JP2010029142A - METHOD FOR DISCRIMINATING EXPRESSED mRNA - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for discriminating expressed mRNA, enabling different tag discrimination for each specimen in an mRNA expression analysis by monomolecular measurement without influencing on the hybridizing efficiency of a target mRNA when the target mRNA to perform the expression analysis is derived from two or more specimens. <P>SOLUTION: The method for discriminating expressed mRNA includes a step of hybridizing two or more double-stranded DNA complexes having at least one restriction enzyme recognition sequence formed of the first oligonucleotide 101 and the second oligonucleotide 102 having an oligo-dT sequence to a target mRNA of each specimen by the oligo-dT sequence, wherein the restriction enzyme recognition sequences are different from each other in a methylation modification manner. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、単分子計測によるmRNA発現解析において、発現解析を行う標的mRNAが２種以上の試料由来である場合に、各標的mRNAがどの試料に由来するかを識別するための発現mRNA識別方法に関する。   In the mRNA expression analysis by single molecule measurement, the present invention is an expression mRNA identification method for identifying which sample each target mRNA is derived from when two or more types of target mRNAs for expression analysis are derived. About.

生物は、発生分化の制御や種々の環境に対する応答のために、そのゲノム上の遺伝子群の発現を制御している。このような遺伝子群の発現状態を網羅的に解析することは、生物応答の機能解明に向けて非常に有用な情報を提供する。さらに、これらの情報はそれぞれの機能の解明だけでなく、疾病関連遺伝子の同定や診断マーカー遺伝子の同定などにも極めて有用である。そのため、これまでに数多くの網羅的遺伝子発現解析技術が開発されてきた。現在、網羅的遺伝子発現解析として最もよく用いられているのは、DNAマイクロアレイを用いた解析手法である。   An organism controls the expression of genes on its genome in order to control development and differentiation and to respond to various environments. Comprehensive analysis of the expression state of such gene groups provides very useful information for elucidating the function of biological responses. Furthermore, these pieces of information are extremely useful not only for elucidating their functions but also for identifying disease-related genes and diagnostic marker genes. Therefore, many comprehensive gene expression analysis techniques have been developed so far. At present, analysis methods using DNA microarrays are most often used for comprehensive gene expression analysis.

DNAマイクロアレイの測定原理は、異なる条件の２群から調製した発現mRNAに相補的な二色蛍光標識化プローブ核酸を合成し、ガラスなどの固相基板上に高密度に固定されたターゲット核酸に対してハイブリダイズさせ、各々のハイブリダイズしたプローブ核酸からの二色の蛍光シグナルを検出し、これより試料に含まれる発現mRNA比を算出するものである（特許文献１，２）。一方、ヒトゲノム解読の終了後、更なる高スループット、低コストなシーケンス解析を実現するために、キャピラリー電気泳動シーケンサに代わる次世代大規模DNAシーケンサの開発が、最近になって飛躍的に進んでいる。2005年に生物発光方式を用いた次世代DNAシーケンサが、次いで2006年に蛍光多分子方式の次世代DNAシーケンサが開発されている。さらには、ライゲーションを利用した製品も開発されている。増幅したDNAを鋳型に用いて配列決定を行う上記シーケンサに加え、近年では、鋳型として1DNA分子を用いる単分子DNAシーケンサが開発されており、鋳型DNAの増幅工程を必要としないことから、より高スループット・低コスト化に向けたシステムとして期待されている。   The measurement principle of DNA microarray is to synthesize two-color fluorescently labeled probe nucleic acid complementary to expressed mRNA prepared from two groups under different conditions, and target nucleic acid immobilized on a solid substrate such as glass at high density The two-color fluorescence signals from each hybridized probe nucleic acid are detected, and the ratio of the expressed mRNA contained in the sample is calculated from this (Patent Documents 1 and 2). On the other hand, the development of the next generation large-scale DNA sequencer that replaces the capillary electrophoresis sequencer has been progressing dramatically in order to realize further high-throughput and low-cost sequence analysis after the completion of human genome decoding. . In 2005, a next-generation DNA sequencer using a bioluminescence method was developed, and in 2006, a next-generation DNA sequencer using a fluorescent multi-molecule method was developed. Furthermore, products using ligation have been developed. In addition to the above sequencer, which uses amplified DNA as a template for sequencing, in recent years, single-molecule DNA sequencers that use one DNA molecule as a template have been developed and do not require a template DNA amplification step. It is expected as a system for reducing throughput and cost.

このような単分子DNA計測を行うDNAシーケンサは、DNA塩基配列決定だけでなく、一度に解析できるスループットの高さから、１から数個の細胞であれば細胞内に発現している全てのmRNAの塩基配列解析を行うことができる。これにより、配列解析された各遺伝子のmRNAの出現頻度を算出することで、この出現頻度から細胞内における各遺伝子の発現頻度を算出することが可能となり、網羅的なmRNA発現解析を実施することができる。   A DNA sequencer that performs such single-molecule DNA measurement is not only for determining DNA base sequences, but also for all mRNAs expressed in cells if it is one to several cells because of the high throughput that can be analyzed at once. Can be analyzed. By calculating the appearance frequency of mRNA of each gene subjected to sequence analysis, it is possible to calculate the expression frequency of each gene in the cell from this appearance frequency, and to perform comprehensive mRNA expression analysis Can do.

上述の単分子DNA計測によるmRNA発現解析では、塩基配列解析反応の再現性から、発現を比較する２種以上の試料由来のmRNA群を同一の反応において解析することが望ましい。しかしながら、その場合にはそれぞれどの試料に由来するmRNAであるかを識別することが必要となる。   In the above-described mRNA expression analysis by single molecule DNA measurement, it is desirable to analyze mRNA groups derived from two or more types of samples to be compared in the same reaction from the reproducibility of the base sequence analysis reaction. However, in that case, it is necessary to identify from which sample each mRNA is derived.

PCR増幅産物を鋳型DNAとして用いる多分子DNA計測では、増幅に用いるPCRプライマーにタグとなる任意の配列を導入し、異なる試料ごとに配列が異なるタグ配列を有するPCR増幅産物を調製し塩基配列解析時にそのタグ部分の配列決定をも行うことで、どの試料に由来するかを同定している。一方、単分子DNA計測によるmRNA発現解析mRNA発現解析の場合には、配列解析の際に用いるオリゴdTプライマーに個別のタグ配列を導入する必要がある。しかしながら、異なるタグ配列を有するオリゴdT配列を用いた場合には、各mRNAのpolyA配列が同一のpolyA配列ではなく、そのため、オリゴdT配列とその近傍の配列がハイブリダイズの効率に影響を及ぼすこととなる。その結果、各試料を識別するため試料毎に異なるタグ配列を有するオリゴdTプライマーを使用した場合に、各タグ配列を有するオリゴdTプライマーのmRNAへのハイブリダイズの効率が各試料間で異なり、そのため、配列解析結果から得られたmRNA発現頻度が実際の各試料毎のmRNAの発現頻度を反映しなくなり、誤ったmRNA発現頻度の結果を得るという問題があった。   In multi-molecule DNA measurement using PCR amplification products as template DNA, arbitrary sequences that become tags are introduced into PCR primers used for amplification, and PCR amplification products with different tag sequences are prepared for different samples, and nucleotide sequence analysis Sometimes the tag part is also sequenced to identify which sample it is from. On the other hand, in the case of mRNA expression analysis by single molecule DNA measurement, it is necessary to introduce individual tag sequences into oligo dT primers used in sequence analysis. However, when oligo dT sequences with different tag sequences are used, the polyA sequence of each mRNA is not the same polyA sequence, so that the oligo dT sequence and the neighboring sequences affect the efficiency of hybridization. It becomes. As a result, when using oligo dT primers having different tag sequences for each sample to identify each sample, the efficiency of hybridization of oligo dT primers having each tag sequence to mRNA differs among the samples. The mRNA expression frequency obtained from the sequence analysis result does not reflect the actual mRNA expression frequency for each sample, and there is a problem that an incorrect mRNA expression frequency result is obtained.

