JP2010145369A - Method and apparatus for delivering fluid to analyzing means in gradient analysis - Google Patents

Method and apparatus for delivering fluid to analyzing means in gradient analysis Download PDF

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原一 植松
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for delivering a fluid capable of achieving accurate composition change even with a minute flow rate in a gradient analysis using a liquid chromatograph apparatus. <P>SOLUTION: An eluent having different compositions over time is delivered to an analyzing means by using a gradient generating apparatus in accordance with the steps of: connecting by a passage switching means a gradient generating column and a passage through which the eluent mixed by a mixing means flows to store the eluent mixed by the mixing means along a length direction of the gradient generating column; and connecting by the passage switching means the gradient generating column and a passage connected with the analyzing means to deliver the eluent stored in the gradient generating column to the analyzing means in a direction opposite to that where the eluent is stored in the former step. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

グラジエント分析において、分析手段へ経時的に異なる組成の溶離液を送液する方法、及び送液装置に関する。   The present invention relates to a method for feeding eluents having different compositions over time to an analysis means in a gradient analysis, and a liquid feeding apparatus.

液体クロマトグラフ装置における溶離液の送液用ポンプとしては、使い勝手のよさと送液の安定性のよさからプランジャ式ポンプがよく用いられる(特許文献1)。   As a pump for feeding an eluent in a liquid chromatograph apparatus, a plunger type pump is often used because of ease of use and stability of liquid feeding (Patent Document 1).

一般的なプランジャ式ポンプの構造を図1から3に示す。プランジャ式ポンプ(10)はチャンバ(11)、プランジャ(12)、入口側チェック弁(13)、出口側チェック弁(14)で構成される(図1)。入口側チェック弁(13)及び出口側チェック弁(14)は、それぞれ下からシート(15)、ボール(16)の順に構成される(図2及び3)。ボール(16)とシート(15)が密着した状態では、液体は通過できない(図2(b)、図3(b))。   The structure of a general plunger pump is shown in FIGS. The plunger pump (10) includes a chamber (11), a plunger (12), an inlet side check valve (13), and an outlet side check valve (14) (FIG. 1). The inlet side check valve (13) and the outlet side check valve (14) are configured from the bottom in the order of the seat (15) and the ball (16), respectively (FIGS. 2 and 3). When the ball (16) and the sheet (15) are in close contact with each other, the liquid cannot pass (FIGS. 2 (b) and 3 (b)).

液体を吸引する工程では(図1(a))は、プランジャ(15)は右方向に移動する。これにより、チャンバ(11)内は陰圧状態になるため、入口側チェック弁(13)のボール(16)は上方向に持ち上がり開放状態となり(図2(a))、出口側チェック弁(14)のボール(16)は重力により下がりシート(15)に密着し閉止状態となって(図3(b))、液体がチャンバ(11)内に吸引される。液体を吐出する工程では(図1(b))は、プランジャ(12)は左方向に移動する。これにより、チャンバ(11)内は加圧になるため、入口側チェック弁(13)のボール(16)が下がり、シート(15)に密着し閉止状態となり(図2(b))、出口側チェック弁(14)のボール(16)は上方向に持ち上がり開放状態となって(図3(a))、チャンバ(11)内の液体が吐出される。前記吸引工程、吐出工程を繰り返すことで、連続的に液体が流れる。   In the step of sucking the liquid (FIG. 1A), the plunger (15) moves in the right direction. As a result, the inside of the chamber (11) is in a negative pressure state, so that the ball (16) of the inlet side check valve (13) is lifted upward and opened (FIG. 2 (a)), and the outlet side check valve (14) ) Is lowered by gravity and is brought into close contact with the sheet (15) (FIG. 3 (b)), and the liquid is sucked into the chamber (11). In the step of discharging the liquid (FIG. 1B), the plunger (12) moves in the left direction. As a result, the inside of the chamber (11) is pressurized, so that the ball (16) of the inlet side check valve (13) is lowered and comes into close contact with the seat (15) (FIG. 2 (b)). The ball (16) of the check valve (14) is lifted upward and opened (FIG. 3 (a)), and the liquid in the chamber (11) is discharged. By repeating the suction process and the discharge process, the liquid flows continuously.

液体クロマトグラフィでは、1種類の溶離液で分析を行なうアイソクラティック溶出法と2種類以上の溶離液組成を変化させて分析を行なうグラジエント溶出法がある。   In liquid chromatography, there are an isocratic elution method in which analysis is performed with one type of eluent and a gradient elution method in which analysis is performed by changing the composition of two or more eluents.

アイソクラティック溶出法では1つの溶離液を1つのポンプで一定の流量で送液を行なう。そのため、毎分数から数十μL程度の流量であっても、プランジャ式ポンプを用いて安定的に送液することができる。   In the isocratic elution method, one eluent is sent at a constant flow rate by one pump. Therefore, even if the flow rate is from several minutes to several tens of μL, the liquid can be stably fed using the plunger pump.

一方、グラジエント溶出法では溶離液の数だけポンプを配して、総量を一定に保ち分析を行なう。2種類の溶離液を使用した場合は、ポンプA(溶離液A)とポンプB(溶離液B)の流量を変化させ、組成に変化をもたせる。例えば、毎分1.00mLで、溶離液A:100%(溶離液B:0%)から溶離液A:0%(溶離液B:100%)のグラジエントを行なう場合、ポンプAは毎分1.00mLから徐々に流量を下げ、最終的に停止する。逆にポンプBは停止状態から徐々に流量を上げていき、最終的には、毎分1.00mLで送液される。ポンプA、ポンプBの総量は常に毎分1.00mLである(図4)。   On the other hand, in the gradient elution method, pumps are arranged for the number of eluents, and the total amount is kept constant for analysis. When two kinds of eluents are used, the flow rate of pump A (eluent A) and pump B (eluent B) is changed to change the composition. For example, when a gradient of eluent A: 100% (eluent B: 0%) to eluent A: 0% (eluent B: 100%) is performed at 1.00 mL per minute, pump A is 1 per minute. Gradually lower the flow from 0.000 mL and finally stop. On the contrary, the pump B gradually increases the flow rate from the stopped state, and finally the liquid is fed at 1.00 mL per minute. The total amount of pump A and pump B is always 1.00 mL per minute (FIG. 4).

