JP2010119306A - Method for producing adenovirus vector - Google Patents
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Abstract
Description
アデノウイルスベクターに関し、ベクター作製用細胞に組み込まれたアデノウイルス由来の遺伝子配列と、アデノウイルスベクターゲノムとの間で起こる相同組換えにより生じたアデノウイルスベクターゲノムが、自己増殖能を有するウイルス(RCA)とならないように、改良したアデノウイルスベクターの作製方法及びアデノウイルスベクターに関する。 Regarding an adenovirus vector, an adenovirus vector genome generated by homologous recombination between an adenovirus-derived gene sequence incorporated in a vector-producing cell and the adenovirus vector genome is a virus having a self-propagating ability (RCA The present invention relates to an improved adenovirus vector production method and an adenovirus vector.
アデノウイルスは増殖に必須のE1領域を欠損しているため、通常の細胞中では増殖できないが、ベクター製造過程にベクター作製用細胞（「パッケージング細胞」ともいう。）である293細胞の染色体に組み込まれているE1遺伝子とベクターのゲノムが相同組換えを起こすために、自己増殖能を獲得したアデノウイルス（replication competent adenovirus；RCA）が出現・混入することは避けられない（図１参照）。即ち、293細胞にはヒト5型アデノウイルスの1-4344 bpのDNAが組み込まれていると考えられており（非特許文献１）、例えば342-3523 bpを欠損しているE1領域を欠損したアデノウイルスベクターとは、E1領域の前後で相同な遺伝子配列（1-342 bp及び3523-4344 bp）を持つため、それらの領域で相同組換えを起こし、RCAが出現する場合がある。野生型ウイルスの出現のためには複数回の相同組換えを必要とするレトロウイルスベクターや、相同組換えによる野生型ウイルスの出現は起こり得ないアデノ随伴ウイルスベクターに比べ、アデノウイルスベクターにおける野生型ウイルスの混入確率は高いといえる。 Adenovirus lacks the E1 region essential for growth, so it cannot grow in normal cells. However, during the vector production process, the chromosome of 293 cells, which are vector production cells (also called “packaging cells”) Since the integrated E1 gene and the genome of the vector undergo homologous recombination, it is inevitable that adenovirus (replication competent adenovirus; RCA) that has acquired self-replication ability will appear and be mixed (see FIG. 1). That is, 293 cells are thought to have 1-4344 bp of human type 5 adenovirus incorporated (Non-patent Document 1), for example, the E1 region lacking 342-3523 bp is deleted. An adenovirus vector has a homologous gene sequence (1-342 bp and 3523-4344 bp) before and after the E1 region, so that homologous recombination occurs in those regions and RCA may appear. Compared to retrovirus vectors that require multiple homologous recombination for the emergence of wild-type viruses and adeno-associated virus vectors that do not allow the appearance of wild-type viruses due to homologous recombination, The probability of virus contamination is high.
現在の米国FDA（Food and Drug Administration）が推奨しているRCA混入に関する許容値は、3×1010 VP（物理学的力価、vector particle）あたり、RCA が1 感染力価（生物学的タイター：infectious titer）未満となっている。RCAの検出に用いる試験方法としては、E1領域を欠損したアデノウイルスベクターを増幅しない通常の細胞（例えば、ヒト肺癌細胞株A549やヒト子宮頸癌細胞株HeLa）にベクターストックを感染させ、CPE（cytopathic effect；細胞中でウイルスが増殖する結果、細胞が死滅する現象）の出現を観察するのが通常である。即ち、RCAが混入していれば、通常の細胞においてもCPEが起こることになる。定量的PCRを用いたRCAの高感度検出法も開発されている（非特許文献２）。 The allowable value for RCA contamination recommended by the current US FDA (Food and Drug Administration) is 3 × 10 10 VP (physical titer, vector particle), and 1 infectious titer (biological titer). : Less than infectious titer). As a test method used for the detection of RCA, normal cells that do not amplify adenoviral vectors lacking the E1 region (eg, human lung cancer cell line A549 or human cervical cancer cell line HeLa) are infected with the vector stock, and CPE ( It is usual to observe the appearance of cytopathic effect (a phenomenon in which cells die as a result of virus growth in the cells). That is, if RCA is mixed, CPE will occur even in normal cells. A highly sensitive detection method for RCA using quantitative PCR has also been developed (Non-patent Document 2).
アデノウイルスベクターにおいて、RCAが理論上起こり得ないシステムについて、いくつか報告されている（非特許文献３、４）。Fallauxらの開発したシステム（非特許文献３）では、アデノウイルスベクター作製用のベクター作製用細胞とアデノウイルスゲノムは、E1遺伝子の459-3510 bpの配列を組み込んだPER細胞と、ウイルスゲノムの459-3510 bpの遺伝子配列を欠損したベクターゲノムからなる。このシステムでは、細胞とベクターにおいて、E1領域の前後で相同な遺伝子配列を有さないため、理論上相同組換えは起こり得ない構造となっている。しかしながら、非相同組換えにより低頻度ながらRCAが出現することが報告されている（非特許文献４）。他では、E1A発現カセットとE1B発現カセットを別々のベクターに搭載させて作製したE1A遺伝子とE1B遺伝子が異なる染色体部位に挿入されているパッケージング細胞が報告されており、この細胞を用いた場合は、前記PER細胞を用いた場合にRCAが検出された条件においても、RCAの出現は全く起こらないことが示されている（非特許文献４）。 Several systems have been reported for systems in which RCA cannot theoretically occur in adenovirus vectors (Non-Patent Documents 3 and 4). In the system developed by Fallaux et al. (Non-Patent Document 3), the vector production cell for adenovirus vector production and the adenovirus genome are PER cells incorporating the 459-3510 bp sequence of the E1 gene, and 459 of the virus genome. It consists of a vector genome lacking a -3510 bp gene sequence. In this system, since the cell and the vector do not have a homologous gene sequence before and after the E1 region, they have a structure in which homologous recombination cannot theoretically occur. However, it has been reported that RCA appears with low frequency due to non-homologous recombination (Non-patent Document 4). Others have reported packaging cells in which E1A and E1B genes are inserted into different chromosomal sites, prepared by mounting the E1A expression cassette and E1B expression cassette on separate vectors. It has been shown that the appearance of RCA does not occur at all even under the condition where RCA is detected when the PER cells are used (Non-patent Document 4).
今後の遺伝子治療臨床試験では、上記の改変したベクター作製用細胞が用いられることが予想されるが、アデノウイルスゲノムを改変してRCAの出現を抑える試みは報告されていない。
本発明は、アデノウイルス（以下「Ad」という。）ベクターの作製において、自己増殖能を獲得したAd、即ちRCAの出現を低減化させたAdベクターを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an Ad vector that has acquired the ability of self-proliferation, that is, the appearance of RCA in the production of an adenovirus (hereinafter referred to as “Ad”) vector.