Proc Natl Acad Sci USA(1994)91:5022-5026Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 5022-5026 Science(1994)270:467-470Science (1994) 270: 467-470

本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、単分子DNA計測によるmRNA発現解析の際に、異なる試料の標的mRNAに対して差異なくハイブリダイズするオリゴdTプライマー配列を有するタグ配列用いることで、検出発現頻度に影響を与えることなく、かつ、その試料毎に異なるタグ識別が可能な発現mRNA識別方法を提供することを目的としている。   The present invention has been made in view of the above problems, and uses a tag sequence having an oligo dT primer sequence that hybridizes without difference to target mRNAs of different samples in mRNA expression analysis by single molecule DNA measurement. Thus, an object of the present invention is to provide a method for identifying an expressed mRNA that does not affect the detection expression frequency and enables tag identification that differs from sample to sample.

本発明は、単分子計測によるmRNA発現解析の際に、発現解析を行う標的mRNAが２種以上の試料由来である場合に、各標的mRNAがどの試料に由来するかを識別するための発現mRNA識別方法において、検出発現頻度に影響を与えることなく、異なる試料の標的mRNAに対して差異なくハイブリダイズするオリゴdTプライマー配列とタグ配列を有した二本鎖DNA複合体として、塩基配列が同じであるが異なるメチル化修飾を受けた制限酵素認識配列をタグ配列に包含した二本鎖DNA複合体を用い、さらに、メチル化感受性およびメチル化非感受性制限酵素処理行うことにより、上記課題を解決するものである。   In the present invention, in the case of mRNA expression analysis by single molecule measurement, when the target mRNA to be analyzed is derived from two or more samples, the expression mRNA for identifying which sample each target mRNA is derived from In the identification method, the base sequence is the same as a double-stranded DNA complex having an oligo dT primer sequence and a tag sequence that hybridize without difference to the target mRNA of different samples without affecting the detection expression frequency. The above problem is solved by using a double-stranded DNA complex that includes a restriction enzyme recognition sequence that has been modified with a different methylation but included in the tag sequence, and is further treated with a methylation-sensitive and methylation-insensitive restriction enzyme. Is.

即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別する方法であって、
(i)オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体を、オリゴdT配列により標的mRNAに試料ごとにハイブリダイズさせる工程と、
(ii)ハイブリダイズしたmRNAと二本鎖DNA複合体を固相担体に固定化させる工程と、
(iii)固定化されたmRNAと二本鎖DNA複合体における二本鎖DNA複合体部位に含まれる制限酵素認識配列のうち第１の制限酵素によって切断可能な配列を第１の制限酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程と、
(iv)5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程と、
(v)取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程と、
(vi)第１の制限酵素により切断されなかったメチル化修飾様式が異なる制限酵素認識配列のうち第２の制限酵素によって切断可能な配列を第２の酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程と、
(vii)第２の制限酵素により形成された5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程と、
(viii)取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程と
を有する発現mRNA識別方法。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for identifying target mRNAs derived from two or more samples in expression analysis by single molecule measurement,
(i) two or more double-stranded DNA complexes formed from a first oligonucleotide and a second oligonucleotide having an oligo dT sequence and having at least one restriction enzyme recognition sequence, wherein the restriction enzyme recognition sequence is methyl Hybridizing the double stranded DNA complexes that differ from each other in a modified modification mode to the target mRNA by oligo dT sequences for each sample;
(ii) a step of immobilizing a hybridized mRNA and a double-stranded DNA complex on a solid phase carrier;
(iii) The restriction enzyme recognition sequence contained in the double-stranded DNA complex site in the immobilized mRNA and double-stranded DNA complex is cleaved by the first restriction enzyme. Forming a 5 ′ protruding end;
(iv) a step of base extension of the 3 ′ end by incorporating a deoxyribonucleotide substrate fluorescently labeled with DNA polymerase into the 5 ′ protruding end site;
(v) detecting the fluorescence of the incorporated fluorescently labeled deoxyribonucleotide substrate and identifying its position on the solid support;
(vi) A restriction enzyme recognition sequence which is not cleaved by the first restriction enzyme but has a different mode of methylation modification, is cleaved by the second restriction enzyme to form a 5 ′ protruding end. Process,
(vii) base-extending the 3 ′ end by incorporating a deoxyribonucleotide substrate fluorescently labeled with DNA polymerase into the 5 ′ protruding end site formed by the second restriction enzyme;
(viii) a method for identifying an expressed mRNA comprising the steps of detecting the fluorescence of the incorporated fluorescently labeled deoxyribonucleotide substrate and identifying its position on the solid phase carrier.

（２）第１オリゴヌクレオチドが5'上流領域に制限酵素認識配列を、3'下流領域にオリゴdT配列を有し、第２オリゴヌクレオチドが第１オリゴヌクレオチドの5'上流領域に存在する制限酵素認識配列の相補的配列を有し、第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドが二本鎖DNA複合体を形成する、（１）に記載の発現mRNA識別方法。 (2) A restriction enzyme in which the first oligonucleotide has a restriction enzyme recognition sequence in the 5 ′ upstream region, an oligo dT sequence in the 3 ′ downstream region, and the second oligonucleotide is present in the 5 ′ upstream region of the first oligonucleotide. The method for identifying an expressed mRNA according to (1), wherein the method has a sequence complementary to the recognition sequence, and the first oligonucleotide and the second oligonucleotide form a double-stranded DNA complex.

（３）ハイブリダイズしたmRNAと二本鎖DNA複合体を固相担体に固定化させる工程において、第２オリゴヌクレオチドが3'末端において固相担体に固定化される、（１）に記載の発現mRNA識別方法。 (3) The expression according to (1), wherein in the step of immobilizing the hybridized mRNA and the double-stranded DNA complex to the solid phase carrier, the second oligonucleotide is immobilized to the solid phase carrier at the 3 ′ end. mRNA identification method.

（４）第１および第２のオリゴヌクレオチドにより形成される二本鎖DNA複合体が有する制限酵素認識配列が、第１および第２の制限酵素に認識され、かつ第１の制限酵素がメチル化感受性であり、第２の制限酵素がメチル化非感受性である、（１）に記載の発現mRNA識別方法。 (4) The restriction enzyme recognition sequence of the double-stranded DNA complex formed by the first and second oligonucleotides is recognized by the first and second restriction enzymes, and the first restriction enzyme is methylated The method for identifying an expressed mRNA according to (1), wherein the method is sensitive and the second restriction enzyme is insensitive to methylation.

（５）メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せが、Mbo IとSau3A Iの組合せ、Hpa IIとMsp Iの組合せ、またはAva IIとSin Iの組合せである（４）に記載の発現mRNA識別方法。 (5) The combination of a methylation-sensitive restriction enzyme and a methylation-insensitive restriction enzyme is a combination of Mbo I and Sau3A I, a combination of Hpa II and Msp I, or a combination of Ava II and Sin I Of mRNA expression

（６）メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがMbo IとSau3A Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GATC配列またはメチル化されたGmATC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、（５）に記載の発現mRNA識別方法。 (6) When the combination of a methylation sensitive restriction enzyme and a methylation insensitive restriction enzyme is Mbo I and Sau3A I, the double-stranded DNA complex is used as a restriction enzyme recognition sequence as a GATC sequence or a methylated GmATC. The method for identifying an expressed mRNA according to (5), wherein the sequence has only one position in the double-stranded DNA complex sequence.

