JP2010017094A - Method for producing acetaldehyde by enzyme reaction - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酵素反応を利用して、ピルビン酸からアセトアルデヒドを効率的に製造する方法に関する。更に本発明は、２段階の酵素反応を利用して、ピルビン酸からエタノールを効率的に製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for efficiently producing acetaldehyde from pyruvic acid using an enzymatic reaction. Furthermore, the present invention relates to a method for efficiently producing ethanol from pyruvic acid using a two-stage enzymatic reaction.
近年、二酸化炭素の排出による地球温暖化が懸念されており、国際的にも京都議定書等に代表される地球温暖化防止の取り組みが注目されている。地球温暖化防止対策の一環として、トウモロコシや木材等のバイオマスから製造されたバイオエタノールを燃料として積極的に利用することが提案されている。バイオエタノールは、本来、大気中の二酸化炭素を固定化したものから製造されるため、バイオエタノールが燃焼する際に発生する二酸化炭素は、京都議定書上の排出量にカウントされないことになっており、バイオエタノールはカーボンニュートラルな物質として認められている。 In recent years, there has been concern about global warming due to the emission of carbon dioxide, and efforts to prevent global warming represented by the Kyoto Protocol etc. are attracting attention internationally. As part of measures to prevent global warming, it has been proposed to use bioethanol produced from biomass such as corn and wood as fuel. Since bioethanol is originally manufactured from a fixed carbon dioxide in the atmosphere, the carbon dioxide generated when bioethanol burns is not counted in the Kyoto Protocol emissions. Bioethanol is recognized as a carbon neutral substance.
従来、バイオマスからエタノールを製造するには、バイオマスを糖化させる工程と、エタノールを生成する微生物を用いて糖化されたバイオマスをエタノール発酵させる工程が必要とされている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、バイオマスからエタノールを製造する従来の方法では、工業的実施の観点からは障害が多い。例えば、エタノール発酵においてエタノールが蓄積する、エタノールを生成する微生物の活性が損なわれるため、高濃度のエタノールを製造できないという欠点がある。更に、エタノール発酵の際に、原料として供給される糖化されたバイオマスは、エタノールの原料として使用されるだけでなく、その一部がTCAサイクルにも供給されてエタノールを生成する微生物の生育のためにも利用されるため、最終的なエタノールの収率が低いという問題点もある。 Conventionally, in order to produce ethanol from biomass, a step of saccharifying biomass and a step of ethanol fermentation of saccharified biomass using a microorganism that produces ethanol are required (see, for example, Patent Document 1). However, the conventional method for producing ethanol from biomass has many obstacles from the viewpoint of industrial implementation. For example, since ethanol accumulates in ethanol fermentation and the activity of microorganisms that produce ethanol is impaired, there is a disadvantage that high concentration ethanol cannot be produced. Furthermore, the saccharified biomass supplied as a raw material during ethanol fermentation is not only used as a raw material for ethanol, but also a part of it is also supplied to the TCA cycle for the growth of microorganisms that produce ethanol. Therefore, there is a problem that the final ethanol yield is low.
エタノールを生成する微生物は、１１個の一連の酵素反応を経てグルコースからエタノールへの変換を行っている。そこで、これらの一連の酵素反応を行うシステムを構築できれば、上記のような微生物を利用するバイオマスエタノールの製造方法の欠点が解消できると期待される。グルコースからエタノールへの変換を行う一連の酵素反応の内、ピルビン酸デカルボキシラーゼによってピルビン酸を脱炭酸させてアセトアルデヒドを生成させる反応がある。しかしながら、この酵素反応を工業的に実施するには、大きな問題点がある。即ち、アセトアルデヒドには、酵素の失活させる性質があるため、生成したアセトアルデヒドが蓄積すると、酵素反応が進行しなくなるという欠点があり、酵素反応によるピルビン酸からアセトアルデヒドの生成を効率的に実施できないのが現状である。そこで、グルコースからエタノールを酵素により製造するためには、ピルビン酸からアセトアルデヒドを効率的に生成できる系の確立が不可欠である。 Microorganisms that produce ethanol convert glucose into ethanol through a series of eleven enzyme reactions. Therefore, if a system for performing a series of these enzyme reactions can be constructed, it is expected that the disadvantages of the biomass ethanol production method using microorganisms as described above can be solved. Among a series of enzyme reactions for converting glucose to ethanol, there is a reaction in which pyruvate is decarboxylated by pyruvate decarboxylase to produce acetaldehyde. However, there are major problems in industrially carrying out this enzyme reaction. In other words, since acetaldehyde has the property of inactivating the enzyme, there is a disadvantage that when the generated acetaldehyde accumulates, the enzymatic reaction does not proceed, and acetaldehyde cannot be efficiently produced from pyruvic acid by the enzymatic reaction. Is the current situation. Therefore, in order to produce ethanol from glucose enzymatically, it is essential to establish a system capable of efficiently producing acetaldehyde from pyruvic acid.
