JP2010164513A - Antibody fixing substrate, manufacturing method and utilization of antibody fixing substrate - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、金属、該金属の表面上に形成された自己組織化単分子膜、及び該自己組織化単分子膜上に物理的な相互作用によって固定化された抗体からなる抗体固定基板に関する。さらに、本発明は、該抗体固定基板の製造方法、該抗体固定基板を利用した抗原を免疫学的に測定する方法、及び該抗原を免疫学的に測定する方法に使用される免疫学的測定用キットに関する。 The present invention relates to an antibody immobilization substrate comprising a metal, a self-assembled monolayer formed on the surface of the metal, and an antibody immobilized on the self-assembled monolayer by physical interaction. Furthermore, the present invention relates to a method for producing the antibody-immobilized substrate, a method for immunologically measuring an antigen using the antibody-immobilized substrate, and an immunological measurement used for a method for immunologically measuring the antigen. Relates to the kit.
抗体を用いた免疫学的測定方法では、被験物質の検出に際して、被験物質に特異的な抗体が固定化された検出部としての基板が利用される。特に、エバネッセント波そのものを被験物質の検出に利用する場合、またはこのエバネッセント波を応用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により被験物質を検出する場合において、金属などの基板上に抗体を固定化することが求められる。被験物質以外の物質による非特異吸着を減少させるために、一般的に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）・デキストラン層などを金属膜上に形成し、その後抗体を固定化する。非特異吸着減少層の上へ抗体を固定化させる方法は、大別して２つの方法が用いられている。一つ目は、非特異吸着減少層に含有させた官能基を介して抗体を共有的に結合する化学結合法である。二つ目は、ファンデル・ワールス力によって抗体を吸着する物理結合法である。物理結合法において、物理吸着において抗体の反応効率を高める方策としては、非特異吸着減少層に吸着させるべき抗体と異なる物質を添加することで抗体の吸着様式を変化させることが試みられている。例えば、核酸断片を共有結合によりＳＡＭ上に結合する方法（特許文献１）やタンパク質を物理結合によりＳＡＭ上にスタンプする方法（非特許文献１）がこれまでに知られている。 In the immunological measurement method using an antibody, a substrate serving as a detection unit on which an antibody specific to the test substance is immobilized is used for detection of the test substance. In particular, when an evanescent wave itself is used for detection of a test substance or when a test substance is detected by a surface plasmon resonance (SPR) method using this evanescent wave, an antibody is immobilized on a substrate such as a metal. Is required. In order to reduce nonspecific adsorption by substances other than the test substance, a self-assembled monolayer (SAM) / dextran layer or the like is generally formed on the metal film, and then the antibody is immobilized. There are roughly two methods for immobilizing antibodies on a non-specific adsorption-decreasing layer. The first is a chemical bonding method in which an antibody is covalently bonded through a functional group contained in a non-specific adsorption reducing layer. The second is a physical binding method in which antibodies are adsorbed by van der Waals forces. In the physical binding method, as a measure for increasing the antibody reaction efficiency in physical adsorption, an attempt is made to change the antibody adsorption mode by adding a substance different from the antibody to be adsorbed to the non-specific adsorption-decreasing layer. For example, a method of binding nucleic acid fragments on SAM by covalent bond (Patent Document 1) and a method of stamping proteins on SAM by physical bond (Non-Patent Document 1) are known so far.
非特異吸着減少層の上へ抗体を固定化させる２つの方法のうち、化学結合法は、抗体分子内に官能基との反応場所を特異的に設けることによって、固定化抗体の配向性を改善することができ、抗体の反応効率を上昇することができる。しかし、化学結合法は、物理結合法に比べると、非特異吸着減少層上に抗体を固定化させる際に、多数の工程を要し、それに伴い使用する反応試薬も多くなるという問題がある。その結果、臨床診断薬に代表される、被験物質に特異的な抗体を固定化した検出部を利用した免疫検査製品を迅速かつ大量に工業的に生産することが困難である。 Of the two methods for immobilizing an antibody on a nonspecific adsorption-reducing layer, the chemical binding method improves the orientation of the immobilized antibody by providing a specific reaction site with a functional group in the antibody molecule. The reaction efficiency of the antibody can be increased. However, compared with the physical binding method, the chemical binding method has a problem that many steps are required to immobilize the antibody on the non-specific adsorption-decreasing layer, and the reaction reagent to be used increases accordingly. As a result, it is difficult to industrially produce rapidly and in large quantities an immunological test product that uses a detection unit in which an antibody specific to a test substance is immobilized, represented by a clinical diagnostic agent.
それに対して、物理結合法は、上記化学結合法の問題を解消する非常に有利な方法であり、抗体を含む溶液を非特異吸着減少層に接触するだけの簡便な操作であることから、特別な操作・設備・試薬を要せず、このことから簡便、低コスト及び低環境負荷で抗体固定基板を製造することができるという利点である。しかし、化学結合法とは違い、ファンデル・ワールス力による結合を用いているために抗体の配向性制御が困難であることから、化学結合法に比して反応効率が低くなる傾向があるという問題がある。 On the other hand, the physical binding method is a very advantageous method that solves the above-described problems of the chemical binding method, and is a simple operation in which a solution containing an antibody is simply contacted with a non-specific adsorption-reducing layer. Thus, there is an advantage that an antibody-immobilized substrate can be produced simply, at low cost and with a low environmental load. However, unlike chemical binding methods, antibody binding is difficult to control because of the use of van der Waals forces, and reaction efficiency tends to be lower than chemical binding methods. There's a problem.
また、上記した通り、物理結合法における上記問題を解決する種々の試みがなされているが、介在させるべき物質などを追加せずに、抗原との反応性が維持された状態で、抗体を非特異吸着減少層に物理吸着する方法や、該方法によって製造された、抗原抗体反応の効率を向上させた抗体固定基板はこれまでに知られていない。 In addition, as described above, various attempts have been made to solve the above-described problems in the physical binding method, but antibodies are not used in a state in which the reactivity with the antigen is maintained without adding substances to be intervened. A method for physical adsorption to the specific adsorption-reducing layer and an antibody-immobilized substrate produced by this method and improving the efficiency of the antigen-antibody reaction have not been known so far.
そこで、本発明の目的は、介在させるべき物質などの追加を要せずに、抗原抗体反応の効率を向上させた物理吸着によって抗体を固定化させた抗体固定基板及び該抗体固定基板の製造方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、該抗体固定基板を利用した、抗原の免疫学的測定方法及び該免疫学的測定方法に使用するための免疫学的測定用キットを提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide an antibody-immobilized substrate on which an antibody is immobilized by physical adsorption that improves the efficiency of an antigen-antibody reaction without requiring addition of a substance to be interposed, and a method for producing the antibody-immobilized substrate. Is to provide. Furthermore, an object of the present invention is to provide an immunological measurement method for an antigen using the antibody-immobilized substrate and an immunological measurement kit for use in the immunological measurement method.
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、金属の表面上に、所定の割合の親水性基を有する自己組織化単分子膜形成分子を用いて自己組織化単分子膜を形成させ、さらに該自己組織化単分子膜上に抗体を物理的に相互作用させて固定化することによって、被験物質である抗原と該自己組織化単分子膜に固定化した抗体と該抗体と異なるエピトープを認識する該抗原に対する抗体を担持した標識物質との免疫複合体の形成を促進させることに成功した。本発明は上記知見に基づいて完成された発明である。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present application have made self-assembled monolayers using self-assembled monolayer-forming molecules having a predetermined proportion of hydrophilic groups on the surface of the metal. The membrane is formed, and the antibody is physically interacted and immobilized on the self-assembled monolayer, whereby the antigen as the test substance, the antibody immobilized on the self-assembled monolayer, and the The present inventors have succeeded in promoting the formation of an immune complex with a labeling substance carrying an antibody against the antigen that recognizes an epitope different from the antibody. The present invention has been completed based on the above findings.
したがって、本発明によれば、金属基板、該金属基板上に形成された２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜、及び該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に物理的な相互作用によって固定化された抗体からなる抗体固定基板において、
該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する少なくとも１種の成分が、一方の末端に親水性基を有し、かつ
該一方の末端に親水性基を有する少なくとも１種の成分が、該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する成分の合計に対して、０．０１〜２％（mol／mol）の割合で存在する、
抗体固定基板が提供される。
Therefore, according to the present invention, a metal substrate, a self-assembled monolayer film formed of two or more components formed on the metal substrate, and a self-assembled monolayer film formed of the two or more components are provided. In an antibody immobilization substrate consisting of antibodies immobilized by physical interaction,
At least one component forming a self-assembled monolayer composed of two or more components has at least one hydrophilic group at one end and at least one hydrophilic group at the one end. The component is present at a ratio of 0.01 to 2% (mol / mol) with respect to the total of the components forming the self-assembled monolayer composed of the two or more types of components.
An antibody immobilization substrate is provided.
本発明の抗体固定基板の好ましい態様は、親水性基が、液体中で負電荷を示す親水性基である。 In a preferred embodiment of the antibody-immobilized substrate of the present invention, the hydrophilic group is a hydrophilic group that exhibits a negative charge in a liquid.