プランジャ式ポンプは、概ね毎分100μL以上の流量では、優れたグラジエント特性を有するが、流量が低くなるにつて、特性が悪くなる傾向がある。その理由として、流量が低いほど、プランジャ(11)の移動速度が遅くなり、チェック弁(15)内のボール(16)の動作が緩慢になるためである。特に、停止状態から流量を上げて行く側のポンプ(前記例ではポンプB)は、グラジエント開始時の動作が不安定になる。図5に模式図を示す。ポンプBは、停止状態から流量を徐々に上げるため、チャンバ(11)内の圧力が、ボール(16)を押し上げるに必要な圧力に達するまで溶離液は流れない。一方、一定送液状態から流量を下げて行く側のポンプ(前記例ではポンプA)は、グラジエント終了時まで動作は安定である(図5(a))。そのため、特にグラジエント開始時に、設定値からの組成及び総流量の乖離が起こる。また、その乖離度合いも変化することから、グラジエントの再現性に大きな影響を与える(図5(b))。グラジエント分析の際、グラジエント開始時の組成および総流量が不安定になると、その後の分析全体に影響を及ぼす(図5(c))。   The plunger pump generally has excellent gradient characteristics at a flow rate of 100 μL or more per minute, but the characteristics tend to deteriorate as the flow rate decreases. The reason is that the lower the flow rate, the slower the movement speed of the plunger (11) and the slower the operation of the ball (16) in the check valve (15). In particular, the pump on the side of increasing the flow rate from the stopped state (pump B in the above example) has an unstable operation at the start of the gradient. FIG. 5 shows a schematic diagram. Since the pump B gradually increases the flow rate from the stop state, the eluent does not flow until the pressure in the chamber (11) reaches the pressure necessary to push up the ball (16). On the other hand, the operation of the pump (the pump A in the above example) that decreases the flow rate from the constant liquid feeding state is stable until the gradient is finished (FIG. 5A). Therefore, especially at the start of the gradient, the composition and the total flow rate deviate from the set values. In addition, since the degree of deviation also changes, it greatly affects the reproducibility of the gradient (FIG. 5B). In the gradient analysis, if the composition at the start of the gradient and the total flow rate become unstable, the entire subsequent analysis is affected (FIG. 5C).

液体クロマトグラフ装置における溶離液の送液用ポンプの別の態様としては、シリンジ式ポンプがある。当該ポンプは、低流量でもプランジャ式ポンプと比較し安定な送液ができるものの、シリンジ容量が有限であること、連続的な使用が困難であること、各バッチ間に差異が生じやすいといった欠点を有する。   As another aspect of the pump for feeding the eluent in the liquid chromatograph apparatus, there is a syringe type pump. Although the pump can deliver liquid stably even at a low flow rate compared to a plunger pump, it has the disadvantages that the syringe capacity is limited, continuous use is difficult, and differences between batches are likely to occur. Have.

グラジエント分析に必要な溶離液を供給する装置としては、
複数種類の溶離液をそれぞれ制御された流量で制御した流量で送液する送液手段と、
前記送液手段から送液された溶離液を混合する混合器と、
前記混合器により混合された溶離液を管内にその長さ方向に沿って供給した順に収容していくグラジエントチューブと、
前記グラジエントチューブを前記送液手段と分析装置との間で切り替えて接続する流路切替バルブを備えた装置があり(特許文献2)、前記装置を液体クロマトグラフに応用することで、混合器による溶離液の組成変化の時間遅れがないグラジエント分析を可能としている。しかしながら、当該装置によるグラジエント分析では、グラジエントチューブに供給された溶離液を分析手段に送液する際に、前記混合器により混合された溶離液の供給方向と同じ方法に送液している。そのため、前述したプランジャポンプを用いたときに生じる問題を解決することは困難であった。また、特許文献2の装置におけるグラジエントチューブは固定容量であるため、分析装置中の分析カラムの容量が変化した場合、柔軟に対応するのが困難であった。
As a device to supply the eluent necessary for gradient analysis,
A liquid feeding means for feeding a plurality of types of eluents at a controlled flow rate;
A mixer for mixing the eluent fed from the liquid feeding means;
A gradient tube that contains the eluent mixed by the mixer in the order in which the eluent is supplied along the length of the tube;
There is an apparatus provided with a flow path switching valve for switching and connecting the gradient tube between the liquid feeding means and the analyzer (Patent Document 2), and by applying the apparatus to a liquid chromatograph, a mixer is used. Gradient analysis without time delay of composition change of eluent is enabled. However, in the gradient analysis by the apparatus, when the eluent supplied to the gradient tube is sent to the analyzing means, it is sent in the same method as the supply direction of the eluent mixed by the mixer. Therefore, it has been difficult to solve the problems that occur when the above-described plunger pump is used. Moreover, since the gradient tube in the apparatus of patent document 2 is a fixed capacity | capacitance, when the capacity | capacitance of the analysis column in an analyzer changes, it was difficult to respond flexibly.

特開2002−243712号公報JP 2002-243712 A 特開2003−014718号公報JP 2003-014718 A

本発明の課題は、液体クロマトグラフ装置を用いたグラジエント分析において、微小流量であっても正確な組成変化を実現するための送液方法、及び送液装置を提供することにある。   The subject of this invention is providing the liquid feeding method and liquid feeding apparatus for implement | achieving an exact composition change even if it is a micro flow rate in gradient analysis using a liquid chromatograph apparatus.

