JP2009534424A - GLP-1 compound / glucagon antibody composition - Google Patents

GLP-1 compound / glucagon antibody composition Download PDF

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Abstract

ＧＬＰ−１化合物に結合された、グルカゴンに結合する抗体を含む組成物、ならびに被験体において、例えば、代謝障害を処置するため、インスリン発現を増強するため、およびインスリン分泌を促進するために該組成物を使用する方法が提供される。このような方法は、例えば、糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、種々の脂質障害、肥満症、心血管疾患および骨障害を処置するために用いられ得る。いくつかの組成物では、抗体は、（ｉ）重鎖可変領域、および（ｉｉ）軽鎖可変領域を含み、ＧＬＰ−１化合物は該重鎖可変領域または該軽鎖可変領域に結合される。A composition comprising an antibody that binds to glucagon, coupled to a GLP-1 compound, and the composition in a subject, for example, to treat metabolic disorders, enhance insulin expression, and promote insulin secretion A method of using the object is provided. Such methods can be used, for example, to treat diabetes, impaired glucose tolerance, insulin resistance, various lipid disorders, obesity, cardiovascular disease and bone disorders. In some compositions, the antibody comprises (i) a heavy chain variable region and (ii) a light chain variable region, wherein a GLP-1 compound is bound to the heavy chain variable region or the light chain variable region.

Description

（関連出願の参照）
本願は、米国仮特許出願６０／７９３，６９０号（２００６年４月２０日出願）（これは、全ての目的のためにその全体が本明細書に参考として援用される）に基づく利益を主張する。 (Refer to related applications)
This application claims benefit based on US Provisional Patent Application No. 60 / 793,690 (filed Apr. 20, 2006), which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes. To do.

（背景）
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）および関連ペプチドグルカゴンは、プログルカゴンの分化プロセシングにより産生され、相反する生物活性を有する。プログルカゴン自体は、膵臓のα細胞ならびに主に遠位小腸および結腸に位置する腸内分泌Ｌ細胞において産生される。膵臓ではグルカゴンはプログルカゴンから選択的に切断される。腸では対照的に、プログルカゴンはプロセシングされてＧＬＰ−１およびグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）を形成し、これらはそれぞれ、プログルカゴンのアミノ酸残基７８〜１０７および１２６〜１５８に対応する（例えば、非特許文献１ならびに非特許文献２を参照）。従来、ＧＬＰ−１のアミノ酸の番号付けは、プログルカゴンの切断から形成されるＧＬＰ−１（１−３７）に基づいている。生物学的活性型はこのペプチドの更なるプロセシングから生成され、これは、１つの番号付け表記ではＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨおよびＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２を生成する。ＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨ（または単にＧＬＰ−１（７−３７））およびＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２は同じ活性を有する。便宜上、「ＧＬＰ−１」という用語はこれらの両形態を指すために用いられる。この番号付け表記では、これらのプロセシングされたペプチドの最初のアミノ酸はＨｉｓ７である。しかし、当該分野で認識されている別の番号付け表記では、プロセシングされたペプチドの番号付けが位置７ではなく位置１としてＨｉｓから開始すると想定している。従って、この番号付けスキームでは、ＧＬＰ−１（１−３１）はＧＬＰ−１（７−３７）と同じであり、ＧＬＰ−１（１−３０）はＧＬＰ−１（７−３６）と同じである。 (background)
Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) and related peptides glucagon are produced by the differentiation processing of proglucagon and have conflicting biological activities. Proglucagon itself is produced in pancreatic alpha cells and enteroendocrine L cells located primarily in the distal small intestine and colon. In the pancreas, glucagon is selectively cleaved from proglucagon. In contrast to the gut, proglucagon is processed to form GLP-1 and glucagon-like peptide 2 (GLP-2), which correspond to amino acid residues 78-107 and 126-158 of proglucagon, respectively ( For example, see Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2.) Traditionally, the amino acid numbering of GLP-1 is based on GLP-1 (1-37) formed from cleavage of proglucagon. The biologically active form is generated from further processing of this peptide, which in one numbering notation generates GLP-1 (7-37) -OH and GLP-1 (7-36) -NH 2 . GLP-1 (7-37) -OH (or simply GLP-1 (7-37)) and GLP-1 (7-36) -NH 2 have the same activity. For convenience, the term “GLP-1” is used to refer to both of these forms. In this numbering notation, the first amino acid of these processed peptides is His7. However, another numbering notation recognized in the art assumes that the numbering of the processed peptide starts at His as position 1 instead of position 7. Thus, in this numbering scheme, GLP-1 (1-31) is the same as GLP-1 (7-37) and GLP-1 (1-30) is the same as GLP-1 (7-36). is there.

グルカゴンは低血糖に応答して膵臓のα細胞から分泌され、グルカゴンの主要な標的器官は肝臓である。グルカゴンはグリコーゲンの分解を刺激し、グリコーゲンの生合成を抑制する。また、グルカゴンは脂肪酸の合成を抑制するが、グルコース新生を促進する。これらの作用の最終結果は、肝臓へのグルコースの放出を大いに増大させることになる。対照的に、ＧＬＰ−１はグルカゴン分泌を低下させると同時に、腸による栄養素の吸収に応答してインスリン分泌、グルコース取込およびサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成を刺激する。様々な臨床データがこれらの活性のエビデンスを提供している。例えば、管理不良の２型糖尿病患者へのＧＬＰ投与は、空腹時血中グルコース濃度を正常化した（例えば、非特許文献３を参照）。   Glucagon is secreted from pancreatic alpha cells in response to hypoglycemia, and the main target organ for glucagon is the liver. Glucagon stimulates glycogen degradation and inhibits glycogen biosynthesis. Glucagon also inhibits fatty acid synthesis but promotes gluconeogenesis. The end result of these effects will greatly increase the release of glucose into the liver. In contrast, GLP-1 decreases glucagon secretion while simultaneously stimulating insulin secretion, glucose uptake and cyclic AMP (cAMP) formation in response to nutrient absorption by the intestine. Various clinical data provide evidence of these activities. For example, administration of GLP to a poorly managed type 2 diabetic patient normalized the fasting blood glucose concentration (see, for example, Non-Patent Document 3).

ＧＬＰ−１は他の多くの重要な活性を有する。例えば、ＧＬＰ−１は胃運動および胃液分泌も抑制する（例えば、非特許文献４を参照）。この作用は、時として、回腸ブレーキ作用と称され、栄養素の可用性の遅滞期をもたらし、従って、迅速なインスリン応答の必要性を大いに低減する。   GLP-1 has many other important activities. For example, GLP-1 also suppresses gastric motility and gastric juice secretion (see, for example, Non-Patent Document 4). This action, sometimes referred to as the ileal braking action, results in a lag phase of nutrient availability, thus greatly reducing the need for a rapid insulin response.

ＧＬＰ−１が細胞の分化および複製を促進することもでき、これは次に、膵島細胞の保持およびβ細胞量の増加に役立つことが諸研究により示されている（例えば、非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８を参照）。ＧＬＰ−１が満腹感を高め、食物摂取を減少させることができるということもエビデンスが示している（例えば、非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１を参照）。   Studies have shown that GLP-1 can also promote cell differentiation and replication, which in turn helps to maintain islet cells and increase β-cell mass (eg, Non-Patent Document 5; Non-Patent Document 6; Non-Patent Document 7; and Non-Patent Document 8). Evidence also indicates that GLP-1 can increase satiety and reduce food intake (see, for example, Non-Patent Document 9; Non-Patent Document 10; Non-Patent Document 11).

他の研究では、ＧＬＰ−１がＧＬＵＴ−１トランスポーター、インスリン受容体およびヘキソキナーゼ−１を含むβ細胞特異的遺伝子を誘導することを示している（例えば、非特許文献１２を参照）。このような誘導は加齢に関連する耐糖能障害を食い止め得る。   Other studies have shown that GLP-1 induces β-cell specific genes including GLUT-1 transporter, insulin receptor and hexokinase-1 (see, for example, Non-Patent Document 12). Such induction can stop the glucose intolerance associated with aging.

ＧＬＰ−１は代謝恒常性の調節に重要な役割を果たすので、糖尿病、肥満症および代謝症候群を含む様々な代謝障害を処置するための魅力的な標的である。現行の糖尿病の処置はインスリン注射およびスルホニル尿素の投与を含む。しかし、両手法は重要な欠点を有する。例えば、インスリン注射は複雑な投与留意点を要し、スルホニル尿素による処置は経時的に効果を失うことが多い。ＧＬＰ−１療法の潜在的利点は、１）インスリン分泌が高血糖に依存するので、安全性の向上、２）グルカゴン分泌の抑制とそれに続く過剰のグルコース排出の抑制、ならびに３）胃排出の緩徐化とそれに続く栄養素吸収の緩徐化および突発的なグルコース増加の防止を含む。   Because GLP-1 plays an important role in the regulation of metabolic homeostasis, it is an attractive target for treating a variety of metabolic disorders including diabetes, obesity and metabolic syndrome. Current treatments for diabetes include insulin injections and administration of sulfonylureas. However, both approaches have significant drawbacks. For example, insulin injection requires complex dosing considerations, and treatment with sulfonylurea often loses effectiveness over time. The potential benefits of GLP-1 therapy are 1) increased safety because insulin secretion depends on hyperglycemia, 2) suppression of glucagon secretion and subsequent suppression of excessive glucose excretion, and 3) slow gastric emptying. And subsequent slowing of nutrient absorption and prevention of sudden increases in glucose.

しかし、ＧＬＰ−１による有効な処置の主要な障害は、ペプチドの非常に短い半減期であり、通常、これはわずか数分である（例えば、非特許文献１３を参照）。分子の半減期を延ばすことを目的に様々な類似体が開発されてきた。しかし、これらの一部は嘔吐および悪心を含む重大な消化管副作用を有する（例えば、非特許文献１４を参照）。
ＩｒｗｉｎおよびＷｏｎｇ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９：２６７−２７７ Ｂｅｌｌら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０４：３６８−３７１ Ｇｕｔｎｉａｋら、１９９２，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：１３１６−１３２２ Ｔｏｌｅｓｓａ，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：７６４−７７４ Ａｎｄｒｅａｓｅｎら、１９９４，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ５５：２２１−２２８ Ｗａｎｇら、１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２８８３−２８８９ Ｍｏｊｓｏｖ，１９９２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．４０：３３３−３４３ Ｘｕら、１９９９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８：２２７０−２２７６ Ｔｏｆｔ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２２：１１３７−１１４３ Ｆｌｉｎｔら、１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：５１５−５２０ Ｇｕｔｓｗｉｌｌｅｒら、１９９９ Ｇｕｔ ４４：８１−８６ ＰｅｒｆｅｔｔｉおよびＭｅｒｋｅｌ，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４３：７１７−７２５ Ｈｏｌｓｔ，１９９４，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０７：１８４８−１８５５ Ａｇｅｒｓｏら、２００２，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４５：１９５−２０２ However, a major obstacle to effective treatment with GLP-1 is the very short half-life of the peptide, which is usually only a few minutes (see, eg, Non-Patent Document 13). Various analogs have been developed with the aim of extending the half-life of the molecule. However, some of these have serious gastrointestinal side effects including vomiting and nausea (see, for example, Non-Patent Document 14).
Irwin and Wong, 1995, Mol. Endocrinol. 9: 267-277 Bell et al., 1983, Nature 304: 368-371. Gutniak et al., 1992, New Eng. J. et al. Med. 326: 1316-1322. Tolessa, 1998, J. MoI. Clin. Invest. 102: 764-774 Andrewsen et al., 1994, Digestion 55: 221-228 Wang et al., 1997, J. MoI. Clin. Invest. 99: 2883-2889 Mojsov, 1992, Int. J. et al. Pep. Prot. Res. 40: 333-343 Xu et al., 1999, Diabetes 48: 2270-2276. Toft-Nielsen et al., 1999, Diabetes Care 22: 1137-1143 Flint et al., 1998, J. MoI. Clin. Invest. 101: 515-520 Gutswiller et al., 1999 Gut 44: 81-86 Perfetti and Merkel, 2000, Eur. J. et al. Endocrinol. 143: 717-725 Holst, 1994, Gastroenterology 107: 1848-1855 Agerso et al., 2002, Diabetologia 45: 195-202.

従って、糖尿病、肥満症および代謝症候群のような様々な代謝疾患の処置に用いる、ＧＬＰ−１型活性を有する改良された分子の必要性が依然として存在する。   Thus, there remains a need for improved molecules with GLP-1 type activity for use in the treatment of various metabolic diseases such as diabetes, obesity and metabolic syndrome.

（要旨）
ＧＬＰ−１化合物に結合した抗グルカゴン抗体を含む組成物が提供される。いくつかの組成物では、抗体はヒトグルカゴンに特異的に結合する。有効量の組成物を投与することによって種々の疾患を処置するための方法も提供される。このような方法は、例えば、糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、種々の脂質障害、肥満症、心血管疾患および骨障害を処置するために用いられ得る。 (Summary)
Compositions comprising an anti-glucagon antibody conjugated to a GLP-1 compound are provided. In some compositions, the antibody specifically binds human glucagon. Also provided are methods for treating various diseases by administering an effective amount of the composition. Such methods can be used, for example, to treat diabetes, impaired glucose tolerance, insulin resistance, various lipid disorders, obesity, cardiovascular disease and bone disorders.

例えば、いくつかの組成物は、グルカゴンに結合する抗体およびグルカゴンに結合する抗体に結合したＧＬＰ−１化合物を含み、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を有する。いくつかの組成物では、抗体は、（ｉ）重鎖可変領域、および（ｉｉ）軽鎖可変領域を含み、ＧＬＰ−１化合物は該重鎖可変領域または該軽鎖可変領域に結合される。いくつかの組成物では、ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端は軽鎖可変領域のアミノ末端に結合し、かつ／あるいはＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端は重鎖可変領域のアミノ末端に結合される。   For example, some compositions comprise an antibody that binds glucagon and a GLP-1 compound bound to an antibody that binds glucagon, wherein the GLP-1 compound has GLP-1 activity. In some compositions, the antibody comprises (i) a heavy chain variable region and (ii) a light chain variable region, wherein a GLP-1 compound is bound to the heavy chain variable region or the light chain variable region. In some compositions, the carboxy terminus of the GLP-1 compound is attached to the amino terminus of the light chain variable region and / or the carboxy terminus of the GLP-1 compound is attached to the amino terminus of the heavy chain variable region.

様々なＧＬＰ−１化合物が抗グルカゴン抗体に結合され得る。一態様では、本明細書で提供される組成物中のＧＬＰ−１化合物は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１ペプチドを含む。   Various GLP-1 compounds can be conjugated to anti-glucagon antibodies. In one aspect, the GLP-1 compound in the compositions provided herein comprises a GLP-1 peptide having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 1 and having GLP-1 activity.

特定の組成物では、ＧＬＰ−１化合物は式Ｉのアミノ酸配列（配列番号９２）：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１（式Ｉ、配列番号９２）
を含み、式中、
Ｒ１はＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
位置１におけるＸａａは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンであり；
位置２におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ｂＡｌａ（２−アミノプロピオン酸）、Ａｓｐ、Ａｌａ、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、２−アミノイソ酪酸またはα−α−二置換アミノ酸であり；
位置３におけるＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり；
位置５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置６におけるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
位置７におけるＸａａはＴｈｒまたはＧｌｙであり；
位置８におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置９におけるＸａａは、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり；
位置１０におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
位置１１におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置１２におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１３におけるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１４におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１５におけるＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１６におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１７におけるＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１８におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１９におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２０におけるＸａａは、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２１におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２２におけるＸａａは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２３におけるＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２４におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２５におけるＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２６におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置２７におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２８におけるＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
位置２９におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３０におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
位置３１におけるＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３２におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓであるか、あるいは省略され；
位置３３におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであるか、あるいは省略され；
位置３４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｔｈｒであるか、あるいは省略され；
位置３５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３６におけるＸａａはＧｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３７におけるＸａａはＧｌｙであるか、あるいは省略され；
但し、位置３２、３３、３４、３５、３６または３７におけるアミノ酸が省略される場合、該アミノ酸の各アミノ酸下流も省略され、化合物はＧＬＰ−１活性を有する。 In certain compositions, the GLP-1 compound has the amino acid sequence of Formula I (SEQ ID NO: 92):
Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Xaa 4 -Xaa 5 -Xaa 6 -Xaa 7 -Xaa 8 -Xaa 9 -Xaa 10 -Xaa 11 -Xaa 12 -Xaa 13 -Xaa 14 -Xaa 15 -Xaa 16 -Xaa 17 -Xaa 18 -Xaa 19 -Xaa 20 -Xaa 21 -Xaa 22 -Xaa 23 -Xaa 24 -Xaa 25 -Xaa 26 -Xaa 27 -Xaa 28 -Xaa 29 -Xaa 30 -Xaa 31 -Xaa 32 -Xaa 33 -Xaa 34 -Xaa 35 -Xaa 36 -Xaa 37 -C (O) -R 1 (Formula I, SEQ ID NO: 92)
Including
R 1 is OR 2 or NR 2 R 3 ;
R 2 and R 3 are independently hydrogen or (C 1 -C 8 ) alkyl;
Xaa at position 1 is L-histidine, D-histidine, desamino-histidine, 2-amino-histidine, 3-hydroxy-histidine, homohistidine, α-fluoromethyl-histidine or α-methyl-histidine;
Xaa at position 2 is Gly, bAla (2-aminopropionic acid), Asp, Ala, 1-amino-cyclopentanecarboxylic acid, 2-aminoisobutyric acid or α-α-disubstituted amino acid;
Xaa at position 3 is Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 4 is Gly, Thr or His;
Xaa at position 5 is Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 6 is His, Trp, Phe or Tyr;
Xaa at position 7 is Thr or Gly;
Xaa at position 8 is Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 9 is Asp, Asn or Glu;
Xaa at position 10 is Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp or Lys;
Xaa at position 11 is Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 12 is Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid Or homoglutamic acid;
Xaa at position 13 is Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 14 is Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr, Asn, Gln, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid or Homoglutamic acid;
Xaa at position 15 is Glu, Asp, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 16 is Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid Yes;
Xaa at position 17 is Gln, Asn, Arg, Glu, Asp, Lys, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 18 is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homo Glutamic acid;
Xaa at position 19 is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid Yes;
Xaa at position 20 is Lys, homolysine, Arg, Gln, Glu, Asp, Thr, His, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 21 is Leu, Glu, Asp, Thr, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 22 is Phe, Trp, Asp, Glu, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 23 is Ile, Leu, Val, Ala, Phe, Asp, Glu, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 24 is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 25 is Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp, Asn or Lys;
Xaa at position 26 is Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 27 is Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp, Asn or Lys;
Xaa at position 28 is Asn, Lys, Arg, Glu, Asp or His;
Xaa at position 29 is Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 30 is Gly, Arg, Lys, Glu, Asp, Thr, Asn or His;
Xaa at position 31 is Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 32 is Thr, Gly, Asn, Ser, Lys or omitted;
Xaa at position 33 is Gly, Asn, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Leu, Phe, Pro or omitted;
Xaa at position 34 is Gly, Thr or omitted;
Xaa at position 35 is Thr, Asn, Gly or is omitted;
Xaa at position 36 is Gly or omitted;
Xaa at position 37 is Gly or omitted;
However, when an amino acid at position 32, 33, 34, 35, 36 or 37 is omitted, the amino acid downstream of the amino acid is also omitted, and the compound has GLP-1 activity.

従って、いくつかの組成物中のＧＬＰ−１化合物は、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含む。   Thus, the GLP-1 compound in some compositions comprises any amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-35, SEQ ID NO: 126 or SEQ ID NO: 127.

