JP2010168368A - Use of psma7, nedd1, and rae1 gene expression inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の用途、すなわちガン細胞増殖抑制剤、このガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤、およびＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の使用方法に関する。 The present invention relates to uses of PSMA7, NEDD1 and RAE1 gene expression inhibitors, that is, cancer cell proliferation inhibitors, anticancer agents containing the cancer cell proliferation inhibitors, and methods of using PSMA7, NEDD1 and RAE1 gene expression inhibitors.
ＰＳＭＡ７は巨大な酵素複合体であるプロテアソーム（proteasome）を構成する複数のタンパク質の１つである。プロテアソームは、非常に規則正しい環の形の２０Ｓコア構造をもち、そのコア構造は２８個の非同一サブユニットの４つの環で構成されており（２つの環は７個のαサブユニット、もう２つの環は７個のβサブユニットで構成される）、ＰＳＭＡ７はαサブユニットを構成する複数のタンパク質の１つである。プロテアソームは真核細胞中に高濃度で分布し、非リソソーム経路のＡＴＰ／ユビキチン依存過程でペプチドを切断する（非特許文献１）。２０Ｓコアのαサブユニットは、ウイルスの複製に重要なタンパク質であるＢ型肝炎ウイルスＸタンパク質と特異的に相互作用することが示されている。また、このαサブユニットは、酸素分圧への細胞応答に重要な転写因子である、ＨＩＦ−１αの調節にも関与している。 PSMA7 is one of a plurality of proteins constituting a proteasome, which is a huge enzyme complex. The proteasome has a 20S core structure in the form of a very regular ring, which is composed of 4 rings of 28 non-identical subunits (2 rings are 7 α subunits, 2 more One ring is composed of seven β subunits), and PSMA7 is one of a plurality of proteins constituting the α subunit. Proteasomes are distributed at high concentrations in eukaryotic cells and cleave peptides in an ATP / ubiquitin-dependent process of the non-lysosomal pathway (Non-patent Document 1). The 20S core alpha subunit has been shown to interact specifically with the hepatitis B virus X protein, a protein important for viral replication. The α subunit is also involved in the regulation of HIF-1α, a transcription factor important for cellular responses to oxygen partial pressure.
ＮＥＤＤ１はマウスの中枢神経系において個体の発生に係わる遺伝子として同定された。多くの生物種でＮＥＤＤ１は存在し、動物種間の相同性が高いことが知られている。ヒトにおいてはＮＥＤＤ１が細胞の中心体（centrosome）や紡錘体（mitotic spindle）に存在することが最近明らかになり、中心体（centrosome）や紡錘体（mitotic spindle）におけるγ−チューブリン環状複合体（gamma-tubulin ring complex）を形成する因子の１つではないかと推測されている。実際、ＮＥＤＤ１の消去により微小管の核形成（microtubule nucleation）や紡錘体の集合（spindle assembly）過程に異常が生じること、また、細胞分裂中のＮＥＤＤ１のリン酸化がγ−チューブリンとの結合を介した紡錘体形成（targeting gamma-tubulin to the spindle）に重要であることなどが報告されている（非特許文献２）。 NEDD1 was identified as a gene involved in individual development in the central nervous system of mice. NEDD1 exists in many biological species and is known to have high homology among animal species. In humans, NEDD1 has recently been found to be present in the centrosome and mitotic spindle of cells, and the γ-tubulin cyclic complex in the centrosome and mitotic spindle ( It is speculated that it may be one of the factors forming a gamma-tubulin ring complex. In fact, elimination of NEDD1 causes abnormalities in the microtubule nucleation and spindle assembly processes, and phosphorylation of NEDD1 during cell division causes binding to γ-tubulin. It is reported that it is important for targeting gamma-tubulin to the spindle (Non-patent Document 2).
ＲＡＥ１（RNA export 1 homolog）は、核質、nuclear rim、および細胞質を貫通する網様構造に、それぞれ集中して（distinct foci in the nucleoplasm, to the nuclear rim, and to meshwork-like structures throughout the cytoplasm）存在しており、ＲＮＡの輸送に係わっていることが示唆されている。さらに、ＲＡＥ１ノックアウトマウスについては、体節形成前に胚性致死となること、細胞周期チェックポイントの異常が生じることが知られている。 RAE1 (RNA export 1 homolog) concentrates on the network structure that penetrates the nucleus, nuclear rim, and cytoplasm (distinct foci in the nucleoplasm, to the nuclear rim, and to meshwork-like structures throughout the cytoplasm). ) And is implicated in RNA transport. Furthermore, it is known that RAE1 knockout mice are embryonic lethal before somite formation and that cell cycle checkpoints are abnormal.
ところで、ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１およびＲＡＥ１遺伝子のそれぞれとヒトを含むほ乳類の病気との関係は知られていない。 By the way, the relationship between each of the PSMA7, NEDD1 and RAE1 genes and diseases of mammals including humans is not known.
そこで、本発明者等は、ガン細胞において高発現している遺伝子の発現抑制が、ガン細胞の増殖に及ぼす影響を調べたところ、特定の遺伝子の発現抑制を行うことで、ガン細胞の増殖を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。 Therefore, the present inventors investigated the influence of the suppression of the expression of a gene highly expressed in cancer cells on the proliferation of cancer cells. By suppressing the expression of a specific gene, the present inventors increased the proliferation of cancer cells. As a result, the inventors have found that the present invention has been suppressed.
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２１）を提供する。
（１）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤のいずれか一つを含むガン細胞増殖抑制剤。
（２）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤を含有する（１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（３）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである（２）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（４）ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである（３）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（５）二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(a)〜(d)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、（４）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(a)配列番号１に記載の塩基配列、
(b)配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(c)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(d)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
（６）二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである（５）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（７）ガンが大腸ガン又は食道ガンである（２）〜（６）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（８）ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤を含有する（１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（９）ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである（８）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１０）ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである（９）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１１）二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(e)〜(h)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、（１０）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(e)配列番号３に記載の塩基配列、
(f)配列番号３に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(g)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(h)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
（１２）二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである（１１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１３）ガンが胃ガンである（８）〜（１２）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１４）ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を含有する（１）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１５）ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドである（１４）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１６）ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドである（１５）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１７）二本鎖ポリヌクレオチドのうち１本が下記(i)〜(l)から選択されるいずれか１つの塩基配列における、連続する１５〜３３塩基長の塩基配列のポリヌクレオチドを干渉配列の相補鎖として含む、（１６）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
(i)配列番号５に記載の塩基配列、
(j)配列番号５に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(k)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(l)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
（１８）二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡである（１７）に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（１９）ガンが食道ガンである（１４）〜（１８）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤。
（２０）（１）から（１９）のいずれか一項に記載のガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤。
（２１）ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法。
That is, the present invention provides the following (1) to (21).
(1) A cancer cell growth inhibitor comprising any one of a PSMA7 gene expression inhibitor, a NEDD1 gene expression inhibitor, and a RAE1 gene expression inhibitor.
(2) The cancer cell proliferation inhibitor according to (1), which contains a PSMA7 gene expression inhibitor.
(3) The cancer cell proliferation inhibitor according to (2), wherein the PSMA7 gene expression inhibitor is a polynucleotide.
(4) The cancer cell proliferation inhibitor according to (3), wherein the polynucleotide is a double-stranded polynucleotide.
(5) One of the double-stranded polynucleotides is a polynucleotide having a base sequence length of 15 to 33 bases in any one base sequence selected from the following (a) to (d): The cancer cell proliferation inhibitor according to (4), which is contained as a complementary strand.
(a) the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(c) a base sequence comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2,
(d) a base comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or mutated by a combination thereof; An array.
(6) The cancer cell proliferation inhibitor according to (5), wherein the double-stranded polynucleotide is double-stranded RNA.
(7) The cancer cell proliferation inhibitor according to any one of (2) to (6), wherein the cancer is colon cancer or esophageal cancer.
(8) The cancer cell proliferation inhibitor according to (1), which contains a NEDD1 gene expression inhibitor.
(9) The cancer cell proliferation inhibitor according to (8), wherein the NEDD1 gene expression inhibitor is a polynucleotide.
(10) The cancer cell proliferation inhibitor according to (9), wherein the polynucleotide is a double-stranded polynucleotide.
(11) One of the double-stranded polynucleotides is a polynucleotide having a base sequence length of 15 to 33 bases in any one base sequence selected from the following (e) to (h): The cancer cell growth inhibitor according to (10), which is contained as a complementary strand.
(e) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3,
(f) a base sequence having 90% or more homology with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
(g) a nucleotide sequence consisting of a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4,
(h) a base comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or mutated by a combination thereof; An array.
(12) The cancer cell proliferation inhibitor according to (11), wherein the double-stranded polynucleotide is double-stranded RNA.
(13) The cancer cell proliferation inhibitor according to any one of (8) to (12), wherein the cancer is gastric cancer.
(14) The cancer cell proliferation inhibitor according to (1), which comprises an RAE1 gene expression inhibitor.
(15) The cancer cell proliferation inhibitor according to (14), wherein the RAE1 gene expression inhibitor is a polynucleotide.
(16) The cancer cell proliferation inhibitor according to (15), wherein the polynucleotide is a double-stranded polynucleotide.