上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する:
第一の発明は、複数種類の溶離液をそれぞれ制御された流量で送液する送液手段と、
前記送液手段により送液された溶離液を混合する混合手段と、
前記混合手段により混合された溶離液を供給された順に長さ方向に沿って収容するグラジエント作成カラムと、
前記グラジエント作成カラムと、前記混合手段により混合された溶離液が流れる流路、または分析手段に接続されている流路とを接続するための流路切替手段を備えた、
グラジエント作成装置を用いて、分析手段へ経時的に異なる組成の溶離液を送液する、分析手段への送液方法であって、
以下に示す工程からなることを特徴とする、前記送液方法である:
(1)前記流路切替手段により、前記グラジエント作成カラムと前記混合手段により混合された溶離液が流れる流路とを接続し、前記グラジエント作成カラムの長さ方向に沿って前記混合手段により混合された溶離液を収容する工程
(2)前記流路切替手段により、前記グラジエント作成カラムと前記分析手段に接続されている流路とを接続し、前記グラジエント作成カラムに収容された溶離液を(1)の工程で溶離液を収容する方向とは逆の方向に前記分析手段へ送液する工程
第二の発明は、前記送液手段がプランジャ式ポンプであることを特徴とする、第一の発明に記載の送液方法である。
The present invention made in view of the above problems includes the following inventions:
The first invention is a liquid feeding means for feeding a plurality of types of eluents at controlled flow rates,
Mixing means for mixing the eluent sent by the liquid feeding means;
A gradient creating column containing the eluent mixed by the mixing means along the length direction in the order of supply;
A flow path switching means for connecting the gradient creating column and a flow path through which the eluent mixed by the mixing means flows or a flow path connected to the analysis means;
A method for feeding to an analysis means, wherein an eluent having a different composition with time is sent to an analysis means using a gradient creating device,
The liquid feeding method is characterized by comprising the following steps:
(1) The flow path switching means connects the gradient creating column and the flow path through which the eluent mixed by the mixing means flows, and is mixed by the mixing means along the length direction of the gradient creating column. (2) The gradient switching column and the flow channel connected to the analyzing unit are connected by the flow channel switching unit, and the eluent stored in the gradient generating column is (1). ) In the process of feeding the eluent in the direction opposite to the direction in which the eluent is accommodated. The second invention is characterized in that the liquid feed means is a plunger pump. The liquid feeding method described in 1.

第三の発明は、前記分析手段が液体クロマトグラフ装置であることを特徴とする、第一または第二の発明に記載の送液方法である。   A third invention is the liquid feeding method according to the first or second invention, wherein the analyzing means is a liquid chromatograph.

第四の発明は、複数種類の溶離液をそれぞれ制御された流量で送液する送液手段と、
前記送液手段により送液された溶離液を混合する混合手段と、
前記混合手段により混合された溶離液を供給された順に長さ方向に沿って収容するグラジエント作成カラムと、
前記グラジエント作成カラムと、前記混合手段により混合された溶離液が流れる流路、または分析手段に接続されている流路とを接続するための流路切替手段を備えた、
グラジエント作成装置において、
前記グラジエント作成カラムが交換可能であることを特徴とする、前記グラジエント作成装置である。
The fourth invention is a liquid feeding means for feeding a plurality of types of eluents at controlled flow rates,
Mixing means for mixing the eluent sent by the liquid feeding means;
A gradient creating column containing the eluent mixed by the mixing means along the length direction in the order of supply;
A flow path switching means for connecting the gradient creating column and a flow path through which the eluent mixed by the mixing means flows or a flow path connected to the analysis means;
In the gradient creation device,
The gradient creating apparatus is characterized in that the gradient creating column is exchangeable.

以下、本発明を詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明は、送液手段を用いて比較的安定した送液性能が得られる流量で複数種類の溶離液を送液し、混合手段にて各溶離液を混合後、経時的に異なる組成の溶離液をグラジエント作成カラムにその長さ方向に沿って収容する。次に、送液手段を用いて溶離液を微小流量で送液し、前記グラジエント作成カラム内に収容された経時的に異なる組成の溶離液を、収容された方向とは逆方向に押し出すことで、所望の組成からなる溶離液を分析手段に送液することを特徴としている。   In the present invention, a plurality of types of eluents are fed at a flow rate that provides relatively stable liquid feeding performance using the liquid feeding means, and each eluent is mixed by the mixing means, and then the elution of different compositions with time is performed. The liquid is stored in the gradient column along its length. Next, the eluent is fed at a minute flow rate using the liquid feeding means, and the eluent having a composition different from time to time contained in the gradient creating column is pushed out in the direction opposite to the contained direction. The eluent having a desired composition is sent to the analyzing means.

本発明の送液方法における送液手段としては、微小流量を送液可能なプランジャ式ポンプ、及びシリンジ式ポンプが例示できるが、特に停止状態から稼動する際の動作が不安定である、プランジャ式ポンプに対し本発明の送液方法を適用するのが好ましい。   Examples of the liquid feeding means in the liquid feeding method of the present invention include a plunger type pump capable of feeding a minute flow rate and a syringe type pump. In particular, the plunger type has an unstable operation when operating from a stopped state. It is preferable to apply the liquid feeding method of the present invention to the pump.

本発明の送液方法における、送液手段により送液された溶離液を混合するための混合手段としては、単に各溶離液が流れる流路を合流する手段、及び各溶離液が流れる流路が合流する部位にミキサー(混合器)を設置した手段が例示できるが、後者の場合は特に微小流量を送液する場合、混合器の有する内部容量により混合器内の溶離液の置換に時間を要するため、前者の手段が好ましい。   In the liquid feeding method of the present invention, the mixing means for mixing the eluent sent by the liquid feeding means includes means for simply joining the flow paths through which the eluents flow and flow paths through which the eluents flow. An example is a means in which a mixer (mixer) is installed at the confluence portion. In the latter case, particularly when a minute flow rate is sent, it takes time to replace the eluent in the mixer due to the internal volume of the mixer. Therefore, the former means is preferable.

本発明の送液方法における、グラジエント作成カラムとしては、分析に必要な溶離液を収容可能な容量以上の容量を有するカラムであれば、形状、材料など特に限定されるものはなく、一例として、中が空洞のステンレスチューブがあげられる。また、両端にフィルタ(52)を備えたパイプ(53)に、不活性な微小粒子(54)を充填したカラム(50)もグラジエント作成カラムとして用いることができる(図6)。不活性な微小粒子(54)を充填した筒状のカラム(50)を使用した場合、前記カラムに収容される経時的に異なる組成の溶離液の組成変化がより平滑化されることが期待できる。なお、本発明の送液装置は、前記グラジエント作成カラムが分析手段中の分析カラムの容量に応じて交換可能であることを特徴としている。   In the liquid feeding method of the present invention, as the gradient creation column, there is no particular limitation on the shape, material, etc., as long as the column has a capacity equal to or larger than the capacity capable of containing the eluent necessary for analysis. An example is a hollow stainless steel tube. Further, a column (50) in which pipes (53) having filters (52) at both ends are filled with inactive fine particles (54) can also be used as a gradient creating column (FIG. 6). When a cylindrical column (50) packed with inert microparticles (54) is used, it can be expected that the composition change of eluents with different compositions contained in the column will be smoothed over time. . The liquid delivery device of the present invention is characterized in that the gradient creating column can be exchanged according to the capacity of the analytical column in the analyzing means.

