JP2010101631A

JP2010101631A - 組織内の脂質抗原の免疫染色方法

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Publication number: JP2010101631A
Application number: JP2008270568A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Kawasaki; 洋志河崎
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2008-10-21
Filing date: 2008-10-21
Publication date: 2010-05-06
Anticipated expiration: 2028-10-21
Also published as: JP5070183B2

Abstract

【課題】オリゴデンドロサイト系列細胞におけるガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの可視化方法を提供する。
【解決手段】オリゴデンドロサイト系列細胞とコレステロール特異的界面活性剤とを接触させる工程、およびコレステロール特異的界面活性剤と接触させたオリゴデンドロサイト系列細胞とガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドに特異的な抗体とを接触させる工程を含む、オリゴデンドロサイト系列細胞におけるガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの可視化方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、脳組織内の脂質抗原の免疫染色方法に関する。より詳細には、本発明は、コレステロール特異的界面活性剤を使用するオリゴデンドロサイト系列細胞におけるガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの可視化方法、そのための組成物およびキットに関する。

オリゴデンドロサイト（ＯＬ）は中枢神経系におけるミエリン形成を担っている。ＯＬ前駆細胞（ＯＰＣ）、前ミエリン形成ＯＬおよびミエリン形成ＯＬを含むＯＬ系列細胞の分化は、逐次的に発現されるＯＬ系列特異的な糖脂質およびタンパク質によって特徴付けられている。これらの抗原の免疫組織化学的検出により、発生過程におけるＯＬ系列細胞の分化段階の同定が可能になる。

最も量の多いミエリン脂質はガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）およびその硫酸化誘導体であるスルファチド（ＳＵＬ）であり、これらを合わせるとミエリン脂質の約２７％を占める。この量の多さおよび細胞特異性により、ＧａｌＣ／ＳＵＬは、細胞分裂を終了したＯＬの最も初期のマーカーの１つとして特に有用になっている。さらに、ＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性はＯＬの細胞膜のほぼ全体に分布しているので、ＧａｌＣ／ＳＵＬは発生過程におけるＯＬの形態変化を可視化するために有用である。

さらに、ＧａｌＣ／ＳＵＬ生合成酵素であるＵＤＰ−ガラクトースセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）を欠損するマウスにおいて、ＯＬの突起は軸索に沿って適切に配置されず、その結果、神経伝導の欠陥およびランビエ絞輪の異常形成が生じる。

病理学的状態におけるＧａｌＣおよび抗ＧａｌＣ抗体の関与が報告されている。クラッベ病（グロボイド細胞白質ジストロフィーとしても知られる）がＧａｌＣ触媒酵素であるガラクトセレブロシダーゼ活性の機能障害によって引き起こされることが示されている。クラッベ病では、ＧａｌＣがインビボで蓄積されることが報告されている。ＧａｌＣは脱髄疾患にも関与している。抗ＧａｌＣ抗体は感染後脳炎およびギラン・バレー症候群の患者において検出されている。さらに、抗ＧａｌＣ抗体は実験的アレルギー性神経炎を引き起こすことが報告されている。また、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の神経細胞および粘膜上皮への侵入におけるＧａｌＣの役割の可能性が報告されている。

上記の結果は、インビボにおけるＧａｌＣ／ＳＵＬ発現の分析がＯＬの分化およびミエリンの機能を理解するために重大であることを示唆する。

培養ＯＬにおけるＧａｌＣ／ＳＵＬの発現レベルおよび分布は多く研究されている。しかし、シュワン細胞中のＧａｌＣ発現レベルが培養中に経時的に急速に変化することが報告されており、培養細胞中のＧａｌＣ発現レベルがインビボでの発現レベルとは異なる可能性が示唆されている。それゆえ、組織切片中のＧａｌＣの発現レベルおよび分布パターンを調べることが望ましい。しかしながら、インビボにおけるＧａｌＣ／ＳＵＬの発現はさほど研究されていない。これは、組織切片におけるＧａｌＣ／ＳＵＬの免疫組織化学的局在の解析が容易でないことによる。

他の脂質分子および親油性トレーサーの場合のように、ＧａｌＣ／ＳＵＬの免疫反応性は、組織切片中への抗体の浸透を増強するために一般的に使用される界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって阻害される（非特許文献１〜２）。これはおそらく、ＧａｌＣ／ＳＵＬがＴｒｉｔｏｎＸ−１００によってＯＬの細胞膜から溶出されたからであると推測される。

