JP2010060394A - Fluorescent probe having stem loop structure - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ステムループ構造を有する蛍光プローブに関する。 The present invention relates to a fluorescent probe having a stem-loop structure.
ポリヌクレオチドの末端にクエンチャー分子(蛍光消光分子）としてグアニン塩基を配置し、他端に蛍光分子を持つプローブが知られている（非特許文献１及び２）。
非特許文献１に記載されたプローブでは、ポリヌクレオチドの末端にクエンチャー分子としてグアニン塩基を配置する必要があり、ステム部位の塩基配列に制限があるという問題がある。
本発明の目的は、ステムループ構造を有するプローブにおいて、ステム部位の塩基配列に制限がなく、簡易に調製できる蛍光プローブを提供することである。
In the probe described in Non-Patent Document 1, it is necessary to place a guanine base as a quencher molecule at the end of the polynucleotide, and there is a problem that the base sequence of the stem site is limited.
An object of the present invention is to provide a fluorescent probe that can be easily prepared in a probe having a stem-loop structure, with no restriction on the base sequence of the stem site.
本発明の蛍光プローブの特徴は、ステムループ構造を有するプローブにおいて、
式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有する点を要旨とする。
Ｒは蛍光性有機基、Ｘは蛍光性有機基とプリン骨格の８位炭素とを繋ぐ結合基、Ｙは水素原子又は水酸基、Ｏは酸素原子、Ｐはリン原子、Ｃは炭素原子、Ｈは水素原子、Ｎは窒素原子を表す。
A feature of the fluorescent probe of the present invention is that in a probe having a stem-loop structure,
The gist is that the nucleotide represented by the formula (1) is contained as a structural unit.
R is a fluorescent organic group, X is a bonding group connecting the fluorescent organic group and the 8-position carbon of the purine skeleton, Y is a hydrogen atom or hydroxyl group, O is an oxygen atom, P is a phosphorus atom, C is a carbon atom, and H is A hydrogen atom and N represent a nitrogen atom.
本発明の蛍光プローブは、ポリヌクレオチドの末端にクエンチャー分子としてグアニン塩基を配置する必要がないため、ステム部位の塩基配列に制限がない。また、本発明の蛍光プローブは、クエンチャー分子を必要としないため、簡易に調製することができる。また、本発明の蛍光プローブの両末端は、蛍光性分子やクエンチャー分子で修飾する必要がないため、さらに任意の修飾を施したり、基材（チップ）へ固定してマイクロアレイを調製することができる。 In the fluorescent probe of the present invention, it is not necessary to place a guanine base as a quencher molecule at the end of the polynucleotide, so that the base sequence of the stem site is not limited. Moreover, since the fluorescent probe of the present invention does not require a quencher molecule, it can be easily prepared. In addition, since both ends of the fluorescent probe of the present invention do not need to be modified with a fluorescent molecule or a quencher molecule, it can be further modified or fixed to a substrate (chip) to prepare a microarray. it can.
本発明において、ステムループ構造とは、二重鎖を形成している部分をステム（茎）、折り返しの輪になっている部分をループ（輪）と見立てて呼ばれる構造を意味する(図１参照。)。ステムループ構造は、ｍＲＮＡの二次構造の一般的な構造の一つである。
また、塩基とは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はウラシル（Ｕ）を意味する。
In the present invention, the stem-loop structure means a structure called a stem (stem) as a part forming a double chain, and a loop (ring) as a part forming a folded ring (see FIG. 1). .). The stem loop structure is one of the general structures of the secondary structure of mRNA.
The base means adenine (A), thymine (T), cytosine (C), guanine (G) or uracil (U).
蛍光性有機基（Ｒ）としては蛍光を発する有機基であれば制限がないが、ピレン骨格、アントラセン骨格、ペリレン骨格、アクリドン骨格、クマリン骨格、イソクマリン骨格、キサントン骨格、チオキサントン骨格、フェナントレン骨格、ベンゾフェノン骨格、フルオレン骨格又はジフェニルチオエーテル骨格を有する有機基が好ましく、さらに好ましくはピレン骨格、アントラセン骨格、ペリレン骨格、アクリドン骨格、クマリン骨格、イソクマリン骨格、キサントン骨格、チオキサントン骨格又はフェナントレン骨格を有する有機基である。 The fluorescent organic group (R) is not limited as long as it is a fluorescent organic group, but a pyrene skeleton, anthracene skeleton, perylene skeleton, acridone skeleton, coumarin skeleton, isocoumarin skeleton, xanthone skeleton, thioxanthone skeleton, phenanthrene skeleton, benzophenone An organic group having a skeleton, a fluorene skeleton, or a diphenylthioether skeleton is preferable, and an organic group having a pyrene skeleton, anthracene skeleton, perylene skeleton, acridone skeleton, coumarin skeleton, isocoumarin skeleton, xanthone skeleton, thioxanthone skeleton, or phenanthrene skeleton is more preferable. .
蛍光性有機基（Ｒ）には、置換基を有してもよい。置換基を有すると、母骨格の吸収波長を長波長側にシフトさせることができる。シフトする程度（シフト値）は、置換基の種類等によって相違し、このシフト値については「有機化学のスペクトルによる同定法 第５版（R.M.Silverstein著、２８１頁、１９９３年東京化学同人発行）」に記載の表が参考となる。
置換基としては、水酸基、炭素数１〜４のアルコキシ基（メトキシ、イソプロポキシ及びブトキシ等）、炭素数１〜４のアシロキシ基（アセトキシ等）、炭素数１〜７のアシル基（アセチル及びベンゾイル等）、ニトロ基及びシアノ基等が挙げられる。
The fluorescent organic group (R) may have a substituent. When it has a substituent, the absorption wavelength of the mother skeleton can be shifted to the long wavelength side. The degree of shift (shift value) varies depending on the type of substituents, etc., and the shift value is described in “Identification Method by Spectrum of Organic Chemistry 5th Edition (RMSilverstein, 281, published by Tokyo Chemical Dojin)”. The listed table is helpful.
Examples of the substituent include a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms (such as methoxy, isopropoxy, and butoxy), an acyloxy group having 1 to 4 carbon atoms (such as acetoxy), and an acyl group having 1 to 7 carbon atoms (acetyl and benzoyl). Etc.), nitro group, cyano group and the like.