本発明の送液方法を用いたシステム構成の一例を図7に示す。図7のシステム構成では、分析を行なう流路(実線)とグラジエント作成流路(破線)とに大別される。分析を行なう流路は、溶離液C(33)、ポンプC(23)、試料注入バルブ(42)、分析カラム(70)、検出器(80)の順に配置され、当該流路は微小流量で送液される。一方、グラジエント作成流路は、溶離液A(31)、送液ポンプA(21)、溶離液B(32)、送液ポンプB(22)、経時的に異なる組成の溶離液を収容するためのグラジエント作成カラム(50)が配置され、当該流路は前記分析を行なう流路の流量の、概ね5から100倍の流量で送液される。そして、流路切替バルブ(41)により、グラジエント作成カラム(50)を微小分析に使用する流路(実線)、またはグラジエントを作成する流路(破線)と接続する。   An example of a system configuration using the liquid feeding method of the present invention is shown in FIG. The system configuration in FIG. 7 is broadly divided into a flow path for analysis (solid line) and a gradient creation flow path (broken line). The flow path for analysis is arranged in the order of the eluent C (33), the pump C (23), the sample injection valve (42), the analysis column (70), and the detector (80). The liquid is sent. On the other hand, the gradient creating flow path accommodates eluent A (31), liquid feed pump A (21), eluent B (32), liquid feed pump B (22), and eluents having different compositions over time. The gradient generating column (50) is arranged, and the flow path is fed at a flow rate of approximately 5 to 100 times the flow rate of the flow path for the analysis. Then, the gradient creating column (50) is connected to the flow channel (solid line) used for microanalysis or the flow channel (broken line) for creating the gradient by the flow channel switching valve (41).

本発明の送液方法を用いたグラジエント分析を3つの工程に分けて説明する(図8)。なお、分析試料を分析カラムから溶出する力は、溶離液Aよりも溶離液Bの方が大きいものとする。   Gradient analysis using the liquid feeding method of the present invention will be described in three steps (FIG. 8). It is assumed that eluent B has a greater force for eluting the analysis sample from the analysis column than eluent A.

工程1 グラジエントカーブの作成
流路切替バルブ(41)をOFF(図9(a))の状態にし、ポンプA(21)から送液された溶離液A(31)と、ポンプB(22)から送液された溶離液B(32)とが混合した溶離液が、グラジエント作成カラム(50)に送液され、前記カラム(50)を通過した溶離液が排出(91)されるようにする。ポンプA(21)、ポンプB(22)により、分析で実際に使用する溶離液の組成変化とは逆の組成変化の溶離液をグラジエント作成カラム(50)に供給する。
Step 1 Gradient curve creation The flow path switching valve (41) is turned off (FIG. 9 (a)), and the eluent A (31) sent from the pump A (21) and the pump B (22) The eluent mixed with the sent eluent B (32) is sent to the gradient creating column (50), and the eluent that has passed through the column (50) is discharged (91). Pump A (21) and pump B (22) supply an eluent having a composition change opposite to the composition change of the eluent actually used in the analysis to the gradient creating column (50).

実際に分析で使用するグラジエントを溶離液B:0%(溶離液A:100%)から溶離液B:100%(溶離液A:0%)、実際の分析での流量をFa、グラジエントカーブ作成時の流量をFgとした場合の、時間及び組成のパターンを表1及び2に示す。   The gradient used in the actual analysis is eluent B: 0% (eluent A: 100%) to eluent B: 100% (eluent A: 0%), the actual flow rate is Fa, and a gradient curve is created. Tables 1 and 2 show time and composition patterns when the hourly flow rate is Fg.

Figure 2010145369
Figure 2010145369

Figure 2010145369
この間、分析カラム(70)には、ポンプC(23)から溶離液C(33)が流量Faで送液される。溶離液C(33)はグラジエント作成に使用する溶離液A(31)または溶離液B(32)と同一であることが望ましい。なお、溶離液C(33)が溶離液A(31)と同一とすると、当該工程で分析カラム(70)の初期化がなされるため、好ましい。
Figure 2010145369
During this time, the eluent C (33) is sent from the pump C (23) to the analysis column (70) at the flow rate Fa. The eluent C (33) is preferably the same as the eluent A (31) or the eluent B (32) used for the gradient preparation. Note that it is preferable that the eluent C (33) is the same as the eluent A (31) because the analysis column (70) is initialized in this step.

工程2 グラジエント逆転写
流路切替バルブ(41)をON(図9(b))の状態にし、ポンプC(23)を用いて、工程1で収容した方向とは逆方向に溶離液C(33)を流量Faで送液することで、グラジエント作成カラム(50)に収容された溶離液を押し出し、分析カラム(70)に流れるようにする。なお、前記カラム(70)を通過した溶離液は系外へ排出(92)される。
Step 2 Gradient reverse transfer The flow path switching valve (41) is turned on (FIG. 9B), and the eluent C (33) is used in the direction opposite to the direction accommodated in Step 1 by using the pump C (23). ) At a flow rate Fa, the eluent contained in the gradient creation column (50) is pushed out and flows into the analysis column (70). The eluent that has passed through the column (70) is discharged out of the system (92).

工程3 分析
工程2の状態で、試料注入バルブ(42)より試料を注入し、分析カラム(70)を用いた分析が行なわれる。
Step 3 Analysis In the state of step 2, a sample is injected from the sample injection valve (42), and analysis using the analysis column (70) is performed.

