JP2010038748A - Immunological measuring method of concentration of insulin of fishes - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は時間分解蛍光免疫測定法等の免疫学的検定によって、アジ科またはタイ科の魚類において、インスリン濃度の測定方法に関する。さらに、ビオチン化インスリンを用いる当該インスリン濃度の測定方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring insulin concentration in fishes of the genus department or family, by immunoassay such as time-resolved fluorescence immunoassay. Furthermore, the present invention relates to a method for measuring the insulin concentration using biotinylated insulin.
アジ科やタイ科の魚は、国内の養殖対象魚種の中で市場規模が１位と２位を占めるなど、生産金額が最も高い魚種である。ブリ（アジ科）とマダイ（タイ科）を合せると、１８００−２０００億円の市場となる。そのため、これらの養殖にあたり、成長に有効な環境の検討が重要となる。 Carpaceae and Thai fish are the fish species with the highest production value, with the market size occupying the first and second place among domestic fish species. Combining yellowtail (Aji family) and red sea bream (Thai family), the market is 180-200 billion yen. For this reason, it is important to consider an environment that is effective for growth in these aquacultures.
この環境の検討にあたり、様々な環境で養殖を行い、魚類の体長の変化をノギス等で測定して比較するという数週間の飼育実験が従来行われてきた。
また、近年では、成長誘導を仲介するいくつかのホルモンにおいて、その血中における濃度が、魚類の成長と高い相関があることが確認されたことから（例えば、非特許文献１参照）、魚類の血中における成長ホルモンの濃度を測定する方法が開発され、用いられるようになってきた。
In the study of this environment, several weeks of breeding experiments have been conducted in which culture is performed in various environments and changes in fish body length are measured and compared with calipers or the like.
In recent years, it has been confirmed that some hormones that mediate growth induction have a high correlation with the growth of fish (see, for example, Non-Patent Document 1). A method for measuring the concentration of growth hormone in the blood has been developed and used.
しかし、魚類の血中における成長ホルモンの濃度を測定する方法は、放射性同位元素を用いて測定するものが主であり、使用済みの試験管類の処理コスト、測定者の健康への影響の問題、放射性同位元素測定のための専用施設や放射性元素取扱主任者資格の必要性等から、その利用が限定的であり容易ではなかった。 However, the method of measuring the concentration of growth hormone in the blood of fish is mainly measured using a radioisotope, and there is a problem of the processing cost of used test tubes and the effect on the health of the measurer. However, its use was limited and not easy due to the need for a dedicated facility for radioisotope measurement and the qualification of a chief radio operator.
そこで、本発明者らは、放射性同位元素を用いず、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンの特異的かつ強力な結合を利用することで、安全かつ容易に実施できる魚類の血中における成長活性をモニタリングできるホルモンの濃度を測定する方法を開発した。本発明者らは、この方法によって、魚類の成長活性をモニタリングできるホルモンのひとつであるＩＧＦ−Ｉ（インスリン様成長因子−１）について、その標識ホルモンとしてビオチン化ＩＧＦ−Ｉを用いることで、時間分解免疫測定法または酵素免疫測定法のいずれの測定方法についても実用的な感度で魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度が測定できることを確認している（例えば、特許文献１参照）。
しかし、この測定方法はＩＧＦ−Ｉを測定するためのものであり、インスリンは測定できない。
Therefore, the present inventors can monitor the growth activity in fish blood that can be carried out safely and easily by using specific and strong binding of biotin and avidin or streptavidin without using a radioisotope. A method for measuring hormone levels was developed. By using this method, biotinylated IGF-I is used as a labeled hormone for IGF-I (insulin-like growth factor-1), which is one of the hormones that can monitor the growth activity of fish. It has been confirmed that the IGF-I concentration of fish can be measured with practical sensitivity for any measurement method of degradation immunoassay or enzyme immunoassay (see, for example, Patent Document 1).
However, this measurement method is for measuring IGF-I and cannot measure insulin.
インスリン濃度の測定方法としては、マツカワ（カレイ科）用の測定方法が開発されている（例えば、非特許文献２参照）。しかし、マツカワのインスリンとアジ科またはタイ科の魚のインスリンとのアミノ酸配列（構造）が異なるため、マツカワ（カレイ科）用の測定方法を用いても、十分な感度でアジ科やタイ科の魚のインスリン濃度を測定することができない。 As a method for measuring the insulin concentration, a measurement method for Matsukawa (Kaleidae) has been developed (see, for example, Non-Patent Document 2). However, because the amino acid sequence (structure) of Matsukawa's insulin differs from that of Ajiaceae or Thai fish, even if the measurement method for Matsukawa (Kaleidae) is used, the sensitivity of Insulin concentration cannot be measured.
魚類においてインスリンとＩＧＦ−Ｉはいずれも成長の制御や様々な生理的現象に深く関わるホルモンであり、各個体の生理的状態のインディケーターとして知られている。しかし、これらは分泌のピークが異なる。インスリンは、給餌後の数時間に血中濃度がピークに達するが、ＩＧＦ−Ｉの血中濃度はこのような短期的な生理的状況の変化では変動せず、給餌後の時間にも関係なく比較的一定である。従って、インスリンは短時間での成長のインディケーターとなり得るが、ＩＧＦ−Ｉは反応が遅く、数日から１−２週間程度のインディケーターとなる。また、インスリンの分泌は、ＩＧＦ−Ｉとは異なっており給餌後に起こる。そのため、インスリン濃度の測定によって、対象魚を開腹せずとも摂餌の状況をモニタリングできる。
さらにインスリンはストレスがかかると分泌されにくくなるため（例えば、非特許文献３参照）飼育魚のストレスマーカーとしての使用も期待できる。
In fish, both insulin and IGF-I are hormones that are deeply involved in growth control and various physiological phenomena, and are known as indicators of the physiological state of each individual. However, they have different secretion peaks. Insulin peaked in the blood several hours after feeding, but the blood level of IGF-I did not change with these short-term changes in physiological conditions, and was independent of the time after feeding. It is relatively constant. Therefore, while insulin can be an indicator of growth in a short time, IGF-I has a slow response and becomes an indicator for several days to about 1-2 weeks. Insulin secretion is different from IGF-I and occurs after feeding. Therefore, by measuring the insulin concentration, it is possible to monitor the feeding status without opening the target fish.
Furthermore, since insulin is difficult to be secreted when stressed (see, for example, Non-Patent Document 3), it can be expected to be used as a stress marker for domestic fish.
