JP2010088332A - Expression vector for performing plurality of gene expressions - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、複数の標的遺伝子を一つのベクターで発現させるための発現ベクター、当該発現ベクターが導入された細胞、当該発現ベクターによって複数の標的遺伝子を発現させる方法、及び当該発現ベクターの導入により複数の遺伝子発現に基づく細胞の形質転換を誘導する方法に関する。 The present invention relates to an expression vector for expressing a plurality of target genes with one vector, a cell into which the expression vector is introduced, a method for expressing a plurality of target genes with the expression vector, and a plurality of vectors by introducing the expression vector. The present invention relates to a method for inducing cell transformation based on the gene expression.
細胞の分化転換においては、多数のネットワーク構成遺伝子が相互に機能し働いていると考えられ、該ネットワーク構成遺伝子をセットで導入する方法が求められてきた。例えばｉＰＳ細胞の作製においては、複数の特定転写因子（例えばＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，Ｃ−ＭＹＣ，ＫＬＦ４等）をセットで機能させることが必要であることが報告されている（非特許文献1）。 In cell transdifferentiation, a large number of network-constituting genes are considered to function and work with each other, and a method for introducing the network-constituting genes as a set has been demanded. For example, in the production of iPS cells, it has been reported that a plurality of specific transcription factors (for example, OCT3 / 4, SOX2, C-MYC, KLF4, etc.) need to function as a set (Non-patent Document 1). .
複数の遺伝子を発現させることが求められる例においては、複数の標的遺伝子を各々個別の発現ベクターに組込み、これら発現ベクターを細胞群に共導入させ発現させる方法、又は、一つの発現ベクターに複数の標的遺伝子を組込み、該発現ベクターを細胞群に導入させ発現させる方法が用いられてきた。例えば八幡らは１分子ベクター上に複数の転写単位を乗せた方法を使用しており（非特許文献２）、また上記ｉＰＳ細胞の樹立においては、一般に因子毎にレトロウイルスベクターを作成し共導入して発現させている（非特許文献１）。 In an example where expression of a plurality of genes is required, a method of incorporating a plurality of target genes into individual expression vectors and co-introducing these expression vectors into a group of cells, or a plurality of expression vectors in one expression vector A method of incorporating a target gene and introducing the expression vector into a cell group for expression has been used. For example, Yawata et al. Uses a method in which a plurality of transcription units are placed on a single molecule vector (Non-patent Document 2). In the establishment of the above iPS cells, a retroviral vector is generally created for each factor and co-introduced. (Non-patent Document 1).
しかし、多種類の発現単位を別々の発現ベクターに組込み細胞群へ共導入する方法においては、処理細胞すべてに全種類の遺伝子が導入されるとは限らず、共導入後、所望の遺伝子が全て導入された細胞を選択する必要があった。このため、選択により遺伝子導入細胞が少数になること、及び、各因子の発現量のばらつきが大きく、効果の解析が困難である等の問題があった。 However, in the method of co-introducing multiple types of expression units into separate expression vectors into the cell population, not all types of genes are introduced into all treated cells. It was necessary to select the introduced cells. For this reason, there have been problems such as a small number of gene-transferred cells due to selection and a large variation in the expression level of each factor, making it difficult to analyze the effect.
また、一つの発現ベクターに複数の標的遺伝子を組込んだ後、細胞群に導入させ発現させる方法においては、同一ベクターの同一方向に２以上の発現単位を搭載すると転写干渉と呼ばれる現象が起き、下流側の発現効率が極端に落ちるという問題があった（非特許文献３）。転写干渉は、１の転写工程が、直接、隣接した第２の転写工程を抑制する作用のことをいい、その現象がおこるメカニズムには、プロモーター競合、シィッテングダック干渉、閉鎖、衝突、妨害の５種類があると報告されている（非特許文献３）。 In addition, in a method in which a plurality of target genes are incorporated into one expression vector and then introduced into a group of cells to be expressed, a phenomenon called transcription interference occurs when two or more expression units are loaded in the same direction of the same vector, There has been a problem that the expression efficiency on the downstream side is extremely lowered (Non-Patent Document 3). Transcription interference refers to the action of one transcription step directly suppressing the second transcription step adjacent to it, and the mechanisms that occur include promoter competition, siting duck interference, closure, collision, and interference. It has been reported that there are five types (Non-patent Document 3).
これを解決する１つの手段として、発現単位を一つのベクターの同一鎖上に逆方向に連結させることによって転写干渉を回避する方法が知られている。しかし、この方法は、３以上の発現単位を発現させたい場合に転写干渉を回避することが困難であるという問題があった。 As one means for solving this, a method of avoiding transcription interference by linking expression units in the reverse direction on the same strand of one vector is known. However, this method has a problem that it is difficult to avoid transcription interference when it is desired to express three or more expression units.
また、上述の八幡らの場合、ｃｈｉｃｋｅｎ ＨＳインスレーターを挿入することにより転写干渉を緩和させているが、多数の転写単位を連結するに当たっては、ベクターの構築において同一プロモーター及びインスレーターから成る数百ベース以上の繰り返し配列を構築することになり、大腸菌内で組み換え／欠失を起こす頻度が高くなる（すなわちベクター構築が困難であること）という問題があった。 In the case of Yawata et al. Described above, transcription interference is mitigated by inserting a chicken HS insulator. However, when many transcription units are connected, several hundreds of the same promoter and insulator are used in the construction of the vector. There was a problem that a repetitive sequence exceeding the base was constructed, and the frequency of recombination / deletion in E. coli was high (that is, vector construction was difficult).
本発明が解決しようとする課題は、複数の標的遺伝子を１つのベクターで発現させることができる発現ベクター、及び、当該発現ベクターが導入された細胞を提供することである。特には、当該ベクターであって、構築が容易なベクターを提供することである。 The problem to be solved by the present invention is to provide an expression vector capable of expressing a plurality of target genes with one vector, and a cell into which the expression vector is introduced. In particular, it is to provide a vector that is easy to construct.
本発明者らは以上の点に鑑み検討を行った結果、１分子のポリメラーゼによる転写系の制御を利用することにより、１つのベクターの同方向に複数の発現単位を連結した場合であっても、複数の遺伝子を発現させることが可能であることを見出した。また、当該ベクターが、発現単位を連結後、ベクターに導入することで容易に構築できることができることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of studying the present inventors in view of the above points, even when a plurality of expression units are linked in the same direction of one vector by utilizing the control of the transcription system by one molecule of polymerase. It was found that a plurality of genes can be expressed. Moreover, it discovered that the said vector can be easily constructed | assembled by introduce | transducing into a vector after connecting an expression unit, and completed this invention.
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
１．プロモーター領域、標的遺伝子領域及びポリＡ付加領域を有する発現単位を２以上含む発現ベクターであって、該発現単位の少なくとも２以上が同一方向に転写されるように同一鎖上に配置された発現ベクター。
２．プロモーター領域が、１分子のポリメラーゼによって制御を受ける配列である前記１に記載の発現ベクター。
３．プロモーター領域が、Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３のＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼから選択される１のポリメラーゼによって制御を受ける配列である前記１に記載の発現ベクター。
４．発現単位を３以上含む前記１から３のいずれか１に記載の発現ベクター。
５．前記１から４のいずれか１に記載の発現ベクターであって、複数の標的遺伝子の発現が可能である発現ベクター。
６．転写干渉を抑制することにより複数の標的遺伝子の発現が可能である前記１から５のいずれか１に記載の発現ベクター。
７．前記１から６のいずれか１に記載の発現ベクターが導入されたことを特徴とする細胞。
８．細胞が、真核細胞である前記７に記載の細胞。
９．細胞が多分化能を有することを特徴とする前記８に記載の細胞。
１０．前記１から６のいずれか１に記載の発現ベクターを細胞に導入する工程を含む形質転換細胞の製造方法。
１１．前記１から６のいずれか１に記載の発現ベクターを細胞に導入する工程を含む多分化能を有する細胞の製造方法。
That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
1. An expression vector comprising two or more expression units having a promoter region, a target gene region and a poly A addition region, wherein the expression vectors are arranged on the same chain so that at least two of the expression units are transcribed in the same direction. .
2. 2. The expression vector according to 1 above, wherein the promoter region is a sequence controlled by one molecule of polymerase.
3. 2. The expression vector according to 1 above, wherein the promoter region is a sequence controlled by one polymerase selected from T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, and SP6 RNA polymerase.
4). 4. The expression vector according to any one of 1 to 3, comprising 3 or more expression units.
5). 5. The expression vector according to any one of 1 to 4, wherein a plurality of target genes can be expressed.
6). 6. The expression vector according to any one of 1 to 5, wherein a plurality of target genes can be expressed by suppressing transcription interference.
7). 7. A cell, wherein the expression vector according to any one of 1 to 6 is introduced.
8). 8. The cell according to 7 above, wherein the cell is a eukaryotic cell.
9. 9. The cell according to 8 above, wherein the cell has pluripotency.
10. A method for producing a transformed cell, comprising a step of introducing the expression vector according to any one of 1 to 6 into a cell.
11. A method for producing a pluripotent cell, comprising a step of introducing the expression vector according to any one of 1 to 6 into a cell.
本発明のベクターは、同一ベクターの同一鎖上に、同方向に転写ユニットを連結しても、転写干渉を抑制することができ、複数の標的遺伝子を発現させることができる。特には、本発明は、１分子のポリメラーゼによる単純な転写系の制御を利用することにより、同一ベクターの同一鎖上に、同方向に転写ユニットを連結しても、転写干渉を抑制することができ、複数の標的遺伝子を発現させることができる。また、本発明の転写干渉が抑制された発現ベクターは、容易に構築することができる。 The vector of the present invention can suppress transcription interference and can express a plurality of target genes even when transcription units are connected in the same direction on the same chain of the same vector. In particular, the present invention uses a simple transcription system control by one molecule of polymerase to suppress transcription interference even when transcription units are connected in the same direction on the same strand of the same vector. Multiple target genes can be expressed. In addition, the expression vector of the present invention in which transcription interference is suppressed can be easily constructed.