（７）メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがHpa IIとMsp Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、CCGG配列またはメチル化されたCmCGG配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、（５）に記載の発現mRNA識別方法。 (7) When the combination of a methylation-sensitive restriction enzyme and a methylation-insensitive restriction enzyme is Hpa II and Msp I, the double-stranded DNA complex is converted into a CCGG sequence or a methylated CmCGG as a restriction enzyme recognition sequence. The method for identifying an expressed mRNA according to (5), wherein the sequence has only one position in the double-stranded DNA complex sequence.

（８）メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがAva IIとSin Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GG(A/T)CC配列またはメチル化されたGG(A/T)mCC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、（５）に記載の発現mRNA識別方法。 (8) When the combination of a methylation sensitive restriction enzyme and a methylation insensitive restriction enzyme is Ava II and Sin I, a double-stranded DNA complex is used as a restriction enzyme recognition sequence as a GG (A / T) CC sequence. Or the expression mRNA identification method as described in (5) which has a methylated GG (A / T) mCC sequence only in one place in a double-stranded DNA complex sequence.

（９）二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列を２種以上有し、各配列に対するメチル化感受性制限酵素およびメチル化非感受性制限酵素をそれぞれ第１および第２の制限酵素として用いて(iii)〜(viii)の工程を繰り返す、（１）に記載の発現mRNA識別方法。 (9) The double-stranded DNA complex has two or more restriction enzyme recognition sequences, and a methylation-sensitive restriction enzyme and a methylation-insensitive restriction enzyme for each sequence are used as the first and second restriction enzymes, respectively. The method for identifying an expressed mRNA according to (1), wherein the steps (iii) to (viii) are repeated.

（１０）非メチル化配列またはメチル化配列を有する第１のオリゴヌクレオチドの5'末端をそれぞれ異なる蛍光色素で標識し、制限酵素処理前にそれぞれの蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程をさらに有する、（１）に記載の発現mRNA識別方法。 (10) The 5 ′ end of the first oligonucleotide having an unmethylated sequence or a methylated sequence is labeled with a different fluorescent dye, and the respective fluorescence is detected before the restriction enzyme treatment, and the position on the solid phase carrier is determined. The method for identifying an expressed mRNA according to (1), further comprising a step of identifying.

（１１）単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別するためのキットであって、オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、該制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体と、該制限酵素認識配列を認識するメチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の少なくとも１種の組合せとを含む前記キット。 (11) A kit for discriminating target mRNAs derived from two or more kinds of samples in expression analysis by single molecule measurement, which is formed from a first oligonucleotide and a second oligonucleotide having an oligo dT sequence and is at least one Two or more types of double-stranded DNA complexes having restriction enzyme recognition sequences, wherein the restriction enzyme recognition sequences are different from each other in a methylation modification mode, and the restriction enzyme recognition sequences are recognized. The kit comprising a methylation sensitive restriction enzyme and a combination of at least one methylation insensitive restriction enzyme.

（１２）メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せが、Mbo IとSau3A Iの組合せ、Hpa IIとMsp Iの組合せ、およびAva IIとSin Iの組合せからなる群から選択される、（１１）に記載のキット。 (12) The combination of a methylation sensitive restriction enzyme and a methylation insensitive restriction enzyme is selected from the group consisting of a combination of Mbo I and Sau3A I, a combination of Hpa II and Msp I, and a combination of Ava II and Sin I The kit according to (11).

本発明によれば、異なる試料に由来する標的mRNAに対して差異なくハイブリダイズするオリゴdTプライマー配列とタグ配列を有した二本鎖DNA複合体として、塩基配列が同じであるが異なるメチル化修飾を受けた制限酵素認識配列をタグ配列として含む二本鎖DNA複合体を用い、メチル化感受性およびメチル化非感受性制限酵素処理を行うことにより、単分子計測によるmRNA発現解析の際に、検出発現頻度に影響を与えることなく、発現mRNAの由来を識別することが可能となる。   According to the present invention, as a double-stranded DNA complex having a tag sequence and an oligo dT primer sequence that hybridizes without difference to target mRNAs derived from different samples, the methylation modification is the same but has the same base sequence. Using a double-stranded DNA complex containing a restriction enzyme recognition sequence that has undergone restriction as a tag sequence, methylation-sensitive and methylation-insensitive restriction enzyme treatment is performed, and mRNA is analyzed during single-molecule measurement. The origin of the expressed mRNA can be identified without affecting the frequency.

本発明は、単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別する方法に関する。   The present invention relates to a method for discriminating target mRNAs derived from two or more samples in expression analysis by single molecule measurement.

第１の工程は、オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体を、オリゴdT配列により標的mRNAに試料ごとにハイブリダイズさせる工程である。   The first step comprises two or more double-stranded DNA complexes formed from a first oligonucleotide and a second oligonucleotide having an oligo dT sequence and having at least one restriction enzyme recognition sequence, In this step, the double-stranded DNA complexes having different sequences in the methylation modification mode are hybridized for each sample to the target mRNA by the oligo dT sequence.

二本鎖DNA複合体は、オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドから形成され、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、通常、少なくとも制限酵素認識配列部位において相補的であり、互いにハイブリダイズする。二本鎖DNA複合体は、発現解析する試料毎に異なるものを用いる。従って、解析する試料の数だけ異なる二本鎖DNA複合体を用いる。そして、複数の異なる二本鎖DNA複合体は、互いに塩基配列は同じであり、制限酵素認識配列におけるメチル化修飾様式においてのみ異なる。例えば、２種の試料由来のmRNAに対しそれぞれ１個の制限酵素認識配列を含む２種の二本鎖DNA複合体を用いる場合、これら二本鎖DNA複合体における制限酵素認識配列は、塩基配列は同じであるが、一方はメチル化修飾を有し他方はメチル化修飾を有しないものとなる。二本鎖DNA複合体が２種以上の制限酵素認識配列を含む場合でもその塩基配列は互いに同じものとなるが、少なくとも１種の制限酵素認識配列においてメチル化修飾の有無が互いに異なれば、二本鎖DNA複合体のメチル化修飾様式は互いに異なるものとされる。第１工程では、解析する試料の数だけの異なる二本鎖DNA複合体を、オリゴdT配列を介して、試料ごとに標的mRNAにハイブリダイズさせる。   The double-stranded DNA complex is formed from a first oligonucleotide and a second oligonucleotide having an oligo dT sequence, and the first and second oligonucleotides are usually complementary at least at the restriction enzyme recognition sequence site, Hybridize to each other. The double-stranded DNA complex is different for each sample whose expression is analyzed. Therefore, double-stranded DNA complexes that differ by the number of samples to be analyzed are used. A plurality of different double-stranded DNA complexes have the same base sequence, and differ only in the methylation modification mode in the restriction enzyme recognition sequence. For example, when two types of double-stranded DNA complexes each containing one restriction enzyme recognition sequence are used for mRNA derived from two types of samples, the restriction enzyme recognition sequences in these double-stranded DNA complexes are base sequences. Are the same, but one has a methylation modification and the other has no methylation modification. Even when the double-stranded DNA complex contains two or more types of restriction enzyme recognition sequences, the base sequences thereof are the same, but if at least one restriction enzyme recognition sequence has different methylation modifications, The methylation modification modes of the double-stranded DNA complex are different from each other. In the first step, as many different double-stranded DNA complexes as the number of samples to be analyzed are hybridized to target mRNA for each sample via an oligo dT sequence.