このように、アジ科またはタイ科の魚類のインスリン濃度の測定が可能となれば、ＩＧＦ−Ｉ濃度の測定とは別の方法で成長活性や摂餌の状態の把握が可能となる。また、魚類におけるストレスの有無やその程度の把握が可能となることから、養殖における成長に有効な環境の検討に有用であり、効率的な育成法の開発に繋がる。そこで、アジ科またはタイ科の魚類を対象とする、新たなインスリン濃度の測定方法の提供が望まれている。
本発明は、ビオチン化インスリンを用いるアジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法の提供を課題とする。 It is an object of the present invention to provide a method for measuring insulin concentration in a fish of the family Clinidae or Thai using biotinylated insulin.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ビオチン化したアジ科の魚類のインスリンを新規に作製し、これを用いてビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンの特異的かつ強力な結合を利用することで、アジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度が測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventor has newly produced a biotinylated fish of the family Glidaceae and uses this to specifically and potently use biotin and avidin or streptavidin. By using the binding, it was found that the insulin concentration in the fishes of the family Daffodil or Thai family can be measured, and the present invention has been completed.
即ち、本発明は次の（１）〜（９）の測定方法、ビオチン化インスリン等に関する。
（１）ビオチン化インスリンを用いるアジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法。
（２）ビオチン化インスリンをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分離し、抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画を用いる上記（１）に記載の測定方法。
（３）測定方法が時間分解蛍光免疫測定法である上記（１）または（２）に記載の測定方法。
（４）ビオチン化インスリンにユーロピウム−アビジン複合体を作用させて、ユーロピウムの時間分解蛍光強度を測定することによる時間分解蛍光免疫測定法を用いる上記（３）に記載の測定方法。
（５）さらに、サンプルを塩酸―エタノール処理（抽出）する工程を含む上記（１）〜（４）のいずれかに記載の測定方法。
（６）アジ科またはタイ科の魚類がブリ、カンパチまたはマダイのいずれかである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の測定方法。
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の測定方法に用いるビオチン化インスリン。
（８）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の測定方法に用いるビオチン化ブリインスリン。
（９）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の測定方法に用いるビオチン化インスリンを含むアジ科またはタイ科の魚類のインスリン濃度の測定キット。
That is, the present invention relates to the following measurement methods (1) to (9), biotinylated insulin and the like.
(1) A method for measuring the concentration of insulin in fishes of the family Carriaceae or Thai family using biotinylated insulin.
(2) The measurement method according to (1) above, wherein a fraction that gives the highest fluorescence intensity in a state in which biotinylated insulin is separated by HPLC (high performance liquid chromatography) and bound to an antibody.
(3) The measuring method according to (1) or (2) above, wherein the measuring method is a time-resolved fluorescence immunoassay.
(4) The measurement method according to the above (3), which uses a time-resolved fluorescence immunoassay method by allowing europium-avidin complex to act on biotinylated insulin and measuring the time-resolved fluorescence intensity of europium.
(5) The measuring method according to any one of (1) to (4), further comprising a step of treating (extracting) the sample with hydrochloric acid-ethanol.
(6) The measuring method according to any one of (1) to (5) above, wherein the fishes of the family Asteridae or Thai are either yellowtail, amberjack or red sea bream.
(7) Biotinylated insulin used in the measurement method according to any one of (1) to (6) above.
(8) Biotinylated brisulin used for the measurement method according to any one of (1) to (6) above.
(9) A kit for measuring the concentration of insulin in a fish of the family Glidaceae or Thai family containing biotinylated insulin used in the measurement method according to any one of (1) to (6) above.
本発明のビオチン化インスリンを用いることを特徴とする、アジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法は、放射性同位元素を用いないため、時間分解蛍光測定装置あるいは蛍光プレートリーダーさえあれば、特別な制限なく、容易に魚類のインスリン濃度の測定が可能となる。本発明により、魚類のインスリン濃度を測定することで、魚類の成長の度合いの調査を容易に行うことができる。
また本発明で作製されたビオチン化インスリンは、放射性同位元素標識インスリンと異なり、かなり安定的であるため、冷蔵すれば数年間は使用可能であり、冷凍状態では半永久的に保存できる。従って、本発明の方法によって、魚類のインスリン濃度を低コストかつ低労力で測定することが可能となる。
The method for measuring the concentration of insulin in a fish of the family Carriaceae or Thai family characterized by using the biotinylated insulin of the present invention does not use a radioisotope, so that there is only a time-resolved fluorescence measuring device or a fluorescence plate reader. Without special restriction, it is possible to easily measure the insulin concentration of fish. According to the present invention, it is possible to easily investigate the degree of fish growth by measuring the insulin concentration of fish.
The biotinylated insulin produced in the present invention is quite stable, unlike radioisotope-labeled insulin, so that it can be used for several years if it is refrigerated and can be stored semipermanently in a frozen state. Therefore, according to the method of the present invention, the insulin concentration of fish can be measured at low cost and with low labor.
本発明の「ビオチン化インスリン」とは、ビオチンを結合させたインスリンのことをいう。特に、アジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法に用いる「ビオチン化インスリン」は、アジ科またはタイ科の魚類由来のインスリンにビオチンを結合させたものであることが好ましく、特にブリ由来のインスリンであることが特に好ましい。
これらのビオチン化インスリンはユーロピウム−アビジン複合体に結合するものであることが好ましい。
ビオチンを結合させるインスリンはアジ科またはタイ科の魚類から抽出した天然のインスリンでも、これらインスリンのアミノ配列に基いて、通常用いられている方法によって化学合成されたインスリンでも用いることができる。
The “biotinylated insulin” of the present invention refers to insulin to which biotin is bound. In particular, the “biotinylated insulin” used in the method for measuring the insulin concentration in the fishes of the family Carpaceae or Thai family is preferably one in which biotin is bound to the insulin derived from the fish of the family Carabidae or the family Thai, particularly from the yellowtail. Particularly preferred is insulin.
These biotinylated insulins are preferably those that bind to the europium-avidin complex.
Insulin to which biotin is bound can be natural insulin extracted from a fish of the family Clamaceae or Thai, or insulin chemically synthesized by a commonly used method based on the amino sequence of these insulins.