以下に本発明の一形態について説明するが、本発明はこれに限られるものではない。また、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。 One embodiment of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to this. In addition, all documents cited throughout the present application are incorporated herein by reference in their entirety.
本明細書においてプロモーター領域とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合することによって標的遺伝子を発現することが可能な転写開始に関与するＤＮＡ上の特定領域の塩基配列のことであり、このような機能を有する塩基配列であれば特に限定されるものでなく、公知のプロモーター領域を用いることができる。本明細書で使用するプロモーター領域として、好ましくは、１分子からなるポリメラーゼにより制御を受けるプロモーター領域であり、より好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、及び、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによって制御を受けることが知られている、Ｔ７ファージＤＮＡのプロモーター領域、Ｔ３ファージＤＮＡのプロモーター領域、及び、ＳＰ６ファージＤＮＡのプロモーター領域である。 In the present specification, the promoter region is a base sequence of a specific region on DNA involved in transcription initiation capable of expressing a target gene by binding with RNA polymerase, and has such a function. The sequence is not particularly limited, and a known promoter region can be used. The promoter region used herein is preferably a promoter region controlled by a single molecule polymerase, and more preferably known to be controlled by T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, and SP6 RNA polymerase. A promoter region of T7 phage DNA, a promoter region of T3 phage DNA, and a promoter region of SP6 phage DNA.
本明細書中においてＴ７ファージＤＮＡのプロモーター領域は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写できる配列であれば特に限定されないが、例えば、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号１）からなるＤＮＡ塩基配列を備える領域、又は、当該配列に１若しくは数個（好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたＤＮＡ塩基配列であって、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより制御を受けることが可能な塩基配列を包含する。例えば、Ｔ７ファージＤＮＡのプロモーター領域は、５’末端が１〜数個欠失している配列を備える領域であってもよい。
また、バクテリオファージＴ３由来のプロモーター領域とは、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写できる配列であれば特に限定されないが、例えば、ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号２）からなるＤＮＡ塩基配列を備える領域、又は、当該配列に１若しくは数個（好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたＤＮＡ塩基配列であって、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼに制御を受けることが可能な塩基配列を備える領域を包含する。
更に、バクテリオファージＳＰ６由来のプロモーター領域は、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写できる配列であれば特に限定されないが、例えば、ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号３）からなるＤＮＡ塩基配列を備える領域、又は当該配列に１若しくは数個（好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたＤＮＡ塩基配列であって、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼに制御を受けることが可能な塩基配列を包含する。例えば、バクテリオファージＳＰ６由来のプロモーター領域は、５’末端が１〜数個欠失している配列を備える領域であってもよい。
In the present specification, the promoter region of T7 phage DNA is not particularly limited as long as T7 RNA polymerase can bind and transcribe, but for example, a region having a DNA base sequence consisting of TATATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO: 1), or the sequence DNA base sequence in which one or several (preferably one) bases are deleted, substituted, inserted or added, and includes a base sequence that can be controlled by T7 RNA polymerase. For example, the promoter region of T7 phage DNA may be a region having a sequence in which one or several 5 ′ ends are deleted.
The promoter region derived from bacteriophage T3 is not particularly limited as long as T3 RNA polymerase can bind and transcribe, but for example, a region having a DNA base sequence consisting of ATTAACCCTCACTAAAGGA (SEQ ID NO: 2), or It includes a DNA base sequence in which one or several (preferably one) bases are deleted, substituted, inserted or added, and a region having a base sequence that can be controlled by T3 RNA polymerase.
Further, the promoter region derived from bacteriophage SP6 is not particularly limited as long as SP6 RNA polymerase can bind and transcribe, but for example, a region having a DNA base sequence consisting of ATTTAGGTGACACTATAG (SEQ ID NO: 3), or 1 or A DNA base sequence in which several (preferably one) bases are deleted, substituted, inserted or added, and includes a base sequence that can be controlled by SP6 RNA polymerase. For example, the promoter region derived from bacteriophage SP6 may be a region having a sequence in which one or several 5 ′ ends are deleted.
本発明に係るベクターに組込む標的遺伝子は、所望の遺伝子を選択することができ、本方法において発現可能な遺伝子であれば特に限定されない。例えば、本発明に係るベクターに組込む標的遺伝子の大きさは、１０〜１０，０００ｂｐとすることができる。 The target gene to be incorporated into the vector according to the present invention is not particularly limited as long as it can select a desired gene and can be expressed in this method. For example, the size of the target gene to be incorporated into the vector according to the present invention can be 10 to 10,000 bp.
該標的遺伝子は、当業者に公知の技術を組み合わせて作製することができる。例えば、標的遺伝子を構成する構成要素の各遺伝子配列を化学的合成法、又はクローニング法によって個々に調整し、これら構成要素をリガーゼを用いて順次連結し、又は、ＰＣＲ増幅法を組み合わせることにより目的の遺伝子を作製することができる。 The target gene can be prepared by combining techniques known to those skilled in the art. For example, each gene sequence of a component constituting a target gene is individually adjusted by a chemical synthesis method or a cloning method, and these components are sequentially ligated using a ligase, or a PCR amplification method is combined. Genes can be prepared.
本発明に係るポリＡとは、ｍＲＮＡの３’末端に付加した２〜２００塩基のアデニン（Ａ）ヌクレオチドのことをいう。本願におけるポリＡは、好ましくは１０から１００塩基のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをいい、より好ましくは１５から６０塩基のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをいう。 The poly A according to the present invention refers to a 2-200 base adenine (A) nucleotide added to the 3 'end of mRNA. The poly A in the present application preferably refers to an adenine (A) nucleotide having 10 to 100 bases, and more preferably refers to an adenine (A) nucleotide having 15 to 60 bases.
本明細書において発現単位は、プロモーター領域、標的遺伝子領域、及び、ポリＡ付加領域を含む。また本発明における発現単位は、その他の配列、例えば、Ｋｏｚａｋ配列、ＵＴＲ領域、ＳＴＮＶ領域、ＴＥＶ領域、ｏｂｅｌｉｎ領域、Ｔ７ターミネーター領域、その他エンハンサー領域、又は、分離精製用タグ等を含むものであってもよい。 In the present specification, the expression unit includes a promoter region, a target gene region, and a poly A addition region. The expression unit in the present invention includes other sequences such as a Kozak sequence, UTR region, STNV region, TEV region, obelin region, T7 terminator region, other enhancer region, or separation and purification tag. Also good.
発現単位は、上述の方法により作製された標的遺伝子にプロモーター領域及びポリＡ領域を付加することにより作製することもできるし、核酸の化学合成法（ＤＣＣ法、りん酸トリエステル法、ホスファイト法、アミダイト法等）、又は、発現単位を構成する構成要素の各遺伝子配列を化学的合成法、又はクローニング法によって個々に調整し、これら構成要素をリガーゼを用いて順次連結し若しくはＰＣＲ増幅法を組み合わせることにより作製することもできる。 The expression unit can be prepared by adding a promoter region and a poly A region to the target gene prepared by the above-described method, or a nucleic acid chemical synthesis method (DCC method, phosphate triester method, phosphite method). , Amidite method, etc.), or individual gene sequences of the constituent elements constituting the expression unit are individually adjusted by chemical synthesis or cloning, and these constituent elements are sequentially ligated using ligase or PCR amplification method. It can also be produced by combining them.
本発明は、前記プロモーター配列、前記標的遺伝子配列、及び、前記ポリＡを含む発現単位を複数有するベクターを提供するものである。本発明のベクターに含まれる発現単位の数は、２以上であれば特に限定されないが、例えば、２〜１００，０００個、２〜５０，０００個、２〜１０，０００個、２〜１，０００個、２〜２００個、２〜１００個、２〜５０個、又は、３〜１００，０００個、３〜５０，０００個、３〜１０，０００個、３〜１，０００個、３〜２００個、３〜１００個、３〜５０個とすることができる。例えば、ベクターとしてＢＡＣを使用した場合、本発明のベクターに含まれる発現単位の数は、２〜１，０００個、３〜２００個、２〜１００個とすることができる。また、例えば、ベクターとして染色体を使用した場合、本発明のベクターに含まれる発現単位の数は、３〜１０，０００個、３〜１，０００個、３〜１００個とすることができる。 The present invention provides a vector having a plurality of expression units including the promoter sequence, the target gene sequence, and the poly A. The number of expression units contained in the vector of the present invention is not particularly limited as long as it is 2 or more. For example, 2 to 100,000, 2 to 50,000, 2 to 10,000, 2 to 1, 000, 2 to 200, 2 to 100, 2 to 50, or 3 to 100,000, 3 to 50,000, 3 to 10,000, 3 to 1,000, 3 to It can be 200, 3-100, 3-50. For example, when BAC is used as a vector, the number of expression units contained in the vector of the present invention can be 2 to 1,000, 3 to 200, and 2 to 100. For example, when a chromosome is used as a vector, the number of expression units contained in the vector of the present invention can be 3 to 10,000, 3 to 1,000, and 3 to 100.