免疫染色プロトコルのＴｒｉｔｏｎＸ−１００での透過処理工程を省略することによってこの問題が解決できる可能性がある。実際、固定脳切片におけるＧａｌＣの分布パターンが透過処理なしで調べられている（非特許文献１〜４）。しかし、固定組織切片を透過処理なしで免疫染色すると、切片の表面に位置する抗原のみが標識され、切片の中央に位置する抗原は染色されないままであった（非特許文献５）。従って、界面活性剤を使用しなければ、切片においてＧａｌＣ／ＳＵＬの３次元分布、形態分化およびＯＬ数を包括的に調べることは困難であった。Warringtonらは、未固定組織切片を用いて組織切片中の糖脂質の分布パターンを明確に可視化した（非特許文献６）。しかし、抗糖脂質抗体はしばしば培養ＯＬに対して生物学的活性を示すので、抗糖脂質抗体との未固定組織のインキュベーションはＯＬに対して予想外の効果を有する可能性がある。

メタノールおよびエタノールもまた脳切片中への抗体の浸透を増強する目的で使用されることがある。これらの試薬は抗体の組織切片中への浸透を効率的に改善するが、これらは広範な脂質をほぼ無差別に可溶化するので（非特許文献７）、これらの試薬を免疫染色に使用した場合、脂質抗原の検出はしばしば困難になる。

それゆえ、ＧａｌＣ／ＳＵＬ発現分布を阻害することなく組織切片中への抗体の浸透を増強する新たな免疫組織化学的方法を確立することが望まれていた。
Ghandour MS et al., J Neurocytol, 1988; 17: 485-98 Reynolds R et al., Development, 1988; 102: 409-25 Curtis R et al., J Neurocytol, 1988; 17: 43-54 Hardy R et al., Development, 1991; 111: 1061-80 Matsubayashi Y et al., J Neurosci Methods, 2008; 174: 71-81 Warrington AE et al., J Neurosci Res, 1992; 33: 338-53 Schuck S etal., Proc Natl Acad Sci USA, 2003; 100: 5795-800

本発明者らは、固定組織切片を使用してＧａｌＣ／ＳＵＬを可視化するための新たな免疫組織化学的手法の作製に着手した。最近、本発明者らは、親油性ニューロントレーサーであるＤｉＩで標識した組織切片のための免疫組織化学的方法を開発した（非特許文献５）。脂質分子をほぼ無差別に可溶化するＴｒｉｔｏｎＸ−１００の代わりに（非特許文献７）、本発明者らは、コレステロール特異的界面活性剤であるジギトニンを用いてＤｉＩ標識切片を透過処理した。本発明者らは、ジギトニンでのＤｉＩ標識脳切片の処理により、ニューロン中のＤｉＩ標識を破壊することなく組織中に抗体を効率的に透過できることを見出した。

同様に、本発明者らは、ジギトニンが内在性糖脂質であるＧａｌＣ／ＳＵＬの分布パターンも阻害しないと考えた。この仮説と一致して、本発明者らは、ジギトニン処理によって、ＧａｌＣ／ＳＵＬ標識を妨害することなく、効率的に組織切片中へ抗体が浸透するようになることをここに示す。ジギトニンは、膜の透過処理やタンパク質の抽出など、細胞生物学的および生化学的アッセイにしばしば使用されているが、本発明者らの知る限り、脳切片中の内在性糖脂質抗原の免疫蛍光染色にジギトニンを適用したのはこれが最初である。固定脳切片におけるＧａｌＣ／ＳＵＬ分布の可視化は、生理学的状態および病理学的状態両方でのＧａｌＣ／ＳＵＬ発現の詳細な検討に有用である。

従って、本発明の目的は、オリゴデンドロサイト系列細胞におけるガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの可視化方法を提供することである。

本発明は、
［１］オリゴデンドロサイト系列細胞とコレステロール特異的界面活性剤とを接触させる工程、およびコレステロール特異的界面活性剤と接触させたオリゴデンドロサイト系列細胞とガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドに特異的な抗体とを接触させる工程を含む、オリゴデンドロサイト系列細胞におけるガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの可視化方法；
［２］コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンである、［１］の方法。
［３］コレステロール特異的界面活性剤を含む、オリゴデンドロサイト系列細胞へのガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドに特異的な抗体の浸透促進用組成物；
［４］コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンである、［３］の組成物；
［５］コレステロール特異的界面活性剤およびガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドに特異的な抗体を含む、オリゴデンドロサイト系列細胞におけるガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの可視化用キット；
［６］コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンである、［５］のキット。
に関する。

本発明により、コレステロール特異的界面活性剤を使用するオリゴデンドロサイト系列細胞におけるガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの可視化方法、そのための組成物およびキットが提供される。