本発明の「ビオチン化インスリン」は、従来知られているいずれの方法でも作製することができる。例えばＰｉｅｒｃｅ社製のＥＺ−ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎのような市販のビオチン化試薬を用いて作製することができる。
本発明の「抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画」とは、ビオチン化インスリンの作製において、抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画のことをいい、このような分画は、高い検出感度を有するビオチン化インスリンとして用いることができる。
The “biotinylated insulin” of the present invention can be prepared by any conventionally known method. For example, it can be prepared using a commercially available biotinylation reagent such as EZ-link Sulfo-LC-LC-biotin manufactured by Pierce.
In the present invention, “the fraction capable of obtaining the highest fluorescence intensity in the state bound to the antibody” refers to the fraction in which the highest fluorescence intensity is obtained in the state bound to the antibody in the production of biotinylated insulin. Okay, such a fraction can be used as biotinylated insulin with high detection sensitivity.
本発明の「ビオチン化インスリン」の作製において、インスリンの１分子あたりビオチンが０−３個結合した混合物が得られる。この混合物は、そのまま測定に用いることもできるが、高い検出感度を安定して得るためには、さらにＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精製することが好ましい。
精製によりインスリンの１分子あたりビオチンが１−３個結合したビオチン化インスリンを分離し、それぞれの分画について抗体と結合させ、この状態で最も高い蛍光強度が得られる分画を選別し、その分画を高い検出感度を有するビオチン化インスリンとして、測定に用いることが好ましい。
In the production of “biotinylated insulin” of the present invention, a mixture in which 0 to 3 biotins are bound per molecule of insulin is obtained. Although this mixture can be used for measurement as it is, in order to stably obtain high detection sensitivity, it is preferable to further purify by HPLC (high performance liquid chromatography).
By purification, biotinylated insulin with 1-3 biotins bound per molecule of insulin is separated, and each fraction is bound to an antibody. In this state, the fraction with the highest fluorescence intensity is selected. The fraction is preferably used for measurement as biotinylated insulin having high detection sensitivity.
本発明の「測定方法」は、アジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度が測定できる方法であれば酵素免疫測定法などにも用いることができるが、時間分解蛍光免疫測定法を用いることが特に好ましい。
本発明の「時間分解蛍光免疫測定法」は、ビオチン化インスリンを用い、さらにビオチンと特異的かつ強力に結合するアビジンにユーロピウムを結合させたユーロピウム−アビジン複合体を用い、両者を結合させ、洗浄操作の後、ユーロピウムを時間分解蛍光測定法で測定することにより、ビオチン化インスリンの抗体との結合量を測定し、サンプル中のインスリン濃度を決定する方法である。
本発明は、免疫測定法の分類では競合法と呼ばれる測定原理に基づいたものであり、本発明の測定方法においてユーロピウムの時間分解蛍光強度はサンプル中のインスリン濃度上昇に依存して減少する。これにより、サンプル中のインスリン濃度を容易に調べることができる。なお、サンプル中のインスリン濃度が測定可能上限を超える場合にはサンプルを希釈して測定することができる。
The “measuring method” of the present invention can be used for enzyme immunoassay and the like as long as it can measure the insulin concentration in the fishes of the family Dinosaur or Thai, but it is particularly preferable to use time-resolved fluorescence immunoassay. preferable.
The “time-resolved fluorescence immunoassay” of the present invention uses biotinylated insulin, and further uses a europium-avidin complex in which europium is bound to avidin that specifically and strongly binds to biotin. After the operation, europium is measured by time-resolved fluorescence measurement, thereby measuring the amount of biotinylated insulin bound to the antibody and determining the insulin concentration in the sample.
The present invention is based on a measurement principle called a competitive method in the classification of immunoassays. In the measurement method of the present invention, the time-resolved fluorescence intensity of europium decreases depending on the increase in the insulin concentration in the sample. Thereby, the insulin concentration in a sample can be investigated easily. When the insulin concentration in the sample exceeds the measurable upper limit, the sample can be diluted and measured.
本発明の「時間分解蛍光免疫測定法」に用いる「ユーロピウム−アビジン複合体」は、ビオチン化インスリンを検出できる程度のユーロピウムがアビジンやストレプトアビジンに結合して複合体を形成しているもののことであり、例えば、パーキンエルマー社製のユーロピウム−ストレプトアビジン複合体等を用いることができる。
ユーロピウムは希土類元素の一つで紫外線をあてると赤い蛍光を長時間にわたって発することが知られており、高感度で特異的な測定が可能となる。この方法は、非放射性でありかつ毒性もないことから、人体および環境に対して安全であり、使用・廃棄にあたり制限がない。
The “europium-avidin complex” used in the “time-resolved fluorescence immunoassay method” of the present invention is a compound in which europium capable of detecting biotinylated insulin is bound to avidin or streptavidin to form a complex. Yes, for example, Europium-Streptavidin complex manufactured by PerkinElmer, Inc. can be used.
Europium is one of the rare earth elements and is known to emit red fluorescence over a long period of time when exposed to ultraviolet light, enabling highly sensitive and specific measurements. Since this method is non-radioactive and non-toxic, it is safe for the human body and the environment, and there are no restrictions on its use and disposal.
さらに、本発明の「測定方法」は、測定対象のサンプルを塩酸―エタノール処理（以下、抽出とする）する工程を含むことが好ましい。この工程によって、サンプルに含まれるインスリン濃度の測定を阻害する物質等を除去することで、インスリン濃度の測定の精度を高めることができる。例えば血液、血漿、血清またはこれらの派生物等のインスリン濃度の測定を阻害する物質等を含むサンプルを測定対象とする場合に、この工程を用いることが特に有効である。
この「サンプルを塩酸―エタノール処理（抽出）する工程」によって行われる処理は、サンプルに含まれるインスリン濃度の測定を阻害する物質が除去できる工程であれば、いずれの処理工程であってもよい。
例えばアジ科またはタイ科の魚類由来の血漿をエチルアルコールと塩酸の混合物と混合し、一定時間放置した後、遠心分離し、上清のみを得る工程が挙げられる。このような工程によって、血漿中のインスリン濃度の測定を阻害する物質が除去され、血漿中のインスリン濃度の測定にあたり、測定値の正確性を増すことができる。
なお、本発明の「測定方法」において、検出感度を高めるために、「時間分解蛍光免疫測定法」における競合的抗原抗体反応ステップ、例えば実施例１、２．インスリン濃度の測定における（２）〜（４）の工程を室温ではなく氷冷することで測定値の正確性を増すことも可能である。
Furthermore, the “measuring method” of the present invention preferably includes a step of treating a sample to be measured with hydrochloric acid-ethanol (hereinafter referred to as extraction). By this step, substances that inhibit measurement of insulin concentration contained in the sample are removed, so that the accuracy of measurement of insulin concentration can be increased. For example, this step is particularly effective when a sample containing a substance that inhibits measurement of insulin concentration such as blood, plasma, serum, or a derivative thereof is to be measured.