本発明の抗体固定基板の好ましい態様は、親水性基が、カルボキシ基、ヒドロキシル基、スルホ基、及びクロロ基からなる群から選ばれる親水性基である。 In a preferred embodiment of the antibody-immobilized substrate of the present invention, the hydrophilic group is a hydrophilic group selected from the group consisting of a carboxy group, a hydroxyl group, a sulfo group, and a chloro group.
本発明の別の側面によれば、金属基板上に、２種類以上の成分を用いて自己組織化単分子膜を形成すること；及び
形成された２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に物理的な相互作用によって抗体を固定化すること
を含む、抗体固定基板を製造する方法において、
該複数の成分のうち少なくとも１種の成分が、一方の末端に親水性基を有し、かつ
該一方の末端に親水性基を有する少なくとも１種の成分が、該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する成分の合計に対して、０．０１〜２％（mol／mol）の割合で存在する、
抗体固定基板を製造する方法が提供される。
According to another aspect of the present invention, a self-assembled monomolecular film is formed on a metal substrate using two or more kinds of components; and the self-assembled monomolecule composed of the two or more kinds of components formed In a method for producing an antibody immobilization substrate comprising immobilizing an antibody on a membrane by physical interaction,
At least one component of the plurality of components has a hydrophilic group at one end, and at least one component having a hydrophilic group at one end includes the two or more components. Present at a rate of 0.01 to 2% (mol / mol) with respect to the total of the components forming the self-assembled monolayer;
A method for producing an antibody-immobilized substrate is provided.
本発明の抗体固定基板を製造する方法の好ましい態様は、親水性基が、液体中で負電荷を示す親水性基である。 In a preferred embodiment of the method for producing an antibody-immobilized substrate of the present invention, the hydrophilic group is a hydrophilic group that exhibits a negative charge in a liquid.
本発明の抗体固定基板を製造する方法の好ましい態様は、親水性基が、カルボキシ基、ヒドロキシル基、スルホ基、及びクロロ基からなる群から選ばれる親水性基である。 In a preferred embodiment of the method for producing the antibody-immobilized substrate of the present invention, the hydrophilic group is a hydrophilic group selected from the group consisting of a carboxy group, a hydroxyl group, a sulfo group, and a chloro group.
本発明の別の側面によれば、本発明の抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある抗原を免疫学的に測定する方法において、
該抗原を、該抗体固定基板に接触させること；及び
該抗体固定基板における抗体固定化部位において、該抗原を検出すること、を含む抗原を免疫学的に測定する方法が提供される。
According to another aspect of the present invention, in a method for immunologically measuring an antigen capable of binding to an antibody immobilized on an antibody immobilization substrate of the present invention,
There is provided a method for immunologically measuring an antigen comprising contacting the antigen with the antibody-immobilized substrate; and detecting the antigen at an antibody-immobilized site on the antibody-immobilized substrate.
本発明の抗原を免疫学的に測定する方法の別の態様は、本発明の抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある抗原を免疫学的に測定する方法において、
該抗原と、該抗体固定基板に固定化された抗体と異なる部位において該抗原への結合性がある抗体又は該抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある物質を担持する標識物質とを、該抗体固定基板に接触させること；及び
該抗体固定基板における抗体固定化部位において、該抗原と該標識物質との複合体又は該標識物質を検出すること、を含む抗原を免疫学的に測定する方法である。
Another aspect of the method for immunologically measuring the antigen of the present invention is a method for immunologically measuring an antigen having an ability to bind to an antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate of the present invention.
A labeling substance carrying the antigen and an antibody that binds to the antigen at a site different from the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate or a substance that binds to the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate And detecting the complex of the antigen and the labeling substance or the labeling substance at the antibody immobilization site on the antibody fixing board. It is a method to measure.
本発明の抗原を免疫学的に測定する方法の好ましい態様は、標識物質が、蛍光粒子である。 In a preferred embodiment of the method for immunologically measuring the antigen of the present invention, the labeling substance is a fluorescent particle.
本発明の抗原を免疫学的に測定する方法の好ましい態様は、蛍光粒子が、１００〜５００ｎｍの直径からなる。 In a preferred embodiment of the method for immunologically measuring the antigen of the present invention, the fluorescent particles have a diameter of 100 to 500 nm.
本発明の別の側面によれば、本発明の抗原を免疫学的に測定する方法に使用するための免疫学的測定用キットにおいて、
該抗原に対する抗体を固定化した本発明の抗体固定基板と、該抗体固定基板に固定化された抗体と異なる部位において該抗原への結合性がある抗体又は該抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある物質を担持する標識物質を含む、免疫学的測定用キットが提供される。
According to another aspect of the present invention, in an immunoassay kit for use in a method for immunologically measuring the antigen of the present invention,
The antibody-immobilized substrate of the present invention on which an antibody against the antigen is immobilized, and an antibody having a binding property to the antigen at a site different from the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate or an antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate There is provided an immunoassay kit comprising a labeling substance that carries a substance capable of binding to the reagent.
本発明の免疫学的測定用キットの好ましい態様は、標識物質が、蛍光粒子である。 In a preferred embodiment of the immunological measurement kit of the present invention, the labeling substance is a fluorescent particle.
本発明の免疫学的測定用キットの好ましい態様は、蛍光粒子が、１００〜５００ｎｍの直径からなる。 In a preferred embodiment of the kit for immunological measurement of the present invention, the fluorescent particles have a diameter of 100 to 500 nm.
本発明の抗体固定基板は、従来法に比して、被験物質である抗原と該抗体固定基板に固定化された抗体、又は該抗原と該抗体固定基板に固定化された抗体と該抗体と異なるエピトープを認識する抗体を担持する標識物質との免疫複合体の形成を促進させることができる。その結果、本発明の抗体固定基板を用いた免疫学的測定方法は、従来法に比して、より高感度に被験物質である抗原を定量することができる。 Compared to conventional methods, the antibody-immobilized substrate of the present invention comprises a test substance antigen and an antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate, or the antigen and antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate and the antibody. Formation of an immune complex with a labeling substance carrying an antibody that recognizes a different epitope can be promoted. As a result, the immunological measurement method using the antibody-immobilized substrate of the present invention can quantify the antigen as the test substance with higher sensitivity than the conventional method.
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の抗体固定基板は、金属基板、該金属基板上に形成された２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜、及び該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に物理的な相互作用によって固定化された抗体からなる抗体固定基板である。ここで、該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する少なくとも１種の成分が、一方の末端に親水性基を有し、かつ該一方の末端に親水性基を有する少なくとも１種の成分が、該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する成分の合計に対して、０．０１〜２％の割合で存在する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The antibody-immobilized substrate of the present invention includes a metal substrate, a self-assembled monomolecular film formed of two or more components formed on the metal substrate, and a self-assembled monomolecular film formed of the two or more components. It is an antibody immobilization substrate made of an antibody immobilized by physical interaction. Here, at least one component forming a self-assembled monolayer composed of two or more components has a hydrophilic group at one end and has a hydrophilic group at one end. One type of component is present at a ratio of 0.01 to 2% with respect to the total of the components that form the self-assembled monolayer composed of the two or more types of components.
本発明の抗体固定基板は、例えば、バイオセンサー用基板として用いることができる。本明細書でいうバイオセンサーとは、最も広義に解釈されるべきものであり、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これらの互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。本発明の抗体固定基板の好適な用途は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；SPR）バイオセンサーや表面プラズモン蛍光（Surface Plasmon Fluoresence; SPF）バイオセンサーである。ＳＰＲバイオセンサーの構成については、例えば、特公平６−２７７０３号広報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図、米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。ＳＰＦバイオセンサーの構成については、例えば、特開２００８−２４９３６０号広報７ページ５行目から９ページ３６行目および第１図から第３図に記載されている。以下、本発明の抗体固定基板について具体的に説明する。 The antibody-immobilized substrate of the present invention can be used, for example, as a biosensor substrate. The biosensor referred to in this specification is to be interpreted in the broadest sense, and refers to a sensor that measures and detects a target substance by converting an interaction between biomolecules into a signal such as an electrical signal. means. A normal biosensor is composed of a receptor site for recognizing a chemical substance to be detected and a transducer site for converting a physical change or chemical change generated therein into an electrical signal. In the living body, there are enzymes / substrates, enzymes / coenzymes, antigens / antibodies, hormones / receptors and the like as substances having affinity for each other. Biosensors use the principle that one of these substances having affinity with each other is immobilized on a substrate and used as a molecular recognition substance, whereby the other substance to be matched is selectively measured. A suitable application of the antibody-immobilized substrate of the present invention is a surface plasmon resonance (SPR) biosensor or a surface plasmon fluorescence (SPF) biosensor. Concerning the configuration of the SPR biosensor, for example, Japanese Patent Publication No. 6-27703, PR 4, page 48 to page 14, line 15 and FIG. 1 to FIG. 8, US Pat. No. 6,829,073, column 6, line 31 to column 7 Line 47 and FIGS. 9A and 9B. The configuration of the SPF biosensor is described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-249360, page 7, line 5 to page 9, line 36 and FIGS. 1 to 3. Hereinafter, the antibody-immobilized substrate of the present invention will be specifically described.