更に、現在、サトウキビやトウモロコシは、エタノール製造の原料となる糖質を高濃度に得ることができるため、バイオマスエタノールの製造原料として主流になっている。これに対して、木材等のセルロース系バイオマスでは、セルラーゼの反応性の低さから高濃度の糖質を得ることができないため、バイオマスエタノールの製造原料として使用するには、得られた糖液（水溶液）の濃縮が必須である。しかしながら、このような糖液の濃縮には、多大なエネルギーを要するため、効率的なエタノール生産が困難になるという問題点がある。そこで、低濃度のピルビン酸から、濃縮された状態のアセトアルデヒドを製造できる方法が開発できれば、セルロース系バイオマスを利用したバイオマスエタノールの製造における従来技術の欠点を克服することもできる。
本発明は、酵素反応を利用して、ピルビン酸からアセトアルデヒドを効率的に製造する技術を提供することを目的とする。更に、本発明は、２段階の酵素反応を利用して、ピルビン酸からエタノールを効率的に製造する技術を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a technique for efficiently producing acetaldehyde from pyruvic acid using an enzymatic reaction. Furthermore, an object of the present invention is to provide a technique for efficiently producing ethanol from pyruvic acid using a two-stage enzymatic reaction.
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねたところ、ピルビン酸デカルボキシラーゼを用いて、ピルビン酸を脱炭酸させてアセトアルデヒドを生成させる酵素反応において、生成したアセトアルデヒドを留去しながら、該酵素反応を行うことにより、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を損なうことなく、効率的にアセトアルデヒドを製造できることを見出した。更に、本発明者等は、驚くべきことに、常圧下での酵素反応において、アセトアルデヒドの沸点よりも遙かに高い温度に設定することによって、ピルビン酸デカルボキシラーゼを安定に保持させることができ、効率的なアセトアルデヒドの製造が可能になることも見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に改良を重ねることにより完成したものである。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have used pyruvic acid decarboxylase to decarboxylate pyruvic acid to produce acetaldehyde while distilling off the generated acetaldehyde. It has been found that acetaldehyde can be efficiently produced by performing the enzyme reaction without impairing the activity of pyruvate decarboxylase. Furthermore, the present inventors can surprisingly hold pyruvic acid decarboxylase stably by setting the temperature much higher than the boiling point of acetaldehyde in the enzyme reaction under normal pressure, It has also been found that efficient production of acetaldehyde becomes possible. The present invention has been completed by making further improvements based on these findings.
即ち、本発明は、下記に掲げるアセトアルデヒドの製造方法を提供する：
項１． ピルビン酸にピルビン酸デカルボキシラーゼを作用させる酵素反応によってアセトアルデヒドを製造する方法であって、生成したアセトアルデヒドを留去しながら該酵素反応を行うことを特徴とする、アセトアルデヒドの製造方法。
項２． 前記酵素反応を常圧下５０℃以上の条件で行うことにより、酵素反応中に生成するアセトアルデヒドを留去する、項１に記載の製造方法。
項３． 前記酵素反応を、反応温度及び圧力雰囲気が下記の式(A)を満たす環境下で行うことにより、酵素反応中に生成するアセトアルデヒドを留去する、項１に記載の製造方法。
That is, the present invention provides the following acetaldehyde production methods:
Item 1. A method for producing acetaldehyde by an enzymatic reaction in which pyruvate decarboxylase is allowed to act on pyruvic acid, wherein the enzymatic reaction is carried out while distilling off the produced acetaldehyde.
Item 2. Item 2. The production method according to Item 1, wherein acetaldehyde produced during the enzyme reaction is distilled off by performing the enzyme reaction under conditions of 50 ° C or higher under normal pressure.
Item 3. Item 2. The production method according to Item 1, wherein the acetaldehyde produced during the enzyme reaction is distilled off by performing the enzyme reaction in an environment where the reaction temperature and pressure atmosphere satisfy the following formula (A).
項４． 前記ピルビン酸デカルボキシラーゼが、Zymobacter属に属する耐熱菌由来の耐熱性酵素である、項１乃至３のいずれかに記載の製造方法。 Item 4. Item 4. The production method according to any one of Items 1 to 3, wherein the pyruvate decarboxylase is a heat-resistant enzyme derived from a heat-resistant bacterium belonging to the genus Zymobacter.
更に、本発明は、下記に掲げるエタノールの製造方法を提供する：
項５． ピルビン酸から酵素反応によりエタノールを製造する方法であって、
(1) ピルビン酸にピルビン酸デカルボキシラーゼを作用させる酵素反応において、生成したアセトアルデヒドを留去しながら該酵素反応を行うことにより、アセトアルデヒドを得る工程、及び
(2)前記工程で得られたアセトアルデヒドにエタノールデヒドロゲナーゼを作用させて、エタノールを得る工程。
Furthermore, the present invention provides the following methods for producing ethanol:
Item 5. A method for producing ethanol from pyruvic acid by an enzymatic reaction,
(1) In an enzyme reaction in which pyruvate decarboxylase is allowed to act on pyruvate, a step of obtaining acetaldehyde by performing the enzyme reaction while distilling off the generated acetaldehyde; and
(2) A step of obtaining ethanol by causing ethanol dehydrogenase to act on the acetaldehyde obtained in the above step.
