JP2010096751A - Method for evaluating stress of animal using anti-interleukin-18 antibody - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、例えば唾液等のサンプル中のインターロイキン-18(以下、「IL-18」という)を、抗IL-18抗体を用いて測定することにより、IL-18を指標として動物のストレスを評価する方法及びストレス抑制剤のスクリーニング方法に関する。 In the present invention, for example, interleukin-18 (hereinafter referred to as `` IL-18 '') in a sample such as saliva is measured using an anti-IL-18 antibody, whereby IL-18 is used as an index to measure animal stress. The present invention relates to a method for evaluating and a screening method for a stress inhibitor.
従来において、ストレスに対する生化学的マーカーとしては、例えば副腎皮質ホルモンであるコルチゾール、カテコールアミンであるアドレナリンやノルアドレナリンが知られる。また、近年において、非侵襲的なストレス評価のためのサンプルとして尿、唾液、涙及び汗等が注目されている。これらサンプルの中でもサンプル採取が容易であり、且つ研究の進展が著しい唾液をサンプルとしたストレスマーカーの検討が進展している。例えば、アミラーゼ、クロモグラニンA及びイムノグロブリンAが唾液中のストレスマーカーとしての重要性が報告されている。 Conventionally, as biochemical markers for stress, for example, cortisol, which is a corticosteroid, and adrenaline and noradrenaline, which are catecholamines, are known. In recent years, urine, saliva, tears, sweat and the like have attracted attention as samples for non-invasive stress evaluation. Among these samples, examination of stress markers using saliva as a sample, which is easy to collect and whose research has been progressing, is progressing. For example, the importance of amylase, chromogranin A and immunoglobulin A as stress markers in saliva has been reported.
また、ストレスと密接に関連する内分泌系や免疫系との関連から、TNF-α等の幾つかのサイトカインについて、ストレスマーカーとしての評価がなされている。例えば、マウスストレスモデルにおいて、IL-18はストレスマーカーとして有用であることが報告されている(非特許文献１)。 In addition, some cytokines such as TNF-α have been evaluated as stress markers due to the endocrine system and immune system closely related to stress. For example, IL-18 has been reported to be useful as a stress marker in a mouse stress model (Non-patent Document 1).
従来のストレス評価方法の多くは、採血による血液中のストレスマーカーの測定により行われてきた。しかしながら、採血はそれ自体がストレスを伴うことから、正確なストレス評価が困難となり、問題であった。また、唾液等を用いた非侵襲的なストレスマーカーの測定においては、ストレスマーカーによっては血液中に比べ含有濃度が低く、測定が不可能であり、問題であった。 Many conventional stress evaluation methods have been performed by measuring a stress marker in blood by blood sampling. However, since blood collection itself involves stress, accurate stress evaluation becomes difficult and has been a problem. Moreover, in the measurement of the noninvasive stress marker using saliva etc., the content concentration was low compared with the blood depending on the stress marker, and measurement was impossible, and it was a problem.
また、ヒトにおいては多くのストレスマーカーの検討がなされているものの、家畜等の動物においては唾液サンプル採取の困難さや高感度なアッセイ方法が確立されていない等の理由からこれまでほとんどストレスマーカーの検討は行われていなかった。 In addition, many stress markers have been studied in humans, but in animals such as livestock, most of the stress markers have been studied so far due to the difficulty of collecting saliva samples and the establishment of highly sensitive assay methods. Was not done.
上述のように、家畜等の動物においてはこれまで唾液等の非侵襲的なサンプルにおいてストレスマーカーの測定を試みた報告はほとんどない。 As described above, in animals such as livestock, there have been almost no reports of attempts to measure stress markers in noninvasive samples such as saliva.
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、簡便に行うことができる動物のストレス評価方法及びストレス抑制剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。 Then, in view of the above-mentioned situation, the present invention aims to provide an animal stress evaluation method and a stress inhibitor screening method that can be easily performed.
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、抗IL-18抗体を用いてブタの唾液においてIL-18を測定した結果、IL-18がストレスマーカーであることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above problems, IL-18 was measured in pig saliva using anti-IL-18 antibody, and as a result, it was found that IL-18 was a stress marker, and the present invention was completed. It came to.
すなわち、本発明は、被験動物由来のサンプルにおいて、抗IL-18抗体を用いてIL-18を測定することを含む、動物のストレス評価方法である。当該評価方法では、非ストレス下の動物由来のサンプルにおけるIL-18量と比較してIL-18量が多いことにより、被験動物がストレスを有すると評価することができる。 That is, the present invention is an animal stress evaluation method comprising measuring IL-18 using anti-IL-18 antibody in a sample derived from a test animal. In this evaluation method, it can be evaluated that the test animal has stress because the amount of IL-18 is larger than the amount of IL-18 in a sample derived from an unstressed animal.
また、本発明に係るストレス評価方法における被験動物としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、ラマ、アルパカ、トナカイ、スイギュウ、ゾウ、ヤク、ミンク等の家畜動物及びイヌ、ネコ、フェレット、サルやモルモット、ハムスター、リス等のげっ歯類動物等の愛玩動物が挙げられる。 In addition, as test animals in the stress evaluation method according to the present invention, pigs, cows, horses, goats, sheep, donkeys, camels, llamas, alpaca, reindeer, buffalo, elephants, yaks, minks and other livestock animals and dogs, cats And pets such as rodents such as ferrets, monkeys, guinea pigs, hamsters and squirrels.
さらに、本発明に係るストレス評価方法におけるサンプルとしては、唾液、尿、涙及び汗等の非侵襲的サンプルが挙げられる。 Furthermore, examples of the sample in the stress evaluation method according to the present invention include noninvasive samples such as saliva, urine, tears, and sweat.
本発明に係るストレス評価方法における抗IL-18抗体としては、抗ブタIL-18モノクローナル抗体が挙げられる。抗ブタIL-18モノクローナル抗体として、例えばY. Muneta et al., J. Immunol. Methods, 236, 99-104, 2000及びY. Muneta et al., J. Interferon Cytokine Res., 20, 331-336, 2000に記載のものが挙げられる。特に、ブタIL-18に反応し、ヒトIL-18との交差反応性を示さないモノクローナル抗体が挙げられ、このようなモノクローナル抗体としては、例えば受託番号FERM P-17527、FERM P-17528及びFERM P-17529で特定されるハイブリドーマにより産生されるものが挙げられる。また、特にブタ、ウシ、ウマ及びヤギ等が被験動物である場合には、抗IL-18モノクローナル抗体として受託番号FERM P-17530、FERM P-17531及びFERM P-21672で特定されるハイブリドーマにより産生されるものも使用できる。 Examples of the anti-IL-18 antibody in the stress evaluation method according to the present invention include an anti-porcine IL-18 monoclonal antibody. Anti-porcine IL-18 monoclonal antibodies include, for example, Y. Muneta et al., J. Immunol. Methods, 236, 99-104, 2000 and Y. Muneta et al., J. Interferon Cytokine Res., 20, 331-336. , 2000. In particular, monoclonal antibodies that react with porcine IL-18 and do not exhibit cross-reactivity with human IL-18 can be mentioned. Examples of such monoclonal antibodies include accession numbers FERM P-17527, FERM P-17528, and FERM. Examples include those produced by the hybridoma specified by P-17529. In particular, when pigs, cows, horses, goats and the like are test animals, they are produced as anti-IL-18 monoclonal antibodies by hybridomas specified by the accession numbers FERM P-17530, FERM P-17531 and FERM P-21672. Can be used.