本発明者らは、上記課題を解決するために検討し、外来遺伝子発現カセットを含むAdベクターとベクター作製用細胞に存在するAdゲノムの相同組換えにより、増殖に必要な部位を含むAdゲノムであっても、その大きさがAdのカプシドで覆うことができる大きさを超える、即ちパッケージングリミットを超えるように設計した外来遺伝子を挿入したAdベクターにより、自己増殖能を有するウイルス粒子が形成されないことに着目し、RCAの出現を低減化させたAdベクターを作製可能なことを見出し、本発明を完成した。 The present inventors have studied in order to solve the above-mentioned problem, and by using homologous recombination between an Ad vector containing a foreign gene expression cassette and an Ad genome existing in a vector production cell, an Ad genome containing a site necessary for propagation is used. Even if it exceeds the size that can be covered with the capsid of Ad, that is, the Ad vector inserted with a foreign gene designed to exceed the packaging limit, virus particles with self-propagating ability are not formed. In particular, the present inventors have found that an Ad vector with reduced appearance of RCA can be produced, thereby completing the present invention.
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．少なくとも領域Ａを欠損してなるAdゲノムに外来遺伝子を挿入し、前記領域Ａをコードする遺伝子配列が組み込まれたAdベクター作製用細胞を用いてAdベクターを作製する方法において、
以下の特徴を含み、
Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こすことによる自己増殖能を獲得したAdの出現を抑制しうる、Adベクターの作製方法：
１）Adゲノムの上記欠損した領域Ａとは異なる部位に、目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し；かつ、
２）Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、上記外来遺伝子を含む全Adの長さが、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子を挿入する。
２．上記２）において、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子が、野生型Adゲノムの長さを100とした場合に、全Adゲノムの長さが少なくとも107を超えるように設計されている外来遺伝子を挿入する、前項１に記載のAdベクターの作製方法。
３．上記において、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こさない場合に、野生型Adの長さを100とした場合に、全Adの長さが105以下となるように設計されている外来遺伝子を挿入する、前項１又は２に記載のAdベクターの作製方法。
４．少なくとも領域Ａを欠損してなるAdゲノムが、E1領域欠損型Adゲノム又は制限増殖型Adゲノムである前項１〜３のいずれか１に記載のAdベクターの作製方法。
５．前項１〜４のいずれか１項に記載の作製方法により作製されるAdベクター。
That is, this invention consists of the following.
1. In a method for producing an Ad vector by using a cell for producing an Ad vector in which a foreign gene is inserted into an Ad genome lacking at least the region A and a gene sequence encoding the region A is incorporated,
Includes the following features:
A method for producing an Ad vector that can suppress the appearance of Ad that has acquired the ability of self-proliferation due to homologous recombination between the Ad genome-derived gene sequence and the Ad-derived gene sequence incorporated into the cell:
1) inserting a foreign gene containing the target gene into a site different from the deleted region A of the Ad genome; and
2) When homologous recombination occurs between the Ad genome-derived gene sequence and the Ad-derived gene sequence incorporated in the cell, the length of the entire Ad including the foreign gene exceeds the packaging limit. Insert a foreign gene of the designed length.
2. In the above 2), the length of the exogenous gene designed to exceed the packaging limit is designed so that the length of the entire Ad genome exceeds 107 when the length of the wild-type Ad genome is 100 2. The method for producing an Ad vector according to item 1 above, wherein a foreign gene is inserted.
3. In the above, when the part of the gene sequence derived from Ad incorporated into the cell does not cause homologous recombination, the length of all Ad is 105 or less when the length of wild-type Ad is 100. 3. The method for producing an Ad vector according to item 1 or 2, wherein the designed foreign gene is inserted.
4). 4. The method for producing an Ad vector according to any one of items 1 to 3, wherein the Ad genome lacking at least the region A is an E1 region-deficient Ad genome or a restricted growth Ad genome.
5). An Ad vector produced by the production method according to any one of items 1 to 4.
本発明のAdベクターの作製方法により、RCAの出現を低減化させたAdベクターを作製することができた。本発明の方法により作製されたAdベクターは、より安全性の高い遺伝子治療用のAdベクターとして利用可能である。 By the method for producing an Ad vector of the present invention, an Ad vector with reduced appearance of RCA could be produced. The Ad vector produced by the method of the present invention can be used as an Ad vector for gene therapy with higher safety.
本発明のAdベクター作製方法は、Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こすことによる自己増殖能を獲得したAdの出現を抑制しうるものであり、少なくとも領域Ａを欠損してなるAdゲノムに目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し、前記領域Ａをコードする遺伝子配列が組み込まれたAdベクター作製用細胞を用いてAdベクターを作製する方法において、以下の特徴を含む方法である。
１）Adの上記欠損した領域Ａとは異なる部位に、目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し；かつ、
２）Ad由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、上記外来遺伝子を含む全Adの長さが、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子を挿入する。
The Ad vector production method of the present invention can suppress the appearance of Ad that has acquired self-proliferation ability due to homologous recombination between the Ad genome-derived gene sequence and the Ad-derived gene sequence incorporated in the cell. A foreign gene containing a target gene is inserted into an Ad genome lacking at least region A, and an Ad vector is produced using an Ad vector production cell in which the gene sequence encoding region A is incorporated. In the method, the method includes the following features.
1) inserting a foreign gene containing a target gene into a site different from the above-mentioned deleted region A of Ad; and
2) When homologous recombination occurs between the Ad-derived gene sequence and the Ad-derived gene sequence incorporated in the cell, the length of all Ad including the foreign gene exceeds the packaging limit. Insert a foreign gene of the designed length.
本発明において使用可能なAdは、in vivo又はin vitroでDNAやRNAなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ挿入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする2型、5型、11型、35型の各Ad、ヒト以外を宿主とするサルAd、マウスAd、イヌAd、ヒツジAd及びトリAdなどが挙げられる。 Ad that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can achieve a function as a vehicle for inserting a nucleic acid sequence such as DNA or RNA into various types of cells in vivo or in vitro. Typically, each of Ad of type 2, type 5, type 11 and type 35 using human as a host, monkey Ad, mouse Ad, dog Ad, sheep Ad and avian Ad other than human as host.
