JP2010081894A - METHOD FOR ASSAYING ACETYL-CoA CARBOXYLASE ACTIVITY, AND SCREENING METHOD USING THE FORMER METHOD - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法に関し、より詳細には、本発明は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成するＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を発生させ、次いで当該過酸化水素を定量することを特徴とするアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring the activity of acetyl-CoA carboxylase, and more particularly, the present invention relates to peroxidation of ADP produced by an enzymatic reaction of acetyl-CoA carboxylase using pyruvate kinase and pyruvate oxidase. The present invention relates to a method for measuring the activity of acetyl-CoA carboxylase, characterized by generating hydrogen and then quantifying the hydrogen peroxide.
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）は、次に示す反応式により、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換すると同時に、ＡＴＰからＡＤＰ及びリン酸に変化させる酵素である。
ビオチン酵素＋ＨＣＯ３ −＋ＡＴＰ → −ＣＯ２−ビオチン酵素＋ＡＤＰ＋リン酸
−ＣＯ２−ビオチン酵素＋アセチル−ＣｏＡ → ビオチン酵素＋マロニル−ＣｏＡ
全体としては次の反応式となる。
ＨＣＯ３ −＋ＡＴＰ＋アセチル−ＣｏＡ → ＡＤＰ＋リン酸＋マロニル−ＣｏＡ
Acetyl-CoA carboxylase (ACC) is an enzyme that converts acetyl-CoA to malonyl-CoA and at the same time changes from ATP to ADP and phosphate according to the following reaction formula.
Biotin Enzyme + HCO 3 - + ATP → - CO 2 - biotin enzyme + ADP + phosphate
- CO 2 - biotin enzyme + Acetyl-CoA → biotin enzyme + malonyl-CoA
As a whole, the following reaction formula is obtained.
HCO 3 − + ATP + acetyl-CoA → ADP + phosphate + malonyl-CoA
ＡＣＣの産物であるマロニル−ＣｏＡは、脂肪酸の生合成及び炭素鎖延長による長鎖脂肪酸合成における前駆体であり、ＡＣＣは脂肪酸の生合成の律速酵素と考えられている。また、細胞内にＡＣＣの産物であるマロニル−ＣｏＡが大量に存在する場合、カルニチンパルミチン酸転移酵素Ｉ（ＣＰＴ−Ｉ）を阻害して脂肪酸のミトコンドリアへの輸送が阻害され、脂肪酸酸化が抑制される。ＡＣＣを欠損したマウスは脂肪酸の酸化が高レベルになり、体脂肪と体重の低下が見られることより、ＡＣＣの阻害剤は抗肥満薬の候補となると考えられている（特許文献１及び２参照）。また、ＡＣＣを活性化させて細胞内に大量のマロニル−ＣｏＡを生成させることにより、細胞内のＣｏＡを低下させ癌細胞を死滅させることも報告されている（特許文献３参照）。 Malonyl-CoA, which is a product of ACC, is a precursor in fatty acid biosynthesis and long-chain fatty acid synthesis by carbon chain extension, and ACC is considered to be a rate-limiting enzyme in fatty acid biosynthesis. In addition, when a large amount of ACC product malonyl-CoA is present in the cell, carnitine palmitate transferase I (CPT-I) is inhibited and fatty acid transport to mitochondria is inhibited, and fatty acid oxidation is suppressed. The Mice lacking ACC are considered to be inhibitors of ACC as candidates for anti-obesity drugs because of high levels of fatty acid oxidation and decreased body fat and body weight (see Patent Documents 1 and 2). ). It has also been reported that ACC is activated to produce a large amount of malonyl-CoA in the cell, thereby reducing the CoA in the cell and killing the cancer cell (see Patent Document 3).
このように、ＡＣＣは脂肪酸の代謝や分解をコントロールする重要な役割を持ち、サブタイプとしてＡＣＣ１及びＡＣＣ２が知られている。ＡＣＣ１は、肝臓や脂肪組織に多く発現し、主に脂質合成に関わる組織に存在する。ＡＣＣ２は、心臓や骨格筋に多く発現し、主に脂肪酸のβ酸化に関わる組織に存在する。
ＡＣＣ１やＡＣＣ２の阻害により、マロニル−ＣｏＡレベルが低下することにより、肝臓などの脂肪組織における長鎖脂肪酸合成が抑制され、骨格筋などにおける脂肪酸β酸化が亢進され、脂肪酸の利用の増加が促される。
したがって、ＡＣＣ１又はＡＣＣ２の活性を阻害するＡＣＣ阻害剤は、メタボリックシンドローム、高脂血症、肥満症、高血圧症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症と関連する心血管疾患などの予防及び治療に極めて有用であると考えられている。また、ＡＣＣの活性促進剤は、抗癌剤への利用も検討されている（特許文献３参照）。
Thus, ACC has an important role in controlling fatty acid metabolism and degradation, and ACC1 and ACC2 are known as subtypes. ACC1 is highly expressed in the liver and adipose tissue, and is present mainly in tissues involved in lipid synthesis. ACC2 is abundantly expressed in the heart and skeletal muscle and is mainly present in tissues involved in β-oxidation of fatty acids.
Inhibition of ACC1 and ACC2 reduces malonyl-CoA levels, thereby suppressing long-chain fatty acid synthesis in adipose tissues such as the liver, enhancing fatty acid β oxidation in skeletal muscles, etc., and promoting increased use of fatty acids. .
Therefore, an ACC inhibitor that inhibits the activity of ACC1 or ACC2 is extremely useful for the prevention and treatment of metabolic syndrome, hyperlipidemia, obesity, hypertension, diabetes, cardiovascular disease associated with atherosclerosis, etc. It is considered to be. In addition, the use of an ACC activity promoter as an anticancer agent has been studied (see Patent Document 3).
このために、ＡＣＣの活性を測定するための多数の測定系が提案されてきている。提案されている測定系としては、（１）放射能標識体を用いる方法、（２）リン酸を測定する方法、（３）ＡＤＰを測定する方法、及び（４）マロニルＣｏＡを測定する方法などが報告されている。
放射能標識体を用いる方法としては、炭素１４で標識された炭酸塩を用いて生成したマロニルＣｏＡの放射能を測定することによりＡＣＣの活性測定を測定する方法がある（非特許文献１参照）。また、炭素１４で放射能標識したアセチルＣｏＡを用いて生成するマロニルＣｏＡの放射能を測定する方法（特許文献１参照）、生成したマロニルＣｏＡを、さらに脂肪酸合成酵素を用いて生成したパルミチン酸を測定することによりＡＣＣの活性測定を測定する方法がある（特許文献４参照）。
これらの方法は、放射能標識体を用いることにより、感度の高い測定が可能ではあるが、特殊な施設でないと測定できないことや、廃棄物に対しても環境汚染の問題が生じるなどの大きな問題がある。
リン酸を測定する方法としては、マラカイドグリーン試薬を用いて生成したリン酸を測定することによりＡＣＣの活性測定を行う方法（特許文献２参照）や、生成したリン酸をマルトースホスホリラーゼ、グルコースオキシダーゼ、パーオキシダーゼをもちいてレゾルフィンの生成量を測定することにより、ＡＣＣの活性測定を行う方法（非特許文献２参照）がある。この方法は放射性化合物を使用しないメリットはある。しかし、ＡＣＣ阻害剤のスクリーニングを行う方法として、リン酸を測定するよりもＡＤＰを測定した方がＡＣＣに対してより選択性が高いことが報告されており（非特許文献２参照）、測定感度に大きな問題があった。
For this reason, many measurement systems for measuring the activity of ACC have been proposed. Proposed measurement systems include (1) a method using a radioactive label, (2) a method for measuring phosphoric acid, (3) a method for measuring ADP, and (4) a method for measuring malonyl CoA. Has been reported.