１．金属基板
本発明の抗体固定基板は、抗体を固定化するための層を有する金属基板上に、抗体を塗布する。本発明では、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。本発明の抗体固定基板の用途によって、本発明の抗体固定基板に供する金属としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金等を利用することができるが、これらに限定されるものではない。これらの金属は単独又は組み合わせて使用することもできる。また、上記用途によっては、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。基板や金属膜の膜厚、金属膜の形成その他金属基板の製造に関する事項は、常法に従い、当業者により適宜調整して決定され得る。
1. Metal substrate The antibody-immobilized substrate of the present invention is prepared by coating an antibody on a metal substrate having a layer for immobilizing the antibody. In the present invention, a metal surface or a metal film can be used as a substrate. Depending on the application of the antibody-immobilized substrate of the present invention, as the metal to be used for the antibody-immobilized substrate of the present invention, for example, gold, silver, copper, aluminum, platinum or the like can be used, but is not limited thereto. . These metals can be used alone or in combination. Further, depending on the application, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal. The thickness of the substrate and the metal film, the formation of the metal film, and other matters relating to the production of the metal substrate can be determined by appropriately adjusting by a person skilled in the art according to a conventional method.
２．２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜
本発明の抗体固定基板における２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜は、異なる反応性基をもつ、少なくとも２種類の成分からなる、自己組織化単分子膜（SAMs；Self-Assembled Monolayers）である。自己組織化単分子膜とは、代表的には、アルカンチオール化合物を金表面に接触、放置した際に、アルカンチオ−ル化合物と金表面が反応して、Ａｕ−Ｓ結合を形成すると共に、アルキル長鎖同士の相互作用によって、金表面に形成される、高い配行性をもつ単分子膜として知られているもので、表面プラズモン共鳴／蛍光や、水晶発振子マイクロバランス（QCM；Quartz Crystal Microbalance）等の分野で広く利用されているものである。
2.2 Self-assembled monolayer composed of two or more components The self-assembled monolayer composed of two or more components in the antibody-immobilized substrate of the present invention comprises at least two components having different reactive groups. These are self-assembled monolayers (SAMs). A self-assembled monolayer typically includes an alkanethiol compound and a gold surface that react with an alkanethiol compound when left in contact with the gold surface to form an Au-S bond, It is known as a highly monolayered monolayer formed on the gold surface by the interaction between long chains. Surface plasmon resonance / fluorescence and Quartz Crystal Microbalance (QCM) ) Etc. are widely used in the field.
本発明における２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する成分は、例えば、下記式（１）で表すことができる。
上記式（１）において、金属基板への結合基としては、チオール基（−ＳＨ）だけでなく、ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）やスルフィド基（−Ｓ−）なども好ましく用いることができる。 In the above formula (1), not only a thiol group (—SH) but also a disulfide group (—S—S—), a sulfide group (—S—) and the like can be preferably used as the bonding group to the metal substrate. .
本発明の抗体固定基板における自己組織化単分子膜において、重要な点は、それが多成分からなる自己組織化単分子膜である点である。本発明の抗体固定基板において、２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する２種類以上の成分のうち、１種又は２種以上の成分は、一方の末端（上記式（１）のX）に親水性基、好ましくは液体中で負電荷を示す親水性基、より好ましくはカルボキシ基、ヒドロキシル基、スルホ基又はクロロ基を有する成分である。ただし、自己組織化単分子膜を形成する２種類以上の成分において、一方の末端に親水性基を有する成分の合計は、該自己組織化単分子膜を形成する成分の合計に対して、０．０１〜２％（mol／mol）が好ましい。さらにこの数値範囲において、例えば、下限値は０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７％（mol／mol）を、上限値は２、１．７、１．５、１．３、１．０％（mol／mol）をとり得る。自己組織化単分子膜を形成する成分において、一方の末端に親水性基を有する成分の合計を上記割合に制御することにより、被験物質である抗原に対する抗体を、該抗原に対する反応性を維持した状態で、２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に物理的な相互作用によって固定化することができる。該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に固定されている抗体の状態は、抗原との抗原抗体反応のし易さに影響し、検出感度や検出限界を左右するため、該抗体の状態をコントロールすることは、実用上、非常に重要である。 In the self-assembled monolayer film on the antibody-immobilized substrate of the present invention, an important point is that it is a multi-component self-assembled monolayer film. In the antibody-immobilized substrate of the present invention, among two or more components forming a self-assembled monolayer composed of two or more components, one or two or more components have one terminal (the above formula (1 X))) is a component having a hydrophilic group, preferably a hydrophilic group which shows a negative charge in a liquid, more preferably a carboxy group, a hydroxyl group, a sulfo group or a chloro group. However, in two or more types of components forming a self-assembled monolayer, the total of components having a hydrophilic group at one end is 0 with respect to the total of components forming the self-assembled monolayer. 0.01 to 2% (mol / mol) is preferable. Further, in this numerical range, for example, the lower limit is 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.07% (mol / mol), and the upper limit is 2, 1.7. 1.5, 1.3, 1.0% (mol / mol). In the component forming the self-assembled monolayer, the reactivity of the antibody against the test substance with the antigen was maintained by controlling the total of the components having a hydrophilic group at one end to the above ratio. In this state, it can be immobilized on a self-assembled monolayer consisting of two or more components by physical interaction. The state of the antibody immobilized on the self-assembled monolayer composed of two or more components affects the ease of antigen-antibody reaction with the antigen, and affects the detection sensitivity and the detection limit. It is very important in practice to control the state of an antibody.
本発明の抗体固定基板における、２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜の具体例としては、（１）１−ウンデカンチオールと１０−カルボキシ−１−デカンチオールからなる膜、（２）１−ウンデカンチオールと１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールからなる膜、（３）１−ウンデカンチオールと１０−カルボキシ−１−デカンチオールと１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールからなる膜などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ここで、（１）における膜中の１０−カルボキシ−１−デカンチオールの割合は、膜全体、すなわち１−ウンデカンチオールと１０−カルボキシ−１−デカンチオールとの合計に対して、０．０１〜２％（mol/mol）である。同様に、（２）における膜中の１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールの割合は、１−ウンデカンチオールと１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールとの合計に対して、０．０１〜２％（mol/mol）である。さらに、（３）における膜中の１０−カルボキシ−１−デカンチオールと１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールとの合計の割合は、膜全体である１−ウンデカンチオールと１０−カルボキシ−１−デカンチオールと１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールとの合計に対して、０．０１〜２％（mol/mol）である。 Specific examples of the self-assembled monolayer composed of two or more components in the antibody-immobilized substrate of the present invention include (1) a film composed of 1-undecanethiol and 10-carboxy-1-decanethiol, (2) Examples include a film composed of 1-undecanethiol and 11-hydroxy-1-undecanethiol, and (3) a film composed of 1-undecanethiol, 10-carboxy-1-decanethiol, and 11-hydroxy-1-undecanethiol. However, it is not limited to these. Here, the ratio of 10-carboxy-1-decanethiol in the film in (1) is 0.01 to about the entire film, that is, the total of 1-undecanethiol and 10-carboxy-1-decanethiol. 2% (mol / mol). Similarly, the ratio of 11-hydroxy-1-undecanethiol in the film in (2) is 0.01-2% (mol based on the total of 1-undecanethiol and 11-hydroxy-1-undecanethiol). / mol). Furthermore, the ratio of the total of 10-carboxy-1-decanethiol and 11-hydroxy-1-undecanethiol in the film in (3) is 1-undecanethiol and 10-carboxy-1-decanethiol as the whole film. And 0.01 to 2% (mol / mol) based on the total of 11-hydroxy-1-undecanethiol.
２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する２種以上の成分のモル比を制御するためには、２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する際に、金属基板表面に接触させる溶液中の、各成分のモル比をコントロールすることにより達成できる。 In order to control the molar ratio of two or more components forming a self-assembled monolayer composed of two or more components, when forming a self-assembled monolayer composed of two or more components, This can be achieved by controlling the molar ratio of each component in the solution brought into contact with the metal substrate surface.
このように金属基板上に、自己組織化単分子膜を形成することで、金属基板表面の状態の影響を直接受けることなく、安定に抗体を固定することができる。金属基板上に形成された、自己組織化単分子膜表面に、安定に抗体を固定することで、該抗体を介して、安定に被験物質である抗原を補足し、かつ金属基板の影響を最小限に抑えてSPRバイオセンサーやSPFバイオセンサーなどのバイオセンサーの実現を可能とする。 Thus, by forming a self-assembled monolayer on the metal substrate, the antibody can be stably immobilized without being directly affected by the state of the metal substrate surface. By immobilizing the antibody stably on the surface of the self-assembled monolayer formed on the metal substrate, the antigen as a test substance is stably captured via the antibody, and the influence of the metal substrate is minimized. It is possible to realize biosensors such as SPR biosensors and SPF biosensors to the limit.
３．抗体
本発明の抗体固定基板に供される抗体は、特に限定されるものではないが、例えば、その抗体が認識する抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その抗原によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
3. Antibody The antibody to be used for the antibody-immobilized substrate of the present invention is not particularly limited. For example, antiserum prepared from the serum of an animal immunized with an antigen recognized by the antibody, purified from antiserum Using an immunoglobulin fraction, a monoclonal antibody obtained by cell fusion using spleen cells of an animal immunized with the antigen, or a fragment thereof [eg, F (ab ′) 2, Fab, Fab ′, or Fv] be able to. These antibodies can be prepared by a conventional method. Furthermore, the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody, or may be a commercially available antibody or an antibody prepared from animal serum or culture supernatant by a known method.