本発明の発現単位を組み込むベクターは、当該技術において公知のものを用いることができ、例えば、本発明の上記発現単位を組み込むことができる適当な挿入部位すなわち制限酵素部位を有していること、該標的遺伝子を宿主細胞内で発現可能であること、及び／又は、該宿主細胞内で自律的に複製可能であること等の性質を有しているベクターを使用することができる。本発明のベクターは、複製開始点、ターミネーター配列、リボソーム結合配列等を適宜含むことができ、加えて、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子等の選択マーカーを含んでもよい。本発明のベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＢＡＣ、及び、染色体を挙げることができるが、これに限定されるものではない。より具体的には、本発明のベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＷ７等のプラスミドを使用することができる。 As the vector incorporating the expression unit of the present invention, those known in the art can be used, for example, having an appropriate insertion site, that is, a restriction enzyme site capable of incorporating the expression unit of the present invention, A vector having such properties as being capable of expressing the target gene in a host cell and / or autonomously replicating in the host cell can be used. The vector of the present invention can appropriately include a replication origin, a terminator sequence, a ribosome binding sequence, and the like, and may further include a selection marker such as a drug resistance gene and a gene that complements auxotrophy. Examples of the vector of the present invention include, but are not limited to, plasmids, cosmids, phages, viruses, BACs, and chromosomes. More specifically, plasmids such as pUC118, pUC18, pBR322, pBluescript, and pGW7 can be used as the vector of the present invention.
本発明の発現ベクターは、細胞に所望の生理的な変化を起こすのに十分な量の標的遺伝子産物を発現するベクターであれば特に限定されない。例えば、本発明のベクターは、蛍光を確認することが可能な量の蛍光蛋白質を発現するベクター、又は、細胞に薬剤耐性能を与える量の薬剤耐性遺伝子産物を発現するベクターであってもよい。 The expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a sufficient amount of a target gene product to cause a desired physiological change in a cell. For example, the vector of the present invention may be a vector that expresses an amount of a fluorescent protein capable of confirming fluorescence, or a vector that expresses an amount of a drug resistance gene product that imparts drug resistance performance to cells.
本発明の発現ベクターは、公知の技術方法を用いて作製することができる。例えば、所望の標的遺伝子を有し適宜制限酵素切断部位を両端に配した発現単位をそれぞれ個々に作製した後、当該発現単位を結合して発現単位の結合物を作製し、その後、当該発現単位結合物の両端に配置した制限酵素切断部位で切断した断片を、適切な制限酵素により切断したベクターにリガーゼを用いて結合することにより、ベクターに導入することができる。また、発現単位の連結部と異なる制限酵素切断部位を発現単位結合物の両端に使用することにより、発現単位の結合物の作製と同時にベクターへの導入を行うこともできる。 The expression vector of the present invention can be prepared using a known technical method. For example, after individually producing each expression unit having a desired target gene and appropriately arranging restriction enzyme cleavage sites at both ends, the expression units are combined to produce a combined expression unit, and then the expression unit Fragments cleaved at the restriction enzyme cleavage sites located at both ends of the ligated product can be introduced into a vector by ligating to a vector cleaved with an appropriate restriction enzyme using ligase. In addition, by using a restriction enzyme cleavage site different from the ligation site of the expression unit at both ends of the expression unit conjugate, the expression unit conjugate can be simultaneously introduced into the vector.
発現単位の結合物の作成は、当業者周知の方法を適宜組み合わせて行うことができるが、例えば、適宜制限酵素切断部位を両端に有する発現単位を順に一つずつＴ４リガーゼで結合させていく（発現単位Ａ及び発現単位Ｂを結合した後、結合物ＡＢに発現単位Ｃを結合させる、以下、これの繰り返しにより発現単位を結合させていく）方法、発現単位の各連結部分に異なる制限酵素を使用することにより一度のライゲーションで連結させる方法、又は、各発現単位を一度に連結させた後、目的の順番で連結している結合物だけを選択して回収する方法等により行うことができる。 A conjugate of expression units can be prepared by appropriately combining methods well known to those skilled in the art. For example, expression units each having a restriction enzyme cleavage site at both ends are appropriately bound one after another with T4 ligase ( After binding the expression unit A and the expression unit B, the expression unit C is bound to the conjugate AB. Hereinafter, the expression unit is bound by repeating this method), a different restriction enzyme is added to each linking part of the expression unit. It can be carried out by a method of ligation by one ligation by using, or a method of selecting and recovering only the bound product linked in the desired order after linking each expression unit at once.
また、本発明の発現ベクターは、例えば、所望の標的遺伝子を有し適宜制限酵素切断部位を両端に配した発現単位をそれぞれ個々に作製した後、発現単位を組み込むベクターに、１個ずつ発現単位を組み込んでいくことにより作製することができる。各発現単位の両端に配置する制限酵素切断部位は、同一であってもよいし異なってもよいが、単離精製プロセスを経ないで作製する場合には異なる制限酵素切断部位を使用することが好ましい。 In addition, the expression vector of the present invention is, for example, prepared individually for each expression unit having a desired target gene and appropriately arranged with restriction enzyme cleavage sites at both ends, and then one expression unit in the vector into which the expression unit is incorporated. Can be produced by incorporating. The restriction enzyme cleavage sites placed at both ends of each expression unit may be the same or different, but different restriction enzyme cleavage sites may be used when preparing without going through the isolation and purification process. preferable.
更に、本発明の発現ベクターは、例えば、既に所望の数のプロモーター領域とポリＡ領域及び該プロモーター領域とポリＡ領域の間に制限酵素切断部位を配置した発現ベクターに、所望の標的遺伝子を組み込むことにより作製することもできる。当該発現ベクター上の制限酵素切断部位は、同一であってもよいし異なってもよいが、異なる制限酵素切断部位を使用することが好ましい。 Furthermore, the expression vector of the present invention incorporates a desired target gene into, for example, an expression vector in which a desired number of promoter regions and polyA regions and a restriction enzyme cleavage site are arranged between the promoter region and polyA region. Can also be produced. The restriction enzyme cleavage sites on the expression vector may be the same or different, but it is preferable to use different restriction enzyme cleavage sites.
本発明のベクターを導入する細胞は、本発明のベクターにより複数の遺伝子を発現させることができる細胞であれば特に限定されず、真核細胞又は原核細胞のいずれであってもよい。例えば、大腸菌等の細菌細胞、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞を使用することができ、好ましくは、動物細胞である。本発明で使用することができる動物細胞の種類は特に限定されないが、例えば、マウス等のげっ歯類、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、又は、サル若しくはヒト等の霊長類に由来する細胞を使用することができる。細胞の種類としては、例えば、内皮細胞、上皮細胞、ニューロン等の神経組織由来細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、各種臓器細胞、筋肉細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、線維芽細胞、樹立されている各種の細胞株、間葉系細胞、又は、幹細胞（ＥＳ細胞等）を使用することができる。 The cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited as long as it can express a plurality of genes by the vector of the present invention, and may be either a eukaryotic cell or a prokaryotic cell. For example, bacterial cells such as Escherichia coli, yeast, plant cells, insect cells, and animal cells can be used, and animal cells are preferable. The types of animal cells that can be used in the present invention are not particularly limited, but for example, cells derived from rodents such as mice, goats, sheep, cows, pigs, or primates such as monkeys or humans are used. can do. Cell types include, for example, endothelial cells, epithelial cells, neurons such as neurons, mesothelial cells, bone cells, lymphocytes, chondrocytes, hematopoietic cells, immune cells, various organ cells, muscle cells, and exocrine cells. Endocrine cells, fibroblasts, established cell lines, mesenchymal cells, or stem cells (ES cells and the like) can be used.
本発明の発現ベクターの細胞への導入は、当業者に公知の通常の遺伝子導入法により行うことができる。例えば、コンピテントセルの使用、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ウイルスによる感染等を挙げることができる。 Introduction of the expression vector of the present invention into cells can be carried out by conventional gene transfer methods known to those skilled in the art. For example, use of competent cells, electroporation method, calcium phosphate method, lipofection method, microinjection method, infection by virus, and the like can be mentioned.
本発明の形質転換細胞は、上述の方法により上記ベクターを細胞に導入することにより得ることができる。本発明の形質転換細胞としては、例えば、上記ベクターの導入によって蛍光発生能、薬剤耐性能、多分化能を獲得した細胞等、遺伝的性質が変化した細胞であり、例えば、ｉＰＳ細胞等の多分化能を有する細胞である。本発明における形質転換細胞は、導入された当該ベクターのうち、当該発現単位がゲノムＤＮＡに組み込まれ、当該ベクターは分解された細胞であってもよい。また、本明細書における形質転換細胞は、本発明のベクターの導入により所望の形質を獲得した細胞であれば特に限定されず、従って、本発明のベクターを保持した状態であってもよいし、本発明が導入されたことにより、所望の形質を獲得した後に、ベクターが脱落したのもであってもよい。 The transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the vector into the cell by the method described above. The transformed cells of the present invention are cells whose genetic properties have been changed, such as cells that have acquired fluorescence generation ability, drug resistance, and pluripotency due to the introduction of the above-described vectors, such as iPS cells. It is a cell that has a chemical capacity. The transformed cell in the present invention may be a cell in which the expression unit is incorporated into genomic DNA and the vector is degraded. In addition, the transformed cell in the present specification is not particularly limited as long as it has acquired a desired trait by introducing the vector of the present invention. Therefore, the transformed cell may be in a state in which the vector of the present invention is retained, Due to the introduction of the present invention, the vector may have dropped out after obtaining the desired trait.