The treatment performed by this “step of treating (extracting) a sample with hydrochloric acid-ethanol” may be any treatment step as long as the substance that inhibits the measurement of insulin concentration contained in the sample can be removed.
For example, there is a step in which plasma derived from a fish of the family Tyridae or Thai family is mixed with a mixture of ethyl alcohol and hydrochloric acid, allowed to stand for a certain period of time, and then centrifuged to obtain only the supernatant. By such a process, a substance that inhibits the measurement of the insulin concentration in plasma is removed, and the accuracy of the measurement value can be increased when measuring the insulin concentration in plasma.
In the “measurement method” of the present invention, in order to increase the detection sensitivity, a competitive antigen-antibody reaction step in the “time-resolved fluorescence immunoassay method”, for example, Examples 1 and 2. It is also possible to increase the accuracy of the measured value by cooling the steps (2) to (4) in measuring the insulin concentration with ice instead of room temperature.
本発明の「測定方法」において、アジ科またはタイ科の魚類のインスリン濃度を測定するために、これらの魚類由来のインスリンに対する抗インスリン抗体を用いることが好ましい。
抗インスリン抗体は、市販されている抗体や、測定の対象魚に合わせて作製された抗インスリン抗血清、抗インスリン抗体を用いることができる。例えば、抗インスリン抗血清は、ブリの内分泌膵臓から抽出したインスリンをマウス、モルモット等の動物に免疫することで得ることができる。
In the “measuring method” of the present invention, it is preferable to use an anti-insulin antibody against insulin derived from these fishes in order to measure the insulin concentration of the fishes of the genus Dinaceae or the Thai family.
As the anti-insulin antibody, a commercially available antibody, or an anti-insulin antiserum or anti-insulin antibody prepared according to the fish to be measured can be used. For example, anti-insulin antiserum can be obtained by immunizing animals such as mice and guinea pigs with insulin extracted from the endocrine pancreas of yellowtail.
本発明の測定対象であるアジ科またはタイ科の魚類は、本発明の測定方法によってサンプル中のインスリン濃度が測定できる、これらの科に属するいずれの魚種も対象とできる。例えば、ブリ、カンパチまたはマダイなどが挙げられる。 The fishes belonging to the family of genus department or family that are the measurement targets of the present invention can be any fish species belonging to these families in which the insulin concentration in the sample can be measured by the measurement method of the present invention. For example, yellowtail, amberjack or red sea bream.
本発明に作製されたビオチン化インスリンと、ユーロピウムが結合したアビジン複合体、測定に最適な試薬や抗体、洗浄液、マイクロウェルプレート等を組み合わせることによりキットとすることもできる。洗浄液は例えば、パーキンエルマー社製の市販のものを用いても良いが、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）等を用いても良い。
以下、本発明の詳細を参考例、試験例および実施例によって示すが、本発明はこれらによって制限されない。
A kit can also be obtained by combining the biotinylated insulin prepared in the present invention with an avidin complex to which europium is bound, a reagent or antibody optimal for measurement, a washing solution, a microwell plate, and the like. For example, a commercially available cleaning solution manufactured by Perkin Elmer may be used, but 20 mM Tris-HCl (including pH 7.8, 0.05% Tween 20 and 150 mM NaCl) may be used.
Hereinafter, although the detail of this invention is shown with a reference example, a test example, and an Example, this invention is not restrict | limited by these.
［参考例］
＜ブリまたはマダイのインスリン配列の決定＞
参考文献１に記載の方法に従って、ブリ、カンパチまたはマダイのブロックマン小体（内分泌膵臓）からインスリンをそれぞれ精製した。これを還元カルボキシメチル化し、逆相ＨＰＬＣでＡ鎖およびＢ鎖をいずれも分離・脱塩した後、プロテインシーケンサー（島津製作所 ＰＰＳＱ−２１）によって配列を決定した。決定したブリ、カンパチおよびマダイのアミノ酸配列と、比較としてマツカワのインスリン−Ｉおよびインスリン−ＩＩのアミノ酸配列を配列表配列番号１〜１０および表１に示した。表１においては、ブリインスリンと比べて配列が異なる箇所をアンダーラインで示した。
参考文献１：Ａｎｄｏｈ，Ｔ．，ａｎｄ Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈ．（１９９８）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎｓ， ｇｌｕｃａｇｏｎｓ ａｎｄ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔｏｎｅ ｆｌｏｕｎｄｅｒ， Ｋａｒｅｉｕｓ ｂｉｃｏｌｏｒａｔｕｓ． Ｚｏｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５，９３９−９４３．
[Reference example]
<Determining the insulin sequence of yellowtail or red sea bream>
According to the method described in Reference 1, insulin was purified from yellowtail, amberjack, or red sea bream block bodies (endocrine pancreas), respectively. This was reduced to carboxymethyl, and both A chain and B chain were separated and desalted by reverse phase HPLC, and then sequenced by a protein sequencer (Shimadzu Corporation PPSQ-21). The amino acid sequences of yellowtail, amberjack and red sea bream determined and the amino acid sequences of insulin-I and insulin-II of Matsukawa are shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 and Table 1 for comparison. In Table 1, the portion where the arrangement is different from that of briinsulin is indicated by an underline.
Reference 1: Andoh, T .; , And Nagasawa, H .; (1998) Purification and structural determination of insulins, glucagons and somatostatin from stone flounder, Karius bicoloratas. Zoological Science, 15, 939-943.
＜アジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法＞
１．インスリン濃度測定用試薬の調製
１）抗インスリン抗血清の作製
参考文献１に記載の方法に従って、ブリの内分泌膵臓からインスリンを抽出しモルモットに下記の方法で免疫し、得られた抗血清を抗インスリン抗血清として用いた。
免疫方法
上記で抽出したブリインスリン（各回３０μｇ）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、１５０ｍＭ）に溶解し、一回目はフロイントの完全アジュバントを加えて５００μｌとし、２回目以降はフロイントの不完全アジュバントを加えて５００μｌとして混合し、計５回の皮下注射を行った。免疫間隔は２週間とし、最終免疫から１週間後に全採血を行い、抗血清を得た。
<Measuring method of insulin concentration in aziridae or Thai fish>
1. Preparation of reagent for measuring insulin concentration 1) Preparation of anti-insulin antiserum In accordance with the method described in Reference 1, insulin is extracted from the endocrine pancreas of yellowtail, and guinea pigs are immunized by the following method. Used as antiserum.