「オリゴデンドロサイト系列細胞」には、オリゴデンドロサイト（ＯＬ）に加えて、オリゴデンドロサイトの発生の過程で生じるオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）のような細胞が含まれる。また、中枢神経系ではオリゴデンドロサイトが出す突起からミエリンが形成されるが、ミエリン形成していない前ミエリン形成オリゴデンドロサイトおよびミエリン形成しているオリゴデンドロサイトのいずれもがオリゴデンドロサイト系列細胞に含まれる。

「ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）」は、セラミドの第一級アルコール性ヒドロキシル基にガラクトースがβ−グリコシド結合したスフィンゴ糖脂質であり、脳ミエリンの構成糖脂質である。「スルファチド（ＳＵＬ）」は、ガラクトセレブロシドのガラクトースのＣ−３位に硫酸基がエステル結合したものであり、これもまた脳ミエリンの構成糖脂質である。これらは、分裂終了オリゴデンドロサイトの最も初期のマーカーである。なお、本発明を、主にオリゴデンドロサイト系列細胞におけるガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの可視化について記載するが、ガラクトセレブロシドは消化器系の上皮など、オリゴデンドロサイト系列以外の細胞にも発現していることが知られており、また、下記のように本発明によって実質的に全ての膜が透過処理できることから、本発明をこれらの糖脂質が発現している可能性のある任意の細胞に適用することができる。

本明細書における用語「ガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドに特異的な抗体」は、ガラクトセレブロシドおよびスルファチドの一方または両方を特異的に認識する抗体をいう。抗体はポリクローナル抗体であってもよいが、均質な結果を得るためにはモノクローナル抗体がより好ましい。また、抗体は、抗原に特異的に結合する能力を有する任意の形態（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖなど）も包含する。このような抗体の例としては、ガラクトセレブロシドおよびスルファチドの両方ならびに他の構造的に関連する微量脂質を認識するモノクローナル抗体Ｒ−ｍＡｂが挙げられる（Ranscht B et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1982; 79:2709-13；Bansal R et al., J Neurosci Res, 1989; 24: 548-57）。

抗原に結合した抗体の可視化には任意の公知の標識を使用することができる。好ましい標識の例としては蛍光標識が挙げられる。抗体を直接的に標識してもよく、または標識２次抗体などを使用して間接的に標識することもできる。

本発明によれば、ガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドに特異的な抗体に加えて別の抗原に対する抗体を使用することによって脳組織切片の多重染色を行うことができる。本発明者らは、コレステロール含量の低い核膜に対してコレステロール特異的界面活性剤であるジギトニンを作用させた場合においても、核内抗原の免疫染色が可能であることを示している。従って、別の抗体として、核内の抗原に対する抗体を使用することができる。このような場合は、それぞれの抗体を波長の異なる蛍光で標識すれば、それぞれの抗原を同時に可視化することができる。

細胞膜には、リン脂質、糖脂質、ステロイド（例えば、コレステロール）などの脂質が含まれることが知られている。またこれらは、その疎水性部分のアルコール成分がグリセロールであるグリセロ脂質、当該成分がスフィンゴシンであるスフィンゴ脂質に分類される。本明細書において使用する用語「コレステロール特異的界面活性剤」は、上記細胞膜中の脂質のうち、コレステロールに対して特異的に作用する界面活性剤をいう。コレステロール特異的界面活性剤としては、サポニン、例えば、ジギトニン、キラヤサポニンなど任意の公知のものを使用することができる。サポニンはステロイドやトリテルペノイドを非糖部とする配糖体の総称であり、ジギタリス由来のステロイド配糖体であるジギトニンもサポニンに含まれる。これらのコレステロール特異的界面活性剤の誘導体も同様に本発明に使用することができる。従って、本明細書において使用する用語「ジギトニン」はその任意の誘導体を含む。本発明には、ジギトニンが好ましく用いられる。以下、本発明を主にジギトニンについて説明する。

界面活性剤は、水の表面張力の低下など、界面または表面の性質を変化させる性質（界面活性）を有する物質の総称であり、その作用は多岐にわたるが、本発明の目的のためには、脂質を破壊するように作用する性質を有するものが好ましく用いられる。界面活性剤の脂質に対する「作用」は、結果的に目的物質に特異的に結合するタンパク質の組織への浸透が促進されれば、その機構に限定はない。例えば、ジギトニンは、コレステロールとともにコレステロール−ジギトニンと称する不溶性複合体を形成して沈殿する。

オリゴデンドロサイト系列細胞と接触させる際のコレステロール特異的界面活性剤の濃度は、使用する脳組織などに応じて変動し得、免疫染色の結果などに基づいて適切に決定される。例えばジギトニンの場合、濃度は例えば１０μｇ／ｍｌ以上、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは６０μｇ／ｍｌ以上、かつ例えば５００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは２５０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１２０μｇ／ｍｌ以下である。