(17) One of the double-stranded polynucleotides is a polynucleotide having a base sequence length of 15 to 33 bases in any one base sequence selected from the following (i) to (l): The cancer cell proliferation inhibitor according to (16), which is contained as a complementary strand.
(i) the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5,
(j) a base sequence having 90% or more homology to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5;
(k) a base sequence comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6,
(l) a base comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or mutated by a combination thereof; An array.
(18) The cancer cell proliferation inhibitor according to (17), wherein the double-stranded polynucleotide is double-stranded RNA.
(19) The cancer cell proliferation inhibitor according to any one of (14) to (18), wherein the cancer is esophageal cancer.
(20) An anticancer agent comprising the cancer cell proliferation inhibitor according to any one of (1) to (19).
(21) A method of using a PSMA7 gene expression inhibitor, a NEDD1 gene expression inhibitor or a RAE1 gene expression inhibitor as an anticancer agent.
本発明によれば、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の新規用途が提供される。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel use of a PSMA7 gene expression inhibitor, a NEDD1 gene expression inhibitor, and a RAE1 gene expression inhibitor is provided.
以下、本発明の実施形態について説明する。
「ストリンジェントな条件」としては、例えば「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，５０℃」、「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」、「１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」、「０．５×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」、「０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」等の条件が挙げられる。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
Examples of “stringent conditions” include “2 × SSC, 0.1% SDS, 50 ° C.”, “2 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, “1 × SSC, 0.1% SDS. 37 ° C. ”, more stringent conditions include, for example,“ 2 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C. ”,“ 0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C. ”,“ 0.2 XSSC, 0.1% SDS, 65 ° C. ”.
塩基配列について「相同性」とは、比較される配列間において、各々の下位列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。このときギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される。相同性の計算には、市販のソフトであるＢＬＡＳＴ（Altschul, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）、ＦＡＳＴＡ（Peasron, Methods in Enzymology 183:63-69 (1990)）等を用いることができる。相同性の数値は、例えば全米バイオテクノロジー（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ (Basic local alignment search tool、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において算出することができる。本発明における相同性を有するポリヌクレオチドとしては、具体的には配列番号１（または３または５）で示される塩基配列のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。 “Homology” with respect to base sequences is used to mean the degree of coincidence of amino acid residues constituting each subsequence between sequences to be compared. At this time, the existence of gaps and the nature of amino acids are considered. For the calculation of homology, commercially available software such as BLAST (Altschul, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Peasron, Methods in Enzymology 183: 63-69 (1990)) and the like are used. Can be used. The numerical value of homology can be calculated, for example, by the National Biotechnology (NCBI) homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Specifically, the polynucleotide having homology in the present invention is at least 90% or more, more preferably 97% or more, more preferably 99% or more with the polynucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (or 3 or 5). A polynucleotide having a homology of at least%.
「ＰＳＭＡ７（またはＮＥＤＤ１またはＲＡＥ１）遺伝子の発現を抑制する」とは、ＰＳＭＡ７（またはＮＥＤＤ１またはＲＡＥ１）のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現量を少なくとも１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上低下させることを意味する。特定遺伝子の発現を抑制するメカニズムは、詳細には一つには特定されないが、例えば転写開始抑制、mRNAの伸長抑制、mRNAの分解、翻訳抑制などが挙げられる。 “Suppressing the expression of PSMA7 (or NEDD1 or RAE1) gene” means that the expression level of mRNA and / or protein of PSMA7 (or NEDD1 or RAE1) is at least 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50 It means to reduce more than%. The mechanism that suppresses the expression of a specific gene is not specified in detail, and examples thereof include suppression of transcription initiation, suppression of mRNA elongation, degradation of mRNA, and suppression of translation.
「ＰＳＭＡ７（またはＮＥＤＤ１またはＲＡＥ１）遺伝子の発現を抑制する物質」とは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡ、非ペプチド性化合物、合成化合物などが挙げられる。より好ましくはポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは二本鎖ＲＮＡである。 Examples of the “substance that suppresses the expression of PSMA7 (or NEDD1 or RAE1) gene” include antisense oligonucleotides, ribozymes, double-stranded RNA, non-peptide compounds, synthetic compounds, and the like. More preferred is a polynucleotide, and even more preferred is a double-stranded RNA.
本発明における「二本鎖ＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉を起こしてｍＲＮＡを分解することにより、ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１又はＲＡＥ１遺伝子の発現を抑制するものである。ＰＳＭＡ７、ＮＥＤＤ１又はＲＡＥ１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡは、それぞれの遺伝子に対して完全に相補的である必要はなく、それぞれの発現を効果的に抑制できるものであればよい。「効果的に抑制」とは、未処置またはコントロール配列の二本鎖ＲＮＡを加えた細胞におけるそれぞれの遺伝子の発現量に対して、それぞれの遺伝に対する二本鎖ＲＮＡを加えた細胞におけるそれぞれの遺伝子の発現量が、少なくとも１０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは７０％以上、抑制されるものをいう。また、「効果的に抑制」されるかぎり、ＲＮＡ鎖の一部が修飾されていてもよい。
また、本発明における「干渉配列」とは、標的ＲＮＡと実際に結合して当該標的ＲＮＡの機能を抑制する機能を有する配列をいう。干渉配列およびその相補的な配列は、その両端または一端に干渉配列を保護するための保護配列を有していてもよい。保護配列としては、たとえばdTdT,dUdU等があげられる。
The “double-stranded RNA” in the present invention suppresses the expression of the PSMA7, NEDD1 or RAE1 gene by causing RNA interference and degrading mRNA. The double-stranded RNA for the PSMA7, NEDD1 or RAE1 gene does not need to be completely complementary to the respective gene, and may be any one that can effectively suppress each expression. “Effective suppression” refers to the expression level of each gene in a cell to which double-stranded RNA of an untreated or control sequence is added, and the respective gene in a cell to which double-stranded RNA for each inheritance is added. Is expressed at least 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 70% or more. Further, as long as “effectively suppressed”, part of the RNA strand may be modified.
Further, the “interference sequence” in the present invention refers to a sequence having a function of actually binding to a target RNA and suppressing the function of the target RNA. The interference sequence and its complementary sequence may have a protective sequence for protecting the interference sequence at both ends or one end thereof. Examples of the protective sequence include dTdT, dUdU and the like.
このような二本鎖ＲＮＡは、化学的に合成することができ、例えばＤＮＡ化学合成でも使用されるホスホアミダイト法により、３'末端から５'末端に向かって一塩基ずつ順番に縮合反応させることにより得られる。ただし、合成過程でＲＮａｓｅによる分解を防ぐために、個々のリボヌクレオチドの２'末端の水酸基を保護して行う。この保護基としては、2'-O-t-butyldimethylsilyl（2'-tBDMS）基、2'-O-triisopropylsilyloxymethyl（2'-TOM）基、5'-silyl-2'-acetoxyethoxy（2'-ACE）基などが挙げられる。 Such double-stranded RNA can be chemically synthesized. For example, by a phosphoramidite method, which is also used in DNA chemical synthesis, a condensation reaction is performed in order from the 3 ′ end to the 5 ′ end, one base at a time. Is obtained. However, in order to prevent degradation by RNase during the synthesis process, the hydroxyl group at the 2 ′ end of each ribonucleotide is protected. This protecting group includes 2'-Ot-butyldimethylsilyl (2'-tBDMS) group, 2'-O-triisopropylsilyloxymethyl (2'-TOM) group, 5'-silyl-2'-acetoxyethoxy (2'-ACE) group Etc.
また、遺伝子の発現抑制は、二本鎖ＲＮＡによるＲＮＡ干渉により生じることが考えられる。ここで、ＲＮＡ干渉とは、低分子のnon-coding二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子により配列特異的に遺伝子発現を抑制する現象をいい、例えばｓｉ（small interfering）ＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの切断、ｓｉＲＮＡによる標的ＤＮＡ領域のヘテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシング、ｍｉ（micro）ＲＮＡによる翻訳抑制、転写抑制、ｍＲＮＡの分解等を指す。 In addition, gene expression suppression may be caused by RNA interference by double-stranded RNA. Here, RNA interference refers to a phenomenon in which gene expression is suppressed in a sequence-specific manner by a low-molecular non-coding double-stranded (ds) RNA molecule. For example, cleavage of a target mRNA by si (small interfering) RNA, siRNA Refers to gene silencing through heterochromatinization of target DNA region by miRNA, translational suppression by mi (micro) RNA, transcriptional suppression, mRNA degradation, and the like.
従来より、ｍＲＮＡに作用し、遺伝子発現を抑制する方法として、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖を結合させ、タンパク質への翻訳を阻害するアンチセンス法が知られているが、人工アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの高次構造の影響により標的部位に有効に結合できない場合があるため活性が弱いという問題点があった。 Conventionally, as a method of acting on mRNA and suppressing gene expression, an antisense method is known in which an antisense strand complementary to mRNA is bound to inhibit translation into a protein. However, there is a problem that the activity is weak because it may not be able to bind effectively to the target site due to the influence of the higher order structure of mRNA.