第１および第２のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さに特に限定はないが、オリゴdT配列は２０〜３０塩基が好ましく、また、二本鎖DNA部分の長さは導入する制限酵素認識配列の数にもよるが、ハイブリダイズの特異性を考慮し２０〜５０塩基が好ましい。   The length of the base sequence of the first and second oligonucleotides is not particularly limited, but the oligo dT sequence is preferably 20 to 30 bases, and the length of the double-stranded DNA portion is the restriction enzyme recognition sequence to be introduced. Although depending on the number, 20 to 50 bases are preferable in consideration of the specificity of hybridization.

以後、例示として、２種の試料由来のmRNA解析の場合について説明する。
本発明の発現mRNA識別方法において用いる、制限酵素認識配列を有する二本鎖DNA複合体を形成する第１および第２のオリゴヌクレオチドの模式図を図１に示す。 Hereinafter, as an example, the case of mRNA analysis from two types of samples will be described.
FIG. 1 shows a schematic diagram of first and second oligonucleotides forming a double-stranded DNA complex having a restriction enzyme recognition sequence used in the method for identifying an expressed mRNA of the present invention.

二本鎖DNA複合体は、第１のオリゴヌクレオチド１と第２のオリゴヌクレオチド３、または第１のオリゴヌクレオチド２と第２のオリゴヌクレオチド４から形成されている。第１のオリゴヌクレオチド１、２は、その3'末端側にmRNAのpolyAとハイブリダイズするオリゴdT配列５、６を有している。また、第１のオリゴヌクレオチド１、２は、その5'末端側に第２のオリゴヌクレオチド３、４と図１に示すように二本鎖DNA複合体を形成する相補的配列を保持しており、その二本鎖DNA部分には制限酵素認識配列７、８が包含されている。この制限酵素認識配列７、８は、DNAメチル化修飾の有無において異なっており、図１では、制限酵素認識配列７はメチル化修飾を受けておらず、制限酵素認識配列８がメチル化修飾を受けている場合を模式的に示している。   The double-stranded DNA complex is formed from the first oligonucleotide 1 and the second oligonucleotide 3 or the first oligonucleotide 2 and the second oligonucleotide 4. The first oligonucleotides 1 and 2 have oligo dT sequences 5 and 6 that hybridize with polyA of mRNA on the 3 ′ end side thereof. In addition, the first oligonucleotides 1 and 2 have a complementary sequence forming a double-stranded DNA complex as shown in FIG. 1 with the second oligonucleotides 3 and 4 on the 5 ′ end side. In the double-stranded DNA portion, restriction enzyme recognition sequences 7 and 8 are included. The restriction enzyme recognition sequences 7 and 8 are different depending on the presence or absence of DNA methylation modification. In FIG. 1, the restriction enzyme recognition sequence 7 is not subjected to methylation modification, and the restriction enzyme recognition sequence 8 is subjected to methylation modification. The case where it receives is shown typically.

次に、第１のオリゴヌクレオチド１と第２のオリゴヌクレオチド３からなる二本鎖DNA複合体と、第１のオリゴヌクレオチド２と第２のオリゴヌクレオチド４からなる二本鎖DNA複合体のオリゴdT配列５または６に対して、それぞれ異なる試料由来のmRNA101または102をハイブリダイズさせ、図２に示すような二本鎖DNA複合体と標的mRNAとの複合体を形成させる。   Next, a double-stranded DNA complex composed of the first oligonucleotide 1 and the second oligonucleotide 3 and an oligo dT of a double-stranded DNA complex composed of the first oligonucleotide 2 and the second oligonucleotide 4 MRNA 101 or 102 derived from a different sample is hybridized to sequence 5 or 6, respectively, to form a complex of double-stranded DNA complex and target mRNA as shown in FIG.

第２の工程は、ハイブリダイズしたmRNAと二本鎖DNA複合体を固相担体に固定化させる工程である。即ち、第１の工程で得られたmRNAと二本鎖DNA複合体からなる複合体を固相担体に固定化させる工程である。固相化以降の工程を図３および図４を用いて説明する。   The second step is a step of immobilizing the hybridized mRNA and double-stranded DNA complex on a solid phase carrier. That is, this is a step of immobilizing a complex comprising the mRNA obtained in the first step and a double-stranded DNA complex on a solid phase carrier. The steps after the solid phase will be described with reference to FIGS.

mRNAと二本鎖DNA複合体からなる複合体の固相担体201への固定は、例えば、図３(a)に示すように第２のオリゴヌクレオチド３、４の3'末端を用いる。3'末端と固相担体201の結合は、用いる固相担体の材質によって適切な方法を選択すればよい。一例として、第２のオリゴヌクレオチド３、４の3'末端にS-H修飾を行い、金被膜を有する固相担体表面にチオール結合により固定化する方法がある。   The complex consisting of mRNA and double-stranded DNA complex is fixed to the solid phase carrier 201 using, for example, the 3 ′ ends of the second oligonucleotides 3 and 4 as shown in FIG. An appropriate method may be selected for binding between the 3 ′ end and the solid phase carrier 201 depending on the material of the solid phase carrier to be used. As an example, there is a method of performing S—H modification on the 3 ′ end of the second oligonucleotides 3 and 4 and immobilizing it on the surface of a solid phase carrier having a gold coating by a thiol bond.

第３の工程は、固定化されたmRNAと二本鎖DNA複合体における二本鎖DNA複合体部位に含まれる制限酵素認識配列のうち第１の制限酵素によって切断可能な配列を第１の制限酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程である。   In the third step, a sequence that can be cleaved by the first restriction enzyme among the restriction enzyme recognition sequences contained in the double-stranded DNA complex site in the immobilized mRNA and double-stranded DNA complex is defined as the first restriction. This is a step of cleaving with an enzyme to form a 5 ′ protruding end.

図３(a)では、第１の制限酵素として、メチル化感受性制限酵素であるMbo Iを用いる場合を示している。図３(a)の上側に位置するmRNA・二本鎖DNA複合体は、制限酵素認識配列であるGATC配列７がメチル化修飾を受けておらず、下側の複合体は制限酵素認識配列であるGATC配列８がメチル化修飾を受けている場合を示している。両者をメチル化感受性である制限酵素Mbo Iで処理することにより、図３(b)に示すようにメチル化修飾を受けていないMbo I認識配列７のみが切断される。二本鎖DNA複合体が制限酵素認識配列を２種以上有する場合は、用いたメチル化感受性制限酵素により認識されるメチル化修飾を受けていない制限酵素認識配列のみが切断される。   FIG. 3A shows a case where Mbo I, which is a methylation sensitive restriction enzyme, is used as the first restriction enzyme. In FIG. 3 (a), the mRNA / double-stranded DNA complex located on the upper side has a restriction enzyme recognition sequence GATC sequence 7 that has not undergone methylation modification, and the lower complex is a restriction enzyme recognition sequence. The case where a certain GATC sequence 8 has undergone methylation modification is shown. By treating both with a restriction enzyme Mbo I that is sensitive to methylation, only the Mbo I recognition sequence 7 that has not undergone methylation modification is cleaved as shown in FIG. 3 (b). When the double-stranded DNA complex has two or more restriction enzyme recognition sequences, only the restriction enzyme recognition sequence not subjected to methylation modification recognized by the methylation sensitive restriction enzyme used is cleaved.