本発明において、オリゴデンドロサイト系列細胞の可視化には、オリゴデンドロサイト系列細胞を含有する可能性のある脳組織切片を使用することができる。脳組織切片は、例えばビブラトームなどの公知の手段を使用して作製することができる。

さらに、本発明は上記方法において使用するための組成物およびキットを提供する。本発明の組成物は上記のようなコレステロール特異的界面活性剤を含む。また、本発明のキットは、上記のようなコレステロール特異的界面活性剤および上記のようなガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドに特異的な抗体を含む。これらの組成物およびキットは、任意のさらなる成分（例えば、別の抗原に対する抗体、可視化用試薬、緩衝液、保存剤など）を含有してもよい。

本発明に従ってガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドのインビボにおける免疫組織化学的局在化を実施することによって、オリゴデンドロサイトの発生、分化、形態変化、ミエリンの形成、機能などを研究することができる。さらに、本発明に従ってガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドを可視化することによって、クラッベ病（グロボイド細胞白質ジストロフィー）、脱髄疾患、感染後脳炎、ギラン・バレー症候群、アレルギー性神経炎、ＡＩＤＳなどのような、ガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの関与が示唆されている疾患におけるこれらの糖脂質の機能の研究や、疾患の診断などを行うことができる。

材料および方法
動物：ＩＣＲおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを日本エスエルシーから購入した。Ｏｌｉｇ１欠損マウス（Xin M et al., J Neurosci, 2005; 25: 1354-65）を１２９およびＣ５７ＢＬ／６のハイブリッドバックグラウンドで維持し、Ｏｌｉｇ１欠損マウスの遺伝子型を記載されているように決定した（Toda T et al., Mol Cell Neurosci, 2008; 39: 40-9）。全てのマウスを通常の１２時間明／暗スケジュールで飼育した。

抗体および試薬：抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体（「Ｒ−ｍＡｂ」）をBarbara Ranscht博士（the Burnham Institute, La Jolla, CA）から得た（Ranscht B et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1982; 79:2709-13）。Ｏ４、ＮｅｕＮ、Ｃｙ３コンジュゲート抗ウサギＩｇＧならびにＣｙ３コンジュゲート抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎから得た。抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）抗体およびＣＣ１抗体をそれぞれＣｏｖａｎｃｅおよびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから得た。Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ３およびＡｌｅｘａ５６８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ１抗体をＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓから得た。Ｃｙ３コンジュゲート抗マウスＩｇＧ２抗体をＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから得た。ジギトニンをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）中５０ｍｇ／ｍｌの濃度で−２０℃でストックした。使用に際して、ストック溶液を少なくとも１００倍希釈した。

脳切片の調製：マウスを深く麻酔し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（４％ＰＦＡ／ＰＢＳ）で経心的に灌流した。脳を摘出し、一晩４％ＰＦＡ／ＰＢＳで後固定した。次いで、脳をビブラトームを用いて切片化し（厚さ３０μｍ）、０．０３％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で貯蔵した。

免疫組織化学：免疫組織化学を以前に記載した方法を改変して実施した（Kawasaki, H., et al., Neuron, 2000; 28:31-40；非特許文献５）。脳切片をＤＭＳＯ（０．２４％〜１％）、ジギトニン（６０〜５００μｇ／ｍｌ）または０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳで室温で３０分間前処理し、１次抗体とともに各前処理溶液中で１２時間４℃でインキュベートした。メタノールでの透過処理については、切片をメタノール中で３０分間−２０℃でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで１次抗体とともに３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１２時間４℃でインキュベートした。１次抗体とのインキュベーション後、切片をＰＢＳで洗浄し、２次抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（終濃度１μｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入）とともに３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で３時間室温でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。次いで、切片を顕微鏡スライドガラスに付着させ、Ｍｏｗｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用してカバーグラスをのせた。抗体希釈は以下のとおりであった：抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ、１：１００；ＣＣ１、１：１０００；抗ＭＢＰ、１：１０００；Ｏ４、１：５００；抗ＮｅｕＶ、１：１０００；Ｃｙ３コンジュゲート抗マウスＩｇＧ２、１：１０００；他の２次抗体、１：５００。