いくつかの組成物では、本明細書で提供される組成物の一部である抗体は：
（ａ）（ｉ）配列番号７６と少なくとも６０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号７７と少なくとも６０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号７８と少なくとも６０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ；
（ｂ）（ｉ）配列番号８４と少なくとも６０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号８５と少なくとも６０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号８６と少なくとも６０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ；あるいは
（ｃ）（ａ）の１つ以上のＬＣ ＣＤＲならびに（ｂ）の１つ以上のＨＣ ＣＤＲ；
を含む。抗体は、（ａ）および（ｂ）における上記一覧のＣＤＲから２、３、４、５または全６個のＣＤＲを含み得る。 In some compositions, the antibodies that are part of the compositions provided herein are:
(A) (i) LC CDR1 having at least 60% sequence identity with SEQ ID NO: 76; (ii) LC CDR2 having at least 60% sequence identity with SEQ ID NO: 77; and (iii) at least SEQ ID NO: 78 with One or more light chain (LC) CDRs selected from the group consisting of LC CDR3 having 60% sequence identity;
(B) (i) HC CDR1 having at least 60% sequence identity with SEQ ID NO: 84; (ii) HC CDR2 having at least 60% sequence identity with SEQ ID NO: 85; and (iii) at least with SEQ ID NO: 86 One or more heavy chain (HC) CDRs selected from the group consisting of HC CDR3 having 60% sequence identity; or (c) one or more LC CDRs of (a) and one or more of (b) HC CDRs of
including. The antibody may comprise 2, 3, 4, 5 or a total of 6 CDRs from the above listed CDRs in (a) and (b).

特定の組成物では、組成物の一部である抗体は：
（ａ）（ｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＬＣ ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＬＣ ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＬＣ ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上のＬＣ ＣＤＲ；
（ｂ）（ｉ）配列番号８４に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号８５に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上のＨＣ ＣＤＲ；あるいは
（ｃ）（ａ）の１つ以上のＬＣ ＣＤＲならびに（ｂ）の１つ以上のＨＣ ＣＤＲ
を含む抗体を含む。抗体は、（ａ）および（ｂ）における上記一覧のＣＤＲから２、３、４、５または全６個のＣＤＲを含み得る。 In certain compositions, antibodies that are part of the composition:
(A) (i) LC CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76; (ii) LC CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77; and (iii) LC having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 78 One or more LC CDRs selected from the group consisting of CDR3;
(B) (i) HC CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 84; (ii) HC CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 85; and (iii) HC having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 86 One or more HC CDRs selected from the group consisting of CDR3; or (c) one or more LC CDRs of (a) and one or more HC CDRs of (b)
Including antibodies. The antibody may comprise 2, 3, 4, 5 or a total of 6 CDRs from the above listed CDRs in (a) and (b).

いくつかの例では、組成物の抗体は、配列番号７８のアミノ酸配列を有するＬＣ ＣＤＲ３および／または配列番号８６のアミノ酸配列を有するＨＣ ＣＤＲ３を含む。他の組成物では、抗体は、（ａ）および（ｂ）における上記一覧のＣＤＲから少なくとも２または３つのＣＤＲを含み得る。   In some examples, the antibody of the composition comprises LC CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78 and / or HC CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86. In other compositions, the antibody may comprise at least 2 or 3 CDRs from the above listed CDRs in (a) and (b).

特定の組成物は、（ａ）配列番号７９と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；または（ｂ）配列番号８３と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；または（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨを含む抗体を含む。このような組成物中の抗体は２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなり得る。   Certain compositions comprise (a) a light chain variable region (VL) having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 79; or (b) a heavy chain variable having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 83. Region (VH); or (c) an antibody comprising (a) VL and (b) VH. The antibody in such a composition can consist of two identical VHs and two identical VLs.

いくつかの組成物では、抗体は、（ａ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖；（ｂ）配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖；または（ｃ）配列番号４１〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ならびに配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。   In some compositions, the antibody comprises (a) a light chain comprising any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 40-81; (b) a heavy chain comprising any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 39 or 82-91; or ( c) including a light chain comprising any amino acid sequence of SEQ ID NO: 41-81 and a heavy chain comprising any amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 or 82-91.

ＧＬＰ−１類似体に結合したグルカゴン結合抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドも本明細書で提供される。特定のこのようなポリペプチドは配列番号４１〜７４の任意のアミノ酸配列を有する。本発明は、更に、配列番号４１〜７４の任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を提供する。   Also provided herein are polypeptides comprising a glucagon-binding antibody light chain variable region conjugated to a GLP-1 analog. Certain such polypeptides have any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 41-74. The present invention further provides an antibody comprising a polypeptide having any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 41 to 74.

本発明は、ＧＬＰ−１ペプチドに結合したグルカゴン結合抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドも提供する。特定の態様では、ポリペプチドは配列番号８３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。特定のこのような融合タンパク質では、ＧＬＰ−１化合物は配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７を含む。   The invention also provides a polypeptide comprising a glucagon-binding antibody heavy chain variable region conjugated to a GLP-1 peptide. In a particular embodiment, the polypeptide is a fusion protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83. In certain such fusion proteins, the GLP-1 compound comprises SEQ ID NO: 1-35, SEQ ID NO: 126 or SEQ ID NO: 127.

医薬的に許容可能な担体および本明細書で提供される有効量の組成物を含む医薬組成物も提供される。例えば、種々の代謝障害を含む種々の疾患を有する被験体を処置するための方法も開示される。通常、このような方法は、本明細書で提供される有効量の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む。処置可能な代謝疾患の具体例には、限定的でないが、糖尿病、肥満症および代謝症候群が含まれる。被験体においてインスリンの発現を増強するための方法、インスリンの分泌を促進するための方法も提供され、該方法は、本明細書で提供される有効量の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む。   Also provided are pharmaceutical compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an effective amount of a composition provided herein. Also disclosed are methods for treating subjects with various diseases, including, for example, various metabolic disorders. Typically, such methods comprise administering to the subject an effective amount of a pharmaceutical composition provided herein. Examples of metabolic diseases that can be treated include, but are not limited to, diabetes, obesity and metabolic syndrome. Also provided are a method for enhancing insulin expression in a subject, a method for promoting insulin secretion, the method comprising administering to the subject an effective amount of a pharmaceutical composition provided herein. including.

更に、本発明は、グルカゴンに結合する抗体およびこれに結合したＧＬＰ−１化合物を含む有効量の組成物を被験体に投与することにより被験体を処置するための方法を提供し、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を有する。このような組成物により処置可能な疾患には、上記一覧の疾患が含まれる。被験体においてインスリンの発現を増強するための方法、インスリンの分泌を促進するための方法についても本明細書で述べられ、該方法は、グルカゴンに結合する抗体；およびこれに結合したＧＬＰ−１化合物を含む有効量の組成物を被験体に投与する工程を含み、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を有する。   The present invention further provides a method for treating a subject by administering to the subject an effective amount of a composition comprising an antibody that binds glucagon and a GLP-1 compound bound thereto, and GLP-1 The compound has GLP-1 activity. Diseases that can be treated with such compositions include those listed above. Also described herein are methods for enhancing insulin expression in a subject, methods for promoting insulin secretion, the method comprising an antibody that binds glucagon; and a GLP-1 compound bound thereto A GLP-1 compound has GLP-1 activity, comprising administering to the subject an effective amount of a composition comprising:

特定の好ましい実施形態の以下の更に詳細な説明および特許請求の範囲から、具体的な実施形態が明らかになるであろう。   Specific embodiments will become apparent from the following more detailed description of certain preferred embodiments and from the claims.

（詳細な説明）
本明細書で用いられる項目の見出しは単に構成を目的とするものであって、述べられる主題を限定すると捉えるべきではない。本願において引用される文献はすべて、任意の目的のために参考として本明細書に明示的に援用される。
Ｉ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に別様に指示しない限り、複数形の参照を含む。 (Detailed explanation)
The section headings used herein are for organizational purposes only and are not to be construed as limiting the subject matter described. All references cited in this application are expressly incorporated herein by reference for any purpose.
I. Definitions As used herein and in the appended claims, the singular forms “a”, “an”, and “the” are clearly different in context. Plural references are included unless otherwise indicated.

別様に明示しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が帰属する技術分野における当業者により一般的に理解される意味を有する。以下の文献は本発明において用いられる多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ ｅｄ．１９９４）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒら、１９８８）；ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，５ＴＨ ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。   Unless defined otherwise, technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by a person skilled in the art to which this invention belongs. The following references provide those skilled in the art with general definitions of many terms used in the present invention: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED. , R. Rieger et al. (Eds.), Springer Verlag (1991); and Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICIONARY OF BIOLOGY (1991).

本明細書で用いられるように、以下の用語は、別様に特記しない限り、それらに帰する意味を有する。   As used herein, the following terms have the meanings ascribed to them unless specified otherwise.

「インスリン向性活性」は、グルコース依存的にインスリンの合成、放出または分泌を増大させる能力を指す。インスリン向性作用は、インスリン陽性細胞数の増加および／または所定の期間における既存のインスリン陽性細胞から合成もしくは放出されるインスリンの量の増加に起因することを含むがこれに限定されない、多くの異なる機構のいずれかから生じ得る。インスリン向性活性は当該分野で公知の方法、例えば、ＧＬＰ−１受容体の結合活性または受容体活性化を測定するインビボ試験およびインビトロ試験（例えば、欧州特許第６１９，３２２号および米国特許第５，１２０，７１２号において述べられているような膵島細胞またはインスリノーマ細胞を用いたアッセイならびに本明細書で述べられるようなアッセイ）を用いてアッセイすることができる。ヒトでは、インスリン向性活性はインスリン濃度またはＣペプチド濃度を検査することにより測定することができる。   “Insulinotropic activity” refers to the ability to increase the synthesis, release or secretion of insulin in a glucose dependent manner. Insulin tropism is many different including, but not limited to, an increase in the number of insulin positive cells and / or an increase in the amount of insulin synthesized or released from existing insulin positive cells in a given period of time. It can arise from any of the mechanisms. Insulinotropic activity is determined by methods known in the art, such as in vivo and in vitro tests measuring GLP-1 receptor binding activity or receptor activation (eg, EP 619,322 and US Pat. No. 5). , 120, 712, assay using pancreatic islet cells or insulinoma cells as well as assays as described herein). In humans, insulinotropic activity can be measured by examining insulin concentration or C-peptide concentration.

本明細書で言及される「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）典型的には天然状態で共に見出される他のタンパク質の少なくとも一部を含まないか、（２）同一供給源、例えば、同一種由来の他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異種由来の細胞により発現されるか、（４）天然状態で会合するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の物質の少なくとも５０％から分離されるか、（５）天然状態で「単離されたタンパク質」が会合するタンパク質の一部と（共有結合的または非共有結合的相互作用により）会合しないか、（６）天然状態で会合しないポリペプチドと（共有結合的または非共有結合的相互作用により）作動可能に会合するか、あるいは（７）天然で生じないということを意味する。このような単離されたタンパク質は、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡあるいはそれらの任意の組合せにコードされ得る。単離されたタンパク質は、その使用（治療、診断、予防、研究またはその他）を妨げ得るその天然環境で見出されるタンパク質またはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。   The term “isolated protein” as referred to herein means that the subject protein does not (1) contain at least a portion of other proteins that are typically found together in the natural state, or (2) Polynucleotides, lipids, carbohydrates or others that are essentially free of other proteins from the same source, eg, (3) expressed by cells from different species, or (4) naturally associated Is separated from at least 50% of the material of (5), or (5) does not associate (by covalent or non-covalent interactions) with a portion of the protein with which the “isolated protein” is associated in the natural state, (6) means operably associated (by covalent or non-covalent interaction) with a polypeptide that does not associate in nature, or (7) does not occur in nature. Such isolated proteins can be encoded by genomic DNA, cDNA, mRNA or other RNA of synthetic origin or any combination thereof. An isolated protein is preferably substantially free of proteins or polypeptides or other contaminants found in its natural environment that can interfere with its use (treatment, diagnosis, prevention, research or others).

「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に用いられ、ペプチド結合により結合したアミノ酸の分子鎖を含む。該用語は生成物の特定の長さには言及しない。従って、ポリペプチドの定義内には「ペプチド」および「オリゴペプチド」が含まれる。該用語はポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、ポリペプチドの意味内にはタンパク質断片、類似体、変異したタンパク質または改変体タンパク質、融合タンパク質などが含まれる。   “Polypeptide” and “protein” are used interchangeably herein and include a molecular chain of amino acids joined by peptide bonds. The term does not refer to a specific length of product. Thus, included within the definition of polypeptide are “peptide” and “oligopeptide”. The term includes post-translational modifications of the polypeptide, such as glycosylation, acetylation, phosphorylation and the like. Furthermore, within the meaning of a polypeptide are included protein fragments, analogs, mutated or modified proteins, fusion proteins, and the like.

「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失あるいは天然に存在するポリペプチドまたは組換えで産生されたポリペプチドの置換を有する、モノマーまたはマルチマーとなり得るポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ポリペプチド断片は少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。特定の実施形態では、断片は少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０アミノ酸長であることが理解されるであろう。特に有用なポリペプチド断片は結合ドメインを含む機能ドメイン含む。本明細書で提供されるような抗体の場合、有用な断片は、限定的でないが、ＣＤＲ領域、特に、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域；重鎖または軽鎖の可変ドメイン；２つのＣＤＲを含む抗体鎖の一部またはちょうどその可変領域などを含む。   The term “polypeptide fragment” can be a monomer or multimer having an amino-terminal deletion, a carboxyl-terminal deletion and / or an internal deletion or substitution of a naturally occurring polypeptide or a recombinantly produced polypeptide. Refers to a polypeptide. In certain embodiments, a polypeptide fragment may comprise an amino acid chain that is at least 5 to about 500 amino acids long. In certain embodiments, it is understood that the fragment is at least 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 or 450 amino acids long. It will be. Particularly useful polypeptide fragments include a functional domain that includes a binding domain. In the case of an antibody as provided herein, useful fragments include, but are not limited to, a CDR region, in particular a heavy chain or light chain CDR3 region; a heavy chain or light chain variable domain; It includes a part of an antibody chain or just its variable region.

本明細書で用いられるような「抗体」または「抗体ペプチド」という用語は、抗原に特異的に結合することができ、抗原の生物学的活性を阻害あるいは調節することができ得る、１つ以上のポリペプチド鎖を含むモノマータンパク質またはマルチマータンパク質を指す。従って、本明細書で用いられる場合、その用語は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリンまたは標的抗原への特異的結合でインタクトな抗体と競合し得るその断片を含み、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および二重特異性抗体を含む。一般に、インタクトな抗体は少なくとも二本の完全長重鎖および二本の完全長軽鎖を含むが、いくつかの例では、重鎖のみを含む場合があり、ラクダにおいて天然に生じる抗体などのより少ない鎖を含み得る。抗体は単一供給源のみに由来しても、「キメラ」（即ち、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来し得る）であってもよい。例えば、ＣＤＲ領域はラットまたはマウスの供給源に由来し得、一方、Ｖ領域のフレームワーク領域はヒトなどの異なる供給源に由来する。本明細書で述べるような抗体または結合断片は、組換えＤＮＡ法またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により、ハイブリドーマにて生成され得る。別様に示さない限り、「抗体」という用語は、二本の完全長重鎖および二本の完全長軽鎖を含む抗体に加え、それらの誘導体、改変体、断片および突然変異タンパク質を含み、それらの例は以下に述べられる。従って、該用語は、抗原（例えば、グルカゴン）に特異的に結合可能な軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のすべてまたは一部を含むポリペプチドを含む。従って、抗体という用語は免疫学的に機能性の断片を含み、例えば、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ断片を含む。 The term “antibody” or “antibody peptide” as used herein refers to one or more that can specifically bind to an antigen and can inhibit or modulate the biological activity of the antigen. Monomeric protein or multimeric protein comprising a polypeptide chain of Thus, as used herein, the term includes intact immunoglobulins of any isotype or fragments thereof that can compete with an intact antibody for specific binding to a target antigen, eg, chimeric antibodies, humanized Includes antibodies, fully human antibodies and bispecific antibodies. In general, an intact antibody contains at least two full-length heavy chains and two full-length light chains, but in some cases may contain only heavy chains, such as antibodies naturally occurring in camels. May contain fewer chains. An antibody may be derived from a single source or may be “chimeric” (ie, different portions of an antibody may be derived from two different antibodies). For example, the CDR regions can be derived from rat or mouse sources, while the framework regions of the V region are derived from different sources such as humans. Antibodies or binding fragments as described herein can be produced in hybridomas by recombinant DNA methods or enzymatic or chemical cleavage of intact antibodies. Unless otherwise indicated, the term “antibody” includes, in addition to antibodies comprising two full length heavy chains and two full length light chains, derivatives, variants, fragments and muteins thereof, Examples of these are described below. Thus, the term includes polypeptides comprising all or part of a light chain variable region and / or heavy chain variable region that can specifically bind to an antigen (eg, glucagon). Thus, the term antibody includes immunologically functional fragments, including, for example, F (ab) fragments, F (ab ′) fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fv fragments and single chain Fv fragments.

「軽鎖」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長軽鎖およびその断片を含む。完全長軽鎖は可変領域ドメインＶＬおよび定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端に位置する。軽鎖はκ鎖およびλ鎖を含む。 The term “light chain” includes full-length light chains and fragments thereof having a variable region sequence sufficient to confer binding specificity. Full-length light chain includes a variable region domain, V L and a constant region domain, C L. The variable region domain of the light chain is located at the amino terminus of the polypeptide. The light chain includes a kappa chain and a lambda chain.

「重鎖」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長重鎖およびその断片を含む。完全長重鎖は可変領域ドメインＶＨならびに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端に位置し、ＣＨドメインはカルボキシル末端に位置し、ＣＨ３が−ＣＯＯＨ端に最も近い。本発明による重鎖は任意のアイソタイプのものでよく、ＩｇＧ（ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプおよびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む。 The term “heavy chain” includes full-length heavy chains and fragments thereof having a variable region sequence sufficient to confer binding specificity. The full length heavy chain includes a variable region domain V H and three constant region domains C H 1, C H 2 and C H 3. V H domain is at the amino-terminus of the polypeptide, C H domain is located at the carboxyl terminus, C H 3 is closest to the -COOH end. The heavy chain according to the present invention may be of any isotype, IgG (IgG1 subtype, including IgG2 subtype, IgG3 subtype and IgG4 subtypes), IgA (including IgA 1 and IgA 2 subtypes), IgM and Contains IgE.

本明細書で用いられるような免疫グロブリン鎖の「免疫学的に機能性の断片」（または単に「断片」）という用語は、完全長鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠いているが、抗原に特異的に結合することが可能な抗体の軽鎖または重鎖の一部を指す。このような断片は標的抗原に特異的に結合するという点において生物学的に活性であり、所定のエピトープへの特異的結合でインタクトな抗体と競合し得る。本発明の一態様では、このような断片は、完全長軽鎖または完全長重鎖に存在するＣＤＲを少なくとも１つ保持し、一部の実施形態では、単一の重鎖および／または軽鎖あるいはそれらの一部分を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ法により生成され得、あるいはインタクトな抗体の酵素的または化学的切断により生成され得る。本発明の免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片は、限定的でないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖドメイン抗体および単鎖抗体を含み、限定的でないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダまたはウサギを含む任意の哺乳動物供給源から得られ得る。二機能性の治療特性を有するか、あるいは血清半減期の延長を有する体内の特定の標的に対する治療剤を作製するために、本発明の抗体の機能性部分、例えば、１つ以上のＣＤＲが第２のタンパク質または小分子に共有結合され得ることが更に検討される。 The term “immunologically functional fragment” (or simply “fragment”) of an immunoglobulin chain as used herein lacks at least some of the amino acids present in the full-length chain, Refers to the light chain or part of a heavy chain of an antibody capable of specifically binding to an antigen. Such fragments are biologically active in that they specifically bind to the target antigen and can compete with intact antibodies for specific binding to a given epitope. In one aspect of the invention, such a fragment retains at least one CDR present in a full-length light chain or full-length heavy chain, and in some embodiments, a single heavy and / or light chain. Or a part thereof is included. These biologically active fragments can be produced by recombinant DNA methods or can be produced by enzymatic or chemical cleavage of intact antibodies. Immunologically functional immunoglobulin fragments of the present invention include, but are not limited to, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv domain antibody and single chain antibody, including but not limited to human, mouse Can be obtained from any mammalian source, including rats, camels or rabbits. In order to create a therapeutic agent for a specific target in the body that has bifunctional therapeutic properties or has an extended serum half-life, a functional portion of an antibody of the invention, eg, one or more CDRs, is added. It is further contemplated that it can be covalently linked to two proteins or small molecules.