さらに、本発明は、抗IL-18抗体を含む動物ストレス評価用キットである。本発明に係るキットの対象動物並びに含まれる抗IL-18抗体としては、上述のものが挙げられる。 Furthermore, the present invention is an animal stress evaluation kit containing an anti-IL-18 antibody. Examples of the target animal of the kit according to the present invention and the anti-IL-18 antibody contained therein include those described above.
また、本発明は、ストレス下の非ヒト被験動物に候補物質を投与する工程又は非ヒト被験動物に候補物質を投与した後、該非ヒト被験動物をストレスに供する工程と、該候補物質を投与した非ヒト被験動物由来のサンプルにおいて、抗IL-18抗体を用いてIL-18を測定する工程とを含む、ストレス抑制剤のスクリーニング方法である。当該スクリーニング方法では、候補物質を投与していない、ストレス下の非ヒト被験動物由来のサンプルにおけるIL-18量と比較してIL-18量が少ないことにより、候補物質がストレス抑制剤であると判定することができる。本発明に係るスクリーニング方法における非ヒト被験動物並びに使用するサンプル及び抗IL-18抗体は、上述の本発明に係るストレス評価方法に準じたものである。 The present invention also includes a step of administering a candidate substance to a non-human test animal under stress or a step of administering the candidate substance to a non-human test animal and then subjecting the non-human test animal to stress, and administering the candidate substance A method for screening a stress suppressant, comprising a step of measuring IL-18 using an anti-IL-18 antibody in a sample derived from a non-human test animal. In the screening method, the candidate substance is a stress inhibitor because the amount of IL-18 is small compared to the amount of IL-18 in a sample derived from a non-human test subject under stress without administration of the candidate substance. Can be determined. The non-human test animal, the sample to be used, and the anti-IL-18 antibody in the screening method according to the present invention conform to the above-described stress evaluation method according to the present invention.
本発明によれば、高感度に動物のストレスを評価することができる。さらに、本発明によれば、非侵襲的サンプルを用いてもストレスを評価することができることから、簡便にストレス評価を行うことができる。また、ヒト、家畜動物、愛玩動物等の動物に対して有効なストレス抑制剤を取得することができる。 According to the present invention, animal stress can be evaluated with high sensitivity. Furthermore, according to the present invention, since stress can be evaluated using a noninvasive sample, stress evaluation can be easily performed. In addition, an effective stress suppressant can be obtained for animals such as humans, livestock animals, pets, and the like.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るストレス評価方法は、被験動物由来のサンプルにおいて、抗IL-18抗体を用いてIL-18を測定し、IL-18を指標(すなわち、ストレスマーカー)として動物のストレスを評価する方法である。評価は、非ストレス下の動物由来のサンプルにおけるIL-18量と比較してIL-18量が多いことにより、被験動物がストレスを有すると判定することにより行われる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The stress evaluation method according to the present invention is a method for measuring IL-18 using an anti-IL-18 antibody in a sample derived from a test animal, and evaluating the stress of the animal using IL-18 as an index (ie, stress marker) It is. The evaluation is performed by determining that the test animal has stress because the IL-18 amount is higher than the IL-18 amount in the sample derived from the non-stressed animal.
ここで、ストレスとしては、例えば感染ストレス、拘束ストレス、輸送(移動)ストレス、離乳ストレス、暑熱ストレス、寒冷ストレス、採血・ワクチン接種（注射）ストレス、密飼ストレス、絶食ストレス等が挙げられる。 Here, examples of stress include infection stress, restraint stress, transport (movement) stress, weaning stress, heat stress, cold stress, blood sampling / vaccination (injection) stress, poaching stress, fasting stress, and the like.
また、被験動物としては、哺乳動物が挙げられ、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、ラマ、アルパカ、トナカイ、スイギュウ、ゾウ、ヤク、ミンク等の家畜動物及びイヌ、ネコ、フェレット、サルやモルモット、ハムスター、リス等のげっ歯類動物等の愛玩動物が挙げられる。好ましくはブタ、ウシ、ウマ、ヤギであり、特に好ましくはブタである。 Examples of test animals include mammals, such as domestic animals such as pigs, cows, horses, goats, sheep, donkeys, camels, llamas, alpaca, reindeer, buffalo, elephants, yaks, minks, and dogs, cats, etc. And pets such as rodents such as ferrets, monkeys, guinea pigs, hamsters and squirrels. Preferred are pigs, cows, horses and goats, and particularly preferred are pigs.
IL-18は、主に活性化マクロファージから産生され、T細胞やNK細胞からのインターフェロン-ガンマ（以下、「IFN-γ」という）の産生を誘導するサイトカインである(H.Okamura et al., Nature, 378, 88-91, 1995)。
IL-18は、例えばマウス(H. Okamura et al., Nature, 378, 88-91, 1995)、ヒト(S. Ushio et al., J. Immunol., 156, 4274-4279, 1996）、ラット（B. Conti et al., J. Biol. Chem., 272, 2035-2037, 1997)及びイヌ(F. Okano et al., J. interferon cytokine Res., 19, 27-32, 1999)について、それらのIL-18をコードする遺伝子の塩基配列が報告されている。
IL-18 is a cytokine that is mainly produced from activated macrophages and induces the production of interferon-gamma (hereinafter referred to as “IFN-γ”) from T cells and NK cells (H. Okamura et al., Nature, 378, 88-91, 1995).
IL-18 is, for example, mouse (H. Okamura et al., Nature, 378, 88-91, 1995), human (S. Ushio et al., J. Immunol., 156, 4274-4279, 1996), rat (B. Conti et al., J. Biol. Chem., 272, 2035-2037, 1997) and dogs (F. Okano et al., J. interferon cytokine Res., 19, 27-32, 1999) The nucleotide sequences of the genes encoding IL-18 have been reported.