以上3つの工程により、低流量でかつ正確な経時的に異なる組成の溶離液を分析カラムに送液し、分析を行なうことができる。本発明の送液方法を用いたグラジエント分析の模式図を図10に示す。特にポンプA、ポンプBにプランジャ式ポンプを使用した場合、前記ポンプに由来する溶離液の組成及び流量精度が劣る領域が、グラジエント分析では終了時に当たるため、グラジエント分析全体への影響を抑えることができる(図11)。   Through the above three steps, it is possible to perform analysis by sending eluents having different compositions over time with a low flow rate to the analysis column. A schematic diagram of gradient analysis using the liquid feeding method of the present invention is shown in FIG. In particular, when a plunger type pump is used for pump A and pump B, the region where the composition and flow rate accuracy of the eluent derived from the pump is inferior is hit at the end of the gradient analysis, so that the influence on the entire gradient analysis can be suppressed. Yes (FIG. 11).

本発明は、グラジエント作成装置を用いて分析手段へ経時的に異なる組成の溶離液を送液する際に、
流路切替手段により、グラジエント作成カラムと混合手段により混合された溶離液が流れる流路とを接続し、前記グラジエント作成カラムの長さ方向に沿って前記混合手段により混合された溶離液を収容する工程、及び
前記流路切替手段により、前記グラジエント作成カラムと前記分析手段に接続されている流路とを接続し、前記グラジエント作成カラムに収容された溶離液を前記工程において溶離液を収容する方向とは逆の方向に前記分析手段へ送液する工程、
を行ない、送液することを特徴としている。本発明の送液方法により、液体クロマトグラフ装置を用いたグラジエント分析において、微小流量であっても正確な組成変化を実現するができる。
The present invention, when sending eluents having different compositions over time to an analysis means using a gradient creating device,
The flow path switching means connects the gradient creating column and the flow path through which the eluent mixed by the mixing means flows, and accommodates the eluent mixed by the mixing means along the length direction of the gradient creating column. A step of connecting the gradient generating column and the flow channel connected to the analyzing means by the step and the flow path switching unit, and storing the eluent stored in the gradient generating column in the step A step of feeding the analysis means in the opposite direction to
It is characterized by performing and feeding liquid. According to the liquid feeding method of the present invention, an accurate composition change can be realized even in a minute flow rate in a gradient analysis using a liquid chromatograph apparatus.

さらに、送液手段がプランジャ式ポンプの場合は、前記ポンプに由来する溶離液の組成及び流量精度が不安定な領域がグラジエント分析終了時となるため、プランジャ式ポンプであっても正確な組成変化を実現することができる。   Furthermore, when the liquid delivery means is a plunger type pump, the region where the composition and flow rate accuracy of the eluent derived from the pump is unstable is at the end of the gradient analysis. Can be realized.

また、本発明の送液装置は、グラジエント作成装置において、前記グラジエント作成カラムが交換可能であることを特徴としており、特許文献2の装置と比較し、分析手段中の分析カラムの容量変化に柔軟に対応することができる。   In addition, the liquid delivery device of the present invention is characterized in that the gradient creation column can be exchanged in the gradient creation device, and is more flexible in changing the capacity of the analysis column in the analysis means than the device of Patent Document 2. It can correspond to.

実施例1 本発明の送液方法を用いた液体クロマトグラフシステム(その1)
本発明の送液方法を利用した液体クロマトグラフシステムの構成を図12に示す。図12のシステム構成では、微小分析を行なう流路(実線)とグラジエント作成流路(破線)に大別される。微小分析を行なう流路は、送液ポンプC(33)、試料注入バルブ(42)、分析用マイクロカラム(70)、紫外可視検出器(80)、抵抗管(111)が配置され、微小流量で送液される。グラジエント作成流路には、送液ポンプA(21)、送液ポンプB(22)、経時的に異なる組成の溶離液を収容するためのグラジエント作成カラム(50)、抵抗管(112)が配置され、グラジエントが作成される。そして、2位置切り替えバルブ(41)により、グラジエント作成カラム(50)を、微小分析を行なう流路(実線)、またはグラジエント作成流路(破線)と接続する。試料注入バルブ(42)、分析用マイクロカラム(70)、2位置切り替えバルブ(41)は熱的安定性を確保するため、同一の恒温槽(100)内に配置し、43℃で一定温度に制御を行なった。
Example 1 Liquid Chromatograph System Using the Liquid Delivery Method of the Present Invention (Part 1)
FIG. 12 shows the configuration of a liquid chromatograph system using the liquid feeding method of the present invention. The system configuration in FIG. 12 is roughly divided into a flow path for performing microanalysis (solid line) and a gradient creation flow path (broken line). The flow path for performing microanalysis includes a liquid feed pump C (33), a sample injection valve (42), an analysis microcolumn (70), an ultraviolet-visible detector (80), and a resistance tube (111), and a microflow rate. The liquid is fed. In the gradient creating flow path, there are arranged a liquid feeding pump A (21), a liquid feeding pump B (22), a gradient creating column (50) for storing eluents having different compositions over time, and a resistance tube (112). And a gradient is created. Then, the gradient creation column (50) is connected to the flow path for performing microanalysis (solid line) or the gradient creation flow path (broken line) by the two-position switching valve (41). The sample injection valve (42), the analytical microcolumn (70), and the two-position switching valve (41) are placed in the same thermostat (100) to ensure thermal stability and are kept at a constant temperature at 43 ° C. Control was performed.

測定条件は分析用マイクロカラム(70)として、内径1mm、長さ30mm、粒径3μmのODSカラム(東ソー社製)、溶離液A(31)及びC(33)としてアセトニトリル/水(25/80)、溶離液B(32)としてアセトニトリル/水(90/10)を使用した。ポンプ(31、32、33)はプランジャ式ポンプである東ソー社製CCPMを一部改良して使用した。試料としては、p−ヒドロキシ安息香酸メチル、p−ヒドロキシ安息香酸エチル、p−ヒドロキシ安息香酸プロピル、p−ヒドロキシ安息香酸n−ブチル、p−ヒドロキシ安息香酸ヘキシル、p−ヒドロキシ安息香酸ヘプチルの6種を混合したものを用いた。グラジエント作成用カラム(50)は外径1/16インチ、内径0.6mm、長さ2mの空のステンレスチューブを使用した(容量:565μL)。   The measurement conditions were an ODS column (manufactured by Tosoh Corporation) having an inner diameter of 1 mm, a length of 30 mm and a particle diameter of 3 μm as an analytical microcolumn (70), and acetonitrile / water (25/80 as eluents A (31) and C (33)). ), Acetonitrile / water (90/10) was used as eluent B (32). The pumps (31, 32, 33) were partially modified from Tosoh CCPM, which is a plunger type pump. Samples include 6 kinds of methyl p-hydroxybenzoate, ethyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate, n-butyl p-hydroxybenzoate, hexyl p-hydroxybenzoate and heptyl p-hydroxybenzoate. A mixture of was used. The gradient column (50) was an empty stainless steel tube having an outer diameter of 1/16 inch, an inner diameter of 0.6 mm, and a length of 2 m (capacity: 565 μL).

