endoplasmic reticulum by a pattern recognition receptor called Toll-like receptor 9 (TLR9) (Non-patent Document 4). This recognition by TLR9 triggers the production of cytokines such as IL-6, TNF-α, and IL-12, and promotes differentiation into Th1 cells. These cytokines activate natural killer (NK) cells, dendritic cells and the like (Non-patent Documents 5-8), and finally produce IFN-γ. Thus, in effect, the interaction between CpG DNA and TLR9 bridges the innate and adaptive immune system. Recently, it has become clear that efficient pharmacological effects can be exerted by directly chemically coupling CpG DNA and antigen.
例えば、TigheらはEscherichia coli beta-galactosidaseやHIV-1 envelope glycoprotein gp120にCpG ODNを化学結合させてマウスに投与したところ、強力なTh1アジュバントとして働くことを示した（非特許文献９）。また、田村らは、CpG DNAをマウスの気管支喘息モデルの気道局所に前投与することによって，好酸球性炎症とTh2反応を抑制した。この抑制にはCpG DNAと抗原の同時投与が必須であり、CpG DNAと抗原を化学的に結合させ、局所へ前投与した。その結果，本結合体は好酸球性炎症の抑制効果を約百倍増強させ、Th1細胞の誘導効率も同程度に増強させた。以上より、CpGを含むDNAと特異抗原の結合体はアレルギー疾患の新しい治療薬となる可能性が示唆された（非特許文献１０）。 For example, Tighe et al. Showed that when CpG ODN was chemically bound to Escherichia coli beta-galactosidase or HIV-1 envelope glycoprotein gp120 and administered to mice, it acts as a potent Th1 adjuvant (Non-patent Document 9). Tamura et al. Also suppressed eosinophilic inflammation and Th2 response by pre-administration of CpG DNA into the respiratory tract of a mouse bronchial asthma model. For this suppression, simultaneous administration of CpG DNA and antigen was essential, and CpG DNA and antigen were chemically bound and pre-administered locally. As a result, this conjugate enhanced the inhibitory effect of eosinophilic inflammation about 100 times, and the induction efficiency of Th1 cells was enhanced to the same extent. From the above, it was suggested that a conjugate of DNA containing CpG and a specific antigen may be a new therapeutic agent for allergic diseases (Non-patent Document 10).
しかしながら、CpG DNA療法には重大な欠点がある。一般に、核酸が単独で生体液の中に露出すると、ヌクレアーゼによる代謝及び血しょう蛋白質との非特異的結合が起こって、直ちに排除される。CpG DNAを実用的な療法に転換するためには、タンパク質とのこれらの好ましくない相互作用を避けることによってCpG DNAを標的細胞に到達させることが本質的に重要である。 However, CpG DNA therapy has significant drawbacks. In general, when a nucleic acid is exposed alone in a biological fluid, it is eliminated immediately due to metabolism by nucleases and nonspecific binding to plasma proteins. In order to convert CpG DNA into a practical therapy, it is essential that CpG DNA reach the target cell by avoiding these unfavorable interactions with the protein.
そこで、天然型のリン酸バックボーンであるホスホジエステル（phosphodiester：PO）を、S−アナログのホスホロチオエート（Phosphorothioate：PS）に変えることで比較的強いヌクレアーゼ耐性能を付与したものが臨床実験で比較的よく検討されている。しかしながら、補体系で非特異的反応を含む予期されなかった生体反応の細胞障害を引き起こすことが幾つかの最近の研究で指摘された（非特許文献１１−１２）。これらの副作用は、血清タンパク質との非特異的結合及びPSの抗原性により説明されている。そこで、そのようなアナログ型核酸を使用せずに、天然型のリン酸バックボーンを有するCpG DNAでヌクレアーゼ媒介代謝から保護することが望まれている。 Therefore, a relatively strong nuclease-resistant performance is obtained in clinical experiments by changing the phosphodiester (PO), which is a natural phosphate backbone, to the S-analog Phosphorothioate (PS). It is being considered. However, some recent studies have pointed out that it causes unexpected biological reaction cytotoxicity involving non-specific reactions in the complement system (Non-Patent Documents 11-12). These side effects are explained by nonspecific binding to serum proteins and the antigenicity of PS. Therefore, it is desired to protect against nuclease-mediated metabolism with CpG DNA having a natural phosphate backbone without using such an analog nucleic acid.
β−（1→3）−D−グルカンの主鎖と、各３個のグルコース当りに１個のβ−（1→3）−D−グルコシル側鎖から成るシゾフィラン（以下、SPGと表記する。）と呼ばれる天然多糖類がある（非特許文献１３）。SPGを含むβ−1,3−グルカンに免疫刺激活性があることは従来から知られており、アジュバントとしてワクチンまたは免疫刺激性核酸に添加される例が報告されている（特許文献１及び２）。SPGは婦人科癌に対する免疫増強法の筋肉内注射製剤臨床薬として20年以上の使用実績があり（非特許文献１４及び１５）、生体内での安全性が確認されている（非特許文献１６）。 Schizophyllan (hereinafter referred to as SPG) consisting of a main chain of β- (1 → 3) -D-glucan and one β- (1 → 3) -D-glucosyl side chain for each three glucoses. ) (Non-Patent Document 13). It has been conventionally known that β-1,3-glucan containing SPG has immunostimulatory activity, and examples of addition to vaccines or immunostimulatory nucleic acids as adjuvants have been reported (Patent Documents 1 and 2). . SPG has been used for more than 20 years as a clinical drug for intramuscular injection preparations for immunity enhancement for gynecological cancer (Non-Patent Documents 14 and 15), and safety in vivo has been confirmed (Non-Patent Document 16). ).
本発明者らは、上記SPGが１本鎖のホモポリヌクレオチドと新規な複合体を形成することを見出した。そして、この複合体の基本的性質が研究され（非特許文献１７−２０）、その複合体をDNAの輸送に適用した。この複合体がタンパク質との好ましくない相互作用に対してDNAを保護し、その結果、サイトカイン産生を増加させることができることを示し、CpG DNAのキャリヤーとしても適用できる可能性を示している（非特許文献２１−２２、特許文献３及び４）。それらの報告では、古典的なCpG配列のオリゴヌクレオチドのPSアナログの DNAを使用し、それをマクロファージ様細胞のような細胞にin vitroで輸送した。
さらに、本発明者らは、SPGに抗原タンパクを化学結合させた後に、上述した核酸と多糖の複合化能を利用してSPG/抗原タンパク/CpG DNAの3元複合体を作成し、それが、CpG DNAを保護しながら、効果的にTh1細胞の誘導効率を増強させることを示した（非特許文献２３）。
The present inventors have found that the SPG forms a novel complex with a single-stranded homopolynucleotide. The basic properties of this complex were studied (Non-patent Documents 17-20), and the complex was applied to DNA transport. This complex protects DNA against unfavorable interactions with proteins, and as a result, can increase cytokine production, indicating that it can also be applied as a carrier of CpG DNA (non-patent Literature 21-22, Patent Literature 3 and 4). In those reports, the DNA of a classic CpG sequence oligonucleotide PS analog was used and transported in vitro to cells such as macrophage-like cells.
Furthermore, after chemically binding the antigen protein to SPG, the present inventors made a ternary complex of SPG / antigen protein / CpG DNA by utilizing the above-mentioned ability of complexing nucleic acid and polysaccharide. It was shown to effectively enhance the induction efficiency of Th1 cells while protecting CpG DNA (Non-patent Document 23).
しかしながら上記従来の技術においては、以下のような課題を有していた。
（１）（非特許文献２３）に記載されているSPG/抗原タンパク/CpG DNAの3元複合体の製造方法は、初めにシゾフィラン（SPG）とオボアルブミン（抗原タンパク質。以下、OVAと表記する。）の複合体を調製し、得られた複合体にCpG DNAを結合させて三元複合体を得る方法である。SPGと抗原タンパク質の複合体の調製は、初めにSPGを水に溶解させ、この溶液に過ヨウ素酸ナトリウムを添加した後、５℃で２時間撹拌する。これにより、３重螺旋のβ−1,3−グルカンの1,6−グルコピラノシド分枝の３位と４位若しくは２位と３位の間が切断され、それらの位置にある水酸基がアルデヒドに変換され、側鎖にアルデヒド基（ホルミル基）を有するβ−1,3−グルカンが得られる。次いで、この側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと、OVAと、還元剤としてのシアノ水素化ホウ素ナトリウムとを重炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、室温で14時間撹拌することにより、β−1,3−グルカンの側鎖のホルミル基とOVAのアミノ基との間でのシッフ塩基の形成と還元的アミノ化により、β−1,3−グルカンの側鎖にOVAが共有結合してSPGと抗原タンパク質の複合体を得ることができる。しかし、この調製方法では、非特許文献２３の図２に示すように、SPGへの抗原タンパク質の反応率が極めて低く（本発明者らの実験では、後述するように１％以下）、極めて収率が低いという課題を有していた。これは、３重螺旋のβ−1,3−グルカンは棒状の高分子であり運動性が低いため、抗原タンパク質との反応が遅いことが原因ではないかと推察された。
（２）SPGと抗原タンパク質の複合体の収率が低いため、CpG DNAを結合させて三元複合体を得る際には、SPGと抗原タンパク質の反応物から、目的物をカラム分離により精製する必要があり、操作が極めて煩雑であるとともに生産性に欠けるという課題を有していた。さらに、カラムによる分離を行なう際に、疎水性の高いカラムを用いると抗原タンパク質の高次構造が変性してしまい、抗原としての機能が低下する問題があった。また、通常はカラム生成された溶液は極めて希薄であり濃縮する必要があるが、この濃縮の過程でタンパク質が凝集したり変性したりする等の問題がある。
However, the above conventional techniques have the following problems.
(1) The method for producing a ternary complex of SPG / antigen protein / CpG DNA described in (Non-patent Document 23) is as follows. First, schizophyllan (SPG) and ovalbumin (antigen protein; hereinafter referred to as OVA). )), And CpG DNA is bound to the resulting complex to obtain a ternary complex. To prepare a complex of SPG and antigen protein, first, SPG is dissolved in water, and sodium periodate is added to this solution, and then stirred at 5 ° C. for 2 hours. This cleaves the 3- and 4-positions or the 2- and 3-positions of the 1,6-glucopyranoside branch of the triple helix β-1,3-glucan and converts the hydroxyl groups at those positions into aldehydes. Thus, β-1,3-glucan having an aldehyde group (formyl group) in the side chain is obtained. Next, β-1,3-glucan having a formyl group in this side chain, OVA, and sodium cyanoborohydride as a reducing agent are dissolved in an aqueous sodium bicarbonate solution and stirred at room temperature for 14 hours. OVA is covalently bound to the side chain of β-1,3-glucan by the formation of a Schiff base between the formyl group of the side chain of β-1,3-glucan and the amino group of OVA and reductive amination. Thus, a complex of SPG and antigen protein can be obtained. However, in this preparation method, as shown in FIG. 2 of Non-Patent Document 23, the reaction rate of the antigen protein to SPG is extremely low (in the experiments of the present inventors, 1% or less as will be described later). The problem was that the rate was low. It was speculated that this is because the triple helix β-1,3-glucan is a rod-like polymer and has low motility, so that the reaction with the antigen protein is slow.