第４の工程は、第３の工程により形成された5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程である。取り込ませるデオキシリボヌクレオチド基質は、すべて蛍光標識されていなくてもよく、いずれか１つが蛍光標識されていればよい。図３(c)では、(b)での制限酵素処理後に基板上の酵素および切断断片を洗浄したのち、DNAポリメラーゼと蛍光標識された基質としてdCTPと標識されていない基質dGTP、dATP、dTTPを新たに基板上に導入し塩基伸長反応を行う場合を示している。蛍光標識されている基質としては、dCTP以外にdGTP、dATP、dTTPのうちのどれか１種が蛍光標識されたものを用いてもよい。   The fourth step is a step of extending the 3 ′ end by incorporating a deoxyribonucleotide substrate fluorescently labeled with DNA polymerase into the 5 ′ protruding end site formed in the third step. The deoxyribonucleotide substrate to be incorporated may not be all fluorescently labeled, and any one of them may be fluorescently labeled. In FIG. 3 (c), after the restriction enzyme treatment in (b), the enzyme and the cleaved fragment on the substrate are washed, and then DNA polymerase and the fluorescently labeled substrates dCTP and unlabeled substrates dGTP, dATP, and dTTP are used. This shows a case where a base elongation reaction is newly performed on a substrate. As the substrate that is fluorescently labeled, a substrate in which any one of dGTP, dATP, and dTTP is fluorescently labeled in addition to dCTP may be used.

第５の工程は、第４の工程で取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程である。図３(c)において、左側の図示しない蛍光検出装置により、取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出する。このとき、左側の図示しない蛍光検出装置により、蛍光検出位置301を同定する。   The fifth step is a step of detecting the fluorescence of the fluorescence-labeled deoxyribonucleotide substrate incorporated in the fourth step and identifying its position on the solid phase carrier. In FIG. 3 (c), the fluorescence of the incorporated fluorescently labeled deoxyribonucleotide substrate is detected by a fluorescence detection device (not shown) on the left side. At this time, the fluorescence detection position 301 is identified by a fluorescence detection device (not shown) on the left side.

第６の工程は、第１の制限酵素により切断されなかったメチル化修飾様式が異なる制限酵素認識配列のうち第２の制限酵素によって切断可能な配列を第２の酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程である。図４(e)では、第１の制限酵素Mbo Iにより切断されなかったメチル化修飾を受けているGATC配列８を第２の制限酵素Sau3A Iにより処理することで、GATC配列８を含む二本鎖DNA複合体部位に5'突出末端を形成させる。   In the sixth step, a sequence that can be cleaved by the second restriction enzyme among the restriction enzyme recognition sequences that are not cleaved by the first restriction enzyme but have different methylation modification patterns is cleaved by the second enzyme, and the 5 ′ protruding end is cleaved. Is a step of forming. In FIG. 4 (e), the GATC sequence 8 that has undergone methylation modification that has not been cleaved by the first restriction enzyme Mbo I is treated with the second restriction enzyme Sau3A I, so that the two containing the GATC sequence 8 are processed. A 5 ′ protruding end is formed at the strand DNA complex site.

第７の工程は、第６の工程により形成された5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程である。図４(f)では、(e)での制限酵素処理後に基板上の酵素および切断断片を洗浄したのち、DNAポリメラーゼと蛍光標識された基質としてdGTPを新たに基板上に導入し塩基伸長反応を行う場合を示している。第４の工程と同様、取り込ませるデオキシリボヌクレオチド基質は、すべて蛍光標識されていなくてもよく、いずれか１つが蛍光標識されていればよい。なお、蛍光標識された基質dGTPの蛍光色素は第４の工程で用いた蛍光標識基質とは別の蛍光色素で標識されているほうが望ましい。また、dGTP以外にdATP、dTTPのうちのどれか１種が蛍光標識されたものを用いてもよい。   The seventh step is a step of extending the 3 ′ end by incorporating a deoxyribonucleotide substrate fluorescently labeled with DNA polymerase into the 5 ′ protruding end site formed in the sixth step. In FIG. 4 (f), after the restriction enzyme treatment in (e), the enzyme and the cleaved fragment on the substrate are washed, and then DNA polymerase and dGTP are newly introduced onto the substrate as a fluorescently labeled substrate to perform a base extension reaction. Shows the case to do. Similar to the fourth step, the deoxyribonucleotide substrate to be incorporated does not have to be fluorescently labeled, and any one may be fluorescently labeled. The fluorescent dye of the fluorescently labeled substrate dGTP is preferably labeled with a fluorescent dye different from the fluorescently labeled substrate used in the fourth step. In addition to dGTP, one of dATP and dTTP that is fluorescently labeled may be used.

第８の工程は、第７の工程で取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程である。図４(f)において、左側の図示しない蛍光検出装置により、取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出する。このとき、左側の図示しない蛍光検出装置により、蛍光検出位置401を同定する。   The eighth step is a step of detecting the fluorescence of the fluorescently labeled deoxyribonucleotide substrate incorporated in the seventh step and identifying its position on the solid phase carrier. In FIG. 4 (f), the fluorescence of the incorporated fluorescence-labeled deoxyribonucleotide substrate is detected by a fluorescence detection device (not shown) on the left side. At this time, the fluorescence detection position 401 is identified by a fluorescence detection device (not shown) on the left side.

本発明の方法では、第５の工程で同定された位置と第８の工程で同定された位置が、それぞれ異なる試料に由来するmRNAが固定されていた位置であると認定できる。   In the method of the present invention, the position identified in the fifth step and the position identified in the eighth step can be recognized as the positions where mRNAs derived from different samples are fixed.

図５に第５の工程より得られる蛍光検出結果501、第８の工程で得られる蛍光検出結果502、さらに、図３(a)において逆転写酵素を用いて蛍光標識基質を取り込ませることにより行った塩基配列解析の際に、輝点が得られた解析結果503を示した。ここで、得られた蛍光検出結果501で検出されている輝点位置301と302を、塩基配列解析結果503の輝点位置と比較することで、輝点位置301と302がそれぞれ塩基配列解析結果の輝点22、23に対応することがわかる。また、得られた蛍光検出結果502で検出されている輝点位置401と402を、塩基配列解析結果503の輝点位置と比較することで、輝点位置401と402がそれぞれ塩基配列解析結果の輝点21、24に対応することがわかる。これより、塩基配列解析結果の22、23が同じ試料由来のmRNAであることが、また、塩基配列解析結果の21、24が同じ試料由来のmRNAであることが判定できる。   FIG. 5 shows the fluorescence detection result 501 obtained in the fifth step, the fluorescence detection result 502 obtained in the eighth step, and further by incorporating a fluorescent labeling substrate using reverse transcriptase in FIG. 3 (a). An analysis result 503 in which bright spots were obtained during the base sequence analysis is shown. Here, by comparing the bright spot positions 301 and 302 detected in the obtained fluorescence detection result 501 with the bright spot position of the base sequence analysis result 503, the bright spot positions 301 and 302 are the base sequence analysis results, respectively. It can be seen that it corresponds to the bright spots 22 and 23. Further, by comparing the bright spot positions 401 and 402 detected in the obtained fluorescence detection result 502 with the bright spot position of the base sequence analysis result 503, the bright spot positions 401 and 402 are It can be seen that it corresponds to bright spots 21 and 24. From this, it can be determined that the base sequence analysis results 22 and 23 are mRNAs derived from the same sample, and the base sequence analysis results 21 and 24 are mRNAs derived from the same sample.