また、本発明者により、ブタにおけるIL-18をコードする遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列が明らかにされた（Muneta Y. et al., Cytokine , 12, 566-572, 2000, Genbank公開データAB01003）。なお、ブタIL-18は、生体内で活性のない前駆体が変換酵素(IL-beta converting enzyme又はcaspase-1と呼ばれる)の作用により切断(ブタIL-18のアミノ酸配列の35-36のAsp-Tyr間でcaspase-1により切断）されて初めて活性を持つという特徴を有し、他のサイトカインが保有するシグナルペプチドを有していない。 Further, the present inventors have revealed the nucleotide sequence and amino acid sequence of a gene encoding IL-18 in pigs (Muneta Y. et al., Cytokine, 12, 566-572, 2000, Genbank publication data AB01003). . Porcine IL-18 is cleaved by an inactive precursor (referred to as IL-beta converting enzyme or caspase-1) from the in vivo precursor (35-36 Asp of porcine IL-18 amino acid sequence). It is characterized by having activity only after being cleaved by caspase-1 between -Tyr) and does not have a signal peptide possessed by other cytokines.
さらに、ウシ、ウマ及びヤギのそれぞれについても、IL-18をコードする遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列が報告されている(ウシ（Shoda, L.K., et al., J. Interferon Cytokine Res., 19, 1169-1177, 1999）、ウマ（Nicolson, L., et al., Immunogenetics, 50, 94-97, 1999）、ヤギ（Hosamani, M., et al., Eur. J. Immunogenetics, 32, 293-297, 2005))。 Furthermore, the base sequence and amino acid sequence of the gene encoding IL-18 have been reported for each of cattle, horses and goats (bovine (Shoda, LK, et al., J. Interferon Cytokine Res., 19, 1169-1177, 1999), horse (Nicolson, L., et al., Immunogenetics, 50, 94-97, 1999), goat (Hosamani, M., et al., Eur. J. Immunogenetics, 32, 293- 297, 2005)).
本発明に係るストレス評価方法においては、先ず抗IL-18抗体及びサンプルを準備する。
抗IL-18抗体は、サンプルが由来する動物のIL-18に対して特異的に反応する抗体である。抗IL-18抗体は、上述の各動物のIL-18をコードする塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて作製した組換えIL-18又はその断片を免疫原として動物に免疫し、単離・精製することで作製することができる。このように作製した抗IL-18抗体は、ポリクローナル抗体である。また、免疫した動物から得られる抗血清を抗IL-18抗体として使用してもよい。免疫する動物としては、例えば、ウマ、サル、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ハト、ニワトリ等が挙げられる。
In the stress evaluation method according to the present invention, first, an anti-IL-18 antibody and a sample are prepared.
An anti-IL-18 antibody is an antibody that specifically reacts with IL-18 of the animal from which the sample is derived. The anti-IL-18 antibody immunizes an animal with recombinant IL-18 or a fragment thereof prepared based on the above-mentioned nucleotide sequence or amino acid sequence encoding IL-18 of each animal as an immunogen, and isolates and purifies it. Can be produced. The anti-IL-18 antibody prepared in this way is a polyclonal antibody. Moreover, you may use the antiserum obtained from the immunized animal as an anti- IL-18 antibody. Examples of animals to be immunized include horses, monkeys, dogs, pigs, goats, sheep, rabbits, guinea pigs, hamsters, rats, mice, pigeons, chickens and the like.
一方、免疫した動物から得られる抗体産生細胞(リンパ節細胞、脾臓細胞等)とミエローマ細胞とを細胞融合させ、適宜選択を行うことで、ハイブリドーマを作製する。このように作製されたハイブリドーマは、抗IL-18モノクローナル抗体を産生することとなる。 On the other hand, a hybridoma is produced by cell fusion of antibody-producing cells (lymph node cells, spleen cells, etc.) obtained from the immunized animal with myeloma cells and selecting appropriately. The hybridoma thus produced will produce an anti-IL-18 monoclonal antibody.
本発明においては、抗IL-18抗体として、抗ブタIL-18モノクローナル抗体が挙げられる（Y. Muneta et al., J. Immunol. Methods, 236, 99-104, 2000及びY. Muneta et al., J. Interferon Cytokine Res., 20, 331-336, 2000）。特に、ブタIL-18に反応し、ヒトIL-18との交差反応性を示さないモノクローナル抗体が挙げられる。当該モノクローナル抗体としては、例えば、特許第3230220号に記載の受託番号FERM P-17527、FERM P-17528、FERM P-17529で特定されるハイブリドーマにより産生されるものが挙げられる。また、特にブタ、ウシ、ウマ及びヤギ等が被験動物である場合には、抗IL-18モノクローナル抗体として、受託番号FERM P-17530、FERM P-17531及びFERM P-21672で特定されるハイブリドーマにより産生されるものも使用できる。受託番号FERM P-17527、FERM P-17528、FERM P-17529、FERM P-17530及びFERM P-17531で特定されるこれらハイブリドーマは、工業技術院生命工学工業技術研究所(現 独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター)に寄託されている(寄託日：平成11年8月25日)。また、受託番号FERM P-21672で特定されるハイブリドーマは、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成20年(2008年)9月11日付けで寄託されている。なお、これらハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体は、ブタIL-18を抗原として用いて作製されたものであるが、ブタに限らず、ウシ、ウマ及びヤギ等に由来するIL-18にも交差反応性を示すものもある。 In the present invention, the anti-IL-18 antibody includes anti-porcine IL-18 monoclonal antibody (Y. Muneta et al., J. Immunol. Methods, 236, 99-104, 2000 and Y. Muneta et al. , J. Interferon Cytokine Res., 20, 331-336, 2000). In particular, monoclonal antibodies that react with porcine IL-18 and do not show cross-reactivity with human IL-18 can be mentioned. Examples of the monoclonal antibody include those produced by hybridomas identified by the accession numbers FERM P-17527, FERM P-17528, and FERM P-17529 described in Japanese Patent No. 3230220. In particular, when pigs, cows, horses, goats, and the like are test animals, anti-IL-18 monoclonal antibodies are identified by the hybridomas identified by the accession numbers FERM P-17530, FERM P-17531, and FERM P-21672. Those produced can also be used. These hybridomas identified by accession numbers FERM P-17527, FERM P-17528, FERM P-17529, FERM P-17530, and FERM P-17531 are designated by the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (now (Deposit date: August 25, 1999). The hybridoma identified by the deposit number FERM P-21672 has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center on September 11, 2008. The monoclonal antibodies produced from these hybridomas were prepared using porcine IL-18 as an antigen, but are not limited to pigs, but also cross-react with IL-18 derived from cattle, horses, goats, etc. Some also show sex.
抗IL-18抗体として、例えば、Serotec社、BenderMedsystem社等から市販されているものを使用してもよい。
また、抗IL-18抗体の免疫グロブリン(Ig)クラスは、IgM、IgD、IgG、IgA、IgE等のいずれのクラスのものであってもよい。さらに、抗IL-18抗体は、一本鎖抗体、抗体フラグメント(FabフラグメントやF(ab')2フラグメント)等であってもよい。
As the anti-IL-18 antibody, for example, those commercially available from Serotec, BenderMedsystem, etc. may be used.