「Ｆａｂ断片」は、一本の軽鎖ならびに一本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。 A “Fab fragment” consists of a light chain and the C H 1 and variable regions of a heavy chain. The heavy chain of a Fab molecule cannot form a disulfide bond with another heavy chain molecule.

「Ｆａｂ断片」は、軽鎖と重鎖との間に鎖間ジスルフィド結合が形成できるように、一本の軽鎖ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む一本の重鎖の一部分を含む。 A “Fab fragment” comprises a single light chain and a portion of a heavy chain that includes a V H domain and a C H 1 domain so that an interchain disulfide bond can be formed between the light chain and the heavy chain. .

「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、二本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、二本の軽鎖およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に定常領域の一部分を有する二本の重鎖を含む。従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、二本の重鎖間のジスルフィド結合により共に保持された２つのＦａｂ断片からなる。 An “F (ab ′) 2 fragment” is a constant region between two light chains and the C H 1 and C H 2 domains so that an interchain disulfide bond is formed between the two heavy chains. Two heavy chains having a portion of Thus, an F (ab ′) 2 fragment consists of two Fab fragments held together by a disulfide bond between two heavy chains.

「Ｆｖ領域」は重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く。   An “Fv region” includes variable regions derived from both heavy and light chains, but lacks a constant region.

「単鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が可撓性リンカーによって結合されて単一ポリペプチド鎖を形成するＦｖ分子であり、単一ポリペプチド鎖は抗原結合領域を形成する。単鎖抗体は、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号において詳細に考察されており、これらの開示内容は参考として援用される。   A “single chain antibody” is an Fv molecule in which the heavy and light chain variable regions are joined by a flexible linker to form a single polypeptide chain, where the single polypeptide chain forms the antigen binding region. Single chain antibodies are discussed in detail in International Patent Application Publication No. WO 88/01649 and US Pat. Nos. 4,946,778 and 5,260,203, the disclosures of which are incorporated by reference. The

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片である。いくつかの例では、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合し、二価ドメイン抗体を生成する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は同じかあるいは異なる抗原を標的とし得る。 A “domain antibody” is an immunologically functional immunoglobulin fragment that contains only the variable region of the heavy chain or the variable region of the light chain. In some examples, two or more VH regions are covalently linked to a peptide linker to generate a bivalent domain antibody. The two VH regions of a bivalent domain antibody can target the same or different antigens.

「二価抗体」は２つの抗原結合部位を含む。いくつかの例では、２つの結合部位は同一の抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異性でもよい（下記参照）。   A “bivalent antibody” contains two antigen binding sites. In some examples, the two binding sites have the same antigen specificity. However, bivalent antibodies may be bispecific (see below).

「多重特異性抗体」は２つ以上の抗原またはエピトープを標的とする抗体である。   A “multispecific antibody” is an antibody that targets two or more antigens or epitopes.

「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二機能性」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は多重特異性抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含むがこれらに限定されない種々の方法により生成され得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。二重特異性抗体の２つの結合部位は、これらは同じかあるいは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。   A “bispecific”, “dual-specific” or “bifunctional” antibody is a hybrid antibody having two different antigen binding sites. Bispecific antibodies are a type of multispecific antibody and can be generated by a variety of methods including, but not limited to, hybridoma fusion or linking of Fab 'fragments. See, for example, Songsivirai and Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al. (1992), J. MoI. Immunol. 148: 1547-1553. The two binding sites of a bispecific antibody bind to two different epitopes that may be present on the same or different protein targets.

「抗原」という用語は、抗体のような選択的結合因子により結合可能であり、さらに、その抗原のエピトープに結合可能な抗体を生成するために動物において用いることが可能な分子または分子の一部分を指す。抗原は１つ以上のエピトープを有し得る。   The term “antigen” refers to a molecule or portion of a molecule that can be bound by a selective binding agent such as an antibody and that can be used in an animal to produce an antibody that can bind to an epitope of that antigen. Point to. An antigen can have one or more epitopes.

「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合が可能な任意の決定基、好ましくは、ポリペプチド決定基を含む。エピトープは抗体により結合される抗原の領域である。特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基群（ｓｕｒｆａｃｅ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有し得る。特定の実施形態では、抗体がタンパク質および／または高分子の複雑な混合物においてその標的抗原を優先的に認識する際、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。平衡解離定数が１０−７Ｍ以下または１０−８Ｍ以下である場合、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。一部の実施形態では、平衡解離定数は１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下であり得る。 The term “epitope” includes any determinant capable of specific binding to an immunoglobulin or T cell receptor, preferably a polypeptide determinant. An epitope is a region of an antigen that is bound by an antibody. In certain embodiments, epitope determinants include chemically active surface groupings of molecules such as amino acids, sugar side chains, phosphoryls or sulfonyls, and in certain embodiments, specific three-dimensional structures. May have characteristics and / or specific charge characteristics. In certain embodiments, an antibody is said to specifically bind an antigen when it preferentially recognizes its target antigen in a complex mixture of proteins and / or macromolecules. An antibody is said to specifically bind an antigen if the equilibrium dissociation constant is 10 −7 M or less or 10 −8 M or less. In some embodiments, the equilibrium dissociation constant can be 10 −9 M or lower or 10 −10 M or lower.

本明細書で用いられ、対象に適用されるような「天然に存在する」という用語は、対象が天然で見出され得るという事実を指す。例えば、天然供給源から単離され得るとともにヒトによって意図的に修飾されていない、生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。   The term “naturally occurring” as used herein and applied to a subject refers to the fact that a subject can be found in nature. For example, a polypeptide or polynucleotide sequence present in an organism (including viruses) that can be isolated from natural sources and not intentionally modified by humans is naturally occurring.

本明細書で言及されるような「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長の一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得る。前記修飾は、ブロモウリジン（ｂｒｏｍｕｒｉｄｉｎｅ）などの塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾を含む。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的には一本鎖形状および二本鎖形状のＤＮＡを含む。   The term “polynucleotide” as referred to herein means a single-stranded or double-stranded nucleic acid polymer of at least 10 bases in length. In certain embodiments, the nucleotides comprising the polynucleotide can be ribonucleotides or deoxyribonucleotides or a modified form of either type of nucleotide. Such modifications include base modifications such as bromouridine, ribose modifications such as arabinoside and 2 ′, 3′-dideoxyribose, and phosphorothioates, phosphorodithioates, phosphoroselenoates, phosphorodiselenoates, phosphorodiselenoates. Including internucleotide linkage modifications such as ate, phosphoranilate and phosphoramidate. The term “polynucleotide” specifically includes single and double stranded forms of DNA.

本明細書で用いられるような「単離ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成起源またはそれらの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源により、単離ポリヌクレオチドは、（１）単離ポリヌクレオチドが天然で見出されるポリヌクレオチドの全体または一部と会合せず、（２）天然状態で結合していないポリヌクレオチドに結合し、あるいは（３）より大きい配列の一部として天然で生じない。   The term “isolated polynucleotide” as used herein means a polynucleotide of genomic, cDNA or synthetic origin or combinations thereof, by which the isolated polynucleotide is (1) isolated The polynucleotide does not associate with all or part of the polynucleotide found in nature, (2) binds to a polynucleotide that is not naturally bound, or (3) does not occur naturally as part of a larger sequence .

本明細書で言及されるような「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然または非天然オリゴヌクレオチド結合により共に結合した天然または修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、通常は一本鎖のメンバーを含むポリヌクレオチドのサブセットであり、２００塩基またはそれ以下の長さを有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、例えば、遺伝子改変体の構築に用いられる。本明細書で提供されるようなオリゴヌクレオチドは、タンパク質コード配列に関してセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。   The term “oligonucleotide” as referred to herein includes natural or modified nucleotides joined together by natural or non-natural oligonucleotide linkages. Oligonucleotides are a subset of polynucleotides that typically include single stranded members and have a length of 200 bases or less. In certain embodiments, the oligonucleotide is 10-60 bases in length. In certain embodiments, the oligonucleotide is 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20-40 bases in length. Oligonucleotides can be single-stranded or double-stranded, and are used, for example, in the construction of genetic variants. Oligonucleotides as provided herein can be sense or antisense oligonucleotides with respect to protein coding sequences.

別記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’→３’付加の方向は転写方向と称され；ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と称され；ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と称される。   Unless specified otherwise, the left-hand end of single-stranded polynucleotide sequences is the 5 'end; the left-hand direction of double-stranded polynucleotide sequences is referred to as the 5' direction. The direction of 5 ′ → 3 ′ addition of the nascent RNA transcript is called the transcription direction; the sequence region on the DNA strand that has the same sequence as the RNA and is 5 ′ to the 5 ′ end of the RNA transcript is The sequence region on the DNA strand that has the same sequence as the RNA and is 3 ′ to the 3 ′ end of the RNA transcript is referred to as the “downstream sequence”.

「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞に伝達するのに用いられる任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指すのに用いられる。   The term “vector” is used to refer to any molecule (eg, nucleic acid, plasmid, or virus) used to transfer coding information to a host cell.

「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に好適であるとともに、挿入異種核酸配列の発現を誘導および／または制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現には、限定されないが、転写、翻訳およびイントロンが存在する場合のＲＮＡスプライシングなどのプロセスが含まれる。   The term “expression vector” refers to a vector that is suitable for transformation of a host cell and contains a nucleic acid sequence that induces and / or controls expression of an inserted heterologous nucleic acid sequence. Expression includes, but is not limited to, processes such as transcription, translation and RNA splicing when introns are present.

「宿主細胞」という用語は、核酸配列を導入されるか、あるいは導入可能であって、更に、対象選択遺伝子を発現させ、あるいは発現可能な細胞を指すのに用いられる。該用語は親細胞の子孫を含み、選択遺伝子が存在する限り、該子孫が形態または遺伝子構造において元の親と同一であることを問わない。   The term “host cell” is used to refer to a cell into which a nucleic acid sequence has been introduced or is capable of being introduced, and that is capable of expressing or expressing a target selection gene. The term includes the progeny of the parent cell, so long as the selection gene is present, it does not matter that the progeny is identical in form or genetic structure to the original parent.

当該分野で公知のような「同一性」という用語は、それらの配列を比較することにより求められるような、２つもしくはそれ以上のポリペプチド分子または２つもしくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当該分野では、「同一性」は、場合により、２つもしくはそれ以上のヌクレオチドまたは２つもしくはそれ以上のアミノ酸配列のストリング間のマッチにより求められるような、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連度も意味する。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（即ち、「アルゴリズム」）により対処されるギャップアラインメント（存在する場合）により、２つ以上の配列のより小さい配列間の同一マッチのパーセントを測定する。   The term “identity” as known in the art is between two or more polypeptide molecules or sequences of two or more nucleic acid molecules, as determined by comparing their sequences. Refers to a relationship. In the art, “identity” is optionally the degree of sequence relatedness between nucleic acid molecules or polypeptides as determined by a match between strings of two or more nucleotides or two or more amino acid sequences. Also means. “Identity” measures the percent of identical matches between smaller sequences of two or more sequences, with gap alignment (if any) addressed by a particular mathematical model or computer program (ie, “algorithm”) To do.

「類似性」という用語は、関連する概念に関して当該分野で用いられるが、「同一性」と対照的に、「類似性」は同一マッチおよび保存的置換マッチを含む関連性の尺度を指す。２つのポリペプチド配列が、例えば、１０／２０の同一アミノ酸を有し、他がすべて非保存的置換である場合、同一性パーセントおよび類似性は共に５０％であろう。同じ例において、保存的置換が存在する更に５つの位置がある場合、同一性パーセントは５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％（１５／２０）であろう。従って、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間の類似性パーセントは、それら２つのポリペプチド間の同一性パーセントより高くなる。   The term “similarity” is used in the art with respect to related concepts, but in contrast to “identity”, “similarity” refers to a measure of relatedness including identical matches and conservative substitution matches. If two polypeptide sequences have, for example, 10/20 identical amino acids and all others are non-conservative substitutions, the percent identity and similarity will both be 50%. In the same example, if there are five more positions where conservative substitutions are present, the percent identity will remain 50%, but the percent similarity will be 75% (15/20). Thus, when there are conservative substitutions, the percent similarity between two polypeptides is higher than the percent identity between those two polypeptides.

関連する核酸およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法により容易に計算することができる。このような方法は、限定的でないが、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＲＯＪＥＣＴＳ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ． Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＡＴＡ，Ｐａｒｔ １，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲＩＭＥＲ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３；およびＤｕｒｂｉｎら、１９９８，ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに述べられている方法が含まれる。   The identity and similarity of related nucleic acids and polypeptides can be readily calculated by known methods. Such methods include, but are not limited to COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, AM, ed.), 1988, Oxford University Press, New York; , Ed.), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (Griffin, AM and Griffin, HG, eds.), 1994, Humana Press, senew; Heinje, G .; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, M .; Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J. et al. Applied Math. 48: 1073; and Durbin et al., 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press.

同一性を定量する好ましい方法は、被験配列間の最大マッチを付与するように設計される。同一性を定量する方法は公共的に利用可能なコンピュータプログラムに示されている。２配列間の同一性を定量する好ましいコンピュータプログラム法には、限定的でないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７を含むＧＣＧプログラムパッケージ；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０）が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，上記参照）から公共的に利用可能である。同一性を定量するのに周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも用いられ得る。   Preferred methods for quantifying identity are designed to give the greatest match between test sequences. Methods for quantifying identity are shown in publicly available computer programs. Preferred computer programming methods for quantifying the identity between two sequences include, but are not limited to, GAP (GCG program package including Devereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res., 12: 387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410). The BLASTX program is publicly available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al., NCB / NLM / NIH Bethesda, MD 20894; publicly available from Altschul et al., 1990, supra). . The well-known Smith Waterman algorithm can also be used to quantify identity.

２つのアミノ酸またはポリヌクレオチド配列をアラインメントするための特定のアラインメントスキームは、２配列の短い領域のマッチングをもたらすことでき、この小さいアラインメント領域は、その２つの全長配列間に有意な関連がなくても、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、特定の実施形態では、選択されたアラインメント法（ＧＡＰプログラム）は標的ポリペプチドの少なくとも５０個の隣接アミノ酸にわたるアラインメントをもたらす。一部の実施形態では、アラインメントは標的ポリペプチドの少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０個のアミノ酸を含み得る。ＧＡＰを用いてポリヌクレオチドがアラインメントされると、アラインメントは少なくとも約１００、１５０または２００個の隣接可能なヌクレオチドにわたり得る。   A specific alignment scheme for aligning two amino acid or polynucleotide sequences can result in matching of a short region of two sequences, even if this small alignment region has no significant association between the two full-length sequences. Can have very high sequence identity. Thus, in certain embodiments, the selected alignment method (GAP program) results in an alignment over at least 50 contiguous amino acids of the target polypeptide. In some embodiments, the alignment can include at least 60, 70, 80, 90, 100, 110 or 120 amino acids of the target polypeptide. When polynucleotides are aligned using GAP, the alignment can span at least about 100, 150, or 200 contiguous nucleotides.

例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、配列同一性パーセントが定量される２つのポリペプチドは、それらのそれぞれのアミノ酸の至適マッチングのためにアラインメントされる（アルゴリズムにより求められるような「マッチ範囲」）。特定の実施形態では、ギャップ開始ペナルティ（平均対角の３倍として計算され；「平均対角」は使用される比較マトリックスの対角の平均であり；「対角」は特定の比較マトリックスによって各完全アミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、キャップ開始ペナルティの１／１０である）ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスが、アルゴリズムと共に用いられる。特定の実施形態では、標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：３４５−３５２；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９を参照）もアルゴリズムにより用いられる。   For example, using the computer algorithm GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), two polypeptides whose percent sequence identity is quantified are aligned for optimal matching of their respective amino acids. (“Match range” as required by the algorithm). In a specific embodiment, the gap start penalty (calculated as 3 times the average diagonal; “average diagonal” is the average of the diagonals of the comparison matrix used; A score or number assigned to a perfect amino acid match) and a gap extension penalty (usually 1/10 of the cap opening penalty) and a comparison matrix such as PAM250 or BLOSUM62 is used with the algorithm. In certain embodiments, a standard comparison matrix (Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: 345-352 for the PAM250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl for the BLOSUM62 comparison matrix. .Acad.Sci USA, 89: 10915-10919) is also used by the algorithm.

特定の実施形態では、ポリペプチド配列比較のためのパラメータは以下を含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２、上記参照、からのＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用であり得る。ヌクレオチド配列では、パラメータはギャップペナルティ５０および各ギャップにおける各シンボルに対するペナルティ３であるギャップ長ペナルティ３を含み得る。特定の実施形態では、前記パラメータはＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチド比較（エンドギャップに対してはペナルティがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。 In certain embodiments, the parameters for polypeptide sequence comparison include:
Algorithm: Needleman et al., 1970, J. MoI. Mol. Biol. 48: 443-453;
Comparison matrix: BLOSUM62 from Henikoff et al., 1992, supra;
Gap penalty: 12
Gap length penalty: 4
Similarity threshold: 0
A GAP program may be useful with the above parameters. For nucleotide sequences, the parameters may include a gap penalty 50 and a gap length penalty 3 that is a penalty 3 for each symbol in each gap. In certain embodiments, the parameters are default parameters for polypeptide comparisons (along with no penalty for end gaps) using the GAP algorithm.

本明細書で用いられるように、従来の２０個のアミノ酸ならびにそれらの一文字および三文字略記は従来の使用法を踏襲する。例えば、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ−Ａ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．），Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９９１を参照されたい。同文献は目的に応じて参考として本明細書に援用される。従来の２０個のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）；α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸および他の非従来型アミノ酸も、本明細書で提供されるようなポリペプチドに好適な構成要素であり得る。非従来型アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニンならびに他の類似アミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で用いられるポリペプチドの表記では、標準的な使用法および慣習に従って、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシル末端方向である。ＧＬＰ−１化合物に関して用いられる際の「下流」という用語は、言及される位置に対してポリペプチドのカルボキシル末端方向、即ち、言及される位置の右側に所在する位置を意味する。ＧＬＰ−１化合物に関して用いられる際の「上流」という用語は、言及される位置に対してポリペプチドのアミノ末端方向、即ち、言及される位置の左側に所在する位置を意味する。推奨ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ ｆｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓが、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８４，２１９，３４５−３７３；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３８，９−３７；１９８５，１５２，１；１９９３，２１３，２；Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，１９８４，２４，ｐ８４以降；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，１４−４２；Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，５６，５９５−６２４；Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９８５，１６，３８７−４１０；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ，１９９２，ｐａｇｅｓ ３９−６９において公表されている。   As used herein, the conventional 20 amino acids and their one-letter and three-letter abbreviations follow conventional usage. See, for example, IMMUNOLOGY-A SYNTHESIS, 2nd Edition, (ES Golub and DR Gren, Eds.), Sinauer Associates: Sunland, MA, 1991. This document is incorporated herein by reference in accordance with the purpose. Conventional 20 amino acid stereoisomers (eg, D-amino acids); α-, α-disubstituted amino acids, N-alkyl amino acids, lactic acid and other non-conventional amino acids are also provided herein. May be a suitable component for any polypeptide. Examples of unconventional amino acids include 4-hydroxyproline, γ-carboxyglutamate, ε-N, N, N-trimethyllysine, ε-N-acetyllysine, O-phosphoserine, N-acetylserine, N-formylmethionine , 3-methylhistidine, 5-hydroxylysine, σ-N-methylarginine and other similar amino acids and imino acids (eg 4-hydroxyproline). In the polypeptide notation used herein, the left-hand direction is the amino terminal direction and the right-hand direction is the carboxyl-terminal direction, in accordance with standard usage and convention. The term “downstream” when used with respect to a GLP-1 compound means a position located in the direction of the carboxyl terminus of a polypeptide relative to the referenced position, ie, to the right of the referenced position. The term “upstream” when used with respect to a GLP-1 compound means the amino terminal direction of the polypeptide relative to the referenced position, ie, the position located to the left of the referenced position. Recommended IUPAC-IUB Nomenclature and Symbol for Amino Acids and Peptides are available from Biochem. J. et al. , 1984, 219, 345-373; Eur. J. et al. Biochem. 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; J. et al. Pept. Prot. Res. 1984, 24, p. Biol. Chem. , 1985, 260, 14-42; Pure Appl. Chem. , 1984, 56, 595-624; Amino Acids and Peptides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, pages 39-69.