Immunization method The brisulin extracted above (30 μg each time) is dissolved in a phosphate buffer solution (pH 7.5, 150 mM), the first time adding Freund's complete adjuvant to 500 μl, and the second and subsequent times incomplete Freund's adjuvant. Was mixed to make 500 μl, and a total of 5 subcutaneous injections were performed. The interval between immunizations was 2 weeks, and after 1 week from the final immunization, whole blood was collected to obtain antiserum.
２）ビオチン化インスリンの作製
次の（１）〜（４）の工程を経て、ビオチン化インスリンを作製した。
（１）上記１．１）と同様の方法によって抽出した５３μｇのブリインスリンと１６０μｇのＥＺ−ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を２５０μｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）で一晩、室温で反応させた。
（２）１０ｍｇのグリシンを加え、過剰のＥＺ−ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎをグリシンと３時間以上反応させ、不活性化した。
（３）１μｌのトリフルオロ酢酸を加えて酸性化し、０．１％トリフルオロ酢酸と５０％アセトニトリルを使用した高速液体クロマトグラフィーでビオチン化ブリインスリンを分離した。カラムは逆相液体クロマトグラフィー用Ｃ１８担体を充填したもの（ワイエムシー社製、ＯＤＳ−ＡＭ 粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍなど）を使用し、カラム温度を３０℃に設定して行った。
（４）分離したビオチン化ブリインスリンの抗体交差性を以下の方法で確認し、最も交差活性が高い分画（図１、斜線部分）をインスリン測定法に使用した。
2) Preparation of biotinylated insulin Biotinylated insulin was prepared through the following steps (1) to (4).
(1) 53 μg of brisulin extracted by the same method as in 1.1) above and 160 μg of EZ-link NHS-LC-LC-biotin (manufactured by Pierce) 250 μl of phosphate buffer (pH 7.8, 150 mM) (Containing NaCl) and allowed to react overnight at room temperature.
(2) 10 mg of glycine was added, and excess EZ-link Sulfo-LC-LC-biotin was reacted with glycine for 3 hours or more to inactivate.
(3) 1 μl of trifluoroacetic acid was added for acidification, and biotinylated briinsulin was separated by high performance liquid chromatography using 0.1% trifluoroacetic acid and 50% acetonitrile. The column was packed with a C18 carrier for reverse phase liquid chromatography (manufactured by YMC, ODS-AM particle size 3 μm, 2.1 mm × 150 mm, etc.), and the column temperature was set to 30 ° C.
(4) The antibody cross-reactivity of the separated biotinylated briinsulin was confirmed by the following method, and the fraction having the highest cross-activity (FIG. 1, shaded area) was used for the insulin measurement method.
２．インスリン濃度の測定
次の（１）〜（７）の工程を経て、インスリン濃度を測定した。
なお、洗浄液には１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）を使用した。
（１）マイクロプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ社製、Ｍａｘｉｓｏｒｐ処理済み）にアフィニティー精製した抗モルモットＩｇＧ溶液（Ａｎｔｉ−ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ （Ｈ＋Ｌ） Ｒｏｃｋｌａｎｄ社（ＵＳＡ））を１０μｇ／ｍｌの濃度で２００μｌ分注し、２時間以上、室温で放置した。
この際、抗モルモットＩｇＧ希釈液として５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＮａＮ３含む）を使用した。
（２）３回洗浄後、上記１．２）で作製したビオチン化ブリインスリンを２００μｌずつマイクロプレートの各ウェル（穴）に分注した。なお、ビオチン化インスリンは４００ｐｇ／ｍｌになるようにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ エチレンジアミン４酢酸、０．０１％ ＮａＮ３を含む１００ｍＭ ｐＨ７．８）で２５％に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）溶液に溶解した。
（３）次に１０μｌの測定用サンプルまたはコントロール（濃度既知のブリインスリン溶液）を各ウェルに分注した。
（４）上記（３）の各ウェルに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＮａＮ３含む）で１３０００倍に希釈した抗ブリインスリン抗血清を８μｌ分注し、十分に撹拌した。そして、マイクロプレートの上面をプラスティックテープでシールした後、チャック付きポリ袋（ユニパックＦ−４）に入れ、発泡スチロール箱に入れた砕氷中で一晩静置した。
（５）３回洗浄後、ユーロピウム−アビジン複合体（パーキンエルマー社製、品番１２４４−３６０）をアッセイ緩衝液（パーキンエルマー社製、品番１２４４−１０６）で０．０４％に希釈し、各ウェルに２００μｌずつ分注した後、１−２時間室温で静置した。
（６）４回洗浄後、増強試薬（パーキンエルマー社製、品番１２４４−１０４）を各ウェルに１００μｌずつ分注し、５分間、撹拌した。
（７）時間分解蛍光測定装置で蛍光強度を測定することによりユーロピウム濃度を計算し、濃度既知の標準品系列から計算される標準曲線からインスリン濃度を決定した。
2. Measurement of insulin concentration The insulin concentration was measured through the following steps (1) to (7).
Note that a 20 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.8) containing 150 mM NaCl and 0.01% Tween 20 was used as the washing solution.
(1) Affinity-purified anti-guinea pig IgG solution (Anti-guinea pig (H + L) Rockland (USA)) was dispensed at a concentration of 10 μg / ml on a microplate (Nalge Nunc, Maxisorp-treated), and 2 It was left at room temperature for more than an hour.
At this time, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8, 150 mM NaCl, 0.01% NaN 3 included) was used as an anti-guinea pig IgG dilution.
(2) After washing 3 times, 200 μl of biotinylated brisulin prepared in 1.2) was dispensed into each well (hole) of the microplate. It should be noted that block ace (large size) diluted to 25% with Tris-HCl buffer solution (100 mM pH 7.8 containing 150 mM NaCl, 10 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.01% NaN 3 ) so that biotinylated insulin is 400 pg / ml. (Manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.)
(3) Next, 10 μl of a sample for measurement or a control (briinsulin solution with a known concentration) was dispensed into each well.
(4) 8 μl of anti-briinsulin antiserum diluted 13000 times with 50 mM Tris-HCl buffer (containing pH 7.8, 150 mM NaCl, 0.01% NaN 3 ) is dispensed into each well of (3) above. Stir well. And after sealing the upper surface of a microplate with a plastic tape, it put into the plastic bag with a chuck | zipper (Unipack F-4), and left still overnight in the crushed ice put in the foamed polystyrene box.