As a method using a radiolabel, there is a method of measuring the activity of ACC by measuring the radioactivity of malonyl CoA produced using a carbonate labeled with carbon 14 (see Non-Patent Document 1). . Further, a method for measuring the radioactivity of malonyl CoA produced using acetyl CoA radiolabeled with carbon 14 (see Patent Document 1), the produced malonyl CoA, and further, palmitic acid produced using a fatty acid synthase There is a method of measuring the activity of ACC by measuring (see Patent Document 4).
These methods can be measured with high sensitivity by using radiolabels, but they cannot be measured without a special facility, and there are major problems such as environmental pollution problems even with waste. There is.
As a method for measuring phosphoric acid, a method for measuring the activity of ACC by measuring phosphoric acid produced using a malachide green reagent (see Patent Document 2), or the produced phosphoric acid is maltose phosphorylase, glucose oxidase. There is a method for measuring the activity of ACC by measuring the amount of resorufin produced using peroxidase (see Non-Patent Document 2). This method has the advantage of not using radioactive compounds. However, as a method for screening for ACC inhibitors, it has been reported that measuring ADP has higher selectivity for ACC than measuring phosphate (see Non-Patent Document 2). There was a big problem.
ＡＤＰを測定する方法としては、生成したＡＤＰと蛍光標識したＡＤＰ抗体（Alexa-633）とを抗原抗体反応により結合させると、みかけ上の分子量が大きくなり、蛍光偏光が増大する。この蛍光偏光を測定することによりＡＣＣの活性測定を行う方法（非特許文献２参照）がある。この方法は、前記したリン酸を測定する方法に比べれば感度は高いが、ＡＤＰ抗体の特性としてＡＴＰが約１００分の１の交叉性を持つため、ＡＤＰの生成量が少ない場合には測定誤差が大きくなるだけでなく、特殊な蛍光偏光測定装置が必要とされるので、簡便な測定方法ではない。また、次の反応式（１）〜（３）により、生成したＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼ（下記反応式（２）参照）、乳酸脱水素酵素を用いて（下記反応式（３）参照）ＮＡＤＨの減少量を測定することにより、ＡＣＣの活性測定を行う方法（非特許文献３参照）がある。
ＨＣＯ３ − ＋ ＡＴＰ ＋ アセチル−ＣｏＡ
→ ＡＤＰ ＋ リン酸 ＋ マロニル−ＣｏＡ （１）
ホスホエノールピルベート ＋ ＡＤＰ → ピルベート ＋ ＡＴＰ （２）
ピルベート ＋ ＮＡＤＨ ＋ Ｈ＋ → 乳酸 ＋ ＮＡＤ＋ （３）
ＮＡＤＨは３４０ｎｍに吸収があり、これがＮＡＤ＋に変化することにより吸収が減少するため、３４０ｎｍにおける吸光度を測定する。この方法は放射性化合物を使用しないメリットはあるが、測定感度が低い。
マロニルＣｏＡを測定する方法としては、下記の反応式（１）、（４）、及び（５）により、まず反応式（１）で生成したマロニルＣｏＡを脂肪酸合成酵素により脂肪酸とＣｏＡにする（下記反応式（４）参照）。次いで、ＣｏＡを蛍光試薬（ＣＰＭ）により測定することによりＡＣＣの活性測定を行う方法（非特許文献４参照）がある。
ＨＣＯ３ − ＋ ＡＴＰ ＋ アセチル−ＣｏＡ
→ ＡＤＰ ＋ リン酸 ＋ マロニル−ＣｏＡ （１）
マロニル−ＣｏＡ ＋ アセチル−ＣｏＡ ＋ ＡＴＰ ＋ ＮＡＤＰＨ
→ パルミチン酸 ＋ ＡＤＰ ＋ ＮＡＤＨ ＋ ＣｏＡ （４）
ＣｏＡ ＋ ＣＰＭ → ＣｏＡ−ＣＰＭ （５）
ＣｏＡ−ＣＰＭは励起波長４０５ｎｍで励起され、５３０ｎｍの蛍光を発する。
この方法は、脂肪酸合成酵素が市販されていないので、動物臓器又は酵素発現細胞から精製して使用しなければならず、汎用性に乏しい。また、脂肪酸合成酵素に対する影響についても考慮する必要があると思われる。
As a method for measuring ADP, when the produced ADP and a fluorescently labeled ADP antibody (Alexa-633) are bound by an antigen-antibody reaction, the apparent molecular weight increases and the fluorescence polarization increases. There is a method of measuring the activity of ACC by measuring the fluorescence polarization (see Non-Patent Document 2). Although this method is more sensitive than the method for measuring phosphate described above, ATP has a crossover property of about 1/100 as a characteristic of the ADP antibody. Is not only a large measurement method, but also requires a special fluorescence polarization measurement device, which is not a simple measurement method. In addition, according to the following reaction formulas (1) to (3), the produced ADP is converted to pyraminate kinase (see the following reaction formula (2)) and lactate dehydrogenase (see the following reaction formula (3)) NADH. There is a method of measuring the activity of ACC by measuring the amount of decrease (see Non-Patent Document 3).
HCO 3 − + ATP + Acetyl-CoA
→ ADP + phosphoric acid + malonyl-CoA (1)
Phosphoenolpyruvate + ADP → Pyruvate + ATP (2)
Pyruvate + NADH + H + → Lactic acid + NAD + (3)
Since NADH has an absorption at 340 nm and this is changed to NAD + , the absorption is decreased, and the absorbance at 340 nm is measured. Although this method has the merit of not using a radioactive compound, the measurement sensitivity is low.
As a method for measuring malonyl-CoA, first, malonyl-CoA produced in reaction formula (1) is converted into fatty acid and CoA by fatty acid synthase according to the following reaction formulas (1), (4), and (5) (see below). Reaction formula (4) reference). Next, there is a method of measuring the activity of ACC by measuring CoA with a fluorescent reagent (CPM) (see Non-Patent Document 4).
HCO 3 − + ATP + Acetyl-CoA
→ ADP + phosphoric acid + malonyl-CoA (1)
Malonyl-CoA + acetyl-CoA + ATP + NADPH
→ Palmitic acid + ADP + NADH + CoA (4)
CoA + CPM → CoA-CPM (5)
CoA-CPM is excited at an excitation wavelength of 405 nm and emits fluorescence at 530 nm.
In this method, since fatty acid synthase is not commercially available, it must be used after purification from animal organs or enzyme-expressing cells. It is also necessary to consider the effect on fatty acid synthase.
このように、ＡＣＣの阻害活性の測定方法の殆どの場合は、感度の点から放射能標識した化合物を用いた方法によっているが、実施場所が限定されることや環境汚染の点などから放射能を用いない方法が望まれる。
しかし、マラカイドグリーン試薬などを使用してリン酸を測定する方法、ＡＤＰを測定するためにＬＤＨを用いたＵＶ法などの方法は測定感度が低いため多量の酵素が必要であるだけでなく、信頼性に乏しい。また、ＡＣＣ阻害剤のスクリーニングを行う方法としては、リン酸を測定するよりもＡＤＰを測定した方がＡＣＣに対してより選択性が高いことも報告されているが、感度よく簡便に測定できる方法は知られていなかった。
As described above, most of the methods for measuring the inhibitory activity of ACC are based on a method using a radiolabeled compound from the viewpoint of sensitivity, but the radioactivity is limited due to the limited place of implementation and environmental pollution. A method that does not use is desired.