本発明において、「少なくとも領域Ａを欠損してなるAdゲノム」とは、具体的にはE1領域欠損型Adや、制限増殖型Adのゲノムなどが好適である。ここで、領域Aとは、具体的にはE1領域、E2領域、E3領域やE4領域が挙げられる。領域Ａを欠損してなるAdゲノムとして、特に好適にはE1領域欠損型のAdゲノムが挙げられる。 In the present invention, specifically, “Ad genome lacking at least region A” is preferably an E1 region-deficient Ad, a restricted growth type Ad genome, or the like. Here, the region A specifically includes an E1 region, an E2 region, an E3 region, and an E4 region. As the Ad genome lacking the region A, an E1 region-deficient Ad genome is particularly preferable.
E1領域欠損型Adゲノムとは、E1領域を欠損させたAdゲノムをいう。E1領域欠損とは、E1タンパク質をコードする領域を機能的に欠損させることを意味する。機能的に欠損させるとは、例えば、宿主細胞内で機能するE1タンパク質を発現させないようにすることであり、E1タンパク質をコードする遺伝子のすべてを欠損している必要はない。一般に、E1領域を欠損したAdは、E1タンパク質を発現している細胞（例えば、293細胞）以外では増殖することができない。 The E1 region-deficient Ad genome refers to an Ad genome lacking the E1 region. E1 region deletion means that a region encoding E1 protein is functionally deleted. The functional deletion means, for example, that the E1 protein that functions in the host cell is not expressed, and it is not necessary to delete all the genes encoding the E1 protein. In general, an Ad that lacks the E1 region cannot proliferate except in cells that express the E1 protein (for example, 293 cells).
ヒト5型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）において、E1領域とは、具体的には342-3253番目に相当する。したがって、本発明のAdベクタープラスミドは、宿主細胞内で機能するE1タンパク質を発現しないのであれば、342-3253番目の領域の一部を有するものであってもよい。 In the human type 5 Ad genome (GenBank Accession numbers: M73260, M29978), the E1 region specifically corresponds to positions 342-3253. Therefore, the Ad vector plasmid of the present invention may have a part of the 342-3253rd region as long as it does not express the E1 protein that functions in the host cell.
本発明のAdベクタープラスミドは、E1領域の他に、例えばE3領域を欠損させた5型Adゲノムの一部又は全部であっても良い。ヒト5型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）のE3領域とは、28133-30818番目又は27865-30995番目に相当する部位をいう。制限増殖型Adは、E1タンパク質の発現が例えば癌細胞でのみ起こるAdであり、NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001)に報告されているものを例示することができる。 In addition to the E1 region, the Ad vector plasmid of the present invention may be, for example, part or all of the type 5 Ad genome lacking the E3 region. The E3 region of the human type 5 Ad genome (GenBank Accession number: M73260, M29978) refers to a site corresponding to the 28133-30818th or 27865-30995th. Restricted growth type Ad is an Ad in which expression of E1 protein occurs only in, for example, cancer cells, and can be exemplified by those reported in NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001).
本発明において、Adゲノムのカプシドタンパク質とは、ウイルスゲノムの表面タンパク質をいい、具体的にはファイバー、ヘキソン、ペントンベース、pIX（プロテインIX）などが挙げられる。ファイバータンパク質は、ノブ、シャフト、テールより構成され、ファイバーノブ、ファイバーシャフト、ファイバーテールともいう。 In the present invention, the Ad genome capsid protein refers to a surface protein of the viral genome, and specifically includes fiber, hexon, penton base, pIX (protein IX) and the like. The fiber protein is composed of a knob, a shaft, and a tail, and is also called a fiber knob, a fiber shaft, and a fiber tail.
本発明のAdベクタープラスミドは、Adベクタープラスミドとしての機能を発揮しうるものであればよく、そのような機能を発揮しうるのであれば、Adゲノムのうち、例えばファイバー、ヘキソン、ペントンベース、pIX（プロテインIX）などの一部を欠損していても良い。具体的には、ファイバータンパク質のうち、ノブ、シャフト、テールなどの一部が欠損するものであってもよい。 The Ad vector plasmid of the present invention is not particularly limited as long as it can function as an Ad vector plasmid. If such a function can be exhibited, among the Ad genomes, for example, fiber, hexon, penton base, pIX (Protein IX) etc. may be partially missing. Specifically, a part of the fiber protein such as a knob, a shaft, or a tail may be lost.
本発明において、「領域Ａをコードする遺伝子配列が組み込まれたAdベクター作製用細胞」とは、例えば領域ＡがE1領域の場合は293細胞が挙げられる。ここにおいて、293細胞とは、ヒト胎児腎細胞をヒト5型AdのE1遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株であり、E1タンパク質を恒常的に発現している。上記の他、領域Ａに対応して、領域Ａをコードする遺伝子を人工的にトランスフォーメーションして作製した細胞であってもよい。 In the present invention, the “cell for preparing an Ad vector into which a gene sequence encoding region A is incorporated” includes, for example, 293 cells when region A is an E1 region. Here, the 293 cell is a cell line established by transforming human fetal kidney cells with the E1 gene of human type 5 Ad, and constantly expresses the E1 protein. In addition to the above, a cell produced by artificial transformation of a gene encoding region A corresponding to region A may be used.
本発明のAdベクターの作製方法は、以下の２つの工程を含むことを特徴とする：
１）Adゲノムの上記欠損した領域Ａとは異なる部位に、目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し；かつ、
２）Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、上記外来遺伝子を含む全Adゲノムの長さが、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子を挿入する。
The method for producing an Ad vector of the present invention comprises the following two steps:
1) inserting a foreign gene containing the target gene into a site different from the deleted region A of the Ad genome; and
2) The length of the entire Ad genome including the foreign gene exceeds the packaging limit when homologous recombination occurs between the Ad genome-derived gene sequence and the Ad-derived gene sequence incorporated into the cell. Insert a foreign gene of the designed length.
一般的に、野生型Adゲノム(100)に対して、全Adゲノムの長さが少なくとも105を超える場合は、パッケージングされないといわれている。本発明において、パッケージングリミットを超えるように設計された長さは、パッケージングされない長さであれば良く、特に限定されないが、野生型Adゲノム(100)とした場合に、全Adゲノムの長さが少なくとも107を超えるものをいう。全Adゲノムの長さが少なくとも107を超える場合は、Adのカプシドでパッケージングできる大きさを超えているので、該Adゲノムはウイルス粒子を形成することができず、ウイルスの自己増殖を獲得することがでない。その結果、RCAの出現が低減化される（図２参照）。 In general, when the length of the entire Ad genome exceeds at least 105 compared to the wild-type Ad genome (100), it is said that it is not packaged. In the present invention, the length designed to exceed the packaging limit is not particularly limited as long as it is a length that is not packaged. However, when the wild-type Ad genome (100) is used, the length of the entire Ad genome is not limited. That whose length exceeds at least 107. If the length of the entire Ad genome exceeds at least 107, it is larger than can be packaged with the Ad capsid, so the Ad genome cannot form virus particles and gains viral self-propagation That's not true. As a result, the appearance of RCA is reduced (see FIG. 2).