(5) After washing three times, the europium-avidin complex (Perkin Elmer, part number 1244-360) was diluted to 0.04% with assay buffer (Perkin Elmer part number 1244-106), and each well After dispensing 200 μl each, the mixture was allowed to stand at room temperature for 1-2 hours.
(6) After washing 4 times, 100 μl of the enhancement reagent (Perkin Elmer, product number 1244-104) was dispensed into each well and stirred for 5 minutes.
(7) The europium concentration was calculated by measuring the fluorescence intensity with a time-resolved fluorescence measuring device, and the insulin concentration was determined from a standard curve calculated from a standard product series with known concentrations.
＜アジ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法＞
上記実施例１の方法によって、アジ科の魚類としてブリのインスリン濃度を測定した。
測定用にブリの血漿を下記の方法で抽出したものを測定用サンプルとして用いた。
測定用サンプルの調製
ブリの血漿を１．５ｍｌマイクロチューブ等に２０−１００μｌ分注し、ミキサー（タイテック社製マイクロミキサーＥ−３６）上で攪拌しながら、等量のエタノール―塩酸（５％ １Ｎ ＨＣｌ、９５％エタノール）を分注した。
分注後、エタノールが蒸発しないようにできるだけ早くチューブのふたを閉め、数分間、十分に攪拌した後、室温で１時間放置した。これを遠心操作（１５０００ｘｇ、１０分間、４度）した後に沈殿を除去し、上清を測定用サンプルとして使用した。
<Measuring method of insulin concentration in fishes of the family Dendrobidae>
According to the method of Example 1 above, the insulin concentration of yellowtail was measured as a fish of the family Asteraceae.
For the measurement, yellowtail plasma extracted by the following method was used as a measurement sample.
Preparation of sample for measurement 20-100 μl of yellowtail plasma is dispensed into a 1.5 ml microtube and the like, while stirring on a mixer (Micromixer E-36 manufactured by Taitec Co., Ltd.), an equal volume of ethanol-hydrochloric acid (5% 1N) HCl, 95% ethanol).
After dispensing, the lid of the tube was closed as soon as possible so as not to evaporate the ethanol, and after sufficiently stirring for several minutes, it was left at room temperature for 1 hour. This was centrifuged (15000 × g, 10 minutes, 4 degrees), the precipitate was removed, and the supernatant was used as a measurement sample.
＜タイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法＞
上記実施例１の方法によって、タイ科の魚類としてマダイのインスリン濃度を測定した。マダイの血漿を抽出は行わず、そのまま測定用サンプルとして用いた。
<Method of measuring insulin concentration in Thai fish>
Insulin concentration of red sea bream as a fish of the Thai family was measured by the method of Example 1 above. The red sea bream plasma was not extracted and used as a sample for measurement.
［試験例１］
参考文献１に記載の方法に従ってブリまたはマダイのブロックマン小体（内分泌膵臓）から精製したブリインスリンまたはマダイインスリンを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＮａＮ３を含む１００ｍＭ ｐＨ７．８）で２５％に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）に溶解したものをそれぞれ用いて、実施例１の測定方法によってインスリン濃度の測定を行った。
その結果、図２に示すように、ブリインスリンおよびマダイインスリンの標準曲線はほとんど重なっており、実用上は同一のものとして測定できることが示された。この結果より、本発明のインスリン濃度の測定方法は、アジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定に有用であることが示された。
[Test Example 1]
Purified brisulin or red sea bream insulin from yellowtail or red sea bream blockman bodies (endocrine pancreas) according to the method described in Reference 1 was added to Tris-HCl buffer (150 mM NaCl, 0.01 mM NaN 3 at 100 mM pH 7. Insulin concentration was measured by the measurement method of Example 1 using each of those dissolved in Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) diluted to 25% in 8).
As a result, as shown in FIG. 2, the standard curves of briinsulin and red sea bream insulin almost overlapped, indicating that they can be measured as the same in practical use. From these results, it was shown that the method for measuring insulin concentration according to the present invention is useful for measuring insulin concentration in fishes of the family Carpidae or Thai.
［試験例２］
＜アジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法の精度の検討＞
参考文献１に記載の方法に従って、ブリ、カンパチおよびマダイのブロックマン小体（内分泌膵臓）から精製したブリインスリンと、比較としてブリインスリンと構造が類似するペプチド（ヒトＩＧＦ−Ｉ、ウシインスリン）や、インスリンと共に膵臓に存在するペプチド（ソマトスタチン−１４、ヒト膵ポリペプチド、ヒトグルカゴンのペプチド（いずれもシグマ社製））を用いて、実施例１の測定方法の精度を検討した。
各ペプチドはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＮａＮ３を含む１００ｍＭ ｐＨ７．８）で２５％に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）に溶解したものを測定用サンプルとした。
その結果、図３に示すように、各種ペプチドは、本発明のインスリン抗血清中の抗体と結合活性を殆ど示さず、本発明の測定方法がアジ科またはタイ科の魚類のインスリンに高い特異性を有することが示された。
[Test Example 2]
<Examination of accuracy of measuring method of insulin concentration in phlogopaceae or Thai fish>
According to the method described in Reference 1, brisulin purified from yellowtail, amberjack, and red sea bream block bodies (endocrine pancreas), and a peptide similar in structure to human insulin (human IGF-I, bovine insulin) The accuracy of the measurement method of Example 1 was examined using peptides that exist in the pancreas together with insulin (somatostatin-14, human pancreatic polypeptide, human glucagon peptide (all manufactured by Sigma)).
Each peptide was dissolved in Block Ace (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) diluted to 25% with Tris-HCl buffer (150 mM NaCl, 100 mM pH 7.8 containing 0.01% NaN 3 ) as a sample for measurement. .
As a result, as shown in FIG. 3, various peptides show almost no binding activity with the antibody in the insulin antiserum of the present invention, and the measurement method of the present invention has high specificity for the insulin of the fishes of the genus Carriaceae or Thai family. It was shown to have
［試験例３］
＜アジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法の測定値の正確性の検討＞
ブリの血漿を実施例２に記載した方法で抽出し、調整した測定用サンプルを用いて、実施例１の測定方法によって、ブリインスリン濃度を測定した。測定値の正確性を一回のアッセイ内および異なるアッセイ間における変動係数を調べた。その結果、表２、３に示したように、他の測定法に比較して変動係数が十分に小さいものであることが確認された。
[Test Example 3]
<Examination of the accuracy of the measurement value of the method for measuring the insulin concentration in the fishes of the genus Tyridae or Thai>
The blood plasma of yellowtail was extracted by the method described in Example 2, and the concentration of brisulin was measured by the measurement method of Example 1 using the prepared measurement sample. The accuracy of the measurements was examined for coefficient of variation within a single assay and between different assays. As a result, as shown in Tables 2 and 3, it was confirmed that the coefficient of variation was sufficiently small as compared with other measurement methods.
［試験例４］
＜アジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法を用いた添加回収試験＞
ブリの血漿に濃度既知のブリインスリンを加え、加えたインスリンに応じた測定値が得られるかどうかを試験した。これは血漿に含まるインスリン以外の物質によって、インスリン濃度の測定値が変化するか否かを試す方法である。
参考文献１に記載の方法に従ってブリのブロックマン小体（内分泌膵臓）から精製したブリインスリンをＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＮａＮ３を含む１００ｍＭ ｐＨ７．８）で２５％に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）にインスリン濃度が１０μｇ／ｍｌになるように溶解し、さらにこの溶液を目標のインスリン濃度になるように血漿に添加した。そして、これを実施例２に記載した方法で抽出し、調整した測定用サンプルを用いて、実施例１に記載したインスリン濃度の測定方法により、インスリン濃度を調べた。
その結果、表４に示すように、１００％に近い回収率が得られ、本発明の測定方法によって、アジ科またはタイ科の魚類において、血漿中のインスリンを特異的に測定できることが示された。
[Test Example 4]
<Additive recovery test using a method for measuring insulin concentration in aziridae or Thai fish>
Buri insulin with a known concentration was added to the plasma of the yellowtail, and it was tested whether a measured value was obtained according to the added insulin. This is a method for examining whether or not the measured value of insulin concentration changes depending on substances other than insulin contained in plasma.
Buriinsulin purified from yellowtail Brockman bodies (endocrine pancreas) according to the method described in Reference 1 to 25% with Tris-HCl buffer (150 mM NaCl, 100 mM pH 7.8 containing 0.01% NaN 3 ) It was dissolved in diluted Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) so that the insulin concentration was 10 μg / ml, and this solution was added to the plasma so that the target insulin concentration was achieved. Then, the insulin concentration was examined by the method for measuring insulin concentration described in Example 1 using the measurement sample extracted and adjusted by the method described in Example 2.
As a result, as shown in Table 4, a recovery rate close to 100% was obtained, and it was shown that the insulin in the plasma can be specifically measured in the fishes of the family Dinaceae or Thai family by the measurement method of the present invention. .
［試験例５］
＜給餌によるブリ血漿中のインスリン濃度の変動＞
実施例１および２に記載した方法により、給餌によるブリ血漿中のインスリン濃度の変動を調べた。
８個体ずつブリを収容した１２水槽を、６台ずつ２実験区に分割し、それぞれを給餌群および絶食群として、血漿インスリン濃度を測定した。各ブリは４８時間絶食した後、絶食群は特に処理せず、実験群はニッスイまだいＥＰ４を飽食給餌した。採血を水槽ごとに１―２時間間隔で行い血漿を得た。これを実施例２に記載した方法によって抽出し、調整した測定用サンプルを用い、実施例１に記載したインスリン濃度の測定方法により、給餌によるブリ血漿中のインスリン濃度の変動を調べた。なお、実験中の水温は２２度、使用魚の体重は１００−２００ｇだった。
その結果図４に示したように、血漿インスリン濃度は給餌によって上昇することが知られているが、本発明によってもブリの給餌後の血漿インスリン濃度を測定できることが把握できた。また、絶食時には血漿インスリン濃度は低下するが、本発明は絶食時低濃度のインスリンを測定することも可能であることが示された。
従って、本発明のインスリン濃度の測定方法によって測定されるインスリンン濃度の範囲が、魚類におけるインスリンの生理的変化をとらえるのに十分であることが示された。
[Test Example 5]
<Fluctuation of insulin concentration in yellowtail plasma by feeding>
By the method described in Examples 1 and 2, changes in insulin concentration in yellowtail plasma by feeding were examined.
The 12 water tanks containing 8 yellowtails were divided into 2 experimental groups, 6 units each, and the plasma insulin concentration was measured with each as a feeding group and a fasting group. After each yellowtail was fasted for 48 hours, the fasting group was not treated in particular, and the experimental group was fed with Nissui still EP4. Blood was collected at intervals of 1-2 hours for each water tank to obtain plasma. This was extracted by the method described in Example 2 and the prepared measurement sample was used, and the change in insulin concentration in yellowtail plasma due to feeding was examined by the method for measuring insulin concentration described in Example 1. The water temperature during the experiment was 22 ° C., and the weight of the fish used was 100-200 g.
As a result, as shown in FIG. 4, it is known that the plasma insulin concentration is increased by feeding, but it was also understood by the present invention that the plasma insulin concentration after feeding yellowtail can be measured. Moreover, although plasma insulin concentration fell at the time of fasting, it was shown that this invention can also measure the insulin of low concentration at the time of fasting.
Therefore, it was shown that the range of insulin concentration measured by the method for measuring insulin concentration of the present invention is sufficient to capture physiological changes in insulin in fish.
［試験例６］
＜ブリ血漿の塩酸―エタノール処理の有無によるインスリン濃度への影響＞
実施例２におけるブリ血漿の塩酸―エタノール処理（抽出）の有無による、測定されるインスリン濃度の違いを調べた。
８個体のブリを２４時間絶食した後採血を行い、血漿を得て、これをサンプルとした。このサンプルを実施例２に記載した方法で抽出したものと、抽出しない場合のものにわけて、実施例１に記載したインスリン濃度の測定方法により、インスリン濃度を調べた。
その結果、図５に示したように、血漿を―抽出したものは、インスリン濃度が１．８−３．４ｎｇ／ｍｌと狭い範囲（実線の矢印の範囲）だったが、抽出しないものは、検出限界以下−７．３ｎｇ／ｍｌに分散した（点線の矢印の範囲）。
[Test Example 6]
<Effect of the presence or absence of hydrochloric acid-ethanol treatment on yellow blood plasma>
The difference in insulin concentration measured according to the presence or absence of hydrochloric acid-ethanol treatment (extraction) of yellowtail plasma in Example 2 was examined.
Eight yellowtails were fasted for 24 hours and then blood was collected to obtain plasma, which was used as a sample. This sample was extracted by the method described in Example 2 and not extracted, and the insulin concentration was examined by the method for measuring insulin concentration described in Example 1.
As a result, as shown in FIG. 5, the plasma-extracted sample had an insulin concentration of 1.8-3.4 ng / ml and a narrow range (the range of solid arrows), but the sample that was not extracted was Dispersed to −7.3 ng / ml below the detection limit (range of dotted arrow).
図５で示されたように、魚類の血漿インスリン濃度は絶食すると数ｎｇ／ｍｌに低下する。そして、本発明で抽出に使用する塩酸−エタノールはタンパク質性の夾雑物を変性・沈殿させる一方、インスリンのようなペプチドには影響しない。つまり、哺乳類の血漿で存在が確認されているインスリン分解酵素やタンパク質性夾雑物の変性・除去には有効と考えられる。抽出しない場合での測定値が広い理由は、分解酵素や夾雑物の影響が出ているものと考えられる。したがって、この結果より、実施例２に示したような本発明の抽出方法が測定値の正確性を高める上で有効であることが確認された。
また、表２と３で示したアッセイ内およびアッセイ間での測定値の正確性と添加回収試験の結果は、抽出を行った血漿の測定値であることから、本発明の信頼性が高く、血漿等の血液由来のサンプルについて塩酸―エタノール処理（抽出）をすることが有効であることが示された。ちなみに、マツカワのインスリン測定法でマツカワ血漿を測定する場合には塩酸−エタノール処理を実施しなくとも、高い正確性が確認されていることから、魚種ごとに血漿の性質が異なることが考えられた。
As shown in FIG. 5, the plasma plasma insulin concentration drops to several ng / ml upon fasting. Hydrochloric acid-ethanol used for extraction in the present invention denatures and precipitates proteinaceous impurities, but does not affect peptides such as insulin. In other words, it is considered effective for denaturation / removal of insulin-degrading enzymes and proteinaceous contaminants that have been confirmed to exist in mammalian plasma. The reason why the measured values are wide when not extracted is considered to be due to the influence of degrading enzymes and impurities. Therefore, from this result, it was confirmed that the extraction method of the present invention as shown in Example 2 is effective in improving the accuracy of the measured value.
In addition, since the accuracy of the measured values and the results of the addition recovery test within and between the assays shown in Tables 2 and 3 are measured values of the extracted plasma, the reliability of the present invention is high. It was shown that treatment with hydrochloric acid-ethanol (extraction) is effective for samples derived from blood such as plasma. By the way, when measuring Matsukawa plasma by Matsukawa's insulin measurement method, high accuracy has been confirmed without performing hydrochloric acid-ethanol treatment, so it is considered that the nature of plasma differs depending on the fish species. It was.
［比較例］
＜マツカワのインスリン濃度の測定方法を用いたブリのインスリン濃度の測定＞
マツカワのインスリン濃度の測定方法（非特許文献２）により、参考文献１に記載の方法に従ってブリまたはマツカワのブロックマン小体（内分泌膵臓）から精製した濃度既知のブリまたはマツカワのインスリンを用いてインスリン濃度を測定した。ブリのインスリンは、血液由来の不純物を含んでいないため、この試験により測定に使用したマツカワのインスリンーＩＩの抗血清の結合特性が反映されると考えられた。
マツカワのインスリン濃度の測定方法として、マツカワから精製したインスリンーＩＩをモルモットに注射して抗血清を得た。この抗血清と、標識インスリンとしてＬＣ―ビオチン（ピアス社製）をＢ鎖のＮ末端のみに結合させた化学合成マツカワインスリンーＩと、ユーロピウムーストレプトアビジンを用いてユーロピウムを検出する時間分解蛍光免疫測定法に基づいてインスリン濃度を測定した。
その結果、表５に示したように、ブリのインスリンではマツカワのインスリンと比較して蛍光強度が上昇したことから、実際の濃度よりも低い濃度として測定され、実際の濃度としての反応を示さなかった。この結果より、ブリのインスリンはマツカワのインスリンに比較して抗マツカワインスリン抗体に対する結合が２−４倍程度弱いことを示され、マツカワのインスリン濃度の測定方法では、ブリのインスリン濃度を正確に測定できないことが確認された。
[Comparative example]
<Measurement of yellowtail insulin concentration using Matsukawa's method for measuring insulin concentration>
According to the method for measuring the concentration of insulin in Matsukawa (Non-patent Document 2), insulin using a known yellowtail or Matsukawa insulin purified from yellowtail or a blockman body (endocrine pancreas) of Matsukawa according to the method described in Reference 1. Concentration was measured. This test was thought to reflect the binding properties of Matsukawa's insulin-II antiserum used in the measurement, as yellowtail insulin does not contain blood-derived impurities.
As a method for measuring Matsukawa's insulin concentration, antiserum was obtained by injecting insulin-II purified from Matsukawa into guinea pigs. Time-resolved fluorescent immunity using this antiserum and chemically synthesized Matsukawa insulin-I, in which LC-biotin (manufactured by Pierce) as labeled insulin is bound only to the N-terminus of the B chain, and europium streptavidin is used to detect europium. Insulin concentration was measured based on the measurement method.
As a result, as shown in Table 5, the fluorescence intensity of the yellowtail insulin was increased compared to that of Matsukawa insulin, so that it was measured as a concentration lower than the actual concentration and did not show a response as the actual concentration. It was. This result shows that yellowtail insulin has about 2-4 times weaker binding to anti-Matsukawa insulin antibody than Matsukawa insulin. The method for measuring Matsukawa's insulin concentration accurately measures yellowtail insulin concentration. It was confirmed that it was not possible.
本発明のアジ科またはタイ科の魚類におけるインスリン濃度の測定方法によって、容易かつ安全にインスリン濃度を測定することで、アジ科またはタイ科の魚類における成長に有効な環境を検討することが可能となり、効率的な育成法の開発に繋がる。 By measuring the insulin concentration easily and safely by the method for measuring insulin concentration in the fishes of the genus Dinaceae or Thai family of the present invention, it becomes possible to examine the environment effective for growth in the fishes of Dinosaurae or Thai species. , Leading to the development of efficient breeding methods.
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| CN107064330B (en) * | 2010-12-28 | 2022-02-25 | 探索诊断投资公司 | Quantitation of insulin by mass spectrometry |
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