断片化抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどに由来する抗体、具体的には、マウスIgG、マウスIgM、ラットIgG、ラットIgM、ウサギIgG、ウサギIgM、ヤギIgG、ヤギIgM、ヒツジIgG、ヒツジIgM等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルの両方に適用可能である。抗体のサブクラスとしてはマウスIgG1やマウスIgG2aなどがあるがこれらに限定されるものではない。断片化抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはFab、F(ab')2等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。本発明の免疫学的測定方法に供される抗体の具体例としては、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を抗原として認識する抗ｈＣＧモノクローナル抗体を挙げることができるが、これに限定されるものではない。 Fragmented antibodies can be used regardless of the animal species or subclass. For example, antibodies that can be used in the present invention are antibodies derived from monkeys, mice, rats, rabbits, goats, sheep, etc., specifically mouse IgG, mouse IgM, rat IgG, rat IgM, rabbit IgG, Rabbit IgM, goat IgG, goat IgM, sheep IgG, sheep IgM, etc. are applicable to both polyclonal and monoclonal. Examples of antibody subclasses include mouse IgG1 and mouse IgG2a, but are not limited thereto. A fragmented antibody is a molecule derived from a complete antibody having at least one antigen-binding site, and specifically, Fab, F (ab ′) 2, and the like. These fragmented antibodies are molecules obtained by enzyme or chemical treatment or using genetic engineering techniques. Specific examples of the antibody used in the immunological measurement method of the present invention include, but are not limited to, an anti-hCG monoclonal antibody that recognizes human chorionic gonadotropin (hCG) as an antigen. .
本発明において、抗体は、物理的な相互作用によって２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に固定される。本発明において物理的な相互作用とは、化学的な相互作用ではないという意味で最も広義に解釈されるべきものである。したがって、化学結合によらない２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上への抗体の固定化は、すべて本発明にいう物理的な相互作用による固定化と認められる。物理的な相互作用としては、例えば、物理吸着がある。物理吸着とは、吸着媒と吸着質との間で化学結合が認められず、単に物理的なファンデル・ワールス力によって起こる吸着をいう。２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜への抗体の物理的な相互作用による固定化は、例えば、２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に、抗体を含む溶液を添加し、０〜５０℃で、数分〜数時間静置することにより達成できる。なお、固定化の後に、抗体が固定化されなかった２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上の部位をブロッキング剤、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ブロックエース、スキムミルク、カゼインなどを使ってブロッキングしてもよい。さらに、ブロッキング剤とともに、又はブロッキング剤を除去した後に、ポリエチレングリコールや多糖類などの合成あるいは天然高分子、界面活性剤、市販のImmunoassay Stabilizer（ABI社）などの、固定化を安定化させる安定化剤を添加してもよい。 In the present invention, the antibody is immobilized on a self-assembled monolayer composed of two or more components by physical interaction. In the present invention, the physical interaction is to be interpreted in the broadest sense in the sense that it is not a chemical interaction. Therefore, the immobilization of the antibody on the self-assembled monolayer composed of two or more kinds of components not depending on the chemical bond is recognized as the immobilization by the physical interaction referred to in the present invention. Examples of the physical interaction include physical adsorption. Physical adsorption refers to adsorption that is caused by physical van der Waals force without chemical bonding between adsorbent and adsorbate. Immobilization of an antibody on a self-assembled monolayer composed of two or more components by physical interaction is performed, for example, by placing a solution containing the antibody on a self-assembled monolayer composed of two or more components. It can be achieved by adding and allowing to stand at 0 to 50 ° C. for several minutes to several hours. In addition, after immobilization, the site on the self-assembled monolayer composed of two or more components to which the antibody has not been immobilized is a blocking agent such as BSA (bovine serum albumin), block ace, skim milk, casein, etc. You may block using. In addition, with or after removal of the blocking agent, stabilization such as the synthesis of polyethylene glycol and polysaccharides, natural polymers, surfactants, and commercially available Immunoassay Stabilizer (ABI) stabilizes the immobilization. An agent may be added.
４．抗体固定基板
本発明においては、本発明の抗体固定基板を製造する方法を包含する。本発明の抗体固定基板は、これまでに述べた、金属基板、該金属基板上での２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜の形成、及び該金属基板上での物理的な相互作用による抗体の固定化によって、製造することができる。具体的には、本発明の抗体固定基板を製造する方法は、例えば、金属基板上に、２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する２又は複数の成分を用いて自己組織化単分子膜を形成し、次いで該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に物理的な相互作用によって抗体を固定化することを含む。ここで、該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する２又は複数の成分のうち１種又は２種以上の成分は、一方の末端に親水性基を有することは、上記した通りである。さらに、該一方の末端に親水性基を有する１種又は２種以上の成分を合計した割合が、該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する成分の合計に対して、０．０１〜２％（mol／mol）であることも上記した通りである。
4). Antibody Immobilization Substrate The present invention includes a method for producing the antibody immobilization substrate of the present invention. The antibody-immobilized substrate of the present invention comprises a metal substrate, a self-assembled monolayer composed of two or more components on the metal substrate, and a physical mutual substrate on the metal substrate. It can be produced by immobilizing an antibody by action. Specifically, the method for producing the antibody-immobilized substrate of the present invention includes, for example, self-organization using two or more components that form a self-assembled monolayer composed of two or more components on a metal substrate. Forming an immobilized monolayer, and then immobilizing an antibody by physical interaction on the self-assembled monolayer composed of two or more components. Here, one or two or more of the two or more components forming the self-assembled monolayer consisting of the two or more components have a hydrophilic group at one end. That's right. Furthermore, the ratio of the total of one or two or more components having a hydrophilic group at the one end is relative to the total of components that form a self-assembled monolayer consisting of the two or more components, As described above, it is 0.01 to 2% (mol / mol).
５．抗原を免疫学的に測定する方法
本発明の抗体固定基板を用いれば、該抗体固定基板に固定化された抗体に対する抗原を、抗原抗体反応などを利用して、免疫学的に定量等の測定を実施できる。本発明は、本発明の抗体固定基板を利用した、抗原を免疫学的に測定する方法を包含する。本発明の抗原を免疫学的に測定する方法は、例えば、抗原を本発明の抗体固定基板に接触させ、次いで該抗体固定基板における抗体固定化部位において、該抗原を検出することを含む方法や；抗原と、該抗体固定基板に固定化された抗体と異なる部位において該抗原への結合性がある抗体又は該抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある物質を担持する標識物質とを、該抗体固定基板に接触させ、次いで該抗体固定基板における抗体固定化部位において、該抗原と該標識物質との複合体又は該標識物質を検出することを含む方法を挙げることができる。
5). Method of immunologically measuring antigen When the antibody-immobilized substrate of the present invention is used, the antigen against the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate is measured immunologically using antigen-antibody reaction or the like. Can be implemented. The present invention includes a method for immunologically measuring an antigen using the antibody-immobilized substrate of the present invention. The method of immunologically measuring the antigen of the present invention includes, for example, a method comprising contacting the antigen with the antibody-immobilized substrate of the present invention, and then detecting the antigen at an antibody-immobilized site on the antibody-immobilized substrate. A labeling substance that carries an antigen and an antibody that binds to the antigen at a site different from the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate or a substance that binds to the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate Can be brought into contact with the antibody-immobilized substrate, and then the complex of the antigen and the labeling substance or the labeling substance is detected at the antibody-immobilized site on the antibody-immobilized substrate.
本発明の抗原を免疫学的に測定する方法における測定対象物である抗原は、本発明の抗体固定基板に固定化された抗体に特異的に認識され得るものである限りにおいて特に限定されるものではなく、抗原そのものが該抗体に認識されてもよいし、抗原の一部、つまりエピトープを介して該抗体に認識されてもよい。また、抗原は、抗体固定基板に固定化された抗体に認識される部位以外に、１又は複数の抗体に認識される部位（エピトープ）を持ち得る。 The antigen to be measured in the method of immunologically measuring the antigen of the present invention is particularly limited as long as it can be specifically recognized by the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate of the present invention. Instead, the antigen itself may be recognized by the antibody, or may be recognized by the antibody via a part of the antigen, that is, an epitope. Further, the antigen may have a site (epitope) recognized by one or more antibodies in addition to the site recognized by the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate.
本発明の抗原を免疫学的に測定する方法は、通常、被験試料中の抗原を測定する。本発明の抗原を免疫学的に測定する方法における被験試料としては、測定の対象となる物質である被験物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。 In the method of immunologically measuring the antigen of the present invention, the antigen in a test sample is usually measured. The test sample in the method of immunologically measuring the antigen of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample that may contain a test substance that is a substance to be measured. Biological samples, especially animal (especially human) body fluids (eg blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose or sputum) or feces (eg feces), organs, Mention may be made of tissues, mucous membranes and skin, swollen specimens (swabs), gargles, or animals and plants themselves or their dried bodies that are considered to contain them.