さらに、上記において、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こさない場合に、野生型Adゲノムの長さを100とした場合に、全Adの長さが105以下となるように設計されている外来遺伝子を挿入することが必要である。Adベクターを例えば遺伝子治療などにより生体内に投与した場合に、目的とする外来遺伝子はパッケージングされることが必要だからである。 Furthermore, in the above, when the part of the gene sequence derived from Ad incorporated into the cell does not undergo homologous recombination, the length of all Ad is 105 or less when the length of the wild-type Ad genome is 100. It is necessary to insert a foreign gene that is designed to be This is because the target foreign gene must be packaged when the Ad vector is administered in vivo by, for example, gene therapy.
具体的には、野生型Adゲノムの長さをＸとし、Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、上記外来遺伝子を含む全Adゲノムの長さをＹとした場合に、Ｙの長さがＸの長さの107％を超える場合にパッケージングされない場合が多く、好適には109.5％以上であり、特に好適には113.9％以上であればパッケージングリミットを超え、RCAが形成されない。より具体的には、ヒト5型Adの野生型Adゲノム長は、35935 bpであり、105％の長さは37732 bp（GenBank Accession番号：M73260, M29978）であり、107％の長さは38450 bpである。 Specifically, when the length of the wild-type Ad genome is X and the gene sequence derived from the Ad genome and the portion of the gene sequence derived from Ad incorporated into the cell undergo homologous recombination, the foreign gene is When the length of the entire Ad genome including Y is Y, it is often not packaged when the length of Y exceeds 107% of the length of X, preferably 109.5% or more, particularly preferably If it is 113.9% or more, the packaging limit is exceeded and RCA is not formed. More specifically, the wild-type Ad genome length of human type 5 Ad is 35935 bp, the length of 105% is 37732 bp (GenBank Accession No .: M73260, M29978), and the length of 107% is 38450 bp.
少なくとも領域Ａを欠損してなるAdゲノムの、領域Ａをコードする遺伝子の長さをｘとし、外来遺伝子の長さをｙとした場合に、ｙと上記Ｘ，Ｙ及びｘとの関係は、以下の式（Ａ）（Ｂ）に示すことができる。さらに、Adベクターゲノムが、領域Ａ以外の箇所でウイルスの増殖能に影響を及ぼさない箇所でｎ箇所の欠損を認め、各々欠損している領域の長さの合計をｘｎとした場合は、以下の式に当てはめることができる。ｘｎの大きさは、適宜決定することができる。但し、領域Ａ以外の箇所でウイルスの増殖能に影響を及ぼさない箇所でAdベクターゲノムに欠損がない場合は、ｘｎ＝0とする。 The relationship between y and the above X, Y and x, where x is the length of the gene encoding region A and y is the length of the foreign gene in the Ad genome lacking at least region A, It can be shown in the following formulas (A) and (B). Furthermore, when the Ad vector genome has defects in n places at places other than the area A that do not affect the virus growth ability, and the total length of each missing area is xn, Can be applied to The size of xn can be determined as appropriate. However, if there is no defect in the Ad vector genome at a place other than the region A that does not affect the virus growth ability, xn = 0 is set.
（Ａ）細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合の、外来遺伝子が組み込まれたときのAdベクターゲノムの長さ：Ｙ
Ｙ＝Ｘ−ｘｎ＋ｙ、ｙ＝Ｙ−（Ｘ−ｘｎ）
（Ｂ）細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こさない場合の、外来遺伝子が組み込まれたときのAdベクターゲノムの長さ：Ｙ’
Ｙ’＝Ｘ−ｘ−ｘｎ＋ｙ、ｙ＝Ｙ’−（Ｘ−ｘ−ｘｎ）
(A) Length of Ad vector genome when a foreign gene is integrated when homologous recombination occurs in a portion of an Ad-derived gene sequence integrated into a cell: Y
Y = X-xn + y, y = Y- (X-xn)
(B) The length of the Ad vector genome when a foreign gene is integrated when the portion of the gene sequence derived from Ad integrated into the cell does not undergo homologous recombination: Y ′
Y ′ = X−x−xn + y, y = Y ′ − (X−x−xn)
上記式に当てはめると、ＹはＸを100としたときに少なくとも107を超え、Ｙ’は105以下であることが必要であるので、
（Ａ）38450＜Ｙ＝35935−ｘｎ＋ｙ、ｙ＝Ｙ−35935＋ｘｎ
（Ｂ）37732≧Ｙ’＝35935−ｘ−ｘｎ＋ｙ，ｙ＝Ｙ’−35935＋ｘ＋ｘｎ
When applied to the above formula, Y must exceed at least 107 when X is 100, and Y ′ needs to be 105 or less.
(A) 38450 <Y = 35935-xn + y, y = Y-35935 + xn
(B) 37732 ≧ Y ′ = 35935−x−xn + y, y = Y′−35935 + x + xn
具体的には、E1領域を欠く5型Adゲノムに、長さをｙとした外来遺伝子を組み込んだ場合には、E1領域は5型Adゲノムの342-3253番目に相当するので、ｘ＝3182を当てはめることができる。また、E1領域の他に欠損箇所がない場合に、ｘｎ＝0を当てはめることができる。この場合には、外来遺伝子ｙの長さは以下より選択することができる。ここにおいて、外来遺伝子ｙとは目的遺伝子が発現可能なものであればよく、目的遺伝子以外の塩基配列を含んでいても良い。
上記より、該例遺伝子ｙの大きさは、2515＋ｘｎ＜ｙ≦4979＋ｘｎの範囲より選択することができる。例えば、E1領域以外の部位で欠損箇所がない場合は、外来遺伝子ｙの大きさは、2515＜ｙ≦4979の範囲より選択することができる。
Specifically, when a foreign gene having a length y is incorporated into a type 5 Ad genome lacking the E1 region, the E1 region corresponds to positions 342-3253 of the type 5 Ad genome, so x = 3182 Can be applied. Further, xn = 0 can be applied when there is no missing portion other than the E1 region. In this case, the length of the foreign gene y can be selected from the following. Here, the foreign gene y may be any gene that can express the target gene, and may include a base sequence other than the target gene.
From the above, the size of the example gene y can be selected from the range of 2515 + xn <y ≦ 4979 + xn. For example, in the case where there is no missing portion at a site other than the E1 region, the size of the foreign gene y can be selected from the range of 2515 <y ≦ 4979.