(2) Since the yield of the complex of SPG and antigen protein is low, when the ternary complex is obtained by binding CpG DNA, the target product is purified from the reaction product of SPG and antigen protein by column separation. There is a problem that it is necessary and the operation is extremely complicated and the productivity is insufficient. Furthermore, when a column with high hydrophobicity is used for separation by a column, there is a problem that the higher-order structure of the antigen protein is denatured and the function as an antigen is lowered. Further, the solution produced in the column is usually extremely dilute and needs to be concentrated, but there are problems such as protein aggregation and denaturation during the concentration process.
本発明は上記従来の課題を解決するもので、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応を容易に進行させ、反応率を従来の３０倍以上に高め、収率を飛躍的に向上させる三元複合体の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性に優れる抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を提供することを目的とする。即ち、本発明の三元複合体を用いることにより、効果的に抗原特異的に免疫反応を誘導することを目的とする。
The present invention solves the above-mentioned conventional problems, and facilitates the reaction between the β-1,3-glucan formyl group and the amino group of the antigen protein to increase the reaction rate by 30 times or more compared with the conventional one. It aims at providing the manufacturing method of the ternary composite which improves a rate drastically.
In addition, the present invention is capable of detaching CpG oligonucleotides and antigen proteins under conditions that can undergo hydrolysis and the like in vivo, and is excellent in target protein antigen protein / CpG oligonucleotide / β-1, An object is to provide a 3-glucan ternary complex. That is, it is an object to effectively induce an immune reaction in an antigen-specific manner by using the ternary complex of the present invention.
上記従来の課題を解決するために本発明の三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体は、以下の構成を有している。
本発明の請求項１に記載の抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系の三元複合体の製造方法は、側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備えている。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）アルカリ水溶液にβ−1,3−グルカンを溶解すると、β−1,3−グルカンの３重螺旋が１本鎖に解離される。また、β−1,3−グルカンが溶解されたアルカリ水溶液を中和すると、３重螺旋への復帰が生じる。β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備えており、中和に伴いβ−1,3−グルカンが１本鎖から３本螺旋へ復帰する速度が、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応速度に比べて遅く、また中和直後の３重螺旋には欠陥や復帰できない１本鎖部分が数多く残っていると考えられ、さらに抗原タンパク質がアルカリ水溶液で変性するのを中和によって防ぐことができるため、反応工程では、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応を容易に進行させ、反応率を高めることができる。また、抗原タンパク質を、有機溶媒を使わず、ｐＨが中性付近の水溶液中で扱うため、タンパク質の変性が大幅に抑えられる。
In order to solve the above conventional problems, the method for producing a ternary complex and the antigen protein / CpG oligonucleotide / β-1,3-glucan ternary complex of the present invention have the following constitutions.
The method for producing an antigen protein / CpG oligonucleotide / β-1,3-glucan ternary complex according to claim 1 of the present invention comprises a β-1,3-glucan having a formyl group in the side chain and an antigen. It comprises a reaction step in which neutralization is carried out simultaneously with (a) reacting with a protein in an aqueous alkali solution, or (b) reacting in an aqueous alkali solution.
With this configuration, the following effects can be obtained.
(1) When β-1,3-glucan is dissolved in an alkaline aqueous solution, the triple helix of β-1,3-glucan is dissociated into a single strand. Moreover, when the aqueous alkaline solution in which β-1,3-glucan is dissolved is neutralized, it returns to the triple helix. It comprises a reaction step in which β-1,3-glucan and an antigen protein are (a) reacted in an alkaline aqueous solution and neutralized at the same time, or (b) sequentially reacted in an alkaline aqueous solution for neutralization. The rate at which β-1,3-glucan returns from a single strand to a triple helix upon neutralization is higher than the reaction rate between the formyl group of β-1,3-glucan and the amino group of the antigen protein. Slowly, the triple helix immediately after neutralization is thought to have many defects and unrecoverable single-stranded portions, and further, it is possible to prevent the antigen protein from being denatured with an aqueous alkaline solution. In the process, the reaction between the formyl group of β-1,3-glucan and the amino group of the antigen protein can be easily advanced to increase the reaction rate. Further, since the antigen protein is handled in an aqueous solution having a pH near neutral without using an organic solvent, protein denaturation can be greatly suppressed.
ここで、β−1,3−グルカンとしては、グルコース環がβ結合で１位と３位の水酸基間が結合した多糖の総称であり、繰り返し単位中に少なくとも１個の１，６−グルコピラノシド分枝を有するものが用いられる。例えば、シゾフィラン、レンチナン、パーマキン、グリホラン、スクレログリカン等を挙げることができる。また、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）やカンジダ菌（Candida albicans）の細胞壁からの抽出物や、アガリクス（Agaricus blaziriensis）由来の比較的長いβ−1,6−グルコシド結合の側鎖を有するβ−1,3−グルカンも用いることができる。さらに、これらの天然由来のβ−1,3−グルカンを化学的に加工して得られる化合物も用いることができる。
なお、CpGオリゴヌクレオチドと安定な三元複合体を形成し、Th1細胞を優位にする効果を発揮させるためには、約２５０００以上の平均分子量にするのが望ましい。
但し、パン酵母やカンジダ菌の細胞壁からの抽出物や、アガリクス由来の比較的長いβ−1,6−グルシド結合の側鎖を有するβ−1,3−グルカンは、水性溶媒に対する溶解性が悪いため、シゾフィラン、レンチナン、パーマキン、グリホラン、スクレログリカン等由来のβ−1,3−グルカンが好適である。
Here, β-1,3-glucan is a generic name for polysaccharides in which the glucose ring is β-bonded and the hydroxyl groups at the 1- and 3-positions are bonded, and contains at least one 1,6-glucopyranoside component in the repeating unit. Those having branches are used. Examples thereof include schizophyllan, lentinan, permakin, glyphoran, scleroglican and the like. In addition, extracts from the cell walls of baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) and Candida albicans, and β-1,6 having a relatively long β-1,6-glucoside-linked side chain derived from Agaricus (Agaricus blaziriensis) 3-glucan can also be used. Furthermore, compounds obtained by chemically processing these naturally-derived β-1,3-glucans can also be used.
In order to form a stable ternary complex with the CpG oligonucleotide and to exert the effect of predominating Th1 cells, it is desirable to have an average molecular weight of about 25,000 or more.
However, extracts from the cell walls of baker's yeast and Candida and β-1,3-glucan having a relatively long β-1,6-glucidic side chain derived from Agaricus have poor solubility in aqueous solvents. Therefore, β-1,3-glucan derived from schizophyllan, lentinan, permakin, glyphoran, scleroglican and the like is preferable.
側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンとしては、通常の有機化学の方法を用いβ−1,3−グルカンを化学修飾して得ることができる。例えば、水酸基へのウィリアムソン反応、付加反応、水酸基を酸化して得られるアルデヒド、カルボン酸への付加、縮合反応、水酸基を活性化（ハロゲン化、トシル化、メシル化など）してのウィリアムソン反応などの水酸基を利用した一般的な有機反応等を挙げることができる。
この中で好ましい方法は、β−1,3−グルカンの1,6−グルコピラノシド分枝の過ヨウ素酸酸化である。過ヨウ素酸酸化は、1,2−ジオールを定量的にアルデヒドへと変換する反応であり、使用できる試薬としては、過ヨウ素酸のアルカリ金属塩であれば特に制限はなく、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、過ヨウ素酸ルビジウムなどの中から適当に選択することができる。その中でも、溶解性および価格的な面から過ヨウ素酸ナトリウムがもっとも好ましく用いられる。
過ヨウ素酸酸化反応における溶媒としては、β−1,3−グルカンが溶解し、かつ、反応に影響を与えない極性溶媒であれば特に制限はない。この点を考慮すると、水がもっとも好ましい。これにより、３重螺旋のβ−1,3−グルカンについて過ヨウ素酸酸化を行なうことができる。また、１本鎖のβ−1,3−グルカンについて過ヨウ素酸酸化を行なう場合には、溶媒は極性有機溶媒、特にジメチルスルホキシドが好適である。β−1,3−グルカンの３重螺旋は極性有機溶媒中で１本鎖に解離されるからである。反応温度は過ヨウ素酸の自己分解反応が進行しない条件下であれば特に制限されることはないが、一般的に、反応は０〜５０℃の温度下に行なわれる。
これにより、β−1,3−グルカンの1,6−グルコピラノシド分枝の３位と４位若しくは２位と３位の間が切断され、それらの位置にある水酸基がアルデヒドに変換される。過ヨウ素酸酸化反応の特徴は、1,2−ジオール間のＣ−Ｃ結合のみに反応することにあるが、β−1,3−グルカンの主鎖に1,2−ジオールはないため、過ヨウ素酸酸化反応によって主鎖が切断されたり変性したりすることはない。
The β-1,3-glucan having a formyl group in the side chain can be obtained by chemically modifying β-1,3-glucan using an ordinary organic chemistry method. For example, Williamson reaction to hydroxyl group, addition reaction, aldehyde obtained by oxidation of hydroxyl group, addition to carboxylic acid, condensation reaction, activated hydroxyl group (halogenation, tosylation, mesylation, etc.) A general organic reaction utilizing a hydroxyl group such as a reaction can be exemplified.
Of these, the preferred method is periodate oxidation of 1,6-glucopyranoside branches of β-1,3-glucan. Periodic acid oxidation is a reaction that quantitatively converts 1,2-diol to aldehyde, and any reagent that can be used is not particularly limited as long as it is an alkali metal salt of periodic acid. It can be appropriately selected from sodium, potassium periodate, rubidium periodate, and the like. Among these, sodium periodate is most preferably used in terms of solubility and cost.