一方、二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉の場合には、ｍＲＮＡの高次構造に無関係に作用することで、ｍＲＮＡの局所的な構造に依存して活性が弱くなるという問題が低減される。 On the other hand, in the case of RNA interference using double-stranded RNA, the problem that the activity becomes weak depending on the local structure of mRNA is reduced by acting independently of the higher order structure of mRNA.
（ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤）
ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤は、ＰＳＭＡ７遺伝子の発現を抑制する物質であり、ＰＳＭＡ７の生成を抑制する。
このようなＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
(PSMA7 gene expression inhibitor)
The PSMA7 gene expression inhibitor is a substance that suppresses the expression of the PSMA7 gene and suppresses the production of PSMA7.
Such a PSMA7 gene expression inhibitor is a polynucleotide, preferably a double-stranded RNA.
ここで、「ＰＳＭＡ７」とは、配列番号２（GenBankアクセッション番号：NP_002783.1）で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。 Here, “PSMA7” is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (GenBank accession number: NP — 002783.1).
「配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつＰＳＭＡ７と実質的に同じ機能を有するポリペプチドが挙げられる。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、配列番号２の全アミノ酸配列中の１〜９個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。 “Polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” includes one or more amino acids deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence mutated by a combination thereof and having substantially the same function as PSMA7. The number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is 1 to 9, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 1 in the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Two.
また、ＰＳＭＡ７には配列番号１（GenBankアクセッション番号：NM_002792.2）に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質も含まれる。「配列番号１で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ、実質的に同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。 PSMA7 also includes a protein encoded by a polynucleotide having the same or substantially the same base sequence as that described in SEQ ID NO: 1 (GenBank accession number: NM_002792.2). As the “base sequence substantially the same as the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,” the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more. And a base sequence encoding a protein having substantially the same function.
ＰＳＭＡ７に対する二本鎖ＲＮＡは、例えばAmbion website (http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)のコンピュータープログラムを用いて設計することが可能である。好ましくは以下の(a)〜(d)から選択されるいずれか１つの塩基配列において連続する塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。当該塩基配列の長さの下限は、好ましくは１５塩基長、より好ましくは１８塩基長、さらに好ましくは２０塩基長であり、上限は、好ましくは３３塩基長、より好ましくは２７塩基長、さらに好ましくは２３塩基長である。 Double-stranded RNA for PSMA7 can be designed using a computer program of Ambion website (http: ///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html), for example. Preferable examples include polynucleotides containing a continuous base sequence in any one base sequence selected from the following (a) to (d). The lower limit of the length of the base sequence is preferably 15 bases, more preferably 18 bases, and even more preferably 20 bases, and the upper limit is preferably 33 bases, more preferably 27 bases, more preferably Is 23 bases long.
(a)配列番号１に記載の塩基配列、
(b)配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(c)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(d)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
(a) the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(c) a base sequence comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2,
(d) a base comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or mutated by a combination thereof; An array.
（ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤）
ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤は、ＮＥＤＤ１遺伝子の発現を抑制する物質であり、ＮＥＤＤ１の生成を抑制する。
このようなＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
(NEDD1 gene expression inhibitor)
The NEDD1 gene expression inhibitor is a substance that suppresses the expression of the NEDD1 gene and suppresses the generation of NEDD1.
Such NEDD1 gene expression inhibitor is a polynucleotide, preferably a double-stranded RNA.
ここで、ＮＥＤＤ１とは、配列番号４（GenBankアクセッション番号：NP_690869.1）で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。 Here, NEDD1 is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (GenBank accession number: NP — 690869.1).
「配列番号４で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつＮＥＤＤ１と実質的に同じ機能を有するポリペプチドが挙げられる。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、配列番号４の全アミノ酸配列中の１〜９個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。 “Polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4” includes one or more amino acids deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence mutated by a combination thereof and having substantially the same function as NEDD1. The number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is 1 to 9, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and more preferably 1 to 1 in the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Two.
また、ＮＥＤＤ１には配列番号３（GenBankアクセッション番号：NM_152905.2）に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質も含まれる。「配列番号３で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、配列番号３で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ、実質的に同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。 NEDD1 also includes a protein encoded by a polynucleotide having the same or substantially the same base sequence as that shown in SEQ ID NO: 3 (GenBank accession number: NM — 152905.2). The “base sequence substantially the same as the base sequence represented by SEQ ID NO: 3” has a homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. And a base sequence encoding a protein having substantially the same function.
ＮＥＤＤ１に対する二本鎖ＲＮＡは、例えばAmbion website (http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)のコンピュータープログラムを用いて設計することが可能である。好ましくは以下の(e)〜(h)から選択されるいずれか１つの塩基配列において連続する塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。当該塩基配列の長さの下限は、好ましくは１５塩基長、より好ましくは１８塩基長、さらに好ましくは２０塩基長であり、上限は、好ましくは３３塩基長、より好ましくは２７塩基長、さらに好ましくは２３塩基長である。 Double-stranded RNA against NEDD1 can be designed using, for example, a computer program of Ambion website (http: ///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). Preferable examples include polynucleotides containing a continuous base sequence in any one base sequence selected from the following (e) to (h). The lower limit of the length of the base sequence is preferably 15 bases, more preferably 18 bases, and even more preferably 20 bases, and the upper limit is preferably 33 bases, more preferably 27 bases, more preferably Is 23 bases long.
(e)配列番号３に記載の塩基配列、
(f)配列番号３に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(g)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(h)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
(e) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3,
(f) a base sequence having 90% or more homology with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
(g) a nucleotide sequence consisting of a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4,
(h) a base comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or mutated by a combination thereof; An array.
（ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤）
ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤は、ＲＡＥ１遺伝子の発現を抑制する物質であり、ＲＡＥ１の生成を抑制する。
このようなＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤がポリヌクレオチドであり、好ましくは二本鎖ＲＮＡである。
(RAE1 gene expression inhibitor)
The RAE1 gene expression inhibitor is a substance that suppresses the expression of the RAE1 gene, and suppresses the production of RAE1.
Such an RAE1 gene expression inhibitor is a polynucleotide, preferably a double-stranded RNA.
ここで、ＲＡＥ１とは、配列番号６（GenBankアクセッション番号：NP_001015885.1）で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。 Here, RAE1 is a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (GenBank accession number: NP_001015885.1).
「配列番号６で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」としては、配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列を含み、かつＲＡＥ１と実質的に同じ機能を有するポリペプチドが挙げられる。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、配列番号６の全アミノ酸配列中の１〜９個、好ましくは、１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。 “Polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6” includes one or more amino acids deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. Or a polypeptide having an amino acid sequence mutated by a combination thereof and having substantially the same function as RAE1. The number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is 1 to 9, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and more preferably 1 to 1 in the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. Two.
また、ＲＡＥ１には配列番号５（GenBankアクセッション番号：NM_001015885.1）に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質も含まれる。「配列番号５で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列」としては、配列番号５で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ、実質的に同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列が挙げられる。 RAE1 also includes a protein encoded by a polynucleotide having the same or substantially the same base sequence as SEQ ID NO: 5 (GenBank accession number: NM_001015885.1). The “base sequence substantially the same as the base sequence represented by SEQ ID NO: 5” refers to a homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. And a base sequence encoding a protein having substantially the same function.
ＲＡＥ１に対する二本鎖ＲＮＡは、例えばAmbion website (http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)のコンピュータープログラムを用いて設計することが可能である。好ましくは以下の(i)〜(l)から選択されるいずれか１つの塩基配列において連続する塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。当該塩基配列の長さの下限は、好ましくは１５塩基長、より好ましくは１８塩基長、さらに好ましくは２０塩基長であり、上限は、好ましくは３３塩基長、より好ましくは２７塩基長、さらに好ましくは２３塩基長である。 Double-stranded RNA for RAE1 can be designed using a computer program of Ambion website (http: ///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html), for example. Preferable examples include polynucleotides containing a continuous base sequence in any one base sequence selected from the following (i) to (l). The lower limit of the length of the base sequence is preferably 15 bases, more preferably 18 bases, and even more preferably 20 bases, and the upper limit is preferably 33 bases, more preferably 27 bases, more preferably Is 23 bases long.
(i)配列番号５に記載の塩基配列、
(j)配列番号５に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(k)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(l)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。
(i) the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5,
(j) a base sequence having 90% or more homology to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5;
(k) a base sequence comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6,
(l) a base comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or mutated by a combination thereof; An array.
（ガン細胞増殖抑制剤）
本発明のガン細胞増殖抑制剤は、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤のいずれか一つを含むものである。なお、ガン細胞増殖抑制により、ガン細胞数の減少、他の臓器へのガンの転移の防止などの効果が期待される。
(Cancer growth inhibitor)
The cancer cell proliferation inhibitor of the present invention comprises any one of a PSMA7 gene expression inhibitor, a NEDD1 gene expression inhibitor, and an RAE1 gene expression inhibitor. In addition, suppression of cancer cell proliferation is expected to have effects such as a reduction in the number of cancer cells and prevention of cancer metastasis to other organs.