ピレン骨格を有する有機基としては、１−ピレニルカルボニルアミノ、１−ピレニルカルボニルオキシ及び１−ピレニル等が挙げられる。 Examples of the organic group having a pyrene skeleton include 1-pyrenylcarbonylamino, 1-pyrenylcarbonyloxy and 1-pyrenyl.
アントラセン骨格を有する有機基としては、１−アントリルカルボニルアミノ、２−アントリルカルボニルアミノ、９−アントリルカルボニルアミノ、１０−ブトキシ−９−アントリルカルボニルアミノ、１−アントリルカルボニルオキシ、２−アントリルカルボニルオキシ、１−アントリル及び２−アントリル等が挙げられる。 Examples of the organic group having an anthracene skeleton include 1-anthrylcarbonylamino, 2-anthrylcarbonylamino, 9-anthrylcarbonylamino, 10-butoxy-9-anthrylcarbonylamino, 1-anthrylcarbonyloxy, 2- Anthrylcarbonyloxy, 1-anthryl, 2-anthryl and the like can be mentioned.
ペリレン骨格を有する有機基としては、３−ペリレニルカルボニルアミノ、３−ペリレニルカルボニルオキシ及び３−ペリレニル等が挙げられる。 Examples of the organic group having a perylene skeleton include 3-perylenylcarbonylamino, 3-perylenylcarbonyloxy, and 3-perylenyl.
アクリドン骨格を有する有機基としては、１０−アクリドニルメチルカルボニルアミノ及び１０−アクリドニルメチルカルボニルオキシ等が挙げられる。 Examples of the organic group having an acridone skeleton include 10-acridonylmethylcarbonylamino and 10-acridonylmethylcarbonyloxy.
クマリン骨格を有する有機基としては、３−クマリニルカルボニルアミノ、３−クマリニルカルボニルオキシ、７−メトキシ−３−クマリニルカルボニルアミノ及び７−メトキシ−３−クマリニルカルボニルオキシ等が挙げられる。 Examples of the organic group having a coumarin skeleton include 3-coumarinylcarbonylamino, 3-coumarinylcarbonyloxy, 7-methoxy-3-coumarinylcarbonylamino and 7-methoxy-3-coumarinylcarbonyloxy.
イソクマリン骨格を有する有機基としては、３−イソクマリニルカルボニルアミノ、３−イソクマリニルカルボニルオキシ、７−メトキシ−３−イソクマリニルカルボニルアミノ及び７−メトキシ−３−イソクマリニルカルボニルオキシ等が挙げられる。 Examples of the organic group having an isocoumarin skeleton include 3-isocoumarinylcarbonylamino, 3-isocoumarinylcarbonyloxy, 7-methoxy-3-isocoumarinylcarbonylamino, and 7-methoxy-3-isocoumarinylcarbonyloxy. Can be mentioned.
キサントン骨格を有する有機基としては、２−キサントニリルカルボニルアミノ、２−キサントニリルカルボニルオキシ、４−キサントニリルカルボニルアミノ、４−キサントニリルカルボニルオキシ、２−キサントニリル、４−キサントニリル、７−メトキシ−２−キサントニリル、２−メトキシ−４−キサントニリル、２−メトキシ−３−キサントニリル及び２，３−ジメトキシ−４−キサントニリル等が挙げられる。 Examples of the organic group having a xanthone skeleton include 2-xanthonyl carbonylamino, 2-xanthonyl carbonyloxy, 4-xanthonyl carbonylamino, 4-xanthonyl carbonyloxy, 2-xanthonyl, 4-xanthonyl, 7 -Methoxy-2-xanthonyl, 2-methoxy-4-xanthonyl, 2-methoxy-3-xanthonyl, 2,3-dimethoxy-4-xanthonyl, and the like.
チオキサントン骨格を有する有機基としては、２−チオキサントニリルカルボニルアミノ、２−チオキサントニリルカルボニルオキシ、４−チオキサントニリルカルボニルアミノ、４−チオキサントニリルカルボニルオキシ、２−チオキサントニリル、４−チオキサントニリル、７−メトキシ−２−チオキサントニリル、２−メトキシ−４−チオキサントニリル、２−メトキシ−３−チオキサントニリル及び２，３−ジメトキシ−４−チオキサントニリル等が挙げられる。 Examples of the organic group having a thioxanthone skeleton include 2-thioxanthonirylcarbonylamino, 2-thioxanthonirylcarbonyloxy, 4-thioxanthonirylcarbonylamino, 4-thioxanthonirylcarbonyloxy, 2-thioxanthoniyl. Ril, 4-thioxanthonyl, 7-methoxy-2-thioxanthonyl, 2-methoxy-4-thioxanthonyl, 2-methoxy-3-thioxanthonyl and 2,3-dimethoxy-4- Examples include thioxanthonitrile.
フェナントレン骨格を有する有機基としては、１−フェナントリルカルボニルアミノ、２−フェナントリルカルボニルアミノ、１−フェナントリルカルボニルオキシ、２−フェナントリルカルボニルオキシ、１−フェナントリル及び９−フェナントリル等が挙げられる。 Examples of the organic group having a phenanthrene skeleton include 1-phenanthrylcarbonylamino, 2-phenanthrylcarbonylamino, 1-phenanthrylcarbonyloxy, 2-phenanthrylcarbonyloxy, 1-phenanthryl and 9-phenanthryl. Can be mentioned.
ベンゾフェノン骨格を有する有機基としては、４−ベンゾイルフェニルカルボニルアミノ、４−ベンゾイルフェニルカルボニルオキシ及び４−ベンゾイルフェニル等が挙げられる。 Examples of the organic group having a benzophenone skeleton include 4-benzoylphenylcarbonylamino, 4-benzoylphenylcarbonyloxy and 4-benzoylphenyl.
フルオレン骨格を有する有機基としては、９−フルオレニルカルボニルアミノ、９−フルオレニルカルボニルオキシ及び９−フルオレニル等が挙げられる。 Examples of the organic group having a fluorene skeleton include 9-fluorenylcarbonylamino, 9-fluorenylcarbonyloxy and 9-fluorenyl.