本発明のAdベクターは、外来遺伝子の大きさが、上記の条件、即ち：
１）Adゲノムの上記欠損した領域Ａとは異なる部位に、目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し；かつ、
２）Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、上記外来遺伝子を含む全Adゲノムの長さが、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子を挿入する、という条件に当てはまるのであれば、Adゲノム由来ではなく、また外来遺伝子でもない他の配列を含むものであっても良い。
In the Ad vector of the present invention, the size of the foreign gene is as described above, ie:
1) inserting a foreign gene containing the target gene into a site different from the deleted region A of the Ad genome; and
2) The length of the entire Ad genome including the foreign gene exceeds the packaging limit when homologous recombination occurs between the Ad genome-derived gene sequence and the Ad-derived gene sequence incorporated into the cell. As long as the condition that a foreign gene having a length designed as described above is inserted, it may contain other sequences that are not derived from the Ad genome and are not foreign genes.
本発明は、上記のAdベクターを作製する方法の他、上記方法によって作製されたAdベクターにも及ぶ。 The present invention extends to the Ad vector prepared by the above method as well as the above method of preparing the Ad vector.
以下に実施例及び実験例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples and experimental examples, but the present invention is not limited thereto.
〔実施例〕Adベクターの構築
本実施例では、5型AdゲノムのE1領域とは異なる部位、即ちE3領域に、βガラクトシダーゼ(LacZ)、ルシフェラーゼ(L)又は緑蛍光タンパク質(GFP)各々をコードする遺伝子を挿入したAdベクターを構築した（Ad-LacZ(E3)、Ad-L(E3)、Ad-GFP(E3)）。Adゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたAd由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合の、上記外来遺伝子を含む全Adゲノムの長さは、パッケージングリミット、即ち37732より、各々0.6 kb、1.6 kb及び3.2 kb超えるように構築されている。各対照として、5型AdゲノムのE1領域に上記各遺伝子を挿入したAdベクター、Ad-LacZ(E1)、Ad-L(E1)及びAd-GFP(E1)を構築した。Adベクターは、すべてHum. Gene Ther., 9, 2577-2583 (1998)及びHum. Gene Ther., 10, 2013-2017 (1999)に記載の方法に従って構築した。
[Example] Construction of Ad vector In this example, β-galactosidase (LacZ), luciferase (L) or green fluorescent protein (GFP) is encoded in a site different from the E1 region of the type 5 Ad genome, that is, the E3 region. Ad vectors into which the genes to be inserted were inserted were constructed (Ad-LacZ (E3), Ad-L (E3), Ad-GFP (E3)). When homologous recombination occurs between the Ad genome-derived gene sequence and the Ad-derived gene sequence incorporated into the cell, the length of the entire Ad genome including the foreign gene is from the packaging limit, ie 37732 Are constructed to exceed 0.6 kb, 1.6 kb, and 3.2 kb, respectively. As each control, Ad vectors, Ad-LacZ (E1), Ad-L (E1) and Ad-GFP (E1) were constructed by inserting the above genes into the E1 region of the type 5 Ad genome. All Ad vectors were constructed according to the methods described in Hum. Gene Ther., 9, 2577-2583 (1998) and Hum. Gene Ther., 10, 2013-2017 (1999).
１）ベクタープラスミドの構築
E3領域に外来遺伝子を有するAdベクタープラスミド構築のために、外来遺伝子カセットをAdのE3領域へ導入可能なAdベクタープラスミド(pAdHM41-E3(+))を、以下のように作製した。pGEM7Zf(+)(Promega社)のXbaI/ScaI断片を以下の配列番号１及び２に示すオリゴヌクレオチドにライゲーションし、pFS3を得た。制限酵素SbfIの認識配列（CCTGCAGG）とAscIの認識認識（GGCGCGCC）には下線を施した。
（配列番号１）5'-CTAGCCTGCAGGATTTAAATGGCGCGCCGCGATCGCGCGGCCGCAGCT-3'
（配列番号２）5'-GCGGCCGCGCGATCGCGGCGCGCCATTTAAATCCTGCAGG-3'
1) Construction of vector plasmid
In order to construct an Ad vector plasmid having a foreign gene in the E3 region, an Ad vector plasmid (pAdHM41-E3 (+)) capable of introducing a foreign gene cassette into the E3 region of Ad was prepared as follows. The XbaI / ScaI fragment of pGEM7Zf (+) (Promega) was ligated to the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 below to obtain pFS3. The restriction enzyme SbfI recognition sequence (CCTGCAGG) and AscI recognition recognition (GGCGCGCC) are underlined.
(SEQ ID NO: 1) 5'-CTAG CCTGCAGG ATTTAAAT GGCGCGCC GCGATCGCGCGGCCGCAGCT-3 '
(SEQ ID NO: 2) 5'-GCGGCCGCGCGATCGC GGCGCGCC ATTTAAAT CCTGCAGG -3 '
E1欠損領域に外来遺伝子を挿入できるベクタープラスミドpAdHM3（Hum. Gene Ther., 9, 2577-2583 (1998)）のSalI部位をAscI リン酸化リンカー（New England Biolabs社）を用いてAscI部位に変え、AscI/SbfIで切断し、pFS3のAscI/SbfI断片とライゲーションした。得られたプラスミドpAd25-35 kbをXbaIで切断し、以下の配列番号３及び４に示すオリゴヌクレオチドとライゲーションした。制限酵素ClaIの認識配列（ATCGAT）には下線を施した。
（配列番号３）5'-CTAGGGAATCGATATCG-3'
（配列番号４）5'-CTAGCGATATCGATTCC-3'
The SalI site of the vector plasmid pAdHM3 (Hum. Gene Ther., 9, 2577-2583 (1998)) that can insert a foreign gene into the E1-deficient region was changed to an AscI site using an AscI phosphorylated linker (New England Biolabs), Cleavage with AscI / SbfI and ligation with the AscI / SbfI fragment of pFS3. The obtained plasmid pAd25-35 kb was cleaved with XbaI and ligated with the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 below. The restriction enzyme ClaI recognition sequence (ATCGAT) is underlined.
(SEQ ID NO: 3) 5'-CTAGGGA ATCGAT ATCG-3 '
(SEQ ID NO: 4) 5'-CTAGCGAT ATCGAT TCC-3 '
得られたプラスミド、pAd25-35 kb(ClaI)をClaIで切断し、以下の配列番号５及び６に示すオリゴヌクレオチドとライゲーションした。
（配列番号５）5'-CGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAATTTAAATATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATGAAATGGCA-3'
（配列番号６）5'-CGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGATATTTAAATTCGCTACCTTAGGACCGTTATAGTTA-3'
得られたプラスミドpAd25-35 kbは、Adゲノム(25292-33289番目)までを含み、25293番目のXbaI認識配列の代わりにI-CeuI/SwaI/PI-SceI認識配列を含む。
The obtained plasmid, pAd25-35 kb (ClaI) was cleaved with ClaI and ligated with the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 below.