本明細書における多分化能を有する細胞は、特定の転写因子（例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ等）をコードするＤＮＡを有する上記ベクターを細胞に導入することにより得ることができる（ＷＯ／２００７／０６９６６６：Ｃｅｌｌ １３１：８６１−８７２：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ２，Ｊｕｎｅ ２００８：１０５−１１５：Ｓｃｉｎｅｎｃｅ ２１ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７：１９１７−１９２０：Ｎａｔｕｒｅ４５１，１４１−１４６，１０ Ｊａｎｕａｒｙ ２００８）。このような多分化能を有する細胞は、一度多分化能を獲得した後は、外来遺伝子由来転写因子の働きがない状態でも多分化能を維持できることが知られている。よって、本明細書における多分化能を有する細胞は、本発明のベクターを保持した状態であってもよいし、本発明のベクターが導入されたことにより、多分化能を獲得した後に、ベクターが脱落したのもであってもよい。 The pluripotent cell in the present specification is a vector having a DNA encoding a specific transcription factor (for example, OCT3 / 4, SOX2, KLF4, C-MYC, NANOG, LIN28, hTERT, SV40 large T, etc.). (WO / 2007/069666: Cell 131: 861-872: Stem Cell Research, Vol. 1, Issue 2, June 2008: 105-115: Science 21 December 2007: 1917-1920. : Nature 451, 141-146, 10 January 2008). Such multipotent cells are known to be able to maintain pluripotency even in the absence of a foreign gene-derived transcription factor, once the pluripotency has been acquired. Therefore, the pluripotent cell in the present specification may be in a state in which the vector of the present invention is retained, or after acquiring the pluripotency by introducing the vector of the present invention, It may have dropped out.
本発明において標的遺伝子の発現方法は、上記の方法で発現ベクターを導入した細胞を発現可能な条件下適切な培地にて培養し、標的遺伝子を発現させる方法であれば特に限定されないが、発現を積極的に誘導する薬剤等を添加してもよい。 In the present invention, the expression method of the target gene is not particularly limited as long as it is a method for culturing the cells into which the expression vector has been introduced by the above-described method in an appropriate medium under conditions capable of expression and expressing the target gene. A drug or the like that actively induces may be added.
本願で使用する発現の確認は、標的遺伝子の発現が確認される方法であれば、特に限定されないが、例えば、発現タンパク質を単離・精製後、分子量の測定を行うことによって導入された遺伝子の翻訳産物であることを確認することができる。発現タンパク質の単離・精製は、例えば発現タンパク質の性質（親和性、分子量、イオンに対する選択性等）を利用して行うこともでき、また、タグ等を付加した標的遺伝子の発現については、タグに親和性のある素材を利用し単離・精製することができる。更に、標的遺伝子の発現の確認として、標的タンパク質に対する抗体を利用して検出するウエスタンブロッティング法や活性測定（蛍光強度測定、標識された基質の分解能測定、薬剤耐性能等）等を挙げることができる。 Confirmation of the expression used in the present application is not particularly limited as long as the expression of the target gene is confirmed. For example, the expression of the gene introduced by isolating and purifying the expressed protein and then measuring the molecular weight. It can be confirmed that it is a translation product. Isolation and purification of the expressed protein can be performed using, for example, the properties of the expressed protein (affinity, molecular weight, selectivity for ions, etc.). It can be isolated and purified using materials that have affinity for. Furthermore, examples of confirmation of target gene expression include Western blotting and activity measurement (detection of fluorescence intensity, measurement of resolution of labeled substrate, drug resistance, etc.), etc., which are detected using an antibody against the target protein. .
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これら実施例により本発明が限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited by these Examples.
ＢＺｎＴＲ１細胞株の作製
（１）ＥＳ細胞の培養
フィーダーフリー株ＥＢ５（独立行政法人理化学研究所多能性幹細胞研究チームより入手 Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．２８：３１−４０，２０００）及びＥＢ３（独立行政法人理化学研究所多能性幹細胞研究チームより入手 Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ ９：４７１−４７７，２００４）を用いて、ゼラチンコート培養皿上にて以下の条件で培養した。
培地（Ｇｌａｓｇｏｗ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ：ＧＭＥＭ）
１０％ ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ
１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ
１０−４Ｍ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１× ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１０００ Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ
培養条件
ゼラチンコートディッシュ上におよそ６，３００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３日培養後に同密度に継代し維持した。
また、ｎＴＲの安定発現株の製造方法については、ｎＴＲと薬剤選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、安定形質転換細胞を選抜して行った。
Production of BZnTR1 cell line (1) Culture of ES cells Feeder-free strain EB5 (obtained from RIKEN pluripotent stem cell research team Kawasaki et al., Neuron. 28: 31-40, 2000) and EB3 (independent Using Ogawa et al., Genes to Cells 9: 471-477, 2004), obtained from the RIKEN pluripotent stem cell research team, cultured on a gelatin-coated culture dish under the following conditions.
Medium (Glasgow minimal essential medium: GMEM)
10% fetal calf serum
1mM sodium pyruvate
10 -4 M 2-mercaptoethanol
1 × nonessential amino acids (Invitrogen)
1000 U / ml LIF
Culture conditions The seeds were seeded on a gelatin-coated dish at a density of approximately 6,300 cells / cm 2 , cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 3 days, and subcultured and maintained at the same density.
The method for producing a stable expression strain of nTR was carried out by introducing an expression vector containing nTR and a drug selection marker gene into a host cell and selecting a stable transformed cell.
（２）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰの構築
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、大腸菌株ＢＬ２１からプライマー５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＧＡＴＴＡＡＣＡＴＣＧＣ−３’（配列番号４）と５’−ＴＴＴＴＡＣＧＣＧＡＡＣＧＣＧＡＡＧＴＣＣＧＡ−３’（配列番号５）を用いてハイフィデリティＰＣＲ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｐｌｕｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、９８℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃３分を２０サイクル）で増幅した（配列番号６）。ＳＶ４０ラージＴ抗原由来核移行配列ＭＰＫＫＫＲＫＶＡ（配列番号７）をコードする５’−ＡＴＧＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＡＧＴＣＧＣＣ−３’（配列番号８）の直下にインフレームでＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を配置した。こうして作製した核移行シグナル付きＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（以下ｎＴＲと略す）をｐＣＡＧ−ＩＰ（独立行政法人理化学研究所多能性幹細胞研究チームより入手）に組み込んでｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰを構築した。ＩＰはＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）−ｐｕｒｏ（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を指す。
構築したプラスミドの概略図を図１に示す。
(2) Construction of pCAG-nTR-IP incorporating T7 RNA polymerase gene T7 RNA polymerase gene was obtained from E. coli strain BL21 with primers 5'-CCACCATGAACACGATATACCATGC-3 '(SEQ ID NO: 4) and 5'-TTTTCGCGACACGCGAAGTCCCGA-3' (SEQ ID NO: 5). ) Using a high fidelity PCR method (Invitrogen's Platinum Pfx DNA polymerase, 20 cycles of 98 ° C. for 15 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 3 minutes) (SEQ ID NO: 6). A T7 RNA polymerase gene was placed in-frame immediately below 5′-ATGCCCTAAGAAGAAGCGCAAAGTCGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 8) encoding the SV40 large T antigen-derived nuclear translocation sequence MPKKKRVA (SEQ ID NO: 7). The T7 RNA polymerase with nuclear translocation signal (hereinafter abbreviated as nTR) thus prepared was incorporated into pCAG-IP (obtained from RIKEN pluripotent stem cell research team) to construct pCAG-nTR-IP. IP refers to IRES (internal ribosome entry site) -puro (puromycin acetyltransferase).
A schematic diagram of the constructed plasmid is shown in FIG.
（３）ｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰをＥＢ３細胞株へ導入
マウスＥＳ細胞株ＥＢ３に、ｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰを導入した。この細胞株をＢＺｎＴＲ１とした。
ｎＴＲの安定発現株の作製は、ｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰを５０マイクログラム、ＳｃａＩにて直鎖上にしたのち、エレクトロポレーション法（８００Ｖ、３μＦ）にて１×１０７個の細胞へ導入し、３．１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で１０センチディッシュ５枚に播種、２日後にＰｕｒｏｍｙｃｉｎ （１．５μｇ／ｍｌ）を添加、薬剤を入れ続けて培養し１０日後に出現したコロニーを４８ウェルプレートへ継代し、３日後に２４ウェルプレートへとさらに継代、このときに増殖の速いクローンすなわち薬剤耐性遺伝子を細胞集団中で均一に発現するクローンを選択した。
(3) Introduction of pCAG-nTR-IP into EB3 cell line pCAG-nTR-IP was introduced into the mouse ES cell line EB3. This cell line was designated as BZnTR1.
To prepare a stable expression strain of nTR, pCAG-nTR-IP was linearized with 50 micrograms of ScaI, and then introduced into 1 × 10 7 cells by electroporation (800 V, 3 μF). 3. Seed five 10 centimeter dishes at a density of 3.1 × 10 4 cells / cm 2 , add Puromycin (1.5 μg / ml) after 2 days, continue to add the drug, and incubate colonies that appeared after 10 days A passage was made to a 48-well plate and further passaged to a 24-well plate after 3 days. At this time, a fast-growing clone, that is, a clone expressing a drug resistance gene uniformly in the cell population was selected.