本発明の方法は、好ましくは、非メチル化配列またはメチル化配列を有する第１のオリゴヌクレオチドの5'末端をそれぞれ異なる蛍光色素で標識し、制限酵素処理前にそれぞれの蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程をさらに有する。例えば、図３(a)において、5'末端の蛍光を検出することにより、固相担体においてmRNAがハイブリダイズした二本鎖DNA複合体が固定化された位置すべてを検出することができる。   In the method of the present invention, preferably, the 5 ′ end of the first oligonucleotide having an unmethylated sequence or a methylated sequence is labeled with a different fluorescent dye, and the respective fluorescence is detected before treatment with a restriction enzyme. The method further includes identifying the position of the phase carrier. For example, in FIG. 3 (a), by detecting the fluorescence at the 5 ′ end, it is possible to detect all the positions where the double-stranded DNA complex to which the mRNA is hybridized on the solid phase carrier is immobilized.

本発明の方法において、第１の制限酵素として用いるメチル化感受性制限酵素と第２の制限酵素として用いるメチル化非感受性制限酵素の組合せとしては、例えば、Mbo IとSau3A Iの組合せ、Hpa IIとMsp Iの組合せ、またはAva IIとSin Iの組合せがあげられる。   In the method of the present invention, as a combination of a methylation sensitive restriction enzyme used as the first restriction enzyme and a methylation insensitive restriction enzyme used as the second restriction enzyme, for example, a combination of Mbo I and Sau3A I, Hpa II and A combination of Msp I, or a combination of Ava II and Sin I.

別の実施形態において本発明の発現mRNA識別方法は、第３および第６の工程において、メチル化感受性制限酵素としてHpa IIを、メチル化非感受性制限酵素としてMsp Iを使用し、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、CCGG 配列またはメチル化されたCmCGG配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有するものである。 In another embodiment, the expression mRNA identification method of the present invention uses Hpa II as a methylation-sensitive restriction enzyme and Msp I as a methylation-insensitive restriction enzyme in the third and sixth steps, and double-stranded DNA. The complex has a CCGG sequence or a methylated C m CGG sequence as a restriction enzyme recognition sequence at only one position in the double-stranded DNA complex sequence.

別の実施形態において本発明の発現mRNA識別方法は、第３および第６の工程において、メチル化感受性制限酵素としてAva IIを、メチル化非感受性制限酵素としてSin Iを使用し、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GG(A/T)CC 配列またはメチル化されたGG(A/T)mCC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有するものである。 In another embodiment, the expression mRNA identification method of the present invention uses Ava II as a methylation-sensitive restriction enzyme and Sin I as a methylation-insensitive restriction enzyme in the third and sixth steps, and double-stranded DNA. The complex has a GG (A / T) CC sequence or a methylated GG (A / T) m CC sequence as a restriction enzyme recognition sequence at only one position in the double-stranded DNA complex sequence.

別の実施形態において本発明の発現mRNA識別方法は、第３および第６の工程において、メチル化感受性制限酵素としてAva IIを、メチル化非感受性制限酵素としてSin Iを使用し、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GG(A/T)CC 配列またはメチル化されたGG(A/T)mCC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有するものである。 In another embodiment, the expression mRNA identification method of the present invention uses Ava II as a methylation-sensitive restriction enzyme and Sin I as a methylation-insensitive restriction enzyme in the third and sixth steps, and double-stranded DNA. The complex has a GG (A / T) CC sequence or a methylated GG (A / T) m CC sequence as a restriction enzyme recognition sequence at only one position in the double-stranded DNA complex sequence.

別の実施形態において本発明の発現mRNA識別方法は、二本鎖DNA複合体として、制限酵素認識配列を２種以上有するものを用い、各配列を認識するメチル化感受性制限酵素およびメチル化非感受性制限酵素をそれぞれ第１および第２の制限酵素として用いて第３〜第８の工程を繰り返すものである。制限酵素認識配列をそれぞれ２種有する二本鎖DNA複合体を３種を用いる場合について図６に示す。図６には、第３〜第８の工程を繰り返して実施する際に、第３および第８の工程において使用するメチル化感受性および非感受性制限酵素処理をそれぞれ異なる制限酵素を用いて行うことで３種以上の試料の識別を可能にする方法を示している。図６の31、33はメチル化感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列であり、32、34はメチル化非感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列である。31と32は、メチル化修飾の有無においては異なるが同じ塩基配列を有し、33と34もまた、メチル化修飾の有無においては異なるが同じ塩基配列を有する。まず、1個目のメチル化感受性制限酵素により処理することで、制限酵素認識配列31が切断されるが、32は切断されない。これにより、まずmRNA 111の由来する試料を同定できる。次に、1個目のメチル化非感受性制限酵素により処理することで、制限酵素認識配列32が切断される。これにより、mRNA 112および113の由来する試料を同定できる。引き続き、２個目のメチル化感受性制限酵素により処理することで、制限酵素認識配列33は切断されるが、34は切断されない。これより、1個目のメチル化非感受性制限酵素処理の結果同定されたmRNA 112および113が異なる試料由来であることが判定できる。二本鎖DNA複合体に含まれる制限酵素認識配列の数をさらに増やすことにより、より多くの試料に由来するmRNAを識別することができる。   In another embodiment, the expression mRNA identification method of the present invention uses a double-stranded DNA complex having two or more restriction enzyme recognition sequences, a methylation sensitive restriction enzyme that recognizes each sequence, and methylation insensitivity. The third to eighth steps are repeated using restriction enzymes as the first and second restriction enzymes, respectively. FIG. 6 shows a case where three types of double-stranded DNA complexes each having two types of restriction enzyme recognition sequences are used. FIG. 6 shows that when the 3rd to 8th steps are repeated, the methylation sensitive and insensitive restriction enzyme treatments used in the 3rd and 8th steps are performed using different restriction enzymes, respectively. 3 illustrates a method that allows identification of three or more samples. 6, 31 and 33 are restriction enzyme recognition sequences cleaved by a methylation-sensitive restriction enzyme, and 32 and 34 are restriction enzyme recognition sequences cleaved by a methylation-insensitive restriction enzyme. 31 and 32 have the same base sequence with different methylation modifications, but 33 and 34 also have the same base sequence with different methylation modifications. First, the restriction enzyme recognition sequence 31 is cleaved by treatment with the first methylation-sensitive restriction enzyme, but 32 is not cleaved. Thereby, first, a sample from which mRNA 111 is derived can be identified. Next, the restriction enzyme recognition sequence 32 is cleaved by treatment with the first methylation-insensitive restriction enzyme. Thereby, the sample from which mRNA 112 and 113 originate can be identified. Subsequently, by treating with a second methylation-sensitive restriction enzyme, the restriction enzyme recognition sequence 33 is cleaved, but 34 is not cleaved. From this, it can be determined that the mRNAs 112 and 113 identified as a result of the first methylation-insensitive restriction enzyme treatment are derived from different samples. By further increasing the number of restriction enzyme recognition sequences contained in the double-stranded DNA complex, mRNA derived from a larger number of samples can be identified.