ここでいうガンとは、大腸ガン、胃ガン、食道ガン、乳ガン、子宮ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、精巣ガン、小腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、舌ガン、脳腫瘍、喉頭ガン、卵巣ガン、急性白血病、慢性白血病、リンパ腫等が含まれる。ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤を含有する抗ガン剤としては、好ましくは大腸ガン、胃ガン、食道ガン、乳ガン、子宮ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、精巣ガン、小腸ガンに作用するものであり、より好ましくは大腸ガン、食道ガンに作用するものであり、さらに好ましくは大腸ガンに作用するものである。ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤を含有する抗ガン剤としては、好ましくは胃ガンに作用するものである。ＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を含有する抗ガン剤としては、好ましくは食道ガンに作用するものである。 Cancer here refers to colon cancer, stomach cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, thyroid cancer, liver cancer, bladder cancer, kidney cancer, ovarian cancer, testicular cancer, small intestine cancer, lung cancer, prostate cancer, pancreatic cancer Tongue cancer, brain tumor, laryngeal cancer, ovarian cancer, acute leukemia, chronic leukemia, lymphoma and the like. As an anticancer agent containing a PSMA7 gene expression inhibitor, colon cancer, stomach cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, thyroid cancer, liver cancer, bladder cancer, kidney cancer, ovarian cancer, testicular cancer, small intestine cancer More preferably, it acts on colon cancer and esophageal cancer, and more preferably it acts on colon cancer. The anticancer agent containing a NEDD1 gene expression inhibitor preferably acts on gastric cancer. The anticancer agent containing an RAE1 gene expression inhibitor preferably acts on esophageal cancer.
（遺伝子発現抑制剤の用途）
別の観点から、本発明は、前述したＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤およびＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の用途を提供する。
例えば、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤は、必要に応じてアテロコラーゲンとともに、ガン患者に投与され、ガン化された細胞のアポトーシスを促進させる抗ガン剤として用いることができる。なお、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の細胞への作用はアポトーシスの促進に限られるものではなく、最終的に細胞死を誘発したり、細胞増殖を抑制することができれば、ガン細胞増殖抑制剤として有用である。ここで、アテロコラーゲンとは、酵素可溶化コラーゲンおよびその修飾物のことをいい、例えばＷＯ０１／０９７８５７に記載されている。
(Use of gene expression inhibitor)
From another viewpoint, the present invention provides the use of the PSMA7 gene expression inhibitor, NEDD1 gene expression inhibitor and RAE1 gene expression inhibitor described above.
For example, a PSMA7 gene expression inhibitor, NEDD1 gene expression inhibitor or RAE1 gene expression inhibitor is administered to a cancer patient together with atelocollagen as necessary, and used as an anticancer agent that promotes apoptosis of cancerous cells. Can do. The action of PSMA7 gene expression inhibitor, NEDD1 gene expression inhibitor or RAE1 gene expression inhibitor on cells is not limited to the promotion of apoptosis, but ultimately induces cell death or suppresses cell proliferation. If possible, it is useful as a cancer cell growth inhibitor. Here, atelocollagen refers to enzyme-solubilized collagen and modified products thereof, and is described, for example, in WO01 / 0978857.
すなわち、本発明は、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の抗ガン剤としての使用方法を提供する。また、さらなる観点から、本発明は、前述したガン細胞増殖抑制剤を含む抗ガン剤を提供する。 That is, the present invention provides a method for using a PSMA7 gene expression inhibitor, a NEDD1 gene expression inhibitor, or a RAE1 gene expression inhibitor as an anticancer agent. From a further viewpoint, the present invention provides an anticancer agent comprising the aforementioned cancer cell proliferation inhibitor.
このような用途において、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤の使用量は、投与方法、腫瘍の種類、大きさによって異なるが、例えばＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤については局所投与では１ｎｍｏｌ／ｋｇ以上１０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下、全身投与では２ｎｍｏｌ／ｋｇ以上５０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下が望ましい。また、アテロコラーゲンと併用する場合には、このアテロコラーゲンの濃度は例えば局所投与では０．１ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以上３０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以下、全身投与では１ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以上５０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖｏｌ）以下が望ましく、その使用量はＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤との混合後、局所投与で５ｍｌ以上１００ｍｌ以下、全身投与で１０ｍｌ以上５００ｍｌ以下が望ましい。 In such applications, the amount of PSMA7 gene expression inhibitor, NEDD1 gene expression inhibitor, or RAE1 gene expression inhibitor varies depending on the administration method, tumor type, and size. For example, PSMA7 gene expression inhibitor, NEDD1 gene The expression inhibitor or RAE1 gene expression inhibitor is preferably 1 nmol / kg or more and 10 nmol / kg or less for local administration and 2 nmol / kg or more and 50 nmol / kg or less for systemic administration. When used together with atelocollagen, the concentration of atelocollagen is, for example, 0.1 mg / ml (w / vol) or more and 30 mg / ml (w / vol) or less for local administration, and 1 mg / ml (w / vol) for systemic administration. ) 50 mg / ml (w / vol) or less is desirable, and the amount used is 5 ml to 100 ml, systemically administered by local administration after mixing with PSMA7 gene expression inhibitor, NEDD1 gene expression inhibitor or RAE1 gene expression inhibitor In this case, 10 ml to 500 ml is desirable.
このような用途によれば、ＰＳＭＡ７遺伝子発現抑制剤、ＮＥＤＤ１遺伝子発現抑制剤またはＲＡＥ１遺伝子発現抑制剤を、ガン化細胞のアポトーシスを促進させる等の機序で細胞死を誘発させ、又は細胞増殖を抑制させることにより、結果としてガンの治療を行うことが可能になる。 According to such an application, PSMA7 gene expression inhibitor, NEDD1 gene expression inhibitor or RAE1 gene expression inhibitor is used to induce cell death or promote cell proliferation by a mechanism such as promoting apoptosis of cancerous cells. As a result, it becomes possible to treat cancer.
以下に、本発明を試験例に基づいて説明するが、本発明はこれら試験例に限定されることはない。
（試験例１）大腸ガン細胞の増殖抑制試験
大腸ガン組織で高発現している９７遺伝子（以下の表）に対するｓｉＲＮＡを大腸ガン細胞に導入し、各遺伝子の発現抑制が細胞のアポトーシス誘導に及ぼす影響を調べた。
Hereinafter, the present invention will be described based on test examples, but the present invention is not limited to these test examples.
(Test Example 1) Growth inhibition test of colon cancer cells siRNAs against 97 genes (table below) that are highly expressed in colorectal cancer tissues are introduced into colon cancer cells, and the suppression of the expression of each gene affects the apoptosis of the cells. The effect was investigated.
（１）アテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイの作製
以下のようにして、ｓｉＲＮＡおよびアテロコラーゲンの混合物を、９６穴マイクロプレートにコーティングし、ｓｉＲＮＡをリバーストランスフェクションできるアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを作製した。
すなわち、アテロコラーゲン（ＰＢＳ中で１６０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）とｓｉＲＮＡ希釈液（ＰＢＳ中で０．４ｍＭ）を１：１の割合で混合、４℃で２０分間、転倒混和し、ｓｉＲＮＡとアテロコラーゲンのコンプレックスを調製した。アテロコラーゲンの最終濃度は８０ｍｇ／ｍｌ、ｓｉＲＮＡの最終濃度は０．２ｍＭとなる。ｓｉＲＮＡ／アテロコラーゲン−コンプレックス５０ｍｌを９６穴プレートの各ウェルに添加、ウェル底面をコーティングして、ｓｉＲＮＡ／アテロコラーゲン−コンプレックスをアレイ化し（ｓｉＲＮＡ １０ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）、アテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを作製した。そこに培養細胞を播種し、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
(1) Production of Atelocollagen Cell Transfection Array As described below, a mixture of siRNA and atelocollagen was coated on a 96-well microplate, and an atelocollagen cell transfection array capable of reverse transfection of siRNA was produced.
That is, atelocollagen (160 mg / ml in PBS, pH 7.4) and siRNA dilution (0.4 mM in PBS) were mixed at a ratio of 1: 1, and mixed by inversion for 20 minutes at 4 ° C., and siRNA and atelocollagen were mixed. A complex was prepared. The final concentration of atelocollagen is 80 mg / ml and the final concentration of siRNA is 0.2 mM. 50 ml of siRNA / Atelocollagen-complex was added to each well of a 96-well plate, the bottom of the well was coated, and siRNA / Atelocollagen-complex was arrayed (siRNA 10 pmol / well) to produce an atelocollagen cell transfection array. Cultured cells were seeded there and transfected with siRNA.
（２）増殖細胞数の測定
作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイに、ＨＴ−２９大腸ガン細胞(The American Type Culture Collection (以下「ATCC」という)より入手)を５×１０3細胞／ｗｅｌｌ播種し、３日間培養した。増殖した細胞数を、プロメガ社推奨のCellTiter-Blue Reagentのプロトコールにしたがって測定した。すなわち、CellTiter-Blue Reagent（プロメガ社製）をＰＢＳ（−）で４倍に希釈し、細胞培養プレートの各ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃）で１時間インキュベート後、プレートリーダー（パーキンエルマー社製）で蛍光値（Ｅｘ５６０／Ｅｍ５９０）を測定した。
(2) Measurement of the number of proliferating cells HT-29 colon cancer cells (obtained from The American Type Culture Collection (hereinafter referred to as “ATCC”)) were seeded at 5 × 10 3 cells / well on the prepared atelocollagen cell transfection array. Cultured for 3 days. The number of proliferated cells was measured according to the CellTiter-Blue Reagent protocol recommended by Promega. That is, CellTiter-Blue Reagent (Promega) was diluted 4-fold with PBS (−), added to each well of the cell culture plate, incubated for 1 hour in a CO 2 incubator (37 ° C.), and then plate reader (Perkin Elmer). Fluorescence value (Ex560 / Em590) was measured by a manufacturer.