Further, the immunoglobulin (Ig) class of the anti-IL-18 antibody may be any class such as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE. Further, the anti-IL-18 antibody may be a single chain antibody, an antibody fragment (Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment), and the like.
抗IL-18抗体は、検出方法に準じて適宜標識することができる。標識としては、例えば、酵素、蛍光色素、ビオチン等を使用することができる。酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が挙げられる。蛍光色素としては、例えばフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等が挙げられる。例えば、標識として酵素を使用する場合には、酵素の基質を加え、反応産物による発色や反応前後の吸光度の変化に基づいて抗原抗体複合体を検出することができる。また、標識として蛍光色素を使用する場合には、蛍光顕微鏡等により蛍光を観察することによって抗原抗体複合体を検出することができる。また、標識としてビオチンを使用する場合には、酵素標識アビジンを加え、次いで酵素の基質を加えて、反応産物による発色や反応前後の吸光度の変化に基づいて抗原抗体複合体を検出することができる。 The anti-IL-18 antibody can be appropriately labeled according to the detection method. As the label, for example, an enzyme, a fluorescent dye, biotin and the like can be used. Examples of the enzyme include horseradish peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase and the like. Examples of the fluorescent dye include fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). For example, when an enzyme is used as a label, the antigen-antibody complex can be detected based on the color of the reaction product and the change in absorbance before and after the reaction by adding the enzyme substrate. When a fluorescent dye is used as a label, the antigen-antibody complex can be detected by observing fluorescence with a fluorescence microscope or the like. In addition, when biotin is used as a label, an enzyme-labeled avidin is added, and then an enzyme substrate is added to detect the antigen-antibody complex based on the color development by the reaction product and the change in absorbance before and after the reaction. .
一方、本発明に係るストレス評価方法におけるサンプルとしては、例えば、組織、臓器、血液(血清)、リンパ液、胃液、唾液、尿、涙、汗、鼻水等の生物学的サンプルが挙げられる。特に、唾液、尿、涙、汗等の非侵襲的サンプルによれば、動物にストレスを与えることなく、サンプルを容易に採取できるので好ましい。 On the other hand, examples of the sample in the stress evaluation method according to the present invention include biological samples such as tissues, organs, blood (serum), lymph, gastric juice, saliva, urine, tears, sweat, and runny nose. In particular, non-invasive samples such as saliva, urine, tears, sweat, etc. are preferable because samples can be easily collected without applying stress to animals.
本発明に係るストレス評価方法では、次いで、抗IL-18抗体を用いて、サンプル中のIL-18を検出する。抗IL-18抗体量やサンプルの希釈率等は、適宜決定することができる。サンプル中に含まれるIL-18の検出は、例えば、ウェスタンブロッティング及び免疫染色の組合せ、エンザイムイムノアッセイ、免疫組織化学染色、フローサイトメトリー等によって行うことができる。 In the stress evaluation method according to the present invention, IL-18 in the sample is then detected using an anti-IL-18 antibody. The amount of anti-IL-18 antibody, the dilution rate of the sample, and the like can be appropriately determined. Detection of IL-18 contained in the sample can be performed by, for example, a combination of Western blotting and immunostaining, enzyme immunoassay, immunohistochemical staining, flow cytometry, and the like.
ウェスタンブロッティング及び免疫染色の組合せは、例えば、次のようにして行うことができる。サンプル又はサンプルから精製したタンパク質を例えばSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により分離した後、電気的にPVDF膜等に転写する。洗浄及びブロッキング後、標識した抗IL-18抗体を反応させる(例えば、37℃で1時間）。次いで、免疫反応により生じた抗原抗体複合体を、標識を指標として検出する。これにより、サンプル中のIL-18を検出することができる。あるいは、標識した二次抗体を用いて、IL-18と抗IL-18抗体との抗原抗体複合体を検出することができる。次いで、検出されたバンド密度を計算することにより、IL-18量を定量することができる。当該バンド密度によれば、非ストレス下の動物由来のサンプルにおけるIL-18バンド密度と比較してIL-18バンド密度が大きいことにより、被験動物がストレスを有すると判定できる。 The combination of Western blotting and immunostaining can be performed as follows, for example. A sample or a protein purified from the sample is separated by, for example, SDS-polyacrylamide electrophoresis and then electrically transferred to a PVDF membrane or the like. After washing and blocking, the labeled anti-IL-18 antibody is reacted (for example, at 37 ° C. for 1 hour). Subsequently, the antigen-antibody complex produced by the immune reaction is detected using the label as an index. Thereby, IL-18 in the sample can be detected. Alternatively, an antigen-antibody complex of IL-18 and anti-IL-18 antibody can be detected using a labeled secondary antibody. The amount of IL-18 can then be quantified by calculating the detected band density. According to the band density, it can be determined that the test animal has stress because the IL-18 band density is higher than the IL-18 band density in a sample derived from an unstressed animal.
エンザイムイムノアッセイは、例えば、次のようにして行うことができる。抗IL-18抗体を至適濃度に希釈して固相(例えば、市販のELISA用プレート)に固定化した後、洗浄及びブロッキングする。次いで、固相にサンプルを加えて反応させ、サンプル中のIL-18と抗IL-18抗体とを反応させる（例えば、37℃で1時間）。次いで、免疫反応によって生じた抗原抗体複合体に、標識した抗IL-18抗体(固相に固定化したものとは別の抗IL-18抗体が好ましい)を反応させ、標識を指標として抗原抗体複合体を検出する。これにより、サンプル中のIL-18を定量的に検出することができる。あるいは、標識した二次抗体を用いて、IL-18と抗IL-18抗体との抗原抗体複合体を検出することができる。なお、本発明者は、ブタIL-18のELISAによる測定法自体を既に確立している(Muneta Y. et al., J. Interferon and Cytokine Res., 20, 331-336, 2000)。当該エンザイムイムノアッセイによれば、標識を指標としてIL-18量を算出し、非ストレス下の動物由来のサンプルにおけるIL-18量と比較してIL-18量が多いことにより、被験動物がストレスを有すると判定できる。 The enzyme immunoassay can be performed, for example, as follows. Anti-IL-18 antibody is diluted to an optimal concentration and immobilized on a solid phase (for example, a commercially available ELISA plate), followed by washing and blocking. Next, the sample is added to the solid phase for reaction, and IL-18 and anti-IL-18 antibody in the sample are reacted (for example, at 37 ° C. for 1 hour). Next, the antigen-antibody complex produced by the immune reaction is reacted with a labeled anti-IL-18 antibody (preferably an anti-IL-18 antibody different from that immobilized on the solid phase), and the antigen antibody is used as a label. Detect complex. Thereby, IL-18 in a sample can be detected quantitatively. Alternatively, an antigen-antibody complex of IL-18 and anti-IL-18 antibody can be detected using a labeled secondary antibody. The present inventor has already established a method for measuring porcine IL-18 by ELISA (Muneta Y. et al., J. Interferon and Cytokine Res., 20, 331-336, 2000). According to the enzyme immunoassay, the amount of IL-18 was calculated using the label as an index, and the test animal was stressed because the amount of IL-18 was higher than the amount of IL-18 in the sample derived from an unstressed animal. It can be determined that it has.