本発明による抗体の結合および中和を評価するにあたり、抗体は特異的に結合し、かつ／あるいはグルカゴンのその受容体への結合を実質的に阻害し、かつ／あるいはグルカゴン受容体の活性化を防止し、その際、過剰の抗体はグルカゴンにより結合され、あるいは活性化される受容体の量を、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％またはそれ以上減少させる（それぞれ、インビトロ競合結合アッセイまたはインビトロ機能アッセイにて測定されるように）。特異的結合抗体は、１０−８モル以下のグルカゴンに結合するための平衡解離定数、至適には１０−９または１０−１０モル以下を有することが見込まれ得る。 In assessing binding and neutralization of an antibody according to the invention, the antibody specifically binds and / or substantially inhibits binding of glucagon to its receptor and / or inhibits activation of glucagon receptor. Preventing, where excess antibody reduces the amount of receptor bound or activated by glucagon by at least about 20%, 40%, 60%, 80%, 85% or more (respectively, As measured in in vitro competitive binding assays or in vitro functional assays). A specific binding antibody can be expected to have an equilibrium dissociation constant for binding to 10 −8 mol or less of glucagon, optimally 10 −9 or 10 −10 mol or less.

「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書で化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子または生体物質で作られる抽出物を示すのに用いられる。   The term “agent” is used herein to indicate a chemical compound, a mixture of chemical compounds, a biopolymer or an extract made of a biomaterial.

本明細書で用いられるように、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、放射線標識アミノ酸の組込みによる検出可能なマーカーの組込みまたは蛍光マーカー、化学発光マーカーもしくは検出可能な活性を有する酵素のポリペプチドもしくは核酸への付着または標識アビジン（例えば、好ましくは、蛍光マーカー、化学発光マーカーなどの検出可能なマーカーまたは、特に、光学的方法もしくは比色法により検出可能な酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出可能なビオチン部分のポリペプチドへの付着を指す。特定の実施形態では、標識は治療的であってもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が当該分野で公知であり、本明細書で開示される方法において有利に用いられ得る。ポリペプチド用の標識の例には、限定されないが、以下のものが含まれる：放射性同位元素もしくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、即ち、ＦＩＴＣ、ローダミンまたはランタニド系蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ビオチニル基などのハプテン標識および二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメインまたはエピトープタグ）。特定の実施形態では、標識は立体障害の可能性を低減するため、種々の長さのスペーサーアーム（例えば、（ＣＨ２）ｎ、ｎ＜約２０）によって付着される。 As used herein, the term “label” or “labeled” has the incorporation of a detectable marker, eg, by incorporation of a radiolabeled amino acid, or a fluorescent marker, chemiluminescent marker or detectable activity. Attachment of an enzyme to a polypeptide or nucleic acid or labeled avidin (eg, preferably a detectable marker such as a fluorescent marker, a chemiluminescent marker, or in particular a strep containing an enzymatic activity detectable by optical or colorimetric methods Avidin) refers to the attachment of a biotin moiety detectable to a polypeptide. In certain embodiments, the label may be therapeutic. Various methods of labeling polypeptides and glycoproteins are known in the art and can be used advantageously in the methods disclosed herein. Examples of labels for polypeptides include, but are not limited to: radioisotopes or radionuclides (eg, 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 90 Y, 99m Tc, 111 In , 125 I, 131 I), fluorescent labels (eg fluorescein isothiocyanate, ie FITC, rhodamine or lanthanide fluorophores), enzyme labels (eg horseradish peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase), chemiluminescence A given polypeptide epitope (eg, leucine zipper pair sequence, secondary antibody binding site, metal binding domain or epitope tag) recognized by a label, a hapten label such as a biotinyl group, and a secondary reporter. In certain embodiments, the label is attached by spacer arms of various lengths (eg, (CH 2 ) n , n <about 20) to reduce the possibility of steric hindrance.

本明細書で用いられるような「生物学的サンプル」という用語は、限定されないが、生物または過去に生きていた生物由来の任意の量の物質を含む。このような生物には、限定されないが、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギおよび他の動物が含まれる。このような物質には、限定されないが、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ節および皮膚が含まれる。   The term “biological sample” as used herein includes, but is not limited to, any amount of material from an organism or an organism that has lived in the past. Such organisms include but are not limited to humans, mice, monkeys, rats, rabbits and other animals. Such substances include but are not limited to blood, serum, urine, cells, organs, tissues, bone, bone marrow, lymph nodes and skin.

本明細書で用いられるような「医薬製剤または薬物」という用語は、患者に適切に投与されると、所望の治療効果を誘導することが可能な化学化合物または組成物を指す。
ＩＩ．概要
ＧＬＰ−１化合物に結合した抗グルカゴン抗体（即ち、グルカゴンに結合する抗体）を含む組成物が本明細書で提供される。通常、抗体はグルカゴンがグルカゴン受容体を活性化することができないように、グルカゴンに結合するのみならず、グルカゴンを中和もする。通常、組成物の抗体はヒトグルカゴンに結合し、重鎖可変領域または軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含む。特定の組成物を用いた結果は、組成物の抗体が、グルカゴンに結合することができ、一方で、これらの２つの実体を結合しているにもかかわらず、ＧＬＰ−１が依然としてＧＬＰ−１受容体に結合することができるということを示す。従って、このような組成物は二重活性を有する。ＧＬＰ−１化合物に融合したグルカゴン抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含むポリペプチドも提供され、これは、任意で１つもしくはそれ以上の他の軽鎖または重鎖またはそれらの断片と組み合わせて抗体を形成することができる。 The term “pharmaceutical formulation or drug” as used herein refers to a chemical compound or composition capable of inducing a desired therapeutic effect when properly administered to a patient.
II. SUMMARY Compositions comprising an anti-glucagon antibody (ie, an antibody that binds glucagon) conjugated to a GLP-1 compound are provided herein. Normally, the antibody not only binds to glucagon but also neutralizes glucagon so that glucagon cannot activate the glucagon receptor. Usually, the antibody of the composition binds to human glucagon and comprises at least a portion of a heavy chain variable region or a light chain variable region. The results with a particular composition show that GLP-1 is still GLP-1 despite the fact that the antibody of the composition is capable of binding to glucagon while binding these two entities. Indicates that it can bind to the receptor. Such compositions therefore have a dual activity. Also provided is a polypeptide comprising at least a portion of a heavy chain variable region or light chain variable region of a glucagon antibody fused to a GLP-1 compound, optionally comprising one or more other light or heavy chains or them An antibody can be formed in combination with a fragment of

組成物の抗体は、免疫学的に機能性の断片を含むキメラ抗体、ヒト化抗体またはインタクトなヒト抗体であってよい。抗体抗原結合部位の免疫結合特性を示すことが可能なポリペプチドも本明細書で開示される。抗グルカゴン抗体に結合されるＧＬＰ−１化合物は、天然ＧＬＰ−１、当該分野で公知の任意のＧＬＰ−１類似体または天然ＧＬＰ−１の活性を有する、本明細書で開示されるＧＬＰ−１類似体の１つであってよい。いくつかの組成物では、抗グルカゴン抗体およびＧＬＰ−１化合物は、２つの分子が直接あるいはペプチドリンカーを介して結合した融合タンパク質の一部である。他の組成物では、抗体およびＧＬＰ−１化合物は融合タンパク質の一部ではなく、その代わりに非ペプチドリンカーを介して結合される。抗体およびポリペプチドをコードする核酸ならびにこれらの核酸を用いて抗体を発現させる方法も開示される。   The antibody of the composition may be a chimeric antibody, a humanized antibody or an intact human antibody comprising an immunologically functional fragment. Polypeptides that are capable of exhibiting the immunobinding properties of an antibody antigen binding site are also disclosed herein. A GLP-1 compound that is conjugated to an anti-glucagon antibody is a native GLP-1, any GLP-1 analog known in the art or a GLP-1 disclosed herein having the activity of a native GLP-1. It may be one of the analogs. In some compositions, the anti-glucagon antibody and the GLP-1 compound are part of a fusion protein in which the two molecules are joined directly or via a peptide linker. In other compositions, the antibody and GLP-1 compound are not part of the fusion protein, but instead are attached via a non-peptide linker. Also disclosed are nucleic acids encoding antibodies and polypeptides and methods of expressing antibodies using these nucleic acids.

以下に更に詳細に述べられるように、提供されるＧＬＰ−１化合物は種々の疾患を処置するため、治療的または予防的に投与され得る。化合物により処置され得る疾患例には、限定的でないが、糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、高血糖、代謝症候群、種々の脂質障害、肥満症、冠動脈疾患、骨障害および過敏性腸症候群が含まれる。
ＩＩＩ．ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物およびポリペプチド
一般に、提供される組成物は、グルカゴンに結合する抗体ならびに該抗体に結合した１つ以上のＧＬＰ−１化合物を含む。抗グルカゴン抗体とＧＬＰ−１化合物との関係を説明するのに用いられる際、「結合した（ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、各分子が少なくとも１つのその天然活性を依然として保持しながら（例えば、該抗体はグルカゴンに結合する能力を維持し、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を維持する）、２分子が結合することを意味する。抗体はいくつかの組成物では完全ヒト抗体である。通常、抗体はグルカゴンに結合するとともにグルカゴン受容体を活性化するその能力を阻害することができる（例えば、本明細書で述べるようなインビトロまたはインビボアッセイにおいて）中和抗体である。２つ以上のＧＬＰ−１化合物が抗体に結合され得、これらは同一かあるいは異なっていてよい。抗体および化合物はリンカーを介して結合してもしなくてもよい。従って、例えば、ＧＬＰ−１化合物および抗体は、リンカーを用いずに、分子中に天然に存在するか、あるいは導入される反応基を介して化学的に結合され得る。他の例では、化合物および抗体は、直接あるいはペプチドリンカーを介し、融合タンパク質の一部として融合される。他の組成物では、ＧＬＰ−１化合物と抗体とを結合するのにペプチドまたは合成リンカーが用いられる。抗体とＧＬＰ−１化合物とを結合するための選択肢に関する更なる詳細が以下に挙げられる。化合物は抗体のＮ末端もしくはＣ末端または両末端に結合され得る。 As described in further detail below, the provided GLP-1 compounds can be administered therapeutically or prophylactically to treat various diseases. Examples of diseases that can be treated with compounds include, but are not limited to, diabetes, impaired glucose tolerance, insulin resistance, hyperglycemia, metabolic syndrome, various lipid disorders, obesity, coronary artery disease, bone disorder and irritable bowel syndrome. included.
III. GLP-1 Compound / Antibody Compositions and Polypeptides In general, provided compositions comprise an antibody that binds glucagon and one or more GLP-1 compounds bound to the antibody. When used to describe the relationship between an anti-glucagon antibody and a GLP-1 compound, the term “linked” means that each molecule still retains at least one of its natural activities (eg, the antibody Maintains the ability to bind to glucagon, and GLP-1 compounds maintain GLP-1 activity), meaning that two molecules bind. The antibody is a fully human antibody in some compositions. Typically, the antibody is a neutralizing antibody that can bind to glucagon and inhibit its ability to activate the glucagon receptor (eg, in an in vitro or in vivo assay as described herein). More than one GLP-1 compound may be conjugated to the antibody and these may be the same or different. Antibodies and compounds may or may not be linked via a linker. Thus, for example, GLP-1 compounds and antibodies can be chemically linked through reactive groups that are either naturally present in the molecule or introduced without the use of a linker. In other examples, the compound and antibody are fused as part of a fusion protein, either directly or via a peptide linker. In other compositions, peptides or synthetic linkers are used to join the GLP-1 compound and the antibody. Further details regarding options for binding antibodies and GLP-1 compounds are listed below. The compound can be attached to the N-terminus or C-terminus or both ends of the antibody.

特定の実施形態では、ＧＬＰ−１化合物は、グルカゴンに結合する抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域に結合される。従って、特定の実施形態では、抗体の軽鎖および重鎖の両鎖がＧＬＰ−１に結合される。異なる鎖に結合される化合物は同一かあるいは異なってよい。   In certain embodiments, the GLP-1 compound is bound to the variable region of the heavy and / or light chain of an antibody that binds glucagon. Thus, in certain embodiments, both the light and heavy chains of the antibody are bound to GLP-1. The compounds attached to different chains may be the same or different.

提供されるいくつかの組成物の抗体は、少なくとも１０４または１０５／Ｍ×秒のグルカゴンに対する結合親和性（Ｋａ）を有する。他の抗体は少なくとも１０６、１０７、１０８または１０９／Ｍ×秒のｋａを有する。提供される特定の抗体は低い解離速度を有する。一部の抗体は、例えば、１×１０−４ｓ−１、１×１０−５ｓ−１またはそれ以下のＫｏｆｆを有する。 The antibodies of some compositions provided have a binding affinity (K a ) for glucagon of at least 10 4 or 10 5 / M × sec. Other antibodies have at least 10 6, 10 7, 10 8 or 10 9 / M × s k a. Certain antibodies provided have a low dissociation rate. Some antibodies have a K off of, for example, 1 × 10 −4 s −1 , 1 × 10 −5 s −1 or less.

いくつかの組成物における抗体はインビトロまたはインビボにて少なくとも１日の半減期を有する（例えば、ヒトを被験体として投与した場合）。特定の組成物における抗体は少なくとも２または３日の半減期を有する。別の実施形態では、抗体は４日またはそれ以上の半減期を有する。更に別の抗体は７日または８日またはそれ以上の半減期を有する。別の実施形態では、非誘導体化または非修飾抗体と比べて長い半減期を有するように、抗体またはその抗原結合部は誘導体化または修飾される。   The antibody in some compositions has a half-life of at least 1 day in vitro or in vivo (eg, when administered as a human subject). The antibody in a particular composition has a half-life of at least 2 or 3 days. In another embodiment, the antibody has a half-life of 4 days or longer. Yet another antibody has a half-life of 7 days or 8 days or more. In another embodiment, the antibody or antigen binding portion thereof is derivatized or modified to have a longer half-life compared to an underivatized or unmodified antibody.

任意で１つ以上のＧＬＰ−１化合物に融合したグルカゴン結合部位を含むポリペプチドも提供される。   Polypeptides comprising a glucagon binding site optionally fused to one or more GLP-1 compounds are also provided.

特定の実施形態では、ＧＬＰ−１／抗体組成物は、少なくとも１つの抗グルカゴン抗体、少なくとも１つのリンカーおよび少なくとも１つのＧＬＰ−１化合物を含む。例示的なリンカーには、限定的でないが、ペプチドリンカー、アルキルリンカー、ＰＥＧリンカーおよび２つのポリペプチドを結合するのに用いられる化学的または酵素的プロセスから生じるリンカーが含まれる。いくつかの組成物では、少なくとも１つの抗グルカゴン抗体は、二本の完全長重鎖および二本の完全長軽鎖を含む。他の組成物では、少なくとも１つの抗グルカゴン抗体は、少なくとも１つの切断型重鎖および／または少なくとも１つの切断型軽鎖を含む。従って、例えば、特定の組成物では、抗体はグルカゴンに結合する能力を保持する断片である。特定の例示的な抗体断片には、限定的でないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が含まれる。 In certain embodiments, the GLP-1 / antibody composition comprises at least one anti-glucagon antibody, at least one linker, and at least one GLP-1 compound. Exemplary linkers include, but are not limited to, peptide linkers, alkyl linkers, PEG linkers, and linkers resulting from chemical or enzymatic processes used to join two polypeptides. In some compositions, the at least one anti-glucagon antibody comprises two full length heavy chains and two full length light chains. In other compositions, the at least one anti-glucagon antibody comprises at least one truncated heavy chain and / or at least one truncated light chain. Thus, for example, in certain compositions, an antibody is a fragment that retains the ability to bind glucagon. Certain exemplary antibody fragments include, but are not limited to, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv and single chain Fv (scFv).

いくつかの組成物におけるＧＬＰ−１化合物のＣ末端は、抗体の軽鎖および／または重鎖のＮ末端に結合され、一方、他の組成物では、ＧＬＰ−１化合物のＮ末端が軽鎖および／または重鎖のＣ末端に結合される。いくつかの組成物では、ＧＬＰ−１化合物はそのＮまたはＣ末端を介して別の分子にそのＮまたはＣ末端を介して結合される。   In some compositions, the C-terminus of the GLP-1 compound is linked to the N-terminus of the antibody light and / or heavy chain, while in other compositions the GLP-1 compound has an N-terminus attached to the light chain and And / or attached to the C-terminus of the heavy chain. In some compositions, the GLP-1 compound is linked via its N or C terminus to another molecule via its N or C terminus.

一部のＧＬＰ−１／抗体組成物は１つの抗グルカゴン抗体および１つのＧＬＰ−１化合物を含む。他の組成物は１つの抗体および２つの化合物を含む。更に他の組成物は１つの抗体および３つ以上のＧＬＰ−１化合物を含む。特定の組成物は２つ以上の抗体および１つのＧＬＰ−１化合物を含む。他の組成物は２つ以上の抗体および２つ以上の化合物を含む。   Some GLP-1 / antibody compositions comprise one anti-glucagon antibody and one GLP-1 compound. Other compositions comprise one antibody and two compounds. Still other compositions comprise one antibody and three or more GLP-1 compounds. Certain compositions comprise more than one antibody and one GLP-1 compound. Other compositions comprise two or more antibodies and two or more compounds.

特定の組成物では、第１のＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の重鎖に結合され、第１の化合物と同じかあるいは異なるアミノ酸配列を有する第２のＧＬＰ−１化合物は、抗体の軽鎖に結合される。この種のいくつかの組成物における抗体および化合物はリンカーを介して結合される。   In certain compositions, the first GLP-1 compound is bound to the heavy chain of an anti-glucagon antibody, and the second GLP-1 compound having the same or different amino acid sequence as the first compound is the light chain of the antibody. Combined with Antibodies and compounds in some such compositions are linked via a linker.