アセトアルデヒドは、人体にとって有毒であるため、従来、酵素を用いたアセトアルデヒドの製造は、密閉された雰囲気で行われている。このような従来法では、酵素の失活によって、高収率なアセトアルデヒドの製造を行うことはできなかった。これに対して、本発明の製造方法によれば、生成したアセトアルデヒドを留去により回収しながら、ピルビン酸からアセトアルデヒドの変換が行われるので、使用する酵素を失活させることなく安定に維持することができ、高収率でアセトアルデヒドを製造することが可能になる。 Since acetaldehyde is toxic to the human body, conventionally, the production of acetaldehyde using an enzyme has been performed in a sealed atmosphere. In such a conventional method, it was not possible to produce a high yield of acetaldehyde due to enzyme deactivation. On the other hand, according to the production method of the present invention, conversion of acetaldehyde from pyruvic acid is performed while recovering the generated acetaldehyde by distillation, so that the enzyme to be used can be stably maintained without being deactivated. And acetaldehyde can be produced with high yield.
また、アセトアルデヒドは、エタノール製造の原料として使用することもできるので、本発明の製造方法を、グルコースから一連の酵素反応によりエタノールを製造するための製造システムに導入することで、従来のバイオマスエタノールの製造方法の代替手段を提供することも可能になる。 Since acetaldehyde can also be used as a raw material for ethanol production, by introducing the production method of the present invention into a production system for producing ethanol from glucose by a series of enzymatic reactions, It is also possible to provide an alternative to the manufacturing method.
更に、本発明によれば、酵素反応が行われている溶液からアセトアルデヒドが留去されることによって分離されるため、高濃度のアセトアルデヒドが回収される。それ故、本願発明は、セルロース系バイオマスを糖化した低濃度のグルコースを出発原料として製造されたピルビン酸であっても、アセトアルデヒドを高濃度で回収することができるので、効率的にアセトアルデヒド及びエタノールの製造が可能になる。 Furthermore, according to the present invention, since acetaldehyde is separated from the solution in which the enzyme reaction is performed by distillation, a high concentration of acetaldehyde is recovered. Therefore, the present invention can recover acetaldehyde at a high concentration even if it is pyruvic acid produced using a low concentration of glucose obtained by saccharifying cellulosic biomass as a starting material. Manufacturing becomes possible.
以下、本発明について詳細に説明する。
１．アセトアルデヒドの製造方法
本発明の製造方法では、生成したアセトアルデヒドを留去しながら、ピルビン酸にピルビン酸デカルボキシラーゼを作用させる酵素反応を行うことを特徴とする。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Method for Producing Acetaldehyde The production method of the present invention is characterized in that an enzymatic reaction in which pyruvate decarboxylase is allowed to act on pyruvate is performed while distilling off the generated acetaldehyde.
本発明の製造方法で原料基質として使用されるピルビン酸については、その由来については特に制限されず、酵素反応によって製造されたもの、或いは化学合成によって製造されたもののいずれであってもよい。好ましくは、バイオマス由来のグルコースから一連の酵素反応を経て合成されたピルビン酸である。このようなピルビン酸を原料基質として使用することによって、カーボンニュートラルな（非枯渇資源としての）アセトアルデヒドの提供ができ、ひいてはバイオマスエタノールの合成原料としての利用も可能になる。 The pyruvic acid used as a raw material substrate in the production method of the present invention is not particularly limited in its origin, and may be any of those produced by an enzymatic reaction or those produced by chemical synthesis. Preferably, it is pyruvic acid synthesized from biomass-derived glucose through a series of enzyme reactions. By using such pyruvic acid as a raw material substrate, carbon neutral acetaldehyde (as a non-depleted resource) can be provided, and as a result, it can also be used as a synthetic raw material for biomass ethanol.