(SEQ ID NO: 5) 5'-CGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAATTTAAATATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATGAAATGGCA-3 '
(SEQ ID NO: 6) 5'-CGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGATATTTAAATTCGCTACCTTAGGACCGTTATAGTTA-3 '
The obtained plasmid pAd25-35 kb contains up to the Ad genome (25292-33289), and contains an I-CeuI / SwaI / PI-SceI recognition sequence instead of the 25293th XbaI recognition sequence.
pAdHM41（J. Gene Med., 5, 267-276 (2003)）をI-CeuI/PI-SceIで切断し、以下の配列番号７及び８に示すオリゴヌクレオチドとライゲーションし、pAdHM41-XbaIを構築した。制限酵素XbaIの認識配列（TCTAGA）には下線を施した。
（配列番号７）5'-ATCGTCTAGAATCGGTGC-3'
（配列番号８）5'-CGATTCTAGACGATTTAG-3'
I-CeuI/SwaI/PI-SceI認識配列を含むpAd25-35 kbのSphI断片をAdベクターのファイバー領域を含むpAdHM41-XbaIのSphI断片でライゲーションし、pAd25-35 kbを得た。SpeIで線形化したpAdHM41-XbaI及びpAd25-35 kbのPacI/AscI破片を、エレクトロポレーションによって大腸菌BJ5183株(recBCとsbcBC)(Qbiogene社)でトランスフォーメーションし、相同組換えを生じさせた。
pAdHM41 (J. Gene Med., 5, 267-276 (2003)) was cleaved with I-CeuI / PI-SceI and ligated with the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 below to construct pAdHM41-XbaI. . The recognition sequence for restriction enzyme XbaI (TCTAGA) is underlined.
(SEQ ID NO: 7) 5'-ATCG TCTAGA ATCGGTGC-3 '
(SEQ ID NO: 8) 5'-CGAT TCTAGA CGATTTAG-3 '
The pAd25-35 kb SphI fragment containing the I-CeuI / SwaI / PI-SceI recognition sequence was ligated with the SphI fragment of pAdHM41-XbaI containing the fiber region of the Ad vector to obtain pAd25-35 kb. The pAdHM41-XbaI and pAd25-35 kb PacI / AscI fragments linearized with SpeI were transformed with E. coli strain BJ5183 (recBC and sbcBC) (Qbiogene) by electroporation to produce homologous recombination.
得られたプラスミドpAdHM41-E3(+)は、E1領域を欠損し、E1欠損領域にXbaI認識配列、E3領域にI-CeuI/SwaI/PI-SceI認識配列、ファイバータンパク質のHIループコード領域であるAdゲノムの位置32679 bpと32680 bp間にCsp45I認識配列、ファイバータンパク質のC-ターミナルの領域である32784 bpと32785 bp間にClaI認識配列を含む。作製した新規ベクタープラスミドpAdHM41-E3(-)、pAdHM41-E3(+)は、それぞれ、E1/E3領域、E1領域を欠損した全長のAdゲノムを有したベクタープラスミドであり、ゲノム両末端にはPacI部位を有している。 The resulting plasmid pAdHM41-E3 (+) lacks the E1 region, has an XbaI recognition sequence in the E1 deletion region, an I-CeuI / SwaI / PI-SceI recognition sequence in the E3 region, and an HI loop coding region of the fiber protein. A Csp45I recognition sequence is contained between positions 32679 bp and 32680 bp of the Ad genome, and a ClaI recognition sequence is contained between 32784 bp and 32785 bp which are regions of the C-terminal of the fiber protein. The prepared new vector plasmids pAdHM41-E3 (-) and pAdHM41-E3 (+) are vector plasmids having a full-length Ad genome lacking the E1 / E3 region and the E1 region, respectively. Has a site.
サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含み、外来遺伝子として、LacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子を各々含むシャトルプラスミド、即ちpHMCMV-LacZ1、pHMCMV-L1及びpHMCMV-GFP1を常法に従い構築した。各遺伝子発現用シャトルプラスミドを各々I-CeuI/PI-SceIで切断し、I-CeuI/PI-SceIで切断したpAdHM3あるいはpAdHM41-E3(+)とライゲーションし、Adベクタープラスミド、即ちpAdHM3-LacZ、pAdHM41-E3(+)-LacZ、pAdHM3-L、pAdHM41-E3(+)-L、pAdHM3-GFP及びpAdHM41-E3(+)-GFPを各々構築した。 Shuttle plasmids containing a cytomegalovirus (CMV) promoter and each containing a LacZ gene, a luciferase gene, and a GFP gene as foreign genes, ie, pHMCMV-LacZ1, pHMCMV-L1, and pHMCMV-GFP1, were constructed according to a conventional method. Each gene expression shuttle plasmid was cleaved with I-CeuI / PI-SceI, ligated with pAdHM3 or pAdHM41-E3 (+) cleaved with I-CeuI / PI-SceI, Ad vector plasmid, i.e., pAdHM3-LacZ, pAdHM41-E3 (+)-LacZ, pAdHM3-L, pAdHM41-E3 (+)-L, pAdHM3-GFP and pAdHM41-E3 (+)-GFP were each constructed.
２）Adベクターの作製
上記１）で構築したベクタープラスミドを各々ウイルスゲノム末端に存在する制限酵素PacIで切断して線状化し、トランスフェクション試薬SuperFectTM(Qiagen社)を用いて293細胞へトランスフェクションした。約10日間培養後、各遺伝子発現Adベクター(Ad-LacZ(E1)、Ad-LacZ(E3)、Ad-L(E1)、Ad-L(E3)、Ad-GFP(E1)及びAd-GFP(E3))を得た（図３）。細胞変成効果（CPE）が生じたAdベクターを20分の1ずつ継代して、Adベクターを増幅させた。7、11、16継代したAdベクターを、塩化セシウム密度勾配遠心を用いた常法により精製した。
2) Preparation of Ad vector The vector plasmid constructed in 1) above was linearized by cutting with the restriction enzyme PacI present at the end of the viral genome, and transfected into 293 cells using the transfection reagent SuperFect ™ (Qiagen). did. After culturing for about 10 days, each gene expression Ad vector (Ad-LacZ (E1), Ad-LacZ (E3), Ad-L (E1), Ad-L (E3), Ad-GFP (E1) and Ad-GFP (E3)) was obtained (FIG. 3). The Ad vector in which the cytopathic effect (CPE) occurred was passaged by 1/20 to amplify the Ad vector. The Ad vector passaged at 7, 11 and 16 was purified by a conventional method using cesium chloride density gradient centrifugation.