他の組成物では、少なくとも１つのＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の重鎖に融合される。更に他の組成物では、ＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の軽鎖に融合される。いくつかの組成物では、第１のＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の重鎖に融合され、第１の化合物と同じかあるいは異なるアミノ酸配列を有する第２のＧＬＰ−１化合物は、抗体の軽鎖に融合される。特定の実施形態では、抗グルカゴン抗体の重鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つのＧＬＰ−１化合物に融合される。特定の実施形態では、抗体の軽鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つのＧＬＰ−１化合物に融合される。特定の実施形態では、抗体の重鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つの第１のＧＬＰ−１化合物に融合され、抗体の軽鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つの第２のＧＬＰ−１化合物に融合される。   In other compositions, at least one GLP-1 compound is fused to the heavy chain of an anti-glucagon antibody. In yet other compositions, the GLP-1 compound is fused to the light chain of an anti-glucagon antibody. In some compositions, the first GLP-1 compound is fused to the heavy chain of an anti-glucagon antibody, and a second GLP-1 compound having the same or different amino acid sequence as the first compound is a light chain of the antibody. Fused to a chain. In certain embodiments, the heavy chain of an anti-glucagon antibody is fused to at least two GLP-1 compounds having the same or different sequences. In certain embodiments, the light chain of the antibody is fused to at least two GLP-1 compounds having the same or different sequences. In certain embodiments, the antibody heavy chain is fused to at least two first GLP-1 compounds having the same or different sequences, and the antibody light chain has the same or different sequences. Fused to two GLP-1 compounds.

特定の組成物は１つの抗グルカゴン抗体当たり２つのＧＬＰ−１化合物の比率を有する。従って、一部の実施形態では、組成物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖に結合した第１のＧＬＰ−１化合物および抗体の第２の重鎖に結合した第２のＧＬＰ−１化合物を含む。特定の実施形態では、このような組成物は、グルカゴン抗体の第１の軽鎖に結合した第１のＧＬＰ−１化合物および抗体の第２の軽鎖に結合した第２のＧＬＰ−１化合物を含む。１つのグルカゴン抗体当たり２つのＧＬＰ−１化合物の比率を含む他の組成物は、当業者には明らかであろう。   Certain compositions have a ratio of two GLP-1 compounds per anti-glucagon antibody. Thus, in some embodiments, the composition comprises a first GLP-1 compound bound to the first heavy chain of an anti-glucagon antibody and a second GLP-1 compound bound to the second heavy chain of the antibody. including. In certain embodiments, such a composition comprises a first GLP-1 compound bound to the first light chain of a glucagon antibody and a second GLP-1 compound bound to the second light chain of the antibody. Including. Other compositions comprising a ratio of two GLP-1 compounds per glucagon antibody will be apparent to those skilled in the art.

いくつかの組成物は１つの抗グルカゴン抗体当たり４つのＧＬＰ−１化合物を含む。従って、一部の実施形態では、組成物は、グルカゴン抗体の第１の重鎖に結合した第１のＧＬＰ−１化合物、抗体の第２の重鎖に結合した第２の化合物、抗体の第１の軽鎖に結合した第３の化合物および抗体の第２の軽鎖に結合した第４の化合物を含む。特定の組成物では、このような組成物は、グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合した第１のＧＬＰ−１化合物、抗体の第１の重鎖のＣ末端に結合した第２の化合物、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合した第３の化合物および抗体の第２の重鎖のＣ末端に結合した第４の化合物を含む。他の組成物では、第１のＧＬＰ−１化合物および第２のＧＬＰ−１化合物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合し、第３のＧＬＰ−１化合物および第４のＧＬＰ−１化合物は、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合する。１つの抗グルカゴン抗体当たり４つのＧＬＰ−１化合物の比率を含む更なる組成物を当業者が設計できるように、他の様々な組成物も本明細書に含まれる。   Some compositions contain 4 GLP-1 compounds per anti-glucagon antibody. Thus, in some embodiments, the composition comprises a first GLP-1 compound bound to the first heavy chain of a glucagon antibody, a second compound bound to the second heavy chain of the antibody, A third compound coupled to one light chain and a fourth compound coupled to the second light chain of the antibody. In certain compositions, such a composition comprises a first GLP-1 compound attached to the N-terminus of the first heavy chain of the glucagon antibody, a second GLP-1 compound attached to the C-terminus of the first heavy chain of the antibody. A third compound attached to the N-terminus of the second heavy chain of the antibody and a fourth compound attached to the C-terminus of the second heavy chain of the antibody. In other compositions, the first GLP-1 compound and the second GLP-1 compound bind to the N-terminus of the first heavy chain of the anti-glucagon antibody, and the third GLP-1 compound and the fourth GLP-1 compound The GLP-1 compound binds to the N-terminus of the second heavy chain of the antibody. Various other compositions are also included herein so that one skilled in the art can design additional compositions comprising a ratio of 4 GLP-1 compounds per anti-glucagon antibody.

更に他の組成物は１つの抗グルカゴン抗体当たり８つのＧＬＰ−１化合物を含む。例えば、いくつかの組成物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合した第１のＧＬＰ−１化合物、抗体の第１の重鎖のＣ末端に結合した第２の化合物、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合した第３の化合物、抗体の第２の重鎖のＣ末端に結合した第４の化合物、抗体の第１の軽鎖のＮ末端に結合した第５の化合物、抗体の第１の軽鎖のＣ末端に結合した第６の化合物、抗体の第２の軽鎖のＮ末端に結合した第７の化合物および抗体の第２の軽鎖のＣ末端に結合した第８の化合物を含む。他の組成物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合した第１および第２のＧＬＰ−１化合物、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合した第３および第４の化合物、抗体の第１の軽鎖のＮ末端に結合した第５および第６の化合物ならびに抗体の第２の軽鎖のＮ末端に結合した第７および第８の化合物を含む。１つの抗グルカゴン抗体当たり８つのＧＬＰ−１化合物の比率を含む更なるＧＬＰ−１／抗体組成物を当業者が設計できるように、同様の比率を含む他の更なる組合せが含まれる。
Ａ．抗体
組成物の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはインタクトなヒト抗体ならびにこのような抗体の免疫学的に機能性の断片（例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片、ドメイン抗体または免疫接着物（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ））であってよい。組成物はグルカゴンに結合する能力を有するポリペプチド（例えば、抗体抗原結合部位を含むポリペプチド）も含み得る。 Still other compositions comprise 8 GLP-1 compounds per anti-glucagon antibody. For example, some compositions comprise a first GLP-1 compound attached to the N-terminus of the first heavy chain of the anti-glucagon antibody, a second compound attached to the C-terminus of the first heavy chain of the antibody, A third compound attached to the N-terminus of the second heavy chain of the antibody; a fourth compound attached to the C-terminus of the second heavy chain of the antibody; and a third compound attached to the N-terminus of the first light chain of the antibody. 5, a sixth compound attached to the C-terminus of the first light chain of the antibody, a seventh compound attached to the N-terminus of the second light chain of the antibody, and the C-terminus of the second light chain of the antibody An eighth compound bound to Other compositions include first and second GLP-1 compounds attached to the N-terminus of the first heavy chain of the anti-glucagon antibody, third and fourth attached to the N-terminus of the second heavy chain of the antibody. And the fifth and sixth compounds bound to the N-terminus of the first light chain of the antibody and the seventh and eighth compounds bound to the N-terminus of the second light chain of the antibody. Other additional combinations containing similar ratios are included so that one skilled in the art can design additional GLP-1 / antibody compositions containing a ratio of 8 GLP-1 compounds per anti-glucagon antibody.
A. Antibodies of antibody compositions include chimeric, humanized or intact human antibodies and immunologically functional fragments of such antibodies (eg, F (ab), F (ab ′), F (ab ′ ) 2 , Fv, single chain Fv fragment, domain antibody or immunoadhesion). The composition can also include a polypeptide capable of binding to glucagon (eg, a polypeptide comprising an antibody antigen binding site).

提供されるいくつかの組成物において有用な、グルカゴンに結合する１つの例示的な抗体は、ＡＧ１５９と称される。この抗体はインタクトなヒト抗体である。完全長軽鎖および重鎖配列、軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列ならびに軽鎖および重鎖ＣＤＲが、以下の表１および２に示される。当業者は本明細書で述べられる方法および手法を用いて、グルカゴンに結合する更なる抗体を作製し、同定することができる。例えば、例示的なグルカゴン抗体およびそれらを作製する方法が米国特許第５，７７０，４４５号に述べられている。
１．例示的な天然抗体
いくつかの組成物は天然抗体と典型的に関連する構造を有する抗体を含む。通常、これらの抗体の構造単位は１つ以上の四量体を含み、その各々が２つの同一対のポリペプチド鎖からなるが、一部の哺乳動物種は単一重鎖のみを有する抗体を生成する。典型的な抗体では、各ペアまたは対は一本の完全長「軽」鎖および一本の完全長「重」鎖を含む。各個々の免疫グロブリン鎖は複数の「免疫グロブリンドメイン」からなり、その各々がほぼ９０〜１１０個のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを発現する。これらのドメインは抗体ポリペプチドが構成される基本単位である。通常、各鎖のアミノ末端部分は抗原認識に関与する可変ドメインを含む。カルボキシ末端部分は鎖の他端よりも進化的に保存され、「定常領域」または「Ｃ領域」と称される。一般的に、ヒト軽鎖はκおよびλ軽鎖に分類され、これらの各々が１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含む。通常、重鎖は、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖またはε鎖に分類され、これらは抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義づける。ＩｇＧは複数のサブタイプを有し、限定的でないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。ＩｇＭサブタイプはＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含む。ＩｇＡサブタイプはＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む。ヒトでは、ＩｇＡアイソタイプおよびＩｇＤアイソタイプは四本の重鎖および四本の軽鎖を含む；ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは二本の重鎖および二本の軽鎖を含む；ＩｇＭアイソタイプは五本の重鎖および五本の軽鎖を含む。通常、重鎖Ｃ領域はエフェクター機能に関与し得る１つ以上のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数はアイソタイプに依存する。例えば、ＩｇＧ重鎖は各々がＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３として周知の３つのＣ領域ドメインを含む。提供される抗体はこれらのアイソタイプおよびサブタイプを任意に有することができる。 One exemplary antibody that binds glucagon useful in some of the compositions provided is designated AG159. This antibody is an intact human antibody. Full length light and heavy chain sequences, light chain variable region and heavy chain variable region sequences, and light and heavy chain CDRs are shown in Tables 1 and 2 below. One skilled in the art can use the methods and techniques described herein to generate and identify additional antibodies that bind to glucagon. For example, exemplary glucagon antibodies and methods for making them are described in US Pat. No. 5,770,445.
1. Exemplary Natural Antibodies Some compositions comprise an antibody having a structure typically associated with a natural antibody. Usually, the structural units of these antibodies contain one or more tetramers, each consisting of two identical pairs of polypeptide chains, but some mammalian species produce antibodies with only a single heavy chain. To do. In a typical antibody, each pair or pair comprises one full length “light” chain and one full length “heavy” chain. Each individual immunoglobulin chain consists of a plurality of “immunoglobulin domains”, each of which consists of approximately 90-110 amino acids and expresses a characteristic folding pattern. These domains are the basic units that make up antibody polypeptides. Usually, the amino-terminal portion of each chain contains a variable domain involved in antigen recognition. The carboxy terminal portion is more evolutionarily conserved than the other end of the chain and is referred to as the “constant region” or “C region”. In general, human light chains are classified as kappa and lambda light chains, each of which contains one variable domain and one constant domain. Usually, heavy chains are classified as μ, δ, γ, α, or ε chains, which define the antibody isotype as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, respectively. IgG has multiple subtypes, including but not limited to IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 and IgG 4 . IgM subtypes include IgM 1 and IgM 2 . IgA subtypes include IgA 1 and IgA 2 . In humans, IgA and IgD isotypes contain four heavy chains and four light chains; IgG and IgE isotypes contain two heavy chains and two light chains; IgM isotypes have five heavy chains And five light chains. Usually, the heavy chain C region contains one or more domains that may be involved in effector function. The number of heavy chain constant region domains depends on the isotype. For example, an IgG heavy chain contains three C region domains, each known as C H 1, C H 2 and C H 3. The provided antibodies can optionally have these isotypes and subtypes.

完全長軽鎖および重鎖では、可変領域および定常領域は約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（汎用目的にその全体を参照して本明細書に援用される）を参照されたい。通常、各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は抗原結合部位を形成する。   In full-length light and heavy chains, the variable and constant regions are joined by a “J” region of about 12 or more amino acids, and the heavy chain also includes a “D” region of about 10 or more amino acids. For example, Fundamental Immunology, 2nd ed. , Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press (incorporated herein by reference in its entirety for general purposes). Usually, the variable regions of each light / heavy chain pair form an antigen binding site.

通常、可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により結合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。通常、各ペアの２鎖のＣＤＲはフレームワーク領域内に組み込まれ、特定のエピトープへの結合を可能とし得る。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は共に、通常、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４ドメインを含む。通常、各ドメインへのアミノ酸の割当は、以下に更に詳細に説明されるように、Ｋａｂａｔらの定義に従う。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）；更に、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３も参照されたい。ＣＤＲは抗原結合に対する主要表面接触点を構成する。例えば、上記ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋを参照されたい。更に、軽鎖のＣＤＲ３、特に、重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域内にて抗原結合における最も重要な決定基を構成し得る。例えば、上記ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ；Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏら（２００１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：６０３−１５；ＸｕおよびＤａｖｉｓ（２０００），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３（１）：３７−４５；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２８）：２６２８５−９０；ならびにＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（４）：２７７−３０２を参照されたい。一部の抗体では、重鎖ＣＤＲ３は抗原と抗体との接触の主要領域を構成するように思われる。上記Ｄｅｓｍｙｔｅｒら。抗体の結合特性を変化させるのに、ＣＤＲ３のみが変化させられたインビトロ選択スキームを用いることができる。   Usually, a variable region exhibits the same general structure of relatively conserved framework regions (FR) joined by three hypervariable regions, also called complementarity determining regions or CDRs. Usually, each pair of two-chain CDRs is incorporated within a framework region and may allow binding to a particular epitope. From the N-terminus to the C-terminus, both the light chain variable region and the heavy chain variable region usually comprise FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4 domains. Usually, the assignment of amino acids to each domain follows the definition of Kabat et al., As described in more detail below. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Intersect (1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.); Chothia and Lesk, 1987, J. Am. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 878-883. CDRs constitute the major surface contact points for antigen binding. See, for example, Chothia and Lesk above. Furthermore, the CDR3 of the light chain, in particular the CDR3 of the heavy chain, may constitute the most important determinant in antigen binding within the light chain variable region and heavy chain variable region. See, for example, Chothia and Lesk; Desiderio et al. (2001), J. Am. Mol. Biol. 310: 603-15; Xu and Davis (2000), Immunity 13 (1): 37-45; Desmyter et al. (2001), J. MoI. Biol. Chem. 276 (28): 26285-90; and Muyldermans (2001), J. MoI. Biotechnol. 74 (4): 277-302. For some antibodies, the heavy chain CDR3 appears to constitute the major region of contact between the antigen and the antibody. Desmyter et al. An in vitro selection scheme in which only CDR3 is altered can be used to alter the binding properties of the antibody.

ＣＤＲは重鎖可変領域配列において以下のように配置され得る。ＣＤＲ１は成熟抗体のほぼ残基３１にて開始し、通常、約５〜７アミノ酸長であり、ほぼ常に、Ｃｙｓ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ（配列番号９３）（「Ｘｘ」は任意のアミノ酸である）が先行する。重鎖ＣＤＲ１に続く残基はほぼ常にトリプトファンであり、Ｔｙｐ−Ｖａｌ、Ｔｒｐ−ＩｌｅまたはＴｒｐ−Ａｌａであることが多い。ＣＤＲ１における最後の残基とＣＤＲ２における最初の残基との間に、ほぼ常に１４個のアミノ酸があり、通常、ＣＤＲ２は１６〜１９個のアミノ酸を含む。ＣＤＲ２は直前にＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号９４）が先行し、直後にＬｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが後続し得る。他のアミノ酸がＣＤＲ２に先行あるいは後続し得る。ＣＤＲ２における最後の残基とＣＤＲ３における最初の残基との間に、ほぼ常に３２個のアミノ酸があり、ＣＤＲ３は約３〜２５残基長となり得る。Ｃｙｓ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘがほぼ常にＣＤＲ３に直前に先行し、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘｘｘ−Ｇｌｙ（配列番号９５）がほぼ常にＣＤＲ３に後続する。   The CDRs can be arranged as follows in the heavy chain variable region sequence. CDR1 starts at approximately residue 31 of the mature antibody and is usually about 5-7 amino acids long, almost always Cys-Xxx-Xxx-Xxxx-Xxxx-Xxxx-Xxx-Xxx (SEQ ID NO: 93) ("Xx" is any amino acid). The residue following heavy chain CDR1 is almost always tryptophan, often Typ-Val, Trp-Ile or Trp-Ala. There are almost always 14 amino acids between the last residue in CDR1 and the first residue in CDR2, and CDR2 usually contains 16-19 amino acids. CDR2 is immediately preceded by Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (SEQ ID NO: 94) and immediately followed by Lys / Arg-Leu / Ile / Val / Phe / Thr / Ala-Thr / Ser / Ile / Ala. obtain. Other amino acids may precede or follow CDR2. There are almost always 32 amino acids between the last residue in CDR2 and the first residue in CDR3, and CDR3 can be about 3-25 residues long. Cys-Xxx-Xxx almost always immediately precedes CDR3, and Trp-Gly-Xxx-Gly (SEQ ID NO: 95) almost always follows CDR3.

軽鎖ＣＤＲは軽鎖配列において以下のように配置され得る。ＣＤＲ１は成熟抗体のほぼ残基２４にて開始し、通常、約１０〜１７残基長である。ＣＤＲ１にはほぼ常にＣｙｓが先行する。ＣＤＲ１の最後の残基とＣＤＲ２の最初の残基との間に、ほぼ常に１５個のアミノ酸があり、ＣＤＲ２はほぼ常に７残基長である。通常、ＣＤＲ２にはＩｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−ＬｙｓまたはＩｌｅ−Ｐｈｅが先行する。軽鎖ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間にほぼ常に３２個の残基があり、通常、ＣＤＲ３は約７〜１０アミノ酸長である。ＣＤＲ３はほぼ常にＣｙｓが先行し、通常、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｘｘｘ−Ｇｌｙ（配列番号９６）が後続する。   The light chain CDRs can be arranged in the light chain sequence as follows: CDR1 starts at approximately residue 24 of the mature antibody and is usually about 10 to 17 residues long. CDR1 is almost always preceded by Cys. There are almost always 15 amino acids between the last residue of CDR1 and the first residue of CDR2, and CDR2 is almost always 7 residues long. Normally, CDR2 is preceded by Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys, or Ile-Phe. There are almost always 32 residues between light chain CDR2 and CDR3, and CDR3 is usually about 7-10 amino acids long. CDR3 is almost always preceded by Cys, usually followed by Phe-Gly-Xxx-Gly (SEQ ID NO: 96).

ＣＤＲを取り囲むフレームワーク領域の長さが、それらの長さを典型と異なるようにさせる挿入および欠失を含み得ることに当業者は気づくであろう。本明細書で意味するように、重鎖フレームワーク領域の長さは以下：ＦＲ１、０〜４１個のアミノ酸；ＦＲ２、５〜２４個のアミノ酸；ＦＲ３、１３〜４２個のアミノ酸；およびＦＲ４、０〜２１個のアミノ酸；の範囲内である。更に、本発明では、軽鎖フレームワーク領域の長さが以下：の範囲内となることを意図し；ＦＲ１、６〜３５個のアミノ酸；ＦＲ２、４〜２５個のアミノ酸；ＦＲ３、２〜４２個のアミノ酸；およびＦＲ４、０〜２３個のアミノ酸；の範囲内である。   Those skilled in the art will be aware that the length of framework regions surrounding the CDRs may include insertions and deletions that make them different from typical ones. As meant herein, the length of the heavy chain framework region is as follows: FR1, 0-41 amino acids; FR2, 5-24 amino acids; FR3, 13-42 amino acids; and FR4, 0 to 21 amino acids. Furthermore, in the present invention, the length of the light chain framework region is intended to be within the following range: FR1, 6-35 amino acids; FR2, 4-25 amino acids; FR3, 2-42 And within the range of FR4, 0-23 amino acids.