微小分析を行なう流路(実線)は、毎分4μLに設定し、溶離液C(33)を一定流量で分析カラムに送液した。グラジエント作成流路(破線)は、毎分80μLに設定し、溶離液B:100%(溶離液A:0%)から溶離液A:100%(溶離液B:0%)まで2.5分のグラジエントを行ない、グラジエント作成カラム(50)に供給した(表3)。この条件で、微小分析を行なう流路(実線)には、毎分4μLで、溶離液B:0%(溶離液A:100%)から溶離液B:100%(溶離液A:0%)まで50分(2.5×80÷4)のグラジエントが行なわれることになる(表4)。   The flow path (solid line) for performing microanalysis was set to 4 μL per minute, and the eluent C (33) was fed to the analysis column at a constant flow rate. The gradient creating channel (broken line) is set to 80 μL / min, and eluent B: 100% (eluent A: 0%) to eluent A: 100% (eluent B: 0%) for 2.5 minutes. Was applied to the gradient creation column (50) (Table 3). Under these conditions, the flow path (solid line) for microanalysis is 4 μL / min. Eluent B: 0% (Eluent A: 100%) to Eluent B: 100% (Eluent A: 0%) A gradient of 50 minutes (2.5 × 80 ÷ 4) will be performed (Table 4).

Figure 2010145369
Figure 2010145369

Figure 2010145369
再現性の結果を図13から15に示す。図13はクロマトグラム(n=10)、図14は溶出時間の変化(n=10)、図15は溶出時間の再現性を、それぞれ示す(n=10×2)。図15に示すように、分析流量が毎分4μLという低流量であっても、各ピークの溶出時間の再現性は0.2から0.5%と良好な値が得られた。よって、本発明の送液方法を用いることにより、一般的に使用されているプランジャ式ポンプを使用しても高精度な分析が可能であることが分かる。図12のシステムは、連続測定が可能であり、かつ精度、使い勝手、操作性に優れたシステムであるといえる。
Figure 2010145369
The reproducibility results are shown in FIGS. 13 shows the chromatogram (n = 10), FIG. 14 shows the change in elution time (n = 10), and FIG. 15 shows the reproducibility of the elution time (n = 10 × 2). As shown in FIG. 15, even when the analysis flow rate was a low flow rate of 4 μL / minute, the reproducibility of the elution time of each peak was as good as 0.2 to 0.5%. Therefore, it can be seen that by using the liquid feeding method of the present invention, a highly accurate analysis can be performed even if a generally used plunger pump is used. The system of FIG. 12 can be said to be a system capable of continuous measurement and excellent in accuracy, usability, and operability.

本実施例では、微小分析に使用する流路(実線)のポンプC(33)の溶離液として、溶離液Aと同一の組成を使用した。この場合、分析用マイクロカラム(70)は2位置切り替えバルブ(41)がOFF(図9(a))の状態で、常にカラムの初期化がなされることになり、2位置切り替えバルブ(42)をON(図9(b))にすることにより、即分析が可能となる(図16)。   In this example, the same composition as the eluent A was used as the eluent of the pump C (33) of the flow path (solid line) used for microanalysis. In this case, the analytical microcolumn (70) is always initialized when the two-position switching valve (41) is OFF (FIG. 9A), and the two-position switching valve (42). When ON is set to ON (FIG. 9B), immediate analysis becomes possible (FIG. 16).

また、微小分析を行なう流路(実線)の溶離液C(33)として、溶離液B(32)と同一の組成を使用することも可能である。この場合、分析用マイクロカラム(70)は2位置切り替えバルブ(41)がOFF(図9(a))の状態で、常にカラムの洗浄がなされることになり、カラムの寿命が延びることが期待できる。なお、溶離液C(33)として、溶離液B(32)と同一のものを使用する場合は、グラジエント作成カラム(50)に経時的に異なる組成の溶離液を収容した後に、初期化するための溶離液A(31)を追加供給することで実現可能である。この場合、2位置切り替えバルブ(41)をON(図9(b))にした後、分析用マイクロカラム(70)には前記カラム(70)を初期化するための溶離液A(31)が流れた後、実際のグラジエントがかかる。試料注入は分析用マイクロカラム(70)の初期化が終了した時点で行なうことになる(図17参照)。この他、溶離液A、Bと異なる組成の溶離液の使用も可能である。   It is also possible to use the same composition as the eluent B (32) as the eluent C (33) of the flow path (solid line) for performing microanalysis. In this case, the analytical microcolumn (70) is always washed with the two-position switching valve (41) being OFF (FIG. 9 (a)), and the lifetime of the column is expected to be extended. it can. When the same eluent C (33) as eluent B (32) is used, the elution is performed after the eluent having different composition with time is stored in the gradient creating column (50). This can be realized by additionally supplying eluent A (31). In this case, after the two-position switching valve (41) is turned ON (FIG. 9B), the eluent A (31) for initializing the column (70) is stored in the analysis microcolumn (70). After flowing, it takes an actual gradient. Sample injection is performed when the initialization of the analytical microcolumn (70) is completed (see FIG. 17). In addition, it is possible to use an eluent having a composition different from those of the eluents A and B.