免疫組織化学染色は、例えば、次のようにして行うことができる。サンプルとして被験動物から組織又は臓器を採取し、公知の方法(例えば、「病理組織標本の作り方（第6版）」、医学書院、慶応義塾大学医学部病理学教室編、p27-41（1986））によりパラフィン包埋組織切片を作製する。そして、該組織切片上に抗IL-18抗体を感作させた後、市販の免疫組織化学染色キット(例えば、ニチレイ社製シンプルステイン)を用いてIL-18を検出する。これにより、IL-18を組織切片(組織標本)上で検出することができる。当該組織切片上の検出によれば、非ストレス下の動物から作製された組織切片上で検出されたIL-18の面積と比較してIL-18の面積が大きいことにより、被験動物がストレスを有すると判定できる。 Immunohistochemical staining can be performed, for example, as follows. A tissue or organ is collected from a test animal as a sample, and a known method (for example, “How to make a pathological tissue specimen (6th edition)”, School of Medicine, Department of Pathology, Keio University School of Medicine, p27-41 (1986)) To prepare paraffin-embedded tissue sections. Then, after sensitizing an anti-IL-18 antibody on the tissue section, IL-18 is detected using a commercially available immunohistochemical staining kit (for example, Simple stain manufactured by Nichirei). Thereby, IL-18 can be detected on the tissue section (tissue specimen). According to the detection on the tissue section, the area of IL-18 is larger than the area of IL-18 detected on the tissue section prepared from the non-stressed animal, so that the test animal is stressed. It can be determined that it has.
フローサイトメトリーは、次のように行うことができる。蛍光色素標識した抗IL-18抗体とサンプルとを反応させ、サンプル中のIL-18と該抗IL-18抗体とを反応させる。次いで、免疫反応によって生じた抗原抗体複合体を、BD FACSCaliburTM等のフローサイトメーターに供し、蛍光色素を指標として抗原抗体複合体を検出する。これにより、サンプル中のIL-18を定量的に検出することができる。あるいは、蛍光色素標識した二次抗体を用いて、IL-18と抗IL-18抗体との抗原抗体複合体を検出することができる。当該フローサイトメトリーによれば、蛍光色素を指標として、非ストレス下の動物由来のサンプルにおけるIL-18量と比較してIL-18量が多いことにより、被験動物がストレスを有すると判定できる。 Flow cytometry can be performed as follows. A fluorescent dye-labeled anti-IL-18 antibody is reacted with the sample, and IL-18 in the sample is reacted with the anti-IL-18 antibody. Next, the antigen-antibody complex generated by the immune reaction is subjected to a flow cytometer such as BD FACSCalibur ™ , and the antigen-antibody complex is detected using a fluorescent dye as an index. Thereby, IL-18 in a sample can be detected quantitatively. Alternatively, an antigen-antibody complex of IL-18 and anti-IL-18 antibody can be detected using a fluorescent dye-labeled secondary antibody. According to the flow cytometry, it can be determined that the test animal has stress because the amount of IL-18 is larger than the amount of IL-18 in a sample derived from an unstressed animal using a fluorescent dye as an index.
本発明に係るキットは、上述の抗IL-18抗体を含む動物ストレス評価用キットである。本発明に係るキットには、抗IL-18抗体以外に、例えば洗浄や希釈用のバッファー、標識二次抗体、標識が酵素の場合の発色用基質、使用説明書等を含むことができる。 The kit according to the present invention is an animal stress evaluation kit containing the above-described anti-IL-18 antibody. In addition to the anti-IL-18 antibody, the kit according to the present invention can contain, for example, a washing and dilution buffer, a labeled secondary antibody, a coloring substrate when the label is an enzyme, instructions for use, and the like.
一方、本発明に係るスクリーング方法は、ストレス下の非ヒト被験動物に候補物質を投与する工程又は非ヒト被験動物に候補物質を投与した後、該非ヒト被験動物をストレスに供する工程と、該候補物質を投与した非ヒト被験動物由来のサンプルにおいて、抗IL-18抗体を用いてIL-18を測定する工程とを含み、IL-18を指標としてストレス抑制剤をスクリーニングする方法である。判定は、候補物質を投与していない、ストレス下の非ヒト被験動物由来のサンプルにおけるIL-18量と比較してIL-18量が少ないことにより、候補物質がストレス抑制剤であると判定することにより行われる。本発明に係るスクリーニング方法は、上述の本発明に係るストレス評価方法に準じてサンプル中のIL-18を測定することで、候補物質がストレス抑制剤であるか否かを判定することができる。 On the other hand, the screening method according to the present invention comprises a step of administering a candidate substance to a non-human test animal under stress or a step of administering the candidate substance to a non-human test animal and then subjecting the non-human test animal to stress, A method of screening a stress suppressant using IL-18 as an index, comprising a step of measuring IL-18 using an anti-IL-18 antibody in a sample derived from a non-human test animal administered with a candidate substance. Judgment is that the candidate substance is a stress inhibitor because the amount of IL-18 is small compared to the amount of IL-18 in a sample derived from a non-human test subject under stress without administration of the candidate substance Is done. The screening method according to the present invention can determine whether or not a candidate substance is a stress suppressor by measuring IL-18 in a sample according to the stress evaluation method according to the present invention described above.
ここで、ストレス抑制剤とは、ストレス負荷を抑制する物質を意味する。なお、ストレス下の非ヒト被験動物に候補物質を投与し、当該候補物質を投与していないストレス下の非ヒト被験動物由来のサンプル(陰性対照)におけるIL-18量と比較してIL-18量が少ないことにより、候補物質がストレス抑制剤であると判定した場合には、当該候補物質はストレス治療剤として使用することもできる。一方、非ヒト被験動物に候補物質を投与した後、該非ヒト被験動物をストレスに供し、当該候補物質を投与していないストレス下の非ヒト被験動物由来のサンプル(陰性対照)におけるIL-18量と比較してIL-18量が少ないことにより、候補物質がストレス抑制剤であると判定した場合には、当該候補物質はストレス予防剤として使用することもできる。 Here, the stress suppressor means a substance that suppresses stress load. It should be noted that IL-18 was administered to a non-human test animal under stress and compared to the IL-18 amount in a sample (negative control) derived from the non-human test animal under stress to which the candidate substance was not administered. When it is determined that the candidate substance is a stress suppressant due to the small amount, the candidate substance can also be used as a stress therapeutic agent. On the other hand, after administering a candidate substance to a non-human test animal, the non-human test animal is subjected to stress, and the amount of IL-18 in a sample derived from a non-human test animal under stress to which the candidate substance is not administered (negative control) When it is determined that the candidate substance is a stress suppressant due to a small amount of IL-18 as compared with the above, the candidate substance can also be used as a stress preventive agent.