顕微鏡観察：顕微鏡による解析を以前に記載のように行った（非特許文献５）。落射蛍光顕微鏡観察をＡｘｉｏＩｍａｇｅｒＡ１顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を用いて実施した。共焦点顕微鏡観察をＬＳＭ５１０顕微鏡および４０ｘ／１．３ＮＡ対物レンズ（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を使用して実施した。Ｚスタック画像（光学的厚さ２．１μｍ）を１．７５μｍ毎に収集し、ＺＥＮ２００７およびＺＥＮ２００７ＬＥソフトウエア（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を使用して３次元（３Ｄ）的に再構築した。画像を単一のＸＹまたはＸＺ光学的断面図として、またはＸＺ最大投射画像として示し、ここで、投射軸に沿って最高強度の画素のみを示すことによって、データの３Ｄ図を算出し表示した。切片を横切って免疫蛍光強度を定量するために、目的の矩形流域（ＲＯＩ）を、脳切片の横幅（２２０μｍ）および深度（約２０μｍ）全体を横切ってＸＺ最大投射画像中に描いた。水平平均画素強度を測定し、ＩｍａｇｅＪ（public domain software, http://rsb.info.nih.gov/ij/）を使用して深度に対してプロットした。

ＮｅｕＮ免疫反応性の細胞内局在のデータ分析：ＮｅｕＮ免疫反応性の細胞内局在の定量的分析は以前に記載した方法を改変して実施した（Matsubayashi Y et al., J Biol Chem, 2001; 276: 41755-60）。各組織切片の中央のＮｅｕＮ免疫反応性の細胞内局在を視覚的に検査し、以下の２つのカテゴリーに分類した：「Ｎ≧Ｃ」、ＮｅｕＮの核免疫反応性が細胞質免疫反応性より強いかそれに等しい；「Ｎ＜Ｃ」、細胞質免疫反応性が核免疫反応性より強い。各カテゴリーに分類された細胞の数を計数し、さらなる統計分析に使用した。統計的有意性を評価するために、各カテゴリーに分類された細胞の絶対数を２×２分割表に挙げ（例えば、ＤＭＳＯ処理サンプル対ジギトニン処理サンプルおよび「Ｎ≧Ｃ」対「Ｎ＜Ｃ」）、Ｓｔａｔｃｅｌ２ソフトウエア（オーエムエス出版）を使用してマンテル−ヘンツェル手順によって分析した。

実施例１：脳切片におけるＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性に対するジギトニンおよび他の透過試薬の効果
最初に、種々の透過試薬のマウス脳切片におけるＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性に対する効果を比較した。ＧａｌＣおよびＳＵＬの両方ならびに他の構造的に関連する微量脂質を認識する（Bansal R et al., J Neurosci Res, 1989; 24: 548-57）モノクローナル抗体Ｒ−ｍＡｂ（Ranscht B et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1982; 79:2709-13）を使用した。以下、この抗体を「抗Ｇａｌ／ＳＵＬ抗体」という。Ｐ８マウスの固定した脳を摘出し、冠状断切片をビブラトームを使用して作製した。次いで、コントロールの３％ＢＳＡ／ＰＢＳ、０．４％ＤＭＳＯ、１２０μｇ／ｍｌジギトニン、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはメタノールを使用して、切片を抗ＧａｌＣ／ＳＵＬおよびＣＣ１抗体で二重染色した。ＣＣ１抗体は、ＯＬ細胞体において顕著に発現しているタンパク質であるＡＰＣを認識する（Bhat RV et al., Glia, 1996; 17: 169-74）。ＣＣ１の免疫反応性は種々の透過試薬によってさほど阻害されないことが見出されたので、ＯＬ細胞体の位置を可視化するためにＣＣ１抗体を使用した。切片をＢＳＡ／ＰＢＳのみを使用して染色した場合、ＧａｌＣ／ＳＵＬおよびＣＣ１免疫反応性は切片の表面においてのみ検出された。ＧａｌＣ／ＳＵＬおよびＣＣ１陽性ＯＬ細胞体の周囲にはしばしばＧａｌＣ／ＳＵＬ陽性の点が存在した。これらの点は切片の表面に出たＯＬ突起を示すと思われる。ジギトニン用の溶媒であるＤＭＳＯで切片を処理しても、実質的に同様な結果が得られた。対照的に、１２０μｇ／ｍｌのジギトニンで処理した切片では、ＧａｌＣ／ＳＵＬ陽性突起が、ＢＳＡ／ＰＢＳやＤＭＳＯ処理したものより明確かつ連続的に染色された。この結果は、ジギトニン処理が抗体の切片中への浸透を増強し、同時にＧａｌＣ／ＳＵＬの分布を阻害しないことを示唆する。切片をＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理した場合、ＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性は破壊され、多数の小疱様の標識がＣＣ１陽性ＯＬ細胞体の周囲に見られた。また、ＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性はメタノール処理の後にはほぼ完全に消失した。これらの結果は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および有機溶媒がＧａｌＣ／ＳＵＬおよび他の脂質分子の免疫染色に適合しないという以前の報告と一致する（非特許文献２；Schwarz A et al., Methods Enzymol, 2000; 312: 179-87）。それゆえ、ジギトニンを以下に実験において使用することとした。