The solvent in the periodate oxidation reaction is not particularly limited as long as it is a polar solvent that dissolves β-1,3-glucan and does not affect the reaction. Considering this point, water is most preferable. Thus, periodate oxidation can be performed on the triple helix β-1,3-glucan. When periodate oxidation is performed on single-stranded β-1,3-glucan, the solvent is preferably a polar organic solvent, particularly dimethyl sulfoxide. This is because the triple helix of β-1,3-glucan is dissociated into a single strand in a polar organic solvent. The reaction temperature is not particularly limited as long as the self-decomposition reaction of periodic acid does not proceed, but in general, the reaction is carried out at a temperature of 0 to 50 ° C.
Thereby, the 3-position and 4-position or the 2-position and 3-position of the 1,6-glucopyranoside branch of β-1,3-glucan are cleaved, and the hydroxyl groups at those positions are converted into aldehydes. The characteristic of periodate oxidation reaction is that it reacts only with the C—C bond between 1,2-diol, but there is no 1,2-diol in the main chain of β-1,3-glucan. The main chain is not cleaved or modified by the iodate oxidation reaction.
抗原タンパク質としては、生体に投与することによって免疫力が増強されワクチン的な効果が期待できるものであれば、特に制限なく用いることができ、例えば、グリアジン，オボムコイド，カゼイン，βラクトグロブリン，オボアルブミン等の抗食物アレルゲン、抗ミトコンドリア抗体に対応した抗原タンパク質群（M1：梅毒、M2：PBC、M7：心筋症）、甲状腺ミクロソームタンパク質、チログリブリン、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）等を用いることができる。 Any antigenic protein can be used without particular limitation as long as it can enhance immunity by administration to a living body and a vaccine-like effect can be expected. For example, gliadin, ovomucoid, casein, β-lactoglobulin, ovalbumin Anti-food allergens such as, antigen protein groups corresponding to anti-mitochondrial antibodies (M1: syphilis, M2: PBC, M7: cardiomyopathy), thyroid microsomal protein, thyroglibulin, myelin basic protein (MBP) and the like can be used.
アルカリ水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水酸化カルシウム等の水溶液を用いることができる。
アルカリ水溶液の濃度としては、０．１〜１Ｍ／Ｌ好ましくは０．２５〜０．５Ｍ／Ｌが好適である。濃度が０．２５Ｍ／Ｌより低くなるにつれβ−1,3−グルカンの３本螺旋から１本鎖への解離が生じ難く、０．５Ｍ／Ｌより高くなるにつれ、多糖自体の加水分解が起こり、分子量が低下し、この結果Th1細胞を優位にする効果が低下する傾向がみられる。特に、０．１Ｍ／Ｌより低くなるか１Ｍ／Ｌより高くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
反応工程における反応温度としては、抗原タンパク質の変性が生じ難い温度であれば特に制限がなく、例えば、１０〜４０℃が好適である。
As the alkaline aqueous solution, an aqueous solution of sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, calcium hydroxide or the like can be used.
The concentration of the aqueous alkaline solution is 0.1 to 1 M / L, preferably 0.25 to 0.5 M / L. As the concentration becomes lower than 0.25 M / L, dissociation of β-1,3-glucan from the triple helix to the single strand hardly occurs, and as it becomes higher than 0.5 M / L, hydrolysis of the polysaccharide itself occurs. The molecular weight decreases, and as a result, the effect of predominating Th1 cells tends to decrease. In particular, when the value is lower than 0.1 M / L or higher than 1 M / L, these tendencies become remarkable, so that neither is preferable.
The reaction temperature in the reaction step is not particularly limited as long as it is a temperature at which denaturation of the antigen protein is difficult to occur.
反応工程においては、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは、（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なうことができる。
β−1,3−グルカンを溶解させたアルカリ水溶液と、抗原タンパク質を溶解させた酸水溶液とを混合することにより、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なうことができる。
酸水溶液としては、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸等の水溶液を用いることができる。
酸水溶液の濃度としては、０．１〜１Ｍ／Ｌ好ましくは０．２５〜０．５Ｍ／Ｌが好適である。濃度が０．２５Ｍ／Ｌより低くなるにつれ中和力が低下する傾向がみられ、０．５Ｍ／Ｌより高くなるにつれ、抗原タンパク質が変性し易くなり反応性が低下する傾向がみられる。特に、０．１Ｍ／Ｌより低くなるか１Ｍ／Ｌより高くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
In the reaction step, β-1,3-glucan and antigen protein are neutralized simultaneously with (a) reacting in an alkaline aqueous solution, or (b) sequentially neutralizing by reacting in an alkaline aqueous solution. Can be done.
When an alkaline aqueous solution in which β-1,3-glucan is dissolved and an acid aqueous solution in which an antigen protein is dissolved are mixed, β-1,3-glucan and the antigen protein are reacted in an alkaline aqueous solution. Neutralization can be performed simultaneously.
As the acid aqueous solution, aqueous solutions of hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid and the like can be used.
The concentration of the acid aqueous solution is 0.1 to 1 M / L, preferably 0.25 to 0.5 M / L. As the concentration becomes lower than 0.25 M / L, the neutralizing power tends to decrease, and as the concentration becomes higher than 0.5 M / L, the antigen protein tends to denature and the reactivity tends to decrease. In particular, when the value is lower than 0.1 M / L or higher than 1 M / L, these tendencies become remarkable, so that neither is preferable.
また、反応工程においては、β−1,3−グルカンを溶解させたアルカリ水溶液と、抗原タンパク質を緩衝水溶液等に溶解させた溶液とを混合するとともに、酸水溶液を同時に若しくは逐次混合することで、中和を行なうことができる。
また、反応工程において、反応と同時に中和を行なう操作には、β−1,3−グルカンを溶解させたアルカリ水溶液に酸水溶液を混合するとともに、抗原タンパク質を緩衝水溶液等に溶解させた溶液を、酸水溶液と同時に若しくは所定時間内に混合することも含まれる。中和に伴いβ−1,3−グルカンが１本鎖から３本螺旋へ復帰する速度は、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応速度に比べて遅いため、アルカリ水溶液に酸水溶液を混合するとともに、抗原タンパク質の溶液を所定時間内に混合することにより、抗原タンパク質はβ−1,3−グルカンに結合できる。
Further, in the reaction step, an alkaline aqueous solution in which β-1,3-glucan is dissolved and a solution in which the antigen protein is dissolved in a buffer aqueous solution or the like are mixed, and an aqueous acid solution is mixed simultaneously or sequentially, Neutralization can be performed.
In the reaction step, the neutralization is performed simultaneously with the reaction by mixing an acid aqueous solution with an alkaline aqueous solution in which β-1,3-glucan is dissolved and a solution in which the antigen protein is dissolved in a buffered aqueous solution or the like. In addition, mixing with an acid aqueous solution or within a predetermined time is also included. The rate at which β-1,3-glucan reverts from a single strand to a triple helix upon neutralization is slower than the reaction rate between the formyl group of β-1,3-glucan and the amino group of the antigen protein. The antigen protein can be bound to β-1,3-glucan by mixing the aqueous acid solution with the alkaline aqueous solution and mixing the antigen protein solution within a predetermined time.
抗原タンパク質の溶液としては、抗原タンパク質を中性付近のｐＨの緩衝溶液に溶解させた緩衝水溶液が好適である。緩衝溶液としては、トリス塩酸，ＴＥ（トリス，エチレンジアミン四酢酸），ＴＡＥ（トリス，酢酸，エチレンジアミン四酢酸），ＴＢＥ（トリス，ホウ酸，エチレンジアミン四酢酸），ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水），ＨＥＰＥＳ（2-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸）等を挙げることができる。
反応工程において、逐次中和を行なう場合、アルカリ水溶液中でβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応開始から中和されるまでの時間としては、６０分以下が好適である。反応開始から中和されるまでの時間が６０分を超えると、アルカリ水溶液により変性される抗原タンパク質の割合が増大するからである。
As the antigen protein solution, a buffer aqueous solution in which the antigen protein is dissolved in a buffer solution having a pH near neutral is suitable. Buffer solutions include Tris hydrochloric acid, TE (Tris, ethylenediaminetetraacetic acid), TAE (Tris, acetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid), TBE (Tris, boric acid, ethylenediaminetetraacetic acid), TBS (Tris buffered saline), HEPES (2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid) and the like.
In the reaction step, when neutralization is performed successively, the time from the start of the reaction between β-1,3-glucan and the antigen protein in an alkaline aqueous solution to neutralization is preferably 60 minutes or less. This is because if the time from the start of the reaction to neutralization exceeds 60 minutes, the proportion of the antigen protein denatured by the alkaline aqueous solution increases.
本発明の請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記反応工程において結合させ生成された前記抗原タンパク質と前記β−1,3−グルカンとの複合体を、5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドと非プロトン性有機溶媒中で反応させる構成を有している。
この構成により、請求項１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）抗原タンパク質とβ−1,3−グルカンとの複合体は、非プロトン性有機溶媒中で１本鎖に解離される。非プロトン性有機溶媒中で解離された１本鎖の複合体と、CpGオリゴヌクレオチドの末端に結合したポリ(dA)テールとを結合させ、３重螺旋構造やその他の構造の三元複合体を安定して高収率で製造できる。得られた三元複合体は、免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いることができる。また、簡便なワクチンやアジュバントとして使用できる。
Invention of Claim 2 of this invention is a manufacturing method of the ternary complex of Claim 1, Comprising: The said antigenic protein couple | bonded and produced | generated in the said reaction process, and the said (beta) -1, 3- glucan Is reacted with a CpG oligonucleotide having a poly (dA) tail at the 5′-end in an aprotic organic solvent.
With this configuration, in addition to the operation obtained in the first aspect, the following operation can be obtained.
(1) A complex of an antigen protein and β-1,3-glucan is dissociated into a single chain in an aprotic organic solvent. A single-stranded complex dissociated in an aprotic organic solvent and a poly (dA) tail bonded to the end of a CpG oligonucleotide are combined to form a triple complex having a triple helix structure or other structure. It can be stably produced at a high yield. The resulting ternary complex can be used for the prevention and treatment of Th2 cell-related diseases by regulating the balance of Th1 cells and Th2 cells in the immune system. It can also be used as a simple vaccine or adjuvant.
ここで、CpGオリゴヌクレオチドは、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドであり、TCGT又はTCGAモチーフを含むＫ−タイプ若しくは3’−末端にGカルテットを有するＤ−タイプ等が用いられる。一般的にプリン-プリン-C-G-ピリミジン-ピリミジンという配列をもつすべてのDNAがこの範疇に含まれる。
CpGオリゴヌクレオチドの5’−末端にポリ(dA)テールを付加するのは、安定した三元複合体を形成させるためである。dA（デオキシアデノシン）の数は特に限定されるものではないが、一般に３０〜８０個好ましくは４０〜６０個である。
各タイプのモチーフは、一つの核酸分子中に複数個存在してもよく、その複数個のタイプが異なるものでも構わない。
Here, the CpG oligonucleotide is an oligonucleotide containing an unmethylated CpG sequence, and a K-type containing a TCGT or TCGA motif or a D-type having a G quartet at the 3′-end is used. In general, all DNA having the sequence of purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine is included in this category.