However, the method of measuring phosphoric acid using a malachide green reagent and the like, and the UV method using LDH to measure ADP not only require a large amount of enzyme because of low measurement sensitivity, It is not reliable. In addition, as a method for screening for ACC inhibitors, it has been reported that measuring ADP is more selective for ACC than measuring phosphoric acid, but it is a method that can be easily measured with high sensitivity. Was not known.
本発明は、放射性標識を使用することなく、高感度で簡便にＡＣＣの活性の測定のための新規な測定方法を提供する。また、本発明は、当該測定方法を用いた被検物質のＡＣＣ活性をスクリーニングする方法を提供する。 The present invention provides a novel measurement method for measuring ACC activity with high sensitivity and ease without using a radioactive label. The present invention also provides a method for screening the ACC activity of a test substance using the measurement method.
本発明者らは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）阻害剤などの探索を行うために、高感度で実用性の高いＡＣＣ活性の測定方法の開発を行ってきた。放射性化合物を使用しないＡＣＣ活性の測定方法としては、この酵素反応で生成するマロニル−ＣｏＡやリン酸を測定する方法などが知られているが、いずれも感度の点で満足できるものではなかった。また、ＡＤＰを測定する方法も知られていたが、誤差が大きく感度も十分ではなく、満足できるものではなかった。そこで、本発明者らは、鋭意検討してきた結果、ＡＤＰを蛍光法により測定する方法により高感度でＡＣＣ活性が測定できる新規な方法を見出した。 In order to search for acetyl-CoA carboxylase (ACC) inhibitors and the like, the present inventors have developed a highly sensitive and practical method for measuring ACC activity. As a method for measuring the ACC activity without using a radioactive compound, a method for measuring malonyl-CoA or phosphoric acid produced by this enzyme reaction is known, but none of them is satisfactory in terms of sensitivity. A method for measuring ADP was also known, but it was not satisfactory because the error was large and the sensitivity was not sufficient. Thus, as a result of intensive studies, the present inventors have found a novel method capable of measuring ACC activity with high sensitivity by a method of measuring ADP by a fluorescence method.
即ち、本発明は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成するＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を発生させ、次いで当該過酸化水素を定量することを特徴とするアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法に関する。
また、本発明は、このための測定用キット、及びこの方法を用いたスクリーニング方法に関する。
That is, the present invention relates to a method for measuring the activity of acetyl-CoA carboxylase, wherein ADP produced by the enzymatic reaction of acetyl-CoA carboxylase is generated using hydrogen peroxide pyruvate kinase and pyruvate oxidase, and then the hydrogen peroxide is generated. The present invention relates to a method for measuring the activity of acetyl-CoA carboxylase characterized by quantifying hydrogen peroxide.
The present invention also relates to a measurement kit for this purpose and a screening method using this method.
本発明をさらに詳細に説明すれば以下のとおりとなる。
（１）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の活性を測定する方法において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成するＡＤＰを、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を発生させ、次いで当該過酸化水素を定量することを特徴とするアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法。
（２）ピルビン酸オキシダーゼを用いる酵素反応が、リン酸の存在下で行われるものである前記（１）に記載の方法。
（３）リン酸が、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素反応で生成したリン酸である前記（２）に記載の方法。
（４）過酸化水素を定量する方法が、パーオキシダーゼを用いた蛍光試薬を用いる方法である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）蛍光試薬が、アンプレックスレッドであり、パーオキシダーゼとの酵素反応によるレゾルフィンの生成量を測定するものである前記（４）に記載の方法。
（６）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法が、ワンポットで行われる前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが、そのサブタイプである前記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法が、被検物質を含有した測定系で行われる前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを含有していることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれかに記載の測定方法を行うための検査キット。
（１０）被検物質を含有する測定系において前記（１）〜（８）のいずれかに記載のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を測定する方法を行って、当該被検物質のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに対する活性を測定することにより、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに対する活性をスクリーニングする方法。
（１１）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに対する活性の測定が、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性阻害を測定する方法である前記（１０）に記載の方法。
The present invention will be described in more detail as follows.
(1) In the method for measuring the activity of acetyl-CoA carboxylase (ACC), ADP generated by the enzymatic reaction of acetyl-CoA carboxylase is generated with hydrogen peroxide using pyruvate kinase and pyruvate oxidase, A method for measuring the activity of acetyl-CoA carboxylase, which comprises quantifying hydrogen peroxide.
(2) The method according to (1) above, wherein the enzyme reaction using pyruvate oxidase is performed in the presence of phosphoric acid.
(3) The method according to (2) above, wherein the phosphate is a phosphate produced by an enzyme reaction of acetyl-CoA carboxylase.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the method for quantifying hydrogen peroxide is a method using a fluorescent reagent using peroxidase.
(5) The method according to (4) above, wherein the fluorescent reagent is Amplex Red and the amount of resorufin produced by an enzymatic reaction with peroxidase is measured.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the method for measuring the activity of acetyl-CoA carboxylase is performed in one pot.
(7) The method according to any one of (1) to (6), wherein acetyl-CoA carboxylase is a subtype thereof.
(8) The method according to any one of (1) to (7), wherein the method for measuring the activity of acetyl-CoA carboxylase is performed in a measurement system containing a test substance.
(9) A test kit for performing the measurement method according to any one of (1) to (8) above, comprising pyruvate kinase and pyruvate oxidase.
(10) A method for measuring the activity of acetyl-CoA carboxylase according to any one of (1) to (8) above in a measurement system containing a test substance, to the acetyl-CoA carboxylase of the test substance A method of screening for activity against acetyl-CoA carboxylase by measuring activity.
(11) The method according to (10) above, wherein the measurement of activity against acetyl-CoA carboxylase is a method of measuring activity inhibition of acetyl-CoA carboxylase.
本発明は、生成したＡＤＰをピルビン酸キナーゼ、及びピルビン酸オキシダーゼを用いて過酸化水素を発生させ、これを定量する、例えば、パーオキシダーゼを用いてレゾルフィンの生成量を測定することにより、ＡＣＣの活性測定を行うことにより、放射性化合物を全く使用することなく、極めて高感度で、かつ簡便に測定することができる方法を提供する。本発明の方法は、高感度で、高信頼性で、かつ放射性物質による環境汚染も無い安全な方法である。また、本発明のこの方法を使用することにより、簡便で大量に各種の物質のＡＣＣ活性を測定することができ、被検物質をスクリーニングする方法として極めて優れている。さらに、本発明の方法は、ＡＣＣのサブタイプであるＡＣＣ１及びＡＣＣ２のいずれに対しても適用可能であり、いずれのサブタイプも使用することができる。 In the present invention, the produced ADP generates hydrogen peroxide using pyruvate kinase and pyruvate oxidase, and quantifies this, for example, by measuring the production amount of resorufin using peroxidase, By performing activity measurement, the present invention provides a method that can be easily measured with extremely high sensitivity without using any radioactive compound. The method of the present invention is a high-sensitivity, high-reliability, and safe method that is free from environmental pollution by radioactive materials. Moreover, by using this method of the present invention, the ACC activity of various substances can be measured easily and in large quantities, and it is extremely excellent as a method for screening a test substance. Furthermore, the method of the present invention can be applied to both ACC1 and ACC2 which are subtypes of ACC, and any subtype can be used.