〔実験例〕精製したベクターのRCA検出試験
実施例で得た精製ベクターストック中にRCAが含まれるかどうかを定量的PCR法を用いて測定した。なお、本実験例で行ったRCA検出試験は、Infectivity PCR法を利用したものであり、Adベクター3×109 VP中にRCAが1 PFU（plaque forming unit）含まれていればRCAを検出できる。
[Experimental Example] RCA Detection Test of Purified Vector Whether or not RCA was contained in the purified vector stock obtained in the example was measured using a quantitative PCR method. In addition, the RCA detection test performed in this experiment example uses the Infectivity PCR method, and RCA can be detected if 1 PFU (plaque forming unit) is included in the Ad vector 3 × 10 9 VP. .
ヒト子宮頸癌細胞株であるHeLa細胞を10 % FCS-MEMを用いて100 mm ディッシュに1.5×106 個播種し、翌日1 % FCS-MEMで希釈した実施例で構築した各Adベクターを109 VP/1.2 mLで2時間感染させた(n=3)。4日後に細胞を回収し、1200 rpmで5分間遠心後上清を捨て、PBS(-) 100 μLに懸濁した。凍結融解を4回行ない、2000 rpmで10分間遠心した。 HeLa cells, a human cervical cancer cell line, were seeded at 1.5 × 10 6 in 100 mm dishes using 10% FCS-MEM and diluted with 1% FCS-MEM the next day. Infected with 9 VP / 1.2 mL for 2 hours (n = 3). After 4 days, the cells were collected, centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded and suspended in 100 μL of PBS (−). Freeze-thaw was performed 4 times and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes.
上清100 μLを37 ℃で30分間DNase I (0.2 mg/mL)、RNase A (0.2 mg/mL)、MgCl2 (10 mM)処理することにより、細胞由来の核酸を分解させた。SMI TEST EX-R&D (Genome Science Laboratories社)を用いて、Adベクター由来のDNAを抽出し、滅菌精製水20 μLに懸濁したものを試料とした。 各試料に含まれるAd E1 DNA量を、ABI Prism 7000 sequence detection system (Applied Biosystems社)を用いて測定した。RCA（野生型Ad）の標準としては、Adenovirus Reference Material (ATCC VR-1516)を使用した。 100 μL of the supernatant was treated with DNase I (0.2 mg / mL), RNase A (0.2 mg / mL), and MgCl 2 (10 mM) at 37 ° C. for 30 minutes to degrade the nucleic acid derived from the cells. A DNA sample derived from Ad vector was extracted using SMI TEST EX-R & D (Genome Science Laboratories) and suspended in 20 μL of sterile purified water. The amount of Ad E1 DNA contained in each sample was measured using an ABI Prism 7000 sequence detection system (Applied Biosystems). Adenovirus Reference Material (ATCC VR-1516) was used as a standard for RCA (wild type Ad).
測定条件は、試料 10 μL、0.5μMプライマーセット、0.16μM TaqMan probe、Real-time PCR Master Mix (TOYOBO社) 25 μLを含む最終容量50 μLの混合液を反応させ、95 ℃ 10分で変性させた後、95 ℃ 15秒、60 ℃ 1分を1サイクルとして40サイクルの条件で定量した。プライマーは、以下の配列番号９及び１０に示すオリゴヌクレオチドを、プローブは配列番号１１に示すオリゴヌクレオチドを用いた。 The measurement conditions were: 10 μL of sample, 0.5 μM primer set, 0.16 μM TaqMan probe, Real-time PCR Master Mix (TOYOBO) reacted with a final volume of 50 μL containing 25 μL and denatured at 95 ° C. for 10 minutes. Thereafter, quantification was performed under the conditions of 40 cycles, with 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute as one cycle. Oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 9 and 10 below were used as primers, and oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 11 were used as probes.
（配列番号９）Ad5dE1-1035F : 5'-TCCGGTCCTTCTAACACACCTC-3'
（配列番号１０）Ad5dE1-1105R : 5'-ACGGCAACTGGTTTAATGGG-3'
（配列番号１１）Ad5dE1-1058TM probe : FAM-TGAGATACACCCGGTGGTCCCGC-TAMRA
(SEQ ID NO: 9) Ad5dE1-1035F: 5'-TCCGGTCCTTCTAACACACCTC-3 '
(SEQ ID NO: 10) Ad5dE1-1105R: 5'-ACGGCAACTGGTTTAATGGG-3 '
(SEQ ID NO: 11) Ad5dE1-1058TM probe: FAM-TGAGATACACCCGGTGGTCCCGC-TAMRA
上記の結果、各ロットのAdベクターについて、n=3でRCA検出試験を行い、RCAが出現した場合を確認した（n=3のうち、１つでもRCAが検出されれば、RCA混入陽性とした）。対照である従来のE1欠損領域に外来遺伝子を挿入したAd-LacZ(E1)、Ad-L(E1)、Ad-GFP(E1)では、RCAが検出されたロット数は継代数が多い程上昇し、16継代ではほとんどのロットのAdベクターでRCAを検出した。一方、1.6 kb又は3.2 kbを超えるように外来遺伝子を搭載したAd-LacZ(E3)やAd-L(E3)では16継代しても全くRCAの出現が認められなかった。従って、パッケージングリミットを十分に超えるようにAdベクターを構築すれば、RCAの出現をほぼ完全に抑制できることが示唆された（表１）。 As a result of the above, the RCA detection test was performed for each lot of Ad vectors at n = 3, and the case where RCA appeared was confirmed (if at least one RCA was detected in n = 3, RCA contamination was positive. did). In Ad-LacZ (E1), Ad-L (E1), and Ad-GFP (E1), in which a foreign gene was inserted into the conventional E1-deficient region as a control, the number of lots in which RCA was detected increased as the number of passages increased. However, RCA was detected in most lots of Ad vectors at passage 16. On the other hand, in Ad-LacZ (E3) and Ad-L (E3) carrying a foreign gene so as to exceed 1.6 kb or 3.2 kb, no RCA appeared even after 16 passages. Therefore, it was suggested that the appearance of RCA can be almost completely suppressed if the Ad vector is constructed so as to sufficiently exceed the packaging limit (Table 1).