The poly (dA) tail is added to the 5′-end of the CpG oligonucleotide in order to form a stable ternary complex. The number of dA (deoxyadenosine) is not particularly limited, but is generally 30 to 80, preferably 40 to 60.
A plurality of types of motifs may be present in one nucleic acid molecule, or the types may be different.
非プロトン性有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（DMSO），アセトニトリル，アセトン等を挙げることができ、特にジメチルスルホキシド（DMSO）が好適である。
抗原タンパク質とβ−1,3−グルカンとの複合体を非プロトン性有機溶媒に溶解して１本鎖に解離させ、ポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドの溶液を混合し、例えば５℃で１０〜２４時間保持することにより、三元複合体が形成される。
CpGオリゴヌクレオチドの溶液としては、中性付近のｐＨの緩衝水溶液が好適である。抗原タンパク質とβ−1,3−グルカンとの複合体を溶解させた非プロトン性有機溶媒に、CpGオリゴヌクレオチドを溶解させた緩衝水溶液を混合することにより、非プロトン性有機溶媒中で１本鎖に解離した複合体が、水が混合されることで、β−1,3−グルカン２本とCpGオリゴヌクレオチド１本の３重螺旋構造やその他の構造のCpGオリゴヌクレオチドとの三元複合体となるからである。
緩衝水溶液としては、トリス塩酸，ＴＥ，ＴＡＥ，ＴＢＥ，ＴＢＳ，ＨＥＰＥＳ等の緩衝溶液を挙げることができる。
Examples of the aprotic organic solvent include dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, acetone and the like, and dimethyl sulfoxide (DMSO) is particularly preferable.
A complex of an antigen protein and β-1,3-glucan is dissolved in an aprotic organic solvent, dissociated into a single strand, and a solution of a CpG oligonucleotide having a poly (dA) tail is mixed. Is held for 10 to 24 hours to form a ternary complex.
As the CpG oligonucleotide solution, a buffered aqueous solution having a pH near neutral is preferable. Single strands in an aprotic organic solvent are prepared by mixing a buffered aqueous solution in which a CpG oligonucleotide is dissolved in an aprotic organic solvent in which a complex of an antigen protein and β-1,3-glucan is dissolved. When the complex dissociated in water is mixed with water, a triple complex of two β-1,3-glucans and one CpG oligonucleotide triplex structure or other CpG oligonucleotide Because it becomes.
Examples of the buffer aqueous solution include buffer solutions such as Tris-HCl, TE, TAE, TBE, TBS, and HEPES.
本発明の請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記反応工程における前記β−1,3−グルカンと前記抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチド又は5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させる構成を有している。
この構成により、請求項１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより、反応工程において、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応に加え、CpGオリゴヌクレオチドのアミノ基との反応が生じ、抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を単一の反応場で操作性良く製造できる。
（２）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場において、アルカリ水溶液中で解離された１本鎖のβ−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドの末端に結合したポリ(dA)テールとを結合させることにより、反応工程において、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応に加え、CpGオリゴヌクレオチドとの反応が生じ、抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を単一の反応場で操作性良く製造できる。
（３）得られた三元複合体は、免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いることができる。
Invention of Claim 3 of this invention is a manufacturing method of the ternary complex of Claim 1, Comprising: In the reaction field of the said beta-1, 3- glucan and the said antigen protein in the said reaction process. And a CpG oligonucleotide having an amino group at the 5′-end or 3′-end, or a CpG oligonucleotide having a poly (dA) tail at the 5′-end.
With this configuration, in addition to the operation obtained in the first aspect, the following operation can be obtained.
(1) By allowing a CpG oligonucleotide having an amino group at the 5′-terminal or 3′-terminal to coexist in the reaction field between β-1,3-glucan and an antigen protein, In addition to the reaction between the formyl group of 3-glucan and the amino group of the antigen protein, the reaction with the amino group of the CpG oligonucleotide occurs, and the antigen protein / CpG oligonucleotide / β-1,3-glucan ternary complex It can be manufactured with good operability in a single reaction field.
(2) Poly (dA) bound to the ends of single-stranded β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide dissociated in an aqueous alkaline solution in the reaction field of β-1,3-glucan and antigen protein By binding the tail, in the reaction step, in addition to the reaction between the formyl group of β-1,3-glucan and the amino group of the antigen protein, a reaction with the CpG oligonucleotide occurs, and the antigen protein / CpG oligonucleotide / A β-1,3-glucan ternary complex can be produced in a single reaction field with good operability.
(3) The obtained ternary complex can be used for the prevention and treatment of Th2 cell-related diseases by regulating the balance of Th1 cells and Th2 cells in the immune system.
ここで、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドや5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドは、酸水溶液若しくは中性付近のｐＨの水溶液に溶解させ、これらの水溶液をアルカリ水溶液に混合することにより、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、CpGオリゴヌクレオチドを共存させることができる。
CpGオリゴヌクレオチドの溶液としては、CpGオリゴヌクレオチドを中性付近のｐＨのトリス塩酸，ＴＥ，ＴＡＥ，ＴＢＥ，ＴＢＳ，ＨＥＰＥＳ等の緩衝溶液に溶解させた緩衝水溶液が好適に用いられる。
酸水溶液としては、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸等の水溶液を用いることができる。
酸水溶液の濃度としては、０．１〜１Ｍ／Ｌ好ましくは０．２５〜０．５Ｍ／Ｌが好適である。濃度が０．２５Ｍ／Ｌより低くなるにつれ中和力が低下する傾向がみられ、０．５Ｍ／Ｌより高くなるにつれ、抗原タンパク質が変性し易くなり反応性が低下する傾向がみられる。特に、０．１Ｍ／Ｌより低くなるか１Ｍ／Ｌより高くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
Here, a CpG oligonucleotide having an amino group at the 5′-end or 3′-end or a CpG oligonucleotide having a poly (dA) tail at the 5′-end is dissolved in an aqueous acid solution or an aqueous solution having a pH near neutrality. By mixing these aqueous solutions with an alkaline aqueous solution, the CpG oligonucleotide can coexist in the reaction field of β-1,3-glucan and the antigen protein.
As the solution of the CpG oligonucleotide, a buffer aqueous solution in which the CpG oligonucleotide is dissolved in a buffer solution such as Tris-HCl, TE, TAE, TBE, TBS, HEPES having a pH near neutral is preferably used.
As the acid aqueous solution, aqueous solutions of hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid and the like can be used.
The concentration of the acid aqueous solution is 0.1 to 1 M / L, preferably 0.25 to 0.5 M / L. As the concentration becomes lower than 0.25 M / L, the neutralizing power tends to decrease, and as the concentration becomes higher than 0.5 M / L, the antigen protein tends to denature and the reactivity tends to decrease. In particular, when the value is lower than 0.1 M / L or higher than 1 M / L, these tendencies become remarkable, so that neither is preferable.
本発明の請求項４に記載の発明は、請求項２に記載の三元複合体の製造方法であって、前記β−1,3−グルカンと前記CpGオリゴヌクレオチドとの結合が、主として水素結合に基づく非共有性結合である構成を有している。
この構成により、請求項２で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的弱いため、生体内で比較的容易にβ−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとを解離させることができる。
The invention according to claim 4 of the present invention is the method for producing the ternary complex according to claim 2, wherein the bond between the β-1,3-glucan and the CpG oligonucleotide is mainly a hydrogen bond. It has the structure which is a non-covalent bond based on.
With this configuration, in addition to the operation obtained in the second aspect, the following operation can be obtained.
(1) Since the binding force between β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide is relatively weak, β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide can be dissociated relatively easily in vivo.
本発明の請求項５に記載の発明は、請求項３に記載の三元複合体の製造方法であって、前記β−1,3−グルカンと前記CpGオリゴヌクレオチドとの結合が、主としてシッフ塩基若しくはアミド結合による構成を有している。
この構成により、請求項３で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドを脱離させることができ、標的指向性を高めることができる。
The invention according to claim 5 of the present invention is the method for producing the ternary complex according to claim 3, wherein the binding between the β-1,3-glucan and the CpG oligonucleotide is mainly a Schiff base. Or it has the structure by an amide bond.
With this configuration, in addition to the operation obtained in the third aspect, the following operation can be obtained.
(1) The binding force between β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide is relatively strong and can be desorbed under conditions that can undergo hydrolysis and the like in vivo. Can increase the sex.
本発明の請求項６に記載の発明は、請求項１乃至５の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記抗原タンパク質が、オボアルブミン（OVA）である構成を有している。
この構成により、請求項１乃至５の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）オボアルブミン（OVA）は、卵アレルギーにおける主要なアレルゲンと考えられており、アレルギー性疾患の抑制効果を増強させるとともに、Th1細胞の誘導効率も増強させることができる。
Invention of Claim 6 of this invention is a manufacturing method of the ternary complex of any one of Claims 1 thru | or 5, Comprising: The said antigen protein is a structure which is ovalbumin (OVA). Have.
With this configuration, in addition to the action obtained in any one of claims 1 to 5, the following action is obtained.
(1) Ovalbumin (OVA) is considered to be a major allergen in egg allergy, and can enhance the inhibitory effect of allergic diseases and the induction efficiency of Th1 cells.
本発明の請求項７に記載の発明は、請求項２乃至６の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記CpGオリゴヌクレオチドが、Ｋ−タイプ若しくはＤ−タイプのものである構成を有している。
この構成により、請求項２乃至６の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）CpGオリゴヌクレオチドがＫ−タイプであると、IL-12の産生を強く誘導し、Ｄ−タイプであると、IL-12と同時にINF-αの産生を誘発する。
Invention of Claim 7 of this invention is a manufacturing method of the ternary complex of any one of Claim 2 thru | or 6, Comprising: Said CpG oligonucleotide is K-type or D-type It has the structure which is thing.
According to this configuration, in addition to the action obtained in any one of claims 2 to 6, the following action is obtained.
(1) When the CpG oligonucleotide is K-type, IL-12 production is strongly induced, and when it is D-type, INF-α production is induced simultaneously with IL-12.