本発明の抗原を免疫学的に測定する方法では、被験試料をそのままで、あるいは、被験試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、さらには、該抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは該抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。抽出用溶媒としては、通常の免疫学的測定方法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液など）、あるいは、該溶媒で希釈することにより直接的に抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。 In the method of immunologically measuring the antigen of the present invention, the test sample is used as it is, or in the form of an extract obtained by extracting the test sample using an appropriate extraction solvent, Can be used in the form of a dilute solution obtained by diluting with a suitable diluent, or in a form obtained by concentrating the extract by an appropriate method. As a solvent for extraction, a solvent (for example, water, physiological saline, or buffer solution) used in a usual immunological measurement method, or an antigen-antibody reaction is directly performed by diluting with the solvent. Water miscible organic solvents that can be used can also be used.
本発明の抗原を免疫学的に測定する方法では、例えば、本発明の抗体固定基板をＳＰＲバイオセンサーの一部として抗原を測定する場合には、抗原と該抗体固定基板に固定化された抗体との間で抗原抗体反応により形成された複合体を検出することにより、該抗原を測定する。一方、本発明の抗原を免疫学的に測定する方法は、例えば、本発明の抗体固定基板をＳＰＦバイオセンサーの一部として抗原を測定する場合には、該抗体固定基板に固定化された抗体と異なる部位において該抗原への結合性がある抗体又は該抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある物質を担持する標識物質（蛍光粒子）を利用して、抗原、該抗体固定基板に固定化された抗体及び該標識物質に担持された抗体の間で抗原抗体反応により形成された複合体、又は該抗体固定基板に固定化された抗体及び該標識物質に担持された該抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある物質の間で抗原抗体反応により形成された複合体を検出することにより、該抗原を測定する。 In the method of immunologically measuring the antigen of the present invention, for example, when measuring the antigen using the antibody-immobilized substrate of the present invention as part of an SPR biosensor, the antigen and the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate are used. The antigen is measured by detecting the complex formed by antigen-antibody reaction. On the other hand, in the method of immunologically measuring the antigen of the present invention, for example, when the antigen is measured using the antibody-immobilized substrate of the present invention as a part of the SPF biosensor, the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate. Using a labeling substance (fluorescent particle) carrying an antibody that binds to the antigen at a different site or a substance that binds to the antibody immobilized on the antibody-immobilizing substrate, and immobilizing the antibody A complex formed by an antigen-antibody reaction between an antibody immobilized on a substrate and an antibody supported on the labeling substance, or an antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate and the antibody supported on the labeling substance The antigen is measured by detecting a complex formed by an antigen-antibody reaction between substances immobilized on the immobilization substrate and having a binding property to the antibody.
標識物質は、例えば、免疫凝集反応に通常用いられ得る高分子やガラスを材質とする物質を挙げることができるが、金属基板や該金属基板上に形成された２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜と相互作用を及ぼしやすい材質の物質は避けるべきである。本発明の抗体固定基板がＳＰＦバイオセンサーの一部として利用されるのであれば、標識物質は蛍光で着色された粒子（以下、蛍光粒子という）であることが好ましい。蛍光粒子の材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどの合成高分子粉末があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。粒子の平均粒径は、粒子の材質や抗原を定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、０．００１〜１０μｍ（より好ましくは１００〜５００ｎｍ）の範囲が好ましい。 Examples of the labeling substance include a substance made of a polymer or glass that can be usually used in an immunoaggregation reaction, and includes a metal substrate and a self-organization composed of two or more components formed on the metal substrate. Substances that are likely to interact with the oxidized monolayer should be avoided. If the antibody-immobilized substrate of the present invention is used as part of an SPF biosensor, the labeling substance is preferably fluorescently colored particles (hereinafter referred to as fluorescent particles). Specific examples of the material of the fluorescent particles include polystyrene, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer. , And synthetic polymer powders such as acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymer, and polyvinyl acetate acrylate, and latex in which these are uniformly suspended is preferable. The average particle diameter of the particles varies depending on the particle material, the concentration range for quantifying the antigen, the measuring instrument, and the like, but is preferably in the range of 0.001 to 10 μm (more preferably 100 to 500 nm).
本発明の抗原を免疫学的に測定する方法に供される標識物質は、（ａ）本発明の抗体固定基板に固定化された抗体と異なる部位（エピトープ）において抗原への結合性がある抗体、又は（ｂ）本発明の抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある物質を担持する。標識物質が上記（ａ）の物質を担持する場合は、測定対象物質である抗原は、抗体固定基板に固定化された抗体に認識される第一の部位と、標識物質に担持された抗体に認識される第二の部位の、少なくとも二種の抗体に認識される部位をもつ。上記（ｂ）の本発明の抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある物質とは、抗原そのものでも良いし本発明の抗体固定基板に固定化された抗体が認識する部位を持つ化合物でもよく、例えば、抗原の誘導体とタンパク質（例えばＢＳＡなど）とを結合させたような化合物などが該当する。 The labeling substance provided for the method of immunologically measuring the antigen of the present invention is (a) an antibody having an antigen-binding property at a site (epitope) different from the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate of the present invention. Or (b) carrying a substance capable of binding to the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate of the present invention. When the labeling substance carries the substance (a) above, the antigen as the measurement target substance is bound to the first site recognized by the antibody immobilized on the antibody immobilizing substrate and the antibody supported on the labeling substance. A second recognized site has a site recognized by at least two antibodies. The substance capable of binding to the antibody immobilized on the antibody-immobilizing substrate of the present invention described in (b) above may be an antigen itself or having a site recognized by the antibody immobilized on the antibody-immobilizing substrate of the present invention. The compound may be a compound, for example, a compound in which a derivative of an antigen and a protein (for example, BSA) are bound.
本発明の抗原を免疫学的に測定する方法は、抗原の存在の有無の検出や抗原の量の測定（すなわち、定量）などを含む、最も広い概念として解釈されるものとして、通常知られている免疫学的な測定方法を制限なく包含するものである。以下に、本発明の抗原を免疫学的に測定する方法の具体的な実施態様として、サンドイッチ法及び競合法について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The method of immunologically measuring the antigen of the present invention is generally known as being interpreted as the broadest concept, including detection of the presence or absence of an antigen, measurement of the amount of antigen (ie, quantification), etc. Without limitation. Hereinafter, the sandwich method and the competition method will be described as specific embodiments of the method for immunologically measuring the antigen of the present invention, but the present invention is not limited to these.
（サンドイッチ法）
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により抗原を測定することができる。まず、抗原に対して特異性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。次いで第１抗体を標識物質に担持させ、かつ第２抗体を金属基板上に形成させた２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に固定して抗体固定基板を作製する。次いで抗原を含む可能性のある被験試料（又はその抽出液）と標識物質とを、抗体固定基板上に接触させる。被験試料中に抗原が存在する場合には、抗原と標識物質に担持させた抗体との間、及び抗原と抗体固定基板に固定化された抗体との間で抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。結果として、被験試料中に抗原が存在する場合には、抗体固定基板に固定化された第２抗体と抗原と標識物質に担持させた第１抗体とからなる免疫複合体が形成される。サンドイッチ法では、該免疫複合体の形成する反応が終了した後、該免疫複合体を形成しなかった標識物質を除去し、洗浄する。次いで該免疫複合体の形成の度合いを標識物質の標識の強弱を検出することにより、抗原の濃度などを測定することができる。
(Sandwich method)
The sandwich method is not particularly limited. For example, the antigen can be measured by the following procedure. First, a first antibody and a second antibody having specificity for an antigen are prepared in advance by the method described above. Next, the first antibody is supported on a labeling substance, and the second antibody is immobilized on a self-assembled monolayer composed of two or more components formed on a metal substrate to produce an antibody-immobilized substrate. Next, a test sample (or an extract thereof) that may contain an antigen and a labeling substance are brought into contact with the antibody-immobilized substrate. When an antigen is present in the test sample, an antigen-antibody reaction occurs between the antigen and the antibody supported on the labeling substance, and between the antigen and the antibody immobilized on the antibody-immobilizing substrate. This antigen-antibody reaction can be performed in the same manner as a normal antigen-antibody reaction. As a result, when an antigen is present in the test sample, an immune complex composed of the second antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate, the antigen, and the first antibody supported on the labeling substance is formed. In the sandwich method, after the reaction to form the immune complex is completed, the labeling substance that has not formed the immune complex is removed and washed. Next, the concentration of the antigen can be measured by detecting the degree of formation of the immune complex and detecting the intensity of labeling of the labeling substance.
（競合法）
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により抗原を測定することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として知られている。
(Competitive law)
The competition method is not particularly limited. For example, the antigen can be measured by the following procedure. The competition method is known as a technique for detecting an antigen of a low molecular weight compound that cannot be assayed by the sandwich method.