（３）機能的スクリーニング試験
細胞増殖測定後、プロメガ社推奨のCaspase-Glo 3/7 ReagentのプロトコールにしたがってCaspase-3/7活性測定試薬（プロメガ社製）を添加して、室温で６０分間インキュベート後、プレートリーダー（パーキンエルマー社製）で発光値を測定し、Caspase活性を測定した。
(3) Functional screening test After measuring cell proliferation, add Caspase-3 / 7 activity measurement reagent (Promega) according to Promega's recommended Caspase-Glo 3/7 Reagent protocol and incubate at room temperature for 60 minutes Thereafter, the luminescence value was measured with a plate reader (manufactured by Perkin Elmer) to measure the caspase activity.
Caspase-3/7活性値を細胞増殖値で除し、コントロールｓｉＲＮＡとして下記の配列（siCONTROL Non-targeting siRNA #1：Dharmacon社、以下の試験例において特筆しない限り、コントロールｓｉＲＮＡとして全て同じものを使用した）を用い、コントロールｓｉＲＮＡの値を１００％としたときの細胞あたりのCaspase-3/7活性の上昇を解析した。
センス鎖 ：5'-UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3'（配列表の配列番号７）
アンチセンス鎖：5'-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3'（配列表の配列番号８）
上記の各遺伝子のノックダウンによりアポトーシス誘導を指標とした機能的スクリーニング試験（functional screening）の結果、特にＰＳＭＡ７のノックダウンにより、ＨＴ−２９大腸ガン細胞において、他の遺伝子のノックダウンと比較して、アポトーシスが著しく誘導されることが明らかになった（図１）。このことは、ＰＳＭＡ７が大腸ガンにおけるアポトース抑制因子である可能性を示唆している。
Divide the Caspase-3 / 7 activity value by the cell proliferation value, and use the following sequence as the control siRNA (siCONTROL Non-targeting siRNA # 1: Dharmacon, unless otherwise specified in the following test examples) The increase in Caspase-3 / 7 activity per cell when the control siRNA value was taken as 100% was analyzed.
Sense strand: 5'-UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3 '(SEQ ID NO: 7 in the sequence listing)
Antisense strand: 5'-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3 '(SEQ ID NO: 8 in the sequence listing)
As a result of a functional screening test using apoptosis induction as an index by knocking down each of the above genes, the knockdown of PSMA7 in particular compared with knockdown of other genes in HT-29 colon cancer cells. It was revealed that apoptosis was remarkably induced (FIG. 1). This suggests that PSMA7 may be an apoptosis inhibitor in colorectal cancer.
（試験例２）ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを用いたアポトーシス誘導試験
試験例１にて作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを用い、ＨＴ−２９細胞にＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ（図４に示した配列＃１〜＃４（それぞれ配列表の配列番号９〜１６）のｓｉＲＮＡの混合物；SMARTpool、Dharmacon社）またはコントロールｓｉＲＮＡを導入し、３日間培養後、ヘキスト染色を行い、細胞核の凝縮や断片化にみられる核形態の変化を観察して、各ｓｉＲＮＡを導入した系におけるアポトーシス誘導を調べた。試験結果を図２に示す。
なお、ヘキスト染色を行った観察とは、細胞をＰＢＳ（−）（phosphate buffered saline (-)；(-)はCaイオン及びMgイオンが成分として入っていないことを示す）で洗浄後、４％ＰＦＡ(paraformaldehyde)、０．１％Triton X-100（シグマ社）、１ｍｇ／ｍｌ Hoechst 33342（ＰＢＳ（−）中）を添加し、室温で２０分間固定し、染色した後に、ＰＢＳ（−）で洗浄後、蛍光顕微鏡下で観察することをいう。
(Test Example 2) Apoptosis induction test using siRNA of PSMA7 Using the atelocollagen cell transfection array prepared in Test Example 1, PSMA7 siRNA (sequences # 1 to # 4 shown in FIG. Mixture of siRNAs of SEQ ID NOS: 9 to 16) in the table; SMARTpool, Dharmacon) or control siRNA introduced and cultured for 3 days, followed by Hoechst staining to observe changes in nuclear morphology as seen in condensation and fragmentation of cell nuclei Then, apoptosis induction in the system into which each siRNA was introduced was examined. The test results are shown in FIG.
The observation with Hoechst staining is 4% after washing the cells with PBS (-) (phosphate buffered saline (-); (-) indicates that Ca ions and Mg ions are not contained as components). PFA (paraformaldehyde), 0.1% Triton X-100 (Sigma), 1 mg / ml Hoechst 33342 (in PBS (−)) was added, fixed at room temperature for 20 minutes, stained, and then with PBS (−). This refers to observation under a fluorescent microscope after washing.
図２によれば、ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを導入したＨＴ−２９細胞では、図中の矢印に示したように、多くのアポトーシス細胞が確認された。一方、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＨＴ−２９細胞では、ほとんどアポトーシス細胞は認められなかった。
Caspase-3/7の活性化と同様に、ヘキスト染色による観察結果は、ＰＳＭＡ７のノックダウンにより、ＨＴ−２９細胞においてアポトーシスが誘導されることを示し、ＰＳＭＡ７が、大腸ガンにおいてアポトーシス抑制的に働くことを裏付けている。
According to FIG. 2, many apoptotic cells were confirmed in HT-29 cells into which PSMA7 siRNA was introduced, as indicated by arrows in the figure. On the other hand, almost no apoptotic cells were observed in HT-29 cells into which control siRNA was introduced.
Similar to the activation of Caspase-3 / 7, observation by Hoechst staining indicates that knockdown of PSMA7 induces apoptosis in HT-29 cells, and PSMA7 acts as an apoptosis inhibitor in colon cancer I support that.
（試験例３）ＰＳＭＡ７のｓｉＲＮＡを用いたノックダウン効率
試験例１にて作製したアテロコラーゲンセルトランスフェクションアレイを用い、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ（図４に示した配列＃１〜＃４（それぞれ配列表の配列番号９〜１６）のｓｉＲＮＡの混合物；SMARTpool、Dharmacon社）またはコントロールｓｉＲＮＡを導入したときにおけるｍＲＮＡのノックダウン効率を調べた。ｍＲＮＡの発現量は、FastLane Cell cDNA Kit （キアゲン社）およびQuantiTect SYBR Green PCR Kit （キアゲン社）のプロトコールにしたがい、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）を使用し測定した。内部標準遺伝子として、ＧＡＰＤＨを用いた。結果を図３に示す。
図３によれば、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡをＨＴ−２９細胞に導入したとき、コントロールｓｉＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡの８０％が発現抑制されていたことがわかった。
(Test Example 3) Knockdown efficiency using siRNA of PSMA7 Using the atelocollagen cell transfection array prepared in Test Example 1, PSMA7 siRNA (sequences # 1 to # 4 shown in FIG. -16) siRNA mixture; SMARTpool, Dharmacon)) or mRNA knockdown efficiency when introducing control siRNA was examined. The mRNA expression level was measured using a real-time PCR system (ABI) according to the protocol of FastLane Cell cDNA Kit (Qiagen) and QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen). GAPDH was used as an internal standard gene. The results are shown in FIG.
According to FIG. 3, it was found that when PSMA7 siRNA was introduced into HT-29 cells, expression of 80% of mRNA was suppressed as compared to control siRNA.
（試験例４）ＰＳＭＡ７に対する４配列のｓｉＲＮＡのノックダウン効率
ＨＴ−２９細胞にLipofectAmine 2000（Invitrogen社）を用いて、図４に示した各配列のｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、３日後にトータルＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ発現量をSYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II（TaKaRa社）のプロトコールにしたがい、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）で測定した。内部標準遺伝子として、ＧＡＰＤＨを用いた。コントロールｓｉＲＮＡ導入細胞における発現量を１００％として表す。結果を図５に示す。
図５によれば、４種のＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡうち、図４の配列＃２（配列表の配列番号１１，１２）の配列がノックダウン効率約７０％を示し、その他の３種のｓｉＲＮＡと比較して、最も高い発現抑制を示すことがわかる。以後、配列＃２のｓｉＲＮＡを大腸ガン皮下腫瘍モデル（ヌードマウス）での実験に用いた。
(Test Example 4) Knockdown efficiency of siRNA having 4 sequences against PSMA7 Using LI-fectAmine 2000 (Invitrogen), HT-29 cells were transfected with siRNA of each sequence shown in FIG. Extraction was performed, and the mRNA expression level was measured with a real-time PCR system (ABI) according to the protocol of SYBRR PrimeScript® RT-PCR Kit II (TaKaRa). GAPDH was used as an internal standard gene. The expression level in control siRNA-introduced cells is expressed as 100%. The results are shown in FIG.