ここで、Ｋ−タイプのCpGオリゴヌクレオチドとしては、TCGT又はTCGAモチーフを含むものが用いられ、例えば、5’末端に40個のdAが結合され、複数個のCpG をもつK3｛5'−(dA)40−ATCGACTCTCGAGCGTTCTC−3'｝（配列番号１）が挙げられる。
Ｄ−タイプのCpGオリゴヌクレオチドとしては、3’−末端にGカルテットを有するものが用いられ、例えば、D35｛5'−(dA)40−GGTGCATCGATGCAGGGGGG−3'｝（配列番号２）が挙げられる
Here, as the K-type CpG oligonucleotide, one containing a TCGT or TCGA motif is used. For example, K3 {5 '-( dA) 40 -ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3 ′} (SEQ ID NO: 1).
As the D-type CpG oligonucleotide, one having a G quartet at the 3′-end is used, and examples thereof include D35 {5 ′-(dA) 40 -GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3 ′} (SEQ ID NO: 2).
本発明の請求項８に記載の発明は、請求項１乃至６の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記抗原タンパク質と前記β−1,3−グルカンの結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合による構成を有している。
この構成により、請求項１乃至６の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下で抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性を高めることができる。また、β−1,3−グルカンが抗原タンパク質を覆ったような状態になるため、非特異的吸着や分解酵素による不活性化を防ぎ、生体内での滞留性が向上することが期待される。
The invention according to claim 8 of the present invention is the method for producing a ternary complex according to any one of claims 1 to 6, wherein the antigen protein is bound to the β-1,3-glucan. However, it has the structure by a Schiff base or an amide bond.
With this configuration, in addition to the action obtained in any one of claims 1 to 6, the following action is obtained.
(1) The binding force between β-1,3-glucan and antigen protein is relatively strong, and antigen protein can be eliminated under conditions that can undergo hydrolysis etc. Can be increased. In addition, since β-1,3-glucan covers the antigenic protein, nonspecific adsorption and inactivation by degrading enzymes are prevented, and it is expected that the retention in vivo is improved. .
本発明の請求項９に記載の抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体は、請求項３に記載の製造方法で得られた構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより得られた三元複合体は、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質との結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合によるため、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質との結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性に優れる。DNAは生体内では容易にDNaseによって分解されるが、β−1,3−グルカンと結合することにより、この分解が大幅に抑制される。
The antigen protein / CpG oligonucleotide / β-1,3-glucan ternary complex according to claim 9 of the present invention has the structure obtained by the production method according to claim 3.
With this configuration, the following effects can be obtained.
(1) A ternary complex obtained by allowing a CpG oligonucleotide having an amino group at the 5′-terminal or 3′-terminal to coexist in a reaction field between β-1,3-glucan and an antigen protein, Since the binding between β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide or antigen protein is due to Schiff base or amide bond, the binding force between β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide or antigen protein is relatively strong. CpG oligonucleotides and antigenic proteins can be removed under conditions that allow hydrolysis and the like in vivo, and the target directivity is excellent. DNA is easily degraded in vivo by DNase, but this degradation is greatly suppressed by binding to β-1,3-glucan.
以上のように、本発明の三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体によれば、以下のような有利な効果が得られる。
請求項１に記載の発明によれば、
（１）β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応を容易に進行させることができ、反応率を従来の３０倍以上に高められる三元複合体の製造方法を提供できる。
As described above, according to the method for producing a ternary complex and the antigen protein / CpG oligonucleotide / β-1,3-glucan ternary complex of the present invention, the following advantageous effects can be obtained.
According to the invention of claim 1,
(1) A method for producing a ternary complex that can facilitate the reaction between the formyl group of β-1,3-glucan and the amino group of the antigen protein, and can increase the reaction rate by 30 times or more compared to the conventional method. Can be provided.
請求項２に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）非プロトン性有機溶媒中で解離された１本鎖の複合体と、CpGオリゴヌクレオチドの末端に結合したポリ(dA)テールとを結合させ、３重螺旋構造やその他の構造の三元複合体を安定して高収率で製造できる三元複合体の製造方法を提供できる。
According to invention of Claim 2, in addition to the effect of Claim 1,
(1) A single-stranded complex dissociated in an aprotic organic solvent and a poly (dA) tail bonded to the end of the CpG oligonucleotide are combined to form a triple helix structure or other ternary structure. It is possible to provide a method for producing a ternary complex capable of stably producing a complex with a high yield.
請求項３に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応に加え、CpGオリゴヌクレオチドとの反応が生じ、抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を単一の反応場で操作性良く製造できる三元複合体の製造方法を提供できる。
According to invention of Claim 3, in addition to the effect of Claim 1,
(1) In addition to the reaction between the formyl group of β-1,3-glucan and the amino group of the antigen protein, a reaction with the CpG oligonucleotide occurs, and the antigen protein / CpG oligonucleotide / β-1,3-glucan system It is possible to provide a method for producing a ternary complex capable of producing a ternary complex with good operability in a single reaction field.
請求項４に記載の発明によれば、請求項２の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的弱いため、生体内で比較的容易にβ−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとを解離させることができる三元複合体の製造方法を提供できる。
According to invention of Claim 4, in addition to the effect of Claim 2,
(1) Since the binding force between β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide is relatively weak, β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide can be dissociated relatively easily in vivo. A method for producing an original composite can be provided.
請求項５に記載の発明によれば、請求項３の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドを脱離させることができ、標的指向性を高める三元複合体の製造方法を提供できる。
According to the invention described in claim 5, in addition to the effect of claim 3,
(1) The binding force between β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide is relatively strong and can be desorbed under conditions that can undergo hydrolysis and the like in vivo. A method for producing a ternary composite with improved properties can be provided.
請求項６に記載の発明によれば、請求項１乃至５の内いずれか１の効果に加え、
（１）アレルギー性疾患の抑制効果を増強させるとともに、Th1細胞の誘導効率も増強させることができる三元複合体の製造方法を提供できる。
According to invention of Claim 6, in addition to the effect of any one of Claims 1 to 5,
(1) A method for producing a ternary complex capable of enhancing the inhibitory effect of allergic diseases and enhancing the induction efficiency of Th1 cells can be provided.
請求項７に記載の発明によれば、請求項２乃至６の内いずれか１の効果に加え、
（１）免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に好適な三元複合体の製造方法を提供できる。
According to the invention described in claim 7, in addition to the effect of any one of claims 2 to 6,
(1) A method for producing a ternary complex suitable for the prevention or treatment of Th2 cell-related diseases can be provided by regulating the balance between Th1 cells and Th2 cells in the immune system.
請求項８に記載の発明によれば、請求項１乃至７の内いずれか１の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下で抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性を高める三元複合体の製造方法を提供できる。
According to the invention described in claim 8, in addition to the effect of any one of claims 1 to 7,
(1) The binding force between β-1,3-glucan and antigen protein is relatively strong, and antigen protein can be eliminated under conditions that can undergo hydrolysis etc. A method for producing a ternary composite can be provided.
請求項９に記載の発明によれば、
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより得られた三元複合体は、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合によるため、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドを脱離させることができ、標的指向性に優れた抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を提供できる。
According to the invention of claim 9,
(1) A ternary complex obtained by allowing a CpG oligonucleotide having an amino group at the 5′-terminal or 3′-terminal to coexist in a reaction field between β-1,3-glucan and an antigen protein, Since the bond between β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide is due to Schiff base or amide bond, the binding force between β-1,3-glucan and CpG oligonucleotide is relatively strong, such as hydrolysis in vivo. CpG oligonucleotide can be desorbed under such conditions as can be obtained, and an antigen protein / CpG oligonucleotide / β-1,3-glucan ternary complex having excellent target directivity can be provided.
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
文献（A.C.S.38(1), 253(1997);Carbohydrate Research, 89, 121-135(1981)）に記載された方法にて、分子量４５万のシゾフィランを得た。この方法は、最少培地を用いてSchizophyllum commune. Fries(ATCC 44220)を７日間静置培養した後、細胞成分及び不溶残渣を遠心分離して、得られた上清を超音波処理するものである。
このシゾフィラン100mgを水100mlに溶解させた。この溶液を６つに分け、その各々に過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（シゾフィラン側鎖グルコースに対して0％、20％、40%、60%、80％、100％の当量数の水溶液）のいずれかをゆっくりと加え、４℃で２日間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。この試料をそれぞれ、SPG, f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGとよぶ。f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGは、過ヨウ素酸酸化により、シゾフィラン（β−1,3−グルカン）の側鎖にホルミル基を有している。
SPG, f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGの試料各1mgを、0.6NのNaOH 1.0mlに各々溶解し１本鎖に解離させた。１本鎖に解離されたことは、ゲル浸透クロマトグラフ／多角度レーザー光散乱検出器（MALS/GPC，Shodex GPC-101,カラムSB-806M,DAWN HELEOS-A）により、分子量が15万に減少していることにより確認した。
次いで、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との複合体を得るため、これらのアルカリ水溶液の各々に、オボアルブミン（OVA）のトリス塩酸緩衝水溶液（100mg/ml）を2μl添加すると同時に、0.6NのHClを1.0ml添加してアルカリ水溶液を中和した。
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. The present invention is not limited to these examples.
Example 1
Schizophyllan having a molecular weight of 450,000 was obtained by the method described in the literature (ACS38 (1), 253 (1997); Carbohydrate Research, 89, 121-135 (1981)). In this method, Schizophyllum commune. Fries (ATCC 44220) is statically cultured for 7 days using a minimal medium, then cell components and insoluble residues are centrifuged, and the resulting supernatant is sonicated. .
100 mg of this schizophyllan was dissolved in 100 ml of water. This solution is divided into 6 parts, each of which is one of sodium periodate aqueous solution (0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% equivalent number of aqueous solution to schizophyllan side chain glucose) Was slowly added and stirred at 4 ° C. for 2 days. The reaction solution was dialyzed with a dialysis membrane (exclusion limit 12000) and then lyophilized. These samples are called SPG, f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, and f100SPG, respectively. f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, and f100SPG have a formyl group in the side chain of schizophyllan (β-1,3-glucan) by periodate oxidation.
1 mg of each sample of SPG, f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, and f100SPG was dissolved in 1.0 ml of 0.6N NaOH and dissociated into single strands. The dissociation into single strands was achieved by gel permeation chromatography / multi-angle laser light scattering detector (MALS / GPC, Shodex GPC-101, column SB-806M, DAWN HELEOS-A), and the molecular weight decreased to 150,000. It was confirmed by doing.
Subsequently, in order to obtain a complex of β-1,3-glucan and an antigen protein, 2 μl of a tris-HCl buffer solution (100 mg / ml) of ovalbumin (OVA) was added to each of these alkaline aqueous solutions at the same time as 0.6 1.0 ml of N HCl was added to neutralize the aqueous alkaline solution.