まず、抗原に対して特異性を有する第１抗体を予め調製する。次いで第１抗体を、金属基板上に形成させた２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に固定して抗体固定基板を作製する。第１抗体に対して結合性を有する、抗原そのもの、または抗原と類似な部位を持ち抗原と同様の第１抗体に対するエピトープを持つ化合物を、標識物質に担持する。次いで抗原を含む可能性のある被験試料（又はその抽出液）と標識物質とを抗体固定基板に接触させると、その被験試料中に抗原が存在しない場合には、抗体固定基板固定化第１抗体と、標識物質に担持された、第１抗体に対して結合性を有する、抗原そのもの、または抗原と同様の第１抗体に対するエピトープを持つ化合物とにより、抗体固定基板上で抗原抗体反応が起き、抗体固定基板と標識物質とからなる免疫複合体が形成される。一方、抗原が存在する場合には、抗原が抗体固定基板固定化第1抗体に結合するために、その後の標識物質に担持させた第１交代に対して結合性を有する、抗原そのもの、または抗原と類似な部位を持ち抗原と同様の第１抗体に対するエピトープを持つ化合物との、抗体固定基板に固定化された第１抗体との抗原抗体反応が阻害され、抗原抗体反応による結合が起こらない。上記抗体抗原反応が終了した後、上記免疫複合体を形成しなかった標識物質を除去し洗浄する。次いで該免疫複合体の形成の度合いを標識物質の標識の強弱を検出することにより、抗原の濃度などを測定することができる。 First, a first antibody having specificity for an antigen is prepared in advance. Next, the first antibody is immobilized on a self-assembled monolayer composed of two or more components formed on a metal substrate to produce an antibody-immobilized substrate. The labeling substance carries the antigen itself having a binding property to the first antibody, or a compound having a site similar to the antigen and having the same epitope for the first antibody as the antigen. Next, when a test sample (or an extract thereof) that may contain an antigen and a labeling substance are brought into contact with the antibody-immobilized substrate, if no antigen is present in the test sample, the antibody-immobilized substrate-immobilized first antibody And an antigen-antibody reaction on the antibody-immobilized substrate by the antigen itself having a binding property to the first antibody, or a compound having an epitope for the first antibody similar to the antigen, carried on the labeling substance, An immune complex composed of the antibody-immobilized substrate and the labeling substance is formed. On the other hand, in the case where an antigen is present, the antigen itself or the antigen having the binding property to the first substitution carried on the subsequent labeling substance so that the antigen binds to the antibody-immobilized substrate-immobilized first antibody. The antigen-antibody reaction with the first antibody immobilized on the antibody-immobilizing substrate with a compound having a similar site to the antigen and having the same epitope for the first antibody as the antigen is inhibited, and binding due to the antigen-antibody reaction does not occur. After the antibody-antigen reaction is completed, the labeling substance that did not form the immune complex is removed and washed. Next, the concentration of the antigen can be measured by detecting the degree of formation of the immune complex and detecting the intensity of labeling of the labeling substance.
本発明の抗原を免疫学的に測定する方法に使用することのできる緩衝液は、通常の抗原抗体反応が行われるｐＨ条件下で緩衝能を有しているものであればよく、そのようなｐＨ条件として５〜１１、より好ましくは、６〜１０が用いられる。このｐＨ条件下で緩衝能を有す緩衝液の例として、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液など、通常の生化学実験において使用され得る緩衝液であれば、いずれも使用可能である。 The buffer solution that can be used in the method of immunologically measuring the antigen of the present invention may be any buffer solution that has a buffer capacity under pH conditions under which a normal antigen-antibody reaction is performed. The pH condition is 5 to 11, more preferably 6 to 10. Examples of buffers having a buffer capacity under this pH condition include, for example, normal biochemical experiments such as phosphate buffer, Tris buffer, MES buffer, HEPES buffer, glycine buffer, and citrate buffer. Any buffer can be used as long as it can be used in the above.
本発明の免疫学的に測定する方法において、各種免疫複合体の検出は、特に制限されないが、例えば、複合体の形成の度合いや標識物質の標識の強度を検出することができる機器、具体的には、ＳＰＲバイオセンサーや装置、ＳＰＦバイオセンサーや装置、マイクロプレートリーダーなどを用いて検出することができる。標識の強度の検出は、通常、抗原抗体反応後一定時間、例えば、数分〜数時間後に終了する。 In the immunological measurement method of the present invention, detection of various immune complexes is not particularly limited. For example, an apparatus capable of detecting the degree of complex formation and the intensity of labeling of a labeling substance, specifically Can be detected using an SPR biosensor or device, an SPF biosensor or device, a microplate reader or the like. The detection of the intensity of the label is usually completed after a certain time after the antigen-antibody reaction, for example, several minutes to several hours.
６．抗原を免疫学的に測定する方法のための免疫学的測定用キット
本発明は、本発明の抗原を免疫学的に測定する方法に使用される、免疫学的測定用キットを包含する。本発明の免疫学的測定用キットは、例えば、抗原に対する抗体を固定化した本発明の抗体固定基板と、該抗体固定基板に固定化された抗体と異なる部位において該抗原への結合性がある抗体又は該抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある物質を担持する標識物質を含むものが挙げられる。
6). The kit for immunological measurement for the method of measuring an antigen immunologically This invention includes the kit for immunological measurement used for the method of measuring the antigen of this invention immunologically. The immunoassay kit of the present invention has, for example, the antibody-immobilized substrate of the present invention on which an antibody against the antigen is immobilized, and has a binding property to the antigen at a site different from the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate. Examples include those containing a labeling substance carrying an antibody or a substance capable of binding to the antibody immobilized on the antibody-immobilizing substrate.
抗原や抗体等を標識物質に担持させる方法は、例えば、特開２０００−２０６１１５号公報に記載のような、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。例えば、抗体を標識物質に担持させる方法として、物理吸着法及び共有結合による化学結合法のいずれでも使用可能で、抗体を標識物質に担持させた後に抗体が被覆されていない担体表面を覆うブロッキング剤としても、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やブロックエース、スキムミルク、カゼインなどが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。 Any known method for preparing a reagent for immunoaggregation reaction, for example, as described in JP-A No. 2000-206115, can be used as a method for supporting an antigen, an antibody or the like on a labeling substance. For example, as a method for supporting an antibody on a labeling substance, either a physical adsorption method or a covalent chemical bonding method can be used. A blocking agent that covers a carrier surface that is not coated with an antibody after the antibody is supported on the labeling substance In addition, known substances such as BSA (bovine serum albumin), block ace, skim milk, and casein can be used. These blocking agents can be subjected to pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali, or the like, if necessary.
抗体を標識物質に担持させる具体的な方法を、以下に例示する。標識物質の固形分濃度が０．１〜１０％になるよう分散させた液に、０．０１〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した抗体溶液を添加して、混合する。温度４〜５０℃の条件下で５分間から〜４８時間撹拌を継続する。次いで遠心分離その他の方法により標識物質と溶液を分離して、溶液に含まれている、標識物質に結合しなかった抗体を十分に除去する。その後、標識物質を緩衝液にて洗浄する操作を０〜１０回繰り返す。標識物質と抗体を混合して、標識物質に抗体を結合させる操作を実施した後に、抗原抗体反応に関与しない成分、好ましくはタンパク質、より好ましくはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ブロックエース、スキムミルク及びカゼインなどのブロッキング剤を使用して標識物質表面の抗体が結合していない部分を保護し、測定時の非特異反応を防ぐことが望ましい。 A specific method for supporting the antibody on the labeling substance is exemplified below. An antibody solution adjusted to a concentration of 0.01 to 20 mg / mL is added to and mixed with a solution in which the solid content concentration of the labeling substance is 0.1 to 10%. Stirring is continued at a temperature of 4-50 ° C. for 5 minutes to ˜48 hours. Subsequently, the labeling substance and the solution are separated by centrifugation or other methods, and the antibody not bound to the labeling substance contained in the solution is sufficiently removed. Thereafter, the operation of washing the labeling substance with a buffer solution is repeated 0 to 10 times. After performing the operation of mixing the labeling substance and the antibody and binding the antibody to the labeling substance, components that do not participate in the antigen-antibody reaction, preferably proteins, more preferably BSA (bovine serum albumin), block ace, skim milk, and casein It is desirable to use a blocking agent such as to protect the portion of the labeling substance surface where the antibody is not bound to prevent nonspecific reaction during measurement.
抗原や抗体等を標識物質に担持させる際に、安定化剤を必要に応じて添加可能である。安定化剤とは、例えばグッドバッファーなどの緩衝液、ポリエチレングリコールや多糖類などの合成あるいは天然高分子、界面活性剤など、反応時の各試薬及び成分、あるいは反応の進行自体を安定化するものであれば特に制限されず、Immunoassay Stabilizer（ABI社）などの市販のものも使用可能である。反応時の各試薬及び成分とは、例えば、担体に結合させた抗体や測定対象成分のことであり、例えば、特開平８−１８７０９５号公報に記載されているように、抗体や酵素などのタンパク質を安定化するために糖類を添加することは公知の事実である。したがって、標識物質や基板中の抗体の安定性を維持するために糖類、アミノ酸などの安定化剤を共存させることは容易に推察可能である。また、抗原を測定の間、安定に保つことを目的として、同様に安定化剤を共存させることができる。 A stabilizer can be added as necessary when the antigen or antibody is supported on the labeling substance. Stabilizers, for example, buffers such as good buffer, synthetic or natural polymers such as polyethylene glycol and polysaccharides, surfactants, etc., which stabilize each reagent and component during the reaction, or the progress of the reaction itself If it is, it will not restrict | limit in particular, Commercially available things, such as Immunoassay Stabilizer (ABI company), can also be used. Reagents and components at the time of reaction are, for example, antibodies bound to a carrier and components to be measured. For example, as described in JP-A-8-187095, proteins such as antibodies and enzymes It is a known fact to add sugars to stabilize Therefore, it can be easily inferred that a stabilizer such as saccharide or amino acid is allowed to coexist in order to maintain the stability of the labeling substance or the antibody in the substrate. In addition, a stabilizer can be similarly present for the purpose of keeping the antigen stable during the measurement.