また、本発明の製造方法で使用される酵素は、ピルビン酸を脱炭酸させてアセトアルデヒドに変換するピルビン酸デカルボキシラーゼである。本発明に使用されるピルビン酸デカルボキシラーゼの由来、温度特性、ｐＨ特性等については、特に制限されないが、酵素反応中にアセトアルデヒドを留去させるという本発明の特徴を鑑みれば、５０℃以上、好ましくは５０〜６０℃、更に好ましくは５５〜６０℃で活性を示す耐熱性のピルビン酸デカルボキシラーゼが好ましい。ピルビン酸デカルボキシラーゼの好適な例としては、Zymobacter属に属する耐熱性細菌由来のもの、Zymobacter palmae由来のものが挙げられる。Zymobacter palmae由来のピルビン酸デカルボキシラーゼについては、具体的には、Krishnan Chandra Raji et al, Cloning and Characterization of the Zymobacter palmae Pyruvate Decarboxylase Gene (pdc) and Comparison to Bacterial Homologues, Applied and Environmental Microbiology, June 2002, Vol. 68, No. 6, pp. 2869-2876等に記載されており、より具体的には配列番号１に示すアミノ酸配列からなるものが例示される。 The enzyme used in the production method of the present invention is pyruvate decarboxylase that decarboxylates pyruvate and converts it to acetaldehyde. The origin, temperature characteristics, pH characteristics and the like of pyruvate decarboxylase used in the present invention are not particularly limited, but in view of the feature of the present invention that acetaldehyde is distilled off during the enzyme reaction, 50 ° C. or higher, preferably Is preferably a thermostable pyruvate decarboxylase exhibiting activity at 50-60 ° C, more preferably 55-60 ° C. Preferable examples of pyruvate decarboxylase include those derived from thermostable bacteria belonging to the genus Zymobacter and those derived from Zymobacter palmae. For pyruvate decarboxylase derived from Zymobacter palmae, specifically, Krishnan Chandra Raji et al, Cloning and Characterization of the Zymobacter palmae Pyruvate Decarboxylase Gene (pdc) and Comparison to Bacterial Homologues, Applied and Environmental Microbiology, June 2002, Vol. 68, No. 6, pp. 2869-2876, etc., and more specifically, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is exemplified.
これらのピルビン酸デカルボキシラーゼとして、市販品として入手することができ、また遺伝子組み換え手段を利用して製造することもできる。 These pyruvate decarboxylase can be obtained as a commercial product, or can be produced using genetic recombination means.
本発明の製造方法では、ピルビン酸デカルボキシラーゼは、必要に応じて適当な担体に固定化した状態で使用してもよい。このようピルビン酸デカルボキシラーゼを担体に固定化して使用すると、製造終了後の酵素の回収が容易になり、また酵素の再利用が可能になるという利点がある。 In the production method of the present invention, pyruvate decarboxylase may be used in a state where it is immobilized on an appropriate carrier, if necessary. When pyruvate decarboxylase is immobilized on a carrier as described above, there are advantages that the enzyme can be easily recovered after the production is completed and the enzyme can be reused.
本発明の製造方法において、ピルビン酸デカルボキシラーゼを利用してピルビン酸をアセトアルデヒドに変換するには、チアミンピロフォスフェートとマグネシウムイオンが必要とされる。ここで、マグネシウムイオンとしては、水溶液中でマグネシウムイオンを生じさせるようなマグネシウム塩を使用することができ、具体的には、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。 In the production method of the present invention, thiamine pyrophosphate and magnesium ion are required to convert pyruvate into acetaldehyde using pyruvate decarboxylase. Here, as the magnesium ion, a magnesium salt that generates magnesium ion in an aqueous solution can be used, and specific examples include magnesium chloride and magnesium sulfate.
本発明の製造方法では、ピルビン酸デカルボキシラーゼによる酵素反応を、生成するアセトアルデヒドを留去しながら実施する。このように生成したアセトアルデヒドを留去しつつ酵素反応を行うことによって、ピルビン酸デカルボキシラーゼを失活させることなく安定に維持して、低濃度のピルビン酸を原料とする場合でも、低い蒸留コストで高濃度のアセトアルデヒドの高効率な製造が実現可能になる。酵素反応中に生成したアセトアルデヒドを留去させる方法については、特に制限されないが、好ましい一例として、ピルビン酸が酵素反応溶液から揮散可能な状態で、常圧下で５０℃以上、好ましくは５５℃以上或いは５０〜６０℃、更に好ましくは５５〜６０℃の温度条件で酵素反応を行う方法が例示される。 In the production method of the present invention, an enzymatic reaction with pyruvate decarboxylase is performed while distilling off the acetaldehyde to be produced. By carrying out the enzymatic reaction while distilling off the acetaldehyde thus produced, the pyruvate decarboxylase can be maintained stably without being inactivated, and even when low concentration pyruvic acid is used as a raw material, at a low distillation cost. Highly efficient production of a high concentration of acetaldehyde can be realized. The method for distilling off the acetaldehyde produced during the enzyme reaction is not particularly limited, but as a preferred example, in a state where pyruvic acid can be volatilized from the enzyme reaction solution, it is 50 ° C. or higher, preferably 55 ° C. or higher under normal pressure. The method of performing an enzyme reaction on 50-60 degreeC, More preferably, the temperature condition of 55-60 degreeC is illustrated.