実施例2 本発明の送液方法を用いた液体クロマトグラフシステム(その2)
本発明の送液方法を利用した液体クロマトグラフシステムの別の構成を図18に示す。各ポンプ(21、22、23)をシリンジ式ポンプにした他は、実施例1に記載の液体クロマトグラフ装置と同様の構成である、図18の装置であっても、実施例1のときと同様、低流量域での安定したグラジエント分析を実現することができる。
Example 2 Liquid Chromatograph System Using the Liquid Delivery Method of the Present Invention (Part 2)
FIG. 18 shows another configuration of the liquid chromatograph system using the liquid feeding method of the present invention. 18 is the same as that of the liquid chromatograph apparatus described in Example 1 except that each pump (21, 22, 23) is a syringe type pump. Similarly, a stable gradient analysis in a low flow rate region can be realized.

プランジャ式ポンプの基本的な構造を示す図。(a)は吸引工程の状態、(b)は吐出工程の状態をそれぞれを示す。The figure which shows the basic structure of a plunger type pump. (A) shows the state of a suction process, (b) shows the state of a discharge process, respectively. 入口側チェック弁の基本的な構造を示す図。(a)は開放時の状態、(b)は閉止時の状態をそれぞれ示す。The figure which shows the basic structure of an inlet side check valve. (A) shows the state when opened, and (b) shows the state when closed. 出口側チェック弁の基本的な構造を示す図。(a)は開放時の状態、(b)は閉止時の状態をそれぞれ示す。The figure which shows the basic structure of an exit side check valve. (A) shows the state when opened, and (b) shows the state when closed. 理想的な状態で2液のグラジエント分析を行なう場合の、ポンプA、ポンプBの流量変化を示した模式図。(a)は各ポンプの流量変化を示した図であり、縦軸は総流量に対する比率、横軸は時間を表す。実線はポンプA、破線はポンプBを表す。(b)はポンプA、ポンプBの総流量の変化を示した図であり、縦軸は総流量、横軸は時間を表す。The schematic diagram which showed the flow volume change of the pump A in the case of performing gradient analysis of 2 liquids in an ideal state. (A) is the figure which showed the flow volume change of each pump, a vertical axis | shaft represents the ratio with respect to a total flow volume, and a horizontal axis represents time. The solid line represents pump A, and the broken line represents pump B. (B) is the figure which showed the change of the total flow volume of the pump A and the pump B, a vertical axis | shaft represents total flow volume and a horizontal axis represents time. プランジャ式ポンプを用いて微小流量でグラジエント分析を行なう場合の、ポンプA、ポンプBの流量変化を示した模式図。(a)は各ポンプの流量変化を示した図であり、縦軸は総流量に対する比率、横軸は時間を表す。実線はポンプA、破線はポンプBを表す。(b)はポンプA、ポンプBの総総量の変化を示した図であり、縦軸は総流量、横軸は時間を表す。(c)はクロマトグラムに与える影響を模式的に示した図である。縦軸は吸光度、横軸は時間を表す。The schematic diagram which showed the flow volume change of the pump A in the case of performing a gradient analysis by a micro flow rate using a plunger type pump. (A) is the figure which showed the flow volume change of each pump, a vertical axis | shaft represents the ratio with respect to a total flow volume, and a horizontal axis represents time. The solid line represents pump A, and the broken line represents pump B. (B) is the figure which showed the change of the total amount of the pump A and the pump B, a vertical axis | shaft represents total flow volume and a horizontal axis represents time. (C) is the figure which showed typically the influence which acts on a chromatogram. The vertical axis represents absorbance, and the horizontal axis represents time. 本発明の送液方法で用いるグラジエント作成カラムの一例図。(a)は全体図であり、(b)はA−A’断面図である。An example figure of the gradient creation column used with the liquid feeding method of this invention. (A) is an overall view, and (b) is an A-A ′ sectional view. 本発明の送液方法を用いたシステム構成を示した図。実線は分析を行なう流路、破線はグラジエント作成流路をそれぞれ示す。The figure which showed the system configuration | structure using the liquid feeding method of this invention. A solid line indicates a flow path for analysis, and a broken line indicates a gradient creation flow path. 本発明の送液方法を用いたグラジエント分析の説明図。Explanatory drawing of gradient analysis using the liquid feeding method of this invention. 流路切替バルブによる切替様式を表した図。(a)はOFF状態、(b)がON状態をそれぞれ示す。The figure showing the switching mode by a flow-path switching valve. (A) shows an OFF state, and (b) shows an ON state. 本発明の送液方法を用いたグラジエント分析における、組成変化を示した模式図。(a)が工程1の組成変化、(b)が工程2及び3における組成変化をそれぞれ示す。The schematic diagram which showed the composition change in the gradient analysis using the liquid feeding method of this invention. (A) shows the composition change of the process 1, and (b) shows the composition change in the processes 2 and 3, respectively. 本発明の送液方法を用いて、プランジャ式ポンプにてグラジエント分析を行なう場合の、ポンプA、ポンプBの流量変化を示した模式図。(a)は各ポンプの流量変化を示した図であり、縦軸は総流量に対する比率、横軸は時間を表す。実線はポンプA、破線はポンプBを表す。(b)はポンプA、ポンプBの総総量の変化を示した図であり、縦軸は総流量、横軸は時間を表す。(c)はクロマトグラムに与える影響を模式的に示した図である。縦軸は吸光度、横軸は時間を表す。The schematic diagram which showed the flow volume change of the pump A and the pump B in the case of performing a gradient analysis with a plunger type pump using the liquid feeding method of this invention. (A) is the figure which showed the flow volume change of each pump, a vertical axis | shaft represents the ratio with respect to a total flow volume, and a horizontal axis represents time. The solid line represents pump A, and the broken line represents pump B. (B) is the figure which showed the change of the total amount of the pump A and the pump B, a vertical axis | shaft represents total flow volume and a horizontal axis represents time. (C) is the figure which showed typically the influence which acts on a chromatogram. The vertical axis represents absorbance, and the horizontal axis represents time. 実施例1で用いたシステム構成を示した図。1 is a diagram illustrating a system configuration used in Embodiment 1. FIG. 本発明の送液方法でグラジエント分析を行なったときのクロマトグラム(n=10)。横軸は時間、縦軸は吸光度を表す.The chromatogram when a gradient analysis is performed with the liquid feeding method of this invention (n = 10). The horizontal axis represents time, and the vertical axis represents absorbance. 本発明の送液方法でグラジエント分析を行なったときの各ピーク溶出時間の変化を示したグラフ。横軸は測定回数、縦軸は溶出時間を表す。The graph which showed the change of each peak elution time when performing gradient analysis by the liquid feeding method of this invention. The horizontal axis represents the number of measurements, and the vertical axis represents the elution time. 本発明の送液方法でグラジエント分析を行なったときの各ピーク溶出時間のCv(%)を示したグラフ。横軸は試料名、縦軸は溶出時間Cv%を表す。The graph which showed Cv (%) of each peak elution time when performing gradient analysis with the liquid feeding method of this invention. The horizontal axis represents the sample name, and the vertical axis represents the elution time Cv%. 本発明の送液方法を用いたグラジエント分析における、組成変化を示した模式図(溶離液Cの組成が溶離液Aと同一の組成の場合)。(a)が工程1の組成変化、(b)が工程2及び3における組成変化をそれぞれ示す。The schematic diagram which showed the composition change in the gradient analysis using the liquid feeding method of this invention (when the composition of the eluent C is the same composition as the eluent A). (A) shows the composition change of the process 1, and (b) shows the composition change in the processes 2 and 3, respectively. 本発明の送液方法を用いたグラジエント分析における、組成変化を示した模式図(溶離液Cの組成が溶離液Bと同一の組成の場合)。(a)が工程1の組成変化、(b)が工程2及び3における組成変化をそれぞれ示す。The schematic diagram which showed the composition change in the gradient analysis using the liquid feeding method of this invention (when the composition of the eluent C is the same composition as the eluent B). (A) shows the composition change of the process 1, and (b) shows the composition change in the processes 2 and 3, respectively. 実施例2で用いたシステム構成を示した図。FIG. 5 is a diagram illustrating a system configuration used in the second embodiment.