発現単位にＩＲＥＳを含む発現ベクター
（１）ｐＢＲ−ＩＲＥＳＥＧＦＰＴｔの構築
ｐＢＲ−ＩＲＥＳＥＧＦＰＴｔは、ｐＢＲ３２２プラスミドにＴ７プロモーター（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣ−３’：配列番号９）＋ＩＲＥＳ＋ＥＧＦＰ＋Ｔ７ターミネーターをこの順に組み込んだ。具体的には、制限酵素サイトＢａｍＨＩとＴ７プロモーター遺伝子配列を含むプライマー５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧ−３’ （配列番号１０）と、制限酵素サイトＮｃｏＩを含むプライマー５’−ＴＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴ−３’ （配列番号１１）を用いてｐＣＡＧ−ＩＰ（独立行政法人理化学研究所多能性幹細胞研究チームより入手）を鋳型にＰＣＲ法（９８度１５秒、５０度３０秒、６８度６０秒を１５サイクル）にてＩＲＥS（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の遺伝子配列（配列番号１２）を増幅させた。次に制限酵素サイトＮｃｏＩを含むプライマー５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１３）と、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを含むプライマー５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号１４）を用いてｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型にＰＣＲ法（９８度１５秒、５０度３０秒、６８度６０秒を１５サイクル）にてＥＧＦＰの遺伝子配列（配列番号１５）を増幅させた。同様に、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを含むプライマー５’−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡ−３’（配列番号１６）と、制限酵素サイトＳａｌＩを含むプライマー５’−ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＣＧＧＣＴＧＣＴＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＧＡ−３’（配列番号１７）を用いてｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を鋳型にＰＣＲ法（９８度１５秒、５０度３０秒、６８度６０秒を１５サイクル）にてＴ７ターミネーターの遺伝子配列（配列番号１８）を増幅させた。最後に上記３つの断片と、予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理したｐＢＲ３２２をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し組換えを行った。ＴｔはＴ７ターミネーターを表す。
構築したプラスミドの概略図を図２に示す。
Expression vector containing IRES as expression unit (1) Construction of pBR-IRESEGFPPTt pBR-IRESEGFPPTt incorporated a T7 promoter (5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGCACCACC-3 ′: SEQ ID NO: 9) + IRES + EGFP + T7 terminator in this order in the pBR322 plasmid. Specifically, a primer 5′-AAAGGATCTCTAATACGACTCACTATAGGGTTTATTTTCCACCATATTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 10) containing a restriction enzyme site BamHI and a T7 promoter gene sequence, and a primer 5′-TTTCCATGGTTGTGCGCTTATTCATCAT11) containing a restriction enzyme site NcoI (SEQ ID NO: 10) Using the pCAG-IP (obtained from RIKEN pluripotent stem cell research team) as a template using PCR, the IRES (98 degrees 15 seconds, 50 degrees 30 seconds, 68 degrees 60 seconds 15 cycles) The gene sequence (internal ribosome entry site) (SEQ ID NO: 12) was amplified. Next, pEGFP-N1 (Clontech) using primer 5′-AAACTCGAGCCACCATGGTGAGCAAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 13) containing the restriction enzyme site NcoI and primer 5′-TTTAAGCTTACTGTACAGCTCGTCCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 14) containing the restriction enzyme site HindIII The EGFP gene sequence (SEQ ID NO: 15) was amplified by PCR (98 degrees 15 seconds, 50 degrees 30 seconds, and 68 degrees 60 seconds in 15 cycles) using a template made by the company. Similarly, using the primer 5′-AAAAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCA-3 ′ (SEQ ID NO: 16) containing the restriction enzyme site HindIII and the primer 5′-TTTGTCGAACCGGCTGCTATACAAAACCCCGA-3 ′ (SEQ ID NO: 17) containing the restriction enzyme site SalI (SEQ ID NO: 17) The gene sequence (SEQ ID NO: 18) of the T7 terminator was amplified by PCR (98 degrees 15 seconds, 50 degrees 30 seconds, 68 degrees 60 seconds for 15 cycles) using Novagen) as a template. Finally, the above three fragments and pBR322 previously treated with restriction enzymes BamHI and SalI were ligated using T4 DNA ligase for recombination. Tt represents a T7 terminator.
A schematic diagram of the constructed plasmid is shown in FIG.
（２）細胞への導入
実施例１で作製したＢＺｎＴＲ１細胞株を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の密度で播種し、実施例１と同様の培養条件で一晩培養した。１μｇのｐＣＡＧ−ｎＴＲ−ＩＰと１μｇのｐＢＲ−ＩＲＥＳＥＧＦＰＴｔを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたリポフェクション法にて試薬添付のプロトコールに従ってトランスフェクションを行った。
(2) Introduction into cells The BZnTR1 cell line prepared in Example 1 was seeded at a density of 5 × 10 4 cells / well (24 well plate) and cultured overnight under the same culture conditions as in Example 1. 1 μg of pCAG-nTR-IP and 1 μg of pBR-IRESEGFPPTt were transfected by Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen) according to the protocol attached to the reagent.
（３）ＥＧＦＰ遺伝子の発現確認
本実施例において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現は、構成的プロモーターＣＡＧにより常時発現した。すなわち、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＴ７プロモーターに結合し、ＥＧＦＰ遺伝子を含むｍＲＮＡが転写され、ｍＲＮＡの翻訳量が一定以上に到達すると、ＥＧＦＰの蛍光として確認できた。
上記細胞を一日培養した後、ＥＧＦＰの一過性発現を蛍光顕微鏡観察によって観測した。顕微鏡ＩＸ７１型（オリンパス社製）を用い、蛍光ミラーユニットのＧＦＰはＵ−ＭＧＦＰＨＱ（オリンパス社製）、ＤｓＲｅｄはＵ−ＭＲＦＰＨＱ（オリンパス社製）を使用した。
(3) Confirmation of EGFP gene expression In this example, the expression of T7 RNA polymerase was always expressed by the constitutive promoter CAG. That is, T7 RNA polymerase was bound to the T7 promoter, and when mRNA containing the EGFP gene was transcribed and the translation amount of the mRNA reached a certain level, it could be confirmed as EGFP fluorescence.
After culturing the cells for one day, transient expression of EGFP was observed by observation with a fluorescence microscope. Using a microscope IX71 type (manufactured by Olympus), U-MGGFPHQ (manufactured by Olympus) was used as the GFP of the fluorescent mirror unit, and U-MRFPQ (manufactured by Olympus) was used as the DsRed.
（４）結果
図３は、発現ベクターｐＢＲ−ＩＲＥＳＥＧＦＰＴｔを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、ＥＧＦＰ遺伝子発現の結果を示す図である。図中、Ｔ７−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰでＥＧＦＰの発現を検出できた（図３右下の写真）。図３では、ｎＴＲを発現する細胞でのみ蛍光がみられることから、ｐＢＲ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰＴｔに内在するプロモーター活性によるＥＧＦＰの発現ではなく、Ｔ７系による転写であることがわかる。
このことから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって発現が制御される転写系はＥＳ細胞において機能することが示された。
(4) Results FIG. 3 shows the results of EGFP gene expression after introducing the expression vector pBR-IRESEGFPPTt into the cell BZnTR1. In the figure, expression of EGFP could be detected with T7-IRES-EGFP (photo at the lower right of FIG. 3). In FIG. 3, since fluorescence is observed only in the cells expressing nTR, it is understood that the transcription is not due to the expression of EGFP due to the promoter activity inherent in pBR-IRES-EGFPPTt but to transcription by the T7 system.
This indicates that the transcription system whose expression is controlled by T7 RNA polymerase functions in ES cells.
発現単位にＩＲＥＳ以外の他の構成領域を含む発現ベクター
（１）ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔ系プラスミドの構築
構築した以下のプラスミドの概略図を図４に示す。
（１−１）ポリＡにおけるＡの数の検討
ｐＢＲ３２２プラスミドに、Ｔ７プロモーターの下流にＥＧＦＰ配列、ポリＡ配列（Ａの数が０個、１５個及び３０個）、及び、クラスIIＴ７ターミネーター配列（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：８８０２−１８８１１，１９９８）を組み込んだベクター、即ち、Ｔ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７ターミネーターを有するベクターを構築した。ここでポリＡとしては以下の配列を付加した。
Ａ０：５’ −ＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＧ−３’（配列番号１９）
Ａ１５：５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＧ−３’（配列番号２０）
Ａ３０：５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＧ−３’（配列番号２１）
また、Ｋｏｚａｋ配列（５’−ＡＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号２２））は、Ｔ７プロモーター直下に配置した。
ベクター構築において、具体的には制限酵素サイトＳａｌＩ、Ｔ７プロモーター遺伝子配列及びＫｏｚａｋ配列を含むプライマー５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号２３）、各ポリＡの配列とＴ７ターミネータークラスIIの配列および制限酵素サイトＢａｍＨＩを含むプライマー５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２４）、５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２５）、又は、５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２６）をそれぞれを用いてｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型にＰＣＲ法（９８度１５秒、５０度３０秒、６８度６０秒を１５サイクル）にてＥＧＦＰの遺伝子配列（配列番号１５）を増幅させた。この断片と、予め制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで処理したｐＢＲ３２２をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し組換えを行った。
Expression Vector Containing Other Constituent Regions Other than IRES in Expression Unit (1) Construction of pPyT7EGFPt-Based Plasmid A schematic diagram of the following constructed plasmid is shown in FIG.
(1-1) Examination of the number of A in poly A In the pBR322 plasmid, an EGFP sequence, a poly A sequence (the number of A is 0, 15, and 30) downstream of the T7 promoter, and a class IIT7 terminator sequence ( He et al., J Biol Chem 273: 8802-18811, 1998), ie, a vector having a T7 promoter-Kozak-EGFP-polyA sequence-T7 terminator was constructed. Here, the following sequence was added as poly A.
A0: 5′-TATCTGTTGTTTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 19)
A15: 5′-AAAAAAAAAAAAAAATATCTGTTGTTTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 20)
A30: 5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATACTGTTTGTTTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 21)
In addition, the Kozak sequence (5′-AGCCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 22)) was placed directly under the T7 promoter.
In the vector construction, specifically, a restriction enzyme site SalI, a primer 5′-AAAGTCCGACTATAATACGACTCACTATAGGGAGCCACATGGTGGAGCCAAGGGCGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 23), a sequence of each poly A and a sequence of T7 terminator class II and restrictions Primer 5′-TTTGGATCCCGACAAACAACAGAATTATTACTTGGTACAGCTCGTCCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 24), 5′-TTTGGATCCCAACAAACAACAGATATAAAAAAAAAATTACTGATCAGTAGCATGATAGATGCATC TATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATACACTGTTACAGCTCGTCCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 26) was used as a template for pEGFP-N1 (manufactured by Clontech) as a template (98 degrees 15 seconds, 50 degrees 30 seconds, 68 degrees 60 seconds P cycle 15 times) The gene sequence (SEQ ID NO: 15) was amplified. This fragment was ligated with pBR322 previously treated with restriction enzymes SalI and BamHI using T4 DNA ligase.
（１−２）５’側翻訳効率向上配列としてＩＲＥＳ（約５００ｂｐ）を配置した発現ベクター
ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔ系プラスミドについて、Ｔ７プロモーターとＩＲＥＳの後に開始コドンＡＴＧから始まるコード領域を配置し、Ｔ７プロモーター−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７ターミネーターからなる発現単位を有するベクターを作製した。具体的なベクターの構築方法は、５’側プライマーとして５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧ−３’（配列番号２７）、３’側プライマーとして５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２８）を用いてｐＢＲ−ＩＲＥＳＥＧＦＰＴｔを鋳型として（１−１）と同条件で増幅し、ＳａｌＩとＢａｍＨＩで処理した後ｐＢＲ３２２のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩサイトへ挿入した。ＩＲＥＳの配列は配列番号１２を使用した。
(1-2) Expression vector in which IRES (about 500 bp) is arranged as a 5′-side translation efficiency improving sequence For pPyT7EGFPt-based plasmid, a coding region starting from start codon ATG is arranged after T7 promoter and IRES, and T7 promoter-IRES- A vector having an expression unit consisting of EGFP-poly A sequence-T7 terminator was prepared. As a specific vector construction method, 5′-AAAGTCCGACTAATACGACTCACTATAGGGTTATTTTCCACCATATTG-3 ′ (SEQ ID NO: 27) as 5′-side primer and 5′-TTTGGATCAGAATACAATAGAATACAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Was used as a template under the same conditions as in (1-1), treated with SalI and BamHI, and then inserted into the SalI-BamHI site of pBR322. The sequence of IRES used SEQ ID NO: 12.
（１−３）５’側翻訳効率向上配列としてＳＴＮＶ配列、ＴＥＶ配列、又は、Ｏｂｅｌｉｎ配列を配置した発現ベクター
ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔ系プラスミドについて、Ｔ７プロモーターと以下の配列の後に開始コドンＡＴＧから始まるコード領域を配置し、Ｔ７プロモーター −ＳＴＮＶ、ＴＥＶ、Ｏｂｅｌｉｎ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７ターミネーターからなる発現単位を有するベクターを構築した。具体的なベクターの構築方法は、５’側プライマーとして翻訳効率向上配列を含む５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号２９）、３’側プライマーとして５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号３０）を使用した以外は（１−１）と同様の方法を用いて行った。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として（１−１）と同条件で増幅し、ＳａｌＩとＢａｍＨＩで処理した後ｐＢＲ３２２のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩサイトへ挿入した。
ＳＴＮＶ配列、ＴＥＶ配列、又は、Ｏｂｅｌｉｎ配列は、以下の配列を使用した。
ＳＴＮＶ：５’−ＡＧＴＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＡＣＴＧＡＣＴＡＡＣ−３’（配列番号３１）（Ｔｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：９５０４−９５１０，１９９３）
ＴＥＶ：５’ −ＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＡＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＣＡＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＣＣ−３’（配列番号３２）（Ｎｉｅｐｅｌ ａｎｄ Ｇａｌｌｉｅ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７３：９０８０−９０８８，１９９９）
Ｏｂｅｌｉｎ：５’−ＡＣＧＡＴＣＧＡＡＣＣＡＡＡＣＡＡＣＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡＧＣＴＡＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＣＴＴＧＴＴＧＴＧＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡ−３’（配列番号３３）（Ｓｈａｌｏｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８８：７３０−９，２００４）
(1-3) Expression vector in which STNV sequence, TEV sequence, or Obelin sequence is arranged as 5 'translation efficiency improving sequence For pPyT7EGFPt-based plasmid, a coding region starting from start codon ATG is placed after T7 promoter and the following sequences Then, a vector having an expression unit consisting of T7 promoter-STNV, TEV, Obelin-EGFP-poly A sequence-T7 terminator was constructed. A specific vector construction method is 5′-AAAGTCCGACTATAATACGACTCACTATAGGGGATGGTGAGCAAGGGCGGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 29) as a 5′-side primer, and 5′-TTTGGATCGACAATACAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA The same method as in (1-1) except that was used. pEGFP-N1 (Clontech) was used as a template, amplified under the same conditions as (1-1), treated with SalI and BamHI, and then inserted into the SalI-BamHI site of pBR322.
The following sequences were used as STNV sequences, TEV sequences, or Obelin sequences.
STNV: 5′-AGTAAAAGACAGGAAACTTTACTACTACTAC-3 ′ (SEQ ID NO: 31) (Timer et al., J Biol Chem 268: 9504-9510, 1993)
TEV: 5'-CAAAACAAACGAATCTCAAGCAATCAAGCATTCTCACTTCTATTGCAGCAATTTAAATCATTTCTTTTAAAGCAAAAGCAATTTTCTGAAAAAGACGACC-3 '(SEQ ID NO: 32) (Niepel and Gallie, J 99, 90).
Obelin: 5'-ACGATCGAACCAAACAACTCAGCTCACGCTACTGAACAACTCTTTGTTGTACAATCAAA-3 '(SEQ ID NO: 33) (Shaloiko et al., Biotechnol Bioeng. 88: 730-9, 2004)
（１−４）５’ＵＴＲ最小配列を配置した発現ベクター
ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔ系プラスミドについて、Ｔ７プロモーターとＵＴＲ最小配列の後に開始コドンＡＴＧから始まるコード領域を配置し、Ｔ７プロモーター−ＵＴＲ−Ｋｏｚａｋ−ＥＧＦＰ−ポリＡ配列−Ｔ７ターミネーターからなる発現単位を有するベクターを構築した（ｐＰｙＴ７−ＵＴＲ−ＥＧＦＰ−Ａ３０ｔ）。具体的なベクターの構築方法は、５’側プライマーとして５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号３４）、３’側プライマーとして５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号３５）を使用した以外は（１−１）と同様の方法を用いて行った。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として（１−１）と同条件で増幅し、ＳａｌＩとＢａｍＨＩで処理した後ｐＢＲ３２２のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩサイトへ挿入した。ＵＴＲ最小配列：５’−ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３６）
(1-4) Expression vector in which 5′UTR minimal sequence is arranged For the pPyT7EGFPt series plasmid, a coding region starting from the start codon ATG is arranged after the T7 promoter and UTR minimal sequence, and T7 promoter-UTR-Kozak-EGFP-polyA A vector having an expression unit consisting of a sequence-T7 terminator was constructed (pPyT7-UTR-EGFP-A30t). As a specific vector construction method, 5′-AAAGTCCGACTAATACGACTCACTATAGGGCTGGAGAATTCGCCACCCATGGTGGACAAGGGATAGAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA The same method as in 1-1) was performed. pEGFP-N1 (Clontech) was used as a template, amplified under the same conditions as (1-1), treated with SalI and BamHI, and then inserted into the SalI-BamHI site of pBR322. UTR minimal sequence: 5'-AGAATTCGCCACC-3 '(SEQ ID NO: 36)
（２）細胞への導入、ＥＧＦＰ遺伝子の発現、発現確認については、実施例２と同様の方法で行った。 (2) Introduction into cells, expression of the EGFP gene, and confirmation of expression were performed in the same manner as in Example 2.
（３）結果
発現ベクターｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、ＥＧＦＰ遺伝子発現をＥＰＩＣＳ ＡＬＴＲＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）解析した結果を図５に示す。解析方法は、前方散乱光（ＦＳ：大きさ）、側方散乱光（ＳＳ：内部構造）の２パラメーターでメジャーな集団を用い（全体の４５％前後）、ＧＦＰ蛍光を４８８ｎｍのアルゴンレーザーで励起、検出を行った。ＥｍｐｔｙでＧＦＰ陽性集団が０．２％存在するが、ＢＺｎＴＲ１はＧＦＰを微弱に発現しており、その蛍光漏れ込みであると推測される。
(3) Results FIG. 5 shows the results of analyzing the EGFP gene expression by EPICS ALTRA (manufactured by Beckman Coulter) after introducing the expression vector pPyT7EGFPt into the cell BZnTR1. The analysis method uses a major group with two parameters of forward scattered light (FS: size) and side scattered light (SS: internal structure) (around 45% of the total), and excites GFP fluorescence with a 488 nm argon laser. , Detected. Although there is 0.2% of GFP positive population in Empty, BZnTR1 expresses GFP weakly, and it is presumed that the fluorescence leaks.
ｐＰｙＴ７ＥＧＦＰｔにおいて、ＥＧＦＰの３’側Ａが３０個、１５個、０個の発現ベクターにおいては、３０個が一番良い翻訳効率だった（図５はＡ０及びＡ３０の例を示した）。また、５’側翻訳効率向上配列としてＩＲＥＳ（約５００ｂｐ）を用いると翻訳効率が顕著に向上することが確認できた。更に、ＳＴＮＶ配列、ＴＥＶ配列、及びＯｂｅｌｉｎ配列を用いても、発現を確認することができた。（ＳＴＮＶのみ示した）。更にまた、真核生物プロモーターからの転写産物において翻訳可能な５’ＵＴＲ最小配列を挿入すると蛍光がみられなくなったことから、Ｔ７系では翻訳効率を上昇させる働きは非常に小さいと考えられた。 In pPyT7EGFPt, 30, 15 and 0 expression vectors on the 3 ′ side of EGFP had 30 translation efficiency (FIG. 5 shows examples of A0 and A30). Further, it was confirmed that when IRES (about 500 bp) was used as the 5 'translation efficiency improving sequence, the translation efficiency was remarkably improved. Furthermore, expression could be confirmed using STNV sequences, TEV sequences, and Obelin sequences. (Only STNV is shown). Furthermore, since no fluorescence was observed when a translatable 5'UTR minimal sequence was inserted into a transcription product from a eukaryotic promoter, it was considered that the T7 system had very little effect on increasing translation efficiency.