また、後述する実施例に示すように、ピルビン酸が酵素反応溶液から揮散可能な状態で、常圧下で５０℃以上、特に好ましくは５５℃以上の温度条件であれば、効率的なアセトアルデヒドの製造が可能になる。一方、アセトアルデヒドの蒸気圧と沸点は、アントワン式で示されるlog10ＰCH3CHO＝7.0565−1070.6／(ｔCH3CHO＋236)［ＰCH3CHO：蒸気圧(mmHg)、ｔCH3CHO：沸点（℃）］の関係にあることを鑑みれば、圧力雰囲気が常圧でない場合であっても、反応温度を適切に制御することによって、実施例と同様に効率的なアセトアルデヒドの製造が可能になる。即ち、本発明の製造方法において、酵素反応中に生成したアセトアルデヒドを留去して効率的にアセトアルデヒドを製造するには、当該酵素反応の反応温度及び圧力雰囲気が下記式（A）を満たす環境下で実施すればよい。 Moreover, as shown in the Example mentioned later, if a temperature condition of 50 degreeC or more under normal pressure and especially preferably 55 degreeC or more is sufficient in the state which pyruvic acid can volatilize from an enzyme reaction solution, it is efficient manufacture of acetaldehyde Is possible. On the other hand, the vapor pressure and boiling point of acetaldehyde are related to the relationship of log 10 P CH3CHO = 7.0565-1070.6 / (t CH3CHO +236) [P CH3CHO : vapor pressure (mmHg), t CH3CHO : boiling point (° C)] expressed by the Antoine formula. In view of the fact, even when the pressure atmosphere is not normal pressure, by efficiently controlling the reaction temperature, it is possible to produce acetaldehyde efficiently as in the examples. That is, in the production method of the present invention, in order to efficiently produce acetaldehyde by distilling off the acetaldehyde generated during the enzyme reaction, the reaction temperature and pressure atmosphere of the enzyme reaction satisfy the following formula (A). It can be done with.
なお、上記式(A)は、アセトアルデヒドのアントワン式における沸点（ｔCH3CHO）に、[ｔ（反応温度）−29.8]を代入することにより導かれる式である。なお、ここで、[ｔ（反応温度）−29.8]は、常圧下でのアセトアルデヒドの製造に好適な温度条件の下限値（50℃）と常圧下でのアセトアルデヒド沸点（20.2℃）との差から算出される値である。 The above formula (A) is a formula derived by substituting [t (reaction temperature) −29.8] into the boiling point (t CH3CHO ) in the Antoine formula of acetaldehyde. Here, [t (reaction temperature) −29.8] is obtained from the difference between the lower limit (50 ° C.) of the temperature condition suitable for the production of acetaldehyde under normal pressure and the boiling point of acetaldehyde (20.2 ° C.) under normal pressure. This is a calculated value.
また、本発明の製造方法において、酵素反応の反応温度及び圧力雰囲気が下記式（B）を満たすことが特に好ましい。 Moreover, in the manufacturing method of this invention, it is especially preferable that the reaction temperature and pressure atmosphere of an enzyme reaction satisfy | fill following formula (B).
なお、上記式(B)は、アセトアルデヒドのアントワン式における沸点（ｔCH3CHO）に、[ｔ（反応温度）−34.8]を代入することにより導かれる式である。なお、ここで、[ｔ（反応温度）−34.8]]は、常圧下でのアセトアルデヒドの製造に特に好適な温度条件の下限値（55℃）と常圧下でのアセトアルデヒド沸点（20.2℃）との差から算出される値である。 The above formula (B) is a formula derived by substituting [t (reaction temperature) −34.8] into the boiling point (t CH3CHO ) in the Antoine formula of acetaldehyde. Here, [t (reaction temperature) -34.8] is the lower limit (55 ° C.) of the temperature condition particularly suitable for the production of acetaldehyde under normal pressure and the boiling point of acetaldehyde (20.2 ° C.) under normal pressure. It is a value calculated from the difference.
上記式(A)及び(B)において、反応温度(t)は、使用するピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が示される範囲であればよいが、通常4〜80℃の温度範囲内で設定される。 In the above formulas (A) and (B), the reaction temperature (t) may be in the range where the activity of the pyruvate decarboxylase used is shown, but is usually set within a temperature range of 4 to 80 ° C.
本発明の製造方法では、生成するアセトアルデヒドを留去しながら酵素反応を行う限り、該酵素反応の開始時のピルビン酸、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、チアミンピロフォスフェート、及びマグネシウムイオンの比率については適宜設定すればよいが、アセトアルデヒドの製造効率を高めるという観点から、以下の比率が例示される：ピルビン酸１モル当たり、ピルビン酸デカルボキシラーゼを1000〜1000000Ｕ、好ましくはピルビン酸１モル当たり、ピルビン酸デカルボキシラーゼを10000〜700000Ｕ、更に好ましくはピルビン酸１モル当たり、ピルビン酸デカルボキシラーゼを100000〜500000Ｕ。また、MgCl2は反応溶液中に0.5〜50 mM、好ましくは1〜20 mM、更に好ましくは3〜10 mM加えればよい。チアミンピロフォスフェートは、反応溶液中に0.01 〜5 mM、好ましくは0.05〜3 mM、さらに好ましくは0.1〜1 mMを加えればよい。 In the production method of the present invention, as long as the enzyme reaction is carried out while distilling off the generated acetaldehyde, the ratio of pyruvate, pyruvate decarboxylase, thiamine pyrophosphate, and magnesium ion at the start of the enzyme reaction is appropriately set. However, from the viewpoint of increasing the production efficiency of acetaldehyde, the following ratios are exemplified: 1000 to 100,000 U of pyruvate decarboxylase per 1 mol of pyruvate, preferably pyruvate decarboxylase per 1 mol of pyruvate From 10,000 to 700,000 U, more preferably from 100,000 to 500,000 U of pyruvate decarboxylase per mole of pyruvate. MgCl 2 may be added to the reaction solution at 0.5 to 50 mM, preferably 1 to 20 mM, more preferably 3 to 10 mM. Thiamine pyrophosphate may be added in an amount of 0.01 to 5 mM, preferably 0.05 to 3 mM, and more preferably 0.1 to 1 mM in the reaction solution.