符号の説明Explanation of symbols

10 プランジャ式ポンプ
11 チャンバ
12 プランジャ
13 入口側チェック弁
14 出口側チェック弁
15 シート
16 ボール
21、22、23 ポンプ
31、32、33 溶離液
41 流路切替バルブ
42 試料注入バルブ
50 グラジエント作成カラム
51 エンドフィッティング
52 フィルタ
53 パイプ
54 微小粒子
60 サンプルチューブ
70 分析カラム
80 検出器
91、92 廃液
100 恒温槽
111、112 抵抗管
10 Plunger type pump 11 Chamber 12 Plunger 13 Inlet side check valve 14 Outlet side check valve 15 Seat 16 Ball 21, 22, 23 Pump 31, 32, 33 Eluent 41 Flow path switching valve 42 Sample injection valve 50 Gradient preparation column 51 End Fitting 52 Filter 53 Pipe 54 Fine particle 60 Sample tube 70 Analysis column 80 Detector 91, 92 Waste liquid 100 Constant temperature bath 111, 112 Resistance tube

Claims (4)

複数種類の溶離液をそれぞれ制御された流量で送液する送液手段と、
前記送液手段により送液された溶離液を混合する混合手段と、
前記混合手段により混合された溶離液を供給された順に長さ方向に沿って収容するグラジエント作成カラムと、
前記グラジエント作成カラムと、前記混合手段により混合された溶離液が流れる流路、または分析手段に接続されている流路とを接続するための流路切替手段を備えた、
グラジエント作成装置を用いて、分析手段へ経時的に異なる組成の溶離液を送液する、分析手段への送液方法であって、
以下に示す工程からなることを特徴とする、前記送液方法:
(1)前記流路切替手段により、前記グラジエント作成カラムと前記混合手段により混合された溶離液が流れる流路とを接続し、前記グラジエント作成カラムの長さ方向に沿って前記混合手段により混合された溶離液を収容する工程
(2)前記流路切替手段により、前記グラジエント作成カラムと前記分析手段に接続されている流路とを接続し、前記グラジエント作成カラムに収容された溶離液を(1)の工程で溶離液を収容する方向とは逆の方向に前記分析手段へ送液する工程
A liquid feeding means for feeding plural kinds of eluents at controlled flow rates;
Mixing means for mixing the eluent sent by the liquid feeding means;
A gradient creating column containing the eluent mixed by the mixing means along the length direction in the order of supply;
A flow path switching means for connecting the gradient creating column and a flow path through which the eluent mixed by the mixing means flows or a flow path connected to the analysis means;
A method for feeding to an analysis means, wherein an eluent having a different composition with time is sent to an analysis means using a gradient creating device,
The liquid feeding method comprising the following steps:
(1) The flow path switching means connects the gradient creating column and the flow path through which the eluent mixed by the mixing means flows, and is mixed by the mixing means along the length direction of the gradient creating column. (2) The gradient switching column is connected to the flow channel connected to the analyzing means by the flow path switching means, and the eluent stored in the gradient generating column is (1) The step of feeding the analysis means in the direction opposite to the direction in which the eluent is accommodated in the step of
前記送液手段がプランジャ式ポンプであることを特徴とする、請求項1に記載の送液方法。 The liquid feeding method according to claim 1, wherein the liquid feeding means is a plunger type pump. 前記分析手段が液体クロマトグラフ装置であることを特徴とする、請求項1または2に記載の送液方法。 The liquid feeding method according to claim 1 or 2, wherein the analyzing means is a liquid chromatograph apparatus. 複数種類の溶離液をそれぞれ制御された流量で送液する送液手段と、
前記送液手段により送液された溶離液を混合する混合手段と、
前記混合手段により混合された溶離液を供給された順に長さ方向に沿って収容するグラジエント作成カラムと、
前記グラジエント作成カラムと、前記混合手段により混合された溶離液が流れる流路、または分析手段に接続されている流路とを接続するための流路切替手段を備えた、グラジエント作成装置において、
前記グラジエント作成カラムが交換可能であることを特徴とする、前記グラジエント作成装置。
A liquid feeding means for feeding plural kinds of eluents at controlled flow rates;
Mixing means for mixing the eluent sent by the liquid feeding means;
A gradient creating column containing the eluent mixed by the mixing means along the length direction in the order of supply;
In the gradient creating device, comprising a flow path switching means for connecting the gradient creating column and a flow path through which the eluent mixed by the mixing means flows, or a flow path connected to the analyzing means,
The gradient creating apparatus is characterized in that the gradient creating column is exchangeable.
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