図１は実施例１における反応物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。ウエル（図の上部）に留まっているOVAがSPGと結合して複合体を形成していることを示している。
図１から、f20SPG, f40SPGでは、シゾフィランとオボアルブミンの複合体（SPG-OVA）のバンドがスメア状であるが、f60SPG，f80SPG, f100SPGでは、SPG-OVAが一本のバンドを形成していることがわかる。これは、f60SPG，f80SPG, f100SPG では、シゾフィラン（SPG）にオボアルブミン（OVA）が強固に結合したことを示している。
FIG. 1 shows the results of agarose gel electrophoresis of the reactants in Example 1. It shows that OVA remaining in the well (upper part of the figure) binds to SPG to form a complex.
From Fig. 1, the band of schizophyllan and ovalbumin complex (SPG-OVA) is smeared in f20SPG and f40SPG, but SPG-OVA forms a single band in f60SPG, f80SPG, and f100SPG. I understand that. This indicates that ovalbumin (OVA) was strongly bound to schizophyllan (SPG) in f60SPG, f80SPG, and f100SPG.
（比較例１）
実施例１と同様の方法により、シゾフィランからf20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGを合成した後、（非特許文献２３）に記載された方法に従って、OVAを結合させた。具体的には、f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPG の各試料を1mg溶解した水溶液に、それぞれOVAのトリス塩酸緩衝水溶液（100mg/ml）を2μl添加し、それと同時に、還元剤としての水素化ホウ素ナトリウム（NaBH４）100mgを0.1Mの重炭酸ナトリウム水溶液に溶解した溶液を混合した後、室温で14時間撹拌した。
(Comparative Example 1)
After synthesizing f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, and f100SPG from Schizophyllan by the same method as in Example 1, OVA was bound according to the method described in (Non-patent Document 23). Specifically, 2 µl of OVA tris-HCl buffer solution (100 mg / ml) was added to each 1 mg solution of f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, and f100SPG, and at the same time, hydrogenation as a reducing agent. A solution prepared by dissolving 100 mg of sodium boron (NaBH 4 ) in 0.1 M aqueous sodium bicarbonate solution was mixed, and then stirred at room temperature for 14 hours.
図２は比較例１における反応物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である
図２からは、未反応のOVAは観測できるが、SPG-OVAの複合体は観測できない。これは、SPGとOVAとの反応性が著しく低いことを示している。
FIG. 2 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of the reactant in Comparative Example 1. From FIG. 2, unreacted OVA can be observed, but SPG-OVA complex cannot be observed. This indicates that the reactivity between SPG and OVA is extremely low.
（化学結合率の評価）
次に、実施例１で説明したf40SPGの中和後の溶液と、比較例１で説明したf40SPGの撹拌後の溶液を、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画して、それぞれの吸収を波長240nmで測定した。
図３は実施例１と比較例１の溶液をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画した試料の流出時間と吸収値とを示す図である。なお、図３には光散乱法（90°）で観測したSPGのピークも示した。このピークは、SPG-OVAの重量平均分子量に対応していると考えられる。
図３において、比較例１の大きなピークは、SPGより低分子量である未結合のOVA（フリーOVA）に相当する。一方、実施例１ではフリーOVAに相当するピークが小さくなり、高分子量のSPGに結合したSPG-OVAに相当するピークが大きくなっている。図３に示すフリーOVAに相当するピークの面積（以下、OVAｆという。）と、SPG-OVAに相当するピークの面積（以下、OVAｂという。）とを求め、OVAの結合率｛OVAｂ/（OVAｂ+OVAｆ）｝を算出したところ、実施例１のf40SPGには90％以上のOVAが反応していること（結合率は90％以上）、比較例１のf40SPGには1％以下のOVAしか反応していないこと（結合率は1％以下）が判明した。
以上の実施例から、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なうことにより、反応率を飛躍的に高められることが明らかとなった。
(Evaluation of chemical bond rate)
Next, the solution after the neutralization of f40SPG described in Example 1 and the solution after the stirring of f40SPG described in Comparative Example 1 are fractionated by gel permeation chromatography (GPC), and the absorption of each wavelength is determined. Measured at 240 nm.
FIG. 3 is a graph showing the outflow time and absorption value of samples obtained by fractionating the solutions of Example 1 and Comparative Example 1 by gel permeation chromatography (GPC). FIG. 3 also shows the SPG peak observed by the light scattering method (90 °). This peak is considered to correspond to the weight average molecular weight of SPG-OVA.
In FIG. 3, the large peak of Comparative Example 1 corresponds to unbound OVA (free OVA) having a lower molecular weight than SPG. On the other hand, in Example 1, the peak corresponding to free OVA is small, and the peak corresponding to SPG-OVA bonded to high molecular weight SPG is large. The peak area corresponding to free OVA shown in FIG. 3 (hereinafter referred to as OVA f ) and the peak area corresponding to SPG-OVA (hereinafter referred to as OVA b ) are obtained, and the OVA coupling rate {OVA b / (OVA b + OVA f )} was calculated. As a result, 90% or more of OVA had reacted with f40SPG of Example 1 (binding rate was 90% or more), and 1% with f40SPG of Comparative Example 1 It was found that only the following OVA was reacting (binding rate was 1% or less).
From the above examples, it has been clarified that the reaction rate can be dramatically increased by reacting β-1,3-glucan and an antigen protein in an alkaline aqueous solution and at the same time neutralizing.
（実施例２）
実施例１で得られたf60SPGとOVAの複合体（以後、f60SPG/OVAという。）に、CpG DNAを反応させる実験を行なった。なお、公知文献（特許第4064108号公報）に明らかなように、SPGのNaOH溶液をHCl溶液で中和することで、dAテールとSPGとの複合化が起きることが知られている。
ここで、本実施例で用いたf60SPG/OVAは、吸光度の測定結果から、SPGの側鎖100残基に対して、約1分子のOVAが結合していることが判明した。
このf60SPG/OVA 1mgを0.6MのNaOH 83 mlに溶解して、f60SPG/OVAの１本鎖のNaOH溶液を作成した。次に、このアルカリ水溶液に0.6M HCl溶液と、5‘端にdAテールがついた配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’のCpG DNA（配列番号３）のトリス塩酸緩衝水溶液49.2ml（DNAの濃度0.16mM）とを同時に添加し反応させた。
円偏光２色性スペクトル（CD）測定によって、反応物はf60SPG/OVA /DNAの三元複合体が形成されていることを確認した。
(Example 2)
An experiment was conducted in which CpG DNA was reacted with the complex of f60SPG and OVA obtained in Example 1 (hereinafter referred to as f60SPG / OVA). As is apparent from the known literature (Japanese Patent No. 4064108), it is known that the dA tail and SPG are complexed by neutralizing the NaOH solution of SPG with the HCl solution.
Here, in the f60SPG / OVA used in this example, it was found from the measurement result of absorbance that about 1 molecule of OVA was bound to 100 residues of the side chain of SPG.
1 mg of this f60SPG / OVA was dissolved in 83 ml of 0.6 M NaOH to prepare a single-chain NaOH solution of f60SPG / OVA. Next, 49.2 ml of an aqueous Tris-HCl buffer solution of CpG DNA (SEQ ID NO: 3) having a sequence of 5′-TCCATGACGTTCCTGATG-3 ′ with a dA tail at the 5 ′ end and a 0.6M HCl solution in this alkaline aqueous solution (DNA concentration 0.16) mM) was added at the same time to react.
The reaction product confirmed that a ternary complex of f60SPG / OVA / DNA was formed by circular dichroism spectrum (CD) measurement.
（実施例３）
実施例１で使用したf60SPG, f80SPGを0.6NのNaOHに溶解し１本鎖に解離させた。この溶液にHClを添加すると同時に、5’端にアミノ基がついたCpG DNA（配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’）（配列番号４）とOVAを、表１の実験No１〜５に示す割合で混合し反応させた。
(Example 3)
The f60SPG and f80SPG used in Example 1 were dissolved in 0.6N NaOH and dissociated into single strands. Simultaneously with the addition of HCl to this solution, CpG DNA (sequence 5′-TCCATGACGTTCCTGATG-3 ′) (SEQ ID NO: 4) with an amino group at the 5 ′ end and OVA were added at the ratios shown in Experiments Nos. 1 to 5 in Table 1. Mix and react.
これらの反応物の評価を、アガロースゲル電気泳動によって行った。ただし、OVAとCpG DNAでは分子量に差があるので、OVAを評価する場合は100V , 400 mA , 1.5 h、CpG DNAを評価する場合は100V , 400mA , 20 minの条件で電気泳動を行った。なお、OVAの染色はSimply Blue(登録商標) SafeStain (invitrogen)で行い、CpG DNAの染色はSYBR Gold (invitrogen)で行った。
図４（ａ）はOVAについて評価したアガロースゲル電気泳動の結果であり、図４（ｂ）はCpG DNAについて評価したアガロースゲル電気泳動の結果である。図４に付した１〜５の番号は、表１の第１行に記載した実験No1〜5と対応している。また、ウエル（図の上部）に留まっているOVA若しくはCpG DNAがSPGと結合したものである。
図４から、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより、三元複合体が形成されることが明らかとなった。
なお、実施例１で説明したのと同様に、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によってOVA，CpG DNA，SPGの各ピークの面積を測定し結合率を算出したところ、実験No2ではOVA 100 ％、CpG DNA 58 ％、実験No3ではOVA 100 ％、CpG DNA 48 ％、実験No4ではOVA 100 ％、CpG DNA 35 ％、実験No5ではOVA 100 ％、CpG DNA 29 ％であり、OVAの反応率はほぼ100％であった。
5’−末端にアミノ基を有するCpG DNAに代えて 3’−末端にアミノ基を有するCpG DNAを用いた場合も、ほぼ同様の結果が得られた。
These reactants were evaluated by agarose gel electrophoresis. However, since there is a difference in molecular weight between OVA and CpG DNA, electrophoresis was performed under the conditions of 100 V, 400 mA, 1.5 h when evaluating OVA, and 100 V, 400 mA, 20 min when evaluating CpG DNA. OVA staining was performed with Simply Blue (registered trademark) SafeStain (invitrogen), and CpG DNA staining was performed with SYBR Gold (invitrogen).
FIG. 4A shows the results of agarose gel electrophoresis evaluated for OVA, and FIG. 4B shows the results of agarose gel electrophoresis evaluated for CpG DNA. The numbers 1 to 5 attached to FIG. 4 correspond to the experiments No 1 to 5 described in the first row of Table 1. In addition, OVA or CpG DNA remaining in the well (upper part of the figure) is bound to SPG.