候補物質としては、例えば核酸、ペプチド、タンパク質、合成化合物、微生物、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、植物抽出物、動物組織抽出物等が挙げられる。 Examples of candidate substances include nucleic acids, peptides, proteins, synthetic compounds, microorganisms, culture supernatants of microorganisms, natural components derived from plants and marine organisms, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
本発明に係るスクリーニング方法における候補物質の投与は、適宜経口又は非経口投与経路により行うことができる。あるいは、候補物質を混ぜた飼料を給餌することで、候補物質を非ヒト被験動物に投与することもできる。 Administration of the candidate substance in the screening method according to the present invention can be performed appropriately by the oral or parenteral administration route. Alternatively, the candidate substance can be administered to a non-human animal by feeding a feed mixed with the candidate substance.
本発明に係るスクリーニング方法により得られたストレス抑制剤は、当該方法に使用した非ヒト被験動物に限らず、他の動物(例えば、ヒトを含めた哺乳動物)に対しても効果を有し得る。 The stress suppressant obtained by the screening method according to the present invention is not limited to the non-human test animal used in the method, and may have an effect on other animals (for example, mammals including humans). .
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.
［実施例１］
ブタの唾液中のIL-18を測定することによる拘束ストレス評価
本実施例では、ブタを実験的拘束ストレス下に置いた後、当該ブタから採取した唾液におけるIL-18を測定することで、拘束ストレスを評価した。
[Example 1]
Restraint stress evaluation by measuring IL-18 in porcine saliva In this example, after placing a pig under experimental restraint stress, IL-18 in saliva collected from the pig was measured. Stress was evaluated.
IL-18の測定にはELISAを使用した。ビオチン標識した検出用抗ブタIL-18抗体として受託番号FERM P-17528で特定されるハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体5-C-5を使用し、プレート固定化用抗ブタIL-18抗体として受託番号FERM P-21672で特定されるハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体11-H-5を使用した(特許第3230220号)。 ELISA was used to measure IL-18. The monoclonal antibody 5-C-5 produced from the hybridoma identified by the accession number FERM P-17528 is used as an anti-porcine IL-18 antibody for detection labeled with biotin, and is entrusted as an anti-porcine IL-18 antibody for plate immobilization. The monoclonal antibody 11-H-5 produced from the hybridoma identified by the number FERM P-21672 was used (Japanese Patent No. 3230220).
実験には、6〜8週齢のランドレース種とヨークシャー種のF1去勢ブタを8頭使用し、4頭ずつ、4.8×3.7×2.4mの部屋で飼育した。飼育舎には南向きにガラス窓がついており、遮音、防塵のために常時閉じた状態とし、明かりは自然採光とした。8時と18時に育成用養豚飼料を使用基準に従い給餌し、飲水は常時供給とした。 In the experiment, 8 F1 castrated pigs of 6-8 weeks old Landrace and Yorkshire were used, and 4 of them were housed in a room of 4.8 × 3.7 × 2.4 m. The breeding house has a glass window facing south, and it is always closed for sound insulation and dust prevention, and the light is natural lighting. At 8 and 18 o'clock, the breeding pig feed was fed according to the usage standards, and drinking water was always supplied.
唾液は、4×5cmに切った脱脂綿に約50cmのタコ糸を結びつけたものを、ブタの顔の前に垂らし、ブタが脱脂綿を自発的に噛み付くことで採取した。ブタが2分間ほど脱脂綿を噛んだ後に、タコ糸を引っ張り、脱脂綿を回収し、直ちに10mlのプラスチックシリンジに脱脂綿を詰め込み、そのシリンジを50mlスピッツ管に入れ、氷上に置いた。その後、2500gで15分間遠心分離し、唾液サンプルを得た。得られた唾液サンプルは、測定時まで-30℃で保存した。全ての測定においては、測定直前に唾液サンプルを37℃の湯煎で解凍し、15000rpmで5分間遠心分離した後、上清のみを測定に使用した。 Saliva was collected by hanging an absorbent cotton cut into 4 x 5 cm with an octopus thread of about 50 cm in front of the pig's face, and the pig voluntarily biting the absorbent cotton. After the pigs chewed the absorbent cotton for about 2 minutes, the octopus thread was pulled, the absorbent cotton was collected, and the absorbent cotton was immediately packed into a 10 ml plastic syringe, and the syringe was placed in a 50 ml Spitz tube and placed on ice. Thereafter, the mixture was centrifuged at 2500 g for 15 minutes to obtain a saliva sample. The obtained saliva sample was stored at −30 ° C. until measurement. In all measurements, the saliva sample was thawed in a 37 ° C. water bath just before the measurement, centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, and then only the supernatant was used for the measurement.
ブタを実験部屋の角側に誘導し、側面と尻側から鉄製のケージを利用し、120×35×70cmの空間内に遮蔽し、拘束ストレスを与えた。この状態では、ブタの頭側と一側面がコンクリート壁に接し、反対側面と尻側は鉄製のケージで圧迫されているため、ブタは身動きをとることができない。実験開始時間は、9時とし、一回の拘束ストレスは2頭ずつとした。ブタを飼育部屋に接する同じ大きさの実験部屋に誘導し、まずブタの口腔を洗浄するために、唾液を採取した。この唾液は測定対象から除外した。次いで5分後、拘束直前に唾液を採取し、基準値とした。その後直ちに前述の方法で拘束を開始した。拘束時間は20分間とし、拘束開始10分後と20分後に唾液を採取した。また、拘束終了後直ちに、ブタを開放し、同室内を自由歩行させ、拘束終了10分後に唾液を採取し、ブタを飼育部屋に戻した。
以上のように、拘束開始直前・拘束開始10分後・拘束開始20分後・拘束終了10分後の計4回、唾液を採取し、IL-18を測定した。
The pig was guided to the corner of the laboratory, and shielded in a 120 x 35 x 70 cm space using an iron cage from the side and buttocks to give restraint stress. In this state, the pig's head and one side are in contact with the concrete wall, and the opposite side and the buttocks are pressed by an iron cage, so the pig cannot move. The experiment start time was 9 o'clock, and each restraint stress was 2 animals. The pigs were guided to an experimental room of the same size that touched the breeding room, and saliva was first collected to clean the pig's mouth. This saliva was excluded from the measurement target. After 5 minutes, saliva was collected immediately before restraint and used as a reference value. Immediately thereafter, restraint was started by the method described above. The restraint time was 20 minutes, and saliva was collected 10 minutes and 20 minutes after the start of restraint. Immediately after the restraint was completed, the pig was opened and allowed to walk freely within the room. Saliva was collected 10 minutes after the restraint was completed, and the pig was returned to the breeding room.
As described above, saliva was collected and measured for IL-18 four times in total, immediately before the start of restraint, 10 minutes after the start of restraint, 20 minutes after the start of restraint, and 10 minutes after the end of restraint.
一方、別の日に対照として拘束を施行せずに同様の時間間隔で唾液採取を行った。拘束を施行しないこと以外は全て同じである。 On the other hand, saliva was collected at the same time interval without restraint as another control. Everything is the same except that the restraint is not enforced.
採取した唾液について、ELISAによるブタIL-18の検出・定量を行った。モノクローナル抗体11-H-5を10μg/mlになるように0.05M炭酸バッファー（pH9.6）に溶解し、96穴Maxisorp plate（Nunc社製）の各ウェルに100μlずつ分注し、4℃で一晩静置した。 From the collected saliva, porcine IL-18 was detected and quantified by ELISA. Monoclonal antibody 11-H-5 is dissolved in 0.05 M carbonate buffer (pH 9.6) to 10 μg / ml, and 100 μl is dispensed into each well of a 96-well Maxisorp plate (Nunc) at 4 ° C. Let stand overnight.
一晩の静置後、プレートを0.05%Tween20を含むPBSで洗浄した後、ブロッキングバッファー（0.8%NaCl、0.01M Na2HPO4、0.02% KH2PO4・2H20、0.02% KCl、0.5% BSA、pH7.4）を各ウェルに100μlずつ分注して、室温で1時間静置し、ブロッキングを行った。
After standing overnight, the plate was washed with PBS containing 0.05
ブロッキング後、プレートを0.05%Tween20を含むPBSで洗浄した後、希釈バッファー（0.8%NaCl、0.01M Na2HPO4、0.02% KH2PO4・2H20、0.02% KCl、0.5% BSA、0.1% Tween 20、pH7.4）で2倍希釈した唾液サンプル100μlを各ウェルに分注して、室温で2時間静置した。
After blocking, the plate was washed with PBS containing 0.05
2時間の静置後、プレートを0.05%Tween20を含むPBSで洗浄した後、ビオチンで標識したモノクローナル抗体5-C-5を150ng/mlになるように上記希釈バッファーに溶解し、各ウェルに100μlずつ分注して、室温で1時間静置した。
After standing for 2 hours, the plate was washed with PBS containing 0.05
1時間の静置後、プレートを0.05%Tween20を含むPBSで洗浄した後、HRP-streptoavidin（Biosource社製）を上記希釈バッファーで2500倍に希釈し、各ウェルに100μlずつ分注して、室温で1時間静置した。 After standing for 1 hour, the plate was washed with PBS containing 0.05% Tween20, HRP-streptoavidin (Biosource) was diluted 2500 times with the above dilution buffer, and 100 μl was dispensed into each well at room temperature. Left for 1 hour.
1時間の静置後、プレートを0.05%Tween20を含むPBSで洗浄した後、ペルオキシダーゼの活性をTMB Peroxidase substrate（KPL社製）を基質として波長450nmにおける吸光度として測定した。
なお、対照として、非拘束下に置いたブタから採取した唾液についても同様の方法でIL-18を測定した。
After standing for 1 hour, the plate was washed with PBS containing 0.05
As a control, IL-18 was measured in the same manner for saliva collected from pigs placed in an unrestrained state.
結果を図１に示す。図１において、縦軸は拘束0分におけるIL-18量を100％とした場合のIL-18増加率(％)である。一方、横軸は拘束ストレス下に置いた時間(分)である。
図１に示すように、拘束ストレス20分で非拘束との間に有意差があり(p<0.05)、IL-18が拘束ストレス時のストレスマーカーとして利用可能であることが明らかになった。
The results are shown in FIG. In FIG. 1, the vertical axis represents the IL-18 increase rate (%) when the amount of IL-18 at 0 minutes of restraint is 100%. On the other hand, the horizontal axis represents the time (minutes) placed under restraint stress.
As shown in FIG. 1, there was a significant difference between unrestrained and restraint stress at 20 minutes (p <0.05), and it became clear that IL-18 can be used as a stress marker during restraint stress.
［比較例１］
ブタの唾液中のコルチゾールを測定することによる拘束ストレス評価
従来から利用されているストレスマーカーのコルチゾールを、ブタから採取した唾液において測定することで拘束ストレスを評価した。
[Comparative Example 1]
Restraint stress evaluation by measuring cortisol in porcine saliva Restraint stress was evaluated by measuring cortisol, a conventionally used stress marker, in saliva collected from pigs.
唾液中コルチゾール濃度を、ELISA法で測定した。まず抗マウスIgG（Vecter Laboratories Inc., USA）を0.1M炭酸ナトリウムバッファー（pH9.6）で10μg/mlに調整し、96穴イムノプレート（Nunc International, USA）に100μl/wellで加えた。その後、プレートを4℃で一晩振盪した。 Salivary cortisol concentration was measured by ELISA. First, anti-mouse IgG (Vecter Laboratories Inc., USA) was adjusted to 10 μg / ml with 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.6) and added to a 96-well immunoplate (Nunc International, USA) at 100 μl / well. The plates were then shaken overnight at 4 ° C.
翌日、アッセイバッファー（0.1％ゼラチン及び0.1％Tween20含有PBS）にてプレートを洗浄し、1：10000に希釈した抗コルチゾールマウスモノクローナル抗体（Chemicon International, USA）を100μl/wellで加え、4℃で一晩静置した。 On the next day, the plate was washed with assay buffer (PBS containing 0.1% gelatin and 0.1% Tween20), anti-cortisol mouse monoclonal antibody (Chemicon International, USA) diluted 1: 10000 was added at 100 μl / well, and the mixture was incubated at 4 ° C. I left still overnight.
翌日、上記アッセイバッファーにてプレートを洗浄した後、段階希釈（8〜1024pg/100μl）したスタンダード用のコルチゾール（Hydrocortisones, Sigma Chemical Co., USA）並びに希釈した実施例１と同様の唾液サンプルをそれぞれ100μl/wellでプレートに入れ、さらに0.005μg/mlに調整されたHRP標識コルチゾール(Sigma Chemical Co., USA)を100μl/wellで添加した。 The next day, after washing the plate with the above assay buffer, cortisol for standard (Hydrocortisones, Sigma Chemical Co., USA) serially diluted (8 to 1024 pg / 100 μl) and the same saliva sample as in Example 1 were diluted. The plate was added at 100 μl / well, and HRP-labeled cortisol (Sigma Chemical Co., USA) adjusted to 0.005 μg / ml was further added at 100 μl / well.
2時間室温で振盪後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ発色反応を行った。発色には、ABTS(Sigma Chemical Co., USA)を0.05Mクエン酸-リン酸水素ナトリウム溶液で10μg/mlに調整し、30％過酸化水素水を10μl混和することで得られた溶液を使用した。当該溶液を50μl/wellずつ添加し、30分間反応させた。 After shaking at room temperature for 2 hours, the plate was washed and a peroxidase color reaction was performed. For color development, use a solution obtained by adjusting ABTS (Sigma Chemical Co., USA) to 10 μg / ml with 0.05 M citric acid-sodium hydrogen phosphate solution and mixing 10 μl of 30% hydrogen peroxide. did. The solution was added at 50 μl / well and allowed to react for 30 minutes.