ジフェニルチオエーテル骨格を有する有機基としては、４−フェニルチオベンゾイルアミノ及び４−フェニルチオベンゾイルオキシ等が挙げられる。 Examples of the organic group having a diphenylthioether skeleton include 4-phenylthiobenzoylamino and 4-phenylthiobenzoyloxy.
蛍光性有機基とプリン骨格の８位炭素とを繋ぐ結合基（Ｘ）としては、式（１）で表されるヌクレオチド（修飾グアニン）がシトシン（Ｃ）とハイブリタイズしたとき、蛍光性有機基が修飾グアニン及びシトシンの塩基対に近づいて蛍光性有機基のπ電子が吸引される状態をとることができれば特に制限はないが、炭素数１〜１８のアルキレン基を含んでなることが好ましい。この結合基（Ｘ）には、エーテル結合、アミド結合、エステル結合、ウレタン結合及び／又はウレア結合等を含んでもよい。 As the linking group (X) that connects the fluorescent organic group and the 8-position carbon of the purine skeleton, when the nucleotide (modified guanine) represented by the formula (1) is hybridized with cytosine (C), the fluorescent organic group Is not particularly limited as long as it can approach the base pair of modified guanine and cytosine and the π electrons of the fluorescent organic group are attracted, but it preferably contains an alkylene group having 1 to 18 carbon atoms. The bonding group (X) may include an ether bond, an amide bond, an ester bond, a urethane bond, and / or a urea bond.
Ｙが水素原子のときＤＮＡに対応し、一方、Ｙが水酸基のときＲＮＡに対応する。 When Y is a hydrogen atom, it corresponds to DNA, while when Y is a hydroxyl group, it corresponds to RNA.
本発明の蛍光プローブは、式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有すれば、その含有位置や含有数に制限はない。 If the fluorescent probe of this invention contains the nucleotide represented by Formula (1) as a structural unit, there will be no restriction | limiting in the containing position and content number.
式（１）で表されるヌクレオチド単位がステム部位に有すると、本発明の蛍光プローブは、ターゲットポリヌクレオチドとハイブリタイズする前は蛍光を発しないが、ターゲットポリヌクレオチドとハイブリタイズすると蛍光を発することとなる。一方、式（１）で表されるヌクレオチド単位がループ部位に有すると、本発明の蛍光プローブは、ターゲットポリヌクレオチドとハイブリタイズする前は蛍光を発するが、ターゲットポリヌクレオチドとハイブリタイズすると蛍光を発しないこととなる。これらのうち、式（１）で表されるヌクレオチド単位をステム部位に有することが好ましい。 When the nucleotide unit represented by the formula (1) is present at the stem site, the fluorescent probe of the present invention does not emit fluorescence before hybridizing with the target polynucleotide, but emits fluorescence when hybridized with the target polynucleotide. It becomes. On the other hand, when the nucleotide unit represented by formula (1) is present in the loop site, the fluorescent probe of the present invention emits fluorescence before hybridizing with the target polynucleotide, but emits fluorescence when hybridized with the target polynucleotide. Will not. Among these, it is preferable to have a nucleotide unit represented by the formula (1) at the stem site.
式（１）で表されるヌクレオチド単位は、３’末端から２〜１０番目の塩基の位置に有することが好ましい。 The nucleotide unit represented by formula (1) preferably has a position of the 2nd to 10th bases from the 3 'end.
ステム部位の塩基の数は特に制限ないが、４〜１０個が好ましい。 The number of bases in the stem site is not particularly limited, but 4 to 10 is preferable.
式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位の含有量は特に制限ないが、１個又は少なくとも２個含有することが好ましく、さらに好ましくは１個又は２〜４個含有することである。少なくとも２個有すると、蛍光が長波長側にシフトする蛍光があるため、検出が容易となりやすい。 The content of the structural unit of the nucleotide represented by the formula (1) is not particularly limited, but it is preferably 1 or at least 2, more preferably 1 or 2 to 4. When there are at least two, the fluorescence tends to be shifted to the longer wavelength side, so that detection is easy.
式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有する蛍光プローブは、公知の方法で製造することができる。たとえば、特開２００８−１６２９１６公報に記載された方法により、２’−デオキシグアノシン又はグアノシンの８−炭素をハロゲン化してから、アセチレン化合物をカップリングした後、接触水素還元することにより、式（２）で表される８-置換グアニンを合成する。次いで、８−置換グアニンを原料の一つとして、ＤＮＡ自動合成機を用い、オリゴヌクレオチドを合成した後、このオリゴヌクレオチドと蛍光性有機基（Ｒ）を構成する前駆体とを反応させて本発明の蛍光プローブを製造することができる。 The fluorescent probe containing the nucleotide represented by the formula (1) as a structural unit can be produced by a known method. For example, after halogenating the 8-carbon of 2′-deoxyguanosine or guanosine by the method described in JP-A-2008-162916, the acetylene compound is coupled and then subjected to catalytic hydrogen reduction to obtain the formula (2 8) -substituted guanine represented by Subsequently, using 8-substituted guanine as one of the raw materials, an oligonucleotide is synthesized using an automatic DNA synthesizer, and then this oligonucleotide is reacted with a precursor constituting the fluorescent organic group (R) to produce the present invention. The fluorescent probe can be manufactured.
なお、式（２）で表される８-置換グアニンと蛍光性有機基（Ｒ）を構成する前駆体とを反応させて式（１）で表されるヌクレオチドを製造した後、このヌクレオチドを原料の一つとして、ＤＮＡ自動合成機を用い、本発明の蛍光プローブを製造してもよい。 The 8-substituted guanine represented by the formula (2) is reacted with the precursor constituting the fluorescent organic group (R) to produce the nucleotide represented by the formula (1), and then this nucleotide is used as a raw material. As one of them, the fluorescent probe of the present invention may be produced using an automatic DNA synthesizer.
Ｚは反応性置換基（アミノ基及びカルボキシル基等）、Ｑは反応性置換基（Ｚ）とプリン骨格の８位炭素とを繋ぐ結合基を表し、Ｙ、Ｏ、Ｐ、Ｃ、Ｈ及びＮは式１と同じ意味である。なお、Ｑは式（１）のＸと同じ基が含まれる。 Z represents a reactive substituent (such as an amino group and a carboxyl group), Q represents a bonding group that connects the reactive substituent (Z) and the 8-position carbon of the purine skeleton, and Y, O, P, C, H, and N Has the same meaning as in formula 1. Q includes the same group as X in formula (1).