実施例２：ジギトニン処理切片におけるＧａｌＣ／ＳＵＬ陽性構造の解析
ジギトニンを使用する本発明の免疫染色方法によってＧａｌＣ／ＳＵＬおよび他のＯＬマーカーの高い空間分解能での共局在の検討が可能になったので、次に大脳皮質におけるＧａｌＣ／ＳＵＬ陽性構造を特徴を解析した。ジギトニン（６０μｇ／ｍｌ）処理切片において、２つの形態的に異なるＯＬが抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体によって標識された。第１のＯＬは、細胞体から放射状に伸張する複雑なロゼット様突起を有していた。二重染色によって、これらのＯＬの大部分がＣＣ１陽性およびＯ４陽性であることが示された。第２のＯＬは少数の短い単純突起を時折有していた。二重染色によって、これらの細胞はＣＣ１陰性およびＯ４陽性であることが示された。その単純な形態のために、後者は前者よりも未熟であると考えられる。これらの構造に加えて、その大部分が白質から皮質へ伸張している比較的直線的な繊維状構造が抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体で標識された。二重免疫染色によって、このＧａｌＣ／ＳＵＬ陽性繊維状構造はＭＢＰについても陽性であることが示された。このことは、これらの繊維状構造がミエリン鞘であることを示唆する。これらの結果は、ＯＬが、ジギトニン処理切片において、抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体で明確に標識されることを示唆する。

ジギトニン処理が大脳皮質に存在する抗原の性質を変化させ、その結果、抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体がジギトニン処理後にＯＬ以外の細胞に存在する予想外の抗原を認識してしまう可能性を排除するために、ＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性がＯＬの非存在下で消失するかどうかをＯｌｉｇ１欠損マウスを使用して検討した。Ｏｌｉｇ１は、ＯＬ分化に必須の塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子であり（Lu QR et al., Cell, 2002; 109: 75-86；Zhou Q et al., Cell, 2002; 109: 61-73）、ＯＬはＯｌｉｇ１欠損マウスにおいて顕著に減少している（Xin M et al., J Neurosci, 2005; 25: 1354-65）。Ｏｌｉｇ１欠損マウス由来の脳切片をジギトニン（１２０μｇ／ｍｌ）を使用して抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体で染色した場合、ＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性は顕著に低下した。総合すると、上記の結果はＧａｌＣ／ＳＵＬがジギトニン処理を使用して抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体で信頼性を有して検出できることを強く示唆する。

実施例３：ＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性に対するジギトニンの濃度依存性効果
ジギトニンの至適濃度を見出すために、ＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性に対する種々の濃度（６０〜５００μｇ／ｍｌ）のジギトニンの効果を検討した。Ｐ９マウス脳切片を種々の濃度のジギトニンを使用して抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体で染色した。６０μｇ／ｍｌのジギトニンで処理した切片において、ＯＬ突起およびミエリンは、コントロールの３％ＢＳＡ／ＰＢＳまたは１％ＤＭＳＯ処理した切片よりも明確かつ連続的に標識された。ＯＬおよびミエリンはより高濃度（１２０〜５００μｇ／ｍｌ）のジギトニンで処理した切片においても明確に検出されたが、おそらくＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性の何らかの分解に起因して、ＧａｌＣ／ＳＵＬ標識の小疱様構造がジギトニン濃度依存的に出現した。Ｏ４^＋ＣＣ１⁻細胞におけるＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性はジギトニン濃度依存的に消失し、切片を２５０μｇ／ｍｌ以上の濃度のジギトニンで処理した場合は検出できなかった。これらの結果は、ジギトニンの至適濃度は約６０〜１２０μｇ／ｍｌであることを示唆する。Ｏ４^＋ＣＣ１^＋ＯＬおよびＭＢＰ^＋ミエリン上のＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性は高濃度（２５０〜５００μｇ／ｍｌ）のジギトニンの存在下でも比較的安定であった。ジギトニンに対する感受性におけるＯ４^＋ＣＣ１⁻細胞との差異の原因は、これらの細胞上のＲ−ｍＡｂ抗原が異なり、それらのジギトニンに対する感受性が異なることなどが予想されるが、現時点では不明である。いずれにしても、組織によって透過効率は異なるので、実用上は、可視化しようとする細胞型および構造に応じて適切なジギトニン濃度を決定することが好ましい。

