JP2010063378A - Cell culture carrier - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、3次元的な細胞の培養が可能な細胞培養担体に関する。 The present invention relates to a cell culture carrier capable of three-dimensional cell culture.
近年、細胞培養技術の向上に伴って、細胞が産生するアミノ酸やタンパク質などを用いた医薬品の開発、更には、細胞自身を患部に移植する再生医療などが行われるようになり、状態が良い細胞が大量に必要とされるようになってきた。このため、様々な細胞を生体外(in vitro)で効率的に培養する方法が検討されている。しかし、これらの研究の多くは、ゼラチンなどをコーティングしたシャーレやフラスコ上などの2次元的な環境で行われている。 In recent years, with the improvement of cell culture technology, the development of pharmaceuticals using amino acids and proteins produced by cells, as well as regenerative medicine for transplanting cells themselves to the affected area, etc. have been carried out, and cells in good condition Is now needed in large quantities. For this reason, methods for efficiently culturing various cells in vitro have been studied. However, many of these studies are conducted in a two-dimensional environment such as a petri dish or flask coated with gelatin.
近年、3次元構造を持たせたバイオマテリアルで細胞を培養すると、細胞の生存率や物質生産効率が向上する傾向があることが示されつつある。このため、3次元培養法が注目を集めている。以上のような現状から、今後は、より生体内(in vivo)環境に酷似した3次元構造を備えたバイオマテリアルの開発が重要になると考えられる。 In recent years, it has been shown that when cells are cultured with a biomaterial having a three-dimensional structure, cell viability and substance production efficiency tend to be improved. For this reason, three-dimensional culture methods are attracting attention. From the current situation as described above, it will be important in the future to develop biomaterials having a three-dimensional structure that more closely resembles an in vivo environment.
このようなバイオマテリアルとしては、ガラス等の無機材料、ステンレス綱等の金属材料、合成樹脂、ゴム等からなる基板表面上に、細胞を凝集化させて保持するための、アレイ状やハニカム状に規則的に配列された細胞培養セル(本願でいう凹部)を備えた細胞培養チップが開示されている(例えば、特許文献1)。 Examples of such biomaterials include an array material and a honeycomb shape for aggregating and holding cells on a substrate surface made of an inorganic material such as glass, a metal material such as stainless steel, a synthetic resin, or rubber. A cell culture chip provided with regularly arranged cell culture cells (recesses in the present application) is disclosed (for example, Patent Document 1).
また、細胞培養担体に1より大きい比重を有する比重調整物質を含めることによって、細胞培養中に細胞培養担体が浮くことがなく、かつ、細胞を良好に培養することが可能な細胞培養担体が開示されている(例えば、特許文献2)。
しかしながら、特許文献1に記載されているように、細胞培養担体の素材として高分子や金属材料等を用いると、細胞培養担体全域にわたって緻密質構造になるため、撒種した細胞が凹部内に接着されずに浮いてしまうため、細胞が凹部内に安定して接着されないという課題を有していた。
However, as described in
また、特許文献2に記載の技術はこのような課題を解決するものであるが、これによって、細胞が細胞培養担体表面に接着されてしまうため、細胞の成長方向が上方のみとなってしまい、3次元的な培養としては限界があるものであった。
Moreover, although the technique described in
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、凹部内で細胞を安定して接着させることができ、かつ、より3次元的に細胞を培養することができる細胞培養担体を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve the above technical problem, and is a cell culture carrier capable of stably adhering cells in a recess and capable of further culturing cells three-dimensionally. The purpose is to provide.
本発明に係る細胞培養担体は、緻密体で構成された第1の基材と、前記第1の基材上に積層され、前記積層された積層方向に開口部を備える凹部が前記第1の基材の表面と平行な方向に複数設けられた第2の基材と、を備え、前記凹部は、前記第1の基材で構成された底部と、前記第2の基材で構成され、少なくともその表面が多孔体である側部と、で構成されていることを特徴とする。 The cell culture carrier according to the present invention includes a first base material composed of a dense body and a concave portion which is laminated on the first base material and has an opening in the laminated direction. A plurality of second base materials provided in a direction parallel to the surface of the base material, wherein the recess is composed of a bottom portion constituted by the first base material and the second base material, It is characterized in that at least the surface thereof is composed of a side part which is a porous body.
このような細胞培養担体を用いることで、凹部内で細胞を安定して接着させることができ、かつ、より3次元的に細胞を培養することができる。 By using such a cell culture carrier, cells can be stably adhered in the recesses, and the cells can be cultured more three-dimensionally.
前記凹部の幅が10μm以上1000μm以下であり、深さが10μm以上1000μm以下であることが好ましい。 It is preferable that the width of the recess is 10 μm or more and 1000 μm or less and the depth is 10 μm or more and 1000 μm or less.
通常、細胞のサイズは10〜20μmであることから、凹部(マイクロウェル部)で細胞が選択的に接着・増殖することを考慮すると、径・深さともに10μm以上であることが好ましい。 Usually, since the size of the cell is 10 to 20 μm, it is preferable that both the diameter and the depth are 10 μm or more considering that cells selectively adhere and proliferate in the recess (microwell portion).
前記第2の基材は、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムのうちのいずれか1種のセラミックスで構成されていることが好ましい。 The second substrate is preferably composed of any one of ceramics selected from zirconia, yttria, titania, alumina, silica, hydroxyapatite, and β-tricalcium phosphate.
このような構成を備えることで、細胞に害がなく、細胞を培養することができる。 With such a configuration, the cells can be cultured without harming the cells.
前記第1の基材は、セラミックス、ガラス、有機物のうちいずれか1種の透明部材で構成されていることが好ましい。 The first substrate is preferably made of any one of transparent members of ceramics, glass, and organic matter.
このような構成を備えることで、第1の基材の裏面側から凹部内で細胞が培養される様子を逐次観察することができるため好ましい。 It is preferable to have such a configuration because it is possible to sequentially observe how cells are cultured in the recesses from the back side of the first substrate.
本発明は、凹部内で細胞を安定して接着させることができ、かつ、より3次元的に細胞を培養することができる細胞培養担体が提供される。 The present invention provides a cell culture carrier capable of stably adhering cells in a recess and capable of further culturing cells three-dimensionally.
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
図1は、本発明の実施形態に係る細胞培養担体の外観構成の一例を示す上面図であり、図2は、図1のA−A線における断面図である。 FIG. 1 is a top view illustrating an example of an external configuration of a cell culture carrier according to an embodiment of the present invention, and FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line AA of FIG.
本実施形態に係る細胞培養担体1は、図1及び図2に示すように、緻密体で構成された第1の基材2と、第1の基材2上に積層された第2の基材3とを備えている。
As shown in FIGS. 1 and 2, the
第2の基材3には、前記積層された積層方向(図2中、α)に開口部4を備える凹部5が設けられ、凹部5は第1の基材2の表面2Aと平行な方向(図2中、β)に複数設けられている。
The
また、凹部5は、第2の基材3の開口部4から、第1の基材2の表面2Aまで積層方向αと反対の方向に貫通した構成を備えており、第1の基材2で構成された底部5Aと、前記第2の基材3で構成された側部5Bとを備えている。また、側部5Bの少なくともその表面は多孔体で構成されている。
Moreover, the
本実施形態に係る細胞培養担体1は、上述したような構成を備えているため、凹部5内に投入された細胞は、緻密体で構成された底部5Aには接着されず浮いた状態となり、一方、少なくとも表面が多孔体で構成された側部5Bに前記細胞が接着される形となるため、結果として、凹部5内に投入された細胞は、凹部5内で浮いた状態で側部5Bに保持されることになる。
Since the
そのため、本実施形態に係る細胞培養担体1は、凹部5内で細胞を安定して接着させることができると共に、凹部5内で接着された細胞の下方は浮いた状態となっているため、前記下方にも空間の余地が存在する。従って、底部に接着させる従来の細胞培養担体よりも、より3次元的に細胞を培養することができる。
Therefore, the
前記第2の基材3全体が3次元的に連通した開気孔を有する多孔体で構成されていることが好ましい。
It is preferable that the entire
このような構成とすることで、第2の基材3の側面3Aから前記開気孔を通じて前記凹部5内に栄養素を供給することが可能となるため、好ましい。
Such a configuration is preferable because nutrients can be supplied from the
なお、ここでいう多孔体の開気孔の気孔径、気孔同士を連通する連通部の口径及び気孔率は、第2の基材3がその形態を保つことができる程度に十分な強度を有していれば、特に限定されない。
Here, the pore diameter of the open pores of the porous body, the diameter of the communicating portion that communicates the pores, and the porosity have sufficient strength that the
このような場合の気孔径としては、例えば、100μm以上600μm以下であり、連通部の口径としては、例えば、10μm以上60μm以下であり、気孔率としては、例えば、55%以上85%以下である。なお、ここでいう開気孔の気孔径は、顕微鏡による観察により測定した平均値である。また、連通部の口径は、水銀圧法で測定した平均値である。気孔率は、多孔体の密度と多孔体の骨格部の密度との理論密度から算出した値である。 The pore diameter in such a case is, for example, 100 μm or more and 600 μm or less, the diameter of the communication part is, for example, 10 μm or more and 60 μm or less, and the porosity is, for example, 55% or more and 85% or less. . Here, the pore diameter of the open pores is an average value measured by observation with a microscope. The diameter of the communication part is an average value measured by the mercury pressure method. The porosity is a value calculated from the theoretical density of the density of the porous body and the density of the skeleton of the porous body.
前記凹部5の幅が10μm以上1000μm以下であり、深さが10μm以上1000μm以下であることが好ましい。
The width of the
通常、細胞のサイズは10〜20μmであることから、凹部(マイクロウェル部)5で細胞が選択的に接着・増殖することを考慮すると、径・深さともに10μm以上であることが好ましい。 Usually, since the size of the cell is 10 to 20 μm, considering that the cell selectively adheres and proliferates in the recess (microwell portion) 5, both the diameter and the depth are preferably 10 μm or more.
前記第2の基材3は、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムのうちのいずれか1種のセラミックスで構成されていることが好ましい。
The
このような構成を備えることで、細胞に害がなく、細胞を培養することができる。 With such a configuration, the cells can be cultured without harming the cells.
より好ましくは、ハイドロキシアパタイトを用いた方が生体適合性の観点から更に好ましい。 More preferably, hydroxyapatite is more preferable from the viewpoint of biocompatibility.
前記第1の基材2は、セラミックス、ガラス、有機物のうちいずれか1種の透明部材で構成されていることが好ましい。
The
このような構成を備えることで、第1の基材2の裏面側から凹部5内で細胞が培養される状況を逐次観察することができるため好ましい。上述したような細胞培養担体1は、例えば、下記のような方法で製造することができる。第1の基材2を周知の方法によって作製すると共に、第2の基材3を、例えば、下記のような方法にて作製する。すなわち、所望のセラミックス原料粉に、分散媒として、例えば、ポリエチレンイミン水溶液を加え、ボールミルで攪拌混合して原料スラリーを調整し、この原料スラリーに、起泡材として、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテルを添加して攪拌して泡沫状スラリーを調整する。さらに、架橋剤としてソルビトールポリグリシジルエーテルを添加し、混合後、型に鋳込み、ゲル化体を作製する。その後、得られたゲル化体を減圧し、硬化後、型から取り出し、例えば、30℃、湿度90%の加湿乾燥器内で一昼夜乾燥させ、成形体(乾燥体)とする。次に、この成形体を、例えば、1200℃で1時間焼成して、焼結体とした後、得られた焼結体に、凹部5となる複数の貫通孔を形成することによって、第2の基材3を作製する。
By providing such a configuration, it is possible to sequentially observe the state in which cells are cultured in the
最後に、前記作製した第1の基材2と、第2の基材3とを図2に示すような構造となるように積層して接合することによって本実施形態に係る細胞培養担体1を製造することができる。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により限定されるものではない。
(実施例1)
第1の基材2を緻密体の透明ガラスとして、第2の基材3を気孔率50%〜60%を有するハイドロキシアパタイト多孔体の焼結体として、それぞれ構成し、幅が40μm、深さが40μmである凹部5が複数形成された図1に示すような細胞培養担体1を作製した。
Finally, the
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further more concretely based on an Example, this invention is not limited by the following Example.
Example 1
The
次に、この細胞培養担体1を24ウェルプレートの穴に入れ、Hep−G2(ヒト肝ガン細胞)を1.0×104個撒種し、10%FBS(fetal bovine serum;ウシ胎児血清)を混合したDMEMを用いて、5%CO2インキュベータ内で、37℃で培養した。
Next, this
7日間経過後、培養担体上で増殖したHep−G2を、トリプシン処理により剥離し、血球計算板により、細胞数を計測したところ、5.0×105個であった。また、増殖した細胞を、グルタルアルデヒドで固定処理し、SEM観察したところ、凹部5内で、Hep−G2が細胞凝集体を形成していることが認められた。
After 7 days, Hep-G2 grown on the culture carrier was peeled off by trypsin treatment, and the number of cells was measured with a hemocytometer. As a result, it was 5.0 × 10 5 . In addition, when the grown cells were fixed with glutaraldehyde and observed with SEM, it was found that Hep-G2 formed cell aggregates in the
さらに、上記において増殖したHep−G2について、免疫測定法により、細胞1.0×106個当たりのアルブミン量を算出したところ、400μg/日であり、ゼラチンコートディッシュにおいて増殖したHep−G2と比較して、約6倍の物質生産能力を有していることが認められた。
(比較例1)
第1の基材2を気孔率50%〜60%を有するハイドロキシアパタイト多孔体の焼結体として構成した以外は、実施例1と同様な細胞培養担体を作製した。
Further, the amount of albumin per 1.0 × 10 6 cells of Hep-G2 grown in the above was calculated by immunoassay, which was 400 μg / day, compared with Hep-G2 grown in gelatin-coated dishes. Thus, it was found that the substance production capacity was about 6 times.
(Comparative Example 1)
A cell culture carrier similar to that of Example 1 was prepared except that the
次に、この細胞培養担体を24ウェルプレートの穴に入れ、Hep−G2(ヒト肝ガン細胞)を1.0×104個撒種し、10%FBS(fetal bovine serum;ウシ胎児血清)を混合したDMEMを用いて、5%CO2インキュベータ内で、37℃で培養した。 Next, this cell culture carrier is put into a well of a 24-well plate, 1.0 × 10 4 Hep-G2 (human hepatoma cells) are seeded, and 10% FBS (fetal bovine serum) is added. Using mixed DMEM, the cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
7日間経過後、培養担体上で増殖したHep−G2を、トリプシン処理により剥離し、血球計算板により、細胞数を計測したところ、1.0×105個であった。また、増殖した細胞を、グルタルアルデヒドで固定処理し、SEM観察したところ、凹部5内で、Hep−G2が細胞凝集体を形成していることが認められた。
After 7 days, Hep-G2 grown on the culture carrier was peeled off by trypsin treatment, and the number of cells was measured with a hemocytometer. As a result, it was 1.0 × 10 5 . In addition, when the grown cells were fixed with glutaraldehyde and observed with SEM, it was found that Hep-G2 formed cell aggregates in the
さらに、上記において増殖したHep−G2について、免疫測定法により、細胞1.0×106個当たりのアルブミン量を算出したところ、40μg/日であり、ゼラチンコートディッシュにおいて増殖したHep−G2と比較して、物質生産能力は同等程度であることが認められた。 Further, the amount of albumin per 1.0 × 10 6 cells of Hep-G2 grown in the above was calculated by immunoassay, which was 40 μg / day, compared with Hep-G2 grown in gelatin-coated dishes. Thus, the material production capacity was found to be comparable.
1…細胞培養担体、2…第1の基材、3…第2の基材、4…開口部、5…凹部、5A…底部、5B…側部。
DESCRIPTION OF
Claims (4)
前記第1の基材上に積層され、前記積層された積層方向に開口部を備える凹部が前記第1の基材の表面と平行な方向に複数設けられた第2の基材と、を備え、
前記凹部は、前記第1の基材で構成された底部と、前記第2の基材で構成され、少なくともその表面が多孔体である側部と、で構成されていることを特徴とする細胞培養担体。 A first substrate composed of a dense body;
A second base material laminated on the first base material and provided with a plurality of recesses having openings in the laminated direction of the stacking in a direction parallel to the surface of the first base material. ,
The cell is characterized in that the recess is constituted by a bottom part constituted by the first base material and a side part constituted by the second base material and at least a surface thereof being a porous body. Culture carrier.
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