本発明の方法におけるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）［ＥＣ ６．４．１．２．］としては、ＡＣＣ１（ＡＣＣ-α、ＡＣＡＣ、ＡＣＡＣＡ、ｔｇｆとしても知られている）と、ＡＣＣ２（ＡＣＣ-β、ＡＣＡＣＢ、ＡＣＣＢ、ＨＡＣＣ２７５としても知られている）のいずれのサブタイプであってもよい。また、その由来は特に制限されないが、入手の容易さや信頼性の観点からヒト又はラット由来のものが好ましい。
本発明の方法におけるピルビン酸キナーゼ［ＥＣ ２．７．１．４０．］としては、哺乳動物の筋肉や心筋などの解糖組織に多く存在するＭ型、肝臓に主として存在するＬ型、脾臓に存在するＳ型、胎生組織に存在するＡ型（又はＫ型）があり、そのいずれでもよいが、好ましくはホスホエノールピルビン酸に親和性が高い活性型が挙げられる。この酵素の安定化のために、グリセロール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、フルクトース−１，６−ビスリン酸などを併用してもよい。
本発明の方法におけるピルビン酸オキシダーゼ［ＥＣ １．２．３．３．］も、いずれのものでも使用できるが、大腸菌から純化されている市販のものが簡便で好ましい。使用に当たっては、比活性を上げるために脂質や界面活性剤を適宜添加して使用してもよい。
Acetyl-CoA carboxylase (ACC) [EC 6.4.1.2. ] Is any subtype of ACC1 (also known as ACC-α, ACAC, ACACA, tgf) and ACC2 (also known as ACC-β, ACACB, ACCB, HACC275) Also good. Moreover, the origin is not particularly limited, but those derived from humans or rats are preferred from the viewpoint of availability and reliability.
Pyruvate kinase in the method of the present invention [EC 2.7.1.40. ] Are M type that is present in a large amount in glycolytic tissues such as muscle and heart muscle of mammals, L type that is mainly present in liver, S type that is present in spleen, and A type (or K type) that is present in embryonic tissue. Any of them may be used, but an active form having high affinity for phosphoenolpyruvate is preferable. In order to stabilize this enzyme, glycerol, dithiothreitol (DTT), fructose-1,6-bisphosphate and the like may be used in combination.
Pyruvate oxidase [EC 1.2.3.3. ] Can be used, but a commercially available product purified from E. coli is simple and preferable. In use, lipids or surfactants may be added as appropriate to increase the specific activity.
本発明における過酸化水素を定量する方法としては、公知の各種の方法を適用することができる。簡便で好ましい方法としては、蛍光試薬を使用した蛍光測定法が挙げられる。好ましい方法としては、例えば、パーオキシダーゼを用いてレゾルフィンの生成量を蛍光により測定する方法が挙げられる。レゾルフィンは励起波長５６０ｎｍで、５９０ｎｍの蛍光を発する。
本発明の方法は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の公知の反応条件下で行うことができる。例えば、ＡＣＣを含有するＡＣＣ溶液、好ましくは脂質を含有しないＢＳＡ、クエン酸カリウム、及びＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液に、被検物質の溶液（ＤＭＳＯ、及びＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液が好ましい。）を加え、３７℃付近で２０〜６０分間、好ましくは約３０分間プレインキュベーションした後、アセチル−ＣｏＡ、ＡＴＰ、及びＮａＨＣＯ３を含有する基質溶液（ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、ＭｇＣｌ２を含むものが好ましい。）を加えて、３７℃付近で３０分〜２時間、好ましくは約１時間反応させることにより行うことができる。
本発明のピルビン酸キナーゼによる反応は、前記したアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の反応生成物を用いて、これにホスホエノールピルビン酸を加えて、３７℃付近で３０分〜２時間、好ましくは約１時間反応させることにより行うことができる。本発明のピルビン酸キナーゼによる反応は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）による反応と同時に行うこともできる。この場合には、ＡＣＣをプレインキュベーションした後にＡＣＣの基質溶液と同時にピルビン酸キナーゼ及びホスホエノールピルビン酸を加えて、３７℃付近で３０分〜２時間、好ましくは約１時間反応させることにより行うことができる。
Various known methods can be applied as a method for quantifying hydrogen peroxide in the present invention. A simple and preferred method is a fluorescence measurement method using a fluorescent reagent. As a preferable method, for example, a method of measuring the amount of resorufin produced by peroxidase by fluorescence is used. Resorufin emits fluorescence at 590 nm with an excitation wavelength of 560 nm.
The method of the present invention can be carried out under the known reaction conditions of acetyl-CoA carboxylase (ACC). For example, the solution of the test substance (DMSO and HEPES (pH 7.5)) is contained in an ACC solution containing ACC, preferably a solution containing BSA not containing lipid, potassium citrate, and HEPES (pH 7.5). Solution is preferred) and preincubation at around 37 ° C. for 20-60 minutes, preferably about 30 minutes, followed by a substrate solution (HEPES (pH 7.5), MgCl 3) containing acetyl-CoA, ATP, and NaHCO 3. 2 is preferable, and the reaction is performed at around 37 ° C. for 30 minutes to 2 hours, preferably about 1 hour.
The reaction with the pyruvate kinase of the present invention is carried out using the above-mentioned reaction product of acetyl-CoA carboxylase (ACC), adding phosphoenolpyruvate to the mixture at around 37 ° C. for 30 minutes to 2 hours, preferably about It can be performed by reacting for 1 hour. The reaction with pyruvate kinase of the present invention can be performed simultaneously with the reaction with acetyl-CoA carboxylase (ACC). In this case, after pre-incubating ACC, pyruvate kinase and phosphoenolpyruvate are added simultaneously with the ACC substrate solution, and the reaction is performed at around 37 ° C. for 30 minutes to 2 hours, preferably about 1 hour. Can do.
本発明のピルビン酸オキシダーゼによる反応は、前記したアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）及びピルビン酸キナーゼの反応生成物を用いて、３７℃付近で３分〜３０分、好ましくは３〜１０分、より好ましくは約５分間反応させることにより行うことができる。ピルビン酸オキシダーゼによる反応の際に、蛍光試薬及びパーオキシダーゼ、例えばＨＲＰ(horseradish peroxidase)を同時に加えておくことにより、同時に酸化反応を行うこともできる。
蛍光測定は公知の各種の方法で行うことができる。レゾルフィンを測定する場合には、例えば、モレキュラーデバイス社製Spectra Max Gemini EMにより励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定することができる。
本発明の方法は、
（１）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）による反応、
（２）ピルビン酸キナーゼによる反応、
（３）ピルビン酸オキシダーゼによる反応、及び、
（４）過酸化水素による反応、
の４段階の反応であるが、これらの反応を同じ反応容器内でワンポットで行うことができる。また、前記したように、（１）の反応と（２）の反応を同時に行い、（３）の反応と（４）の反応を同じ反応容器内で同時に行うこともできる。
The reaction with pyruvate oxidase of the present invention is performed using the above-mentioned reaction product of acetyl-CoA carboxylase (ACC) and pyruvate kinase at 37 ° C. for 3 minutes to 30 minutes, preferably 3 to 10 minutes, more preferably Can be carried out by reacting for about 5 minutes. In the reaction with pyruvate oxidase, a fluorescent reagent and a peroxidase such as HRP (horseradish peroxidase) can be added at the same time to simultaneously perform an oxidation reaction.
The fluorescence measurement can be performed by various known methods. When measuring resorufin, for example, the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 560 nm and a fluorescence wavelength of 590 nm can be measured by Spectra Max Gemini EM manufactured by Molecular Devices.
The method of the present invention comprises:
(1) Reaction with acetyl-CoA carboxylase (ACC),
(2) reaction by pyruvate kinase,
(3) reaction with pyruvate oxidase, and
(4) Reaction with hydrogen peroxide,
These reactions can be carried out in one pot in the same reaction vessel. Further, as described above, the reaction (1) and the reaction (2) can be simultaneously performed, and the reaction (3) and the reaction (4) can be simultaneously performed in the same reaction vessel.
本発明の方法をより詳細に説明するが、以下の説明は本発明を説明するためのものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。
ＡＣＣ阻害剤として公知のＣＰ−６４０１８６（Ｒ体）を使用して試験を行った。ＣＰ−６４０１８６は、非特許文献１やStructure, Vol. 12, 1683-1691(2004)に記載されている化合物であり、次の式、
The method of the present invention will be described in more detail. However, the following description is for explaining the present invention, and the present invention is not limited to the following description.
The test was conducted using CP-640186 (R form) known as an ACC inhibitor. CP-640186 is a compound described in Non-Patent Document 1 and Structure, Vol. 12, 1683-1691 (2004), and has the following formula:
で表される化合物である。
また、これらの試験におけるＡＣＣの１ｍＵは、１分間に１ミリモルのＮＡＤＨからＮＡＤに変化する量、即ち１分間に１ミリモルのＡＤＰを遊離する量とした。
試験に用いたＡＣＣ１は、蔗糖負荷した６匹のラット肝臓より細胞質画分を分離し、単量体アビジンを結合させたアフィニティーカラムにより精製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、分子量２６５Ｋにほぼ単一バンドとして検出された。
試験に用いたＡＣＣ２は、ラットの心臓より細胞質画分を分離し、単量体アビジンを結合させたアフィニティーカラムにより精製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、分子量２８０Ｋに染色バンドが確認された。
It is a compound represented by these.
In addition, 1 mU of ACC in these tests was an amount that changed from 1 mmol of NADH to NAD per minute, that is, an amount that liberates 1 mmol of ADP per minute.
ACC1 used in the test was purified from an affinity column to which monomeric avidin was bound by separating the cytoplasmic fraction from 6 rat livers loaded with sucrose. As a result of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, it was detected as a substantially single band at a molecular weight of 265K.
ACC2 used in the test was purified from an affinity column to which monomeric avidin was bound by separating the cytoplasmic fraction from the rat heart. As a result of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, a stained band was confirmed at a molecular weight of 280K.
比較のために非特許文献２に記載のＡＤＰ測定法（以下、ＵＶ法と略称することがある。）を行った。
まず、ＵＶ法によりＡＣＣ阻害活性を測定するために、ＡＣＣ１を用いて酵素量の設定を行った。０〜５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液を用いて３７℃で１時間反応後、３４０ｎｍで測定した結果を図１に示した。図１の横軸はＡＣＣ１の量（ｍＵ／ｗｅｌｌ）であり、縦軸は３４０ｎｍにおける吸収量を示す。
この結果、０〜２．５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を用いた場合には、ほぼ直線的に減少し、それ以上のＡＣＣ１では一定の値を示した。この結果より、最大反応量の約８０％であるＡＣＣ量２ｍＵ／ｗｅｌｌを用いることにした。
For comparison, the ADP measurement method described in Non-Patent Document 2 (hereinafter sometimes abbreviated as UV method) was performed.
First, in order to measure ACC inhibitory activity by the UV method, an enzyme amount was set using ACC1. FIG. 1 shows the result of measurement at 340 nm after reaction at 37 ° C. for 1 hour using a solution containing 0 to 5 mU / well of ACC1. The horizontal axis in FIG. 1 represents the amount of ACC1 (mU / well), and the vertical axis represents the amount of absorption at 340 nm.
As a result, when ACC1 of 0 to 2.5 mU / well was used, it decreased almost linearly, and in ACC1 higher than that, a constant value was shown. From this result, it was decided to use an ACC amount of 2 mU / well, which is about 80% of the maximum reaction amount.
次に、本発明の方法（以下、蛍光法と略称することがある。）によりＡＣＣ阻害活性を測定するために、ＡＣＣ１を用いて酵素量の設定を行った。０〜１ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液を用いて３７℃で１時間反応した。ピルビン酸測定試薬５０μｌを加え３７℃で５分間反応後、励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した結果を図２に示した。図２の横軸はＡＣＣ１の量（ｍＵ／ｗｅｌｌ）であり、縦軸は５９０ｎｍにおける蛍光強度を示す。
この結果、０〜０．２５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を用いた場合には、ほぼ直線的に増加し、それ以上のＡＣＣ１では緩やかな増加を示した。この結果より、使用するＡＣＣ量は０．２ｍＵ／ｗｅｌｌとした。
Next, in order to measure the ACC inhibitory activity by the method of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as a fluorescence method), the amount of enzyme was set using ACC1. It reacted at 37 degreeC for 1 hour using the solution containing ACC1 of 0-1 mU / well. FIG. 2 shows the result of measuring the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 560 nm and a fluorescence wavelength of 590 nm after adding 50 μl of a pyruvic acid measuring reagent and reacting at 37 ° C. for 5 minutes. The horizontal axis in FIG. 2 represents the amount of ACC1 (mU / well), and the vertical axis represents the fluorescence intensity at 590 nm.
As a result, when ACC1 of 0 to 0.25 mU / well was used, it increased almost linearly, and ACC1 higher than that showed a moderate increase. From this result, the amount of ACC to be used was 0.2 mU / well.
次に、ＵＶ法と蛍光法によるＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ阻害活性を比較した。
ＵＶ法によるＣＰ−６４０１８６の活性測定は、２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液を用いて３７℃で１時間反応した。蛍光法によるＣＰ−６４０１８６の活性測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液を用いて３７℃で１時間反応した。ＣＰ−６４０１８６を添加しない場合のＡＣＣ活性を１００％とした時の各濃度における活性（％）を図３に示した。図３の横軸はＣＰ−６４０１８６の量（μＭ）であり、縦軸は酵素活性の残存率（％）を示す。
この結果、ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ阻害活性をＵＶ法で測定した場合と蛍光法で測定した場合とで比較すると、殆ど同じ阻害曲線となることがわかった。この試験においては、ＵＶ法ではＡＣＣ量が２ｍＵ／ｗｅｌｌであり、本発明の蛍光法ではＡＣＣ量が０．２ｍＵ／ｗｅｌｌであることから、蛍光法はＵＶ法に比較して約１０分の１量のＡＣＣで阻害活性を測定することができることがわかる。
Next, the ACC inhibitory activity of CP-640186 by the UV method and the fluorescence method was compared.
The activity of CP-640186 by the UV method was reacted at 37 ° C. for 1 hour using a solution containing 2 mU / well of ACC1. For the measurement of CP-640186 activity by fluorescence method, reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour using a solution containing ACC1 of 0.2 mU / well. FIG. 3 shows the activity (%) at each concentration when the ACC activity when CP-640186 is not added is defined as 100%. In FIG. 3, the horizontal axis represents the amount of CP-640186 (μM), and the vertical axis represents the residual rate (%) of the enzyme activity.
As a result, it was found that when the ACC inhibitory activity of CP-640186 was measured by the UV method and when measured by the fluorescence method, almost the same inhibition curves were obtained. In this test, since the ACC amount is 2 mU / well in the UV method and the ACC amount is 0.2 mU / well in the fluorescence method of the present invention, the fluorescence method is about 1/10 compared to the UV method. It can be seen that the inhibitory activity can be measured with an amount of ACC.
次に、ＣＰ−６４０１８６によるＡＣＣ１とＡＣＣ２の阻害活性の比較を行った。
ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ１活性の測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのラット肝臓由来ＡＣＣ１を用い本発明の蛍光法により測定した。ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ２活性測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのラット心臓由来ＡＣＣ２を用い本発明の蛍光法により測定した。
ＣＰ−６４０１８６を添加しない場合のＡＣＣ活性を１００％とした時の各濃度における活性（％）を図４に示した。図４の横軸はＣＰ−６４０１８６の量（μＭ）であり、縦軸は酵素活性の残存率（％）を示す。
この結果、ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ１とＡＣＣ２阻害活性を比較すると、殆ど同じ阻害曲線を描くことがわかった。
Next, the inhibitory activity of ACC1 and ACC2 by CP-640186 was compared.
The ACC1 activity of CP-640186 was measured by the fluorescence method of the present invention using ACC1 derived from rat liver of 0.2 mU / well. The ACC2 activity of CP-640186 was measured by the fluorescence method of the present invention using ACC2 derived from rat heart of 0.2 mU / well.
FIG. 4 shows the activity (%) at each concentration when the ACC activity when CP-640186 is not added is defined as 100%. The horizontal axis of FIG. 4 is the amount (μM) of CP-640186, and the vertical axis shows the residual rate (%) of enzyme activity.
As a result, it was found that when ACC1 and ACC2 inhibitory activities of CP-640186 were compared, almost the same inhibition curves were drawn.
これらの結果から、本発明の蛍光法によるＡＣＣ活性の測定では、従来のＵＶ法（非特許文献２参照）に比較して使用する酵素量が約１０分の１とすることができ、極めて高感度での測定が可能となり、本発明の測定法はＡＣＣ阻害薬のスクリーニングを行う場合に有用であると考えられる。 From these results, in the measurement of ACC activity by the fluorescence method of the present invention, the amount of enzyme used can be reduced to about 1/10 compared to the conventional UV method (see Non-Patent Document 2), which is extremely high. Measurement with sensitivity is possible, and the measurement method of the present invention is considered useful when screening for ACC inhibitors.
本発明のスクリーニング方法は、前記してきた本発明の測定方法に準じて、
（１）ＡＣＣ溶液に被検物質溶液を加え、必要によりプレインキュベーションを行った 後、基質溶液を加えて反応させる工程、
（２）次いで、ピルビン酸キナーゼによる反応を行う工程、
（３）ピルビン酸オキシダーゼによる反応を行う工程、
（４）過酸化水素による反応を行う工程、及び、
（５）過酸化水素による定量を行う工程、
からなる。これらの工程のうち（１）〜（４）の反応は、同じ反応容器内でワンポットで行うことができる。また、前記したように、（１）の反応と（２）の反応を同時に行い、（３）の反応と（４）の反応を同じ反応容器内で同時に行うこともできる。
本発明のスクリーニング方法により、被検物質のＡＣＣに対する活性（阻害活性又は亢進活性）を簡便に高感度で行うことができ、メタボリックシンドローム、高脂血症、肥満症、高血圧症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症と関連する心血管疾患などの予防及び治療に極めて有用なＡＣＣ阻害剤や、抗癌剤として期待されているＡＣＣ活性化剤などを、高信頼性で大量に迅速にスクリーニングすることができる。
The screening method of the present invention is based on the measurement method of the present invention described above.
(1) A step of adding a test substance solution to an ACC solution, preincubating if necessary, and then adding a substrate solution to react.
(2) Next, a step of performing a reaction with pyruvate kinase,
(3) a step of performing a reaction with pyruvate oxidase,
(4) a step of reacting with hydrogen peroxide, and
(5) a step of performing determination with hydrogen peroxide,
Consists of. Among these steps, the reactions (1) to (4) can be carried out in one pot in the same reaction vessel. Further, as described above, the reaction (1) and the reaction (2) can be simultaneously performed, and the reaction (3) and the reaction (4) can be simultaneously performed in the same reaction vessel.
According to the screening method of the present invention, the activity (inhibitory activity or enhancement activity) of the test substance against ACC can be easily performed with high sensitivity, metabolic syndrome, hyperlipidemia, obesity, hypertension, diabetes, atherosclerosis. An ACC inhibitor that is extremely useful for the prevention and treatment of cardiovascular diseases associated with arteriosclerosis, an ACC activator that is expected as an anticancer agent, and the like can be rapidly screened in large quantities with high reliability.
また、本発明は、本発明の方法を行うための測定キットを提供するものである。本発明の測定キットは、本発明の測定方法に使用するためのピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを含有していることを特徴とする検査キットである。本発明の検査キットは、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼのほかに、ＡＣＣを含有することが好ましく、これらの酵素は緩衝液などの溶液状態としておくこともできる。さらに、必要に応じて、ピルビン酸キナーゼの基質物質、蛍光試薬、ＨＲＰ(horseradish peroxidase)などのパーオキシダーゼ、及びこれらの溶液とするための溶媒（緩衝液）などを含有していてもよい。 The present invention also provides a measurement kit for performing the method of the present invention. The measurement kit of the present invention is a test kit characterized by containing pyruvate kinase and pyruvate oxidase for use in the measurement method of the present invention. The test kit of the present invention preferably contains ACC in addition to pyruvate kinase and pyruvate oxidase, and these enzymes can be in a solution state such as a buffer solution. Furthermore, it may contain a substrate substance for pyruvate kinase, a fluorescent reagent, a peroxidase such as HRP (horseradish peroxidase), and a solvent (buffer solution) for making these solutions, if necessary.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
１）ＡＣＣ１の調製
ＳＤラット（雄性１５０−２００ｇ）６匹を２日間絶食させた後、高糖食（high sucrose diet (AIN76A)）で３日間飼育した。エーテル麻酔後肝臓を摘出し、冷却したＰＢＳ １０００ｍｌで洗浄した。ホモジネート緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む溶液）５００ｍｌ、及びシグマ社製のプロテアーゼ阻害混合物（protease inhibitor cocktail）５ｍｌを加え、ワーリングブレンダーで１分間、４℃でホモジナイズした。３％ＰＥＧに調製後、２０，０００×ｇ、１５分間４℃で遠心した。上清を５％ＰＥＧに調製後、２０，０００×ｇ、２０分間４℃で遠心した。沈殿物をカラム緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び５％グリセリンを含む溶液）３０ｍｌに溶解した。プロメガ社製のアビジンカラム（SoftLink soft release avidin resin）５ｍｌに吸着させた。カラム緩衝液３００ｍｌを用いて洗浄した。溶出液（２ｍＭビオチンを添加したカラム緩衝液）３０ｍｌを用いてＡＣＣを溶出した。活性画分を膜ろ過装置−Ｕｌｔｒａ−４（分子量画分３０，０００）を用いて濃縮後−８０℃で保存した。
1) Preparation of ACC1 Six SD rats (male 150-200 g) were fasted for 2 days and then bred for 3 days on a high sugar diet (AIN76A). After ether anesthesia, the liver was removed and washed with 1000 ml of cooled PBS. Add 500 ml of homogenate buffer (solution containing 50 mM potassium phosphate (pH 7.5), 10 mM EDTA and 10 mM 2-mercaptoethanol), and 5 ml of protease inhibitor cocktail (Protease inhibitor cocktail) manufactured by Sigma, and use a Waring blender for 1 minute. Homogenized at 4 ° C. After preparing 3% PEG, it was centrifuged at 20,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant was prepared in 5% PEG and then centrifuged at 20,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. The precipitate was dissolved in 30 ml of a column buffer (a solution containing 100 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 0.5 M NaCl and 5% glycerin). It was made to adsorb | suck to 5 ml of avidin column (SoftLink soft release avidin resin) by Promega. Wash with 300 ml column buffer. ACC was eluted using 30 ml of eluate (column buffer added with 2 mM biotin). The active fraction was concentrated using a membrane filtration device-Ultra-4 (molecular weight fraction 30,000) and stored at -80 ° C.
２）ＡＣＣ２の調製
正常食で飼育したＳＤラット（雄性１５０−２００ｇ）１０２匹をエーテル麻酔した。心臓を摘出後冷却したＰＢＳ １，０００ｍｌで洗浄した。ホモジネート緩衝液（２２５ｍＭマンニトール、７５ｍＭショ糖、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液）６００ｍｌ及びシグマ社製のプロテアーゼ阻害混合物（protease inhibitor cocktail）５ｍｌを加え、ワーリングブレンダーで１分間、４℃でホモジナイズした。１，２００×ｇ、１０分間４℃で遠心後上清を更に１２，０００×ｇ、１０分間４℃で遠心した。上清に硫安を加えて５０％飽和に調製した。１２，０００×ｇ、１０分間４℃で遠心して沈殿物を回収した。沈殿物をカラム緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び５％グリセリンを含む溶液）８０ｍｌに溶解した。透析チューブに入れて５００ｍｌのカラム緩衝液で１時間透析した。この操作を５回繰り返して硫安を除去した。プロメガ社製のアビジンカラム（SoftLink soft release avidin resin）５ｍｌに吸着させた。カラム緩衝液３００ｍｌを用いて洗浄した。溶出液（２ｍＭビオチンを添加したカラム緩衝液）３０ｍｌを用いてＡＣＣを溶出した。活性画分を膜ろ過装置−Ｕｌｔｒａ−４（分子量画分３０，０００）を用いて濃縮後−８０℃で保存した。
2) Preparation of ACC2 102 SD rats (male 150-200 g) reared on a normal diet were anesthetized with ether. The heart was removed and washed with 1,000 ml of cooled PBS. Add 600 ml of a homogenate buffer (a solution containing 225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 0.05 mM EDTA) and 5 ml of a protease inhibitor cocktail manufactured by Sigma, using a Waring blender. Homogenized for 1 minute at 4 ° C. After centrifugation at 1,200 × g for 10 minutes at 4 ° C., the supernatant was further centrifuged at 12,000 × g for 10 minutes at 4 ° C. Ammonium sulfate was added to the supernatant to prepare 50% saturation. The precipitate was collected by centrifugation at 12,000 × g for 10 minutes at 4 ° C. The precipitate was dissolved in 80 ml of a column buffer (a solution containing 100 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 0.5 M NaCl, and 5% glycerin). It was put into a dialysis tube and dialyzed against 500 ml of column buffer for 1 hour. This operation was repeated 5 times to remove ammonium sulfate. It was made to adsorb | suck to 5 ml of avidin column (SoftLink soft release avidin resin) by Promega. Wash with 300 ml column buffer. ACC was eluted using 30 ml of eluate (column buffer added with 2 mM biotin). The active fraction was concentrated using a membrane filtration apparatus-Ultra-4 (molecular weight fraction 30,000) and stored at -80 ° C.
本発明のＡＣＣ活性の測定は９６ｗｅｌｌマイクロプレートを用いて行った。ＡＣＣ溶液（０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ、０．７５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ(fatty acid free)、１０ｍＭ クエン酸カリウム、及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液）２５μｌ、及びＣＰ−６４０１８６を含む溶液（０．２５％ＤＭＳＯ及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液で希釈したＣＰ−６４０１８６溶液）２５μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．６６ｍＭ アセチル−ＣｏＡ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．４ｍＭ ホスホエノールピルビン酸、２ｍＭ ＡＴＰ、及び２．２Ｕ／ｗｅｌｌのピルビン酸キナーゼを含む溶液）５０μｌを加え３７℃で１時間反応した。
反応後、ピルビン酸測定試薬（３００μＭ Amplex red（Invitrogen社）、２Ｕ／ｍｌのＨＲＰ(horseradish peroxidase)、及び２Ｕ／ｍｌのピルビン酸オキシダーゼを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ５．８））５０μｌを加え、３７℃で５分間反応させた。
反応後、モレキュラーデバイス社製Spectra Max Gemini EMにより励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
なお、ＡＣＣの１ｍＵは１分間に１ミリモルのＮＡＤＨからＮＡＤに変化する量、即ち１分間に１ミリモルのＡＤＰを遊離する量とした。
The ACC activity of the present invention was measured using a 96-well microplate. ACC solution (solution containing 0.2 mU / well ACC, 0.75 mg / ml BSA (fatty acid free), 10 mM potassium citrate, and 50 mM HEPES (pH 7.5)) 25 μl, and a solution containing CP-640186 25 μl (CP-640186 solution diluted with a solution containing 0.25% DMSO and 50 mM HEPES (pH 7.5)) was added and preincubated at 37 ° C. for 30 minutes. Substrate solution (solution containing 50 mM HEPES (pH 7.5), 0.66 mM acetyl-CoA, 4 mM MgCl 2 , 10 mM NaHCO 3 , 0.4 mM phosphoenolpyruvate, 2 mM ATP, and 2.2 U / well pyruvate kinase 50 μl was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
After the reaction, pyruvic acid measurement reagent (0.05 μM phosphate buffer (pH 5.8) containing 300 μM Amplex red (Invitrogen), 2 U / ml HRP (horseradish peroxidase), and 2 U / ml pyruvate oxidase)) 50 μl was added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes.
After the reaction, the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 560 nm and a fluorescence wavelength of 590 nm was measured by Spectra Max Gemini EM manufactured by Molecular Devices.
In addition, 1 mU of ACC was an amount that changed from 1 mmol of NADH to NAD per minute, that is, an amount that liberates 1 mmol of ADP per minute.
比較例１ ＵＶ法による測定
ＵＶ法によるＡＣＣ活性の測定は９６ｗｅｌｌマイクロプレートを用いて行った。ＡＣＣ溶液（２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ、０．７５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ(fatty acid free)、１０ｍＭ クエン酸カリウム、及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液）５０μｌ及びＣＰ−６４０１８６溶液（０．２５％ＤＭＳＯ及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む溶液で希釈したＣＰ−６４０１８６溶液）５０μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．６６ｍＭ アセチル−ＣｏＡ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．４ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ、２．２Ｕ／ｗｅｌｌのピルビン酸キナーゼ、及び４．６Ｕ／ｗｅｌｌのＬＤＨ(lactate dehydrogenase)を含む溶液）１００μｌを加え３７℃で１時間反応した。
反応後、モレキュラーデバイス社製Versa Maxにより波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
なお、ＡＣＣの１ｍＵは１分間に１ミリモルのＮＡＤＨからＮＡＤに変化する量、即ち１分間に１ミリモルのＡＤＰを遊離する量とした。
Comparative Example 1 Measurement by UV Method Measurement of ACC activity by UV method was performed using a 96-well microplate. 50 μl of ACC solution (solution containing 2 mU / well ACC, 0.75 mg / ml fatty acid free (BSA), 10 mM potassium citrate, and 50 mM HEPES (pH 7.5)) and CP-640186 solution (0.25%) 50 μl of CP-640186 solution diluted with a solution containing DMSO and 50 mM HEPES (pH 7.5) was added, and preincubated at 37 ° C. for 30 minutes. Substrate solution (50 mM HEPES (pH 7.5), 0.66 mM acetyl-CoA, 4 mM MgCl 2 , 25 mM NaHCO 3 , 1 mM phosphoenolpyruvate, 0.4 mM NADH, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 2.2 U / well 100 μl of a solution containing pyruvate kinase and 4.6 U / well of LDH (lactate dehydrogenase) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
After the reaction, absorbance at a wavelength of 340 nm was measured by Versa Max manufactured by Molecular Devices.
In addition, 1 mU of ACC was an amount that changed from 1 mmol of NADH to NAD per minute, that is, an amount that liberates 1 mmol of ADP per minute.
本発明の蛍光法における酵素量の設定
本発明の蛍光法によりＡＣＣ阻害活性を測定するために、ＡＣＣ１を用いて酵素量の設定を行った。
０〜１ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液２５μｌ及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）２５μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液５０μｌを加え３７℃で１時間反応した。ピルビン酸測定試薬５０μｌを加え３７℃で５分間反応後、励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
結果を図２に示す。０〜０．２５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を用いた場合には、ほぼ直線的に増加し、それ以上のＡＣＣ１では緩やかな増加を示した。この結果より、使用するＡＣＣ量は０．２ｍＵ／ｗｅｌｌとした。
Setting of enzyme amount in the fluorescence method of the present invention In order to measure the ACC inhibitory activity by the fluorescence method of the present invention, the enzyme amount was set using ACC1.
25 μl of a solution containing 0 to 1 mU / well of ACC1 and 25 μl of 50 mM HEPES (pH 7.5) were added and preincubated at 37 ° C. for 30 minutes. 50 μl of the substrate solution was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After adding 50 μl of a pyruvic acid measuring reagent and reacting at 37 ° C. for 5 minutes, the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 560 nm and a fluorescence wavelength of 590 nm was measured.
The results are shown in FIG. When ACC1 of 0 to 0.25 mU / well was used, it increased almost linearly, and ACC1 higher than that showed a moderate increase. From this result, the amount of ACC to be used was 0.2 mU / well.
比較例２ ＵＶ法における酵素量の設定
ＵＶ法によりＡＣＣ阻害活性を測定するために、ＡＣＣ１を用いて酵素量の設定を行った。
０〜５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液５０μｌ及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）５０μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液１００μｌを加え３７℃で１時間反応後、３４０ｎｍで測定した。
結果を図１に示す。０〜２．５ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を用いた場合には、ほぼ直線的に減少し、それ以上のＡＣＣ１では一定の値を示した。この結果より、最大反応量の約８０％であるＡＣＣ量２ｍＵ／ｗｅｌｌを用いることにした。
Comparative Example 2 Setting of enzyme amount in UV method In order to measure ACC inhibitory activity by UV method, the amount of enzyme was set using ACC1.
50 μl of a solution containing 0 to 5 mU / well of ACC1 and 50 μl of 50 mM HEPES (pH 7.5) were added and preincubated at 37 ° C. for 30 minutes. After adding 100 μl of the substrate solution and reacting at 37 ° C. for 1 hour, measurement was performed at 340 nm.
The results are shown in FIG. When ACC1 of 0-2.5 mU / well was used, it decreased almost linearly, and a constant value was shown in ACC1 higher than that. From this result, it was decided to use an ACC amount of 2 mU / well, which is about 80% of the maximum reaction amount.
ＵＶ法と蛍光法によるＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ阻害活性の比較
ＵＶ法による阻害活性の測定は、２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液５０μｌ及びＣＰ−６４０１８６（０〜４０μＭ）溶液５０μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液１００μｌを加え３７℃で１時間反応後、３４０ｎｍで測定した。
本発明の蛍光法による阻害活性の測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液２５μｌ及びＣＰ−６４０１８６(０〜４００μＭ）溶液２５μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液１００μｌを加え３７℃で１時間反応した。ピルビン酸測定試薬５０μｌを加え３７℃で５分間反応後、励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
ＣＰ−６４０１８６を添加しない場合のＡＣＣ活性を１００％とした時の各濃度における活性（％）を計算した。
結果を図３に示す。ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ阻害活性をＵＶ法で測定した場合と蛍光法で測定した場合とで比較すると、殆ど同じ阻害曲線を描いた。蛍光法はＵＶ法に比較して約１０分の１量のＡＣＣで阻害活性を測定することができた。
Comparison of ACC inhibitory activity of CP-640186 by UV method and fluorescence method Inhibitory activity by UV method was measured by adding 50 μl of a solution containing 2 mU / well of ACC1 and 50 μl of CP-640186 (0-40 μM) at 37 ° C. Preincubation for 30 minutes. After adding 100 μl of the substrate solution and reacting at 37 ° C. for 1 hour, measurement was performed at 340 nm.
The inhibitory activity by the fluorescence method of the present invention was measured by adding 25 μl of a solution containing ACC1 of 0.2 mU / well and 25 μl of CP-640186 (0 to 400 μM), and preincubating at 37 ° C. for 30 minutes. 100 μl of the substrate solution was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After adding 50 μl of a pyruvic acid measuring reagent and reacting at 37 ° C. for 5 minutes, the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 560 nm and a fluorescence wavelength of 590 nm was measured.
The activity (%) at each concentration was calculated assuming that the ACC activity when CP-640186 was not added was 100%.
The results are shown in FIG. When the ACC inhibitory activity of CP-640186 was measured by the UV method and when measured by the fluorescence method, almost the same inhibition curves were drawn. The fluorescence method was able to measure the inhibitory activity with about one-tenth the amount of ACC compared to the UV method.
ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ１とＡＣＣ２との阻害活性の比較
ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ１阻害活性の測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ１を含む溶液２５μｌ及びＣＰ−６４０１８６（０〜４００μＭ）溶液２５μｌを加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。基質溶液１００μｌを加え３７℃で１時間反応した。ピルビン酸測定試薬５０μｌを加え３７℃で５分間反応後、励起波長５６０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
また、ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ２阻害活性の測定は、０．２ｍＵ／ｗｅｌｌのＡＣＣ２を含む溶液２５μｌを用い及びＣＰ−６４０１８６（０〜４０μＭ）溶液２５μｌを加えＡＣＣ１と同様に行った。
ＣＰ−６４０１８６を添加しない場合のＡＣＣ活性を１００％とした時の各濃度における活性（％）を計算した。
結果を図４に示す。この結果、ＣＰ−６４０１８６のＡＣＣ１とＡＣＣ２阻害活性を比較すると、殆ど同じ阻害曲線を描くことがわかった。
Comparison of inhibitory activity of CP-640186 between ACC1 and ACC2 CP-640186 was measured for ACC1 inhibitory activity by adding 25 μl of a solution containing ACC1 of 0.2 mU / well and 25 μl of CP-640186 (0-400 μM) solution. Pre-incubation at 30 ° C. for 30 minutes. 100 μl of the substrate solution was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After adding 50 μl of a pyruvic acid measuring reagent and reacting at 37 ° C. for 5 minutes, the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 560 nm and a fluorescence wavelength of 590 nm was measured.
Moreover, the measurement of the ACC2 inhibitory activity of CP-640186 was performed in the same manner as ACC1 using 25 μl of a solution containing ACC2 of 0.2 mU / well and adding 25 μl of a CP-640186 (0 to 40 μM) solution.
The activity (%) at each concentration was calculated assuming that the ACC activity when CP-640186 was not added was 100%.
The results are shown in FIG. As a result, it was found that when ACC1 and ACC2 inhibitory activities of CP-640186 were compared, almost the same inhibition curves were drawn.
本発明は、メタボリックシンドローム、高脂血症、肥満症、高血圧症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症と関連する心血管疾患などの予防及び治療に極めて有用であると考えられているＡＣＣ阻害剤や、抗癌剤への利用も検討されているＡＣＣの活性促進剤などを、簡便で高感度で、かつ放射性物質を使用することなく安全にスクリーニングすることができる新規なＡＣＣ活性測定方法を提供するものであり、有用な新規な医薬品や食品類の開発に有用な手法となり産業上の利用可能性を有している。 The present invention relates to an ACC inhibitor that is considered to be extremely useful for the prevention and treatment of metabolic syndrome, hyperlipidemia, obesity, hypertension, diabetes, cardiovascular disease associated with atherosclerosis, and the like. The present invention provides a novel ACC activity measurement method capable of screening ACC activity promoters, etc., which are also being studied for use as anticancer agents, in a simple, highly sensitive and safe manner without using radioactive substances. It is a useful technique for developing useful new medicines and foods and has industrial applicability.
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