次に、抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体が、ジギトニン処理した大脳皮質の切片中にどの程度深く浸透しているかを検討した。Ｐ９マウス脳切片を、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ、１％ＤＭＳＯまたは６０〜５００μｇ／ｍｌジギトニンを使用して抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体で染色し、次いで大脳皮質第ＶＩ層におけるＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性を共焦点顕微鏡観察を使用することによって検討した。コントロールのＢＳＡ／ＰＢＳおよびＤＭＳＯ処理組織において、切片の中央の免疫反応性はかすかであった。これと一致して、免疫蛍光強度を測定し、切片の深度に対してプロットすると、強度プロフィールは切片の中央に深い谷を示した。対照的に、ジギトニン処理サンプルでは、切片の中央の免疫反応性は、ジギトニン濃度依存的に顕著に増強された。従って、強度−深度プロットの谷はジギトニン処理切片においては顕著に浅かった。これらの結果は、ジギトニン処理が有意に抗体の大脳皮質組織切片中への浸透を増強することを実証する。ジギトニンが小脳切片中への抗体浸透も増強するという本発明者らの以前の報告と合わせると（非特許文献５）、これらの結果はジギトニン処理を種々の脳領域に適用することができることを意味している。

上記のように、ＧａｌＣ／ＳＵＬ標識の小疱様構造がジギトニン濃度依存的に出現した。このことは、ジギトニン処理がＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性の何らかの分解を引き起こす可能性があることを示唆する。６０μｇ／ｍｌのジギトニンで切片処理した場合には少数の小疱しか出現しなかったことは重要である。さらに、切片をより高濃度のジギトニンで処理した場合でさえ、共焦点顕微鏡観察は、これらの小疱が切片の表面に限定されており、ジギトニン処理が切片の中央のＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性を有意に改善したことを実証した。まとめると、これらの結果は、特に、切片を６０〜１２０μｇ／ｍｌのジギトニンで処理した場合に、ジギトニン処理が最小の分解を伴ってＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性を有意に増強することを実証する。実際、ＤＭＳＯではなく、１２０μｇ／ｍｌのジギトニンを使用して、切片の深度全体にわたるＯＬ突起の可視化に成功した。

実施例４：本発明の方法を用いた核膜の透過処理
ジギトニンの標的であるコレステロールは細胞の膜の中に不均一に分布している。最小量のコレステロールを含有し、従ってジギトニンに最も耐性である膜の１つは核膜である（Elias PM et al., J Cell Biol, 1978; 78: 577-96；Adam SA et al., J Cell Biol, 1990; 111: 807-16；van Meer G et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2008; 9: 112-24）。それゆえ、本発明の方法には、核内抗原の免疫染色に適用できないという制限がある可能性があった。そうであれば、抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体および核内抗原に対する他の抗体での二重染色は可能でなくなる。しかし、本発明者らは、核内抗原でさえもジギトニンを１０００μｇ／ｍｌの濃度で使用すれば首尾良く検出できることを以前に実証している（非特許文献５）。１０００μｇ／ｍｌのジギトニンはＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性を分解したので、ここでは、より低濃度のジギトニンが核膜の透過処理および核内抗原の検出に十分であるかどうかを検討した。皮質切片を、マウス脳の大部分のニューロンで発現されており、そして細胞核および細胞質中に存在するタンパク質であるＮｅｕＮに対する抗体で、種々の濃度（６０〜１００μｇ／ｍｌ）のジギトニンを使用して染色した（Mullen RJ et al., Development, 1992;116: 201-11；Lind D et al., J Neurosci Res, 2005; 79:295-302）。次いで、切片の中央のＮｅｕＮ免疫反応性を共焦点顕微鏡観察を使用して分析した。

コントロールの１％ＤＭＳＯ処理切片では、ＮｅｕＮ免疫反応性は切片の中央で弱かった。さらに、この弱いＮｅｕＮ免疫反応性は主に細胞質中に局在化しており、核内の頻度はより少なかった。核内のＮｅｕＮ免疫反応性が細胞質中のＮｅｕＮ免疫反応性と同等かそれ以上であるニューロンの割合（以下、この割合を「Ｎ≧Ｃ」値という）は約５５％であった。これらの細胞では、ビブラトーム切片作製の間に起こった核膜の偶発的な物理的破損に起因して核ＮｅｕＮが抗体によって標識された可能性が高い。実質的に同様な結果が、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ処理切片について得られた。

対照的に、ジギトニン処理切片では、「Ｎ≧Ｃ」値は、ジギトニン濃度に依存して有意に増加し、ジギトニン濃度を１２０μｇ／ｍｌ以上に増加させた場合に約９３％のプラトー値に達した。従って、１２０μｇ／ｍｌのジギトニンで処理した脳切片の中央では、核ＮｅｕＮ免疫反応性は、ほとんど全てのＮｅｕＮ陽性細胞において首尾良く検出された。まとめると、これらの結果は、細胞核の中の抗原でさえ、ジギトニンを１２０μｇ／ｍｌの濃度で使用することによって本発明の方法を用いて首尾良く検出できることを実証する。実際、このジギトニン濃度を使用して、抗ＧａｌＣ／ＳＵＬ抗体および抗ＮｅｕＮ抗体での二重染色もまた組織切片の深度全体にわたって可能であった。