別の実施形態において本発明は、単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別するためのキットに関する。該キットは、オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、該制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体と、該制限酵素認識配列を認識するメチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の少なくとも１種の組合せとを含む。メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せ、それらが認識する制限酵素認識配列については上述のとおりである。   In another embodiment, the present invention relates to a kit for identifying target mRNAs derived from two or more samples in expression analysis by single molecule measurement. The kit comprises two or more double-stranded DNA complexes formed from a first oligonucleotide and a second oligonucleotide having an oligo dT sequence and having at least one restriction enzyme recognition sequence, the restriction enzyme recognition sequence And a combination of at least one of a methylation-sensitive restriction enzyme that recognizes the restriction enzyme recognition sequence and a methylation-insensitive restriction enzyme. The combination of a methylation sensitive restriction enzyme and a methylation insensitive restriction enzyme, and the restriction enzyme recognition sequence recognized by them are as described above.

本発明のキットは、前記のほか、DNAポリメラーゼなどのその他の酵素、dNTP、NTP、緩衝液、減菌水、標品（標準菌株、標準DNAなど）等を含んだものとして構成される。   In addition to the above, the kit of the present invention is configured to include other enzymes such as DNA polymerase, dNTP, NTP, buffer solution, sterilized water, standard (standard strain, standard DNA, etc.) and the like.

上述してきたように、本発明によれば、単分子計測によるmRNA発現解析において、発現解析を行う標的mRNAが２種以上の試料由来である場合に、標的mRNAのハイブリダイズ効率に影響を与えることなく、その試料毎に異なるタグ識別が可能な発現mRNA識別方法を提供することが出来る。これにより、高精度にかつ高スループットな単分子計測によるmRNA発現解析を達成できる。   As described above, according to the present invention, in the mRNA expression analysis by single molecule measurement, when the target mRNA to be analyzed is derived from two or more samples, the hybridization efficiency of the target mRNA is affected. In addition, it is possible to provide a method for identifying an expressed mRNA capable of identifying different tags for each sample. Thereby, mRNA expression analysis by single molecule measurement with high accuracy and high throughput can be achieved.

本発明において用いる制限酵素認識配列を有する二本鎖DNA複合体を形成する第１および第２のオリゴヌクレオチドの模式図を示す。FIG. 2 shows a schematic diagram of first and second oligonucleotides forming a double-stranded DNA complex having a restriction enzyme recognition sequence used in the present invention. 異なる試料由来のmRNAをハイブリダイズさせた二本鎖DNA複合体と標的mRNAとの複合体の模式図を示す。The schematic diagram of the composite_body | complex of the double stranded DNA complex which hybridized the mRNA derived from a different sample, and target mRNA is shown. mRNAと二本鎖DNA複合体からなる複合体の固相担体への固定化以降の工程の説明図である。It is explanatory drawing of the process after fixation to the solid-phase carrier of the composite_body | complex which consists of mRNA and a double stranded DNA complex. mRNAと二本鎖DNA複合体からなる複合体の固相担体への固定化以降の工程の説明図である。It is explanatory drawing of the process after fixation to the solid-phase carrier of the composite_body | complex which consists of mRNA and a double stranded DNA complex. 第５および第８の工程より得られる蛍光検出結果と逆転写酵素を用いて蛍光標識基質を取り込ませることにより行ったmRNA塩基配列解析結果を比較することにより、発現mRNAを同定・識別する方法の説明図である。A method for identifying and discriminating expressed mRNAs by comparing the fluorescence detection results obtained from the fifth and eighth steps with the results of mRNA base sequence analysis performed by incorporating a fluorescently labeled substrate using reverse transcriptase. It is explanatory drawing. ２種以上の制限酵素認識配列を保持する二本鎖DNA複合体を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the double stranded DNA complex holding 2 or more types of restriction enzyme recognition sequences.

符号の説明Explanation of symbols

１，２…第１のオリゴヌクレオチド、３，４…第２のオリゴヌクレオチド、５，６…オリゴdT配列領域、７…メチル化修飾を受けていない制限酵素認識配列、８…メチル化修飾を受けている制限酵素認識配列、９…メチル化修飾を受けていないGATC配列、１０…メチル化修飾を受けているGATC配列、２１，２２，２３，２４…塩基配列解析の際に検出された輝点位置、３１…１個目のメチル化感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列、３２…１個目のメチル化非感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列、３３…２個目のメチル化感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列、３４…２個目のメチル化非感受性制限酵素により切断される制限酵素認識配列、１０１，１０２，１１１，１１２，１１３…異なる試料由来の標的mRNA、２０１…固相担体、３０１，３０２…第５の工程より得られる蛍光検出輝点位置、４０１，４０２…第８の工程で得られる蛍光検出輝点位置、５０１…第５の工程より得られる蛍光検出結果、５０２…第８の工程で得られる蛍光検出結果、５０３…単分子計測による塩基配列解析結果 1, 2 ... 1st oligonucleotide, 3, 4 ... 2nd oligonucleotide, 5, 6 ... oligo dT sequence region, 7 ... restriction enzyme recognition sequence not subjected to methylation modification, 8 ... subjected to methylation modification Restriction enzyme recognition sequence, 9 ... GATC sequence not subjected to methylation modification, 10 ... GATC sequence subjected to methylation modification, 21, 22, 23, 24 ... Bright spots detected during base sequence analysis Position, 31 ... restriction enzyme recognition sequence cleaved by the first methylation sensitive restriction enzyme, 32 ... restriction enzyme recognition sequence cleaved by the first methylation insensitive restriction enzyme, 33 ... second methyl Restriction enzyme recognition sequence cleaved by the oxidization sensitive restriction enzyme, 34... Restriction enzyme recognition sequence cleaved by the second methylation-insensitive restriction enzyme, 101, 102, 111, 112, 113. Target mRNA, 201 ... solid phase carrier, 301,302 ... fluorescence detection luminescent spot position obtained in the fifth step, 401,402 ... fluorescence detection luminescent spot position obtained in the eighth step, 501 ... from the fifth step Fluorescence detection result obtained in the eighth step, 502 ... Fluorescence detection result obtained in the eighth step, 503 ... Base sequence analysis result by single molecule measurement

Claims (12)