According to FIG. 5, among the four types of PSMA7 siRNA, the sequence of sequence # 2 (SEQ ID NO: 11, 12 in the sequence listing) of FIG. 4 shows a knockdown efficiency of about 70%, compared with the other three types of siRNA. It can be seen that the highest expression suppression is observed. Thereafter, the siRNA of sequence # 2 was used for experiments in a colon cancer subcutaneous tumor model (nude mice).
（試験例５）大腸ガン細胞株におけるＰＳＭＡ７の発現
大腸ガン細胞株５種（CaCo2：ヒト結腸腺ガン、HCT116：ヒト結腸腺ガン、HT-29：ヒト結腸腺ガン、LoVo：ヒト結腸腺ガン（鎖骨リンパ節転移巣）、T84：ヒト結腸ガン：肺転移巣；全てATCCより入手）と、正常大腸組織におけるＰＳＭＡ７の発現量を比較した。
ｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（SYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II : TaKaRa社; リアルタイムＰＣＲシステム: ＡＢＩ使用）により測定した。ＰＳＭＡ７遺伝子のプライマー（配列表の配列番号１７、１８）を用いるとともに、１８ｓ ｒＲＮＡ（配列表の配列番号１９、２０）の発現を内部標準として補正した。正常大腸組織試料１、２の平均値を１とした。結果を図６に示す。配列表の配列番号１７〜２０の配列を、図７に示す。
図６によれば、５種類すべての大腸ガン細胞株で、正常大腸組織よりも高いＰＳＭＡ７の発現が認められた。
(Test Example 5) Expression of PSMA7 in colorectal cancer cell lines Five colorectal cancer cell lines (CaCo2: human colon adenocarcinoma, HCT116: human colon adenocarcinoma, HT-29: human colon adenocarcinoma, LoVo: human colon adenocarcinoma ( (Clavicular lymph node metastases), T84: human colon cancer: lung metastases; all obtained from ATCC) and PSMA7 expression levels in normal colon tissues were compared.
The expression level of mRNA was measured by real-time RT-PCR (SYBRR PrimeScript® RT-PCR Kit II: TaKaRa; real-time PCR system: using ABI). While using primers of the PSMA7 gene (SEQ ID NOs: 17 and 18 in the sequence listing), expression of 18s rRNA (SEQ ID NOs: 19 and 20 in the sequence listing) was corrected as an internal standard. The average value of normal colon tissue samples 1 and 2 was taken as 1. The results are shown in FIG. The sequences of SEQ ID NOs: 17 to 20 in the sequence listing are shown in FIG.
According to FIG. 6, expression of PSMA7 higher than that of normal colon tissue was observed in all five types of colon cancer cell lines.
（試験例６）各種ガン組織および正常組織におけるＰＳＭＡ７の発現量の比較
腫瘍とその隣接正常組織とから抽出したＲＮＡセット（FirstChoice Tumor/Normal Adjacent Tissue RNA: Ambion社）を用い、各種ガン組織および正常組織におけるＰＳＭＡ７の発現量を比較した。ｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（SYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II : TaKaRa社; リアルタイムＰＣＲシステム: ＡＢＩ使用）により測定した。１８ｓ ｒＲＮＡの発現を内部標準として補正した。正常大腸組織試料１、２の平均値を１とした。結果を図８に示す。
図８によれば、大腸ガン組織およびその他のガン組織（乳ガン、子宮ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、精巣ガン、胃ガン、リンフォーマ、小腸ガン）において、ＰＳＭＡ７の発現の亢進が認められた。よって、ＰＳＭＡ７は、これらのガン種において、腫瘍のガン化、悪性化に関与すると考えられる。
(Test Example 6) Comparison of expression levels of PSMA7 in various cancer tissues and normal tissues Using an RNA set (FirstChoice Tumor / Normal Adjacent Tissue RNA: Ambion) extracted from a tumor and its adjacent normal tissues, various cancer tissues and normal The expression levels of PSMA7 in the tissues were compared. The expression level of mRNA was measured by real-time RT-PCR (SYBRR PrimeScript® RT-PCR Kit II: TaKaRa; real-time PCR system: using ABI). Expression of 18s rRNA was corrected as an internal standard. The average value of normal colon tissue samples 1 and 2 was taken as 1. The results are shown in FIG.
According to FIG. 8, in colon cancer tissue and other cancer tissues (breast cancer, uterine cancer, thyroid cancer, liver cancer, bladder cancer, kidney cancer, ovarian cancer, testicular cancer, stomach cancer, lymphoma, small intestine cancer), PSMA7 Increased expression was observed. Therefore, PSMA7 is considered to be involved in tumor canceration and malignancy in these cancer types.
（試験例７）動物モデルを用いたＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡの大腸ガン皮下移植腫瘍に及ぼす影響
図９は、本試験の手順の概略を示す。
図９に示したように、４週齢のメスのヌードマウス後背部皮下にＨＴ−２９細胞（5x106 細胞／部位）を移植し、腫瘍径が約５−６ｍｍに達した７日後に、図４の配列＃２（配列表の配列番号１１、１２）のｓｉＲＮＡ（１ｎｍｏｌ／部位）を、アテロコラーゲン（最終濃度:０．５％）を導入担体として腫瘍内投与した。
(Test Example 7) Effect of PSMA7 siRNA Using Animal Model on Colon Cancer Subcutaneous Transplanted Tumor FIG. 9 shows an outline of the procedure of this test.
As shown in FIG. 9, HT-29 cells (5 × 10 6 cells / site) were transplanted subcutaneously into the back of a 4-week-old female nude mouse, and 7 days after the tumor diameter reached about 5-6 mm, SiRNA (1 nmol / site) of SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 11 and 12 in the sequence listing) was administered intratumorally with atelocollagen (final concentration: 0.5%) as an introduction carrier.
（ｍＲＮＡの発現抑制）
ｓｉＲＮＡの投与２４時間後に腫瘍を採取し、ｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した（SYBRR PrimeScriptR RT-PCR Kit II : TaKaRa社; リアルタイムＰＣＲシステム: ＡＢＩ使用）。内部標準遺伝子には、ＧＡＰＤＨを用いた。コントロールｓｉＲＮＡ導入細胞における発現量を１００％として表す。結果を図１０に示す。
図１０によれば、コントロールｓｉＲＮＡ投与群と比較し、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与群はＰＳＭＡ７のｍＲＮＡの発現が約３５％減少していることがわかった。大腸ガン皮下移植腫瘍組織においても、ｓｉＲＮＡの投与によりＰＳＭＡ７の発現が抑制されることが示された。
(Suppression of mRNA expression)
Tumors were collected 24 hours after administration of siRNA, mRNA was extracted, and the expression level of mRNA was measured by real-time RT-PCR (SYBRR PrimeScript® RT-PCR Kit II: TaKaRa; real-time PCR system: using ABI). GAPDH was used as an internal standard gene. The expression level in control siRNA-introduced cells is expressed as 100%. The results are shown in FIG.
According to FIG. 10, it was found that the expression of PSMA7 mRNA was decreased by about 35% in the PSMA7 siRNA administration group compared to the control siRNA administration group. It was shown that the expression of PSMA7 was suppressed by administration of siRNA also in colon cancer subcutaneously transplanted tumor tissues.
（アポトーシス誘導）
ｓｉＲＮＡの投与７２時間後に腫瘍を採取し、凍結組織切片を作製し、TUNEL染色（In Situ Cell Death Detection Kit: Roche社）した。結果を図１１に示す。なお、図１１において明確に示されていないが、核はＤＡＰＩ染色で青色に、TUNEL陽性細胞はフルオレセイン標識による緑色に染色される。
図１１によれば、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡを投与したＨＴ−２９腫瘍では、多くのTUNEL陽性細胞が観察された。一方、コントロールｓｉＲＮＡを導入したＨＴ−２９腫瘍では、ほとんどTUNEL陽性細胞は認められなかった。よって、ＰＳＭＡ７の発現抑制により、大腸ガン皮下移植腫瘍組織においてもアポトーシスが誘導されることが確認された。
(Induction of apoptosis)
Tumors were collected 72 hours after siRNA administration, frozen tissue sections were prepared, and TUNEL staining (In Situ Cell Death Detection Kit: Roche) was performed. The results are shown in FIG. Although not clearly shown in FIG. 11, nuclei are stained blue by DAPI staining, and TUNEL positive cells are stained green by fluorescein labeling.
According to FIG. 11, many TUNEL positive cells were observed in the HT-29 tumor administered with PSMA7 siRNA. On the other hand, almost no TUNEL positive cells were observed in the HT-29 tumor introduced with the control siRNA. Therefore, it was confirmed that apoptosis was induced also in tumor tissues transplanted subcutaneously to colon cancer by suppressing the expression of PSMA7.