式（２）で表される８-置換グアニンのＺがアミノ基の場合、蛍光性有機基（Ｒ）を構成する前駆体として、蛍光有機基（Ｒ）をもつカルボキシスクシンイミドエステル又は蛍光有機基（Ｒ）をもつハロゲン化物等を用いることにより、蛍光有機基（Ｒ）がアミド結合又はアミノ結合により結合した蛍光プローブ又は式（１）で表されるヌクレオチドが得られる。 When Z of the 8-substituted guanine represented by the formula (2) is an amino group, a carboxysuccinimide ester having a fluorescent organic group (R) or a fluorescent organic group (R) as a precursor constituting the fluorescent organic group (R) ( By using a halide or the like having R), a fluorescent probe in which the fluorescent organic group (R) is bonded by an amide bond or an amino bond or a nucleotide represented by the formula (1) is obtained.
蛍光有機基（Ｒ）をもつカルボキシスクシンイミドエステルを用いる場合、反応溶媒（たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）やアルカリ触媒（たとえば、炭酸水素ナトリウム）を用いることが好ましい。反応温度は２５〜３８℃程度である。反応時間は１０〜２４時間程度である。 When a carboxysuccinimide ester having a fluorescent organic group (R) is used, it is preferable to use a reaction solvent (for example, N, N-dimethylformamide) or an alkali catalyst (for example, sodium bicarbonate). The reaction temperature is about 25-38 ° C. The reaction time is about 10 to 24 hours.
蛍光有機基（Ｒ）をもつハロゲン化物を用いる場合、反応溶媒（たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン及びトルエン）を用いることが好ましい。反応温度は２０〜３８℃程度である。反応時間は１〜１０時間程度である。 When a halide having a fluorescent organic group (R) is used, it is preferable to use a reaction solvent (for example, N, N-dimethylformamide, acetone and toluene). The reaction temperature is about 20 to 38 ° C. The reaction time is about 1 to 10 hours.
蛍光有機基（Ｒ）をもつカルボキシスクシンイミドエステルは、公知の方法で得ることができ、たとえば、蛍光有機基（Ｒ）を持つカルボン酸（たとえば、１−ピレンカルボン酸、４−オキソ−４−ピレニルブタン酸、３−クマリンカルボン酸、１０−アクリドニル酢酸、３−ペリレンカルボン酸、２−アントラセンカルボン酸、１−アントラセンカルボン酸、９−アントラセンカルボン酸、３−キサントンカルボン酸、３−チオキサントンカルボン酸、９−フルオレンカルボン酸及び９−フェナントレンカルボン酸）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを反応させることにより得ることができる。 The carboxysuccinimide ester having a fluorescent organic group (R) can be obtained by a known method, for example, a carboxylic acid having a fluorescent organic group (R) (for example, 1-pyrenecarboxylic acid, 4-oxo-4-pyrenylbutane). Acid, 3-coumarin carboxylic acid, 10-acridonyl acetic acid, 3-perylene carboxylic acid, 2-anthracene carboxylic acid, 1-anthracene carboxylic acid, 9-anthracene carboxylic acid, 3-xanthone carboxylic acid, 3-thioxanthone carboxylic acid, 9 -Fluorenecarboxylic acid and 9-phenanthrenecarboxylic acid) and N-hydroxysuccinimide can be obtained.
蛍光有機基（Ｒ）をもつハロゲン化物は、市場から容易に入手できるほか、公知の方法｛J.Am.Chem.Soc.(74)4296(1952)、Arch.Pharm.(Weinheim)326、451(1993)、Chem.Pharm.Bull.35(6)2545(1987)、Indian Journal of Chemistry(20)50(1981)、Chemische Berichte(49)2487(1916)、Journal of the Chemical Society(99)2047(1911)、J.Photochem.Photobio.A;Chem(159)173(2003)、第４版実験化学講座２１日本化学会編ｐ２７５、Tetrahedron:Asynmetry,18(8)1003(2007)、Organic Letters,8(6)1189(2006)、Journal of Organometallic Chemistry,691,p1389(2006)、Bull. Chem. Soc. Jpn.,(53)1385(1980)、The Journal of Organic Chemistry(65)3005(2000)、Journal of the American Chemical Society(69)1038(1941)、Organic synthesis, Coll.vol.5,918(1973)、第４版実験化学講座１９日本化学会編ｐ４２２、第４版実験化学講座２１日本化学会編ｐ１０６、第４版実験化学講座２０日本化学会編ｐ１、第４版実験化学講座１９日本化学会編ｐ４２２｝によって得ることができる。 Halides having a fluorescent organic group (R) can be easily obtained from the market, and the known methods {J. Am. Chem. Soc. (74) 4296 (1952), Arch. Pharm. (Weinheim) 326, 451 (1993), Chem. Pharm. Bull. 35 (6) 2545 (1987), Indian Journal of Chemistry (20) 50 (1981), Chemische Berichte (49) 2487 (1916), Journal of the Chemical Society (99) 2047 (1911), J. Photochem. Photobio. A; Chem (159) 173 (2003), 4th edition, Experimental Chemistry Lecture 21 edited by the Chemical Society of Japan, p275, Tetrahedron: Asynmetry, 18 (8) 1003 (2007), Organic Letters, 8 (6) 1189 (2006), Journal of Organometallic Chemistry, 691, p1389 (2006), Bull. Chem. Soc. Jpn., (53) 1385 (1980), The Journal of Organic Chemistry (65) 3005 (2000) , Journal of the American Chemical Society (69) 1038 (1941), Organic synthesis, Coll. Vol. 5, 918 (1973), 4th edition Experimental Chemistry Course 19 Japanese Chemical Society, p422, 4th edition Experimental Chemistry Course 21 Japanese Chemical Society Ed p106, 4th edition experimental chemistry course 20 Japanese Chemical Society ed p1, 4th edition experimental chemistry course 19 It can be obtained by the present edited by the Chemical Society P422}.
本発明の蛍光プローブは、ポリヌクレオチドの末端にクエンチャー分子としてグアニン塩基を配置する必要がないため、ステム部位の塩基配列に制限がない。したがって、ステム部位及びループ部位を自由に設計できる。
また、本発明の蛍光プローブの両末端は、蛍光性分子やクエンチャー分子で修飾する必要がないため、さらに任意の修飾を施したり、基材（チップ）へ固定してマイクロアレイを調製することができる。たとえば、酵素に対し完全な耐性を持ち、粗抽出液中でのタンパク質結合を検出しうるペプチド核酸（ＰＮＡ）を本発明の蛍光プローブに応用すると、網羅的なＤＮＡ−タンパク質間の結合解析が可能となる。また、各種疾患に対応させたＰＮＡを本発明の蛍光プローブに応用すると、各疾患におけるプロモーター異常・遺伝子発現異常の高速解析を行うことが可能となる。
In the fluorescent probe of the present invention, it is not necessary to place a guanine base as a quencher molecule at the end of the polynucleotide, so that the base sequence of the stem site is not limited. Therefore, a stem part and a loop part can be designed freely.
In addition, since both ends of the fluorescent probe of the present invention do not need to be modified with a fluorescent molecule or a quencher molecule, it can be further modified or fixed to a substrate (chip) to prepare a microarray. it can. For example, when peptide nucleic acids (PNA) that have complete resistance to enzymes and can detect protein binding in crude extracts are applied to the fluorescent probe of the present invention, comprehensive DNA-protein binding analysis is possible. It becomes. In addition, when PNA corresponding to various diseases is applied to the fluorescent probe of the present invention, it becomes possible to perform high-speed analysis of promoter abnormality and gene expression abnormality in each disease.
＜実施例１＞
特開２００８−１６２９１６号公報の実施例の記載に準じて、２’−デオキシグアノシン５．６８１ｇ（０．０２１ｍｏｌ）を蒸留水４００ｍｌに懸濁させ、Ｎ−ブロモコハク酸イミド４．１７ｇ（０．０２３ｍｏｌ）を加え、約２５℃で３０分間反応させた後、析出した固体を減圧濾過し、蒸留水で洗浄し、さらにアセトンで洗浄して、淡紫色固体（ｓ１）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析及びＩＲ分析により、得られた淡紫色固体（ｓ１）は、８−ブロモ−デオキシグアノシンであることを同定した。
<Example 1>
According to the description in the examples of JP-A-2008-162916, 5.681 g (0.021 mol) of 2′-deoxyguanosine was suspended in 400 ml of distilled water, and 4.17 g (0.023 mol) of N-bromosuccinimide was obtained. ) And reacted at about 25 ° C. for 30 minutes, and then the precipitated solid was filtered under reduced pressure, washed with distilled water, and further washed with acetone to obtain a pale purple solid (s1).
The pale purple solid (s1) obtained was identified as 8-bromo-deoxyguanosine by 1 H-NMR analysis and IR analysis.
淡紫色固体（ｓ１）３００ｍｇ（０．８６７ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下、Ｎ−ヘキサ−５−イニルトリフルオロアセトアミド４９８ｍｇ（２．５８１ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）３３ｍｇ（０．１７３ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）９９ｍｇ（０．０８６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン１４８μＬ（１．４６３ｍｍｏｌ）を加え、５５℃で２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール：体積比７／１）により精製して、白色固体（ｓ２）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析及びＩＲ分析により、得られた白色固体（ｓ２）は、８−（６−（トリフルオロメチルカルボニルアミノ）ヘキサ−１−イニル）デオキシグアノシンであることを同定した。
300 mg (0.867 mmol) of pale purple solid (s1) was dissolved in 30 ml of anhydrous N, N-dimethylformamide, and 498 mg (2.581 mmol) of N-hex-5-ynyltrifluoroacetamide, copper iodide ( I) 33 mg (0.173 mmol), tetrakistriphenylphosphine palladium (0) 99 mg (0.086 mmol) and triethylamine 148 μL (1.463 mmol) were added, and the mixture was stirred at 55 ° C. for 2 hours. After confirming the disappearance of the raw material by thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was distilled off, and the residue was purified by column chromatography (silica gel, chloroform / methanol: volume ratio 7/1) to obtain a white solid (s2 )
The white solid (s2) obtained was identified as 8- (6- (trifluoromethylcarbonylamino) hex-1-ynyl) deoxyguanosine by 1 H-NMR analysis and IR analysis.
白色固体（ｓ２）３７６ｍｇ（０．７２１ｍｍｏｌ）を無水エタノール１５ｍｌに溶解し、パラジウムカーボン５０ｍｇを加え、系内を水素置換した後、約２５℃で１４時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール：体積比７／１）により精製して、白色固体（ｓ３）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析及びＩＲ分析により、得られた白色固体（ｓ３）は、８−（６−（トリフルオロメチルカルボニルアミノ）ヘキシル）デオキシグアノシンであることを同定した。
376 mg (0.721 mmol) of a white solid (s2) was dissolved in 15 ml of absolute ethanol, 50 mg of palladium carbon was added, the inside of the system was replaced with hydrogen, and the mixture was stirred at about 25 ° C. for 14 hours. After confirming the disappearance of the raw material by thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was distilled off, and the residue was purified by column chromatography (silica gel, chloroform / methanol: volume ratio 7/1) to obtain a white solid (s3 )
By 1 H-NMR analysis and IR analysis, the resulting white solid (s3) was identified as the 8- (6- (trifluoromethyl carbonylamino) hexyl) deoxyguanosine.
白色固体（ｓ３）１９５ｍｇ（０．４２２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタール１ｍｌ（５．８３５ｍｍｏｌ）を加えた後、５０℃で２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール：体積比７／１）で精製して、白色固体（ｓ４）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析及びＩＲ分析により、得られた白色固体（ｓ４）は、８−（６−（トリフルオロメチルカルボニルアミノ）ヘキシル）デオキシグアノシンのプリン骨格の２位のアミノ基をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールで保護した化合物であることを同定した。
195 mg (0.422 mmol) of a white solid (s3) was dissolved in 10 ml of anhydrous N, N-dimethylformamide under an argon atmosphere, 1 ml (5.835 mmol) of N, N′-dimethylformamide diethyl acetal was added, and then 50 ° C. For 2 hours. After confirming the disappearance of the raw material by thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by column chromatography (silica gel, chloroform / methanol: volume ratio 7/1) to obtain a white solid ( s4) was obtained.
According to 1 H-NMR analysis and IR analysis, the obtained white solid (s4) was obtained by converting the amino group at the 2-position of the purine skeleton of 8- (6- (trifluoromethylcarbonylamino) hexyl) deoxyguanosine to N, N ′ -Identified as a compound protected with dimethylformamide diethyl acetal.
アルゴン雰囲気下、白色固体（ｓ４）１５２ｍｇ（０．２９４ｍｍｏｌ）を無水ピリジン１０ｍｌに溶解し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド１２０ｍｇ（０．３５４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン７．２ｍｇ（０．０５９ｍｍｏｌ）を加えた後、約２５℃で１時間攪拌した。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン：体積比８９／１０／１）により精製して、白色固体（ｓ５）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析及びＩＲ分析により、得られた白色固体（ｓ５）は、８−（６−（トリフルオロメチルカルボニルアミノ）ヘキシル）デオキシグアノシンのプリン骨格の２位のアミノ基をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールで保護し、デオキシリボース骨格の５’位の水酸基をジメメトキシトリチル基で保護した化合物であることを同定した。
Under an argon atmosphere, 152 mg (0.294 mmol) of a white solid (s4) was dissolved in 10 ml of anhydrous pyridine, 120 mg (0.354 mmol) of 4,4′-dimethoxytrityl chloride, 7.2 mg of N, N-dimethylaminopyridine (0 0.059 mmol), and the mixture was stirred at about 25 ° C. for 1 hour. After confirming the disappearance of the raw materials by thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by column chromatography (silica gel, chloroform / methanol / triethylamine: volume ratio 89/10/1), A white solid (s5) was obtained.
According to 1 H-NMR analysis and IR analysis, the obtained white solid (s5) was obtained by converting the amino group at the 2-position of the purine skeleton of 8- (6- (trifluoromethylcarbonylamino) hexyl) deoxyguanosine to N, N ′ -It was identified as a compound protected with dimethylformamide diethyl acetal and protected with a dimethylmethoxytrityl group at the 5 'hydroxyl group of the deoxyribose skeleton.
アルゴン雰囲気下、白色固体（ｓ５）５２ｍｇ（０．０５９ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン４６０μｌに溶解し、１Ｈ−テトラゾール無水アセトニトリル溶液（０．４５Ｍ）１９６μｌ（０．０８８ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト２８μｌ（０．０８９ｍｍｏｌ）を加えた後、約２５℃で２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認してから、反応液を分液ロートに移して、飽和重曹水及び蒸留水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、反応溶媒を減圧留去した。残渣を無水アセトニトリル１ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系、ナカライテスク株式会社製）で濾過し、濾液を減圧蒸留して、８−（６−（トリフルオロメチルカルボニルアミノ）ヘキシル）デオキシグアノシンのプリン骨格の２位のアミノ基をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールで保護し、デオキシリボース骨格の５’位の水酸基をジメメトキシトリチル基で保護し、デオキシリボース骨格の３’位の水酸基を２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトで保護した化合物（ｓ６）を得た。 Under an argon atmosphere, 52 mg (0.059 mmol) of a white solid (s5) was dissolved in 460 μl of anhydrous dichloromethane, 196 μl (0.088 mmol) of 1H-tetrazole anhydrous acetonitrile solution (0.45M) and 2-cyanoethyl-N, N, N After adding 28 μl (0.089 mmol) of “, N′-tetraisopropyl phosphorodiamidite, the mixture was stirred at about 25 ° C. for 2 hours. After confirming the disappearance of the raw materials by thin layer chromatography (TLC), the reaction solution was transferred to a separatory funnel, washed with saturated sodium bicarbonate water and distilled water, and the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate. Was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in 1 ml of anhydrous acetonitrile, filtered through Cosmonis filter S (solvent system, manufactured by Nacalai Tesque), the filtrate was distilled under reduced pressure, and 8- (6- (trifluoromethylcarbonylamino) hexyl) deoxyguanosine The purine skeleton at the 2-position amino group is protected with N, N′-dimethylformamide diethyl acetal, the deoxyribose skeleton at the 5′-position hydroxyl group is protected with a dimethylmethoxytrityl group, and the deoxyribose skeleton at the 3′-position hydroxyl group Was protected with 2-cyanoethyl-N, N, N ′, N′-tetraisopropyl phosphorodiamidite (s6).
化合物（ｓ６）を原料の一部として、ＤＮＡ自動合成機（３４００ＤＮＡ／ＲＮＡ シンセサイザ、アプライドバイオシステムズ社）を用いて、オリゴヌクレオチド（ｗ１）｛5'-TGACGAGTATCCAAGATTGAATCwTCA-3’：wは化合物（ｓ６）に対応する。｝を合成した。 Compound (s6) as a part of raw material, using an automatic DNA synthesizer (3400 DNA / RNA synthesizer, Applied Biosystems), oligonucleotide (w1) {5'-TGACGAGTATCCAAGATTGAATCwTCA-3 ': w is compound (s6) Corresponding to } Was synthesized.
無水ジメチルホルムアミド１ｍｌに、１−ピレンカルボン酸５０ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）を溶解し、水溶性カルボジイミド｛１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩｝３８ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド２８ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を加えた後、約２５℃で１２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム）で精製して、１−ピレンカルボン酸スクシンイミドエステルを得た。 In 1 ml of anhydrous dimethylformamide, 50 mg (0.20 mmol) of 1-pyrenecarboxylic acid is dissolved, and 38 mg (0.20 mmol) of water-soluble carbodiimide {1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride} and N -After adding 28 mg (0.24 mmol) of hydroxysuccinimide, the mixture was stirred at about 25 ° C for 12 hours. After confirming the disappearance of the raw material by thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by column chromatography (silica gel, chloroform) to obtain 1-pyrenecarboxylic acid succinimide ester.
オリゴヌクレオチド（ｗ１）４．２ｍｇ（０．５μｍｏｌ）に、１．０Ｍ−炭酸水素ナトリウム水溶液３００μｌを加えてから、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１００μｌに溶解した後、１−ピレンカルボン酸スクシンイミドエステル２．０ｍｇ（５．８μｍｏｌ）を加えて、３７℃で約１２時間攪拌して、塩基ｗのプリン骨格の８位に結合基（Ｘ）を介してピレン骨格が結合したオリゴヌクレオチド（ｗ２）を合成した。 To 4.2 mg (0.5 μmol) of oligonucleotide (w1), 300 μl of 1.0 M aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added and dissolved in 100 μl of N, N-dimethylformamide, and then 1-pyrenecarboxylic acid succinimide ester. 0 mg (5.8 μmol) was added, and the mixture was stirred at 37 ° C. for about 12 hours to synthesize an oligonucleotide (w2) in which the pyrene skeleton was bonded to the 8-position of the purine skeleton of the base w via the bonding group (X). .
合成終了後、固相担体から切り出された溶液を０．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し替え、３７℃で１８時間加熱して、脱保護を行った。ついで、約２５℃に冷却してから、０．５ｍｌエッペンドルフチューブに超純水１９μｌを加えた後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、約２万Ｇ、１分間）して、高速液体クロマトグラフィー（ＰＵ−２０８０−ｐｕｌｓ、ＪＡＳＣＯ）で精製した。精製後、凍結乾燥して、本発明の蛍光プローブ（１）｛5'-TGACGAGTATCCAAGATTGAATCmTCA-3’：mは式（３）で表される化合物に対応する。｝を得た。 After completion of the synthesis, the solution cut out from the solid support was transferred to a 0.5 ml Eppendorf tube and heated at 37 ° C. for 18 hours for deprotection. Next, after cooling to about 25 ° C., 19 μl of ultrapure water was added to a 0.5 ml Eppendorf tube, followed by centrifugation (15000 rpm, about 20,000 G, 1 minute), and high performance liquid chromatography (PU-2080). -Puls, JASCO). After purification, the product is freeze-dried, and the fluorescent probe (1) {5′-TGACGAGTATCCAAGATTGAATCmTCA-3 ′: m of the present invention corresponds to the compound represented by the formula (3). }.
本発明の蛍光プローブ（１）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ、株式会社島津製作所）による質量分析（親ピーク８６３４．９４）、高速液体クロマトグラフィー（FLOW２．０ｍｌ／ｍｉｎ、AF buffer／ＣＨ３ＣＮ：３〜２０％（４５min）、Size１０×１５０ｍｍ、CHEMCONBOND 5-ODS-H、図２）及び酵素分解による各ヌクレオチドの含有率の解析の結果から確認した。 The fluorescent probe (1) of the present invention is obtained by mass spectrometry (parent peak 8634.94) by MALDI-TOF MASS (AXIMA-LNR, Shimadzu Corporation), high performance liquid chromatography (FLOW 2.0 ml / min, AF buffer / CH 3 CN: 3 to 20% (45 min), Size 10 × 150 mm, CHEMCONBOND 5-ODS-H, FIG. 2) and the result of analysis of the content of each nucleotide by enzymatic degradation.
以上の化学反応を以下にまとめた。
なお、ＴＡＦはトリフルオロアセチル基を表し、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基を表し、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。 TAF represents a trifluoroacetyl group, DMTr represents a dimethoxytrityl group, and iPr represents an isopropyl group.
＜実施例２＞
無水ジメチルホルムアミド１ｍｌに、４−オキソ−４−ピレニルブタン酸５０ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）を溶解し、水溶性カルボジイミド｛１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩｝３８ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド２３ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）を加えた後、約２５℃で１２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム）で精製して、４−オキソ−４−ピレニルブタン酸スクシンイミドエステルを得た。
<Example 2>
In 1 ml of anhydrous dimethylformamide, 50 mg (0.17 mmol) of 4-oxo-4-pyrenylbutanoic acid was dissolved, and water-soluble carbodiimide {1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride} 38 mg (0.20 mmol) ) And N-hydroxysuccinimide (23 mg, 0.20 mmol) were added, and the mixture was stirred at about 25 ° C. for 12 hours. After confirming the disappearance of the raw material by thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by column chromatography (silica gel, chloroform) to give 4-oxo-4-pyrenylbutanoic acid succinimide ester. Obtained.
「１−ピレンカルボン酸スクシンイミドエステル２．０ｍｇ（５．８μｍｏｌ）」を「４−オキソ−４−ピレニルブタン酸スクシンイミドエステル２．０ｍｇ、（５．０μｍｏｌ）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の蛍光プローブ（２）｛5'-TGACGAGTATCCAAGATTGAATCnTCA-3’：nは式（４）で表される化合物に対応する。｝を得た。 Example 1 except that “1-pyrenecarboxylic acid succinimide ester 2.0 mg (5.8 μmol)” was changed to “4-oxo-4-pyrenylbutanoic acid succinimide ester 2.0 mg, (5.0 μmol)”. Thus, the fluorescent probe (2) {5′-TGACGAGTATCCAAGATTGAATCnTCA-3 ′: n in the present invention corresponds to the compound represented by the formula (4). }.
本発明の蛍光プローブ（２）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ、株式会社島津製作所）による質量分析（親ピーク８６９１．００）、高速液体クロマトグラフィー（FLOW２．０ｍｌ／ｍｉｎ、AF buffer／ＣＨ３ＣＮ：３〜２０％（４５min）、Size１０×１５０ｍｍ、CHEMCONBOND 5-ODS-H、図３）及び酵素分解による各ヌクレオチドの含有率の解析の結果から確認した。 The fluorescent probe (2) of the present invention is obtained by mass spectrometry (parent peak 8691.00) by MALDI-TOF MASS (AXIMA-LNR, Shimadzu Corporation), high performance liquid chromatography (FLOW 2.0 ml / min, AF buffer / CH 3 CN: 3 to 20% (45 min), Size 10 × 150 mm, CHEMCONBOND 5-ODS-H, FIG. 3) and the results of analysis of the content of each nucleotide by enzymatic degradation were confirmed.
＜実施例３＞
化合物（ｓ６）及び１−ピレンカルボン酸スクシンイミドエステルを用いて、実施例１と同様にして、本発明の蛍光プローブ（３）｛5'-TGACAGGTATCCAAGATTGAACTmTCA-3’：mは式（３）で表される化合物に対応する。｝を得た。
<Example 3>
Using the compound (s6) and 1-pyrenecarboxylic acid succinimide ester in the same manner as in Example 1, the fluorescent probe (3) of the present invention {5'-TGACAGGTATCCAAGATTGAACTmTCA-3 ': m is represented by the formula (3). Corresponding to the compound. }.
本発明の蛍光プローブ（３）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ、株式会社島津製作所）による質量分析（親ピーク８６３４．９４）、高速液体クロマトグラフィー（FLOW２．０ｍｌ／ｍｉｎ、AF buffer／ＣＨ３ＣＮ：３〜２０％（４５min）、Size１０×１５０ｍｍ、CHEMCONBOND 5-ODS-H）及び酵素分解による各ヌクレオチドの含有率の解析の結果から確認した。 The fluorescent probe (3) of the present invention is obtained by mass spectrometry (parent peak 8634.94) by MALDI-TOF MASS (AXIMA-LNR, Shimadzu Corporation), high performance liquid chromatography (FLOW 2.0 ml / min, AF buffer / CH 3 CN: 3 to 20% (45 min), Size 10 × 150 mm, CHEMCONBOND 5-ODS-H) and the results of analysis of the content of each nucleotide by enzymatic degradation.
＜実施例４＞
化合物（ｓ６）及び１−ピレンカルボン酸スクシンイミドエステルを用いて、実施例１と同様にして、本発明の蛍光プローブ（４）｛5'-AGCAGCTGTATCCAAGATTGAAAmCTmCT-3’：mは式（３）で表される化合物に対応する。｝を得た。
<Example 4>
Using the compound (s6) and 1-pyrenecarboxylic acid succinimide ester in the same manner as in Example 1, the fluorescent probe (4) of the present invention {5'-AGCAGCTGTATCCAAGATTGAAAmCTmCT-3 ': m is represented by the formula (3). Corresponding to the compound. }.
本発明の蛍光プローブ（４）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ、株式会社島津製作所）による質量分析（親ピーク９１２４．２６）、高速液体クロマトグラフィー（FLOW２．０ｍｌ／ｍｉｎ、AF buffer／ＣＨ３ＣＮ：３〜２０％（４５min）、Size１０×１５０ｍｍ、CHEMCONBOND 5-ODS-H）及び酵素分解による各ヌクレオチドの含有率の解析の結果から確認した。 The fluorescent probe (4) of the present invention is obtained by mass spectrometry (parent peak 9124.26) by MALDI-TOF MASS (AXIMA-LNR, Shimadzu Corporation), high performance liquid chromatography (FLOW 2.0 ml / min, AF buffer / CH 3 CN: 3 to 20% (45 min), Size 10 × 150 mm, CHEMCONBOND 5-ODS-H) and the results of analysis of the content of each nucleotide by enzymatic degradation.
＜蛍光分光分析＞
エッペンドルフチューブに、塩化ナトリウム水溶液及びリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を加え、それぞれの最終濃度が０．１Ｍ及び５０ｍＭとなるように超純水を加えて濃度調整した後、評価試料（蛍光プローブ）と相補的な塩基配列をもつオリゴデオキシヌクレオチド１００μＭを最終濃度が２．５μＭになるようにして加えてから、攪拌し遠心分離した。評価試料（蛍光プローブ）を７０℃で１０分間アニーリングを行い、蛍光スペクトルを測定した。
また、相補的な塩基配列をもつオリゴデオキシヌクレオチドを用いなかったこと以外、上記と同様にして蛍光スペクトルを測定した。
<Fluorescence spectroscopy>
After adding an aqueous solution of sodium chloride and a phosphate buffer solution (pH 7.0) to an Eppendorf tube and adjusting the concentration by adding ultrapure water so that the final concentrations thereof are 0.1 M and 50 mM, respectively, an evaluation sample (fluorescent probe) 100 μM of an oligodeoxynucleotide having a base sequence complementary to) was added to a final concentration of 2.5 μM, and the mixture was stirred and centrifuged. The evaluation sample (fluorescent probe) was annealed at 70 ° C. for 10 minutes, and the fluorescence spectrum was measured.
Further, the fluorescence spectrum was measured in the same manner as described above except that oligodeoxynucleotide having a complementary base sequence was not used.
測定結果を図４〜１１に示す。図４〜９から明らかなように、本発明の蛍光プローブは、相補的な塩基配列とハイブリタイズすると蛍光を出すが、相補的な塩基配列とハイブリタイズしないと蛍光を出さないか、一定波長において蛍光を出さなかった。すなわち、ハイブリタイズの有無によって広い波長範囲で蛍光強度が著しく相違した。
また、図１０及び１１から明らかなように、本発明の蛍光プローブに、式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として２個含むものは、ハイブリタイズの有無によって、長波長側で蛍光強度が著しく相違した。
The measurement results are shown in FIGS. As is apparent from FIGS. 4 to 9, the fluorescent probe of the present invention emits fluorescence when hybridized with a complementary base sequence, but does not emit fluorescence unless hybridized with a complementary base sequence, or at a constant wavelength. It did not emit fluorescence. That is, the fluorescence intensity was significantly different in a wide wavelength range depending on the presence or absence of hybridization.
Further, as is apparent from FIGS. 10 and 11, the fluorescent probe of the present invention containing two nucleotides represented by the formula (1) as a structural unit has a fluorescence intensity on the long wavelength side depending on the presence or absence of hybridization. Was significantly different.
１ 蛍光性有機基
２ ハイブリタイズしたときの蛍光スペクトル
３ ハイブリタイズしていないときの蛍光スペクトル
４ 目的物
1 Fluorescent organic group 2 Fluorescence spectrum when hybridized 3 Fluorescence spectrum when not hybridized 4 Target product
Claims (8)
式（１）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有することを特徴とする蛍光プローブ。
Ｒは蛍光性有機基、Ｘは蛍光性有機基とプリン骨格の８位炭素とを繋ぐ結合基、Ｙは水素原子又は水酸基、Ｏは酸素原子、Ｐはリン原子、Ｃは炭素原子、Ｈは水素原子、Ｎは窒素原子を表す。 In a probe having a stem loop structure,
A fluorescent probe comprising a nucleotide represented by formula (1) as a structural unit.
R is a fluorescent organic group, X is a bonding group connecting the fluorescent organic group and the 8-position carbon of the purine skeleton, Y is a hydrogen atom or hydroxyl group, O is an oxygen atom, P is a phosphorus atom, C is a carbon atom, and H is A hydrogen atom and N represent a nitrogen atom.
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