単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別する方法であって、
(i)オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体を、オリゴdT配列により標的mRNAに試料ごとにハイブリダイズさせる工程と、
(ii)ハイブリダイズしたmRNAと二本鎖DNA複合体を固相担体に固定化させる工程と、
(iii)固定化されたmRNAと二本鎖DNA複合体における二本鎖DNA複合体部位に含まれる制限酵素認識配列のうち第１の制限酵素によって切断可能な配列を第１の制限酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程と、
(iv)5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程と、
(v)取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程と、
(vi)第１の制限酵素により切断されなかったメチル化修飾様式が異なる制限酵素認識配列のうち第２の制限酵素によって切断可能な配列を第２の酵素により切断し5'突出末端を形成させる工程と、
(vii)第２の制限酵素により形成された5'突出末端部位にDNAポリメラーゼにより蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチド基質を取り込ませることによりその3'末端を塩基伸長させる工程と、
(viii)取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチド基質の蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程と
を有する発現mRNA識別方法。 A method for identifying target mRNAs derived from two or more samples in expression analysis by single molecule measurement,
(i) two or more double-stranded DNA complexes formed from a first oligonucleotide and a second oligonucleotide having an oligo dT sequence and having at least one restriction enzyme recognition sequence, wherein the restriction enzyme recognition sequence is methyl Hybridizing the double stranded DNA complexes that differ from each other in a modified modification mode to the target mRNA by oligo dT sequences for each sample;
(ii) a step of immobilizing a hybridized mRNA and a double-stranded DNA complex on a solid phase carrier;
(iii) The restriction enzyme recognition sequence contained in the double-stranded DNA complex site in the immobilized mRNA and double-stranded DNA complex is cleaved by the first restriction enzyme. Forming a 5 ′ protruding end;
(iv) a step of base extension of the 3 ′ end by incorporating a deoxyribonucleotide substrate fluorescently labeled with DNA polymerase into the 5 ′ protruding end site;
(v) detecting the fluorescence of the incorporated fluorescently labeled deoxyribonucleotide substrate and identifying its position on the solid support;
(vi) A restriction enzyme recognition sequence which is not cleaved by the first restriction enzyme but has a different mode of methylation modification, is cleaved by the second restriction enzyme to form a 5 ′ protruding end. Process,
(vii) base-extending the 3 ′ end by incorporating a deoxyribonucleotide substrate fluorescently labeled with DNA polymerase into the 5 ′ protruding end site formed by the second restriction enzyme;
(viii) a method for identifying an expressed mRNA comprising the steps of detecting the fluorescence of the incorporated fluorescently labeled deoxyribonucleotide substrate and identifying its position on the solid phase carrier. 第１オリゴヌクレオチドが5'上流領域に制限酵素認識配列を、3'下流領域にオリゴdT配列を有し、第２オリゴヌクレオチドが第１オリゴヌクレオチドの5'上流領域に存在する制限酵素認識配列の相補的配列を有し、第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドが二本鎖DNA複合体を形成する、請求項１に記載の発現mRNA識別方法。   The first oligonucleotide has a restriction enzyme recognition sequence in the 5 ′ upstream region, an oligo dT sequence in the 3 ′ downstream region, and the second oligonucleotide is a restriction enzyme recognition sequence present in the 5 ′ upstream region of the first oligonucleotide. The expression mRNA identification method according to claim 1, which has a complementary sequence, and wherein the first oligonucleotide and the second oligonucleotide form a double-stranded DNA complex. ハイブリダイズしたmRNAと二本鎖DNA複合体を固相担体に固定化させる工程において、第２オリゴヌクレオチドが3'末端において固相担体に固定化される、請求項１に記載の発現mRNA識別方法。   The method for identifying an expressed mRNA according to claim 1, wherein in the step of immobilizing the hybridized mRNA and the double-stranded DNA complex to the solid phase carrier, the second oligonucleotide is immobilized to the solid phase carrier at the 3 'end. . 第１および第２のオリゴヌクレオチドにより形成される二本鎖DNA複合体が有する制限酵素認識配列が、第１および第２の制限酵素に認識され、かつ第１の制限酵素がメチル化感受性であり、第２の制限酵素がメチル化非感受性である、請求項１に記載の発現mRNA識別方法。   The restriction enzyme recognition sequence of the double-stranded DNA complex formed by the first and second oligonucleotides is recognized by the first and second restriction enzymes, and the first restriction enzyme is sensitive to methylation The method for identifying an expressed mRNA according to claim 1, wherein the second restriction enzyme is insensitive to methylation. メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せが、Mbo IとSau3A Iの組合せ、Hpa IIとMsp Iの組合せ、またはAva IIとSin Iの組合せである請求項４に記載の発現mRNA識別方法。   The expressed mRNA according to claim 4, wherein the combination of a methylation sensitive restriction enzyme and a methylation insensitive restriction enzyme is a combination of Mbo I and Sau3A I, a combination of Hpa II and Msp I, or a combination of Ava II and Sin I. Identification method. メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがMbo IとSau3A Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GATC配列またはメチル化されたGmATC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、請求項５に記載の発現mRNA識別方法。 When the combination of the methylation sensitive restriction enzyme and the methylation insensitive restriction enzyme is Mbo I and Sau3A I, the double-stranded DNA complex is used as a restriction enzyme recognition sequence as a GATC sequence or a methylated G m ATC sequence. The expression mRNA identification method of Claim 5 which has only one place in a double stranded DNA complex arrangement | sequence. メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがHpa IIとMsp Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、CCGG配列またはメチル化されたCmCGG配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、請求項５に記載の発現mRNA識別方法。 When the combination of a methylation sensitive restriction enzyme and a methylation insensitive restriction enzyme is Hpa II and Msp I, the double-stranded DNA complex is used as a restriction enzyme recognition sequence as a CCGG sequence or a methylated C m CGG sequence. The expression mRNA identification method of Claim 5 which has only one place in a double stranded DNA complex arrangement | sequence. メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せがAva IIとSin Iの場合には、二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列として、GG(A/T)CC配列またはメチル化されたGG(A/T)mCC配列を二本鎖DNA複合体配列中に１箇所だけ有する、請求項５に記載の発現mRNA識別方法。 When the combination of methylation-sensitive restriction enzyme and methylation-insensitive restriction enzyme is Ava II and Sin I, the double-stranded DNA complex is used as a restriction enzyme recognition sequence as a GG (A / T) CC sequence or methylation. The method for identifying an expressed mRNA according to claim 5, wherein the GG (A / T) m CC sequence thus obtained has only one position in the double-stranded DNA complex sequence. 二本鎖DNA複合体が、制限酵素認識配列を２種以上有し、各配列に対するメチル化感受性制限酵素およびメチル化非感受性制限酵素をそれぞれ第１および第２の制限酵素として用いて(iii)〜(viii)の工程を繰り返す、請求項１に記載の発現mRNA識別方法。   The double-stranded DNA complex has two or more restriction enzyme recognition sequences, and a methylation-sensitive restriction enzyme and a methylation-insensitive restriction enzyme for each sequence are used as the first and second restriction enzymes, respectively (iii) The method for identifying an expressed mRNA according to claim 1, wherein the steps (viii) are repeated. 非メチル化配列またはメチル化配列を有する第１のオリゴヌクレオチドの5'末端をそれぞれ異なる蛍光色素で標識し、制限酵素処理前にそれぞれの蛍光を検出し、固相担体におけるその位置を同定する工程をさらに有する、請求項１に記載の発現mRNA識別方法。   A step of labeling the 5 ′ end of the first oligonucleotide having an unmethylated sequence or a methylated sequence with a different fluorescent dye, detecting each fluorescence before treatment with a restriction enzyme, and identifying its position on a solid phase carrier The method for identifying expressed mRNA according to claim 1, further comprising: 単分子計測による発現解析において２種以上の試料由来の標的mRNAを識別するためのキットであって、オリゴdT配列を有する第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドから形成され少なくとも１個の制限酵素認識配列を有する２種以上の二本鎖DNA複合体であって、該制限酵素認識配列がメチル化修飾様式において互いに異なる該二本鎖DNA複合体と、該制限酵素認識配列を認識するメチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の少なくとも１種の組合せとを含む前記キット。   A kit for discriminating target mRNAs derived from two or more samples in expression analysis by single molecule measurement, which is formed from a first oligonucleotide and a second oligonucleotide having an oligo dT sequence and recognizes at least one restriction enzyme Two or more double-stranded DNA complexes having sequences, wherein the restriction enzyme recognition sequences differ from each other in the methylation modification mode, and methylation sensitivity for recognizing the restriction enzyme recognition sequences The kit comprising a restriction enzyme and at least one combination of methylation-insensitive restriction enzymes. メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合せが、Mbo IとSau3A Iの組合せ、Hpa IIとMsp Iの組合せ、およびAva IIとSin Iの組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載のキット。   The combination of a methylation sensitive restriction enzyme and a methylation insensitive restriction enzyme is selected from the group consisting of a combination of Mbo I and Sau3A I, a combination of Hpa II and Msp I, and a combination of Ava II and Sin I. The kit according to 11.
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