（試験例８）食道ガン細胞におけるＰＳＭＡ７遺伝子の発現試験
図１２は、ＰＳＭＡ７遺伝子について、食道ガンの患者から採取した４２サンプルにおいて行った発現試験の結果を示す。この発現試験は、食道ガン非ガン部および４２症例の食道ガン部から抽出したＲＮＡ10μgを鋳型としてfirst strand cDNA合成キット（GEヘルスケア）を用いてcDNAを合成後、1/20量のcDNAを鋳型にPCRを行い、さらにPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することによって行った。
図１２によれば、コントロールのβ−アクチン（Operon社、以下の試験例においてコントロールのβ−アクチンとして全て同じものを使用した）の発現量が各サンプルについてほぼ同程度であることから、サンプル間で含まれるｍＲＮＡ量に大きな差がないことが示される。また、食道非ガン部からのサンプルにおける結果と比較して、いずれのガン細胞からのサンプルにおいても発現量に多少の差があるものの、ＰＳＭＡ７遺伝子が発現していることがわかる。
Test Example 8 Expression Test of PSMA7 Gene in Esophageal Cancer Cells FIG. 12 shows the results of an expression test performed on 42 samples collected from esophageal cancer patients for the PSMA7 gene. In this expression test, 10 µg of RNA extracted from the non-cancerous part of esophageal cancer and 42 cases of esophageal cancer was used as a template to synthesize cDNA using the first strand cDNA synthesis kit (GE Healthcare), and then 1/20 amount of cDNA was used as the template. PCR was performed, and the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis and then stained with ethidium bromide.
According to FIG. 12, the expression level of control β-actin (Operon, the same test β-actin was used in the following test examples) was almost the same for each sample. It is shown that there is no big difference in the amount of mRNA contained in. Further, it can be seen that the PSMA7 gene is expressed in the samples from any cancer cells, although the expression level is slightly different from the results in the samples from the non-cancerous part of the esophagus.
（試験例９）食道ガン細胞におけるＲＡＥ１遺伝子の発現試験
図１３は、ＲＡＥ１遺伝子について、食道ガンの患者から採取した４２サンプルにおいて行った発現試験の結果を示す。この発現試験は、食道ガン非ガン部および４２症例の食道ガン部から抽出したＲＮＡ10μgを鋳型としてfirst strand cDNA合成キット（GEヘルスケア社）を用いてcDNAを合成後、1/20量のcDNAを鋳型にPCRを行い、さらにPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することによって行った。
図１３によれば、コントロールのβ−アクチンの発現量が各サンプルについてほぼ同程度であることから、サンプル間で含まれるｍＲＮＡ量に大きな差がないことが示される。また、食道非ガン部からのサンプルにおける結果と比較して、いずれのガン細胞からのサンプルにおいても発現量に多少の差があるものの、ＲＡＥ１遺伝子が発現していることがわかる。
Test Example 9 Expression Test of RAE1 Gene in Esophageal Cancer Cells FIG. 13 shows the results of an expression test performed on 42 samples collected from patients with esophageal cancer for the RAE1 gene. In this expression test, cDNA was synthesized using a first strand cDNA synthesis kit (GE Healthcare) using 10 μg of RNA extracted from the non-cancerous part of esophageal cancer and 42 cases of esophageal cancer as a template. PCR was performed on the template, and the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis and then stained with ethidium bromide.
According to FIG. 13, since the expression level of β-actin as a control is almost the same for each sample, it is shown that there is no great difference in the amount of mRNA contained between samples. In addition, it can be seen that the RAE1 gene is expressed in the samples from any cancer cells, although the expression level is slightly different from the results in the samples from the non-cancerous part of the esophagus.
（試験例１０）ＰＳＭＡ７およびＲＡＥ１ｓｉＲＮＡによる食道ガン細胞の増殖抑制試験
この増殖抑制試験は、TE3(食道扁平上皮ガン由来)細胞にDhamaFECT(Dharmacon社)を用いて、以下の各配列のsiRNAをトランスフェクションし、３日後に細胞数を血球計算盤を用いて計測することによって行った。コントロールsiRNA（QIAGEN社）導入時の細胞数を１００として、ＰＳＭＡ７およびＲＡＥ１siRNA導入時の細胞数を図１４に示した。以下の各配列中の小文字のt、c、gはそれぞれ保護配列としてのデオキシチミン、デオキシシトシン、デオキシグアニンを示す。
PSMA7のsiRNA（Ambion, siRNAID#11945）:
センス鎖 ：5'-GGAAGAGACAUUGUUGUUCtt -3'（配列表の配列番号２１）
アンチセンス鎖：5'-GAACAACAAUGUCUCUUCCtc-3'（配列表の配列番号２２）
RAE1のsiRNA（Ambion, siRNAID#139221）:
センス鎖 ：5'-GCUAGAGAAUCAACCUUCUtt-3'（配列表の配列番号２３）
アンチセンス鎖：5'-AGAAGGUUGAUUCUCUAGCtg-3'（配列表の配列番号２４）
コントロールのsiRNA(QIUAGEN, 1022076):
センス鎖 ：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3'（配列表の配列番号２５）
アンチセンス鎖：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3'（配列表の配列番号２６）
図１４によれば、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡおよびＲＡＥ１ｓｉＲＮＡを投与することにより、食道ガン細胞の増殖が抑制されたことがわかる。
(Test Example 10) Proliferation inhibition test of esophageal cancer cells by PSMA7 and RAE1 siRNA This growth inhibition test was performed by transfecting siRNA of each of the following sequences into TE3 (derived from esophageal squamous cell carcinoma) cells using DhamaFECT (Dharmacon). 3 days later, the number of cells was measured using a hemocytometer. FIG. 14 shows the number of cells when PSMA7 and RAE1 siRNA were introduced, with the number of cells when introducing control siRNA (QIAGEN) being 100. Lowercase letters t, c, and g in the following sequences represent deoxythymine, deoxycytosine, and deoxyguanine as protective sequences, respectively.
SiRNA for PSMA7 (Ambion, siRNAID # 11945):
Sense strand: 5'-GGAAGAGACAUUGUUGUUCtt-3 '(SEQ ID NO: 21 in the sequence listing)
Antisense strand: 5'-GAACAACAAUGUCUCUUCCtc-3 '(SEQ ID NO: 22 in the sequence listing)
RAE1 siRNA (Ambion, siRNAID # 139221):
Sense strand: 5′-GCUAGAGAAUCAACCUUCUtt-3 ′ (SEQ ID NO: 23 in the sequence listing)
Antisense strand: 5'-AGAAGGUUGAUUCUCUAGCtg-3 '(SEQ ID NO: 24 in the sequence listing)
Control siRNA (QIUAGEN, 1022076):
Sense strand: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3 ′ (SEQ ID NO: 25 in the sequence listing)
Antisense strand: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 '(SEQ ID NO: 26 in the sequence listing)
FIG. 14 shows that administration of PSMA7 siRNA and RAE1 siRNA suppressed the growth of esophageal cancer cells.
（試験例１１）胃ガン細胞におけるＮＥＤＤ１遺伝子の発現試験
図１５は、ＮＥＤＤ１遺伝子について、胃ガンの患者から採取したサンプルにおいて行った発現検査の結果を示す。この発現試験は、非ガン部胃粘膜の３層（pit, neck, gland）、８症例の分化型胃ガン部および１０症例の未分化型胃ガン部から抽出したＲＮＡ10μgを鋳型としてfirst strand cDNA合成キット（GEヘルスケア）を用いてcDNAを合成後、1/20量のcDNAを鋳型にPCRを行い、さらにPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することによって行った。非ガン部胃粘膜３層の鋳型cDNAの合成は、Fukaya M et al., Gastroenterology 2006; 131: 14-29に記載されている。
図１５によれば、コントロールのβ−アクチンの発現量が各サンプルについてほぼ同程度であることから、サンプル間で含まれるｍＲＮＡ量に大きな差がないことが示される。また、非ガン部（Normal）からのサンプルにおける結果と比較して、いずれのガン組織からのサンプルにおいても発現量に多少の差があるものの、ＮＥＤＤ１遺伝子が発現していることがわかる。
Test Example 11 NEDD1 Gene Expression Test in Gastric Cancer Cells FIG. 15 shows the results of an expression test performed on a sample collected from a stomach cancer patient for the NEDD1 gene. In this expression test, first strand cDNA synthesis was performed using 10 μg of RNA extracted from 3 layers of non-cancerous gastric mucosa (pit, neck, gland), 8 cases of differentiated gastric cancer and 10 cases of undifferentiated gastric cancer as a template. After synthesis of cDNA using the kit (GE Healthcare), PCR was performed using 1/20 amount of cDNA as a template, and the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis and then stained with ethidium bromide. The synthesis of non-cancerous gastric mucosal three-layer template cDNA is described in Fukaya M et al., Gastroenterology 2006; 131: 14-29.
According to FIG. 15, since the expression level of β-actin as a control is almost the same for each sample, it is shown that there is no significant difference in the amount of mRNA contained between samples. Moreover, it can be seen that the NEDD1 gene is expressed in the samples from any cancer tissue, although the expression level is slightly different from the results in the samples from the non-cancerous part (Normal).