（１）ｐＲＧとｐＲＧｉｎｖの構築（２種の発現単位を有する発現ベクター）
ｐＲＧ及びｐＲＧｉｎｖは、ＧＦＰとＤｓＲｅｄの２種類の遺伝子を使用して、それぞれ、Ｔ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ＥＧＦＰ−Ａ３０−Ｔ７ ターミネーターとＴ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ＤｓＲｅｄ−Ａ３０−Ｔ７ ターミネーターからなる発現単位を作製し、順向きあるいは逆向きに上述の方法と同様に構築した。
ベクター構築において、具体的には５’側プライマー５’−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧ−３’（配列番号３７）と３’側プライマー５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号３８）、鋳型としてｐＣＡＧ−ＤｓＲｅｄ−ＩＰを用いて実施例３の（１−１）と同条件でＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ＤｓＲｅｄ−Ａ３０−Ｔ７ ターミネーター断片として増幅し、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化した後平滑化し、実施例３の（１−１）作製したプラスミドｐＰｙＴ７ＥＧＦＰＡ３０ｔの平滑化したＳａｌＩサイトに挿入した。
構築したプラスミドの概略図を図６に示す。
（２）細胞への導入、ＥＧＦＰ遺伝子の発現、発現確認については、実施例２と同様の方法で行った。
また、発現確認においては、薬剤耐性能を有する遺伝子の発現を確認するため、薬剤添加を行った。薬剤耐性株の選択のためには、Ｎｅｏｍｙｃｉｎ（Ｎａｃａｌａｉ社）、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社ＨｙｇｒｏＧｏｌｄ）をＮｅｏｍｙｃｉｎを用いた。一過性発現であるため、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎを３００μｇ／ｍｌと１０００μｇ／ｍｌで条件検討を行い、一日で生存する細胞（薬剤耐性遺伝子が発現された細胞）と死滅する細胞との見分けがつく程度の薬剤濃度を決定した。
（３）結果
発現ベクターｐＲＧ及びｐＲＧｉｎｖを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、標的遺伝子発現の結果を図７に示す。順向き逆向きいずれにおいても視認できる程度の発現が確認された。
(1) Construction of pRG and pRGinv (expression vector having two types of expression units)
pRG and pRGinv use two types of genes, GFP and DsRed, to produce expression units consisting of T7 promoter-Kozak-EGFP-A30-T7 terminator and T7 promoter-Kozak-DsRed-A30-T7 terminator, respectively. It was constructed in the same way as described above in the forward or reverse direction.
In the vector construction, specifically, 5′-side primer 5′-AAAGTCGCACTATAATACGACTCACTATAGGGAGCCCACCATGGCCTCTCTCCG-3 ′ (SEQ ID NO: 37) and 3′-side primer 5′-AAAGGATCTGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT PCR was performed under the same conditions as in Example 1-1 (1-1), amplified as a T7 promoter-Kozak-DsRed-A30-T7 terminator fragment, digested with SalI and BamHI, and then blunted. 1-1) Inserted into the smoothed SalI site of the prepared plasmid pPyT7EGGFPA30t I entered.
A schematic diagram of the constructed plasmid is shown in FIG.
(2) Introduction into cells, expression of the EGFP gene, and confirmation of expression were performed in the same manner as in Example 2.
In addition, in the expression confirmation, a drug was added in order to confirm the expression of a gene having drug resistance. For the selection of drug-resistant strains, Neomycin was used as Neomycin (Nacalai) and Hygromycin (Invivogen Hygro Gold). Because of transient expression, the condition of Hygromycin at 300 μg / ml and 1000 μg / ml is examined, so that it is possible to distinguish between cells that survive in a day (cells that express drug resistance genes) and cells that die. Drug concentration was determined.
(3) Results FIG. 7 shows the results of target gene expression after introducing the expression vectors pRG and pRGinv into the cell BZnTR1. It was confirmed that it was visible in both the forward and reverse directions.
（１）ｐＧＲＮＨの構築（４種の発現単位を有する発現ベクター）
４種の標的遺伝子を発現させるため、ＥＧＦＰ，ＤｅＲｅｄ，Ｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子），Ｈｐｈ（ハイグロマイシン耐性遺伝子）について、それぞれＴ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ｃＤＮＡ（ＥＧＦＰ，ＤｅＲｅｄ，Ｎｅｏ，Ｈｐｈ）−Ａ３０−Ｔ７ターミネーターからなる発現単位を作製し、同一ベクターの同一鎖上に配置させ発現ベクターを構築した。
構築したプラスミドの概略図を図８に示す。
発現ベクターｐＧＲＮＨは、ＥＧＦＰ、ＤｅＲｅｄ、Ｎｅｏ、ＨｐｈのそれぞれをＰＣＲでＴ７プロモーター−Ｋｏｚａｋ−ｃＤＮＡ−Ａ３０−Ｔ７ ターミネーターの順に配置したものを１つの発現単位として構築し、これら４つを連結しｐＢＲ３２２プラスミドに挿入した。ＥＧＦＰの配列は配列番号１５、ＤｓＲｅｄの配列は配列番号３９、Ｎｅｏの配列は配列番号４０、Ｈｐｈの配列は配列番号４１の配列を使用した。
具体的には、制限酵素ＳｆｉＩサイトを５’末端に配したプライマー（Ｔ７プロモーターあるいはＴ７ターミネーターを直下に配する）を用いて増幅し（テンプレートは市販のベクターを使用した）、ＳｆｉＩで切断後、電気泳動を行って目的遺伝子を回収した。回収した目的遺伝子量は、電気泳動を行い、そのエチジウムブロマイドによる蛍光強度から濃度を算出することにより確認した。モル比にして１：１：１：１となるように、ＥＧＦＰ，ＤｅＲｅｄ，Ｎｅｏ，及びＨｐｈの４断片を混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで一晩連結反応を行った。ここで、ＳｆｉＩサイトの切断配列は任意の３塩基ＮＮＮであり、隣接させたい断片のＳｆｉＩサイトのＮＮＮと相補的なＮＮＮとすれば設計通りの断片同士が結合することとなり、４断片を設計通り配置することができる。
本実施例では、４断片について以下のプライマーで増幅することにより、各ＳｆｉＩサイトを作製した。
ＥＧＦＰ
ＡＴＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ（配列番号４２）
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧ（配列番号４３）
ＤｓＲｅｄ
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ（配列番号４４）
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＴＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧ（配列番号４５）
Ｎｅｏ
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ（配列番号４６）
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＴＴＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧ（配列番号４７）
Ｈｐｈ
ＡＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＧＧＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ（配列番号４８）
ＡＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧ（配列番号４９）
上記４つの増幅断片をＳｆｉＩで消化し、ゲル回収の後ライゲーションすると４断片が設計通りの順番で結合したものができた。
また、ＧＦＰとＨｐｈの片側については、プルーフリーディング活性のあるＰｆｘで増幅し、平滑末端とした。この末端にアダプター（５’−ＴＣＡＴＡＣＣＧＣＧＡＣＡＣＴ−３’（配列番号５０）と５’−ＡＧＴＧＴＣＧＣＧＧＴＡＴ−３’（配列番号５１）をアニーリング）を連結し、電気泳動後ゲル回収を行った。これをｐＢＲ３２２にクローニングした。
(1) Construction of pGRNH (expression vector having four expression units)
In order to express four types of target genes, TGFP promoter-Kozak-cDNA (EGFP, DeRed, Neo, Hph) -A30-T7 for EGFP, DeRed, Neo (neomycin resistance gene) and Hph (hygromycin resistance gene), respectively. An expression unit consisting of a terminator was prepared and placed on the same chain of the same vector to construct an expression vector.
A schematic diagram of the constructed plasmid is shown in FIG.
The expression vector pGRNH is constructed by arranging EGFP, DeRed, Neo, and Hph by PCR in the order of T7 promoter-Kozak-cDNA-A30-T7 terminator as one expression unit, and connecting these four to the pBR322 plasmid Inserted into. The sequence of EGFP was SEQ ID NO: 15, the sequence of DsRed was SEQ ID NO: 39, the sequence of Neo was SEQ ID NO: 40, and the sequence of Hph was SEQ ID NO: 41.
Specifically, amplification was performed using a primer having a restriction enzyme SfiI site at the 5 ′ end (a T7 promoter or T7 terminator was placed directly below) (a commercially available vector was used as the template), and after cleavage with SfiI, The target gene was recovered by electrophoresis. The amount of the target gene recovered was confirmed by performing electrophoresis and calculating the concentration from the fluorescence intensity of the ethidium bromide. Four fragments of EGFP, DeRed, Neo, and Hph were mixed so that the molar ratio was 1: 1: 1: 1, and ligation reaction was performed overnight with T4 DNA ligase. Here, the cleavage sequence of the SfiI site is an arbitrary 3 base NNN, and if the NNN complementary to the NNN of the SfiI site of the fragment to be adjacent is used, the fragments as designed will be bound together, and 4 fragments will be bound as designed. Can be arranged.