反応後、1N硫酸を75μl/wellで入れ、発色反応を停止した後、波長415nmにおける吸光度を測定し、コルチゾール濃度を算出した。 After the reaction, 1N sulfuric acid was added at 75 μl / well to stop the color reaction, and then the absorbance at a wavelength of 415 nm was measured to calculate the cortisol concentration.
結果を図２に示す。図２において、縦軸は拘束0分におけるコルチゾール量を100％とした場合のコルチゾール増加率(％)である。一方、横軸は拘束ストレス下に置いた時間(分)である。 The results are shown in FIG. In FIG. 2, the vertical axis represents the cortisol increase rate (%) when the amount of cortisol at 0 minutes of restraint is 100%. On the other hand, the horizontal axis represents the time (minutes) placed under restraint stress.
図１及び２から判るように、コルチゾール(図２)と比較して、IL-18(図１)は拘束終了後速やかに元のレベルに回復することから、ストレスマーカーとして優れていることが示唆された。 As can be seen from FIGS. 1 and 2, compared to cortisol (FIG. 2), IL-18 (FIG. 1) recovers to its original level immediately after the end of restraint, suggesting that it is excellent as a stress marker. It was done.
［実施例２］
ストレス抑制剤投与とブタの血清中のIL-18との相関関係の評価
本実施例では、ブタに既知のストレス抑制剤を投与し、ストレス下に置いた後、当該ブタから採取した血清におけるIL-18を測定することで、ストレス抑制剤によるストレス抑制をIL-18を指標に評価できることを示す。
[Example 2]
Evaluation of Correlation between Stress Suppressor Administration and IL-18 in Porcine Serum In this example, a known stress suppressor was administered to pigs, placed under stress, and then IL in serum collected from the pigs. By measuring -18, it is shown that stress suppression by a stress inhibitor can be evaluated using IL-18 as an index.
本実施例で使用するストレス抑制剤は、既にストレス抑制剤としての効果が実証されている乳酸菌FERM P-19169である(特開2009-102292号公報)。なお、以下では、当該乳酸菌FERM P-19169を「乳酸菌」と称する。 The stress suppressor used in this example is lactic acid bacterium FERM P-19169, which has already been proven to be effective as a stress suppressor (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-102292). Hereinafter, the lactic acid bacterium FERM P-19169 is referred to as “lactic acid bacterium”.
生後7〜10日齢のブタ28頭を2群(乳酸菌投与群及び非投与群)に分けて、乳酸菌投与群には、33日間、代用乳(バースデーミルク伊藤忠(株))及び哺乳期子豚育成用飼料(モアアップ伊藤忠(株))に乳酸菌を飼料中3％となるように添加したものを給餌(投与)し、一方、乳酸菌非投与群には、乳酸菌を含まない同様の代用乳及び哺乳期子豚育成用飼料を給餌した。乳酸菌は、バケツ中で飼料に均等に混和し、自由給餌する。なお、給餌は、採食量により、1日に1〜2回給与した。 28 pigs aged 7 to 10 days are divided into 2 groups (lactic acid bacteria administration group and non-administration group), and the lactobacillus administration group includes milk substitute (birth milk Itochu Corporation) and suckling piglets for 33 days Feeding (administering) a feed for breeding (more up ITOCHU Corp.) with lactic acid bacteria added to 3% of the feed, while the non-lactic acid bacteria non-administered group contains similar milk substitute and Feeding for growing piglets was provided. Lactic acid bacteria are mixed evenly into the feed in a bucket and fed freely. In addition, feeding was fed once or twice a day depending on the amount of food intake.
乳酸菌投与群及び非投与群をそれぞれ上述の給餌から15日目に離乳し、離乳ストレスに供した。さらに、上述の給餌から25日目に豚舎を移動させることで乳酸菌投与群及び非投与群をそれぞれ移動ストレスに供した。 The lactic acid bacteria administration group and the non-administration group were each weaned on the 15th day from the above feeding and subjected to weaning stress. Furthermore, the lactic acid bacteria administration group and the non-administration group were subjected to migration stress by moving the pig house on the 25th day from the above feeding.
次いで、離乳前後、移動直後及び移動1週間後(計4回)、各ブタから採血し、血清中のIL-18を測定した。測定は、実施例１に記載のELISAによるブタIL-18の検出・定量に準じて行った。 Subsequently, blood was collected from each pig before and after weaning, immediately after movement, and one week after movement (total 4 times), and IL-18 in the serum was measured. The measurement was performed according to the detection and quantification of porcine IL-18 by ELISA described in Example 1.
結果を図３に示す。図３において、縦軸は血清サンプルにおけるIL-18量(pg/ml)である。一方、横軸は各血清サンプルである。なお、数値は、各群の平均値＋標準偏差である。 The results are shown in FIG. In FIG. 3, the vertical axis represents the amount of IL-18 (pg / ml) in the serum sample. On the other hand, the horizontal axis represents each serum sample. In addition, a numerical value is the average value + standard deviation of each group.
図３に示すように、乳酸菌投与群では試験期間全体に渡って、非投与群に比べて、ストレスマーカーであるIL-18が低い傾向で推移している。また移動ストレスを受けた直後のブタでは、IL-18が急激に増加したが、乳酸菌投与群では非投与群に比べ、IL-18の上昇は有意に抑えられた。これらの結果は、当該乳酸菌のストレス抑制剤としての効果を、ブタIL-18の測定により定量的に示した結果であり、ブタIL-18のストレスマーカーとしての有用性を示すものである。 As shown in FIG. 3, in the lactic acid bacteria-administered group, the stress marker IL-18 tends to be lower over the entire test period than in the non-administered group. Moreover, IL-18 increased rapidly in the pigs immediately after migratory stress, but the increase in IL-18 was significantly suppressed in the lactic acid bacteria administration group compared to the non-administration group. These results are the results of quantitatively showing the effect of the lactic acid bacteria as a stress inhibitor by measuring porcine IL-18, and show the usefulness of porcine IL-18 as a stress marker.
Claims (18)
該候補物質を投与した非ヒト被験動物由来のサンプルにおいて、抗インターロイキン-18抗体を用いてインターロイキン-18を測定する工程と、
を含む、ストレス抑制剤のスクリーニング方法。 Administering a candidate substance to a non-human test animal under stress or administering a candidate substance to a non-human test animal, and then subjecting the non-human test animal to stress;
In a sample derived from a non-human test animal to which the candidate substance has been administered, measuring interleukin-18 using an anti-interleukin-18 antibody;
A method for screening a stress suppressant, comprising:
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