（試験例１２）ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡによる胃ガン細胞の増殖抑制試験
この増殖抑制試験は、HSC60(未分化胃ガン由来)細胞にDhamaFECT(Dharmacon社)を用いて、以下の配列のsiRNAをトランスフェクションし、2日間、細胞数を血球計算板を用いて計測することによって行った。コントロールsiRNAは前記試験例１０に記載したQIAGEN，１０２２０７６を用いた。
NEDD1のsiRNA（Ambion, siRNAID#122064）:
センス鎖 ：5'-CGAAGUGUUAAUGUGAAUGtt-3'（配列表の配列番号２７）
アンチセンス鎖：5'-CAUUCACAUUAACACUUCGtt-3'（配列表の配列番号２８）
図１６によれば、ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡを投与することにより、特に投与後二日目にて胃ガン細胞の増殖が抑制されたことがわかる。
(Test Example 12) Growth inhibition test of gastric cancer cells by NEDD1 siRNA In this growth inhibition test, siRNA having the following sequence was transfected into HSC60 (derived from undifferentiated gastric cancer) cells using DhamaFECT (Dharmacon). The number of cells was measured every day using a hemocytometer. As a control siRNA, QIAGEN, 1022076 described in Test Example 10 was used.
NEDD1 siRNA (Ambion, siRNAID # 122064):
Sense strand: 5'-CGAAGUGUUAAUGUGAAUGtt-3 '(SEQ ID NO: 27 in the sequence listing)
Antisense strand: 5'-CAUUCACAUUAACACUUCGtt-3 '(SEQ ID NO: 28 in the sequence listing)
FIG. 16 shows that administration of NEDD1 siRNA suppressed the growth of gastric cancer cells, particularly on the second day after administration.
（試験例１３）ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸ガン肝転移抑制実験
ヌードマウス（BALB/c-nu/nu）６週齢のオスに、2x106個のヒト大腸ガン細胞HT-29-P-VLを脾臓に注入した。ガン細胞の注入から５日後および１０日後のそれぞれにおいて計２回、ネガティブ・コントロールｓｉＲＮＡ（AllStars, Qiagen）またはＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ（SIGMA）をＪｅｔＰＥＩ（6.4mL, Poly-plus transfection)と混合し、2.5mg/kg、200μL/mouseで尾静脈より投与した。ガンの転移の有無を、ガン細胞の注入から１５日後における、イメージング画像により評価した。
図１７に、得られた画像を模式的に示した図を示す。図１７において、左側にネガティブ・コントロールｓｉＲＮＡ投与マウスで得られた評価画像を示し、右側のＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与マウスで得られた評価画像を示す。
図１７によれば、ネガティブ・コントロールｓｉＲＮＡ投与マウスでは、肝臓にガン細胞由来のシグナルが検出されたのに対し、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡ投与マウスではそのようなガン細胞由来のシグナルは検出されず、ＰＳＭＡ７ｓｉＲＮＡの投与により肝臓への転移抑制効果が認められたことがわかる。
(Test Example 13) Inhibition experiment of human colon cancer liver metastasis by administration of PSMA7 siRNA Nude mouse (BALB / c-nu / nu) 6 weeks old male 2x10 6 human colon cancer cells HT-29-P-VL were spleen Injected into. Negative control siRNA (AllStars, Qiagen) or PSMA7 siRNA (SIGMA) was mixed with JetPEI (6.4 mL, Poly-plus transfection) twice at a total of 5 mg and 10 days after cancer cell injection, and 2.5 mg / kg. 200 μL / mouse was administered from the tail vein. The presence or absence of cancer metastasis was evaluated by imaging images 15 days after the injection of cancer cells.
FIG. 17 schematically shows the obtained image. In FIG. 17, the left side shows an evaluation image obtained in a negative control siRNA-administered mouse, and the right side shows an evaluation image obtained in a PSMA7 siRNA-administered mouse.
According to FIG. 17, in the negative control siRNA-administered mice, cancer cell-derived signals were detected in the liver, whereas in the PSMA7 siRNA-administered mice, such cancer cell-derived signals were not detected. It can be seen that the effect of suppressing metastasis to the liver was observed.
（試験例１４）マウス腹腔内ヒト移植腫瘍増殖に対するＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの抑制試験
４０万個のルシフェラーゼ遺伝子を導入したヒト未分化胃ガン由来６０Ａｓ６細胞をC,B17/lcr-scidマウスの腹腔に投与後、１日目から１４日目までに、５０μｇのＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡを０．５％アテロコラーゲン（株式会社高研）および１０μｌのDharmaFECT（Dharmacon社）を混合して得られた混合物を合計６回腹腔内に投与した６匹、およびｓｉＲＮＡを含まない混合物を投与した６匹のそれぞれのマウスを、ＩＶＩＳ（Xenogen社）によってイメージングし、腹腔内での６０Ａｓ６細胞の増殖を、ルシフェラーゼが発する光（光子）を計数（測定）することによって見積もった。
図１８に、このＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの腹腔内投与によるin vivo腹膜再発抑制の結果を経時的なガン細胞の増殖抑制の観点から説明するグラフを示す。
図１８によれば、ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡをマウス腹腔内に投与することによって、６０Ａｓ６細胞の増殖が有意に抑えられていることがわかる。
(Test Example 14) Inhibition test of NEDD1 siRNA against mouse intraperitoneal human transplanted tumor growth After administration of 400,000 As6 cells derived from human undifferentiated gastric cancer introduced with 400,000 luciferase genes to the peritoneal cavity of C, B17 / lcr-scid mice, 1 From day 14 to day 14, a mixture obtained by mixing 50 μg of NEDD1 siRNA with 0.5% atelocollagen (Koken) and 10 μl of DharmaFECT (Dharmacon) was intraperitoneally administered 6 times in total 6 6 mice and 6 mice each receiving a mixture containing no siRNA were imaged by IVIS (Xenogen), and the proliferation of 60 As6 cells in the peritoneal cavity was counted (measured) by the light (photons) emitted by luciferase. Estimated by doing.
FIG. 18 shows a graph illustrating the results of in vivo peritoneal recurrence suppression by intraperitoneal administration of this NEDD1 siRNA from the viewpoint of suppression of cancer cell proliferation over time.
According to FIG. 18, it can be seen that the growth of 60As6 cells is significantly suppressed by administering NEDD1 siRNA into the abdominal cavity of mice.
（試験例１５）マウス腹腔内ヒト移植腫瘍増殖に対するＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡの抑制試験
１０万個のヒト未分化胃ガン由来６０Ａｓ６細胞をC,B17/lcr-scidマウスの腹腔に投与後、１日目から２２日目までに、５０μｇのＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡを０．５％アテロコラーゲン（株式会社高研）および１０μｌのDharmaFECT（Dharmacon社）を混合して得られた混合物を合計９回腹腔内に投与した８匹、およびｓｉＲＮＡを含まない混合物を投与した９匹のそれぞれのマウスの生存状態を約１００日間観察した。
図１９に、ｓｉＲＮＡを投与したグループと、投与しなかったグループとにおけるマウスの生存率の変化を説明するグラフを示す。
図１９によれば、ｓｉＲＮＡを投与したグループと、投与しなかったグループとで比較すると、ＮＥＤＤ１ｓｉＲＮＡをマウス腹腔内に投与することによって、有為に延命できたことがわかる。
(Test Example 15) Inhibition test of NEDD1 siRNA against mouse intraperitoneal human transplanted tumor growth After administration of 100,000 human undifferentiated gastric cancer-derived 60As6 cells to the abdominal cavity of C, B17 / lcr-scid mice, the first day to the 22nd day By the way, 8 mice that received 50 μg NEDD1 siRNA mixed with 0.5% atelocollagen (Koken) and 10 μl DharmaFECT (Dharmacon) intraperitoneally for a total of 9 times, and siRNA The survival status of each of the 9 mice that received the unmixed mixture was observed for about 100 days.
FIG. 19 shows a graph illustrating changes in the survival rate of mice in a group to which siRNA was administered and a group to which siRNA was not administered.
According to FIG. 19, comparing the group administered with siRNA with the group not administered, it can be seen that life could be significantly extended by administering NEDD1 siRNA into the mouse abdominal cavity.
Claims (21)
(a)配列番号１に記載の塩基配列、
(b)配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(c)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(d)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。 One of the double-stranded polynucleotides is one of the following base sequences selected from (a) to (d), and a polynucleotide having a continuous base sequence of 15 to 33 bases in length is used as a complementary strand of the interference sequence: The cancer cell proliferation inhibitor of Claim 4 containing.
(a) the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(b) a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(c) a base sequence comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2,
(d) a base comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or mutated by a combination thereof; An array.
(e)配列番号３に記載の塩基配列、
(f)配列番号３に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(g)配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(h)配列番号４に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。 One of the double-stranded polynucleotides is a polynucleotide having a base sequence length of 15 to 33 bases in any one base sequence selected from the following (e) to (h) as a complementary strand of the interference sequence: The cancer cell proliferation inhibitor of Claim 10 containing.
(e) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3,
(f) a base sequence having 90% or more homology with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
(g) a nucleotide sequence consisting of a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4,
(h) a base comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or mutated by a combination thereof; An array.
(i)配列番号５に記載の塩基配列、
(j)配列番号５に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列、
(k)配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列、
(l)配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、またはその組み合わせにより変異されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる塩基配列。 One of the double-stranded polynucleotides is a polynucleotide having a base sequence of 15 to 33 bases in any one of the base sequences selected from the following (i) to (l) as a complementary strand of the interference sequence: The cancer cell proliferation inhibitor of Claim 16 containing.
(i) the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5,
(j) a base sequence having 90% or more homology to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5;
(k) a base sequence comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6,
(l) a base comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or mutated by a combination thereof; An array.
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