７．抗体固定基板の利用態様
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を、従来用いられている、蛍光測定法（ＦＩＡ）、酵素発色法（ＥＩＡ）、放射能測定法（ＲＩＡ）、発光法（ＣＬＥＩＡ）、電気化学発光法（ＥＣＬＩＡ）、磁気免疫測定法（ＭＩＡ）等の様々な手法を用いて、検出及び／又は測定することができる。また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などの非電気化学的方法を好ましく用いることができる。
7). Utilization Mode of Antibody Immobilization Substrate In the present invention, the interaction between a physiologically active substance immobilized on a sensor substrate and a test substance is used in the conventional fluorescence measurement method (FIA), enzyme color development method (EIA). , And can be detected and / or measured using various techniques such as radioactivity measurement (RIA), luminescence (CLEIA), electrochemiluminescence (ECLIA), and magnetic immunoassay (MIA). In addition, non-electrochemical methods such as surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, measurement technology using a functionalized surface from gold colloidal particles to ultrafine particles are preferably used. Can do.
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ２，ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ５，ＴｉＯ２，ＴｉＯ２-ＳｉＯ２，ＨｆＯ２，ＺｒＯ２，Ａｌ２Ｏ３，Ｓｉ３Ｎ４，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。 For example, as one embodiment, there is a structure in which a waveguide layer having a flat thin layer is provided on a substrate (for example, Pyrex glass). The waveguide layer and the substrate together form a so-called waveguide. The waveguide layer is, for example, an oxide layer (SiO2, SnO2, Ta2O5, TiO2, TiO2-SiO2, HfO2, ZrO2, Al2O3, Si3N4, HfON, SiON, scandium oxide or a mixture thereof), a plastic layer (for example, polystyrene, polyethylene, A multilayer laminate such as polycarbonate) is possible. In order for light rays to propagate through the waveguide layer by total reflection, the refractive index of the waveguide layer must be greater than the refractive index of an adjacent medium (for example, a base material or an additional layer described later). A diffraction grating is disposed on the surface of the waveguide layer or the volume of the waveguide layer facing the substrate or the measurement substance. The diffraction grating can be formed in the substrate by embossing, holography or other methods. A thin waveguide film having a higher refractive index is then coated on the upper surface of the diffraction grating. The diffraction grating focuses incident light to the waveguide layer, emits a mode already guided in the waveguide layer, transmits part of the mode in the traveling direction, and reflects part of the mode. Has function. The waveguide layer covers the grating region with an additional layer. The additional layer can be a multilayer film as required. The additional layer can have a function that enables selective detection of a substance contained in the measurement substance. As a preferred embodiment, a layer having a detection function can be provided on the outermost surface of the additional layer. As a layer having such a detection function, a layer capable of immobilizing a physiologically active substance can be used.
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。 As another embodiment, a configuration in which an array of diffraction grating waveguides is incorporated in a well of a microplate is also possible (Japanese Patent Publication No. 2007-501432). That is, if the diffraction grating waveguides are arranged in an array on the bottom surface of the well of the microplate, it is possible to screen a drug or chemical substance with high throughput.
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。 In order to enable detection of a physiologically active substance on the upper layer (detection region) of the diffraction grating waveguide, the diffraction grating waveguide detects incident light and reflected light to detect a change in refractive characteristics. For this purpose, one or more light sources (eg lasers, diodes) and one or more detectors (eg spectrometers, CCD cameras or other photodetectors) can be used. . There are two different modes of operation—spectroscopy and angle methods for measuring refractive index changes. In spectroscopy, a broadband beam is sent as incident light to a diffraction grating waveguide and the reflected light is collected and measured, for example, with a spectrometer. By observing the spectral position of the resonance wavelength (peak), the refractive index change, that is, the coupling at or near the surface of the diffraction grating waveguide can be measured. Also, in the angle method, nominally single wavelength light is focused to produce a range of illumination angles and directed into the diffraction grating waveguide. The reflected light is measured by a CCD camera or other photodetector. By measuring the position of the resonance angle reflected by the diffraction grating waveguide, it is possible to measure the refractive index change, ie, coupling, at or near the surface of the diffraction grating waveguide.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
１．金膜上への2種の分子からなる自己組織化単分子膜（SAM）の形成
pMMA製の8連プレート（自社製）のウェル底面に金を蒸着し金膜とした。1-Undecanethiol（和光純薬323-78512 ）および、末端にカルボキシ基(COOH)を持つ10-Carboxy-1-decanethiol（同仁化学C835）の計2種のアルカンチオールをヘキサン（和光純薬081-00413）に溶解して1mM溶液を作製したのち、それぞれを表１割合で混合した。1-Undecanethiolが100%、90%、及び0%の物を比較例とした。
Gold was vapor-deposited on the bottom of the well of a pMMA 8-plate (made in-house) to form a gold film. A total of two alkanethiols, 1-Undecanethiol (Wako Pure Chemicals 323-78512) and 10-Carboxy-1-decanethiol (Dojindo C835), which has a carboxy group (COOH) at the end, are added to hexane (Wako Pure Chemicals 081-00413). 1) to prepare a 1 mM solution, and then mixed in the proportions shown in Table 1. Comparative examples were 1-Undecanethiol 100%, 90%, and 0%.
アルカンチオール混合溶液を100μLずつウェルに添加し、オーバーナイト（16時間以上）静置することでSAMを形成した。その後混合溶液を除去し、ヘキサン100μLにて3回・超純水100μLにて1回洗浄後乾燥した。 100 μL of the alkanethiol mixed solution was added to each well and allowed to stand overnight (16 hours or longer) to form SAM. Thereafter, the mixed solution was removed, washed 3 times with 100 μL of hexane and once with 100 μL of ultrapure water, and then dried.
２．SAM上への抗体固定化
抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン(=hCGと略す)モノクローナル抗体（Anti-h alpha subunit 6601 SPR-5, Medix社製）を濃度10 μg/mlとなるよう150mM NaCl溶液に希釈し、SAMを形成したウェルに100μLずつ添加した後1時間室温で静置した。抗体液除去後、ブロッキング剤として1％カゼインを含むPBS(pH7.4)を100μLずつ各ウェルに添加し、1時間室温で静置した。カゼイン液除去後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer（ABI社製）を100μLずつ各ウェルに添加し、室温で30分間放置の後除去した。以上によって抗体固定化したものを乾燥機中で完全に乾かし、以降の実験に使用した。
2. Antibody immobilization on SAM Anti-human chorionic gonadotropin (= hCG) monoclonal antibody (Anti-h alpha subunit 6601 SPR-5, manufactured by Medix) was diluted in 150 mM NaCl solution to a concentration of 10 μg / ml. Then, 100 μL was added to each well in which SAM was formed, and then allowed to stand at room temperature for 1 hour. After removal of the antibody solution, 100 μL of PBS (pH 7.4) containing 1% casein as a blocking agent was added to each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After removing the casein solution, 100 μL of Immunoassay Stabilizer (manufactured by ABI) was added to each well as a stabilizer, left at room temperature for 30 minutes, and then removed. The antibody immobilized as described above was completely dried in a dryer and used for the subsequent experiments.
３．抗hCG蛍光粒子試薬の作製
蛍光粒子に結合する抗hCG抗体は、SAM上に固定した抗体とは異なるhCG上のエピトープを認識する抗体である。２％近赤外蛍光粒子溶液（Ｆ８８１１、φ２１０ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）２５０ μＬに５０ ｍＭ ＭＥＳバッファー(ｐＨ ６．０)１５０μＬおよび、５．０ｍｇ／ｍＬ抗hCGモノクローナル抗体（Anti-hCG 5008 SP-5, Medix社製）溶液１００ μＬを加え室温で１５分間攪拌した。４００ ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を５ μL加え室温で2時間撹拌した。２ ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を ２５μＬ添加し３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）にて、粒子を沈降させた。上清を取り除き、ＰＢＳ (ｐＨ７．４)を５００μL加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させた。さらに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、蛍光粒子を再分散させることで、抗hCG蛍光粒子の1％（w/v）溶液を得た。
3. Preparation of Anti-hCG Fluorescent Particle Reagent Anti-hCG antibody that binds to fluorescent particles is an antibody that recognizes an epitope on hCG different from the antibody immobilized on SAM. 250 μL of 2% near-infrared fluorescent particle solution (F8811, φ210 nm, Molecular Probes), 150 μL of 50 mM MES buffer (pH 6.0) and 5.0 mg / mL anti-hCG monoclonal antibody (Anti-hCG 5008 SP-5) (Manufactured by Medix) 100 μL of the solution was added and stirred at room temperature for 15 minutes. 5 μL of a 400 mg / mL aqueous solution of WSC (Part No. 01-62-0011, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and stirred at room temperature for 2 hours. After adding 25 μL of 2 mol / L Glycine aqueous solution and stirring for 30 minutes, the particles were sedimented by centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C., 15 minutes). The supernatant was removed, 500 μL of PBS (pH 7.4) was added, and the fluorescent particles were redispersed with an ultrasonic cleaner. After further centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C., 15 minutes), the supernatant was removed, 500 μL of 1% BSA in PBS (pH 7.4) was added, and the fluorescent particles were redispersed, thereby anti-hCG fluorescence. A 1% (w / v) solution of particles was obtained.