ここで、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性単位は、下記の条件で１分間に１μmolのNADHを酸化する活性を１Ｕとする。なお、NADHの分子吸光係数は6.22 mM-1cm-1とする。
基質溶液：10 mM ピルビン酸カリウム、0.1 mM チアミンピロフォスフェート、5 mM 塩化マグネシウム、0.15 mM NADH、10 Uアルコールデヒドロゲナーゼ（酵母由来, 和光純薬製cat. No.300-50021）を含む酢酸緩衝液(測定対象のピルビン酸デカルボキシラーゼの至適pHに調整)を調製する。
測定プロトコール：
（１）光路長10mmのキュベットに上記基質溶液1mlをとり、50℃で３分間プレインキュベートする。
（２）酵素溶液を１〜５ml混合し、340 nmにおける吸光度の減少（NADHの減少量）を測定することで、ピルビン酸デカルボキシラーゼによってピルビン酸より生成したアセトアルデヒドの生成速度を測定する。
Here, the activity unit of pyruvate decarboxylase is defined as 1 U that oxidizes 1 μmol of NADH per minute under the following conditions. The molecular extinction coefficient of NADH is 6.22 mM -1 cm -1 .
Substrate solution: acetate buffer containing 10 mM potassium pyruvate, 0.1 mM thiamine pyrophosphate, 5 mM magnesium chloride, 0.15 mM NADH, 10 U alcohol dehydrogenase (derived from yeast, cat. No. 300-50021, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Adjusted to the optimum pH of the pyruvate decarboxylase to be measured).
Measurement protocol:
(1) Take 1 ml of the substrate solution in a cuvette with an optical path length of 10 mm and preincubate at 50 ° C. for 3 minutes.
(2) 1 to 5 ml of the enzyme solution is mixed, and the reduction rate of absorbance at 340 nm (decrease amount of NADH) is measured to measure the production rate of acetaldehyde produced from pyruvic acid by pyruvate decarboxylase.
また、本発明の製造方法において、ピルビン酸をアセトアルデヒドに変換する酵素反応は、水溶液中で実施される。酵素反応開始時のピルビン酸濃度については、特に制限されるものではないが、0.01〜10重量％、好ましくは0.05〜5重量％、更に好ましくは0.07〜0.2重量％となるように設定すればよい。また、酵素反応が行われる水溶液のｐＨ条件についても特に制限されるものではなく、使用するピルビン酸をピルビン酸デカルボキシラーゼの作用可能なｐＨ範囲、好ましくは至適ｐＨに設定すればよい。 In the production method of the present invention, the enzyme reaction for converting pyruvic acid to acetaldehyde is carried out in an aqueous solution. The pyruvic acid concentration at the start of the enzyme reaction is not particularly limited, but may be set to 0.01 to 10% by weight, preferably 0.05 to 5% by weight, and more preferably 0.07 to 0.2% by weight. . Further, the pH condition of the aqueous solution in which the enzyme reaction is performed is not particularly limited, and the pyruvic acid to be used may be set to a pH range in which pyruvic acid decarboxylase can act, preferably an optimum pH.
本発明の製造方法における酵素反応の形式についても特に制限されず、原料を仕込んだ後にバッチ形式で酵素反応を実施してもよく、またピルビン酸デカルボキシラーゼを含む水溶液中に、ピルビン酸、チアミンピロフォスフェート、及びマグネシウム塩を流加させながら酵素反応を実施してもよい。 The form of the enzyme reaction in the production method of the present invention is not particularly limited, and the enzyme reaction may be carried out in a batch form after charging the raw materials. In addition, pyruvic acid, thiamine pyrol in an aqueous solution containing pyruvic acid decarboxylase may be used. The enzymatic reaction may be carried out while feeding phosphate and magnesium salt.
本発明の製造方法では、留去されたアセトアルデヒドを回収することにより、目的物であるアセトアルデヒドが得られる。留去されたアセトアルデヒドは、公知の方法によって回収することができる。例えば、留去されたアセトアルデヒドを含む気体を冷却して、液化したアセトアルデヒドを回収することによって、アセトアルデヒドを得ることができる。
２．エタノールの製造方法
本発明は、上記アセトアルデヒドの製造方法を利用して、更に、ピルビン酸から酵素反応によりエタノールを製造する方法についても提供する。具体的には、本発明では、下記工程(1)及び(2)を経ることによって、エタノールの製造が実現される。
(1)ピルビン酸にピルビン酸デカルボキシラーゼを作用させる酵素反応において、生成するアセトアルデヒドを留去しながら該酵素反応を行うことにより、アセトアルデヒドを得る工程、及び
(2)前記工程(1)で得られたアセトアルデヒドにエタノールデヒドロゲナーゼを作用させて、エタノールを得る工程。
In the production method of the present invention, the target acetaldehyde is obtained by recovering the distilled off acetaldehyde. The acetaldehyde distilled off can be recovered by a known method. For example, acetaldehyde can be obtained by cooling a gas containing distilled acetaldehyde and recovering liquefied acetaldehyde.