即ち、E3領域を有したAdベクターを用いた場合（pAdHM41-E3(+)を用いてAdベクターを作製した場合）、外来遺伝子のカセットのサイズが、1.8 kb以上、5.0 kb以下であれば、目的のE1領域欠損型Adベクターのみがパッケージングされ、E1領域を含むAdベクターゲノムはパッケージングされないことになる。また、 3130bpのE3領域を欠損させたAdベクターの場合（pAdHM41-E3(-)を用いてAdベクターを作製した場合）、外来遺伝子のカセットのサイズが、5.0 kb以上、8.1 kb以下であれば、目的のE1領域欠損型Adベクターのみがパッケージングされて、E1領域を含むAdベクターゲノムはパッケージングされないことになる。 That is, when an Ad vector having an E3 region is used (when an Ad vector is prepared using pAdHM41-E3 (+)), if the size of the foreign gene cassette is 1.8 kb or more and 5.0 kb or less, Only the target E1 region-deficient Ad vector is packaged, and the Ad vector genome containing the E1 region is not packaged. In the case of an Ad vector lacking the 3130 bp E3 region (when an Ad vector is prepared using pAdHM41-E3 (-)), if the size of the foreign gene cassette is 5.0 kb or more and 8.1 kb or less Only the target E1 region-deficient Ad vector is packaged, and the Ad vector genome containing the E1 region is not packaged.
なお、本実施例では、外来遺伝子の挿入部位としてE3領域を用いたが、本発明のAdベクターにおける遺伝子導入系はE3領域以外の部位（例えば、ファイバーC末端コード領域や、E4遺伝子と3'ITRの間の領域、pIX C末端コード領域）に外来遺伝子を挿入した場合にも利用できると考えられる。 In this example, the E3 region was used as the insertion site for the foreign gene, but the gene transfer system in the Ad vector of the present invention is a site other than the E3 region (for example, fiber C-terminal coding region, E4 gene and 3 ′ It can also be used when a foreign gene is inserted into the region between ITRs and the pIX C-terminal coding region.
理論上、外来遺伝子のサイズが約2.5 kb以上、5.0 kb以下であればE3領域を有したベクタープラスミドpAdHM41-E3(+)を、約5.7 kb以上、8.1 kb以下であればpAdHM41-E3(-)を用いることで、RCAの出現を抑えたAdベクターが作製できると考えられる。なお、2.5 kb以下の外来遺伝子や、5.0 kb以上、約5.7 kb以下の外来遺伝子の場合には、遺伝子発現に無関係な遺伝子配列（スタッファー配列）を付与することで遺伝子サイズを調整すれば、RCAの出現を抑えたAdベクターが作製できる。本実験例により、パッケージングリミットを十分超える様にベクター設計をすることがRCA出現の頻度減少に好ましいことが示唆された。 Theoretically, if the size of the foreign gene is about 2.5 kb or more and 5.0 kb or less, the vector plasmid pAdHM41-E3 (+) having the E3 region is used.If the size of the foreign gene is about 5.7 kb or more and 8.1 kb or less, pAdHM41-E3 (- ) Can be used to produce Ad vectors that suppress the appearance of RCA. In the case of a foreign gene of 2.5 kb or less, or a foreign gene of 5.0 kb or more and about 5.7 kb or less, if the gene size is adjusted by adding a gene sequence unrelated to gene expression (stuffer sequence), RCA Ad vectors that suppress the appearance of can be produced. This experimental result suggests that designing the vector so as to sufficiently exceed the packaging limit is preferable for reducing the frequency of RCA appearance.
以上詳述したように、本発明の方法により作製されたAdベクターは、より安全性の高い遺伝子治療用のAdベクターとして利用可能である。従来のE1欠損領域に外来遺伝子を挿入したAdベクターでは、調製したAdベクターのロット毎に、RCAの混入率をチェックする面倒な作業が必要であったが、本発明の方法により作製されたAdベクターを利用すれば、実質的にRCAの混入率をチェックする作業も不要になり、非常に有用である。また、現在米国FDAは、Adベクターを用いた遺伝子治療臨床研究で用いるRCA混入の許容量として、3×1010 （VP）粒子あたり、1 PFU以下であることを推奨しており、293細胞を用いた従来のAdベクターでは、継代を重ねることにより、この許容量は超えてしまうことがあると予想される。本発明の方法により作製されたAdベクターを用いれば、RCAの出現頻度が激減するため、安全性の向上やAdベクターを製造していく上でのコスト削減の点で、大きな貢献が期待できる。 As described in detail above, the Ad vector produced by the method of the present invention can be used as an Ad vector for gene therapy with higher safety. In the conventional Ad vector in which a foreign gene has been inserted into the E1 deficient region, it was necessary to perform a troublesome work to check the contamination rate of RCA for each lot of the prepared Ad vector, but the Ad vector prepared by the method of the present invention was used. If a vector is used, the work of checking the contamination rate of RCA substantially becomes unnecessary, which is very useful. Currently, the US FDA recommends that the allowable amount of RCA contamination used in gene therapy clinical research using Ad vectors is 1 PFU or less per 3 × 10 10 (VP) particles. With the conventional Ad vector used, it is expected that this tolerance may be exceeded by repeated passages. If the Ad vector produced by the method of the present invention is used, the appearance frequency of RCA is drastically reduced. Therefore, a great contribution can be expected in terms of safety improvement and cost reduction in the production of the Ad vector.
Claims (5)
以下の特徴を含み、
アデノウイルスゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたアデノウイルス由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こすことによる自己増殖能を獲得したアデノウイルスの出現を抑制しうる、アデノウイルスベクターの作製方法：
１）アデノウイルスゲノムの上記欠損した領域Ａとは異なる部位に、目的遺伝子を含む外来遺伝子を挿入し；かつ、
２）アデノウイルスゲノム由来の遺伝子配列と、細胞に組み込まれたアデノウイルス由来の遺伝子配列の部分が相同組換えを起こした場合に、上記外来遺伝子を含む全アデノウイルスゲノムの長さが、パッケージングリミットを超えるように設計された長さの外来遺伝子を挿入する。 In a method for producing an adenovirus vector using a cell for producing an adenovirus vector in which a foreign gene is inserted into an adenovirus genome lacking at least region A and a gene sequence encoding the region A is incorporated,
Includes the following features:
Creation of adenovirus vectors that can suppress the appearance of adenoviruses that have acquired the ability of self-replication by homologous recombination between the adenovirus genome-derived gene sequence and the adenovirus-derived gene sequence incorporated into the cell. Method:
1) inserting a foreign gene containing a target gene into a site different from the deleted region A of the adenovirus genome; and
2) When the homologous recombination occurs between the adenovirus genome-derived gene sequence and the adenovirus-derived gene sequence incorporated into the cell, the length of the entire adenovirus genome including the foreign gene is packaged. Insert a foreign gene of a length designed to exceed the limit.
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