上記で説明したように核膜はジギトニンに対して最も耐性な膜であると考えられているので、これらの結果から、実質的に全ての膜が１２０μｇ／ｍｌのジギトニンによって十分に透過処理できるということが推測できる。従って、１２０μｇ／ｍｌを上回るジギトニン濃度の増加は膜透過性に対してほとんど付加的な効果をもたらさず、ＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性の分解の危険性を増大させる可能性がある。

実施例５：Ｏ４免疫反応性に対するジギトニンの効果
本発明の方法がＧａｌＣ／ＳＵＬのみならず透過試薬に対して脆弱な他の抗原にも適用できるかどうかを検討するために、Ｏ４免疫反応性に対するジギトニンの効果を検討した。Ｏ４抗体は、ＳＵＬおよび未同定の分子であるＰＯＡを含むＯＬおよびＯＰＣによって発現される複数の抗原を認識する（Sommer I et al., Dev Biol, 1981; 83: 311-27；Bansal R et al., J Neurosci Res, 1989; 24: 548-57；Bansal R et al., J Neurochem, 1992; 58: 2221-9）。重要なことに、Ｏ４免疫反応性ははアセトン（Sommer I et al., Dev Biol, 1981; 83: 311-27）またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００（未発表データ）によって阻害される。ＢＳＡ／ＰＢＳ、ＤＭＳＯまたは６０〜２５０μｇ／ｍｌのジギトニンを使用して、Ｐ９マウス脳切片をＯ４抗体で染色した。Ｏ４免疫反応性はＢＳＡ／ＰＢＳ、ＤＭＳＯ処理切片の表面で明確に検出されたが、ジギトニン処理切片では６０μｇ／ｍｌの濃度でさえも非常に低下した。切片をより高濃度（１２０および２５０μｇ／ｍｌ）のジギトニンで処理した場合、免疫反応性はほぼ完全に消失した。それゆえ、Ｏ４免疫反応性はＧａｌＣ／ＳＵＬ免疫反応性よりもジギトニンに感受性である可能性がある。６０μｇ／ｍｌ未満の濃度のジギトニンがＯ４免疫染色に適合する可能性はあるが、この点は検討していない。なぜなら、切片の中央での核内ＮｅｕＮ免疫反応性の効率的な検出のためには６０μｇ／ｍｌ以上のジギトニンが必要であるからである。これらの結果は、ジギトニンに対する感受性は種々の脂質抗原の間で異なり、全ての種類の脂質分子が必ずしもジギトニンを使用して検査できるわけではないことを示唆する。

最近の研究では、ジギトニン処理が、内在性脂質抗原であるホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２）の細胞内局在をＨＬ−６０細胞において維持することが示されている（Sharma VP et al., J Leukoc Biol, 2008; 84: 440-7）。また、本発明者らは、ジギトニン処理が親油性ニューロントレーサーであるＤｉＩと適合することをことを示している（非特許文献５）。これらの知見および本明細書における糖脂質抗原ＧａｌＣ／ＳＵＬの検出から、免疫染色によって他の脂質または親油性トレーサーの局在を検討するためにジギトニン処理を使用することができる可能性が示唆され得る。しかし、本実施例においてＯ４について示したように、全ての脂質がジギトニンを使用して可視化できるわけではない。特定の脂質分子の局在の保存にジギトニン処理が有用であるかどうかを分子の構造に基づいて予測するための法則を見出すことは今後の課題となっている。

Claims

オリゴデンドロサイト系列細胞とコレステロール特異的界面活性剤とを接触させる工程、およびコレステロール特異的界面活性剤と接触させたオリゴデンドロサイト系列細胞とガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドに特異的な抗体とを接触させる工程を含む、オリゴデンドロサイト系列細胞におけるガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの可視化方法。
コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンである、請求項１に記載の方法。
コレステロール特異的界面活性剤を含む、オリゴデンドロサイト系列細胞へのガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドに特異的な抗体の浸透促進用組成物。
コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンである、請求項３に記載の組成物。
コレステロール特異的界面活性剤およびガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドに特異的な抗体を含む、オリゴデンドロサイト系列細胞におけるガラクトセレブロシドおよび／またはスルファチドの可視化用キット。
コレステロール特異的界面活性剤がジギトニンである、請求項５に記載のキット。