It is clear from FIG. 4 that a ternary complex is formed by coexisting a CpG oligonucleotide having an amino group at the 5′-end in the reaction field of β-1,3-glucan and an antigen protein. became.
As described in Example 1, the area of each peak of OVA, CpG DNA, and SPG was measured by gel permeation chromatography (GPC) and the binding rate was calculated. In Experiment No2, OVA 100%, CpG DNA 58%, Experiment No3 OVA 100%, CpG DNA 48%, Experiment No4 OVA 100%, CpG DNA 35%, Experiment No5 OVA 100%, CpG DNA 29%, OVA reaction rate is almost 100% Met.
Similar results were obtained when CpG DNA having an amino group at the 3′-end was used instead of CpG DNA having an amino group at the 5′-end.
（実施例４）
実施例１で得られたf60SPGの所定量を、0.6NのNaOH 48 mlに溶解し１本鎖に解離させた。このアルカリ水溶液に、HCl（0.6M、48 ml）を添加すると同時に、dAテールがついたCpG DNA（配列番号３）（3g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液と、OVA（100g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液と、を所定量加えて反応させた（実験No１〜５）。表２に、実験No１〜５のf60SPG，OVA，CpG DNAの仕込みのモル比を示す。
Example 4
A predetermined amount of f60SPG obtained in Example 1 was dissolved in 48 ml of 0.6N NaOH and dissociated into single strands. To this aqueous alkaline solution, HCl (0.6 M, 48 ml) was added, and at the same time, CpG DNA (SEQ ID NO: 3) (3 g / l) with Tris-HCl buffer in dA tail and OVA (100 g / l) Tris was added. A predetermined amount of a hydrochloric acid buffer aqueous solution was added and reacted (Experiment Nos. 1 to 5). Table 2 shows the molar ratio of preparation of f60SPG, OVA, and CpG DNA in Experiment Nos. 1 to 5.
反応物の評価を、ポリアクリルアミド電気泳動で行った。OVAの染色はSimply Blue（登録商標）SafeStain (invitrogen)で行い、CpG DNAの染色はSYBR Gold (invitrogen)で行った。
図５（ａ）はOVAについて評価したポリアクリルアミド電気泳動の結果であり、図５（ｂ）はCpG DNAについて評価したポリアクリルアミド電気泳動の結果である。図５に付した１〜５の番号は、表２に記載したNo１〜５と対応している。
図５（ａ）に示すOVAの染色結果によれば、No３，４，５とf60SPGの量が減少するにつれ、フリーOVAの量が増加する傾向がみられるが、高分子側のバンドも確認できることから、f60SPG とOVAが結合していると考えられる。
図５（ｂ）に示すCpG DNAの染色結果によれば、No３，４，５とf60SPGの量が減少するにつれ、フリーDNAの量が増加する傾向がみられるが、高分子側のバンドが濃くなる傾向がみられることから、f60SPG とCpG DNA も結合していると考えられる。
これらの結果から、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより、三元複合体が形成されていると考えられる。また、高分子側のバンドの濃さから、SPG 1.5分子に対してOVA 1つおよびCpG DNA 2つが複合化していると推察される。
The reaction product was evaluated by polyacrylamide electrophoresis. OVA staining was performed with Simply Blue (registered trademark) SafeStain (invitrogen), and CpG DNA staining was performed with SYBR Gold (invitrogen).
FIG. 5 (a) shows the results of polyacrylamide electrophoresis evaluated for OVA, and FIG. 5 (b) shows the results of polyacrylamide electrophoresis evaluated for CpG DNA. The numbers 1 to 5 attached to FIG. 5 correspond to Nos 1 to 5 described in Table 2.
According to the OVA staining result shown in FIG. 5 (a), the amount of free OVA tends to increase as the amount of No3, 4, 5 and f60SPG decreases, but the band on the polymer side can also be confirmed. Therefore, it is considered that f60SPG and OVA are combined.
According to the CpG DNA staining result shown in FIG. 5 (b), the amount of free DNA tends to increase as the amount of No3, 4, 5 and f60SPG decreases, but the band on the polymer side is deeper. It is considered that f60SPG and CpG DNA are also bound.
From these results, a ternary complex was formed by coexisting a CpG oligonucleotide having a poly (dA) tail at the 5′-end in the reaction field of β-1,3-glucan and an antigen protein. It is thought that there is. Moreover, from the density of the band on the polymer side, it is inferred that one OVA and two CpG DNAs are complexed to 1.5 SPG molecules.
（実施例５）
実施例１で使用したf60SPG 0.5mgを0.6NのNaOH 48 mlに溶解し１本鎖に解離させた。このアルカリ水溶液に、HCl（0.6M、48 ml）を添加した後、定められた時間後に、５‘端にアミノ基がついたCpG DNA（配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’）（配列番号４）（3g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液0.5 mlと、OVA（100g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液1.0 mlと、を加えて反応させた。
これらの反応物の評価を、アガロースゲル電気泳動によって行ったところ、高分子側のバンドが確認された。従って、三元複合体が形成されているものと判断できる。
さらに、実施例１で説明したのと同様に、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によってOVA，CpG DNA，SPGの各ピークの面積を測定し、OVAとDNAの結合率を算出した。
表３に、アルカリ水溶液に塩酸を添加してからOVA及びDNAの溶液を添加するまでの時間と、OVAの結合率（モル％）、DNAの結合率（モル％）との関係を示す。
(Example 5)
0.5 mg of f60SPG used in Example 1 was dissolved in 48 ml of 0.6N NaOH and dissociated into single strands. After adding HCl (0.6 M, 48 ml) to this aqueous alkaline solution, CpG DNA having an amino group at the 5 ′ end (sequence 5′-TCCATGACGTTCCTGATG-3 ′) (SEQ ID NO: 4) (3 g / l) Tris-HCl buffer aqueous solution 0.5 ml and OVA (100 g / l) Tris-HCl buffer aqueous solution 1.0 ml were added and reacted.
When these reaction products were evaluated by agarose gel electrophoresis, a band on the polymer side was confirmed. Therefore, it can be determined that a ternary complex is formed.
Further, in the same manner as described in Example 1, the area of each peak of OVA, CpG DNA, and SPG was measured by gel permeation chromatography (GPC), and the binding rate of OVA and DNA was calculated.
Table 3 shows the relationship between the time from the addition of hydrochloric acid to the aqueous alkaline solution to the addition of the OVA and DNA solution, the OVA binding rate (mol%), and the DNA binding rate (mol%).
表３より、アルカリ水溶液に塩酸を添加してからOVA及びDNAの溶液を添加するまでの時間が長くなるにつれ、OVAとCpG DNAの結合率が低下する傾向がみられ、60分を超えると、OVAの反応率が50％以下となることがわかる。これは、中和に伴いβ−1,3−グルカンが１本鎖から３重螺旋の棒状の高分子に復帰し、運動性が低下するためであると考えられる。
また、SPGのアルカリ水溶液にOVAを添加してから中和する場合、OVAを添加してから中和するまでの時間が長くなるにつれ、OVAの結合率が低下することも確認した。これは、アルカリ水溶液により変性される抗原タンパク質の割合が増大するためであると考えられる。
From Table 3, as the time from the addition of hydrochloric acid to the aqueous alkaline solution to the addition of the OVA and DNA solution becomes longer, the binding rate of OVA and CpG DNA tends to decrease. It can be seen that the OVA reaction rate is 50% or less. This is considered to be because β-1,3-glucan returns from a single strand to a triple-helix rod-like polymer with neutralization, and the mobility is lowered.
It was also confirmed that when the neutralization was performed after adding OVA to the alkaline aqueous solution of SPG, the OVA binding rate decreased as the time from addition of OVA to neutralization increased. This is considered to be because the ratio of the antigen protein denatured by the alkaline aqueous solution increases.
（実施例６）
抗ミトコンドリア抗体（AMA）への対応抗原であるM2型抗原を、公知文献（日本生化学会編（1992）「新生化学実験講座 第12巻」東京化学同人）に記載されている方法にて得た。次いで、イムノブロット法にて70kDa, 50kDa, 47kDa, 40kDa の４つの分画を得た。この中で70kDaのタンパク質はM2分画の大部分を占めていた。このM2抗原を、HEPES緩衝水溶液に分散して100mg/mlの溶液を作成した。
実施例１と同様に、f60SPG 1mgを0.6NのNaOH 1.0mlに溶解したアルカリ水溶液に、M2抗原のHEPES緩衝水溶液を2μl添加すると同時に、0.6NのHClを1.0ml添加してアルカリ水溶液を中和した。得られた反応物をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画して、M2抗原（タンパク質）の結合率を算出したところ、80％であった。
また、実施例５と同様に、f60SPG 0.5mgを0.6NのNaOH 48 mlに溶解したアルカリ水溶液に、HCl（0.6M、48 ml）を添加し、20分後に、５‘端にアミノ基がついたCpG DNA（配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’）（配列番号４）（3g/l）のHEPES緩衝水溶液0.5 mlと、M2抗原（100mg/ml）のHEPES緩衝水溶液1.0 mlと、を加えて反応させた。得られた反応物をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画した結果、M2抗原（タンパク質）のM2抗原の結合率は80％、CpG DNAの結合率は35％と算出された。
以上のことから、オボアルブミン（OVA）以外の抗原タンパク質を用いた場合にも、抗原タンパク質／CpG DNA／β−1,3−グルカン系三元複合体を、高い収率で製造できることが確認された。
(Example 6)
M2 type antigen, which is a corresponding antigen to anti-mitochondrial antibody (AMA), was obtained by a method described in a publicly-known literature (Japan Biochemical Society (1992), “New Chemistry Experiment Course Vol. 12,” Tokyo Kagaku Dojin) . Subsequently, four fractions of 70 kDa, 50 kDa, 47 kDa and 40 kDa were obtained by immunoblotting. Among them, the 70 kDa protein accounted for most of the M2 fraction. This M2 antigen was dispersed in a HEPES buffer aqueous solution to prepare a 100 mg / ml solution.
As in Example 1, 2 μl of M2 antigen HEPES buffer solution was added to an alkaline aqueous solution in which 1 mg of f60SPG was dissolved in 0.6 ml of NaOH, and simultaneously 1.0 ml of 0.6N HCl was added to neutralize the alkaline aqueous solution. did. The obtained reaction product was fractionated by gel permeation chromatography (GPC), and the binding rate of M2 antigen (protein) was calculated to be 80%.