In this example, each SfiI site was prepared by amplifying four fragments with the following primers.
EGFP
ATCCAGTGGCTAATACGACTCAC (SEQ ID NO: 42)
AAAAGGCCATTCTGGCCCGACAAACAACAG (SEQ ID NO: 43)
DsRed
AAAAGGCCCAAATGGCCTAATACGACTCAC (SEQ ID NO: 44)
AAAAGGGCCATCTTGGCCCGACAAACAACAG (SEQ ID NO: 45)
Neo
AAAAGGCCAAGATGGGCCTAATACGACTCAC (SEQ ID NO: 46)
AAAAGGCCACTTTGGCCCCGACAAACAACAG (SEQ ID NO: 47)
Hph
AAAAGGCCAAAGTGGGCCTAATACGACTCAC (SEQ ID NO: 48)
ATCCACACTGCCCGACAAACAACAG (SEQ ID NO: 49)
The above four amplified fragments were digested with SfiI and ligated after gel recovery. As a result, 4 fragments were combined in the designed order.
In addition, one side of GFP and Hph was amplified with Pfx having proofreading activity to obtain blunt ends. An adapter (5′-TCATACCGCGCACT-3 ′ (SEQ ID NO: 50) and 5′-AGGTCGCGGTAT-3 ′ (SEQ ID NO: 51) was annealed) was connected to this end, and gel recovery was performed after electrophoresis. This was cloned into pBR322.
（２）細胞への導入、ＥＧＦＰ遺伝子の発現については、実施例２と同様の方法で行った。発現確認については、実施例４と同様の方法で行った。 (2) Introduction into cells and expression of the EGFP gene were performed in the same manner as in Example 2. The expression was confirmed by the same method as in Example 4.
（３）結果
発現ベクターｐＧＲＮＨを細胞ＢＺｎＴＲ１へ導入後、標的遺伝子発現の結果を図９に示す。ＧＦＰ，ＤｓＲｅｄ，Ｎｅｏ，Ｈｐｈを同一ベクターにクローニングしたｐＧＲＮＨを用いて、これをＢＺｎＴＲ１へ導入した結果、一日後に蛍光が確認できた（図９上）。また、薬剤耐性能試験の結果、Ｎｅｏｍｙｃｉｎ が１，５００（μｇ／ｍｌ）、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎが３００（μｇ／ｍｌ）で一日後に薬剤感受性細胞が死滅することがわかった。ｐＧＲＮＨを導入したＢＺｎＴＲ１について、この濃度で薬剤添加後一日において、両薬剤に耐性を示すことがわかった（図９下）。
(3) Results FIG. 9 shows the results of target gene expression after the expression vector pGRNH was introduced into the cell BZnTR1. Using pGRNH obtained by cloning GFP, DsRed, Neo, and Hph into the same vector, this was introduced into BZnTR1, and as a result, fluorescence was confirmed one day later (upper FIG. 9). Further, as a result of the drug resistance test, it was found that drug-sensitive cells die after one day when Neomycin is 1,500 (μg / ml) and Hygromycin is 300 (μg / ml). About BZnTR1 which introduce | transduced pGRNH, it turned out that it shows tolerance to both chemical | medical agents on the day after the chemical | medical agent addition at this density | concentration (FIG. 9 lower).
本実施例においては、直列の４種遺伝子を発現させることが可能であることが示された。このことから原理的には所望の数の遺伝子を同時に発現させることができることが示された。つまり、これまではｉ）転写干渉ｉｉ）長鎖反復配列によるプラスミド構築の困難さの、いずれかの支障により多因子同時発現は不可能であった。本発明により２及び４個の発現単位で転写干渉を受けず（複数個つなげても転写干渉はないと推測できる）、且つ反復配列が５０ベース以下に抑制できた（経験上、反復配列として懸念される長さではない）ことから、複数個の発現単位からの発現を阻害する原因を全て取り除けたといえる。 In this example, it was shown that it is possible to express four types of genes in series. This indicates that in principle, a desired number of genes can be expressed simultaneously. In other words, so far, i) transcription interference ii) difficulty in constructing a plasmid with a long repetitive sequence, and thus, multifactor co-expression has been impossible due to any hindrance. According to the present invention, 2 and 4 expression units did not receive transcription interference (it can be assumed that there is no transcription interference even if a plurality of expression units are connected), and the repetitive sequence could be suppressed to 50 bases or less (experience as a repetitive sequence is a concern) Therefore, it can be said that all the causes that inhibit the expression from a plurality of expression units have been removed.
本実施例の結果から、２以上の発現単位を同一ベクター上に搭載すると発現効率が極端に落ちる転写干渉現象の原因は、転写が多数の基本転写因子の協調的機能によるものであることにあると考えられた。すなわち多数の基本転写因子の協調的機能による転写の場合、その多数の構成因子のうちどの一つが機能阻害を受けても転写できなくなると考えられた。つまり、同様の働きをするタンパク質が競合的に働くことにより、転写機能の阻害の影響を受けやすくなっていると考えられる。例えば、１０因子からなる転写系を考えると、それぞれの因子が競合的阻害をうける確率が０．２であるとして、そのどれもが阻害を受けない（転写される）確率は０．８の１０乗、すなわち０．１１程度になる。一方、１因子からなる転写系だと、たとえ競合阻害を受ける確率が０．３だったとしても、転写される確率は０．７となる。従って、極めて単純なポリメラーゼとプロモーターから成る転写系、具体的には１分子のポリメラーゼにより制御を受ける転写系を用いることで、転写干渉を回避できることが示された。 From the results of this Example, the cause of the transcription interference phenomenon in which the expression efficiency is extremely lowered when two or more expression units are mounted on the same vector is that the transcription is due to the cooperative function of many basic transcription factors. It was considered. In other words, in the case of transcription by the cooperative function of a large number of basic transcription factors, it was thought that transcription could not be performed even if any one of the large number of component factors was inhibited by the function. That is, it is considered that a protein having a similar function is competitively susceptible to the influence of the transcription function inhibition. For example, when considering a transcription system consisting of 10 factors, the probability that each factor will be competitively inhibited is 0.2, and the probability that none of them will be inhibited (transcribed) is 10 of 10. The power, that is, about 0.11. On the other hand, in a transcription system consisting of one factor, the probability of transcription is 0.7 even if the probability of competitive inhibition is 0.3. Therefore, it was shown that transcription interference can be avoided by using a very simple transcription system comprising a polymerase and a promoter, specifically, a transcription system controlled by one molecule of polymerase.
以上のことから、本願発明に使用されるＲＮＡポリメラーゼは、一種類の分子で各プロモーターからの転写が可能である転写系であれば転写干渉を起こさないことが示された。一般に、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６のポリメラーゼは、それぞれ特異的なプロモーター領域に結合し、１分子のポリメラーゼによって転写調節を担うものと考えられている（Ｊｏｎaｔｈaｎ Ｆｉｎｎ，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎaｌ ｅｘｐｒｅｓｓ aｒｔｉｃｌｅ １０．１０９６／ｆｊ．０４−２７６９ｆｊｅ Ｊaｎ． ２６，２００５）。ここではＴ７系を用いたが、同じく一分子のＲＮＡポリメラーゼで転写できるＴ３系やＳＰ６系（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １９：６０８−１０， ２００５）でも同様の効果が得られると考えられる。 From the above, it was shown that the RNA polymerase used in the present invention does not cause transcription interference if it is a transcription system capable of transcription from each promoter with one kind of molecule. In general, T7, T3, and SP6 polymerases are each considered to bind to a specific promoter region and be responsible for transcriptional regulation by one molecule of polymerase (Jonathan Finn, The FASEB Journal express array 10.1096 / fj.04-2769 fje Jan. 26, 2005). Although the T7 system was used here, it is considered that the same effect can be obtained with the T3 system and the SP6 system (Finn et al., FASEB J. 19: 608-10, 2005) that can also be transcribed with one molecule of RNA polymerase. .
また、本願の実施例ではＥＳ細胞を使用したが、ＥＳ細胞は、外来のプロモーターを抑制する強い活性をもち、限られたハウスキーピング遺伝子プロモーターが使用できるのみであること、高速で増殖するため翻訳産物が拡散するのが速く、転写翻訳の効果を得られにくいこと、高速増殖と多能性に起因する高い毒性（あるいは分化誘導刺激）感受性により、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ分子が毒性（あるいはクロマチン状態や細胞の性質になんらかの影響）を示せばたちまち細胞は死滅（あるいは分化）することが知られている。従って、本発明のベクター又は方法は、これらの厳しい条件を有するＥＳ細胞において転写翻訳が可能な系であることから、他の全ての細胞においても使用できるものである。 In addition, although ES cells were used in the examples of the present application, ES cells have a strong activity of suppressing foreign promoters and can only use a limited housekeeping gene promoter. T7 RNA polymerase molecules are toxic (or chromatin or cellular) due to the rapid diffusion of the product, difficulty in obtaining transcription and translation effects, and high toxicity (or differentiation-inducing stimulation) susceptibility due to rapid proliferation and pluripotency. It is known that cells will die (or differentiate) as soon as they show some influence on their properties. Therefore, since the vector or method of the present invention is a system capable of transcription and translation in ES cells having these severe conditions, it can be used in all other cells.
本発明の発現ベクターを用いれば、１種のベクターを細胞に導入させることによって、複数の標的遺伝子を効率よく発現させることが求められる形質転換（例えばｉＰＳ細胞樹立）に利用することができる。 The expression vector of the present invention can be used for transformation (for example, iPS cell establishment) required to efficiently express a plurality of target genes by introducing one kind of vector into a cell.
Claims (11)
A method for producing a multipotent cell comprising a step of introducing the expression vector according to any one of claims 1 to 6 into a cell.
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