４．抗hCG蛍光粒子によるhCG測定
上記条件で作製した抗hCG蛍光粒子を1重量％のBSAを含むPBS溶液（pH7.4）で0.02重量％に希釈した。また、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に1.8ｘ10-10 MとなるようhCG溶液を調製し、hCG抗原溶液とした。0.02重量％抗hCG蛍光粒子30μＬとhCG抗原溶液30μＬを混合し、5分間室温で反応後、全量を上記した抗hCG抗体固定化SAMプレートの各ウェルに添加した。４時間室温で静置したのち、反応液を除去した。Tween0.05%を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）100μＬで４回洗浄した後、マイクロプレートリーダー（ARVOMX, パーキンエルマー社製）を用いて蛍光強度を測定した。その結果、表１に表される混合比(3)においてシグナルのピークが観察された。ピークでのシグナル量は比較例である混合比(1)の約2.6倍となった（図１）。
4). HCG Measurement Using Anti-hCG Fluorescent Particles Anti-hCG fluorescent particles prepared under the above conditions were diluted to 0.02 wt% with a PBS solution (pH 7.4) containing 1 wt% BSA. In addition, an hCG solution was prepared in a phosphate buffer solution (pH 7.4) so as to be 1.8 × 10 −10 M to obtain an hCG antigen solution. After mixing 30 μL of 0.02 wt% anti-hCG fluorescent particles and 30 μL of hCG antigen solution for 5 minutes at room temperature, the entire amount was added to each well of the anti-hCG antibody-immobilized SAM plate. After standing at room temperature for 4 hours, the reaction solution was removed. After washing 4 times with 100 μL of a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 0.05% Tween, the fluorescence intensity was measured using a microplate reader (ARVOMX, manufactured by PerkinElmer). As a result, a signal peak was observed at the mixing ratio (3) shown in Table 1. The amount of signal at the peak was about 2.6 times the mixing ratio (1) as a comparative example (FIG. 1).
５．抗体固定化量の測定
Auセンサーチップ（Biacore社製BR-1004-05）を表１から選択した(1),(3),(4)溶液にオーバーナイトで浸漬しSAMを形成した。Biacore3000（Biacore社）を用いて20μg/mlの抗hCG抗体溶液を5 μl/minの割合で30分間流し抗体を固定化した。固定化と同時にRU（共鳴シグナル；ＲＵ値）を測定し抗体の結合相対量を見積もった（図２）。シグナルが増加する混合SAM 0.1%においては抗体量の増加が見られなかったことから、配向性の向上などによって抗体の反応性が上昇していると考えられる。
5). Measurement of antibody immobilization amount
Au sensor chips (BR-1004-05 manufactured by Biacore) were immersed in the solutions (1), (3) and (4) selected from Table 1 overnight to form SAM. Using Biacore 3000 (Biacore), a 20 μg / ml anti-hCG antibody solution was flowed at a rate of 5 μl / min for 30 minutes to immobilize the antibody. Simultaneously with the immobilization, RU (resonance signal; RU value) was measured to estimate the relative amount of antibody binding (FIG. 2). In the mixed SAM 0.1% in which the signal increases, no increase in the amount of antibody was observed. Therefore, it is considered that the reactivity of the antibody is increased by improving the orientation.
実施例1で述べた1-Undecanethiolに混合する自己組織化単分子として、新たに、末端にヒドロキシ基(OH)を持つアルカンチオールである11-Hydroxy-1-undecanethiol（同仁化学 H337）を選択し、表２の割合で２種類の成分からなる自己組織化単分子膜を形成させた。
2種のアルカンチオオールからなるSAM膜を形成し、SAM膜上に抗体を物理結合にて結合した。抗hCG抗体を結合する蛍光粒子として２％黄緑赤外粒子溶液（Ｆ８８０３、φ５００ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を使用し、実施例1と同様なhCG検出アッセイを行った（図３）。その結果、実施例1と同様に表１に表される混合比(3)、すなわち11-Hydroxy-1-undecanethiolが全体の0.1%となる場合においてシグナルのピークが観察され、そのシグナル量は比較例である混合比(1)の約1.2倍となった。抗原抗体アッセイのシグナルが極端に低下する混合SAM20%でも、0%と同等の抗体固定化量を示した（図４）。 A SAM film composed of two types of alkanethiools was formed, and antibodies were bound on the SAM film by physical bonding. The same hCG detection assay as in Example 1 was performed using a 2% yellow-green infrared particle solution (F8803, φ500 nm, Molecular Probes) as fluorescent particles that bind the anti-hCG antibody (FIG. 3). As a result, a signal peak was observed when the mixing ratio (3) shown in Table 1 as in Example 1, ie, 11-Hydroxy-1-undecanethiol was 0.1% of the total, and the signal amount was compared. It was about 1.2 times the mixing ratio (1) as an example. Even with 20% mixed SAM, in which the signal of the antigen-antibody assay was extremely reduced, an antibody immobilization amount equivalent to 0% was shown (FIG. 4).
Claims (13)
該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する少なくとも１種の成分が、一方の末端に親水性基を有し、かつ
該一方の末端に親水性基を有する少なくとも１種の成分が、該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する成分の合計に対して、０．０１〜２％（mol／mol）の割合で存在する、
抗体固定基板。 Immobilized by physical interaction on metal substrate, self-assembled monolayer composed of two or more components formed on the metal substrate, and self-assembled monolayer composed of two or more components In the antibody immobilization substrate comprising the prepared antibody,
At least one component forming a self-assembled monolayer composed of two or more components has at least one hydrophilic group at one end and at least one hydrophilic group at the one end. The component is present at a ratio of 0.01 to 2% (mol / mol) with respect to the total of the components forming the self-assembled monolayer composed of the two or more types of components.
Antibody immobilization substrate.
形成された２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜上に物理的な相互作用によって抗体を固定化すること
を含む、抗体固定基板を製造する方法において、
該複数の成分のうち少なくとも１種の成分が、一方の末端に親水性基を有し、かつ
該一方の末端に親水性基を有する少なくとも１種の成分が、該２種類以上の成分からなる自己組織化単分子膜を形成する成分の合計に対して、０．０１〜２％（mol／mol）の割合で存在する、
抗体固定基板を製造する方法。 Forming a self-assembled monolayer using two or more components on a metal substrate; and antibodies by physical interaction on the formed self-assembled monolayer consisting of two or more components In a method for producing an antibody-immobilized substrate, comprising immobilizing
At least one component of the plurality of components has a hydrophilic group at one end, and at least one component having a hydrophilic group at one end includes the two or more components. Present at a rate of 0.01 to 2% (mol / mol) with respect to the total of the components forming the self-assembled monolayer;
A method for producing an antibody-immobilized substrate.
該抗原を、該抗体固定基板に接触させること；及び
該抗体固定基板における抗体固定化部位において、該抗原を検出すること、を含む抗原を免疫学的に測定する方法。 In the method of immunologically measuring an antigen having a binding property to the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate according to any one of claims 1 to 3,
A method for immunologically measuring an antigen, comprising contacting the antigen with the antibody-immobilized substrate; and detecting the antigen at an antibody-immobilized site on the antibody-immobilized substrate.
該抗原と、該抗体固定基板に固定化された抗体と異なる部位において該抗原への結合性がある抗体又は該抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある物質を担持する標識物質とを、該抗体固定基板に接触させること；及び
該抗体固定基板における抗体固定化部位において、該抗原と該標識物質との複合体又は該標識物質を検出すること、を含む抗原を免疫学的に測定する方法。 In the method of immunologically measuring an antigen having a binding property to the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate according to any one of claims 1 to 3,
A labeling substance carrying the antigen and an antibody that binds to the antigen at a site different from the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate or a substance that binds to the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate And detecting the complex of the antigen and the labeling substance or the labeling substance at the antibody immobilization site on the antibody fixing board. How to measure.
該抗原に対する抗体を固定化した請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体固定基板と、該抗体固定基板に固定化された抗体と異なる部位において該抗原への結合性がある抗体又は該抗体固定基板に固定化された抗体への結合性がある物質を担持する標識物質を含む、免疫学的測定用キット。 In an immunological measurement kit for use in the method of immunologically measuring the antigen according to any one of claims 8 to 10,
The antibody-immobilized substrate according to any one of claims 1 to 3, wherein an antibody against the antigen is immobilized, and an antibody having a binding property to the antigen at a site different from the antibody immobilized on the antibody-immobilized substrate, A kit for immunological measurement comprising a labeling substance carrying a substance capable of binding to an antibody immobilized on the antibody-immobilizing substrate.
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