Similarly to Example 5, HCl (0.6 M, 48 ml) was added to an alkaline aqueous solution in which 0.5 mg of f60SPG was dissolved in 48 ml of 0.6N NaOH, and after 20 minutes, an amino group was attached to the 5 ′ end. Reaction with 0.5 ml of HEPES buffer solution of CpG DNA (sequence 5'-TCCATGACGTTCCTGATG-3 ') (SEQ ID NO: 4) (3 g / l) and 1.0 ml of HEPES buffer solution of M2 antigen (100 mg / ml) I let you. As a result of fractionating the obtained reaction product by gel permeation chromatography (GPC), the M2 antigen binding rate of M2 antigen (protein) was calculated to be 80%, and the binding rate of CpG DNA was calculated to be 35%.
From the above, it was confirmed that the antigen protein / CpG DNA / β-1,3-glucan ternary complex can be produced in a high yield even when an antigen protein other than ovalbumin (OVA) is used. It was.
本発明は、医薬組成物の技術分野に属し、Th2細胞関連疾患、特に、アレルギー反応（例えば、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎）を抑制できる薬剤、抗腫瘍（例えば、ガン）効果を期待できる薬剤を提供できる。 The present invention belongs to the technical field of pharmaceutical compositions, and is capable of suppressing Th2 cell-related diseases, particularly allergic reactions (eg, hay fever, bronchial asthma, atopic dermatitis), and antitumor (eg, cancer) effects. Providing promising drugs.
Claims (9)
側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備えていることを特徴とする三元複合体の製造方法。 A method for producing an antigen protein / CpG oligonucleotide / β-1,3-glucan ternary complex comprising:
Β-1,3-glucan having a formyl group in the side chain and an antigen protein are neutralized at the same time as (a) reacting in an alkaline aqueous solution, or (b) sequentially neutralizing by reacting in an alkaline aqueous solution. A process for producing a ternary composite comprising a reaction step of
An antigen protein / CpG oligonucleotide / β-1,3-glucan ternary complex obtained by the production method according to claim 3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009017093A JP5035808B2 (en) | 2009-01-28 | 2009-01-28 | Method for producing ternary composite |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009017093A JP5035808B2 (en) | 2009-01-28 | 2009-01-28 | Method for producing ternary composite |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010174107A true JP2010174107A (en) | 2010-08-12 |
| JP5035808B2 JP5035808B2 (en) | 2012-09-26 |
Family
ID=42705386
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009017093A Expired - Fee Related JP5035808B2 (en) | 2009-01-28 | 2009-01-28 | Method for producing ternary composite |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5035808B2 (en) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015041318A1 (en) | 2013-09-20 | 2015-03-26 | 独立行政法人医薬基盤研究所 | Complex containing oligonucleotide having immunopotentiating activity and use thereof |
| WO2015118789A1 (en) * | 2014-02-06 | 2015-08-13 | 独立行政法人科学技術振興機構 | PEPTIDE/β-1,3-GLUCAN COMPLEX AND PRODUCTION METHOD THEREFOR, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING PEPTIDE/β-1,3-GLUCAN COMPLEX |
| WO2016152767A1 (en) * | 2015-03-20 | 2016-09-29 | 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 | CpG SPACER-OLIGONUCLEOTIDE-CONTAINING COMPLEX HAVING IMMUNOPOTENTIATING ACTIVITY, AND USE OF SAME |
| WO2017217531A1 (en) * | 2016-06-16 | 2017-12-21 | ナパジェン ファーマ，インコーポレテッド | Nucleic acid-antigen peptide conjugate |
| CN108295049A (en) * | 2018-02-12 | 2018-07-20 | 中山大学 | A kind of water-soluble amination β -1,3-D- glucan nano-particles of Antigen and its preparation method and application |
| WO2018180819A1 (en) * | 2017-03-30 | 2018-10-04 | 公立大学法人北九州市立大学 | Immunity-inducing agent and pharmaceutical composition containing same |
| WO2020067400A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | 公立大学法人北九州市立大学 | Immune inducer comprising antigen peptide-adjuvant nucleotide conjugate and pharmaceutical composition comprising same |
| KR20230107833A (en) | 2020-11-12 | 2023-07-18 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | Complex of beta glucan and nucleic acid with controlled particle diameter |
-
2009
- 2009-01-28 JP JP2009017093A patent/JP5035808B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10202606B2 (en) | 2013-09-20 | 2019-02-12 | National Institutes Of Biomedical Innovation, Health And Nutrition | Complex containing oligonucleotide having immunopotentiating activity and use thereof |
| EP4253546A2 (en) | 2013-09-20 | 2023-10-04 | National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition | Complex containing oligonucleotide having immunopotentiating activity and use thereof |
| KR20160055863A (en) | 2013-09-20 | 2016-05-18 | 고쿠리츠 켄큐 카이하츠 호진 이야쿠 키반 켄코 에이요 켄큐쇼 | Complex containing oligonucleotide having immunopotentiating activity and use thereof |
| CN114652739A (en) * | 2013-09-20 | 2022-06-24 | 国立研究开发法人医疗基盘健康荣养研究所 | Complexes comprising oligonucleotides with immunopotentiating activity and uses thereof |
| KR20220068276A (en) | 2013-09-20 | 2022-05-25 | 고쿠리츠 켄큐 카이하츠 호진 이야쿠 키반 켄코 에이요 켄큐쇼 | Complex containing oligonucleotide having immunopotentiating activity and use thereof |
| WO2015041318A1 (en) | 2013-09-20 | 2015-03-26 | 独立行政法人医薬基盤研究所 | Complex containing oligonucleotide having immunopotentiating activity and use thereof |
| US11015202B2 (en) | 2013-09-20 | 2021-05-25 | National Institutes Of Biomedical Innovation, Health And Nutrition | Complex containing oligonucleotide having immunopotentiating activity and use thereof |
| EP3572511A1 (en) | 2013-09-20 | 2019-11-27 | National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition | Complex containing oligonucleotide having immunopotentiating activity and use thereof |
| JPWO2015118789A1 (en) * | 2014-02-06 | 2017-03-23 | 国立研究開発法人科学技術振興機構 | Peptide / β-1,3-glucan complex, method for producing the same, and pharmaceutical composition containing the same |
| US10195270B2 (en) | 2014-02-06 | 2019-02-05 | Japan Science And Technology Agency | Peptide/β-1,3-glucan complex and production method thereof and pharmaceutical composition containing peptide/β-1,3-glucan complex |
| EP3103807A4 (en) * | 2014-02-06 | 2017-02-01 | Japan Science And Technology Agency | Peptide/ -1,3-glucan complex and production method therefor, and pharmaceutical composition containing peptide/ -1,3-glucan complex |
| WO2015118789A1 (en) * | 2014-02-06 | 2015-08-13 | 独立行政法人科学技術振興機構 | PEPTIDE/β-1,3-GLUCAN COMPLEX AND PRODUCTION METHOD THEREFOR, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING PEPTIDE/β-1,3-GLUCAN COMPLEX |
| WO2016152767A1 (en) * | 2015-03-20 | 2016-09-29 | 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 | CpG SPACER-OLIGONUCLEOTIDE-CONTAINING COMPLEX HAVING IMMUNOPOTENTIATING ACTIVITY, AND USE OF SAME |
| JPWO2017217531A1 (en) * | 2016-06-16 | 2019-04-04 | ナパジェン ファーマ, インコーポレテッドNapaJen Pharma, Inc. | Nucleic acid and antigen peptide conjugates |
| WO2017217531A1 (en) * | 2016-06-16 | 2017-12-21 | ナパジェン ファーマ，インコーポレテッド | Nucleic acid-antigen peptide conjugate |
| WO2018180819A1 (en) * | 2017-03-30 | 2018-10-04 | 公立大学法人北九州市立大学 | Immunity-inducing agent and pharmaceutical composition containing same |
| US11793874B2 (en) | 2017-03-30 | 2023-10-24 | The University Of Kitakyushu | Immunity-inducing agent and pharmaceutical composition containing same |
| CN108295049A (en) * | 2018-02-12 | 2018-07-20 | 中山大学 | A kind of water-soluble amination β -1,3-D- glucan nano-particles of Antigen and its preparation method and application |
| WO2020067400A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | 公立大学法人北九州市立大学 | Immune inducer comprising antigen peptide-adjuvant nucleotide conjugate and pharmaceutical composition comprising same |
| KR20210069651A (en) | 2018-09-28 | 2021-06-11 | 더 유니버시티 오브 키타큐슈 | Immune inducing agent comprising antigen peptide-adjuvant nucleotide conjugate and pharmaceutical composition comprising same |
| KR20230107833A (en) | 2020-11-12 | 2023-07-18 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | Complex of beta glucan and nucleic acid with controlled particle diameter |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5035808B2 (en) | 2012-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5035808B2 (en) | Method for producing ternary composite | |
| JP7366541B2 (en) | Nucleic acid carriers and therapeutic uses | |
| TWI696630B (en) | Complex containing oligonucleotide with immunological activation activity and use thereof | |
| TWI612970B (en) | Peptide/beta-1,3-glucan composite, method for producing the same and pharmaceutical composition containing the same | |
| JP4064108B2 (en) | Gene carrier | |
| JP4850512B2 (en) | Immunostimulant | |
| JP2019513692A (en) | Nucleic acid carriers and therapeutic uses | |
| JP2008100919A (en) | Nucleic acid/polysaccharide complex useful for preventing th2 cell-associated disease | |
| WO2002072152A1 (en) | Gene carriers with the use of polysaccharide and process for producing the same | |
| WO2016152767A1 (en) | CpG SPACER-OLIGONUCLEOTIDE-CONTAINING COMPLEX HAVING IMMUNOPOTENTIATING ACTIVITY, AND USE OF SAME | |
| JP6501247B2 (en) | Immunostimulatory polynucleotide / schizophyllan complex and pharmaceutical composition containing the same | |
| US20240075132A1 (en) | Immunity-inducing agent and pharmaceutical composition containing same | |
| Xu et al. | Single-helical formyl β-glucan effectively deliver CpG DNA with poly (dA) to macrophages for enhanced vaccine effects | |
| US20220193210A1 (en) | Therapeutics for autoimmune kidney disease: synthetic antigens | |
| EP2594592A1 (en) | (nucleic acid)-polysaccharide complex | |
| WO2021132528A1 (en) | Short-chain cpg-containing oligodeoxynucleotide with linked polydeoxyadenylic acid, complex containing said oligodeoxynucleotide, and use thereof | |
| Jin et al. | Preparation of a water soluble aminated β‐1, 3‐D‐glucan for gene carrier: The in vitro study of the anti‐inflammatory activity and transfection efficiency | |
| CA3213390A1 (en) | Polysaccharide adjuvants for virus vaccines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120329 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120528 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120619 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120626 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150713 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5035808 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |