JP2010068773A

JP2010068773A - 3-4c alcohol resistant eukaryocyte

Info

Publication number: JP2010068773A
Application number: JP2008241600A
Authority: JP
Inventors: Min-Tian Gao; ミンテンコウ; Nobuhiro Ishida; 亘広石田; Takashi Shimamura; 隆嶋村; Haruo Takahashi; 治雄高橋
Original assignee: Toyota Central R&D Labs Inc
Current assignee: Toyota Central R&D Labs Inc
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2010-04-02

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a eukaryocyte suitable for producing a 3-4C alcohol. <P>SOLUTION: The eukaryocyte having enhanced 3-4C alcohol resistance is provided by highly expressing thioredoxin. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、炭素数が３〜４のアルコールに耐性を有するＣ₃−Ｃ₄アルコール耐性真核細胞、その作製方法及びその利用に関する。 The present invention relates to a C ₃ -C ₄ alcohol-resistant eukaryotic cell having resistance to an alcohol having ₃ to 4 carbon atoms, a production method thereof and use thereof.

微生物を利用して発酵を行い、有用物質を生産する方法は、食品業界及び化学業界において多大な実績をあげている。なかでも、酵母（Saccharomyces cerevisiae）や麹菌などの真核細胞は、パン、アルコール飲料、工業用エタノール、乳酸の生産など、その用途は広く、種々の研究がなされている。近年、有限である石油資源を代替するべく、循環利用可能なエネルギー源から燃料及び工業用原料としてより有用なブタノールやイソプロパノールなどのＣ₃−Ｃ₄アルコールの生産技術が注目されている。 The method of producing useful substances by performing fermentation using microorganisms has a great track record in the food industry and the chemical industry. Among them, eukaryotic cells such as yeast (Saccharomyces cerevisiae) and Neisseria gonorrhoeae have a wide range of uses such as production of bread, alcoholic beverages, industrial ethanol and lactic acid, and various studies have been made. In recent years, in order to replace finite petroleum resources, attention has been focused on production technologies for C ₃ -C ₄ alcohols such as butanol and isopropanol which are more useful as fuels and industrial raw materials from recyclable energy sources.

既に、大腸菌によるＣ₃−Ｃ₄アルコールの生産が報告されている（非特許文献１）。また、コリネ型細菌によるイソプロパノールの生産技術も報告されている（非特許文献２）。一方、Saccharomyces属などの酵母においても、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールを生産することが知られている（特許文献１、２）。 The production of C ₃ -C ₄ alcohol by E. coli has already been reported (Non-patent Document 1). Also, isopropanol production technology using coryneform bacteria has been reported (Non-patent Document 2). On the other hand, it is known that yeasts such as the genus Saccharomyces also produce C ₃ -C ₄ alcohol (Patent Documents 1 and 2).

特開平１１−２３５１７８号公報JP-A-11-235178 特表２００７−５３３３０１号公報Special table 2007-533301 gazette Liaoら、Nature、Vol. 451, p86-89Liao et al., Nature, Vol. 451, p86-89 Yukawaら、Appl. Microbaiol. Biothecnol. Vol. 77, p1219-1224, 2008Yukawa et al., Appl. Microbaiol. Biothecnol. Vol. 77, p1219-1224, 2008

上記大腸菌やコリネバクテリウムなどのバクテリアは、扱いやすく代謝工学的にも有利である反面、代謝産物の高濃度生産が困難である問題がある。したがって、高濃度にＣ₃−Ｃ₄アルコールを生産することは困難であった。また、酵母などの真核細胞におけるＣ₃−Ｃ₄アルコール産生経路は、特殊な経路であり、１０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍ程度の量しか得ることができず、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールを燃料や工業用原料として使用することは実質的に不可能であった。 Bacteria such as Escherichia coli and Corynebacterium are easy to handle and advantageous in metabolic engineering, but have a problem that it is difficult to produce high concentrations of metabolites. Therefore, it was difficult to produce C ₃ -C ₄ alcohol at a high concentration. Also, C ₃ -C ₄ alcohol production pathway in eukaryotic cells such as yeast, is a special path, can not be obtained only an amount of about 10ppm~50ppm, C ₃ -C ₄ alcohol fuels and industrial raw materials It was virtually impossible to use as.

酵母などの真核細胞は、バクテリアに比較して、一般に、各種ストレスに耐性能が高いと考えられている。したがって、真核細胞を遺伝子工学的に改変するなどしてＣ₃−Ｃ₄アルコールの高濃度生産が可能になれば、発酵によりＣ₃−Ｃ₄アルコールを効率よく得ることができると考えられる。 Eukaryotic cells such as yeast are generally considered to be more resistant to various stresses than bacteria. Therefore, it is considered that C ₃ -C ₄ alcohol can be efficiently obtained by fermentation if high concentration production of C ₃ -C ₄ alcohol becomes possible by modifying eukaryotic cells by genetic engineering.

しかしながら、本発明者らによれば、酵母はストレス耐性であるにも関わらずＣ₃−Ｃ₄アルコールに対しては耐性が低いことが判明した。すなわち、酵母などの真核細胞を利用して実用的なレベルでＣ₃−Ｃ₄アルコールを生産するには、真核細胞に対してＣ₃−Ｃ₄アルコールに対する耐性能を付与して、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールの存在下での増殖能や発酵能を高める必要があることがわかった。 However, according to the inventors, it has been found that yeast is less resistant to C ₃ -C ₄ alcohols despite being resistant to stress. That is, in order to produce C ₃ -C ₄ alcohol at a practical level using eukaryotic cells such as yeast, the resistance to C ₃ -C ₄ alcohol is imparted to eukaryotic cells, and C ₃ -C ₄ alcohol is produced. ₃ -C ₄ increase the proliferation ability and fermentation ability in the presence of an alcohol necessary it has been found that.

そこで、本発明は、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールを生産するのに適した真核細胞、その作製方法及びその利用を提供することを一つの目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a eukaryotic cell suitable for producing C ₃ -C ₄ alcohol, a method for producing the same, and use thereof.

本発明者らは、チオレドキシンに着目した。チオレドキシンは、抗酸化ストレスに応答するタンパク質として知られている。本発明者らは、チオレドキシンの発現量を増大させることで発現させることにより、その真核細胞のＣ₃−Ｃ₄アルコールに対する耐性能を増強できることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。 The inventors focused on thioredoxin. Thioredoxin is known as a protein that responds to antioxidant stress. The present inventors have found that the eukaryotic cell resistance to C ₃ -C ₄ alcohol can be enhanced by increasing the expression level of thioredoxin, thereby completing the present invention. According to the present invention, the following means are provided.

本発明によれば、チオレドキシンを高発現する、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール耐性が増強された真核細胞が提供される。 According to the present invention, the thioredoxin is highly expressed, C ₃ -C ₄ eukaryotic cell alcohol resistance is enhanced are provided.

本発明によれば、チオレドキシンをコードする以下のいずれかのＤＮＡを発現可能に保持する、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール耐性が増強された真核細胞も提供される。
（１）配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（２）配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイゼズし、かつ、チオレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号１又は３で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有し、かつチオレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（５）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、かつ、チオレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（６）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１又は数個以上のアミノ酸変異を有し、かつ、チオレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ According to the present invention, there is also provided a eukaryotic cell having enhanced resistance to C ₃ -C ₄ alcohol, which is capable of expressing any of the following DNAs encoding thioredoxin.
(1) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
(2) DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions and encodes a protein having thioredoxin activity
(3) DNA encoding a protein having 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and having thioredoxin activity
(4) DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
(5) DNA encoding a protein having 50% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having thioredoxin activity
(6) DNA encoding a protein having one or several amino acid mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having thioredoxin activity

さらに、前記Ｃ₃−Ｃ₄アルコールは、１−ブタノール、２-メチル-１-プロパノール及び２−プロパノールから選択される１種又は２種以上である前記真核細胞も提供される。前記真核細胞は酵母であってもよく、サッカロマイセス属酵母であってもよく、さらには、サッカロマイセス・セレビジエであってもよい。また、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール生産用遺伝子組換え体の宿主用である、前記細胞も提供される。 Furthermore, the eukaryotic cell in which the C ₃ -C ₄ alcohol is one or more selected from 1-butanol, 2-methyl-1-propanol and 2-propanol is also provided. The eukaryotic cell may be yeast, Saccharomyces genus yeast, or Saccharomyces cerevisiae. Also, a host for C ₃ -C ₄ alcohol production recombinants, the cells are also provided.

本発明によれば、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡを含む、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール耐性が増強された真核細胞作製用の遺伝子組換え用ＤＮＡ構築物が提供される。 According to the present invention, there is provided a DNA construct for gene recombination for producing eukaryotic cells having enhanced C ₃ -C ₄ alcohol resistance, comprising the DNA according to any one of (1) to (6) above. The

本発明によれば、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡを導入することを含む、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール耐性が増強された真核細胞の作製方法が提供される。 According to the present invention, the above (1) to comprising introducing the DNA of any one of (6), C ₃ -C ₄ Preparation Methods of eukaryotic cell alcohol resistance is enhanced are provided.

本発明によれば、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール生産のための真核細胞のスクリーニング方法であって、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールの生産に関与する遺伝子改変又は培養条件を付与した前記真核細胞を培養する工程と、前記工程におけるＣ₃−Ｃ₄アルコールの生産又はその生産量を検出する工程、
を備える、スクリーニング方法が提供される。 According to the present invention, a method of screening eukaryotic cells for C ₃ -C ₄ alcohols production, the eukaryotic cells confer genetic modification or culture conditions involved in the production of C ₃ -C ₄ alcohols A step of culturing, and a step of detecting the production of C ₃ -C ₄ alcohol or the production amount thereof in the step,
A screening method is provided.

本発明は、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール耐性を有する、真核細胞、その作製方法及びその利用に関している。本発明の真核細胞は、チオレドキシンを高発現することにより、又は特定のチオレドキシンが発現されることにより、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール耐性を有するようになる。したがって、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールが、例えば、１ｗｔ／ｖｏｌ％以上、好ましくは２ｗｔ／ｖｏｌ％以上のレベルで存在していても、増殖能及び各種有用物質の産生（発酵）能を維持することができるようになる。チオレドキシンは、広く生物に存在するユビキタスタンパク質であり、その酸化還元活性に基づきタンパク質の活性や機能、性質を調節する機能を担っていると考えられる。しかしながら、エタノール耐性の発現に、チオレドキシンが関与することは全く知られていないし、ましてやＣ₃−Ｃ₄アルコール耐性の発現とチオレドキシンとの関係も全く検討されていない。以下、本発明の各種実施携帯 The present invention relates to a eukaryotic cell having C ₃ -C ₄ alcohol resistance, a production method thereof and use thereof. The eukaryotic cell of the present invention becomes resistant to C ₃ -C ₄ alcohol by expressing thioredoxin at a high level or by expressing a specific thioredoxin. Therefore, even when C ₃ -C ₄ alcohol is present at a level of, for example, 1 wt / vol% or more, preferably 2 wt / vol% or more, the ability to proliferate and produce (fermentation) various useful substances is maintained. Will be able to. Thioredoxin is a ubiquitous protein widely present in living organisms, and is thought to have a function of regulating the activity, function, and property of the protein based on its redox activity. However, it is not known at all that thioredoxin is involved in the expression of ethanol resistance, and even the relationship between the expression of C ₃ -C ₄ alcohol resistance and thioredoxin has not been studied at all. Hereinafter, various implementations of the present invention

（Ｃ₃−Ｃ₄アルコール耐性が増強された真核細胞）
本発明において真核細胞とは、特に限定しないが、動物細胞、植物細胞、真菌等が挙げられる。なかでも、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールの生産を考慮すると、麹菌や酵母が挙げられる。麹菌としては、Aspergillus 属に属する菌が挙げられる。例えば、Aspergillus orizae、Aspergillus aculeatus、Aspergillus kawachii、Aspergillus awamori、Aspergillus saitoi、Aspergillus soya、Aspergillus nigar、Aspergillus tamari等が挙げられる。他に、Monascus anka、Monascus purpureus等のMonascus属に属する菌が挙げられる。さらに、Rhizopus oligosporus、Rhizopus javanicusなどのRhizopus属に属する菌やMucor rouxii等のMucor属に属する菌が挙げられる。 (C ₃ -C ₄ eukaryotic cell alcohol resistance is enhanced)
In the present invention, eukaryotic cells are not particularly limited, and examples thereof include animal cells, plant cells, and fungi. Among these, in consideration of the production of C ₃ -C ₄ alcohol, gonococcus and yeast can be mentioned. As the koji mold, bacteria belonging to the genus Aspergillus can be mentioned. Examples include Aspergillus orizae, Aspergillus aculeatus, Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus saitoi, Aspergillus soya, Aspergillus nigar, Aspergillus tamari and the like. Other examples include bacteria belonging to the genus Monascus such as Monascus anka and Monascus purpureus. Furthermore, bacteria belonging to the genus Rhizopus such as Rhizopus oligosporus and Rhizopus javanicus and bacteria belonging to the genus Mucor such as Mucor rouxii can be mentioned.

酵母としては、Saccharomyces属、Candida属、Torulopsis属、Zygosaccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Pichia属、Yarrowia属、Hansenula属、Kluyveromyces属、Debaryomyces属、Geotrichum属、Wickerhamia属、Fellomyces属、Sporobolomyces属等が挙げられる。工業的利用を考慮すると、Saccharomyces属、Candida属、Torulopsis属、Zygosaccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Pichia属、Kluyveromyces属が好ましく、より好ましくは、Saccharomyces属である。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビジエである。 Examples of yeasts include Saccharomyces, Candida, Torulopsis, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Yarrowia, Hansenula, Kluyveromyces, Debaryomyces, Geotrichum, Wickerhamia, Poroboloces, etc. In view of industrial use, Saccharomyces, Candida, Torulopsis, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, and Kluyveromyces are preferred, and Saccharomyces is more preferred. More preferred is Saccharomyces cerevisiae.

本明細書においてＣ₃−Ｃ₄アルコールとは、炭素数が３以上４以下のアルキル基を備えるアルコールを意味する。また、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールは、第１級、第２級及び第３級アルコールのいずれであってもよく、１価、２価及び３価のアルコールのいずれであってもよい。典型的には１価のアルコールである。アルコールによる増殖・発酵阻害は、水酸基（ＯＨ）が細胞膜の流動性や機能維持を妨害することであると考えられる。チオレドキシンの発現により、１価のアルコールに対する耐性の向上が認められていることから、同様に水酸基が原因となる２価、３価アルコールによる増殖・発酵阻害も同様にチオレドキシンの発現により耐性の向上が認められる。Ｃ₃−Ｃ₄アルコールとしては、具体的には、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２−メチル−２−プロパノール等が挙げられる。なかでも、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、２-メチル−２−プロパノールに対して耐性が発揮されることが好ましい。より好ましくは、１−ブタノール、２-メチル-１-プロパノール及び２−プロパノールである。 In the present specification, the C ₃ -C ₄ alcohol means an alcohol having an alkyl group having 3 to 4 carbon atoms. The C ₃ -C ₄ alcohol may be any of primary, secondary, and tertiary alcohols, and may be any of monovalent, divalent, and trivalent alcohols. Typically a monohydric alcohol. Growth and fermentation inhibition by alcohol is considered to be that hydroxyl groups (OH) interfere with fluidity and function maintenance of cell membranes. Since the improvement of tolerance to monohydric alcohol has been recognized by the expression of thioredoxin, the growth and fermentation inhibition by divalent and trihydric alcohol caused by hydroxyl group is similarly improved by the expression of thioredoxin. Is recognized. Specific examples of the C ₃ -C ₄ alcohol include 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 2-methyl-2-propanol, and the like. Especially, it is preferable that tolerance is exhibited with respect to 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, and 2-methyl-2-propanol. More preferred are 1-butanol, 2-methyl-1-propanol and 2-propanol.

真核細胞が耐性を有するのが好ましい培地中のＣ₃−Ｃ₄アルコール濃度は特に限定しない。Ｃ₃−Ｃ₄アルコールの種類にもよるが、２．０ｗｔ／ｖｏｌ％以上とすることができ、より好ましくは３．０ｗｔ／ｖｏｌ％以上とすることができる。 The concentration of C ₃ -C ₄ alcohol in the medium in which eukaryotic cells are preferably resistant is not particularly limited. Although it depends on the type of C ₃ -C ₄ alcohol, it can be 2.0 wt / vol% or more, more preferably 3.0 wt / vol% or more.

真核細胞では、チオレドキシンが高発現されている。チオレドキシンは、高度に保存されたＣ−Ｘ−Ｙ−Ｃの活性中心（特にＸ：Ｇｌｙ、Ｙ：Ｐｒｏ）をもつ、約１２０ｋＤａの電子伝達タンパク質であり、酵素などの他のタンパク質に存在するジスルフィド結合の酸化還元活性を有する。チオレドキシンとしては、このように定義付けされるものであれば特に限定しないで用いることができる。 In eukaryotic cells, thioredoxin is highly expressed. Thioredoxin is an approximately 120 kDa electron transfer protein with a highly conserved C—X—Y—C active center (especially X: Gly, Y: Pro), and is a disulfide present in other proteins such as enzymes. Has redox activity of the bond. The thioredoxin can be used without particular limitation as long as it is defined as described above.

チオレドキシンは、真核細胞が本来的に有する内在性のものであってもよいし、遺伝子組換え等により発現される外来性のものであってもよい。また、チオレドキシンは、好ましくは真核生物由来のチオレドキシンである。なかでも、植物由来のチオレドキシンが好ましい。植物は、移動が不可能であることが多く、高いストレス耐性が期待できると考えられるからである。植物由来のチオレドキシンとしては、双子葉植物由来であっても単子葉植物由来であってもよい。例えば、アブラナ科シロイヌナズナ属の一年草であるシロイヌナズナ（学名：Arabidopsis thaliana）のＴＲＸ−ｈ７（配列番号２、Gene Pept ID; AAO24572, Gene Bank ID; BT003140）やＴＲＸ-ｈ８（配列番号４、Gene Pept ID; AAO39898, Gene Bank ID; BT003670）が挙げられる。 The thioredoxin may be an intrinsic one inherent in eukaryotic cells or an exogenous one expressed by genetic recombination or the like. The thioredoxin is preferably a eukaryotic thioredoxin. Of these, plant-derived thioredoxin is preferable. This is because plants are often unable to move and are expected to have high stress tolerance. The plant-derived thioredoxin may be derived from a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant. For example, TRX-h7 (SEQ ID NO: 2, Gene Pept ID; AAO24572, Gene Bank ID; BT003140) and TRX-h8 (SEQ ID NO: 4, Gene) of Arabidopsis thaliana, an annual plant of the Brassicaceae family Pept ID; AAO39898, Gene Bank ID; BT003670).

チオレドキシンとしては、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と一定以上の類似性及び／又は同一性を有し、かつ配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列で表されるタンパク質と同一の活性を有しているものを用いることができる。チオレドキシンとしては、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の類似性があることが好ましく、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは、８０％以上であり、一層好ましくは９０％以上であり、さらに一層好ましくは９５％以上である。また、チオレドキシンとしては、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と３０％以上の同一性があることが好ましく、より好ましくは４０％以上であり、さらに好ましくは５０％以上である。さらには、７０％以上の同一性があることがより好ましく、さらに好ましくは８０％以上であり、一層好ましくは、９０％以上であり、さらに一層好ましくは９５％以上である。 Thioredoxin has a certain degree of similarity and / or identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and is identical to the protein represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4. What has activity can be used. The thioredoxin preferably has 60% or more similarity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, and still more preferably It is 90% or more, and more preferably 95% or more. Further, thioredoxin preferably has 30% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, more preferably 40% or more, and still more preferably 50% or more. Furthermore, it is more preferable that there is an identity of 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more.

なお、本明細書において同一性及び類似性とは、当該技術で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。 In the present specification, identity and similarity are relationships between two or more proteins or two or more polynucleotides determined by comparing sequences, as is known in the art. In the art, “identity” means between protein or polynucleotide sequences, as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of such sequences. Means the degree of sequence invariance. Similarity is also the correlation between protein or polynucleotide sequences, as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of partial sequences. Means the degree of More specifically, it is determined by sequence identity and conservation (substitutions that maintain specific amino acids in the sequence or physicochemical properties in the sequence). Similarity is referred to as Similarity in the BLAST sequence homology search results described below. The method for determining identity and similarity is preferably a method designed to align the longest between the sequences to be compared. Methods for determining identity and similarity are provided as programs available to the public. For example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program by Altschul et al. (Eg Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)). The conditions for using software such as BLAST are not particularly limited, but it is preferable to use default values.

このような同一性及び／又は類似性を備えるチオレドキシンは、例えば、配列番号２又は４で表されるアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ（たとえば、配列番号１又は３で表される塩基配列からなる）に対して、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等が挙げられる。また、タンパク質のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。本発明において発現が増強されるチオレドキシンは、このようにアミノ酸の欠失、置換、付加により配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列が変異したタンパク質であって、配列番号２又は４で表されるチオレドキシンと同一のチオレドキシン活性を有するものであってもよい。なお、変異の数は、好ましくは１０まで、より好ましくは５まで、最も好ましくは３までである。 A thioredoxin having such identity and / or similarity is, for example, a DNA encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 (for example, consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3). In contrast, conventional mutagenesis methods, site-directed mutagenesis methods, molecular evolution methods using error-prone PCR, and the like can be mentioned. Also, amino acid mutations in proteins can occur in nature. The thioredoxin whose expression is enhanced in the present invention is a protein in which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 has been mutated by amino acid deletion, substitution, or addition, and is represented by SEQ ID NO: 2 or 4. It may have the same thioredoxin activity as thioredoxin. The number of mutations is preferably up to 10, more preferably up to 5, and most preferably up to 3.

アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。 As an example of amino acid substitution, conservative substitution is preferable, and specific examples include substitution within the following groups. (Glycine, alanine) (valine, isoleucine, leucine) (aspartic acid, glutamic acid) (asparagine, glutamine) (serine, threonine) (lysine, arginine) (phenylalanine, tyrosine).

また、チオレドキシンとしては、当業者であれば、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション技術などを用いて配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（たとえば配列番号１又は３で表される塩基配列）またはその一部をもとに、これと同一性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同一のチオレドキシン活性を有するタンパク質を得ることも通常行い得る。 Further, as a thioredoxin, those skilled in the art can use a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 (for example, SEQ ID NO: 1 or 4) using a hybridization technique under stringent conditions. Thioredoxin identical to the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 after isolating a DNA having high identity based on the base sequence represented by 3) or a part thereof It is also usually possible to obtain a protein having activity.

ストリンジェントな条件は、当業者であれば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより決定することができる。 Stringent conditions can be determined by those skilled in the art according to T.W. It can be determined by referring to Maniatis, J. Sambrook et al. Experimental documents (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 1989, 2001) as appropriate.

なお配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同一のチオレドキシン活性とは、例えば、一般的なチオレドキシン活性であり、酸化還元酵素活性によって確認できる。なお、なお同一の活性という場合には、その程度は問わない。好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からタンパク質のチオレドキシン活性の３０％以上であり、より好ましくは、５０％以上であり、さらに好ましくは、８０％以上である。 The thioredoxin activity identical to the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 is, for example, general thioredoxin activity and can be confirmed by oxidoreductase activity. In addition, the degree is not ask | required when it says that it is the same activity. Preferably, it is 30% or more of the thioredoxin activity of the protein from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, more preferably 50% or more, and further preferably 80% or more.

公共に提供される相同性検索プログラムによれば、配列番号２と上記同一性及び類似性を充足するチオレドキシンとしては、シロイヌナズナの他のチオレドキシンであるＴＲＸ−ｈ８（配列番号４）、サッカロマイセス・セレビジエのＴＲＸ１及びＴＲＸ２等が挙げられる。 According to a homology search program provided to the public, thioredoxins satisfying the above-described identity and similarity with SEQ ID NO: 2 include TRX-h8 (SEQ ID NO: 4), another thioredoxin of Arabidopsis thaliana, and Saccharomyces cerevisiae. TRX1 and TRX2 etc. are mentioned.

真核細胞は、チオレドキシンをコードするＤＮＡを発現可能に保持している。チオレドキシンをコードするＤＮＡは、チオレドキシンをコードするものであれば特に限定しないが、好ましくは、上記したように、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のほか、これらと上記した一定の関係を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、チオレドキシンをコードするＤＮＡとしては、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡのほか、これらの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイゼズし、かつ、チオレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ及び塩基配列１又は３で表される塩基配列に対して好ましくは、７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつチオレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。なお、こうした塩基配列には、塩基配列の少なくとも他のヌクレオチドに置換されて遺伝暗号の縮重に基づく塩基置換を含んでいてもよい。このようなヌクレオチド置換されたＤＮＡは公知の方法により得ることができる。 The eukaryotic cell holds the DNA encoding thioredoxin so that it can be expressed. The DNA encoding thioredoxin is not particularly limited as long as it encodes thioredoxin, but preferably, as described above, in addition to the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, these and the above-mentioned constants DNA encoding a protein having the following relationship may be mentioned. In addition to the DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, the DNA encoding thioredoxin is a protein that hybridizes with DNA comprising these nucleotide sequences under stringent conditions and has thioredoxin activity. Preferably, it has 70% or more identity, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more identity to the DNA encoding DNA and the base sequence represented by base sequence 1 or 3, and has thioredoxin activity. DNA which codes the protein which has is mentioned. Such a base sequence may include a base substitution based on the degeneracy of the genetic code by substituting at least another nucleotide of the base sequence. Such nucleotide-substituted DNA can be obtained by a known method.

真核細胞は、好ましくは、チオレドキシンを高発現する。すなわち、チオレドキシンをコードするＤＮＡを高発現可能に保持している。かかる真核細胞におけるチオレドキシンをコードするＤＮＡの保持形態には、各種形態が挙げられる。例えば、内在性チオレドキシンの発現を増強するには、強力な誘導的プロモーターや構成的プロモーターの制御下に内在性チオレドキシンをコードするＤＮＡを連結する構成を遺伝子組換えにより真核細胞に保持されていることが好ましい。また、適当なプロモーターの制御下に内在性チオレドキシンをコードするＤＮＡを連結する構成のＤＮＡ断片の複数コピーが遺伝子組換えにより真核細胞に保持されていてもよい。このような構成のＤＮＡ断片を複数コピーが導入されて保持されていてもよい。また、外来性のチオレドキシンを真核細胞内で発現させることにより、チオレドキシンの発現を増強する場合には、適当なプロモーター、好ましくは、強力な誘導的又は構成的プロモーターの制御下に外来性のチオレドキシンをコードするＤＮＡを連結した構成が遺伝子組換えにより真核細胞に保持されていることが好ましい。真核細胞は、遺伝子組換えにより内在性チオレドキシンと外来性チオレドキシンとの双方の発現が増強されていてもよい。このようなＤＮＡ断片は、相同組換え技術により真核細胞の染色体上に組み込まれていてもよいし、プラスミド等の染色体外ＤＮＡとして保持されていてもよいし、これらの双方であってもよい。かかる遺伝子組換えは、例えば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。また、細胞の種類に応じて適切なプロモーターも適宜選択される。例えば、酵母においては、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。 The eukaryotic cell preferably highly expresses thioredoxin. That is, the DNA encoding thioredoxin is retained so as to be highly expressible. There are various forms of retention of DNA encoding thioredoxin in such eukaryotic cells. For example, in order to enhance the expression of endogenous thioredoxin, a structure in which DNA encoding endogenous thioredoxin is linked under the control of a strong inducible promoter or constitutive promoter is retained in eukaryotic cells by genetic recombination. It is preferable. In addition, a plurality of copies of a DNA fragment configured to link DNA encoding endogenous thioredoxin under the control of an appropriate promoter may be retained in a eukaryotic cell by genetic recombination. A plurality of copies of the DNA fragment having such a structure may be introduced and held. In the case of enhancing the expression of thioredoxin by expressing the exogenous thioredoxin in a eukaryotic cell, the exogenous thioredoxin is preferably controlled under the control of a suitable promoter, preferably a strong inducible or constitutive promoter. It is preferable that the structure in which the DNA encoding is linked to a eukaryotic cell by genetic recombination. In eukaryotic cells, the expression of both endogenous thioredoxin and exogenous thioredoxin may be enhanced by genetic recombination. Such a DNA fragment may be incorporated on the chromosome of a eukaryotic cell by homologous recombination techniques, may be retained as extrachromosomal DNA such as a plasmid, or both of them. . Such genetic recombination is described, for example, in T.W. A person skilled in the art can carry out this method by referring appropriately to an experimental book by Maniatis, J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 1989, 2001). An appropriate promoter is also appropriately selected according to the cell type. For example, in yeast, 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, etc. are mentioned.

例えば、このような真核細胞としては、チオレドキシンとして上記したシロイヌナズナＴＲＸ−ｈ７又はＴＲＸ−ｈ８若しくはこれらと一定以上の同一性及び／又は類似性を有するアミノ酸酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ等を適当なプロモーターの制御下に連結されたＤＮＡ構築物を染色体外あるいは染色体外に導入し保持させた酵母、典型的にはサッカロマイセス・セレビジエ等のサッカロマイセス属酵母が挙げられる。 For example, such eukaryotic cells include the above-described Arabidopsis TRX-h7 or TRX-h8 as thioredoxin or DNA encoding a protein comprising an amino acid acid sequence having a certain identity and / or similarity with these. Examples include yeast in which a DNA construct linked under the control of an appropriate promoter is introduced or held extrachromosomally or extrachromosomally, typically Saccharomyces genus yeasts such as Saccharomyces cerevisiae.

このような真核細胞は、実施例において示すように、培地中のＣ₃−Ｃ₄アルコールに対して耐性能を有し、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールの存在下において、チオレドキシンの発現量が増大されているかあるいは特定のチオレドキシンが発現されていない場合に比較して増殖能が向上されている。すなわち、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールの存在下における比増殖速度の低下が抑制されている。こうした真核細胞を、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールを産生する真核細胞の遺伝子組換え体の宿主として用いることができる。かかるＣ₃−Ｃ₄アルコール耐性能を獲得した真核細胞は、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール存在下であっても、増殖能の低下が抑制され、自身の産物であるＣ₃−Ｃ₄アルコールによる増殖能の低下が抑制され、従来よりも高濃度に培地中にＣ₃−Ｃ₄アルコールを生産させることができるようになる。 As shown in the Examples, such eukaryotic cells are resistant to C ₃ -C ₄ alcohol in the medium, and the expression level of thioredoxin is increased in the presence of C ₃ -C ₄ alcohol. Or the ability to grow is improved compared to the case where a specific thioredoxin is not expressed. That is, a decrease in the specific growth rate in the presence of C ₃ -C ₄ alcohol is suppressed. Such eukaryotic cells can be used as a host for genetically modified eukaryotic cells that produce C ₃ -C ₄ alcohols. The eukaryotic cells that have acquired such C ₃ -C ₄ alcohol resistance are suppressed in their ability to proliferate even in the presence of C ₃ -C ₄ alcohol, and are caused by their own product, C ₃ -C ₄ alcohol. Decrease in growth ability is suppressed, and C ₃ -C ₄ alcohol can be produced in the medium at a higher concentration than before.

（遺伝子組換え用ＤＮＡ構築物）
本発明によれば、チオレドキシンをコードするＤＮＡを含む、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール耐性が増強された真核細胞作製用の遺伝子組換え用ＤＮＡ構築物が提供される。ＤＮＡ構築物は、上記した本発明で用いるチオレドキシンをコードするＤＮＡであればよい。 (DNA construct for gene recombination)
According to the present invention comprises a DNA encoding the thioredoxin, C ₃ -C ₄ recombinant for DNA construct alcohol resistant for producing eukaryotic cells enhanced is provided. The DNA construct should just be DNA which codes the thioredoxin used by above-mentioned this invention.

チオレドキシンをコードするＤＮＡは、上記したように、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡほか、当該ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイゼズし、かつ、チオレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡと一定以上の同一性を有し、かつチオレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、当該アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、かつ、チオレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、当該アミノ酸配列において１又は数個以上のアミノ酸変異を有し、かつ、チオレドキシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。 As described above, DNA encoding thioredoxin includes DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and DNA that hybridizes with the DNA under stringent conditions and encodes a protein having thioredoxin activity. DNA encoding a protein having a certain degree of identity with the DNA and having thioredoxin activity, DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and 50% identity or more with the amino acid sequence And a DNA encoding a protein having thioredoxin activity, and a DNA encoding a protein having one or more amino acid mutations in the amino acid sequence and having a thioredoxin activity.

なお、ＤＮＡは、ｃＤＮＡのほか、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡも含まれる。遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるタンパク質のアミノ酸配列を変えることなく所定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドを他の種類のヌクレオチドに置換することができる。従って、本発明のＤＮＡはまた、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変換されたヌクレオチド配列も含有する。このようなＤＮＡは、公知の方法により合成することができる。 In addition to cDNA, DNA includes genomic DNA and chemically synthesized DNA. According to the degeneracy of the genetic code, at least one nucleotide of the nucleotide sequence encoding a protein consisting of a predetermined amino acid sequence can be replaced with another type of nucleotide without changing the amino acid sequence of the protein produced from the gene. Thus, the DNA of the present invention also contains nucleotide sequences that have been converted by substitution based on the degeneracy of the genetic code. Such DNA can be synthesized by a known method.

ＤＮＡ構築物は、チオレドキシンの発現を目的とした組換えベクターとして各種形態を採ることができる。組換えベクターは、例えば、チオレドキシンをコードするＤＮＡを含む断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。用いる発現ベクターは、酵母由来、真菌由来、昆虫ウイルス由来、脊椎動物ウイルス由来のいずれのベクターでも良いが、宿主として使用する真核細胞に適したものを選択する。 The DNA construct can take various forms as a recombinant vector for the purpose of expressing thioredoxin. A recombinant vector can be produced, for example, by ligating a fragment containing DNA encoding thioredoxin downstream of a promoter in an appropriate expression vector. The expression vector to be used may be any of vectors derived from yeast, fungi, insect virus, and vertebrate virus, but one suitable for eukaryotic cells used as a host is selected.

微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適したプラスミドベクターが組み換え体ＤＮＡの複製可能な発現ベクターとして一般に用いられる。 When microorganisms are used as hosts, plasmid vectors suitable for these microorganisms are generally used as expression vectors capable of replicating recombinant DNA.

たとえば、酵母で本発明のＤＮＡを発現させるためには、複製可能なベクターとして、たとえばＹＥｐ２４を用いることができる。プラスミドＹＥｐ２４はＵＲＡ３遺伝子を含有しており、このＵＲＡ３遺伝子をマーカー遺伝子として利用することができる。酵母細胞用の発現ベクターのプロモーターの例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼなどの遺伝子のプロモーター等が挙げられる。 For example, in order to express the DNA of the present invention in yeast, for example, YEp24 can be used as a replicable vector. The plasmid YEp24 contains the URA3 gene, and this URA3 gene can be used as a marker gene. Examples of expression vector promoters for yeast cells include promoters for genes such as 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase.

また、真菌で本発明のＤＮＡを発現するための発現ベクターに用いられるプロモーター及びターミナーターの例としては、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、アクチン等の遺伝子プロモーター及びターミネーターが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＰＧＡＣＹ２、ｐＢＳＦＡＨＹ８３等が挙げられる。 Examples of promoters and terminators used in the expression vectors for expressing the DNA of the present invention in fungi include genes such as phosphoglycerate kinase (PGK), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD), and actin. Examples include promoters and terminators. Examples of suitable expression vectors include plasmids pPGACY2, pBSFAHY83, and the like.

なお、組換えベクターの作製、組換え体宿主としての酵母等の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。 Note that general operations necessary for preparation of a recombinant vector and handling of yeast or the like as a recombinant host are usually performed by those skilled in the art. A person skilled in the art can carry out this method by referring appropriately to an experimental book by Maniatis, J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 1989, 2001).

（Ｃ₃−Ｃ₅アルコール耐性が増強された真核細胞の作製方法）
本発明のアルコール耐性が増強された真核細胞の作製方法に関する。本発明の作製方法は、遺伝子組換え技術を用いて、内在性又は外来性のチオレドキシンをコードするＤＮＡを誘導的又は構成的なプロモーターの制御下に連結して宿主真核細胞に導入することによって、チオレドキシンの発現量を増大させた真核細胞を得る工程を含んでいる。上記のとおり、チオレドキシンをコードするＤＮＡの真核細胞に対する導入形態は特に限定しないで、染色体上であっても染色体外であってもよい。なお、かかるチオレドキシンコードＤＮＡの導入に際しては、上記組換えベクターを、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ-デキストラン法、カチオン脂質媒介法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等、感染、または他の方法によって行われ得る。このような手法は、上記した実験書等に記載される。 (C ₃ -C ₅ method for producing eukaryotic cells alcohol resistance is enhanced)
The present invention relates to a method for producing eukaryotic cells with enhanced alcohol tolerance. In the production method of the present invention, a gene encoding endogenous or exogenous thioredoxin is ligated under the control of an inducible or constitutive promoter and introduced into a host eukaryotic cell using genetic recombination technology. And a step of obtaining a eukaryotic cell having an increased expression level of thioredoxin. As described above, the mode of introduction of DNA encoding thioredoxin into eukaryotic cells is not particularly limited, and may be on the chromosome or extrachromosomal. In the introduction of such thioredoxin-encoding DNA, the above recombinant vector can be performed by infection or other methods such as calcium phosphate method, DEAE-dextran method, cationic lipid mediated method, electroporation method, lipofection method and the like. Such a method is described in the above-mentioned experiment document.

（Ｃ₃−Ｃ₄アルコール生産に適した真核細胞のスクリーニング方法）
本発明は、また、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール生産に適した真核細胞のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール耐性が増強された真核細胞に対して、Ｃ₃−Ｃ₅アルコール生産に関与する操作、より具体的には、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール生産の増大に関連する可能性のある遺伝子改変又は培養条件を付与して前記真核細胞を培養する工程と、前記真核細胞によるＣ₃−Ｃ₄アルコールの生産又はその生産量を検出する工程と、を備えることができる。本発明のスクリーニング方法によれば、遺伝子組換えによりＣ₃−Ｃ₄アルコールを生産するのに適した真核細胞を得ることができる。ここで、遺伝子改変とは、導入又は破壊する遺伝子の種類、当該遺伝子が連結されるプロモーターの種類、遺伝子の導入形態（染色体上か染色体外か、ターゲティングかランダム導入か、多数導入か単数導入か等）等を含んでいる。 (C ₃ -C ₄ Screening Methods of eukaryotic cell suitable for alcohol production)
The present invention also relates to a method for screening a eukaryotic cell suitable for C ₃ -C ₄ alcohol production. The screening method of the present invention, with respect to C ₃ -C ₄ eukaryotic cell alcohol resistance is enhanced, the operation involved in C ₃ -C ₅ alcohol production, more specifically, C ₃ -C ₄ alcohol production A step of culturing the eukaryotic cell by applying a genetic modification or a culture condition that may be related to an increase in the number of cells, and a step of detecting the production of C ₃ -C ₄ alcohol by the eukaryotic cell or the production amount thereof. Can be provided. According to the screening method of the present invention, eukaryotic cells suitable for producing C ₃ -C ₄ alcohol can be obtained by genetic recombination. Here, genetic modification means the type of gene to be introduced or destroyed, the type of promoter to which the gene is linked, the mode of gene introduction (on-chromosome or extrachromosomal, targeting or random introduction, multiple introduction or single introduction) Etc.).

Ｃ₃−Ｃ₄アルコール生産に適した真核細胞としては、アルコール発酵を行う酵母や麹菌が挙げられる。これらの真核微生物は、エタノールのほかに、Ｃ₃−Ｃ₄アルコールをエタノールにたいして極微量ではあるが生産しているからである。 Eukaryotic cells suitable for C ₃ -C ₄ alcohol production, yeast and Aspergillus oryzae performing alcohol fermentation. This is because, in addition to ethanol, these eukaryotic microorganisms produce C ₃ -C ₄ alcohols with a very small amount of ethanol.

Ｃ₃−Ｃ₄アルコール耐性が増強された真核細胞に対してＣ₃−Ｃ₄アルコール生産に関与する遺伝子に改変を施すには、イソプロパノールに関する上記非特許文献１、２等に記載のクロストリジウム・アセトブチリカム等に由来の酵素群の導入が挙げられる。また、ブタノールに関する文献（Applied Microbiol. Biotechol. 2008/08/03 Jan;77(6):1305-1316）に記載のクロストリジウム・アセトブチリカム等に由来の酵素群の導入が挙げられる。また、例えば、イソブタノールの生産に関して、分岐鎖アミノ酸のアミノ基転移酵素の構造遺伝子の発現量を増大させることなどの遺伝子改変が挙げられる。具体的には、ＢＡＴ１又はＢＡＴ２の構造遺伝子を含む多コピープラスミドによる遺伝子導入が挙げられる（特開平１１−２３５１７８号公報）。種々の遺伝子改変を行うための遺伝子組換えは、上記した実験書等に記載されている。またＣ₃−Ｃ₄アルコールを得るための培地に特定のアミノ酸を添加するなどの培養条件を変更することが挙げられる（特表２００７−５３３３０１号公報）。 To apply the modified gene involved in C ₃ -C ₄ alcohols produced against C ₃ -C ₄ eukaryotic cell alcohol resistance is enhanced, Clostridium described in Non-Patent Documents 1 and 2 relates to isopropanol Introducing enzymes derived from acetobutylicum and the like. Moreover, introduction | transduction of the enzyme group derived from Clostridium acetobutylicum etc. as described in the literature (Applied Microbiol. Biotechol. 2008/08/03 Jan; 77 (6): 1305-1316) regarding butanol is mentioned. In addition, for example, with respect to the production of isobutanol, genetic modifications such as increasing the expression level of a branched chain amino acid aminotransferase structural gene can be mentioned. Specific examples include gene transfer using a multi-copy plasmid containing the BAT1 or BAT2 structural gene (Japanese Patent Laid-Open No. 11-235178). Genetic recombination for carrying out various gene modifications is described in the above-mentioned experiments and the like. Also include changing the culture conditions, such as adding a specific amino acid in a medium to obtain a C ₃ -C ₄ alcohols (JP-T-2007-533301).

次に、こうした遺伝子改変を施した前記真核細胞を培養してＣ₃−Ｃ₄アルコールの生産又はその生産量を検出する。真核細胞を培養するための条件は、Ｃ₃−Ｃ₄アルコール生産増大の可能性のある条件として特別に付与する培養条件以外については、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。宿主である真核細胞の増殖を維持する炭素、窒素、および必須ミネラルの吸収可能供給源を含む任意の適切な栄養培地中で、遺伝子改変の種類や宿主である真核細胞が備えるＣ₃−Ｃ₄アルコール耐性の増強に必要なチオレドキシンの産生を生じる遺伝子発現を開始するために必要な条件（例えば、誘導プロモーターを用いる場合の温度、ｐＨ、特定化合物の添加等）を備えるようにすることができる。 Next, the eukaryotic cells subjected to such genetic modification are cultured to detect the production of C ₃ -C ₄ alcohol or the production amount thereof. The conditions for culturing eukaryotic cells can be appropriately selected according to the cell type, except for the culture conditions that are specifically given as conditions that may increase the production of C ₃ -C ₄ alcohol. In any suitable nutrient medium containing an absorbable source of carbon, nitrogen, and essential minerals that maintain the growth of the host eukaryotic cell, the type of genetic modification and the C ₃ − that the host eukaryotic cell comprises It is necessary to provide conditions necessary for initiating gene expression that causes production of thioredoxin necessary for enhancing C ₄ alcohol resistance (for example, temperature, pH, addition of a specific compound, etc. when using an inducible promoter). it can.

Ｃ₃−Ｃ₄アルコールの検出は、公知の方法により可能である。例えば、ガスクロストグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー等を用いることができる。 C ₃ -C ₄ alcohol can be detected by a known method. For example, gas crossgraphy and high performance liquid chromatography can be used.

以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to these Examples.

（酵母染色体導入用遺伝子組換えベクターの構築）
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来の３種類のチオレドキシン遺伝子（ＴＲＸ−ｈ７、ＴＲＸ−ｈ８、ＰＲＸ２）をサッカロマイセス・セレビジエにて高発現させるための染色体導入用遺伝子組換えベクターを構築した。本実施例にて構築した３種類のベクターをそれぞれｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７−ＴＲＸｈ７、ｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７−ＴＲＸｈ８及びｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７−ＰＲＸ２と命名した（図２、図３〜図５）。以下、本実施例におけるベクター構築工程の詳細を図１〜図５に基づいて説明する。なお、ベクター構築手順はこれに限定されるものではない。ベクター構築における一連の操作は、一般的なＤＮＡサブクローニング法に準じて行い、一連の酵素類はタカラバイオ社の製品を利用した。 (Construction of genetic recombination vectors for yeast chromosome transfer)
A chromosomal transfer gene recombination vector was constructed for high expression in Arabidopsis thaliana of three thioredoxin genes (TRX-h7, TRX-h8, PRX2) in Saccharomyces cerevisiae. The three types of vectors constructed in this example were named pBHPH-HOR7-TRXh7, pBHPH-HOR7-TRXh8, and pBHPH-HOR7-PRX2 (FIGS. 2 and 3 to 5). Hereinafter, the details of the vector construction process in this example will be described with reference to FIGS. The vector construction procedure is not limited to this. A series of operations in vector construction was carried out according to a general DNA subcloning method, and a series of enzymes used products of Takara Bio Inc.

（プレベクターｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７Ｐの作製）
一般的なＤＮＡサブクローニング法に従って、プレベクターｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７Ｐを構築した。プレベクター構築のスキームを図１及び図２に示す。最初に、サッカロマイセス・セレビジエのＮＲＢＣ２２６０株（独立行政法人製品評価技術機構の登録菌株である。）のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を行い、相同組換えに必要なＲＰＢ９遺伝子（増幅末端に制限酵素ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、サイトを付与した）、ＲＣＳ１遺伝子（増幅末端に制限酵素ＳａｃＩ、ＮｏｔＩサイトを付与した）を単離した。増幅の際に使用したオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列は以下の通りであった。 (Preparation of prevector pBHPH-HOR7P)
A prevector pBHPH-HOR7P was constructed according to a general DNA subcloning method. The scheme of prevector construction is shown in FIGS. First, a PCR reaction was performed using the genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae NRBC2260 strain (registered strain of Independent Administrative Institution Product Evaluation Technology Organization) as a template, and the RPB9 gene necessary for homologous recombination (restriction enzyme Apa at the amplification end) was obtained. I, Kpn I, and sites) and RCS1 gene (with restriction enzymes SacI and NotI sites added to the amplification ends) were isolated. The nucleotide sequences of the oligonucleotide primers used for amplification were as follows.

ＲＰＢ９−Ｆ（配列番号５）：ata tat ggg ccc gtg cta aga tca gga ttt ttt cat g
ＲＰＢ９−Ｒ（配列番号６）：ata tat ggt acc caa gag cag att cta ggt aga acg
ＲＣＳ１−Ｆ（配列番号７）：ata tat gag ctc gac gca ctc cga tgc tgc taa cca c
ＲＣＳ１−Ｒ（配列番号８）：ata tat gcg gcc gcc gat ata tgt aat ata ata aga acg RPB9-F (SEQ ID NO: 5): ata tat ggg ccc gtg cta aga tca gga ttt ttt cat g
RPB9-R (SEQ ID NO: 6): atat tat ggt acc caa gag cag att cta ggt aga acg
RCS1-F (SEQ ID NO: 7): ata tat gag ctc gac gca ctc cga tgc tgc taa cca c
RCS1-R (SEQ ID NO: 8): ata tat gcg gcc gcc gat ata tgt aat ata ata aga acg

ＰＣＲ反応には、増幅酵素しての増幅断片の正確性が高いとされるＫＯＤ plusＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡株式会社製）を使用した。調製した酵母ＮＲＢＣ２２６０株のゲノムＤＮＡ０ｎｇ、オリゴヌクレオチドプライマー５０ｐｍｏｌ、１０×ＫＯＤ反応用バッファー５μｌ、２５ｍＭＭｇＳＯ₄ ２μｌ、２ｍＭｄＮＴＰｍｉｘ５μｌ、ＫＯＤplusポリメラーゼ１．０ユニットを加えた合計で５０μｌの反応溶液をＰＣＲ増幅装置ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によってＤＮＡ増幅した。ＰＣＲ増幅装置の反応条件は、９６℃２分の熱処理後、９６℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で６０秒の３つの温度変化を１サイクルとし、これを２５サイクル繰り返し、最後に４℃とした。本反応試料５μｌを、１％ＴＢＥアガロースゲル（０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド含有）にて電気泳動し、本ゲルを２５４ｎｍの紫外線照射（フナコシ社製）によってＤＮＡのバンドを検出し、適切に遺伝子増幅が行われたことを確認した。 For the PCR reaction, KOD plus DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), which is considered to have high accuracy of the amplified fragment as an amplification enzyme, was used. A total of 50 μl of the reaction solution was prepared by adding 0 ng genomic DNA of the prepared yeast NRBC2260 strain, 50 pmol of oligonucleotide primer, 5 μl of 10 × KOD reaction buffer, 2 μl of 25 mM MgSO ₄ , 5 μl of 2 mM dNTPmix, and 1.0 unit of KODplus polymerase. DNA amplification was performed by Amp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems). The reaction conditions of the PCR amplification apparatus are as follows: after heat treatment at 96 ° C. for 2 minutes, one cycle consists of three temperature changes of 96 ° C. for 30 seconds, 53 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 60 seconds. The temperature was 4 ° C. 5 μl of this reaction sample was electrophoresed on a 1% TBE agarose gel (containing 0.5 μg / ml ethidium bromide), and the gel band was detected by UV irradiation at 254 nm (manufactured by Funakoshi). It was confirmed that gene amplification was performed.

単離した各遺伝子断片を、各種制限酵素にて処理した。制限酵素反応液の組成は、常法に従った。次に、ｐＢＨＰＨ−ＰＴベクター（ハイグロマイシン遺伝子発現型ベクター、図１上段）を制限酵素ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ処理によりＲＰＢ断片を導入し（図１中段）、続いて制限酵素ＳａｃＩ、ＮｏｔＩによりＲＣＳ１断片を順次導入し、ｐＢＨＰＨ−ＲＰＢ−ＲＣＳベクター（図１下段）を構築した。 Each isolated gene fragment was treated with various restriction enzymes. The composition of the restriction enzyme reaction solution followed a conventional method. Next, the pBHPH-PT vector (hygromycin gene expression type vector, upper part of FIG. 1) was introduced with RPB fragments by treatment with restriction enzymes ApaI and KpnI (middle part of FIG. 1), and then the RCS1 fragment was sequentially introduced with restriction enzymes SacI and NotI. The pBHPH-RPB-RCS vector (lower part of FIG. 1) was constructed.

続いて特開２００３−３７９０７６号公報に開示されるｐＢＴＲＰ−ＨＯＲ７Ｐ−ＬＤＨベクターを、制限酵素ＮｏｔＩ、ＳｐｅＩで処理し、得られたＨＯＲ７遺伝子プロモーターを含む断片を取得した。本断片を、上記にて構築したｐＢＨＰＨ−ＲＰＢ−ＲＣＳベクター中に連結させ、プレベクタープレベクターｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７Ｐ（図２上段）を構築した。 Subsequently, the pBTRP-HOR7P-LDH vector disclosed in JP-A-2003-379076 was treated with restriction enzymes NotI and SpeI, and the resulting fragment containing the HOR7 gene promoter was obtained. This fragment was ligated into the pBHPH-RPB-RCS vector constructed above to construct a prevector prevector pBHPH-HOR7P (upper part of FIG. 2).

（チオレドキシン遺伝子を導入した最終ベクターの構築）
上記のとおり構築したプレベクターｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７Ｐを制限酵素ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ処理した。続いて、ＴＲＸｈ７（Gene Pept ID; AAO24572, Gene Bank ID; BT003140）、ＴＲＸｈ８（Gene Pept ID; AAO39898, Gene Bank ID; BT003670）、ＰＲＸ２（Gene Pept ID; AAG46826.1, Gene Bank ID; AF332463）の各遺伝子にターミネーターを付与した３種類の遺伝子断片ＴＲＸｈ７−Ｔ、ＴＲＸｈ８−Ｔ、ＰＲＸ２−Ｔを連結し、３種類の最終ベクターｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７Ｐ−ＴＲＸｈ７、ｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７Ｐ−ＴＲＸｈ８、及びｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７Ｐ−ＰＲＸ２を作製した（図２下段）。各最終ベクターの詳細なマップを図３〜５に示す。 (Construction of final vector with thioredoxin gene introduced)
The prevector pBHPH-HOR7P constructed as described above was treated with restriction enzymes SpeI and BamHI. Subsequently, TRXh7 (Gene Pept ID; AAO24572, Gene Bank ID; BT003140), TRXh8 (Gene Pept ID; AAO39898, Gene Bank ID; BT003670), PRX2 (Gene Pept ID; AAG46826.1, Gene Bank ID; AF332463) Three gene fragments TRXh7-T, TRXh8-T, and PRX2-T, each having a terminator attached to each gene, are ligated, and three final vectors pBHPH-HOR7P-TRXh7, pBHPH-HOR7P-TRXh8, and pBHPH-HOR7P-PRX2 Was prepared (bottom of FIG. 2). Detailed maps of each final vector are shown in FIGS.

なお、上記一連のＤＮＡ連結反応は、LigaFast Rapid DNA Ligation（プロメガ社製）を用い、詳細は、付属のプロトコールに従った。また、Ligation反応溶液のコンピテント細胞への形質転換には、大腸菌JM109株（東洋紡社製）を使用した。いずれの場合も、抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有したＬＢプレート下でコロニー選抜を行い、各コロニーを用いたコロニーＰＣＲを行うことで、目的のベクターであるかどうかを確認した。なお、エタノール沈殿処理、制限酵素処理等の一連の操作は、既述の実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)に従った。 The series of DNA ligation reactions used LigaFast Rapid DNA Ligation (manufactured by Promega), and details followed the attached protocol. In addition, Escherichia coli JM109 strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used for transformation of the Ligation reaction solution into competent cells. In either case, colonies were selected under an LB plate containing 100 μg / ml of the antibiotic ampicillin, and colony PCR using each colony was performed to confirm whether the target vector was obtained. In addition, a series of operations such as ethanol precipitation treatment and restriction enzyme treatment were performed in accordance with the above-described experimental documents (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 1989, 2001).

（チオレドキシン遺伝子発現株の単離）
宿主として、実施例１で用いた酵母ＮＲＢＣ２２６０株を用いた。この酵母をＹＰＤ培養液１０ｍｌにて３０℃で対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．８）まで培養し、これにFrozen-EZ Yeast Tranforamation IIキット（ＺＹＭＯＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピセントセルに実施例１で作製した３種類の染色体導入型ベクターを制限酵素ＡｐａＩ、ＳａｃＩで処理して遺伝子導入した。これらの形質転換試料を洗浄後、１００μｌの滅菌水に懸濁させてハイグロマイシン選抜培地（最終ハイグロマイシン濃度５０μｇ／ｍｌ）に塗沫し、それぞれについて３０℃、静置培養下で形質転換体の選抜を行った。 (Isolation of thioredoxin gene expression strain)
As a host, the yeast NRBC2260 strain used in Example 1 was used. This yeast was cultured in 10 ml of YPD culture solution at 30 ° C. until the logarithmic growth phase (OD600 nm = 0.8), and a competent cell was prepared using Frozen-EZ Yeast Tranforamation II kit (manufactured by ZYMO RESEARCH). . According to the protocol attached to the kit, the three types of chromosomal transfer vectors prepared in Example 1 were treated with the restriction enzymes ApaI and SacI and introduced into this competent cell. These transformed samples are washed, suspended in 100 μl of sterilized water, smeared on hygromycin selective medium (final hygromycin concentration 50 μg / ml), and each of the transformants is cultured at 30 ° C. under static culture. Selected.

得られたそれぞれのコロニーを新たなハイグロマイシン選抜培地で再度単離し、したがって、生育能を安定に保持している株を形質転換株候補とした。次に、これらの候補株をＹＰＤ培養液２ｍで一晩培養し、これにゲノム調製キットＧｅｎとるくん酵母用(商標、タカラバイオ株式会社製)を用いてゲノムＤＮＡを調製した。調製した各ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ解析を行い、各チオレドキシン遺伝子の有無が確認できたものを形質転換体株とした。 Each of the obtained colonies was again isolated with a new hygromycin selection medium. Therefore, a strain that stably maintained the growth ability was used as a transformant candidate. Next, these candidate strains were cultured overnight in a YPD culture solution 2 m, and genomic DNA was prepared using the genome preparation kit Gen Toru-kun yeast (trademark, manufactured by Takara Bio Inc.). PCR analysis was performed using each of the prepared genomic DNAs as a template, and transformants were identified as having the presence or absence of each thioredoxin gene.

得られた各形質転換体を、１０％ＹＰＤ培地にて静置培養し、４８時間後の菌体を集菌し、Ｅ．Ｎ．Ｚ．ＡＲＮＡキットにてＲＮＡを調製した。調製試料をもとにＲｅｖｅｒｅｓｅ−ＴｒａｎｓｔｒｉｐｔＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を実施して、６種類の遺伝子組換え酵母について、チオレドキシン遺伝子（ＴＲＸ−ｈ７、ＴＲＸ−ｈ８、ＰＲＸ２）の遺伝子発現を確認した。なお、得られた形質転換体を、それぞれSaccharomyces cerevisiaeＯＣ２−ＴＲＸ-ｈ７、ＯＣ２−ＴＲＸ-ｈ８及びＯＣ２−ＴＲＸ-ｈ７株、及びＯＣ２−ＰＲＸ２株と命名した。 The obtained transformants were statically cultured in a 10% YPD medium, and the cells after 48 hours were collected. N. Z. A RNA was prepared using an RNA kit. Based on the prepared sample, reverse-transcript PCR (reverse transcription PCR) was performed, and the gene expression of the thioredoxin genes (TRX-h7, TRX-h8, PRX2) was confirmed for six types of genetically modified yeasts. In addition, the obtained transformant was named Saccharomyces cerevisiae OC2-TRX-h7, OC2-TRX-h8, OC2-TRX-h7 strain, and OC2-PRX2 strain, respectively.

（チオレドキシン遺伝子発現株における１−ブタノール耐性の評価）
実施例１で用いた酵母ＮＲＢＣ２２６０株と実施例２で作製した各形質転換株における１−ブタノール耐性効果を評価した。 (Evaluation of 1-butanol resistance in thioredoxin gene expression strains)
The yeast NRBC2260 strain used in Example 1 and the 1-butanol resistance effect in each transformed strain prepared in Example 2 were evaluated.

各形質転換株を、前培養としてＹＰＤ培地５ｍｌ、３０℃にて一晩培養した。続いて、新なたＹＰＤ培養液５ｍｌに、１−ブタノール（和光純薬株式会社製）を最終濃度１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）になるように添加し、これにそれぞれの前培養菌株を初期ＯＤ値が０．０１になるように加えて、３０℃、７２時間にわたって培養した。培養には、小型振とう培養装置ＴＶＳ０６２ＣＡ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を使用し、ＯＤ６６０ｎｍを６０分おきに自動測定した。得られた各菌体の増殖曲線から一般的な手法に従って比増殖速度を求めた。各株の比増殖速度の結果を表１に示す。また、各株において、１−ブタノールを添加しない場合の比増殖濃度を１００とし、添加により低減した増殖速度の低減割合（比増殖度の保持率）を下記の式に従って算出した。各株の比増殖速度の保持率を図６に示す。
比増殖速度の保持率（％）＝添加後の比増殖速度／添加前の比増殖速度×１００ Each transformant was cultured overnight at 30 ° C. in 5 ml of YPD medium as a preculture. Subsequently, 1-butanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 5 ml of a new YPD culture solution to a final concentration of 1.5% (wt / vol), and each precultured strain was added thereto. The initial OD value was 0.01, and the cells were cultured at 30 ° C. for 72 hours. For culture, a small shake culture apparatus TVS062CA (manufactured by ADVANTEC) was used, and OD660 nm was automatically measured every 60 minutes. The specific growth rate was determined from the obtained growth curves of each bacterial cell according to a general method. The results of the specific growth rate of each strain are shown in Table 1. In each strain, the specific growth concentration when 1-butanol was not added was taken as 100, and the reduction rate of the growth rate reduced by the addition (retention rate of specific growth rate) was calculated according to the following formula. The retention rate of the specific growth rate of each strain is shown in FIG.
Retention rate of specific growth rate (%) = specific growth rate after addition / specific growth rate before addition × 100

表１及び図６に示すように、１−ブタノールを培地に添加することで、酵母の成長が大きく抑制されることがわかった。しかしながら、チオレドキシン遺伝子ＴＲＸ−ｈ７及びＴＲＸ−ｈ８を発現させた組換え酵母では、最終濃度１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の１−ブタノール添加した場合における、比増殖速度の低減割合が低いこと、換言すれば、比増殖速度の保持率が高いことが確認された。このことから、チオレドキシン遺伝子ＴＲＸ−ｈ７及びＴＲＸ−ｈ８は、１−ブタノール耐性の向上に寄与することが明らかとなった。特に、ＴＲＸ−ｈ７遺伝子は１−ブタノール耐性向上に寄与が大きいことがわかった。一方、チオレドキシン酸化酵素遺伝子ＰＲＸ２では、比増殖速度の低下抑制効果が認められなかった。このことから、１−ブタノール耐性向上の付与は、全てのチオレドキシン酸化還元酵素遺伝子に共通した現象でないことがわかった。 As shown in Table 1 and FIG. 6, it was found that the growth of yeast was greatly suppressed by adding 1-butanol to the medium. However, in the recombinant yeast in which the thioredoxin genes TRX-h7 and TRX-h8 are expressed, the reduction rate of the specific growth rate is low when 1-butanol is added at a final concentration of 1.5% (wt / vol). In other words, it was confirmed that the retention rate of the specific growth rate was high. From this, it became clear that the thioredoxin genes TRX-h7 and TRX-h8 contribute to the improvement of 1-butanol resistance. In particular, it was found that the TRX-h7 gene greatly contributes to improvement of 1-butanol resistance. On the other hand, in the thioredoxin oxidase gene PRX2, the effect of suppressing the decrease in specific growth rate was not observed. From this, it was found that the improvement of 1-butanol resistance was not a phenomenon common to all thioredoxin oxidoreductase genes.

（ＴＲＸ−ｈ７遺伝子発現株における１−ブタノール添加濃度の影響）
本実施例では、実施例３の結果から、既述の酵母ＮＲＢＣ２２６０株とＯＣ２−ＴＲＸ-ｈ７株における１−ブタノール添加濃度に対する耐性効果を評価した。 (Influence of 1-butanol addition concentration in TRX-h7 gene expression strain)
In this example, from the results of Example 3, the resistance effect to the 1-butanol addition concentration in the yeast NRBC2260 strain and the OC2-TRX-h7 strain described above was evaluated.

各菌株を、前培養としてＹＰＤ培地５ｍｌ、３０℃にて一晩培養した。続いて新たなＹＰＤ培養液５ｍｌに、１−ブタノールを最終濃度１．５、２．０及び２．５（いずれもｗｔ／ｖｏｌ％）となるように添加して、これにそれぞれの前培養菌株を初期ＯＤ値が０．０１になるように加え、３０℃で７２時間〜９６時間にわたって培養した。培養には、小型振とう培養装置ＴＶＳ０６２ＣＡ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を使用し、ＯＤ６６０ｎｍを６０分おきに自動測定した。得られた各菌体の増殖曲線から一般的な手法に従って比増殖速度を求めた。また、各株において、実施例３と同様にして１−ブタノールの添加により低減した増殖速度の低減割合（比増殖度の保持率）を算出した。比増殖速度の結果を表２に示し、各株の比増殖速度の保持率を図７に示す。 Each strain was cultured overnight at 30 ° C. in 5 ml of YPD medium as a preculture. Subsequently, 1-butanol was added to 5 ml of a new YPD culture solution so that the final concentrations were 1.5, 2.0 and 2.5 (all were wt / vol%). Was added at an initial OD value of 0.01 and cultured at 30 ° C. for 72 to 96 hours. For culture, a small shake culture apparatus TVS062CA (manufactured by ADVANTEC) was used, and OD660 nm was automatically measured every 60 minutes. The specific growth rate was determined from the obtained growth curves of each bacterial cell according to a general method. In addition, in each strain, the rate of growth rate reduction (retention rate of specific growth rate) reduced by the addition of 1-butanol was calculated in the same manner as in Example 3. The results of the specific growth rate are shown in Table 2, and the retention rate of the specific growth rate of each strain is shown in FIG.

表２及び図７に示すように、１−ブタノールの添加濃度が高くなるにつれ、培養の誘導期が長くなる傾向が観察されたが、比増殖速度としては、添加濃度に依存されない結果が得られた。２種類の酵母間での比較では、１−ブタノールを添加することにより、比増殖速度が低下したが、いずれの添加濃度であっても、ＯＣ２−ＴＲＸｈ７株の法がより高い比増殖速度保持率を示した。これらの結果から、ＴＲＸ−ｈ７遺伝子は、１−ブタノール耐性向上に寄与することが確認できた。 As shown in Table 2 and FIG. 7, as the concentration of 1-butanol increased, a tendency for the induction period of culture to become longer was observed. However, as the specific growth rate, a result independent of the concentration of addition was obtained. It was. In comparison between the two types of yeast, the specific growth rate was reduced by adding 1-butanol, but the OC2-TRXh7 strain method has a higher specific growth rate retention rate at any added concentration. showed that. From these results, it was confirmed that the TRX-h7 gene contributes to 1-butanol resistance improvement.

（ＴＲＸ−ｈ７遺伝子発現株におけるイソブタノール（２-メチル-１-プロパノール）及びイソプロパノール（２−プロパノール）への耐性の評価
本実施例では、ＴＲＸ−ｈ７遺伝子を導入することにより、１−ブタノールだけでなく他の高級アルコールに対する耐性向上に寄与するかどうかを調べるため、イソブタノール及びイソプロパノールについても検討した。 (Evaluation of resistance to isobutanol (2-methyl-1-propanol) and isopropanol (2-propanol) in a TRX-h7 gene expression strain) In this example, only 1-butanol was introduced by introducing the TRX-h7 gene. In addition, in order to investigate whether it contributes to the improvement of resistance to other higher alcohols, isobutanol and isopropanol were also examined.

実施例３と同様に、酵母ＮＲＢＣ２２６０株と、ＯＣ２−ＴＲＸｈ７株を、前培養としてＹＰＤ培地５ｍｌ、３０℃にて一晩培養した。続いて新たなＹＰＤ培養液５ｍｌに、イソブタノールを最終濃度２．５及び４．０（いずれもｗｔ／ｖｏｌ％）及びイソプロパノールを最終濃度７．０及び８．０（いずれもｗｔ／ｖｏｌ％）となるように添加して、これにそれぞれの前培養菌株を初期ＯＤ値が０．０１になるように加え、３０℃で７２時間〜９６時間にわたって培養した。培養には、小型振とう培養装置ＴＶＳ０６２ＣＡ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を使用し、ＯＤ６６０ｎｍを６０分おきに自動測定した。得られた各菌体の増殖曲線から一般的な手法に従って比増殖速度を求めた。また、各株において、実施例３と同様にして各アルコールの添加により低減した増殖速度の低減割合（比増殖度の保持率）を算出した。各株の比増殖速度の結果を表３に示し、各株の比増殖速度の保持率を図８に示す。 As in Example 3, yeast NRBC2260 strain and OC2-TRXh7 strain were cultured overnight at 30 ° C. in 5 ml of YPD medium as preculture. Subsequently, in 5 ml of a new YPD culture solution, isobutanol at final concentrations of 2.5 and 4.0 (both wt / vol%) and isopropanol at final concentrations of 7.0 and 8.0 (both wt / vol%) Then, each precultured strain was added so that the initial OD value was 0.01, and cultured at 30 ° C. for 72 hours to 96 hours. For culture, a small shake culture apparatus TVS062CA (manufactured by ADVANTEC) was used, and OD660 nm was automatically measured every 60 minutes. The specific growth rate was determined from the obtained growth curves of each bacterial cell according to a general method. In each strain, the rate of growth rate reduction (retention rate of specific growth rate) reduced by the addition of each alcohol was calculated in the same manner as in Example 3. The results of the specific growth rate of each strain are shown in Table 3, and the retention rate of the specific growth rate of each strain is shown in FIG.

表３及び図８に示すように、ＴＲＸ−ｈ７遺伝子を導入することにより、イソブタノール及びイソプロパノールともに２０％以上の耐性保持率の向上が認められた。また、添加濃度が高くなるにつれ、ＯＣ２株及びＯＣ２−ＴＲＸｈ７株、いずれも増殖速度が低下するが、ＯＣ２−ＴＲＸｈ７株においては、非導入株に比べて、アルコール濃度による低下率が低いことがわかった。特に、４．０％イソブタノール添加時には、ＯＣ２株では全く増殖が認められなかったのに対し、ＯＣ２−ＴＲＸｈ７株では、速度が極めて遅いものの酵母の増殖が認められた。これらの結果からArabidopsis thaliana由来のＴＲＸ−ｈ７遺伝子を導入することにより、Ｃ₃アルコール及びＣ₄アルコールに対する耐性向上に効果があることがわかった。 As shown in Table 3 and FIG. 8, by introducing the TRX-h7 gene, an improvement in resistance retention of 20% or more was observed for both isobutanol and isopropanol. In addition, as the additive concentration increases, the growth rate of both the OC2 strain and the OC2-TRXh7 strain decreases, but the decrease rate due to the alcohol concentration is lower in the OC2-TRXh7 strain than in the non-introduced strain. It was. In particular, when 4.0% isobutanol was added, no growth was observed in the OC2 strain, whereas in the OC2-TRXh7 strain, yeast growth was observed although the rate was extremely slow. From these results, it was found that introduction of the TRX-h7 gene derived from Arabidopsis thaliana is effective in improving resistance to C ₃ alcohol and C ₄ alcohol.

チオレドキシン遺伝子高発現のための染色体導入用ベクター構築スキームの前段を示す図である。It is a figure which shows the front | former stage of the vector construction scheme for chromosome introduction for thioredoxin gene high expression. チオレドキシン遺伝子高発現のための染色体導入用ベクター構築スキームの後段を示す図である。It is a figure which shows the back | latter stage of the vector construction scheme for chromosome introduction | transduction for thioredoxin gene high expression. ｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７−ＴＲＸｈ７のマップを示す図である。It is a figure which shows the map of pBHPH-HOR7-TRXh7. 、ｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７−ＴＲＸｈ８のマップを示す図である。ＣＢＨ II変異体によるＰＳＣ溶液の分解結果を示す図である。, PBHPH-HOR7-TRXh8 is a diagram showing a map. It is a figure which shows the decomposition | disassembly result of the PSC solution by CBH II variant. ｐＢＨＰＨ−ＨＯＲ７−ＰＲＸ２のマップを示す図である。It is a figure which shows the map of pBHPH-HOR7-PRX2. １−ブタノール１．５ｗｔ／ｖｏｌ％添加時のチオレドキシン導入株の耐性保持率を示す図である。It is a figure which shows the tolerance retention of a thioredoxin introduction strain at the time of 1-butanol 1.5wt / vol% addition. 各種濃度で１−ブタノールを添加した時のチオレドキシン導入株の耐性保持率を示す図である。It is a figure which shows the tolerance retention of a thioredoxin introduction strain when 1-butanol is added with various density | concentrations. ２-メチル-１-プロパノール及び２−プロパノール添加時時のチオレドキシン導入株の耐性保持率をしたがって、すなわち、市販酵素製剤に対するＣＢＨ II変異体の添加効果の評価結果を相加予測値と実測値とから示す図である。Therefore, the resistance retention rate of the thioredoxin-introduced strain when 2-methyl-1-propanol and 2-propanol were added, that is, the evaluation result of the addition effect of the CBH II mutant on the commercially available enzyme preparation was expressed as an additive predicted value and an actual measurement value. FIG.

配列番号５〜８：プライマー SEQ ID NOs: 5-8: Primers

Claims

Thioredoxin is highly expressed, C ₃ -C ₄ eukaryotic cell alcohol resistance is enhanced.

Thioredoxin expressible retains one of the following encoding, C ₃ -C ₄ eukaryotic cell alcohol resistance is enhanced.
(1) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
(2) DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions and encodes a protein having thioredoxin activity
(3) DNA encoding a protein having 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and having thioredoxin activity
(4) DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
(5) DNA encoding a protein having 50% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having thioredoxin activity
(6) DNA encoding a protein having one or several amino acid mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having thioredoxin activity

The cell according to claim 1 or 2, wherein the C ₃ -C ₄ alcohol is one or more selected from 1-butanol, 2-methyl-1-propanol and 2-propanol.

The cell according to claim 1, wherein the eukaryotic cell is yeast.

The cell according to claim 4, wherein the yeast is a Saccharomyces yeast.

The cell according to claim 5, wherein the Saccharomyces yeast is Saccharomyces cerevisiae.

C ₃ -C ₄ is a host for alcohol production recombinants, cell according to any of claims 1 to 6.

A DNA construct for gene recombination for producing a eukaryotic cell having enhanced resistance to C ₃ -C ₄ alcohol, comprising the DNA according to any of the following.
(1) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
(2) DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions and encodes a protein having thioredoxin activity
(3) DNA encoding a protein having 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and having thioredoxin activity
(4) DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
(5) DNA encoding a protein having 50% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having thioredoxin activity
(6) DNA encoding a protein having one or several amino acid mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having thioredoxin activity

Comprising introducing DNA of any of the following, C ₃ -C ₄ manufacturing method of a eukaryotic cell alcohol resistance is enhanced.
(1) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
(2) DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions and encodes a protein having thioredoxin activity
(3) DNA encoding a protein having 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and having thioredoxin activity
(4) DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
(5) DNA encoding a protein having 50% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having thioredoxin activity
(6) DNA encoding a protein having one or several amino acid mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having thioredoxin activity

A C ₃ -C ₄ Screening Methods of eukaryotic cells for alcohol production,
A step of culturing eukaryotic cell of any one of C ₃ -C ₄ claims 1-7 imparted with genetically modified or culture conditions involved in alcohol production,
Detecting the production of C ₃ -C ₄ alcohol or the production amount thereof in the step,
A screening method comprising: