JP2010046010A - Method for transforming plant of genus oryza - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、イネ属の植物を形質転換する方法に関し、詳しくはアグロバクテリウム法によりイネ属の植物を高効率で形質転換する方法に関する。 The present invention relates to a method for transforming a plant of the genus rice, and more particularly to a method for transforming a plant of the genus rice plant with high efficiency by the Agrobacterium method.
イネは、コムギやトウモロコシと並び、主要な穀類の一つであり、特にアジア地域においては、主食として極めて重要な作物である。
現在および将来に予想される食料問題やエネルギー問題において、収量の増産、耐病性、寒冷地や乾燥地などへの抵抗性、味質向上、エネルギー資源に利用に適した非可食部、などに繋がる形質を有するイネの品種や系統の作出は、極めて重要である。
そのような中、近年、イネにおいて、ゲノム解析で明らかになった情報から、網羅的に表現型解析（フェノーム的解析）を行うために、ハイスループットで大量に形質転換体を作出する系の開発が求められ、形質転換系の改変がすすめられてきた。しかし、日本晴、キタアケなどの一部のイネ品種以外は、未だ形質転換効率が低く、数万の形質転換体を用いた大規模解析が難しい状況にある。
また近年、ＧＭ植物の実用化に向けて、抗生物質抵抗性遺伝子を利用しない新たな選抜マーカー（ＡＬＳ、ＮｉＲ遺伝子等）が開発されているが、その選抜効率は低い。
Rice is one of the major cereals along with wheat and corn, and is an extremely important crop as a staple food, especially in the Asian region.
For current and future food and energy problems, increase yield, disease resistance, resistance to cold and dry areas, improve taste quality, and non-edible parts suitable for use in energy resources, etc. It is extremely important to produce rice varieties and lines with connected traits.
Under such circumstances, in recent years, in order to comprehensively perform phenotypic analysis (phenomic analysis) from information clarified by genome analysis in rice, development of a system that produces a large amount of transformants at high throughput And transformation of the transformation system has been promoted. However, with the exception of some rice varieties such as Nipponbare and Kitaake, transformation efficiency is still low, and large-scale analysis using tens of thousands of transformants is difficult.
In recent years, new selection markers (ALS, NiR genes, etc.) that do not use antibiotic resistance genes have been developed for practical application of GM plants, but the selection efficiency is low.
アグロバクテリウム法による形質転換法は、多くの双子葉類の植物においては、極めて有用な外来遺伝子を導入する方法である。特に、エレクトロポレーション法やパーティクルガン法に比べて、形質転換処理が簡便であり、またその効率も安定している。さらには１個体あたりに同じ遺伝子が複数導入されにくい（一遺伝子を導入した個体が得られやすい）、などの点で優れた利点を有する。
そこで、イネにおいても、アグロバクテリウム法の利用が試みられたが、イネを含む単子葉類に属する植物に対しては、効率が‘極めて低い’。
そのため、イネにおいても、アグロバクテリウム法を利用可能にするために、各種条件（カルス誘導条件、共存培養条件、各種添加物、培養日数、培養温度、アグロバクテリウム濃度等）の改変を行うことで、形質転換効率を向上させる研究が行われてきた（例えば、特許文献１、非特許文献１，２参照）
しかしながら、これらの多くの方法は、形質転換効率の高い日本晴やキタアケなどの限定された品種を用いた研究であり、有用品種を含む多くの品種に適用が可能な普遍的な方法ではない。
今後の実用化に向けて、‘有用品種を含む多くのイネ品種に適用が可能であり’且つ‘形質転換効率が顕著に高い’方法の開発が求められており、さらには選抜マーカー遺伝子を用いた選抜を行うことなく、形質転換したイネ属の植物の植物体を得る方法の開発、が求められている。
The transformation method by the Agrobacterium method is a method for introducing a very useful foreign gene in many dicotyledonous plants. In particular, the transformation process is simpler and more efficient than the electroporation method and the particle gun method. Furthermore, it has an excellent advantage in that it is difficult to introduce a plurality of the same genes per individual (it is easy to obtain an individual into which a single gene has been introduced).
Thus, the use of the Agrobacterium method has also been attempted for rice, but the efficiency is 'very low' for plants belonging to monocotyledons containing rice.
Therefore, various conditions (callus induction conditions, co-cultivation conditions, various additives, culture days, culture temperature, Agrobacterium concentration, etc.) must be modified in rice so that the Agrobacterium method can be used. Thus, studies have been conducted to improve transformation efficiency (see, for example, Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2).
However, many of these methods are studies using limited varieties such as Nipponbare and Kitaake, which have high transformation efficiency, and are not universal methods applicable to many varieties including useful varieties.
Development of a method that can be applied to many rice varieties, including useful varieties, and that has a remarkably high transformation efficiency is required for practical use in the future. Therefore, there is a demand for the development of a method for obtaining a transformed plant of the genus Rice without performing selection.
本発明は、上記の課題を解決し、‘有用品種を含む多くのイネ品種に適用が可能（普遍的な方法）であり’且つ‘形質転換効率が顕著に高い’、アグロバクテリウム法によりイネ属の植物を形質転換する方法、を提供すること、を課題とする。
さらに本発明は、選抜マーカー遺伝子を用いた選抜を行うことなく、形質転換したイネ属の植物の植物体を得る方法を提供することを、を課題とする。
The present invention solves the above-mentioned problems and is applicable to many rice varieties including useful varieties (universal method) and 'remarkably high transformation efficiency'. It is an object of the present invention to provide a method for transforming a genus plant.
Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for obtaining a plant body of a transformed rice genus plant without performing selection using a selection marker gene.
本発明者は、予め外来遺伝子が導入してあるアグロバクテリウムを培養して懸濁した懸濁液に、イネ属の植物のカルスを浸漬し、その後、当該カルスを、‘吸収できる液量に対して所定範囲の液量の共存培養用液体培地、を吸収させた濾紙’の上に静置し、アグロバクテリウムとの共存培養を行うことにより、；共存培養時に‘カルスの増殖を抑制せず’且つ‘過剰なアグロバクテリウムの増殖を抑制する’ことができ、当該カルスに前記外来遺伝子を高効率で導入できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。 The present inventor immerses callus of a plant of the genus rice in a suspension obtained by culturing and suspending Agrobacterium into which a foreign gene has been introduced in advance. On the other hand, by placing it on a filter paper that has absorbed a liquid culture medium for co-cultivation in a predetermined range and co-culturing with Agrobacterium; The present inventors have found that it is possible to 'suppress the growth of excess Agrobacterium' and to introduce the foreign gene into the callus with high efficiency, and have completed the present invention based on these findings.
即ち、請求項１に係る発明は、アグロバクテリウム法によりイネ属の植物を形質転換するにあたり、；予め外来遺伝子が導入してあるアグロバクテリウムを培養して懸濁した懸濁液に、イネ属の植物のカルスを浸漬し、その後、当該カルスを、吸収できる液量の９０〜１１０％の共存培養用液体培地を吸収させた濾紙の上に静置し、アグロバクテリウムとの共存培養を行うことにより、；当該カルスに前記外来遺伝子を高効率で導入することを特徴とする、アグロバクテリウム法によりイネ属の植物を形質転換する方法である。
請求項２に係る発明は、前記濾紙に吸収させた共存培養用液体培地の液量が、前記濾紙が吸収できる液量の９６〜１０５％である、請求項１に記載のイネ属の植物を形質転換する方法である。
請求項３に係る発明は、前記アグロバクテリウムとの共存培養が、前記濾紙に吸収させた共存培養用培地の蒸発が抑制された密封容器内で行われるものである、請求項１又は２のいずれかに記載のイネ属の植物を形質転換する方法である。
請求項４に係る発明は、前記イネ属の植物が、Oryza sativa subsp. japonica、又は、Oryza sativa subsp. indicaである、請求項１〜３のいずれかに記載のイネ属の植物を形質転換する方法である。
請求項５に係る発明は、前記濾紙が、２号定性濾紙を１〜５枚重ねたものである、請求項１〜４のいずれかに記載のイネ属の植物を形質転換する方法である。
請求項６に係る発明は、前記カルスが、２〜４ｍｍの大きさのものである、請求項１〜５のいずれかに記載のイネ属の植物を形質転換する方法である。
請求項７に係る発明は、請求項１〜６のいずれかに記載のイネ属の植物を形質転換する方法から得られた、形質転換されたイネ属の植物である。
That is, the invention according to claim 1 is a method for transforming a plant of the genus Rice by the Agrobacterium method; a suspension obtained by culturing and suspending Agrobacterium into which a foreign gene has been introduced in advance; Immerse the callus of a genus plant, and then leave the callus on a filter paper that has absorbed 90 to 110% of the liquid medium for co-cultivation of the amount of liquid that can be absorbed, and co-cultivate with Agrobacterium. A method for transforming a plant of the genus Rice by the Agrobacterium method, characterized by introducing the foreign gene into the callus with high efficiency.
The invention according to claim 2 is the plant of the genus Rice according to claim 1, wherein the amount of the liquid medium for co-cultivation absorbed in the filter paper is 96 to 105% of the amount of liquid that can be absorbed by the filter paper. It is a method of transformation.
The invention according to claim 3 is characterized in that the co-culture with Agrobacterium is performed in a sealed container in which evaporation of the co-culture medium absorbed in the filter paper is suppressed. A method for transforming a plant of the genus Rice according to any one of the above.
The invention according to claim 4 transforms the rice plant of any one of claims 1 to 3, wherein the plant of the rice genus is Oryza sativa subsp. Japonica or Oryza sativa subsp. Indica. Is the method.
The invention according to claim 5 is a method for transforming a plant of the genus Rice according to any one of claims 1 to 4, wherein the filter paper is a stack of 1 to 5 qualitative filter papers of No. 2.
The invention according to claim 6 is the method for transforming a plant of the genus Rice according to any one of claims 1 to 5, wherein the callus has a size of 2 to 4 mm.
The invention according to claim 7 is a transformed rice plant obtained from the method for transforming a rice plant according to any one of claims 1 to 6.
本発明は、‘有用品種を含む多くのイネ品種に適用が可能（普遍的な方法）であり’且つ‘形質転換効率が顕著に高い’、アグロバクテリウム法によりイネ属の植物を形質転換する方法、を提供することを可能とする。
また本発明は、選抜マーカー遺伝子を用いた選抜を行うことなく、形質転換したイネ属の植物の植物体を得ることを、可能とする。
さらに本発明は、イネ属の植物を形質転換した後のカルスの褐色化を抑制することを可能とする。
The present invention is 'applicable to many rice varieties including useful varieties (universal method)' and 'transformation efficiency is remarkably high', and transforms plants of the genus Rice by the Agrobacterium method. It is possible to provide a method.
Furthermore, the present invention makes it possible to obtain a plant body of a transformed rice genus plant without performing selection using a selection marker gene.
Further, the present invention makes it possible to suppress browning of callus after transformation of a plant of the genus Rice.
本発明は、アグロバクテリウム法によりイネ属の植物を高効率で形質転換する方法、に関する。詳しくは、アグロバクテリウム法によりイネ属の植物を形質転換するにあたり、；予め外来遺伝子が導入してあるアグロバクテリウムを培養して懸濁した懸濁液に、イネ属の植物のカルスを浸漬し、その後、当該カルスを、‘吸収できる液量の所定範囲内の液量’の共存培養用液体培地、を吸収させた濾紙の上に静置し、アグロバクテリウムとの共存培養を行うことにより、；当該カルスに前記外来遺伝子を高効率で導入することを特徴とする、アグロバクテリウム法によりイネ属の植物を形質転換する方法、に関するものである。 The present invention relates to a method for transforming rice plants with high efficiency by the Agrobacterium method. Specifically, when transforming a rice plant by the Agrobacterium method, the callus of the plant of the rice genus is immersed in a suspension in which Agrobacterium previously introduced with a foreign gene is cultured and suspended. Then, the callus is allowed to stand on a filter paper that has been absorbed with a liquid medium for co-cultivation having a liquid volume within a predetermined range of the liquid volume that can be absorbed, and co-cultured with Agrobacterium. A method for transforming a plant of the genus Rice by the Agrobacterium method, which comprises introducing the foreign gene into the callus with high efficiency.
本発明の形質転換法は、従来のアグロバクテリウム法が適用可能な植物であれば適用可能な方法であるが、特に、従来のアグロバクテリウム法の適用が難しかった‘イネ属の植物’を対象にして行った場合において、顕著な効果を奏する方法である。 The transformation method of the present invention can be applied to any plant to which the conventional Agrobacterium method can be applied. In particular, the plant of the genus Rice is difficult to apply the conventional Agrobacterium method. This is a method that produces a remarkable effect when performed on a target.
本発明の形質転換法は、イネ属の植物の如何なる種類のものに対しても用いることができるが、特には、‘ジャポニカ種（Oryza sativa subsp. japonica）’、‘インディカ種（Oryza sativa subsp. indica）’、に属するものに用いることで、顕著な効果を奏することができる。
なお、具体的には、‘ジャポニカ種’の日本晴、北海飼３０８、コシヒカリ、ササニシキ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、キヌヒカリ、きらら３９７など、；‘インディカ種’のＤｕｌａｒ、Ｐａｎｂｉｒａ、ＩＲ８、；などの品種に用いること、特には、日本晴、北海飼３０８、コシヒカリ、Ｄｕｌａｒといった品種に対して用いることが有用である。
The transformation method of the present invention can be used for any kind of plants of the genus Rice, but in particular, 'Japonica species (Oryza sativa subsp. Japonica)', 'Indica species (Oryza sativa subsp. indica) ', a remarkable effect can be obtained.
More specifically, varieties such as Nihonbare of “Japonica species”, Hokkaido 308, Koshihikari, Sasanishiki, Hitomebore, Hinohikari, Akitakomachi, Kinuhikari, Kirara 397, etc .; In particular, it is useful to use for varieties such as Nipponbare, Hokkaido 308, Koshihikari, and Dual.
本発明の形質転換法は、以下の‘カルス調製工程’と、‘アグロバクテリウム懸濁液調製工程’と、‘共存培養工程’と、を行うことを特徴とする方法である。 The transformation method of the present invention is a method characterized by performing the following ‘callus preparation step’, ‘Agrobacterium suspension preparation step’, and ‘co-cultivation step’.
本発明の形質転換法における‘カルス調製工程’は、前記イネ属の植物のカルスを調製する工程である。本工程のカルス調製は、例えば、Hieiらの従来の方法（Plant J. 6 (1994) 271-282.）によって調製することができる。カルスはイネ種子、イネ未熟胚などを適当なオーキシン類を含む、固体培地の上に置き、温度２５〜３２℃で静置培養することで誘導することができる。（なお、ここで固体培地とは、寒天、ゲルライトなどでゲル化させた培地を指す。以下同じ。）
具体的には、まず、イネの種子を、次亜塩素酸ナトリウム溶液、を用いて種子表面を滅菌し（‘種子の休眠打破’が必要な場合は、さらに過酸化水素水で処理し）、オーキシン類（例えば２，４−Ｄ）を含むＮ６培地、ＭＳ培地、ＤＫＮ培地、具体的には「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）およびゲルライト（3 g/L）を含むＮ６培地、または、ＤＫＮ培地」、などの固体培地上で、温度２５〜３２℃（好ましくは２８℃付近）において、２〜４週間、静置培養することで、カルスを誘導する。
そして、誘導されたカルスは、さらに、新しく準備した上記固体培地の上に置いて、カルスの生育に適した光量（例えば５０μｍｏｌｍ-2ｓ-1）の明条件下（明期１６時間と暗期８時間の明暗周期下）で、１〜４日間、静置培養し、成長させることで、本工程で調製したカルスとして用いることができる。
本工程で調製されるカルスとしては、好ましくは、２〜４ｍｍの大きさのものであることが望ましい。
The “callus preparation step” in the transformation method of the present invention is a step of preparing callus of the plant of the genus Rice. The callus preparation in this step can be prepared, for example, by the conventional method of Hiei et al. (Plant J. 6 (1994) 271-282.). Callus can be induced by placing rice seeds, immature rice embryos, etc. on a solid medium containing appropriate auxins and culturing them statically at a temperature of 25 to 32 ° C. (Here, the solid medium refers to a medium gelled with agar, gellite, etc. The same shall apply hereinafter.)
Specifically, first, sterilize the seed surface of the rice seed using a sodium hypochlorite solution (if 'seed dormancy breaking' is necessary, treat with hydrogen peroxide) N6 medium containing auxins (for example, 2,4-D), MS medium, DKN medium, specifically, “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), N6 medium containing sucrose (30 g / L) and gellite (3 g / L), or a solid medium such as DKN medium ”at a temperature of 25 to 32 ° C. (preferably around 28 ° C.) In the above, calli are induced by static culture for 2 to 4 weeks.
The induced callus is further placed on the above-prepared solid medium, and the light condition (for example, 50 μmolm −2 s −1 ) under light conditions (16 hours light period and dark period) suitable for callus growth. It can be used as a callus prepared in this step by allowing it to stand and culture for 1 to 4 days under an 8-hour light-dark cycle).
The callus prepared in this step is preferably 2 to 4 mm in size.
本発明の形質転換法における‘アグロバクテリウム懸濁液調製工程’は、予め外来遺伝子が導入してあるアグロバクテリウムを培養して、液体培地中に懸濁した懸濁液を調製する工程である。
本工程におけるアグロバクテリウムの培養は、従来の方法に従って行えばよいが、具体的には、当該アグロバクテリウムに導入してある抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質（ハイグロマイシン、カナマイシンなど）を含む固体培地〔ＡＢ培地、ＬＢ培地など（好ましくはＡＢ培地）〕の上で、温度２５〜２８℃で、２〜３日間静置培養することで、アグロバクテリウムを培養することができる。
そして、当該増殖したアグロバクテリウムは、液体培地中〔アセトシリンゴンを含むＡＡＭ培地、Ｎ６培地など、（好ましくはアセトシリンゴンを含むＡＡＭ培地）〕に懸濁することで、懸濁液を調製することができる。
The “Agrobacterium suspension preparation step” in the transformation method of the present invention is a step of culturing Agrobacterium into which a foreign gene has been introduced in advance and preparing a suspension suspended in a liquid medium. is there.
In this step, Agrobacterium may be cultured according to conventional methods. Specifically, antibiotics (hygromycin, kanamycin, etc.) corresponding to the antibiotic resistance gene introduced into the Agrobacterium are used. Agrobacterium can be cultured by standing and culturing at a temperature of 25 to 28 ° C. for 2 to 3 days on a solid medium [AB medium, LB medium, etc. (preferably AB medium)].
Then, the grown Agrobacterium is suspended in a liquid medium [AAM medium containing acetosyringone, N6 medium, etc. (preferably AAM medium containing acetosyringone)] to prepare a suspension. can do.
なお、本工程において、増殖したアグロバクテリウムの液体培地中への懸濁は、ＯＤ６００の値が０．０１〜０．４、好ましくは０．０２〜０．２、さらに好ましくは０．０４〜０．２、最も好ましくは０．０４、になるように懸濁することが望ましい。
なお、ＯＤ６００の値が、当該所定範囲より大きくても小さくても、形質転換効率が低下し好ましくない
In this step, the suspension of the grown Agrobacterium in the liquid medium has an OD600 value of 0.01 to 0.4, preferably 0.02 to 0.2, and more preferably 0.04 to 0.04. It is desirable to suspend to 0.2, most preferably 0.04.
In addition, even if the value of OD600 is larger or smaller than the predetermined range, the transformation efficiency is lowered, which is not preferable.
本工程に用いる‘アグロバクテリウム’は、アグロバクテリウム法に用いることができるものであれば如何なる種類のものでも用いることができ、特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacience）EHA101株、EHA105株、LBA4404株などを用いることができるが、具体的には、EHA101株を用いることできる。 As the 'Agrobacterium' used in this step, any kind can be used as long as it can be used in the Agrobacterium method. In particular, Agrobacterium tumefacience EHA101 strain, EHA105 strain The LBA4404 strain and the like can be used, and specifically, the EHA101 strain can be used.
また、‘予め外来遺伝子が導入してあるアグロバクテリウム’とは、外来遺伝子をサブクローニングしたバイナリーベクターをアグロバクテリウムに保持させることによって、調製されたものである。
なお、バイナリーベクターとしては、pIG121Hm、pCAMBIAシリーズなどを用いることができるが、具体的には、pCAMBIA1301を用いることができる。
Further, “Agrobacterium into which a foreign gene has been introduced in advance” is prepared by allowing Agrobacterium to hold a binary vector obtained by subcloning a foreign gene.
As a binary vector, pIG121Hm, pCAMBIA series, or the like can be used. Specifically, pCAMBIA1301 can be used.
本発明の形質転換法における‘共存培養工程’とは、「カルスを、‘吸収できる液量に対して所定範囲の液量の共存培養用液体培地、を吸収させた濾紙’の上に静置し、アグロバクテリウムとの共存培養を行う工程」である。なお、図１に、本発明の実施の一態様の共存培養の状態を示す写真像図を示す。 In the transformation method of the present invention, the “co-cultivation step” means that “callus is placed on a filter paper in which a liquid medium for co-cultivation in a predetermined range of liquid volume that can be absorbed is absorbed”. And a step of co-culturing with Agrobacterium ”. In addition, in FIG. 1, the photograph image figure which shows the state of the cocultivation of one aspect | mode of implementation of this invention is shown.
本共存培養工程を行うにあたり、まず、上記カルス調製工程で得られた‘カルス’を、上記アグロバクテリウム懸濁液調製工程で得られた‘アグロバクテリウム懸濁液’に浸漬する。
当該浸漬は、１〜５分間、好ましくは２分間程度行うことが望ましい。なお、浸漬後のカルスは、（例えば濾紙上に置いて、）余分な懸濁液を十分に取り除くことは、共存培養時に過剰なアグロバクテリウムが増殖することを抑制できる点で望ましい。
そして、浸漬後の当該カルスを、‘吸収できる液量に対して所定範囲の液量の共存培養用液体培地、を吸収させた濾紙’の上に静置し、アグロバクテリウムとの共存培養を行う。当該共存培養を行うことにより、当該カルスに、アグロバクテリウムが感染し、前記外来遺伝子が導入される。
なお、当該外来遺伝子の導入は、カルスのゲノムＤＮＡ中に導入されるため、トランジェントな遺伝子導入法でなく、安定的に形質転換を行うことが可能な方法である。
In performing this co-cultivation step, first, the “callus” obtained in the callus preparation step is immersed in the “Agrobacterium suspension” obtained in the Agrobacterium suspension preparation step.
The immersion is desirably performed for 1 to 5 minutes, preferably about 2 minutes. In addition, it is desirable for the callus after immersion to sufficiently remove an excessive suspension (for example, by placing it on a filter paper) from the viewpoint that excessive Agrobacterium can be prevented from growing during co-culture.
Then, the callus after immersion is allowed to stand on a filter paper that has absorbed a liquid culture medium for co-cultivation in a predetermined range with respect to the amount of liquid that can be absorbed, and co-cultivation with Agrobacterium is performed. Do. By performing the co-culture, the callus is infected with Agrobacterium and the foreign gene is introduced.
In addition, since the introduction of the foreign gene is introduced into the genomic DNA of callus, it is not a transient gene introduction method but a method capable of performing stable transformation.
本工程において、‘濾紙が吸収できる液量に対する所定範囲の液量’とは、濾紙が吸収できる液量を１００％とした場合に、その吸収できる液量の９０〜１１０％、好ましくは９１〜１０９％、さらに好ましくは９６〜１０５％、最も好ましくは、濾紙が吸収できる液量とほぼ等しい液量の１００％付近、の液量を指すものである。
本発明は、濾紙に吸収させた前記液体培地の液量が、上記所定の範囲にある場合にのみ、‘カルスの増殖を抑制せず’且つ‘過剰なアグロバクテリウムの増殖を抑制する’ことができ、形質転換効率を顕著に向上させることを可能とする方法である。
なお、濾紙に吸収させた前記液体培地の液量が、上記所定の範囲より少ない場合、乾燥によって、カルスの増殖、及び、アグロバクテリウムの増殖が共に抑制されすぎることにより、形質転換効率が低下し好ましくない。
また、上記所定の範囲より多い場合、アグロバクテリウムが過剰に増殖しすぎることにより、形質転換効率が低下し好ましくない。
In this step, “the amount of liquid in a predetermined range relative to the amount of liquid that can be absorbed by the filter paper” means 90 to 110% of the amount of liquid that can be absorbed when the amount of liquid that can be absorbed by the filter paper is 100%, preferably 91 to 109%, more preferably 96 to 105%, and most preferably the amount of liquid that is nearly 100% of the amount of liquid that can be absorbed by the filter paper.
The present invention is to 'do not inhibit the growth of callus' and 'suppress the growth of excess Agrobacterium' only when the amount of the liquid medium absorbed by the filter paper is within the predetermined range. This is a method that makes it possible to remarkably improve the transformation efficiency.
When the amount of the liquid medium absorbed by the filter paper is less than the above predetermined range, the transformation efficiency is lowered due to excessive suppression of both callus growth and Agrobacterium growth by drying. It is not preferable.
Moreover, when more than the said predetermined range, since Agrobacterium grows too much, transformation efficiency falls and it is unpreferable.
本工程において用いる‘濾紙’としては、定性濾紙、定量濾紙等の親水性の高い分析用濾紙であれば、如何なるものでも用いることができる。例えば、統一規格である１〜５号定性濾紙（ワットマン社、ＡＤＶＡＮＴＥＣ東洋社などから入手可能）を、０．２６ｍｍ（２号定性濾紙１枚に相当）以上、好ましくは０．２６ｍｍ（２号定性濾紙１枚に相当）〜１．３ｍｍ（２号定性濾紙５枚に相当）、さらに好ましくは０．５２ｍｍ（２号定性濾紙２枚に相当）〜１．３ｍｍ（２号定性濾紙５枚に相当）、の範囲の‘厚さ’、になるように、好適な枚数を組み合わせて用いることができる。
また、濾紙の‘大きさ’としては、入手できる定性濾紙の規格の大きさのものであれば、如何なるものでも用いることができる。また、複数枚の濾紙を組み合わせて並べて、面積を大きくすることも可能である。
なお、具体的には、直径９ｃｍの２号定性濾紙を１枚（吸収できる液量約１．８３ｍＬ）以上、好ましくは１〜５枚（吸収できる液量約１．８３〜９．１６ｍＬ）、さらに好ましくは２〜５枚（吸収できる液量約３．６６〜９．１６ｍｌ）を、本工程に用いることができる。
As the “filter paper” used in this step, any filter paper with high hydrophilicity such as qualitative filter paper or quantitative filter paper can be used. For example, No. 1-5 qualitative filter paper (available from Whatman, ADVANTEC Toyo Co., Ltd.), which is a unified standard, is 0.26 mm (corresponding to one qualitative filter paper of No. 2) or more, preferably 0.26 mm (No. 2 qualitative (Corresponds to 1 sheet of filter paper) to 1.3 mm (corresponds to 5 sheets of qualitative filter paper No. 2), more preferably 0.52 mm (corresponds to 2 sheets of qualitative filter paper 2) to 1.3 mm (corresponds to 5 sheets of qualitative filter paper No. 2) ), In a range of “thickness”, a suitable number can be used in combination.
In addition, as the “size” of the filter paper, any filter paper can be used as long as it has a standard size of available qualitative filter paper. It is also possible to increase the area by combining a plurality of filter papers.
Specifically, the number 2 qualitative filter paper having a diameter of 9 cm is more than one sheet (absorbable liquid amount is about 1.83 mL), preferably 1 to 5 sheets (absorbable liquid amount is about 1.83 to 9.16 mL), More preferably, 2 to 5 sheets (amount of liquid that can be absorbed is about 3.66 to 9.16 ml) can be used in this step.
本工程における、共存培養は、前記濾紙に吸収させた共存培養用培地の蒸発が抑制された密封容器内で行うことが望ましい。
例えば、プラスチックシャーレ、ガラスシャーレ、マジェンタボックスを密封して行うことができるが、具体的には、パラフィルムでシールした直径９ｃｍのプラスチックシャーレ内で行うことができる。
なお、密封が不完全であった場合、共存培養中に培養容器中の水分が失われてしまい、最適な培地量と異なる条件下での共存培養となり安定した形質転換効率が得られなくなり、好ましくない。
The co-culture in this step is preferably performed in a sealed container in which evaporation of the co-culture medium absorbed by the filter paper is suppressed.
For example, a plastic petri dish, a glass petri dish, and a magenta box can be sealed, and specifically, it can be performed in a plastic petri dish having a diameter of 9 cm sealed with parafilm.
If the sealing is incomplete, moisture in the culture vessel is lost during co-cultivation, and co-cultivation is performed under conditions different from the optimal amount of medium, and stable transformation efficiency cannot be obtained. Absent.
本工程における共存培養は、２〜４日間、暗黒下で行うものである。
また、本工程における共存培養の温度は、２４〜３０℃、好ましくは２５〜２８℃付近、さらに好ましくは２５℃付近で行うことが望ましい。
温度が、上記所定の温度より高い場合、アグロバクテリウムが過剰増殖しやすくなり、また、Ｔ−ＤＮＡ領域の植物ゲノム（カルスゲノム）への転移効率が低下し（それにより形質転換効率が低下し）好ましくない。
また、温度が上記所定の温度より低い場合には、カルスおよびアグロバクテリウムの増殖が抑制され（それにより形質転換効率が低下し）好ましくない。
The coculture in this step is performed in the dark for 2 to 4 days.
The co-cultivation temperature in this step is preferably 24 to 30 ° C, preferably about 25 to 28 ° C, more preferably about 25 ° C.
When the temperature is higher than the above-mentioned predetermined temperature, Agrobacterium tends to overgrow, and the transfer efficiency of the T-DNA region to the plant genome (callus genome) decreases (thereby, the transformation efficiency decreases). It is not preferable.
On the other hand, when the temperature is lower than the above-mentioned predetermined temperature, the growth of callus and Agrobacterium is suppressed (thus reducing the transformation efficiency), which is not preferable.
本工程における、‘共存培養用液体培地’としては、Ｌ-システインおよびアセトシリゴンを含むＮ６培地、ＤＫＮ培地、などの液体培地を用いることができる。好ましくは、１００〜４００ｍｇ／ＬのＬ-システインを含むものであることが望ましい。
具体的には、「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）、グルコース（5 g/L）、Ｌ−システイン（100 mg/L）およびアセトシリンゴン（15 mg/L）を含むＮ６培地、または、ＤＫＮ培地」、などの液体培地を用いることができる。
As the “liquid medium for co-cultivation” in this step, a liquid medium such as an N6 medium or DKN medium containing L-cysteine and acetosirigon can be used. Preferably, it contains 100 to 400 mg / L L-cysteine.
Specifically, “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L), glucose (5 g / L) , An N6 medium containing L-cysteine (100 mg / L) and acetosyringone (15 mg / L), or a DKN medium ”.
本発明の形質転換法は、上記工程から主になるものでるが、これらの工程を経ることにより、共存培養時に‘カルスの増殖を抑制せず’且つ‘過剰なアグロバクテリウムの増殖を抑制する’ことができ、アグロバクテリウムの感染に適した状態を安定して維持することを可能にするものである。
それにより、本発明は、‘カルスへの形質転換効率を、顕著に向上させること’ができるものである。
また、本発明は、アグロバクテリウムの過剰増殖が原因と考えられるイネカルスの褐色化を抑制することも可能となる。
なお、上記したように、本発明は‘有用品種を含む多くのイネ品種に適用が可能’な方法（普遍的な方法）である。
The transformation method of the present invention is mainly from the above steps, but through these steps, it does not suppress the growth of callus and suppresses the excessive growth of Agrobacterium during co-culture. It is possible to stably maintain a state suitable for Agrobacterium infection.
As a result, the present invention is capable of 'remarkably improving the efficiency of transformation into callus'.
In addition, the present invention can suppress browning of rice callus, which is considered to be caused by excessive growth of Agrobacterium.
As described above, the present invention is a method (universal method) that can be applied to many rice varieties including useful varieties.
また、本発明においては、上記共存培養工程後に得られたカルスは、顕著に高い効率（頻度）で形質転換されたものであるため、‘選抜マーカー遺伝子を用いた選抜を行うことなく’培養することで（即ち下記の‘無選抜培養’を行うことで）、形質転換されたイネ属の植物体を得ることを可能とするものである。
なお、‘従来法’では、形質転換効率が低いため、共存培養後に得られたカルスに対して、‘選抜マーカー遺伝子〔抗生物質耐性遺伝子（例えばハイグロマイシン）や栄養要求性遺伝子〕を用いた選抜培養（前記抗生物質を含有する培地や栄養要求性の培地での培養）’を行って、形質転換された植物体を選抜することが必須となる。
In the present invention, the callus obtained after the co-cultivation step has been transformed with a remarkably high efficiency (frequency). Therefore, the callus is cultured without performing selection using a selection marker gene. (That is, by performing the following “non-selective culture”), it is possible to obtain transformed rice plants.
In addition, since the transformation efficiency is low in the “conventional method”, a selection marker gene [antibiotic resistance gene (for example, hygromycin) or auxotrophic gene] is selected against callus obtained after co-culture. It is essential to select a transformed plant by culturing (culturing in a medium containing the antibiotic or an auxotrophic medium).
本発明においては、上記選抜マーカー遺伝子を用いた選抜を行わずに、上記共存培養工程後に得られたカルスから、形質転換されたイネ属の植物体を得ることができる。
具体的には、まず、上記共存培養工程後に得られたカルスを、選抜培地でない培地（選抜に用いる抗生物質を含有しない培地や栄養要求性でない培地）で、培養する。
当該培養は、Ｎ６培地、ＤＫＮ培地などの固体培地（具体的には、「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）、メロペン（25 mg/L）、ゲルライト（3 g/L）を含むＮ６固体培地」）の上で、温度２５〜３２℃で（具体的には２８℃）、カルスの生育に適した光量（例えば５０μｍｏｌｍ-2ｓ-1）の明条件下（具体的には、明期１６時間と暗期８時間の明暗周期下）において、７〜１４日（具体的には１０日間）静置培養する。
In the present invention, a transformed plant of the genus Rice can be obtained from the callus obtained after the co-cultivation step without performing the selection using the selection marker gene.
Specifically, first, the callus obtained after the co-cultivation step is cultured in a medium that is not a selection medium (a medium that does not contain an antibiotic used for selection or a medium that is not auxotrophic).
The culture is carried out using a solid medium such as N6 medium or DKN medium (specifically, “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose). (30 g / L), meropen (25 mg / L), N6 solid medium containing gellite (3 g / L) ”) at a temperature of 25 to 32 ° C. (specifically 28 ° C.), Under light conditions (specifically, 50 μmolm −2 s −1 ) suitable for growth (specifically, under a light / dark cycle of 16 hours light period and 8 hours dark period), 7 to 14 days (specifically 10 Days) static culture.
その後、当該カルスから細胞塊を剥離させる。
‘カルスからの細胞塊の剥離’は、‘当該カルスの表面から２００〜４００μｍの細胞塊（小細胞塊）を剥離’させるものである。
これは、上記共存培養での形質転換はカルスの表面で起こる事が多いため、カルス表面から剥離させた細胞塊を集積させた後に、用いることが望ましいからである。
剥離される操作としては、懸濁、振とう、押しつぶし、などの操作によって行うことができるが、具体的には、カルスをスパーテル等で約３ｍｍに砕き、１０ｍｌの駒込ピペットでの懸濁操作後、４００μｍのナイロンメッシュで駒込ピペットを使いながら濾過し、ついで、２００μmのナイロンメッシュを通過できない小細胞塊（２００〜４００μｍの細胞塊）を集めることで、行う。
Thereafter, the cell mass is detached from the callus.
“Peeling of cell mass from callus” means “peeling a cell mass (small cell mass) of 200 to 400 μm from the surface of the callus”.
This is because the transformation in the above co-culture often occurs on the surface of the callus, so it is desirable to use it after accumulating the cell mass detached from the surface of the callus.
The operation to be peeled can be performed by operations such as suspension, shaking, and crushing. Specifically, the callus is crushed to about 3 mm with a spatula or the like, and then suspended with a 10 ml Komagome pipette. The filtration is performed using a Komagome pipette with a 400 μm nylon mesh, and then a small cell mass (200 to 400 μm cell mass) that cannot pass through the 200 μm nylon mesh is collected.
得られた当該細胞塊（小細胞塊）は、メロペンを含むＮ６培地、ＭＳ培地、ＤＫＮ培地などの固体培地、具体的には「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）、メロペン（25 mg/L）およびゲルライト（3 g/L）を含むＮ６培地、」上で、温度２５〜３２℃で（具体的には２８℃）、生育に適した光量（例えば５０μｍｏｌｍ-2ｓ-1）の明条件下（具体的には、明期１６時間と暗期８時間の明暗周期下）において、７〜１４日間（具体的には７日間）、静置培養し、当該細胞塊を成長肥大させる。
その後、成長肥大させた細胞塊は、‘再分化用固体培地’、具体的には、再分化用ＭＳ固体培地「メロペン（25 mg/L）、スクロース（30 g/L）、ソルビトール（20 g/L）、カザミノ酸（2 g/L）、カイネチン（2.5 mg/L）、ＮＡＡ（0.1 mg/L）およびゲルライト（4 g/L）を含むｐＨ５．７に調整したＭＳ固体培地」上において、温度２５〜３２℃（具体的には２８℃）、生育に適した光量（例えば５０μｍｏｌｍ-2ｓ-1）の明条件下（具体的には、明期１６時間と暗期８時間の明暗周期下）で、１４〜３０日間（具体的には２１日間）、静置培養することで、再分化したイネ属の植物体を得ることができる。
なお、得られた再分化したイネ植物体は、固体培地（ＭＳ培地など）上で、植物体が成長するまで（例えば根が発根するまで）、上記と同様の温度や光条件で静置培養した後、鉢上げすることができる。
The obtained cell mass (small cell mass) is a solid medium such as N6 medium, MS medium, or DKN medium containing meropen, specifically, “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM). ), N6 medium containing casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L), meropen (25 mg / L) and gellite (3 g / L), ”temperature 25-32 ° C. (Specifically, at 28 ° C.) under light conditions (specifically, under a light-dark cycle of 16 hours of light period and 8 hours of dark period) under a light amount suitable for growth (for example, 50 μmolm −2 s −1 ) The culture is allowed to stand for 7 to 14 days (specifically, 7 days), and the cell mass is grown and enlarged.
After that, the cell mass grown and enlarged is “solid medium for regeneration”, specifically, MS solid medium for regeneration “meropen (25 mg / L), sucrose (30 g / L), sorbitol (20 g / L), MS solid medium adjusted to pH 5.7 containing casamino acid (2 g / L), kinetin (2.5 mg / L), NAA (0.1 mg / L) and gellite (4 g / L) , Temperature 25-32 ° C. (specifically 28 ° C.), light conditions suitable for growth (for example, 50 μmolm −2 s −1 ) under bright conditions (specifically, 16 hours light period and 8 hours dark period) Under a cycle), a redifferentiated plant of the genus Rice can be obtained by stationary culture for 14 to 30 days (specifically, 21 days).
The obtained re-differentiated rice plant is allowed to stand at a temperature and light conditions similar to those described above until the plant grows (for example, until roots are rooted) on a solid medium (MS medium, etc.). After culturing, it can be raised.
上記のようにして得られた、再分化したイネ属の植物体は、従来法（‘数万個体以上に１個体’の割合で形質転換体を含む）に比べて極めて高い効率（頻度）で形質転換された個体を含む（‘約１００〜２５０個体に１個体’の割合で形質転換体を含む）ものであるので、得られる全ての再分化植物体よりゲノムＤＮＡを抽出し、導入遺伝子の存在をＰＣＲ法により判別し、形質転換体を選抜することが可能である。また、ＧＵＳ、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子を予め組込んだ前記バイナリーベクターを用いることで、形質転換体を容易に選抜することが可能である。
また、形質転換により‘導入した外来遺伝子’が、植物体の形態に影響を与えるものである場合（例えば葉の形態や植物体の色、成長率など）、表現型を手がかりに、直接、形質転換体を選抜することも可能である。
Regenerated rice plants obtained as described above have extremely high efficiency (frequency) compared to conventional methods (including transformants at a ratio of 'one in every tens of thousands). Since it contains transformed individuals (including transformants at a ratio of about 1 to about 100 to 250 individuals), genomic DNA is extracted from all the redifferentiated plants obtained, It is possible to discriminate the presence by the PCR method and select transformants. Moreover, it is possible to easily select transformants by using the binary vector in which a reporter gene such as GUS or GFP is previously incorporated.
In addition, if the 'foreign gene' introduced by transformation affects the plant morphology (for example, leaf morphology, plant color, growth rate, etc.) It is also possible to select converters.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited by these Examples.
実施例１（濾紙に吸収させる培地の液量の検討１）
１）イネカルスの調製
イネ（品種：‘日本晴’）の種子を、籾殻を除去後、１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液に３０分間、次いで１％過酸化水素水に３時間（種子の休眠打破）、そして再度１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液に１０分間浸漬することで、種子表面を滅菌した。滅菌後、当該種子を滅菌水で３度洗浄した。
次に、当該種子を、「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）およびゲルライト（3 g/L）を含むｐＨ５．７に調整したＮ６固体培地（Sci. Sin. 18 (1975) 659-668）」（即ち、Ｎ６Ｄ固形培地）を用いて３週間静置培養することで、カルスを誘導した。
そして、活発に増殖しているカルスを、再度上記と同一組成の固体培地に移して３日間静置培養することで、成長したイネカルスを調製した。なお、培養は、温度２８℃、５０μｍｏｌｍ-2ｓ-1の明条件下（明期１６時間と暗期８時間の明暗周期下）で行った。
Example 1 (Examination of the amount of medium to be absorbed by filter paper 1)
1) Preparation of rice callus After removing rice husks from rice (variety: 'Nihonbare'), 10% sodium hypochlorite solution for 30 minutes, then 1% hydrogen peroxide solution for 3 hours (breaking seed dormancy) Then, the seed surface was sterilized by dipping again in a 10% sodium hypochlorite solution for 10 minutes. After sterilization, the seed was washed three times with sterilized water.
Next, the seeds were divided into “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L) and gellite (3 g / L). Callus were induced by static culture for 3 weeks using N6 solid medium (Sci. Sin. 18 (1975) 659-668) (ie, N6D solid medium) adjusted to pH 5.7 containing L). .
Then, the actively growing callus was again transferred to a solid medium having the same composition as described above and statically cultured for 3 days to prepare a grown rice callus. Cultivation was performed under light conditions (temperature: 28 ° C., 50 μmolm −2 s −1 (light period 16 hours and dark period 8 hours)).
２）アグロバクテリウム懸濁液の調製
アグロバクテリウムのバイナリーベクターとしては、pCAMBIA1301（アクセッションナンバー：F234297、http://www.cambia.org/daisy/cambia/2046/version/1/part/4/data/pCAMBIA1301.pdf）を用いた。なお、当該ベクターのマップを図２に示す、
上述のバイナリーベクターを保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefacience EHA101株）を、ハイグロマイシン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）および寒天（15 g/L）を含むＡＢ固体培地（Proc Natl. Acad. Sci. 71 (1974) 3672-3676）上において、２８℃で３日間静置培養した。
そして、増殖したアグロバクテリウムを、アセトシリンゴン（15 mg/L）を含むＡＡＭ液体培地（Plant J. 6 (1994) 271-282）中に、‘ＯＤ６００の値が０．０４’になるように懸濁することで、アグロバクテリウム懸濁液を調製した。
2) Preparation of Agrobacterium suspension The binary vector of Agrobacterium is pCAMBIA1301 (accession number: F234297, http://www.cambia.org/daisy/cambia/2046/version/1/part/4 /data/pCAMBIA1301.pdf). The map of the vector is shown in FIG.
Agrobacterium (Agrobacterium tumefacience EHA101 strain) carrying the above binary vector was transformed into an AB solid medium (Proc Natl) containing hygromycin (50 mg / L), kanamycin (50 mg / L) and agar (15 g / L). Acad. Sci. 71 (1974) 3672-3676) was cultured at 28 ° C. for 3 days.
The grown Agrobacterium is placed in an AAM liquid medium (Plant J. 6 (1994) 271-282) containing acetosyringone (15 mg / L) so that the value of “OD600 is 0.04”. Agrobacterium suspension was prepared.
３）アグロバクテリウムとの共存培養
上記１）で得られた２〜４ｍｍ程度の大きさのカルスを、上記２）で得られたアグロバクテリウムの懸濁液に２分間浸漬し、その後、カルスを２号定性濾紙（東洋ADVANTEC社製）上に置き、余分な懸濁液を十分に取り除いた。
その後、９ｃｍプラスチックシャーレ内に、‘直径９ｃｍの２号定性濾紙（東洋ADVANTEC社製）３枚’に、共存培養用液体培地「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）、グルコース（5g/L）、Ｌ−システイン（100 mg/L）およびアセトシリンゴン（15 mg/L）を含むＮ６液体培地」を、‘表１’に記載の所定量吸収させたものを準備した。なお、当該濾紙（直径９ｃｍの２号定性濾紙３枚）が１００％吸収できる液量は、約５．５ｍｌである。
そして、当該濾紙の上に前記カルスを置き、プラスチックシャーレの蓋を被せてパラフィルムでシールすることで密閉した。
その後、‘温度２８℃’において、暗黒下で３日間静置することで、当該カルス表面に付着したアグロバクテリウムとの共存培養を行った。
3) Co-cultivation with Agrobacterium Callus having a size of about 2 to 4 mm obtained in 1) above is immersed in the suspension of Agrobacterium obtained in 2) for 2 minutes, and then callus Was placed on No. 2 qualitative filter paper (manufactured by Toyo ADVANTEC), and excess suspension was sufficiently removed.
Thereafter, in a 9 cm plastic petri dish, three sheets of “No. 2 qualitative filter paper with a diameter of 9 cm (manufactured by Toyo ADVANTEC)”, a liquid medium for co-cultivation “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM) , N6 liquid containing casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L), glucose (5 g / L), L-cysteine (100 mg / L) and acetosyringone (15 mg / L) A medium in which a predetermined amount of “medium” described in “Table 1” was absorbed was prepared. The amount of liquid that the filter paper (three No. 2 qualitative filter papers having a diameter of 9 cm) can absorb 100% is about 5.5 ml.
Then, the callus was placed on the filter paper, covered with a plastic petri dish and sealed with parafilm.
Thereafter, the cells were allowed to stand at “temperature 28 ° C.” for 3 days in the dark, thereby co-culturing with Agrobacterium adhering to the callus surface.
なお、対照として、「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）、グルコース（5 g/L）、Ｌ−システイン（100 mg/L）、アセトシリンゴン（15 mg/L）およびゲルライト（3 g/L）を含むＮ６固体培地」に、直径９ｃｍの２号定性濾紙（東洋ADVANTEC社製）を１枚置き、その上に前記カルスを置いた、ことを除いては、上記と同様の操作を行なって、アグロバクテリウムとの共存培養を行った。 As controls, “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L), glucose (5 g / L) N6 solid medium containing L, cysteine (100 mg / L), acetosyringone (15 mg / L) and gellite (3 g / L) ”, No. 2 qualitative filter paper (manufactured by Toyo ADVANTEC) Except that one call was placed and the callus was placed thereon, the same operation as described above was performed to perform co-culture with Agrobacterium.
４）選抜マーカー遺伝子を用いた選抜培養、および、形質転換効率の測定
上記３）で得られた共存培養後のカルスを５０ｍｌの遠心管に移し、水４０ｍｌを加え、浸盪した。この操作を２回繰り返し、最後に５０ｍｇ/Ｌのメロペン（大日本住友製薬）を含む水４０ｍｌに懸濁した。
そして、カルスを２号定性濾紙（東洋ADVANTEC社製）上に移し、余分な水分を除いた後、選抜用固体培地「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）、メロペン（25 mg/L）、ハイグロマシン（50 mg/L）およびゲルライト（3 g/L）を含むＮ６固体培地」の上に置き、温度２８℃、５０μｍｏｌｍ-2ｓ-1の明条件下（明期１６時間と暗期８時間の明暗周期下）で、４日間静置培養することで、ハイグロマイシンでの選抜培養を行い、形質転換されたイネカルスを選抜した。
4) Selection culture using selection marker gene and measurement of transformation efficiency The callus after co-culture obtained in 3) above was transferred to a 50 ml centrifuge tube, and 40 ml of water was added, followed by shaking. This operation was repeated twice, and finally suspended in 40 ml of water containing 50 mg / L meropen (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.).
Then, the callus was transferred onto No. 2 qualitative filter paper (manufactured by Toyo ADVANTEC), and after removing excess water, a selective solid medium “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM), casein Above "N6 solid medium containing hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L), meropen (25 mg / L), hygromachine (50 mg / L) and gellite (3 g / L)" And selective culture with hygromycin by static culture for 4 days under the light condition of 28 ° C. and 50 μmolm −2 s −1 (under the light / dark cycle of 16 hours light period and 8 hours dark period) The transformed rice callus was selected.
その後、形質転換効率の測定は、ＧＵＳ染色で発色したスポット数を計測することで行った。
常法に従って調製したＧＵＳ染色液（100mM sodium phosphate buffer pH7.0、1mM X-Gluc(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)、2.5mM フェリシアン化鉄(K3Fe(CN)6)、2.5mM フェロシアン化鉄(K4Fe(CN)6・3H2O)）に、上記選抜したカルスを浸漬し、３７℃で１日間静置することで、ＧＵＳ染色を行った。
発色反応後、カルスを２号定性濾紙（東洋ADVANTEC社製）上に移し、余分な水分を除いた後、実体顕微鏡で観察し、カルス１個あたりの発色した青色スポット数（形質転換された細胞数）を計測した。計測は、５個以上のカルスについて計測する操作を、同じ実験を３回繰り返し行い、‘カルス１個あたりの発色した青色スポット数の平均値’を算出した。また、計測した最大値を１００とした時の各値の相対値、および、対照の計測値を１とした時の相対値（表１括弧内）も算出した。結果を表１に示す。（なお、６．５ｍｌの試験区のみは１回の実験の平均値を示す。他の試験区は全て３回の実験の平均値を示す。）
Thereafter, the transformation efficiency was measured by measuring the number of spots developed by GUS staining.
GUS staining solution (100 mM sodium phosphate buffer pH 7.0, 1 mM X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide), 2.5 mM iron ferricyanide (K 3 Fe (CN) 6 ), 2.5 mM iron ferrocyanide (K 4 Fe (CN) 6 · 3H 2 O)) is immersed in the above selected callus and allowed to stand at 37 ° C. for 1 day, thereby staining GUS. Went.
After the color development reaction, the callus was transferred onto No. 2 qualitative filter paper (manufactured by Toyo ADVANTEC), after removing excess water, and observed with a stereomicroscope, the number of colored blue spots per callus (transformed cells) Number). For the measurement, the same experiment was repeated three times for the operation of measuring five or more calli, and the “average value of the number of colored blue spots per callus” was calculated. In addition, the relative value of each value when the measured maximum value was 100 and the relative value when the measured value of the control was 1 (in parentheses in Table 1) were also calculated. The results are shown in Table 1. (Only the 6.5 ml test group shows the average value of one experiment. All other test groups show the average value of three experiments.)
５）形質転換植物体の再分化、および、導入された外来ＤＮＡの確認
上記選抜された形質転換カルスを、再分化用固体培地「メロペン（25 mg/L）、ハイグロマイシン（50 mg/L）、スクロース（30 g/L）、ソルビトール（20 g/L）、カザミノ酸（2 g/L）、カイネチン（2.5 mg/L）、ＮＡＡ（0.1 mg/L）およびゲルライト（4 g/L）を含むｐＨ５．７に調整したＭＳ固体培地（Physiol. Plant 15 (1962) 473-497）」上に移して、２８℃、明条件下（明期１６時間と暗期８時間の明暗周期下）で、３週間静置培養することで、再分化したイネ植物体を得た。
次に、再分化したイネ植物体を、「メロペン（25 mg/L）、ハイグロマシン（50 mg/L）、スクロース（30 g/L）およびゲルライト（4 g/L）を含むｐＨ５．７に調整したＭＳ固体培地」上に移して静置培養し、根の発根を確認後、鉢上げした。
5) Redifferentiation of the transformed plant body and confirmation of the introduced foreign DNA The transformed callus selected above was transformed into a solid medium for regeneration, “meropen (25 mg / L), hygromycin (50 mg / L)”. , Sucrose (30 g / L), sorbitol (20 g / L), casamino acid (2 g / L), kinetin (2.5 mg / L), NAA (0.1 mg / L) and gellite (4 g / L) MS solid medium adjusted to pH 5.7 containing (Physiol. Plant 15 (1962) 473-497) ”and light condition (under light-dark cycle of 16 hours light period and 8 hours dark period) at 28 ° C. Re-differentiated rice plants were obtained by static culture for 3 weeks.
Next, the regenerated rice plant was adjusted to pH 5.7 containing “meropen (25 mg / L), hygromachine (50 mg / L), sucrose (30 g / L) and gellite (4 g / L). It was transferred to an “adjusted MS solid medium” and allowed to stand for cultivation.
その後、得られた再分化植物体のうちの６個体から、ＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出した。そして、導入したpCAMBIA1301上のＧＵＳ遺伝子における配列（配列番号１，２）をプライマーとして用いて、ＰＣＲ（９４℃５分、〔９４℃３０秒、５６℃２０秒、７２℃１分〕を３５サイクル、７２℃５分）を行い、再分化植物体のＤＮＡにpCAMBIA1301に由来する外来ＤＮＡ配列が導入されたかどうかを確認した。
ＰＣＲの増幅産物を電気泳動しＥｔＢｒ染色した結果を図３に示す。なお、図３において、各レーンは次のサンプルを泳動したものである。
（レーンＭ：サイズマーカー、レーンＰ：pCAMBIA1301のプラスミドＤＮＡそのものを鋳型にしてＰＣＲを行ったポジティブコントロール、レーンＮ：日本晴由来ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行ったネガティブコントロール、レーン１〜６：上記得られた植物由来ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った増幅産物。）
Thereafter, DNA was extracted from 6 individuals of the obtained redifferentiated plants by the CTAB method. Then, using the sequence (SEQ ID NOs: 1 and 2) in the GUS gene on the introduced pCAMBIA1301 as a primer, 35 cycles of PCR (94 ° C. for 5 minutes, [94 ° C. for 30 seconds, 56 ° C. for 20 seconds, 72 ° C. for 1 minute]) , 72 ° C. for 5 minutes), and it was confirmed whether or not the foreign DNA sequence derived from pCAMBIA1301 was introduced into the DNA of the redifferentiated plant body.
FIG. 3 shows the result of electrophoresis of the PCR amplification product and staining with EtBr. In FIG. 3, each lane is a migration of the next sample.
(Lane M: size marker, lane P: positive control in which PCR was performed using plasmid DNA itself of pCAMBIA1301 as a template, lane N: negative control in which PCR was performed using Nipponbare-derived DNA as a template, lanes 1 to 6: the above obtained An amplification product obtained by performing PCR using the obtained plant-derived DNA as a template.)
表１より明らかなように、共存培養用液体培地を吸収させた濾紙上で、アグロバクテリウムとの共存培養を行うことにより、形質転換効率が向上することが明らかになった。
具体的には、当該濾紙（直径９ｃｍの２号定性濾紙３枚）が９０．９％〜１０９．１％吸収できる量（５．０〜６．０ｍｌ）の当該液体培地を吸収させた濾紙上で行った場合、対照である固体培地で行った時に比べて、顕著に（具体的には約１１倍以上）形質転換効率が向上することが明らかになった。
特に、当該濾紙が１００％吸収できる量と同量（５．５ｍｌ）の当該液体培地を吸収させた濾紙上で行った場合、形質転換効率が著しく向上する（対照である固体培地で行った時の約５０倍に向上する）ことが明らかになった。
また、図３の結果より、調べた６個体の再分化イネ植物体のＤＮＡ中に、pCAMBIA1301に由来する外来ＤＮＡ配列が導入されたことが示された。
As is clear from Table 1, it was revealed that the transformation efficiency was improved by co-culturing with Agrobacterium on the filter paper in which the liquid medium for co-cultivation was absorbed.
Specifically, the filter paper (three No. 2 qualitative filter papers having a diameter of 9 cm) on the filter paper having absorbed 90.9% to 109.1% of the liquid medium (5.0 to 6.0 ml). It was revealed that the transformation efficiency was remarkably improved (specifically, about 11 times or more) in comparison with the solid medium as a control.
In particular, when performed on a filter paper that has absorbed the same amount (5.5 ml) of the liquid medium as the filter paper can absorb 100%, the transformation efficiency is remarkably improved (when performed on a solid medium as a control). It has become clear that it is improved by about 50 times.
In addition, the results of FIG. 3 showed that the foreign DNA sequence derived from pCAMBIA1301 was introduced into the DNA of the 6 redifferentiated rice plants examined.
実施例２（濾紙に吸収させる液体培地の液量の検討２）
１）イネカルスの調製
実施例１と同様にして、イネ（品種：日本晴）のカルスを調製した。
２）アグロバクテリウム懸濁液の調製
実施例１と同様にして、アグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ６００の値：０．０４）を調製した。
３）アグロバクテリウムとの共存培養
前記濾紙（直径９ｃｍの２号定性濾紙３枚）に、共存培養用液体培地を‘表２’に記載の所定量を吸収させたこと、および、前記共存培養時の温度を‘２５℃’で行ったこと、を除いて、実施例１と同様にして、アグロバクテリウムとの共存培養を行った。
４）選抜マーカー遺伝子を用いた選抜培養、および、形質転換効率の測定
実施例１と同様にして、形質転換されたイネカルスを選抜した。そして、実施例１と同様にして形質転換効率を測定した。結果を表２に示す。（なお、５．２５ｍｌの試験区のみは２回の実験の平均値を示す。他の試験区は全て３回の実験の平均値を示す。）
Example 2 (Examination of the amount of liquid medium absorbed in filter paper 2)
1) Preparation of Rice Callus In the same manner as in Example 1, rice (variety: Nipponbare) callus was prepared.
2) Preparation of Agrobacterium Suspension Agrobacterium suspension (OD600 value: 0.04) was prepared in the same manner as Example 1.
3) Co-cultivation with Agrobacterium The above-mentioned filter paper (three No. 2 qualitative filter papers with a diameter of 9 cm) absorbed a predetermined amount of the liquid medium for co-cultivation described in 'Table 2', and the co-culture Co-culture with Agrobacterium was performed in the same manner as in Example 1 except that the temperature at that time was “25 ° C.”.
4) Selection culture using selection marker gene and measurement of transformation efficiency In the same manner as in Example 1, transformed rice callus was selected. Then, the transformation efficiency was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 2. (Only the test group of 5.25 ml shows the average value of two experiments. All other test groups show the average value of three experiments.)
表２より明らかなように、当該濾紙（直径９ｃｍの２号定性濾紙３枚）が９５．５％および１０４．５％吸収できる量（５．２５および５．７５ｍｌ）の共存培養用液体培地を吸収させた濾紙上で行った場合との比較から、当該濾紙が１００％吸収できる量と同量（５．５ｍｌ）の当該液体培地を吸収させた濾紙上で行った場合に、‘形質転換効率が最大になること’が示唆された。 As is clear from Table 2, the liquid medium for co-cultivation in an amount (5.25 and 5.75 ml) that the filter paper (three qualitative filter papers of 9 cm in diameter) can absorb 95.5% and 104.5% From the comparison with the case where it was carried out on the absorbed filter paper, it was found that when the transformation was carried out on the filter paper in which the same amount (5.5 ml) of the liquid medium as the filter paper could absorb 100%, It was suggested that 'maximize'.
なお、上記実施例１，２より、アグロバクテリウムとの共存培養における‘濾紙に吸収させる共存培養用液体培地の液量’は、９０〜１１０％、好ましくは９１〜１０９％、より好ましくは９５〜１０５％、最も好ましくは１００％程度、が望ましいことが分かった。 From Examples 1 and 2, the amount of the liquid medium for co-culture to be absorbed by filter paper in co-culture with Agrobacterium is 90 to 110%, preferably 91 to 109%, more preferably 95. It has been found that ~ 105%, most preferably around 100% is desirable.
実施例３（品種の検討）
１）イネカルスの調製
表３に記載の‘各品種（日本晴、北海飼３０８、コシヒカリ、Ｄｕｌａｒ）’のイネの種子に対して、実施例１の記載と同様にして種子表面を滅菌した。
次に、日本晴、北海飼３０８、Ｄｕｌａｒの当該種子については、実施例１と同様にして、イネのカルスを調製した。
また、コシヒカリの当該種子については、「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）およびゲルライト（3 g/L）を含むｐＨ５．７に調整したＮ６固体培地」（即ちＮ６Ｄ固形培地）を用いて‘１週間’静置培養し、ついで、種子全体を、「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）およびゲルライト（3 g/L）を含むｐＨ５．７に調整した‘ＤＫＮ固体培地’（Breed. Sci. 50 (2000) 197-202）」に移して‘３週間’静置培養することで、カルスを誘導した。
そして、活発に増殖しているカルスを、再度上記と同一組成のＤＫＮ固体培地に移して３日間静置培養することで、成長したイネカルスを調製した。なお、培養は、温度２８℃、５０μｍｏｌｍ-2ｓ-1の明条件下（明期１６時間と暗期８時間の明暗周期下）で行った。
Example 3 (Examination of variety)
1) Preparation of Rice Callus Seed surface was sterilized in the same manner as described in Example 1 with respect to rice seeds of “various varieties (Nipponbare, Hokkaido 308, Koshihikari, Dual)” described in Table 3.
Next, rice calli were prepared in the same manner as in Example 1 for the seeds of Nipponbare, Hokkaido 308, and Dual.
For the seeds of Koshihikari, “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L) and gellite (3 g / L) and N6 solid medium adjusted to pH 5.7 ”(that is, N6D solid medium) for 1 week of stationary culture, and then the whole seeds were treated with“ 2,4-D (2 mg / L). L), 'DKN solid medium' (Breed) adjusted to pH 5.7 containing proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L) and gellite (3 g / L) . Sci. 50 (2000) 197-202) ”and callus were induced by '3 weeks' static culture.
Then, the actively growing callus was again transferred to a DKN solid medium having the same composition as described above and statically cultured for 3 days to prepare a grown rice callus. Cultivation was performed under light conditions (temperature: 28 ° C., 50 μmolm −2 s −1 (light period 16 hours and dark period 8 hours)).
２）アグロバクテリウム懸濁液の調製
実施例１と同様にして、アグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ６００の値：０．０４）を調製した。
2) Preparation of Agrobacterium Suspension Agrobacterium suspension (OD600 value: 0.04) was prepared in the same manner as Example 1.
３）アグロバクテリウムとの共存培養
日本晴、北海飼３０８、Ｄｕｌａｒの得られた前記カルスについては、前記濾紙（直径９ｃｍの２号定性濾紙３枚）に共存培養用液体培地を‘５．５ｍｌ’を吸収させたこと、および、前記共存培養時の温度を‘２５℃’で行ったこと、を除いて、実施例１と同様にして、アグロバクテリウムとの共存培養を行った。
また、コシヒカリの得られた前記カルスについては、共存培養用液体培地として、「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）、グルコース（5g/L）、Ｌ−システイン（100 mg/L）およびアセトシリンゴン（15 mg/L）を含む‘ＤＫＮ液体培地’」を用いたこと、前記濾紙（直径９ｃｍの２号定性濾紙３枚）に共存培養用液体培地を‘５．５ｍｌ’を吸収させたこと、および、前記共存培養時の温度を‘２５℃’で行ったこと、を除いて、実施例１と同様にして、アグロバクテリウムとの共存培養を行った。
3) Co-cultivation with Agrobacterium For the callus obtained by Nipponbare, Hokkaikai 308, Dual, the liquid medium for co-cultivation was placed on the filter paper (3 No. 2 qualitative filter paper with a diameter of 9 cm). Was co-cultured with Agrobacterium in the same manner as in Example 1 except that the temperature of the co-cultivation was “25 ° C.”.
For the callus from which Koshihikari was obtained, as a liquid medium for co-cultivation, “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L), “DKN liquid medium” containing glucose (5 g / L), L-cysteine (100 mg / L) and acetosyringone (15 mg / L) ”, the filter paper (diameter 9 cm No. 2 qualitative filter paper) was absorbed except that 5.5 ml of the liquid medium for co-cultivation was absorbed and that the temperature during the co-cultivation was performed at 25 ° C. In the same manner as in Example 1, co-culture with Agrobacterium was performed.
４）選抜マーカー遺伝子を用いた選抜培養、および、形質転換効率の測定
日本晴、北海飼３０８、Ｄｕｌａｒの共存培養後の前記カルスについては、ハイグロマイシンでの選抜培養を‘７日間’行ったことを除いて、実施例１と同様にして、形質転換されたイネカルスを選抜した。
また、コシヒカリの共存培養後の前記カルスについては、選抜用固体培地として「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）、メロペン（25 mg/L）、ハイグロマシン（50 mg/L）およびゲルライト（3 g/L）を含む‘ＤＫＮ固体培地’」を用いたこと、および、ハイグロマイシンでの選抜培養を‘７日間’行ったことを除いて、実施例１と同様にして、形質転換されたイネカルスを選抜した。
4) Selection culture using a selection marker gene and measurement of transformation efficiency The callus after co-cultivation of Nipponbare, Hokkai 308, and Dual was subjected to selection culture with hygromycin for "7 days". Except for the above, in the same manner as in Example 1, transformed rice callus was selected.
For the callus after co-cultivation of Koshihikari, as a solid medium for selection, “2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose ( 30 g / L), “DKN solid medium” containing meropen (25 mg / L), hygromachine (50 mg / L) and gellite (3 g / L) ”and selection with hygromycin Transformed rice callus was selected in the same manner as in Example 1 except that the culture was carried out for “7 days”.
そして、‘１０個以上’のカルスについて計測する操作を行ったことを除いて、実施例１と同様にして形質転換効率を測定した。結果を表３に示す。また、ＧＵＳ染色したカルスの実体顕微鏡写真を図４に示す。また、ＧＵＳ染色する前のカルスの状態を図５に示す。 Then, the transformation efficiency was measured in the same manner as in Example 1 except that the operation of measuring “10 or more” calli was performed. The results are shown in Table 3. A stereomicrograph of callus stained with GUS is shown in FIG. Moreover, the state of the callus before GUS dyeing is shown in FIG.
表３および図４より明らかなように、日本晴、北海飼３０８、コシヒカリ、Ｄｕｌａｒのいずれの品種においても、共存培養用液体培地を吸収させた濾紙上で、アグロバクテリウムとの共存培養を行うことにより、形質転換効率が‘顕著に’向上することが明らかになった。
この結果、日本晴、北海飼３０８、コシヒカリは、‘ジャポニカ種（Oryza sativa subsp. japonica）’であり、Ｄｕｌａｒは、‘インディカ種（Oryza sativa subsp. indica）’であることから、本技術は、‘イネ属の植物において普遍的に適用できる’可能性が高いことが示された。
As is clear from Table 3 and FIG. 4, cocultivation with Agrobacterium should be carried out on the filter paper that has absorbed the liquid culture medium for cocultivation in all varieties of Nipponbare, Hokkaido 308, Koshihikari, and Dual. As a result, it became clear that the transformation efficiency was significantly improved.
As a result, Nihonbare, Hokkaido 308, Koshihikari are 'Opiza species (Oryza sativa subsp. Japonica)', and Dural is 'Indica species (Oryza sativa subsp. Indica)'. It has been shown that it has a high possibility of 'universal application in rice plants.
また、図５が示すように、対照である固体培地で共存培養を行ったものでは（特にＤｕｌａｒにおいて）‘カルスの褐色化’が顕著に見られたが、共存培養用液体培地を吸収させた濾紙上で共存培養を行ったものでは、‘カルスの褐色化’が抑制されることが明らかになった。
これは、共存培養時のアグロバクテリウムの過剰増殖が抑制されたために、褐色化が起こらなかったためと考えられる。
In addition, as shown in FIG. 5, in the case where the coculture was performed on the solid medium as a control (particularly in the case of Dual), 'browning of the callus' was noticeable, but the liquid medium for coculture was absorbed. It was revealed that 'browning of callus' was suppressed when co-cultured on filter paper.
This is thought to be because browning did not occur because the overgrowth of Agrobacterium during co-culture was suppressed.
実施例４（共存培養時の温度およびアグロバクテリウム濃度の検討）
１）イネカルスの調製
実施例１と同様にして、イネ（品種：日本晴）のカルスを調製した。
２）アグロバクテリウム懸濁液の調製
アグロバクテリウムの懸濁液のＯＤ６００の値を、‘表４’に記載の所定濃度に調製したことを除いて、実施例１と同様にして、アグロバクテリウム懸濁液を調製した。
３）アグロバクテリウムとの共存培養
前記濾紙（直径９ｃｍの２号定性濾紙３枚）に共存培養用液体培地を‘５．５ｍｌ’を吸収させたこと、および、共存培養の温度を‘表４’に記載の温度で行ったこと、を除いて、実施例１と同様にして、アグロバクテリウムとの共存培養を行った。
４）選抜マーカー遺伝子を用いた選抜培養、および、形質転換効率の測定
実施例１と同様にして、形質転換されたイネカルスを選抜した。そして、実施例１と同様にして形質転換効率を測定した。結果を表４に示す。
Example 4 (Examination of temperature and Agrobacterium concentration during co-culture)
1) Preparation of Rice Callus In the same manner as in Example 1, rice (variety: Nipponbare) callus was prepared.
2) Preparation of Agrobacterium Suspension Agrobacterium suspension was prepared in the same manner as in Example 1 except that the OD600 value of the suspension of Agrobacterium was adjusted to the predetermined concentration described in 'Table 4'. A um suspension was prepared.
3) Co-culture with Agrobacterium The above-mentioned filter paper (three No. 2 qualitative filter papers with a diameter of 9 cm) absorbed 5.5 ml of the co-culture liquid medium, and the temperature of co-culture was shown in Table 4 Co-culture with Agrobacterium was performed in the same manner as in Example 1 except that it was performed at the temperature described in '.
4) Selection culture using selection marker gene and measurement of transformation efficiency In the same manner as in Example 1, transformed rice callus was selected. Then, the transformation efficiency was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 4.
表４が示すように、共存培養時の温度が２８℃で行うよりも、２５℃で行う方が、形質転換効率が有意に高いこと（平均値では約１．５〜３．０倍）が示された。
なお、２５℃で共存培養を行った場合では、アグロバクテリウムの濃度の濃淡（ＯＤ６００が０．０４〜０．２）に関わらず、形質転換効率に差は見られなかったが、２８℃で共存培養を行った場合は、アグロバクテリウムの濃度が、ＯＤ６００が０．０４の時（最大）と０．２の時では、有意差があること（平均値では約１．８倍）が示された。
これらのことは、２８℃で共存培養を行った場合、アグロバクテリウムが（特に濃度が濃い場合に）過剰増殖しやすく、カルスに損傷を与えて形質転換効率を減少させているためと考えられる。
As shown in Table 4, the transformation efficiency is significantly higher when performed at 25 ° C. than when the temperature during co-cultivation is 28 ° C. (average is about 1.5 to 3.0 times). Indicated.
When co-cultivation was performed at 25 ° C., no difference was observed in transformation efficiency regardless of the concentration of Agrobacterium (OD600: 0.04 to 0.2), but at 28 ° C. When co-cultivation is performed, there is a significant difference between the Agrobacterium concentration when OD600 is 0.04 (maximum) and 0.2 (average is about 1.8 times). It was done.
These are considered to be because Agrobacterium is prone to overgrowth when co-cultured at 28 ° C. (especially when the concentration is high), damaging callus and reducing transformation efficiency. .
以上のことより、‘２５℃’付近の温度で共存培養を行うことで、形質転換効率を高めることができ、アグロバクテリウムの濃度を変化させても安定して行うことできることが示された。 From the above, it was shown that by performing co-cultivation at a temperature around '25 ° C. ', the transformation efficiency can be increased, and it can be performed stably even if the concentration of Agrobacterium is changed.
実施例５（濾紙の枚数の検討）
１）イネカルスの調製
実施例１と同様にして、イネ（品種：日本晴）のカルスを調製した。
２）アグロバクテリウム懸濁液の調製
実施例１と同様にして、アグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ６００の値：０．０４）を調製した。
３）アグロバクテリウムとの共存培養
前記濾紙（直径９ｃｍの２号定性濾紙）を‘表５’に記載の枚数用いて、共存培養液を‘表５’に記載の所定量（各濾紙が１００％吸収できる液量とほぼ同量）を吸収させたこと、および、前記共存培養時の温度を‘２５℃’で行ったこと、を除いて、実施例１と同様にして、アグロバクテリウムとの共存培養を行った。
４）選抜マーカー遺伝子を用いた選抜培養、および、形質転換効率の測定
実施例１と同様にして、形質転換されたイネカルスを選抜した。
そして、８個のカルスについて計測する操作を‘１回のみ’行ったことを除いて、実施例１と同様にして、形質転換効率を測定した。結果を表５に示す。
Example 5 (Examination of the number of filter papers)
1) Preparation of Rice Callus In the same manner as in Example 1, rice (variety: Nipponbare) callus was prepared.
2) Preparation of Agrobacterium Suspension Agrobacterium suspension (OD600 value: 0.04) was prepared in the same manner as Example 1.
3) Co-culture with Agrobacterium Using the above filter paper (No. 2 qualitative filter paper with a diameter of 9 cm) as described in 'Table 5', the co-culture solution is a predetermined amount described in 'Table 5' (each filter paper is 100 Agrobacterium was absorbed in the same manner as in Example 1 except that it was absorbed at about 25%, and the temperature during the co-cultivation was “25 ° C.”. Was co-cultured.
4) Selection culture using selection marker gene and measurement of transformation efficiency In the same manner as in Example 1, transformed rice callus was selected.
Then, the transformation efficiency was measured in the same manner as in Example 1 except that the operation of measuring eight calli was performed only once. The results are shown in Table 5.
表５より明らかなように、定性濾紙の厚さ（２号濾紙の枚数）を０．２６ｍｍ（１枚）〜１．３ｍｍ（５枚）の範囲で行った場合においても、各濾紙が１００％吸収できる液量とほぼ同量の液量を吸収させて共存培養を行うことで、形質転換効率が高く維持されることが示された。
なお、特には、０．５２ｍｍ（２枚）〜１．３ｍｍ（５枚）の範囲で行った場合に、形質転換効率が高く維持されることが示された。
As is apparent from Table 5, even when the thickness of the qualitative filter paper (number of No. 2 filter paper) is 0.26 mm (1 sheet) to 1.3 mm (5 sheets), each filter paper is 100%. It was shown that transformation efficiency was maintained at a high level by co-culturing by absorbing approximately the same amount of solution that could be absorbed.
In particular, it was shown that the transformation efficiency was maintained high when performed in the range of 0.52 mm (2 sheets) to 1.3 mm (5 sheets).
実施例６（無選抜培養）
選抜マーカー遺伝子を用いた選抜培養を行うことなく、形質転換された植物体を得ることを試みた。
１）イネカルスの調製
実施例１と同様にして、イネ（品種：日本晴）のカルスを調製した。
２）アグロバクテリウム懸濁液の調製
実施例１と同様にして、アグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ６００の値：０．０４）を調製した。
３）アグロバクテリウムとの共存培養
前記濾紙（直径９ｃｍの２号定性濾紙３枚）に共存培養用液体培地を‘５．５ｍｌ’を吸収させたこと、および、前記共存培養時の温度を‘２５℃’で行ったことを除いて、実施例１と同様にして、アグロバクテリウムとの共存培養を行った。
Example 6 (Unselected culture)
An attempt was made to obtain transformed plants without performing selective culture using a selection marker gene.
1) Preparation of Rice Callus In the same manner as in Example 1, rice (variety: Nipponbare) callus was prepared.
2) Preparation of Agrobacterium Suspension Agrobacterium suspension (OD600 value: 0.04) was prepared in the same manner as Example 1.
3) Co-culture with Agrobacterium The above-mentioned filter paper (3 No. 2 qualitative filter paper with a diameter of 9 cm) absorbs 5.5 ml of the co-culture liquid medium, and the temperature during the co-culture is Co-culture with Agrobacterium was performed in the same manner as in Example 1 except that it was performed at 25 ° C '.
４）「無選抜培養」と形質転換植物体の再分化、および、形質転換効率の測定
上記、アグロバクテリウムとの共存培養後、‘選抜試薬(抗生物質など)’を含まない「２，４−Ｄ（2 mg/L）、プロリン（10 mM）、カゼイン加水分解物（300 mg/L）、スクロース（30 g/L）、メロペン（25 mg/L）およびゲルライト（3 g/L）を含むＮ６固体培地」の上に置き、温度２８℃、５０μｍｏｌｍ-2ｓ-1の明条件下（明期１６時間と暗期８時間の明暗周期下）で、１０日間培養した（図６Ａの段階）。
その後、カルスを薬さじで３ｍｍほどに砕いた後、駒込ピペットでよく懸濁し、２００〜４００μｍのナイロンメッシュを用いて濾過することで、２００〜４００μｍの小細胞塊を集めた（図６Ｂの段階）。
集めた‘小細胞塊’を再度Ｎ６固体培地の上に移し、温度２８℃、５０μｍｏｌｍ-2ｓ-1の明条件下（明期１６時間と暗期８時間の明暗周期下）で、７日間培養することで、細胞塊を成長肥大させた（図６Ｃの段階）。
その後、成長肥大させた全ての細胞塊を、‘実施例１の５に記載の再分化用固形培地からハイグロマイシンをのぞいた以外は同一組成の固形培地’の上に移し、再分化させたイネ植物体を得た（図６Ｄの段階）。（なお、上記図６Ａ〜Ｄに示す写真は、各段階の一部の細胞塊（植物体）を、実施例１に記載の方法と同様にしてＧＵＳ染色したものである。）
4) “Non-selection culture” and redifferentiation of transformed plants, and measurement of transformation efficiency After the co-culture with the above-mentioned Agrobacterium, “2, 4 without selection reagents (antibiotics, etc.)” -D (2 mg / L), proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L), meropen (25 mg / L) and gellite (3 g / L) Placed on the N6 solid medium containing "and cultured for 10 days under the light condition (at a light period of 16 hours and a dark period of 8 hours) at a temperature of 28 ° C. and 50 μmolm −2 s −1 (stage in FIG. 6A). ).
Thereafter, the callus was crushed to about 3 mm with a spoon, then suspended well with a Komagome pipette, and filtered through a 200-400 μm nylon mesh to collect a 200-400 μm small cell mass (step in FIG. 6B). ).
Collected and transferred to the top of the re-N6 solid medium 'small cell masses', the temperature 28 ° C., a light under the conditions of 50μmolm -2 s -1 (under light-dark cycle of 16 hours light and 8 hours dark) for 7 days By culturing, the cell mass was grown and enlarged (stage in FIG. 6C).
Thereafter, all the cell clusters grown and enlarged were transferred onto a solid medium having the same composition except that hygromycin was removed from the solid medium for redifferentiation described in 5 of Example 1 and redifferentiated rice. A plant was obtained (stage in FIG. 6D). (The photographs shown in FIGS. 6A to 6D are GUS-stained in the same manner as in Example 1 for some cell clusters (plants) at each stage.)
その後、形質転換効率の測定は、上記Ｎ６固体培地の上に移した‘小細胞塊’に対する、‘ＧＵＳ染色された再分化植物体’の数の割合を計測することで行った。なお、ＧＵＳ染色は、実施例１に記載の方法と同様にして行った。
なお、計測は、１００個以上の小細胞塊について計測する操作を３回行った（試験１〜３）。結果を表５に示す。
Thereafter, the transformation efficiency was measured by measuring the ratio of the number of “GUS-stained redifferentiated plants” to the “small cell mass” transferred onto the N6 solid medium. GUS staining was performed in the same manner as described in Example 1.
In addition, the measurement performed the operation | movement which measures about 100 or more small cell clusters 3 times (tests 1-3). The results are shown in Table 5.
表５の結果が示すように、本発明の方法でアグロバクテリウムとの共存培養を行うことによって、１００〜２５６個の小細胞塊に対して１個体の割合で、‘選抜マーカー遺伝子を用いた選抜を行うことなく’、形質転換されたイネ植物体を得ることができる事を明らかになった。
なお、選抜マーカー遺伝子を用いた選抜培養を行うことなく、このような高い頻度で形質転換体が得られるとの報告は、今までなされていない。
As shown in the results of Table 5, by performing co-culture with Agrobacterium by the method of the present invention, the 'selection marker gene was used at a rate of 1 individual per 100 to 256 small cell masses. It became clear that transformed rice plants could be obtained without selection.
It has not been reported so far that a transformant can be obtained at such a high frequency without performing selective culture using a selective marker gene.
本発明は、食料問題やエネルギー問題において、有用な形質を有するイネの品種や系統の作出に貢献できることが期待される。
また本発明は、形質転換効率の低い植物のＧＭ植物の開発、遺伝子解析（遺伝子機能解析）が飛躍的に進展することが期待される。
The present invention is expected to contribute to the production of rice varieties and lines having useful traits in food problems and energy problems.
In addition, the present invention is expected to make dramatic progress in the development and gene analysis (gene function analysis) of GM plants with low transformation efficiency.
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