2. Method for Producing Ethanol The present invention further provides a method for producing ethanol from pyruvic acid by an enzymatic reaction using the method for producing acetaldehyde. Specifically, in the present invention, ethanol can be produced through the following steps (1) and (2).
(1) In an enzyme reaction in which pyruvate decarboxylase is allowed to act on pyruvate, a step of obtaining acetaldehyde by performing the enzyme reaction while distilling off the generated acetaldehyde; and
(2) A step of obtaining ethanol by causing ethanol dehydrogenase to act on the acetaldehyde obtained in the step (1).
上記工程(1)は、前述するアセトアルデヒドの製造方法と同じ条件で実施される。 The step (1) is carried out under the same conditions as in the acetaldehyde production method described above.
また、上記工程(2)は、エタノールデヒドロゲナーゼを利用して、上記工程(1)で得られたアセトアルデヒドをエタノールに変換することにより実施される。エタノールデヒドロゲナーゼを利用してアセトアルデヒドをエタノールに変換するには、補酵素としてNADHが必要である。ここで、エタノールデヒドロゲナーゼ自体は公知であり、またエタノールデヒドロゲナーゼを利用してアセトアルデヒドをエタノールに変換する方法についても公知であるので、上記工程(2)は、公知の反応条件に従って実施することができる。 The step (2) is performed by converting the acetaldehyde obtained in the step (1) into ethanol using ethanol dehydrogenase. In order to convert acetaldehyde into ethanol using ethanol dehydrogenase, NADH is required as a coenzyme. Here, since ethanol dehydrogenase itself is known and a method for converting acetaldehyde into ethanol using ethanol dehydrogenase is also known, the above step (2) can be carried out according to known reaction conditions.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例
0.1 M酢酸緩衝液（pH6.0）に、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（配列番号１のアミノ酸配列からなる酵素、Zymobacter palmae由来、至適温度60℃、至適pH6.0、配列番号２に示す塩基配列の遺伝子をpET21dにクローニングし大腸菌にて発現させた）を2.7Ｕ／ｍｌ、チアミンピロフォスフェートを0.1 mM、MgCl2を5 mM、ピルビン酸を１０ｍＭとなるように添加し、常圧下で、３０、４０、５０又は５５℃の温度条件で５分間緩やかに振とう（50rpm）して、酵素反応を行った。なお、反応液から生成するアセトアルデヒドが揮散により留去されるように、酵素反応を行う容器を設定しておき、酵素反応中に留去されたアルデヒドを冷却することにより、アセトアルデヒドを液化させて回収した。
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples, but the present invention is not limited thereto.
Example
In 0.1 M acetate buffer (pH 6.0), pyruvate decarboxylase (enzyme consisting of amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, derived from Zymobacter palmae, optimal temperature 60 ° C., optimal pH 6.0, base sequence shown in SEQ ID NO: 2) Was cloned into pET21d and expressed in E. coli) at 2.7 U / ml, thiamine pyrophosphate 0.1 mM, MgCl 2 5 mM, and
反応終了後、残存しているピルビン酸デカルボキシラーゼの活性を測定した。ここで、ピルビン酸デカルボキシラーゼの残存活性は、上記反応を行った反応液５μlと0.1M酢酸緩衝液pH6.0、0.15 mM NADH、チアミンピロフォスフェートを0.1 mM、MgCl2を5 mM、アルコールデヒドロゲナーゼ（酵母由来）を混合し、40℃でプレインキュベーションして、溶液中のピルビン酸、アセトアルデヒドを完全に消費させた後、ピルビン酸（終濃度10 mM）を加え、340 nmにおける吸光度の減少を測定することにより求めた。更に、残存しているピルビン酸濃度についても測定した。なお、ピルビン酸濃度の測定は、乳酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＨを用いる吸光度分析法により行った。
After completion of the reaction, the activity of the remaining pyruvate decarboxylase was measured. Here, the remaining activity of pyruvate decarboxylase is 5 μl of the reaction solution in which the above reaction was performed, 0.1 M acetate buffer pH 6.0, 0.15 mM NADH, thiamine pyrophosphate 0.1 mM, MgCl 2 5 mM, alcohol dehydrogenase. (Yeast-derived) was mixed and preincubated at 40 ° C to completely consume pyruvic acid and acetaldehyde in the solution. Then, pyruvic acid (
ピルビン酸濃度及びピルビン酸デカルボキシラーゼの活性の測定結果を図１及び２にそれぞれ示す。図２から明らかなように、いずれの温度条件でも、ピルビン酸濃度が減少しており、アセトアルデヒドが製造できていることが確認された。但し、図１に示されるように、反応温度が４０℃以下では、反応開始後５分に既にピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が５％以上損なわれており、長時間の酵素反応には不向きであることが確認された。これは、生成したアセトアルデヒドが反応液中から速やかに留去されなかったことに起因していると推測される。これに対して、反応温度が５０℃以上では、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が殆ど損なわれておらず、長時間の酵素反応も可能であり、工業的な実施にも適用可能であることが明らかとなった。特に、反応温度が５０℃以上の場合において、ピルビン酸の残存濃度が低く、アセトアルデヒドが多く生成しているにも拘わらず、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が殆ど失われていないことは特筆すべき意外な効果であり、これは、生成したアセトアルデヒドが速やかに留去されていることに起因していると考えられる。 The measurement results of pyruvate concentration and pyruvate decarboxylase activity are shown in FIGS. 1 and 2, respectively. As is clear from FIG. 2, it was confirmed that the pyruvic acid concentration was reduced and acetaldehyde could be produced under any temperature condition. However, as shown in FIG. 1, when the reaction temperature is 40 ° C. or less, the activity of pyruvate decarboxylase is already impaired by 5% or more 5 minutes after the start of the reaction, which is not suitable for a long-time enzyme reaction. It was confirmed. This is presumed to be due to the fact that the generated acetaldehyde was not quickly distilled off from the reaction solution. On the other hand, when the reaction temperature is 50 ° C. or higher, it is clear that the activity of pyruvate decarboxylase is hardly impaired, long-time enzyme reaction is possible, and it can be applied to industrial implementation. It became. In particular, when the reaction temperature is 50 ° C. or higher, it is notable that the activity of pyruvate decarboxylase is hardly lost even though the residual concentration of pyruvate is low and a large amount of acetaldehyde is produced. This is considered to be due to the fact that the generated acetaldehyde is rapidly distilled off.
比較例
0.1M酢酸緩衝液（pH6.0）に、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（配列番号１のアミノ酸配列からなる酵素、Zymobacter palmae由来、至適温度60℃、至適pH6.0、配列番号２に示す塩基配列の遺伝子をpET21dにクローニングし大腸菌にて発現させた）を2.7Ｕ／ｍｌ、チアミンピロフォスフェートを0.1 mM、MgCl2を5 mM、及びピルビン酸を１０ｍＭとなるように添加し、常圧下で、３０、４０、５０又は５５℃の温度条件で５分間静置して、酵素反応を行った。なお、本酵素反応中は、酵素反応を行う容器を密閉状態にして、反応液から生成するアセトアルデヒドが揮散されないように設定した。
Comparative example
In 0.1M acetate buffer (pH 6.0), pyruvate decarboxylase (enzyme consisting of amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, derived from Zymobacter palmae, optimal temperature 60 ° C, optimal pH 6.0, nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2) Was cloned in pET21d and expressed in E. coli) at 2.7 U / ml, thiamine pyrophosphate 0.1 mM, MgCl 2 5 mM, and
反応終了後、上記実施例と同様に、残存しているピルビン酸デカルボキシラーゼの活性について測定した。 After the reaction was completed, the remaining pyruvate decarboxylase activity was measured in the same manner as in the above example.
ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性の測定結果を図３に示す。この結果、いずれの温度条件においても、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が損なわれていた。特に、５０℃以上の温度条件では、ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が著しく消失していた。即ち、本結果から、アセトアルデヒドを留去することなくピルビン酸デカルボキシラーゼを利用してアセトアルデヒドの製造（従来法）を行っても、反応開始５分という短時間でピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が損なわれることが確認され、工業的には実用化できないことが明らかとなった。 The measurement result of the activity of pyruvate decarboxylase is shown in FIG. As a result, the activity of pyruvate decarboxylase was impaired under any temperature condition. In particular, the activity of pyruvate decarboxylase was significantly lost at a temperature of 50 ° C. or higher. That is, from this result, even if the production of acetaldehyde (conventional method) using pyruvate decarboxylase without distilling off acetaldehyde, the activity of pyruvate decarboxylase is impaired in a short time of 5 minutes from the start of the reaction. As a result, it became clear that it could not be put into practical use industrially.
Claims (5)
(1) ピルビン酸にピルビン酸デカルボキシラーゼを作用させる酵素反応において、生成したアセトアルデヒドを留去しながら該酵素反応を行うことにより、アセトアルデヒドを得る工程、及び
(2)前記工程で得られたアセトアルデヒドにエタノールデヒドロゲナーゼを作用させて、エタノールを得る工程。 A method for producing ethanol from pyruvic acid by an enzymatic reaction,
(1) In an enzyme reaction in which pyruvate decarboxylase is allowed to act on pyruvate, a step of obtaining acetaldehyde by performing the enzyme reaction while distilling off the generated acetaldehyde; and
(2) A step of obtaining ethanol by causing ethanol dehydrogenase to act on the acetaldehyde obtained in the above step.
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