通常、天然抗体は、タンパク質分泌のために抗体を細胞経路に誘導し、かつ成熟抗体には存在しない単一配列を含む。本明細書で提供されるような抗体をコードするポリヌクレオチドは、下述のように、天然シグナル配列または異種シグナル配列をコードし得る。   Natural antibodies typically contain a single sequence that directs the antibody to the cellular pathway for protein secretion and is absent from mature antibodies. A polynucleotide encoding an antibody as provided herein can encode a natural signal sequence or a heterologous signal sequence, as described below.

抗体はインビトロにて成熟させ、改変特性、例えば、抗原に対するより高い親和性またはより低い解離定数を有する抗体を作製することができる。ＣＤＲ内の残基のみ、特に、ＣＤＲ３ｓの変形は、同一の抗原に結合するが、より高い親和性を有する改変抗体をもたらし得る。例えば、Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−６７；Ｙａｎｇら、１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３を参照されたい。本発明は、種々のインビトロでの選択スキーム、例えば、親和性成熟および／または鎖シャッフリング（Ｋａｎｇら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１１２０−２３）あるいはＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１）により作製される抗体を包含し、これにより、抗体は有利な特性を有するように選択され得る。多くのスキームでは、公知の抗体がインビトロにて多くはＣＤＲ内の特定の位置においてランダム化され、選択プロセスを受け、これにより、所望の特性、例えば、特定の抗原に対する親和性の増大を有する抗体が単離され得る。例えば、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｕｃｋｅｎら、２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：５９１−６０１；Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏら、２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：６０３−１５；Ｙａｎｇら、１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−６７を参照されたい。通常、このような変異抗体は、突然変異誘発および選択工程の設計に依存し、１つ以上のＣＤＲにおける複数の改変残基を含み得る。例えば、上記ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｕｃｋｅｎらを参照されたい。   Antibodies can be matured in vitro to produce antibodies with altered properties, such as higher affinity for antigen or lower dissociation constant. Only residues within the CDRs, in particular variants of CDR3s, can result in modified antibodies that bind to the same antigen but have a higher affinity. See, for example, Schier et al., 1996, J. MoI. Mol. Biol. 263: 551-67; Yang et al., 1995, J. MoI. Mol. Biol. 254: 392-403. The present invention provides various in vitro selection schemes such as affinity maturation and / or strand shuffling (Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 11120-23) or DNA shuffling (Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391), by which antibodies can be selected to have advantageous properties. In many schemes, known antibodies are randomized in vitro, often at specific positions within the CDRs, and undergo a selection process that results in an antibody having a desired property, eg, increased affinity for a particular antigen. Can be isolated. For example, van den Beucken et al., 2001, J. MoI. Mol. Biol. 310: 591-601; Desiderio et al., 2001, J. MoI. Mol. Biol. 310: 603-15; Yang et al., 1995, J. MoI. Mol. Biol. 254: 392-403; Schier et al., 1996, J. MoI. Mol. Biol. 263: 551-67. Typically, such variant antibodies will contain multiple modified residues in one or more CDRs, depending on the design of the mutagenesis and selection process. See, for example, van den Beucken et al.

提供される抗体の一部の完全長軽鎖および重鎖の具体例ならびにそれらの対応するアミノ酸配列は、表１に挙げられるものを含み、表１はＡＧ１５９の軽鎖および重鎖配列を示す。軽鎖および重鎖に関連する更なる配列が表２に挙げられる。一部の重鎖配列のＣ末端は、タンパク質が発現する宿主に依存して、．．．ＳＬＳＰＧＫまたは．．．ＳＬＳＰＧにて終止し得る。Ｃ末端リジンが存在し、あるいは存在しないことは、リジンの記号を括弧に入れることにより、即ち、（Ｋ）により、表１および２に示される。例えば、ＣＨＯ細胞では、Ｃ末端リジンは切断され、．．．ＳＬＳＰＧＫではなく．．．ＳＬＳＰＧのＣ末端配列をもたらす。   Specific examples of some full-length light and heavy chains and their corresponding amino acid sequences of the antibodies provided include those listed in Table 1, which shows the light and heavy chain sequences of AG159. Additional sequences associated with the light and heavy chains are listed in Table 2. Depending on the host in which the protein is expressed,. . . SLSPGK or. . . Can be terminated with SLSPG. The presence or absence of the C-terminal lysine is shown in Tables 1 and 2 by placing the lysine symbol in parentheses, ie, (K). For example, in CHO cells, the C-terminal lysine is cleaved and. . . Not SLSPGK. . . Resulting in the C-terminal sequence of SLSPG.

表１：軽鎖および重鎖   Table 1: Light and heavy chains

Figure 2009534424
表２
Figure 2009534424
 Table 2

Figure 2009534424
表１に挙げられる軽鎖は表１に示される任意の重鎖と組み合わせられ、抗体を形成することができる。従って、特定の組成物に含まれる抗体は、Ｌ１がＨ１またはＨ２と組み合わせられる抗体を含む。いくつかの例では、抗体は表１に挙げられるものから少なくとも一本の重鎖および一本の軽鎖を含む。他の例では、抗体は二本の同一軽鎖および二本の同一重鎖を含む。一例として、抗体は二本のＬ１軽鎖および二本のＨ１重鎖あるいは二本のＬ１軽鎖および二本のＨ２重鎖を含み得る。
Figure 2009534424
 The light chains listed in Table 1 can be combined with any heavy chain shown in Table 1 to form antibodies. Accordingly, antibodies included in a particular composition include antibodies in which L1 is combined with H1 or H2. In some examples, the antibody comprises at least one heavy chain and one light chain from those listed in Table 1. In other examples, the antibody comprises two identical light chains and two identical heavy chains. As an example, an antibody can comprise two L1 light chains and two H1 heavy chains or two L1 light chains and two H2 heavy chains.

他の組成物は、表１に示される重鎖および軽鎖の組合せにより形成される抗体の改変体である抗体を含み、これらの鎖のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を各々が有する軽鎖および／または重鎖を含む。いくつかの例では、このような抗体は少なくとも一本の重鎖および一本の軽鎖を含み、一方、他の例では、改変体型は二本の同一軽鎖および二本の同一重鎖を含む。
２．抗体可変ドメイン
特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、配列番号７９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および／または配列番号８３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ならびにこれらの軽鎖可変領域および重鎖可変領域の免疫学的に機能性の断片、誘導体、突然変異タンパク質および改変体を含む抗体を含む。可変ドメイン配列は表３に示される。 Other compositions include antibodies that are variants of antibodies formed by the heavy and light chain combinations shown in Table 1, and the amino acid sequences of these chains and at least 50%, 60%, 70%, 75 It includes light and / or heavy chains, each having%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% or 99% identity. In some examples, such an antibody comprises at least one heavy chain and one light chain, while in other examples, a variant form contains two identical light chains and two identical heavy chains. Including.
2. Antibody Variable Domain Certain GLP-1 compounds / antibody compositions comprise a light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and / or a heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83, as well as these light chain variable regions and Includes antibodies, including immunologically functional fragments, derivatives, muteins and variants of the heavy chain variable region. The variable domain sequences are shown in Table 3.

表３   Table 3

Figure 2009534424
いくつかの組成物の抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基のみにて配列番号７９の配列と異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、このような配列差の各々は独立して、１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換である。一部の抗体における軽鎖可変領域は、配列番号７９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
Figure 2009534424
 Some compositions of antibodies have the sequence of SEQ ID NO: 79 with only 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acid residues. It includes a light chain variable domain comprising a sequence of different amino acids, and each such sequence difference is independently a single amino acid deletion, insertion or substitution. The light chain variable region in some antibodies is at least 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% with the amino acid sequence of the light chain variable region of SEQ ID NO: 79. Or a sequence of amino acids with 99% sequence identity.

提供される特定の組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基のみにて配列番号８３の配列と異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、このような配列差の各々は独立して、１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換である。一部の抗体における重鎖可変領域は、配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
３．抗体のＣＤＲ
所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４２，１９９１においてＫａｂａｔらにより述べられているシステムを用いて同定され得る。本明細書で開示される組成物の特定の抗体は、表４にまとめる１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列と同一であるか、あるいは該アミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。 The specific composition provided is a sequence of SEQ ID NO: 83 with only 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acid residues. Including heavy chain variable domains containing different amino acid sequences, each such sequence difference is independently a deletion, insertion or substitution of one amino acid. The heavy chain variable region in some antibodies comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83 and at least 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% or 99% sequence Includes sequences of amino acids having identity.
3. Antibody CDRs
The complementarity determining region (CDR) and framework region (FR) of a given antibody are described in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. , US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991 can be identified using the system described by Kabat et al. Certain antibodies of the compositions disclosed herein can be one or more of the amino acid sequences of one or more CDRs summarized in Table 4 or having substantial sequence identity with the amino acid sequences. Contains amino acid sequence.

表４：ＣＤＲ   Table 4: CDR

Figure 2009534424
提供される特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の抗体は、１、２、３、４、５または全６個の上記一覧のＣＤＲを含み得る。一部の抗体は軽鎖ＣＤＲ３および／または重鎖ＣＤＲ３を含む。特定の抗体は表４に挙げたＣＤＲの変異形を有し、１つ以上（例えば、２、３、４、５または６）のＣＤＲの各々が表４に挙げたＣＤＲ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。例えば、抗体または断片は、表４に挙げた軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３のそれぞれと少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を各々が有する軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３を含み得る。また、任意のＣＤＲのアミノ酸配列が表４に挙げた配列とわずか１、２、３、４または５個のアミノ酸残基のみ異なるように、提供される一部の抗体のＣＤＲ配列は表４に挙げたＣＤＲ配列と異なり得る。通常、一覧表示された配列との相違は保存的置換である（以下参照）。
Figure 2009534424
 The antibodies of a particular GLP-1 compound / antibody composition provided can comprise 1, 2, 3, 4, 5 or a total of 6 CDRs as listed above. Some antibodies comprise light chain CDR3 and / or heavy chain CDR3. Certain antibodies have variants of the CDRs listed in Table 4 and each of one or more (eg, 2, 3, 4, 5 or 6) CDRs is at least 50% of the CDR sequences listed in Table 4, It has 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% or 95% sequence identity. For example, the antibody or fragment has at least 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% or 95% sequence identity with each of the light chain CDR3 and heavy chain CDR3 listed in Table 4. Can each comprise a light chain CDR3 and a heavy chain CDR3. Also, the CDR sequences of some of the antibodies provided are in Table 4 so that the amino acid sequence of any CDR differs from the sequence listed in Table 4 by only 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues. It may be different from the CDR sequences listed. The difference from the listed sequences is usually a conservative substitution (see below).

好適なベクターを用いることにより、１つもしくはそれ以上の軽鎖または重鎖ＣＤＲを含むポリペプチドが生成され、以下に更に詳細に述べられるようにポリペプチドを好適な宿主細胞に発現させ得る。   By using a suitable vector, a polypeptide comprising one or more light or heavy chain CDRs can be produced and the polypeptide can be expressed in a suitable host cell as described in more detail below.

表３および４に開示される重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲは、限定的でないが、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体およびｓｃＦｖｓを含む、当該分野で公知の種々のタイプの免疫学的に機能性の断片のいずれかを調製するのに用いることができる。
４．モノクローナル抗体
提供される特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、グルカゴン（例えば、ヒトグルカゴン）に結合するモノクローナル抗体を含む。当該分野で公知の任意の手法を用いて、例えば、免疫化スケジュールの完了後、トランスジェニック動物から採取した脾細胞を不死化することにより、モノクローナル抗体は作製され得る。当該分野で公知の任意の手法を用いて、例えば、脾細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製することにより、脾細胞は不死化され得る。ハイブリドーマ作製の融合処理に用いる骨髄腫細胞は、非抗体産生性であり、高融合効率および所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地で増殖することができないようにさせる酵素欠損を有することが好ましい。マウスにおける融合に用いる好適な細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕ１が含まれ；ラットにおける融合に用いられる細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。 The heavy and light chain variable regions and CDRs disclosed in Tables 3 and 4 include, but are not limited to, domain antibodies, Fab fragments, Fab ′ fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fv fragments, single chain antibodies and scFvs Can be used to prepare any of the various types of immunologically functional fragments known in the art.
4). Monoclonal Antibodies Certain GLP-1 compound / antibody compositions provided include monoclonal antibodies that bind to glucagon (eg, human glucagon). Monoclonal antibodies can be generated using any technique known in the art, eg, by immortalizing splenocytes taken from the transgenic animal after completion of the immunization schedule. Splenocytes can be immortalized using any technique known in the art, for example, by fusing spleen cells with myeloma cells to produce a hybridoma. The myeloma cells used in the fusion treatment for hybridoma production are non-antibody producing enzymes that prevent high proliferation efficiency and growth in specific selective media that support the growth of only the desired fused cells (hybridoma). It is preferable to have a defect. Examples of suitable cell lines for fusion in mice include Sp-20, P3-X63 / Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1 / 1.1. Ag 41, Sp210-Ag14, FO, NSO / U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 and S194 / 5XX0 Bu1; examples of cell lines used for fusion in rats include R210. RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F and 4B210 are included. Other cell lines useful for cell fusion are U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 and UC729-6.

いくつかの例では、グルカゴン免疫原で動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）を免疫化し、免疫化動物から脾細胞を採取し、採取した脾細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、これにより、ハイブリドーマ細胞を作製し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、グルカゴンに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することにより、ハイブリドーマ細胞株は作製される。   In some examples, an animal (eg, a transgenic animal having a human immunoglobulin sequence) is immunized with a glucagon immunogen, splenocytes are collected from the immunized animal, and the collected splenocytes are fused to a myeloma cell line. Thus, a hybridoma cell line is prepared by preparing a hybridoma cell, establishing a hybridoma cell line from the hybridoma cell, and identifying a hybridoma cell line that produces an antibody that binds to glucagon.

ハイブリドーマ細胞株から分泌されるモノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の手法を用いて精製することができる。ハイブリドーマまたはｍＡｂｓは、特定の特性、例えば、グルカゴン誘発性活性を阻止する能力を有するｍＡｂを同定するため、更にスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングの例は以下の実施例に示される。
５．キメラ抗体およびヒト化抗体
他のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物はキメラまたはヒト化抗体を含む。治療剤として用いるモノクローナル抗体は使用前に種々の方法で修飾され得る。一例は「キメラ」抗体であり、これは、共有結合して機能性免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖またはそれらの免疫学的に機能性の部分を生成する、異なる抗体由来のタンパク質セグメントからなる抗体である。一般に、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種に由来し、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一かあるいは相同であり、一方、鎖の残部は、別の種由来であり、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一かあるいは相同である。キメラ抗体に関する方法については、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照されたい。これらは参考として本明細書に援用される。ＣＤＲグラフト化については、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号および同第５，５３０，１０１号に述べられており、これらはすべて、汎用目的で参考として本明細書に援用される。 Monoclonal antibodies secreted from hybridoma cell lines can be purified using any technique known in the art. Hybridomas or mAbs can be further screened to identify mAbs that have specific properties, such as the ability to block glucagon-induced activity. Examples of such screening are shown in the examples below.
5. Chimeric and humanized antibodies Other GLP-1 compound / antibody compositions include chimeric or humanized antibodies. Monoclonal antibodies used as therapeutic agents can be modified in various ways before use. An example is a “chimeric” antibody, which is an antibody consisting of protein segments from different antibodies that are covalently linked to produce a functional immunoglobulin light or heavy chain or an immunologically functional portion thereof. is there. In general, a portion of the heavy and / or light chain is the same or homologous to the corresponding sequence in an antibody belonging to a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the rest of the chain is separate Or the same or homologous to the corresponding sequence in an antibody belonging to another antibody class or subclass. For methods relating to chimeric antibodies, see, eg, US Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1985). These are hereby incorporated by reference. For CDR grafting, for example, U.S. Patent Nos. 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089 and 5,530. , 101, all of which are incorporated herein by reference for general purposes.

一般に、キメラ抗体を作製する目標は、対象患者種由来のアミノ酸の数が最大となるキメラを作製することである。一例は、抗体が、特定の種に由来し、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、一方、抗体鎖の残部が、別の種由来であり、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一かあるいは相同である、「ＣＤＲグラフト化」抗体である。ヒトにおける使用では、齧歯動物抗体由来のＶ領域または選択ＣＤＲがヒト抗体にグラフト化され、ヒト抗体の天然Ｖ領域または選択ＣＤＲを置き換えることが多い。   In general, the goal of producing a chimeric antibody is to produce a chimera that maximizes the number of amino acids from the subject patient species. One example is that the antibody comprises one or more complementarity determining regions (CDRs) from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the remainder of the antibody chain is from another species A “CDR grafted” antibody that is the same or homologous to the corresponding sequence in an antibody that is, or belongs to, another antibody class or subclass. For use in humans, V regions or selected CDRs from rodent antibodies are often grafted onto human antibodies, replacing the natural V regions or selected CDRs of human antibodies.

１つの有用なタイプのキメラ抗体は「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、当初、非ヒト動物において産出されたモノクローナル抗体から作製される。このモノクローナル抗体における特定のアミノ酸残基、典型的には、抗体の非抗原認識部分由来の残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基と相同となるように修飾される。ヒト化は種々の方法を用いて、例えば、齧歯動物可変領域の少なくとも一部分をヒト抗体の対応する領域に置換することにより実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号；Ｊｏｎｅｓら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−３６を参照）。
６．完全ヒト抗体
抗体が完全ヒト抗体である組成物も提供される。上述のように、本明細書で開示されるＡＧ１５９ Ａｂは完全ヒト抗グルカゴン抗体の一例である。ヒトを抗原に曝すことなく、グルカゴンに特異的な他の完全ヒト抗体を作製する方法が利用可能である（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の作製を実施する１つの手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内在性Ｉｇ遺伝子が不活化される、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座のマウスへの導入は、任意の所望の抗原で免疫化することができる動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製する一手段である。完全ヒト抗体を用いることは、治療剤としてマウスまたはマウス誘導体化Ｍａｂをヒトに投与することによって引き起こされ得る場合がある免疫原性およびアレルギー反応を最小限にすることができる。 One useful type of chimeric antibody is a “humanized” antibody. In general, humanized antibodies are produced from monoclonal antibodies originally produced in non-human animals. Certain amino acid residues in this monoclonal antibody, typically residues from the non-antigen recognition portion of the antibody, are modified to be homologous to the corresponding residues in the human antibody of the corresponding isotype. Humanization can be performed using a variety of methods, for example, by replacing at least a portion of a rodent variable region with a corresponding region of a human antibody (see, eg, US Pat. No. 5,585,089 and No. 5,693,762; Jones et al., 1986, Nature 321: 522-25; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-36).
6). Also provided are compositions in which the fully human antibody is a fully human antibody. As mentioned above, AG159 Ab disclosed herein is an example of a fully human anti-glucagon antibody. Methods are available for making other fully human antibodies specific for glucagon without exposing the human to the antigen ("fully human antibodies"). One means of carrying out the production of fully human antibodies is “humanization” of the mouse humoral immune system. Introduction of human immunoglobulin (Ig) loci into mice in which the endogenous Ig gene is inactivated can be achieved by using fully human monoclonal antibodies (MAbs) in mice that are animals that can be immunized with any desired antigen. It is one means of manufacturing. Using fully human antibodies can minimize immunogenicity and allergic reactions that may be caused by administering mouse or mouse derivatized Mabs to humans as therapeutic agents.

完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生なしにヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（通常、マウス）を免疫化することにより、作製することができる。通常、これを目的とする抗原は６個またはそれ以上の隣接アミノ酸を有し、任意で、ハプテンなどの担体に接合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８；およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。このような方法の一例では、マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする内在性マウス免疫グロブリン遺伝子座を不能化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡの大断片をマウスに挿入することにより、トランスジェニック動物が作製される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全補体以下のものを有する部分的に改変された動物は、次に、交雑され、所望の免疫系の改変をすべて有する動物が得られる。免疫原を投与されると、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に免疫特異的であるがマウスアミノ酸配列よりむしろヒトアミノ酸配列（可変領域を含む）を有する抗体を産生する。このような方法の更なる詳細については、例えば、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９４／０２６０２を参照されたい。これらは参考として本明細書に援用される。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関する更なる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号；同第６，７１３，６１０号；同第６，６７３，９８６号；同第６，１６２，９６３号；同第５，５４５，８０７号；同第６，３００，１２９号；同第６，２５５，４５８号；同第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号および同第５，５４５，８０６号；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１０７４１，ＷＯ９０／０４０３６ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号および欧州特許第５４６０７３Ａ１号に述べられており、これらはすべて、汎用目的でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。   Fully human antibodies can be made by immunizing a transgenic animal (usually a mouse) capable of producing a repertoire of human antibodies without endogenous immunoglobulin production. Usually, antigens intended for this will have 6 or more adjacent amino acids, optionally conjugated to a carrier such as a hapten. See, for example, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-255; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-258; and Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. One example of such a method is to disable the endogenous mouse immunoglobulin loci encoding mouse immunoglobulin heavy and light chains and to remove a large fragment of human genomic DNA containing loci encoding human heavy and light chain proteins. Transgenic animals are produced by inserting into mice. Partially modified animals having less than the full complement of human immunoglobulin loci are then crossed to obtain animals with all of the desired immune system modifications. Upon administration of the immunogen, these transgenic animals produce antibodies that are immunospecific for the immunogen but have a human amino acid sequence (including variable regions) rather than a mouse amino acid sequence. For further details of such methods, see, for example, WO 96/33735 and WO 94/02602. These are hereby incorporated by reference. Further methods for transgenic mice for generating human antibodies are described in US Pat. Nos. 5,545,807; 6,713,610; 6,673,986; No. 963; No. 5,545,807; No. 6,300,129; No. 6,255,458; No. 5,877,397; No. 5,874,299 and No. No. 5,545,806; PCT publications WO 91/10741, WO 90/04036 and EP 546073B1 and EP 546073A1, all of which are hereby incorporated by reference in their entirety for general purposes. Incorporated.

本明細書で「ＨｕＭａｂ」マウスと称される上述のトランスジェニックマウスは、内在性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的変異と共に、再配列されないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリンミニ遺伝子座を有する（Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９）。従って、マウスは免疫化に応答してマウスＩｇＭまたはκの発現低下を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子はクラス変換および体細胞変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧ κモノクローナル抗体を生成する（上記Ｌｏｎｂｅｒｇら；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製については、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎら、１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒら、１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１； ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１に詳細に説明されており、前記文献は汎用目的でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。更に、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；ならびに米国特許第５，５４５，８０７号；国際特許公報第ＷＯ９３／１２２７号；同第ＷＯ９２／２２６４６号；および同第ＷＯ９２／０３９１８号を参照されたい。これらすべての開示内容は汎用目的でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。これらのトランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を産生させるために利用される技術は、ＷＯ９８／２４８９３およびＭｅｎｄｅｚら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６にも開示されており、これらは参考として本明細書に援用される。例えば、ヒト抗グルカゴン抗体を作製するのに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランスジェニックマウス系統を用いることができる。   The above-described transgenic mice, referred to herein as “HuMab” mice, are non-rearranged human heavy (μ and γ) and κ light chains with target mutations that inactivate endogenous μ and κ chain loci. It has a human immunoglobulin minilocus that encodes an immunoglobulin sequence (Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-859). Thus, mice show decreased expression of mouse IgM or κ in response to immunization, the introduced human heavy and light chain transgenes undergo class conversion and somatic mutation, and high affinity human IgG κ monoclonal antibodies (Lonberg et al .; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. NY Acad. Sci 764: 536-546). For preparation of HuMab mice, see Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research, 20: 6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Biol. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113: 49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6: 579-591; Lonberg and Huszar, 1995, International. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851, which are incorporated herein by reference in their entirety for general purposes. Further, U.S. Pat. Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; No. 5,877,397; No. 5,661,016; No. 5,814,318; No. 5,874,299; and No. 5,770,429; 545,807; International Patent Publication Nos. WO93 / 1227; WO92 / 22646; and WO92 / 03918. All of these disclosures are incorporated herein by reference in their entirety for general purposes. Techniques utilized to produce human antibodies in these transgenic mice are also disclosed in WO 98/24893 and Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146-156, which are incorporated herein by reference. Incorporated. For example, HCo7 and HCo12 transgenic mouse strains can be used to generate human anti-glucagon antibodies.

ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ＭＡｂが、上述のようなトランスジェニックマウスから産生され、選択され得る。このような抗体は好適なベクターおよび宿主細胞を用いてクローニングされ、発現され得（例えば、以下の実施例を参照）、あるいは抗体は培養ハイブリドーマ細胞から採取され得る。   Using hybridoma technology, antigen-specific MAbs with the desired specificity can be produced and selected from transgenic mice as described above. Such antibodies can be cloned and expressed using suitable vectors and host cells (see, eg, the examples below), or antibodies can be harvested from cultured hybridoma cells.

完全ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーから得ることもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；およびＭａｒｋｓら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示されているように）。ファージディスプレイ法は、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの提示、続いて、選択抗原へのそれらの結合によるファージの選択を通して免疫選択を模倣する。このような手法の１つがＰＣＴ公報第ＷＯ９９／１０４９４号に述べられており（参考として本明細書に援用される）、このような手法を用いたＭＰＬ−およびｍｓｋ−受容体に対する高親和性および機能性アゴニスト抗体の単離について述べている。
７．二重特異性または二重機能性抗体
本明細書で開示される組成物に含まれる抗体は、上述のような１つもしくはそれ以上のＣＤＲまたは１つもしくはそれ以上の可変領域を含む二重特異性および二重機能性抗体であってもよい。いくつかの例における二重特異性または二重機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアおよび２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、限定的でないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む、種々の方法により作製され得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。
８．例示的な変異抗体
本明細書で提供される特定の組成物の抗体は、上記で開示された抗体（例えば、表１および２に挙げられる配列を有する抗体）の改変体形態である。例えば、一部の抗体は、表１および２に挙げられる、１つ以上の重鎖もしくは軽鎖、可変領域またはＣＤＲにおいて１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する抗体である。 Fully human antibodies can also be obtained from phage display libraries (as disclosed in Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; and Marks et al., 19991, J. Mol. Biol. 222: 581). To). Phage display methods mimic immune selection through the display of antibody repertoires on the surface of filamentous bacteriophages, followed by selection of phage by their binding to a selected antigen. One such technique is described in PCT Publication No. WO 99/10494 (incorporated herein by reference) and uses such techniques for high affinity for MPL- and msk-receptors and The isolation of functional agonist antibodies is described.
7). Bispecific or Bifunctional Antibodies Antibodies included in the compositions disclosed herein can be bispecifics that include one or more CDRs or one or more variable regions as described above. And bifunctional antibodies. The bispecific or bifunctional antibody in some examples is an artificial hybrid antibody having two different heavy / light chain pairs and two different binding sites. Bispecific antibodies can be made by a variety of methods including, but not limited to, fusion of hybridomas or binding of Fab ′ fragments. See, for example, Songsivirai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al., 1992, J. MoI. Immunol. 148: 1547-1553.
8). Exemplary Variant Antibodies Antibodies of certain compositions provided herein are modified forms of the antibodies disclosed above (eg, antibodies having the sequences listed in Tables 1 and 2). For example, some antibodies are those having one or more conservative amino acid substitutions in one or more heavy or light chains, variable regions or CDRs listed in Tables 1 and 2.

天然アミノ酸は側鎖の共通の性質に基づいてクラスに分類され得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーの同クラスの他のメンバーとの交換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、通常、生物系での合成よりむしろ化学的ペプチド合成により組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらは、ペプチド擬似体および他の逆形態もしくは転置形態のアミノ酸部分を含む。 Natural amino acids can be classified into classes based on common properties of side chains:
1) Hydrophobicity: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) Neutral hydrophobicity: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) Acidity: Asp, Glu;
4) Basic: His, Lys, Arg;
5) Residues affecting chain orientation: Gly, Pro; and 6) Aromaticity: Trp, Tyr, Phe.
Conservative amino acid substitutions can include exchanging one member of these classes for another member of the same class. Conservative amino acid substitutions can include unnatural amino acid residues that are usually incorporated by chemical peptide synthesis rather than by synthesis in biological systems. These include peptidomimetics and other inverted or transposed amino acid moieties.

非保存的置換は、上記クラスの１つのメンバーの他のクラスのメンバーとの交換を含み得る。このような置換残基は、ヒト抗体と相同な抗体の領域または分子の非相同領域に導入され得る。   Non-conservative substitutions may include exchanging one member of the class with a member of another class. Such substituted residues may be introduced into regions of the antibody that are homologous with human antibodies or non-homologous regions of the molecule.

このような変換を行う際、特定の実施形態に基づき、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質のヒドロパシープロファイルは、各アミノ酸に数値（「ヒドロパシー指数」）を割り当て、次に、ペプチド鎖に沿ってこれらの値を繰り返し平均化することにより、計算される。各アミノ酸はその疎水性および電荷特性に基づき、ヒドロパシー指数を割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。   In performing such a conversion, the hydropathic index of the amino acid can be considered based on the particular embodiment. The hydropathy profile of a protein is calculated by assigning a numerical value (“hydropathic index”) to each amino acid, and then averaging these values repeatedly along the peptide chain. Each amino acid is assigned a hydropathic index based on its hydrophobicity and charge characteristics. They are: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1 Glycine (−0.4); threonine (−0.7); serine (−0.8); tryptophan (−0.9); tyrosine (−1.3); proline (−1.6); ); Histidine (-3.2); glutamate (-3.5); glutamine (-3.5); aspartate (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3. 9); and arginine (-4.5).

タンパク質に相互作用的生物学的機能を付与する際のヒドロパシープロファイルの重要性は、当該分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照）。特定のアミノ酸が同様のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され、なおも同様の生物学的活性を保持し得ることは周知である。ヒドロパシー指数に基づいて変換する際、特定の実施形態では、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。一部の態様では、±１以内のアミノ酸が含まれ、他の態様では、±０．５以内のアミノ酸が含まれる。   The importance of hydropathic profiles in conferring interactive biological functions on proteins is understood in the art (see, eg, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131). ). It is well known that certain amino acids can be substituted with other amino acids with similar hydropathy indices or scores and still retain similar biological activity. When converting based on the hydropathic index, certain embodiments include substitutions of amino acids whose hydropathic index is within ± 2. In some embodiments, amino acids within ± 1 are included, and in other embodiments, amino acids within ± 0.5 are included.

類似アミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得、特に、これにより生成される生理機能タンパク質またはペプチドを、本発明の場合のように、免疫的実施形態に用いることを目的とする場合、効果的になされ得ることも当該分野では理解される。特定の実施形態では、隣接するアミノ酸の親水性により左右されるような、タンパク質の最大の局所的平均親水性は、その免疫原性および抗原結合もしくは免疫原性、即ち、タンパク質の生物学的特性と相関する。   Substitution of similar amino acids can be made effectively on the basis of hydrophilicity, especially when the physiologically functional protein or peptide produced thereby is intended for use in an immunological embodiment as in the present invention It is also understood in the art that it can be done effectively. In certain embodiments, the maximum local average hydrophilicity of a protein, as governed by the hydrophilicity of adjacent amino acids, is its immunogenicity and antigen binding or immunogenicity, ie the biological properties of the protein. Correlate with

以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づく変換を行う際、特定の実施形態では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態では、±１以内のアミノ酸が含まれ、更に別の実施形態では、±０．５以内のアミノ酸が含まれる。いくつかの例では、また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを特定し得る。これらの領域は「エピトープコア領域」と称される。   The following hydrophilicity values have been assigned to these amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartate (+ 3.0 ± 1); glutamate (+ 3.0 ± 1) ); Serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (−0.4); proline (−0.5 ± 1); alanine (−0) Histidine (-1.0); methionine (-1.3); valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8); ); Tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5) and tryptophan (-3.4). When performing conversions based on similar hydrophilicity values, certain embodiments include amino acid substitutions with a hydrophilicity value within ± 2; in other embodiments, amino acids within ± 1 are included; In this embodiment, within ± 0.5 amino acids are included. In some examples, epitopes can also be identified from primary amino acid sequences based on hydrophilicity. These regions are referred to as “epitope core regions”.

例示的な保存的アミノ酸置換が表５に示される。   Exemplary conservative amino acid substitutions are shown in Table 5.

表５   Table 5

Figure 2009534424
当業者は周知の手法を用いて、本明細書で示されるポリペプチドの好適な改変体を決定することができるであろう。当業者は活性に重要であるとは考えられない領域を標的とすることにより、活性を破壊することなく、変化され得る分子の好適な領域を特定し得る。当業者は類似ポリペプチド間に保存された分子の残基および部分を特定することもできるであろう。更なる実施形態では、生物活性または構造に重要でありうる領域でさえも、生物活性を破壊することなく、あるいはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換を受け得る。
Figure 2009534424
 Those skilled in the art will be able to determine suitable variants of the polypeptides presented herein using well known techniques. One skilled in the art can identify suitable regions of the molecule that can be altered without destroying activity by targeting regions that are not believed to be important for activity. One skilled in the art will also be able to identify residues and portions of the molecule that are conserved between similar polypeptides. In further embodiments, even regions that may be important for biological activity or structure may undergo conservative amino acid substitutions without destroying biological activity or adversely affecting the polypeptide structure.

加えて、当業者は構造−機能試験をレビューし、活性または構造に重要な類似ポリペプチドにおける残基を特定することができる。このような比較に照らし、当業者は、類似タンパク質における活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者はこのような予測される重要なアミノ酸残基に対し、化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。   In addition, one of ordinary skill in the art can review structure-function tests and identify residues in similar polypeptides that are important for activity or structure. In light of such a comparison, one skilled in the art can predict the importance of amino acid residues in a protein that correspond to amino acid residues important for activity or structure in similar proteins. One skilled in the art can select chemically similar amino acid substitutions for such predicted important amino acid residues.

当業者は類似ポリペプチドにおける構造に関連して三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報に照らし、当業者はその三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測し得る。当業者はタンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基に極端な変更をしないように選択し得るが、それは、このような残基が他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。更に、当業者は各所望のアミノ酸残基において単一アミノ酸置換を含む試験される改変体を作製し得る。次に、これらの改変体は、本明細書で述べるようなグルカゴン活性用アッセイを用いてスクリーニングすることができ（以下の実施例を参照）、従って、いずれのアミノ酸が変更でき、また、いずれが変更されてはならないかということに関する情報をもたらす。言い換えると、このような定期試験から収集される情報に基づき、当業者は、単独で、あるいは他の変異と組み合わせて更なる置換を避ける必要があるアミノ酸位置を容易に決定することができる。   One skilled in the art can also analyze the three-dimensional structure and amino acid sequence in relation to the structure in similar polypeptides. In light of such information, one skilled in the art can predict the alignment of antibody amino acid residues with respect to their three-dimensional structure. One skilled in the art may choose not to make extreme changes to the amino acid residues that are predicted to be on the surface of the protein, but that such residues may be involved in important interactions with other molecules. Because. In addition, one of skill in the art can generate tested variants that contain a single amino acid substitution at each desired amino acid residue. These variants can then be screened using an assay for glucagon activity as described herein (see examples below), thus any amino acids can be altered and Provides information about what should be changed. In other words, based on information gathered from such routine tests, one of skill in the art can readily determine amino acid positions that need to avoid further substitutions alone or in combination with other mutations.

多くの科学文献が二次構造の予測に取り組んできた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２−２４５；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３：２１１−２２２；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８；Ｃｈｏｕら、１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４を参照されたい。更に、現在、二次構造の予測を支援するコンピュータプログラムが利用可能である。二次構造を予測する一方法は相同モデリングに基づく。例えば、３０％超の配列同一性または４０％超の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。近年のタンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の発展により、二次構造の予測性の向上が得られ、これには、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の折り畳みのポテンシャル数が含まれる。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質には限られた数の折り畳みがあり、また、構造の臨界数が解明されれば、構造予測は劇的により正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。   Many scientific literatures have worked on predicting secondary structure. Mout, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7: 422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13: 222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113: 211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Area Mol. Biol. 47: 45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276; and Chou et al., 1979, Biophys. J. et al. 26: 367-384. In addition, computer programs that support secondary structure prediction are currently available. One way to predict secondary structure is based on homology modeling. For example, two polypeptides or proteins with greater than 30% sequence identity or greater than 40% similarity often have similar structural topologies. Recent developments in protein structure databases (PDBs) have improved secondary structure predictability, which includes the number of potential folds in the structure of a polypeptide or protein. Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27: 244-247. There is a limited number of folds in a given polypeptide or protein, and it has been suggested that if the critical number of structures is solved, the structure prediction will be dramatically more accurate (Brenner et al., 1997 Curr. Op.Struct.Biol.7: 369-376).

二次構造を予測する更なる方法には、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５−１９）、「プロファイル解析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４−１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）および「進化的連結（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（上記Ｈｏｌｍ，１９９９；および上記Ｂｒｅｎｎｅｒ，１９９７を参照）が含まれる。   Additional methods for predicting secondary structure include “Threading” (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 377-87; Shippl et al., 1996, Structure 4: 15-19), “Profile Analysis. (Bowie et al., 1991, Science 253: 164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183: 146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 4355-4358) and “ Evolutionary linkage "(see Holm, 1999; and Brenner, 1997).

本発明の一部の実施形態では、（１）タンパク質分解感受性を低下させ、（２）易酸化性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更し、（４）リガンドまたは抗原結合親和性を変更し、かつ／あるいは（４）このようなポリペプチドに対して他の物理化学的もしくは機能的性質を付与し、または変更する、アミノ酸置換がなされる。例えば、天然配列において、単一または多重アミノ酸置換（特定の実施形態では保存的アミノ酸置換）がなされ得る。置換は分子間接触を形成するドメインの外側に位置する抗体部分でなされ得る。このような実施形態では、親配列の構造特性を実質的に変更しない保存的アミノ酸置換を用いることができる（例えば、親または天然抗体を特徴づける二次構造を崩壊しない、１つ以上の置換アミノ酸）。当該分野で認められているポリペプチドの二次および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．），１９８４，Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ＢｒａｎｄｅｎおよびＴｏｏｚｅ，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５に述べられており、これらは各々参考として本明細書に組み込まれる。   In some embodiments of the invention, (1) reduce proteolytic sensitivity, (2) reduce oxidizability, (3) alter the binding affinity to form a protein complex, (4 Amino acid substitutions are made that alter) the ligand or antigen binding affinity and / or confer or alter other physicochemical or functional properties to such polypeptides. For example, single or multiple amino acid substitutions (in certain embodiments, conservative amino acid substitutions) can be made in the native sequence. Substitutions can be made with antibody portions located outside of the domains that form intermolecular contacts. In such embodiments, conservative amino acid substitutions that do not substantially alter the structural properties of the parent sequence can be used (eg, one or more substituted amino acids that do not disrupt the secondary structure that characterizes the parent or natural antibody). ). Examples of secondary and tertiary structures of polypeptides recognized in the art are described in Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tokyo, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; 105, Nur. Incorporated in the description.

いくつかの組成物において用いられる抗体改変体は、改変Ｆｃ断片または改変重鎖定常領域を含む抗体を含み得る。「結晶化する断片」を表すＦｃ断片または重鎖定常領域は変異によって改変され、抗体に変性特性を付与することができる。例えば、ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ，１９９２，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５１：１−８４；ＲａｖｅｔｃｈおよびＢｏｌｌａｎｄ，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５−９０；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４；ＴｅｌｌｅｍａｎおよびＪｕｎｇｈａｎｓ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １００：２４５−２５１；Ｍｅｄｅｓａｎら、１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０９２−２１００；これらはすべて参考として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。このような変異は、置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含み得、通常、本明細書で述べられる方法および当該分野で公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ Ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌｕｍｅ １５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．を参照されたい。これらは参考として本明細書に組み込まれる）により、１つ以上の変異原性オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異誘発によって生じる。   Antibody variants used in some compositions may include antibodies comprising modified Fc fragments or modified heavy chain constant regions. Fc fragments or heavy chain constant regions representing “crystallizing fragments” can be altered by mutation to confer denaturing properties to the antibody. See, for example, Burton and Woof, 1992, Advances in Immunology 51: 1-84; Ravetch and Balland, 2001, Annu. Rev. Immunol. 19: 275-90; Shields et al., 2001, Journal of Biol. Chem. 276: 6591-6604; Tellman and Junghans, 2000, Immunology 100: 245-251; Medesan et al., 1998, Eur. J. et al. Immunol. 28: 2092-2100; all of which are incorporated herein by reference). Such mutations can include substitutions, additions, deletions, or combinations thereof, and are generally methods described herein and methods known in the art (eg, Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd. Ed., 2001, Cold Spring Harbor, NY, and Berger and Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., Academic Press. Are incorporated herein by reference) and are site-specific using one or more mutagenic oligonucleotides. Caused by different induction.

本明細書で開示されるいくつかの組成物における抗体は、本明細書で開示される抗体のグリコシル化改変体を包含し、グリコシル化部位の数および／またはタイプが親ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて変更されている。特定の実施形態では、抗体タンパク質改変体は天然抗体よりも多いあるいは少ない数のＮ−結合グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とし、Ｘと指定されたアミノ酸残基はプロリンを除く任意のアミノ酸残基であってよい。この配列を生成するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ−結合炭水化物鎖の付加のための新規部位の可能性を与える。あるいは、この配列を排除あるいは変更する置換は、天然ポリペプチドに存在するＮ−結合炭水化物鎖の付加を防止する。例えば、グリコシル化は、Ａｓｎの欠失により、あるいはＡｓｎを異なるアミノ酸に置換することにより、低下し得る。他の実施形態では、１つ以上の新規Ｎ−結合部位が生成される。通常、抗体はＦｃ領域にＮ−結合グリコシル化部位を有する。   Antibodies in some compositions disclosed herein include glycosylation variants of the antibodies disclosed herein, wherein the number and / or type of glycosylation sites differs from the amino acid sequence of the parent polypeptide. It has been changed compared. In certain embodiments, antibody protein variants contain more or fewer N-linked glycosylation sites than native antibodies. The N-linked glycosylation site is characterized by the sequence: Asn-X-Ser or Asn-X-Thr, and the amino acid residue designated X may be any amino acid residue except proline. Substitution of amino acid residues to generate this sequence provides the possibility of new sites for the addition of N-linked carbohydrate chains. Alternatively, substitutions that eliminate or alter this sequence prevent the addition of N-linked carbohydrate chains present in the native polypeptide. For example, glycosylation can be reduced by deletion of Asn or by replacing Asn with a different amino acid. In other embodiments, one or more new N-binding sites are generated. Usually, an antibody has an N-linked glycosylation site in the Fc region.

更なる好ましい抗体改変体は、親または天然アミノ酸配列における１つ以上のシステイン残基が欠失され、あるいは別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されたシステイン改変体を含む。システイン改変体は、特に、抗体が生理活性構造に再び折り畳まれる必要がある際に有用である。システイン改変体は天然抗体よりも少ないシステイン残基を有し得、通常、不対システインから生じる相互作用を最小限にするように偶数を有する。   Further preferred antibody variants include cysteine variants in which one or more cysteine residues in the parent or native amino acid sequence have been deleted or replaced with another amino acid (eg, serine). Cysteine variants are particularly useful when antibodies need to be refolded into a bioactive structure. Cysteine variants can have fewer cysteine residues than natural antibodies, and usually have an even number to minimize the interactions resulting from unpaired cysteines.

開示される重鎖および軽鎖の可変領域ドメインおよびＣＤＲは、グルカゴン（例えば、ヒトグルカゴン）に特異的に結合し得る抗原結合領域を含むポリペプチドを調製するのに用いることができる。例えば、表２に挙げられる１つ以上のＣＤＲは、共有結合または非共有結合で分子（例えば、ポリペプチド）に組み込まれ、イムノアドヘジンを生成することができる。イムノアドヘジンはより大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（ｓ）を組み込み、ＣＤＲ（ｓ）を別のポリペプチド鎖に共有結合させ、あるいはＣＤＲ（ｓ）を非共有結合で組み込み得る。ＣＤＲ（ｓ）はイムノアドヘジンが対象とする特定の抗原（例えば、グルカゴンまたはそのエピトープ）に特異的に結合することを可能とする。   The disclosed heavy and light chain variable region domains and CDRs can be used to prepare polypeptides comprising an antigen binding region that can specifically bind to glucagon (eg, human glucagon). For example, one or more of the CDRs listed in Table 2 can be incorporated into a molecule (eg, a polypeptide) covalently or non-covalently to produce an immunoadhesin. Immunoadhesins can incorporate CDR (s) as part of a larger polypeptide chain, covalently link CDR (s) to another polypeptide chain, or incorporate CDR (s) non-covalently. CDR (s) allows immunoadhesin to specifically bind to a specific antigen of interest (eg, glucagon or an epitope thereof).

本明細書で述べられる可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく擬似体（例えば、ペプチド擬似体」（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）または「ペプチド擬似体」（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））も提供される。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチドあるいはペプチドおよび非ペプチド領域の組合せとなり得る。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ ｐ．３９２；ならびにＥｖａｎｓら、１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９、これらは目的に応じて参考として本明細書に組み込まれる。治療上有用なペプチドに構造的に類似するペプチド擬似体は、類似の治療効果または予防効果をもたらすのに用いられ得る。このような化合物はコンピュータ化分子モデリングの支援により開発される場合が多い。一般的に、本発明のペプチド擬似体は、所望の生物活性を示す抗体に構造的に類似しているが、当該分野で周知の方法により、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合に任意で置換される、１つ以上のペプチド結合を有するタンパク質である。特定の実施形態では、より安定なタンパク質を生成するのに、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じタイプのＤ−アミノ酸への体系的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）が用いられ得る。さらに、当該分野で公知の方法により（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）、参考として本明細書に援用される）、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することにより、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む制限ペプチドが作製され得る。 Also provided are mimetics (eg, peptide mimetics or “peptidomimetics”) based on the variable region domains and CDRs described herein. These analogs can be peptides, non-peptides or a combination of peptide and non-peptide regions. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; and Evans et al., 1987, J. MoI. Med. Chem. 30: 1229, which are incorporated herein by reference for their purposes. Peptide mimetics that are structurally similar to therapeutically useful peptides can be used to produce similar therapeutic or prophylactic effects. Such compounds are often developed with the aid of computerized molecular modeling. In general, the peptidomimetics of the present invention are structurally similar to antibodies exhibiting the desired biological activity, but can be obtained by methods well known in the art by —CH 2 NH—, —CH 2 S—, — Optionally substituted with a bond selected from CH 2 —CH 2 —, —CH═CH— (cis and trans), —COCH 2 —, —CH (OH) CH 2 — and —CH 2 SO—. A protein having one or more peptide bonds. In certain embodiments, a systematic substitution of one or more amino acids of the consensus sequence to the same type of D-amino acid (eg, D-lysine instead of L-lysine) is used to produce a more stable protein. Can be used. In addition, by methods known in the art (Rizo and Giersch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61: 387, incorporated herein by reference), for example, intramolecular disulfide bridges that cyclize peptides. By adding an internal cysteine residue that can be formed, a restriction peptide containing a consensus sequence or a substantially identical consensus sequence variation can be created.

いくつかの組成物では、１つ以上の抗グルカゴン抗体ポリペプチドを含むオリゴマーが用いられ得る。オリゴマーは共有結合または非共有結合した二量体、三量体または高重合オリゴマーの形態でよい。２つ以上の抗グルカゴン抗体ポリペプチドを含むオリゴマーが使用のために検討され、一例がホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが含まれる。
Ｂ．ＧＬＰ−１化合物
組成物の抗グルカゴン抗体には種々のＧＬＰ−１化合物を結合することができ、ＧＬＰ−１それ自体および多種多様のＧＬＰ−１類似体が含まれる。 In some compositions, an oligomer comprising one or more anti-glucagon antibody polypeptides can be used. The oligomers may be in the form of covalently or non-covalently linked dimers, trimers or highly polymerized oligomers. Oligomers containing two or more anti-glucagon antibody polypeptides have been considered for use, one example being a homodimer. Other oligomers include heterodimers, homotrimers, heterotrimers, homotetramers, heterotetramers and the like.
B. GLP-1 compounds The anti-glucagon antibodies of the composition can bind various GLP-1 compounds and include GLP-1 itself and a wide variety of GLP-1 analogs.

本明細書で用いられるように、「ＧＬＰ−１」という用語は、上記背景技術において述べたようなグルカゴン様ペプチド１を指す。ＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨのカルボキシル末端は切断され、ＧＬＰ−１（１−３０）−ＮＨ２を生成することができる。上述のように、ＧＬＰ−１（１−３１）とも称されるＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨおよびＧＬＰ−１（１−３０）−ＮＨ２は同一活性を有する。便宜上、これら両方の生物活性形態を指すのに、「ＧＬＰ−１」および「天然ＧＬＰ−１」という用語が用いられる。上述のように、当該分野では２つの異なる番号付け表記が用いられている。本明細書で採用される番号付け表記は、ＧＬＰ−１のＮ末端ヒスチジンを残基番号１と考える番号付け表記である。従って、天然ＧＬＰ−１（即ち、ＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨ）は以下のアミノ酸配列を有する：
１Ｈｉｓ−２Ａｌａ−３Ｇｌｕ−４Ｇｌｙ−５Ｔｈｒ−６Ｐｈｅ−７Ｔｈｒ−８Ｓｅｒ−９Ａｓｐ−１０Ｖａｌ−１１Ｓｅｒ−１２Ｓｅｒ−１３Ｔｙｒ−１４Ｌｅｕ−１５Ｇｌｕ−１６Ｇｌｙ−１７Ｇｌｎ−１８Ａｌａ−１９Ａｌａ−２０Ｌｙｓ−２１Ｇｌｕ−２２Ｐｈｅ−２３Ｉｌｅ−２４Ａｌａ−２５Ｔｒｐ−２６Ｌｅｕ−２７Ｖａｌ−２８Ｌｙｓ−２９Ｇｌｙ−３０Ａｒｇ−３１Ｇｌｙ（配列番号１）。 As used herein, the term “GLP-1” refers to glucagon-like peptide 1 as described in the background art above. Carboxyl terminus of GLP-1 (1-31) -OH is cleaved, it is possible to generate a GLP-1 (1-30) -NH 2 . As mentioned above, GLP-1 (1-31) also referred to as GLP-1 (1-31) -OH and GLP-1 (1-30) -NH 2 has the same activity. For convenience, the terms “GLP-1” and “native GLP-1” are used to refer to both of these bioactive forms. As mentioned above, two different numbering notations are used in the field. The numbering notation employed herein is a numbering notation that considers the N-terminal histidine of GLP-1 as residue number 1. Thus, native GLP-1 (ie GLP-1 (1-31) -OH) has the following amino acid sequence:
1 His- 2 Ala- 3 Glu- 4 Gly- 5 Thr- 6 Phe- 7 Thr- 8 Ser- 9 Asp- 10 Val- 11 Ser- 12 Ser- 13 Tyr- 14 Leu- 15 Glu- 16 Gly- 17 Gln - 18 Ala- 19 Ala- 20 Lys- 21 Glu- 22 Phe- 23 Ile- 24 Ala- 25 Trp- 26 Leu- 27 Val- 28 Lys- 29 Gly- 30 Arg- 31 Gly ( SEQ ID NO: 1).

Ｎ末端とＣ末端との間に位置するアミノ酸は、表示されるように連続的に番号付けされる。従って、例えば、位置２におけるアミノ酸はＡｌａであり、位置２０におけるアミノ酸はＬｙｓである。同様に、本明細書で特定位置において置換することに言及する際、同じ番号付けシステムが適用される。従って、例えば、位置１６におけるＡｌａの置換とは、位置１６におけるＧｌｙがＡｌａに置換されたということである。ＧＬＰ−１（１−３１）のアミノ末端においてアミノ酸が付加される場合、位置１のすぐ上流のアミノ酸がアミノ酸−１であり、次の上流アミノ酸が位置−２であるなどのように、位置は減少順に連続的に番号付けされる。アミノ酸がＧＬＰ−１のカルボキシル末端に付加される場合、位置３１のすぐ下流のアミノ酸がアミノ酸３２であり、次の下流アミノ酸が位置３３であるなどのように、位置は増加順に連続的に番号付けされる。天然ＧＬＰ−１配列に対する変更は括弧内に示され、次の形態：ｘ位置番号ｙを有し、ｘは天然ＧＬＰ−１配列での表示位置番号におけるアミノ酸であり、ｙはこの位置で置換されるアミノ酸である。従って、例えば、Ａ２Ｇとは、天然ＧＬＰ−１配列の位置２におけるアラニンがグリシンに置換されたということである。多重置換は順方向スラッシュ（／）により分離される。Ｃ末端に付加されるアミノ酸はプラス記号（＋）、続いて、付加の位置で示される。   Amino acids located between the N-terminus and the C-terminus are numbered sequentially as indicated. Thus, for example, the amino acid at position 2 is Ala and the amino acid at position 20 is Lys. Similarly, the same numbering system applies when referring to substitution at a specific position herein. Thus, for example, replacement of Ala at position 16 means that Gly at position 16 has been replaced with Ala. When an amino acid is added at the amino terminus of GLP-1 (1-31), the position is Numbered sequentially in decreasing order. When amino acids are added to the carboxyl terminus of GLP-1, the positions are numbered sequentially in increasing order, such as the amino acid immediately downstream of position 31 is amino acid 32, the next downstream amino acid is position 33, etc. Is done. Changes to the native GLP-1 sequence are shown in parentheses and have the following form: x position number y, x is the amino acid at the indicated position number in the native GLP-1 sequence, and y is substituted at this position Is an amino acid. Thus, for example, A2G means that the alanine at position 2 of the native GLP-1 sequence was replaced with glycine. Multiple permutations are separated by a forward slash (/). Amino acids added to the C-terminus are indicated by a plus sign (+) followed by an additional position.

本明細書で用いられるような「ＧＬＰ−１化合物」は、ＧＬＰ−１ペプチドを含む分子を指し、１つ以上の追加の構成要素（例えば、インビボにて化合物の半減期を延長する構成要素）を含み得る。   A “GLP-1 compound” as used herein refers to a molecule comprising a GLP-1 peptide, one or more additional components (eg, components that extend the half-life of the compound in vivo). Can be included.

本明細書で用いられるような「ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、天然ＧＬＰ−１または天然ＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨもしくはＧＬＰ−１（１−３０）−ＮＨ２のアミノ酸配列において１つもしくはそれ以上の変更を有するが、少なくとも１つの天然ＧＬＰ−１の活性を保持するペプチドを指す。該用語は、エキセンジン−３およびエキセンジン−４などのエキセンジンファミリーのメンバー（例えば、米国特許第５，４２４，２８６号を参照）あるいはエキセンジンのアミノ酸配列において１つ以上の変更を有するペプチドも含み、但し、ペプチドは少なくとも１つのＧＬＰ−１活性を保持する。例えば、エキセンジン−４は以下のアミノ酸配列を有する：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号１２７）。 The term “GLP-1 peptide” as used herein is a natural GLP-1 or 1 in the amino acid sequence of natural GLP-1 (1-31) -OH or GLP-1 (1-30) -NH2. Refers to a peptide having one or more changes but retaining at least one activity of native GLP-1. The term also includes exendin family members such as exendin-3 and exendin-4 (see, eg, US Pat. No. 5,424,286) or peptides having one or more changes in the amino acid sequence of exendin, However, the peptide retains at least one GLP-1 activity. For example, exendin-4 has the following amino acid sequence:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp- Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 127).

エキセンジン−３は以下のアミノ酸配列を有する：
Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ（配列番号１３１）。 Exendin-3 has the following amino acid sequence:
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu LyS As

「ＧＬＰ−１活性」という語句またはその文法的等価語は、ＧＬＰ−１およびエキセンジンと関連する任意の活性を広範に指す。被験体に投与される際、このような活性の例には、限定的でないが、インスリン向性活性、胃運動の抑制、胃液分泌の抑制、β細胞の増殖および複製の促進、β細胞量の増加、満腹感の増大ならびに食物摂取の減少が含まれる。   The phrase “GLP-1 activity” or its grammatical equivalent broadly refers to any activity associated with GLP-1 and exendin. Examples of such activities when administered to a subject include, but are not limited to, insulinotropic activity, inhibition of gastric motility, inhibition of gastric secretion, promotion of β-cell proliferation and replication, Includes increased, increased satiety as well as decreased food intake.

「ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、本明細書で開示されるＧＬＰ−１ペプチドの１つと機能的等価物である、ＧＬＰ−１ペプチドの改変体、断片および誘導体も含み、改変体、断片または誘導体は類似のアミノ酸配列（例えば、保存的置換を含む）を有するとともに、ある程度、少なくとも１つのＧＬＰ−１ペプチド活性を保持するという点で機能的等価物である。   The term “GLP-1 peptide” also includes variants, fragments and derivatives of GLP-1 peptide that are functional equivalents to one of the GLP-1 peptides disclosed herein, Derivatives are functional equivalents in that they have similar amino acid sequences (eg, including conservative substitutions) and to some extent retain at least one GLP-1 peptide activity.

「ＧＬＰ−１改変体」は、本明細書で述べられるＧＬＰ−１ペプチドと「実質的に同一」（上記定義を参照）であるペプチドを含む。このような改変体は、欠失、挿入および／または置換のようなアミノ酸の変更を有するタンパク質を含む。通常、このような変更は、改変体タンパク質の活性が本明細書で開示されるＧＬＰ−１ペプチドの１つに実質的に類似するように、保存的性質である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８４，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照）。置換の場合、別のアミノ酸を置換するアミノ酸は通常、類似の構造および／または化学的性質を有する。ＧＬＰ−１改変体は本明細書で述べるようなＧＬＰ−１ペプチドと少なくとも６０％、７０％または７５％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有し得、但し、改変体は依然としてＧＬＰ−１活性を有する。   A “GLP-1 variant” includes a peptide that is “substantially identical” to the GLP-1 peptide described herein (see above definition). Such variants include proteins with amino acid changes such as deletions, insertions and / or substitutions. Usually, such changes are conservative in nature such that the activity of the variant protein is substantially similar to one of the GLP-1 peptides disclosed herein (eg, Creighton, 1984, Proteins , WH Freeman and Company). In the case of substitution, an amino acid that replaces another amino acid usually has a similar structure and / or chemical properties. A GLP-1 variant is at least 60%, 70% or 75%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, 95%, 96%, 97 with a GLP-1 peptide as described herein. %, 98% or 99% amino acid identity, provided that the variant still has GLP-1 activity.

本明細書で用いられるような「ＧＬＰ−１誘導体」は、１つ以上のアミノ酸が、１）対応するＤ−アミノ酸に置換され、２）非天然アミノ酸残基に変更され、かつ／あるいは、３）化学的に修飾されたＧＬＰ−１ペプチドの１つを指す。化学修飾の例には、限定されないが、ペプチド骨格および／またはアミノ酸側鎖のアルキル化、アシル化、脱アミド、エステル化、リン酸化およびグリコシル化が含まれる。   As used herein, a “GLP-1 derivative” has one or more amino acids substituted by 1) the corresponding D-amino acid, 2) changed to an unnatural amino acid residue, and / or 3 ) Refers to one of the chemically modified GLP-1 peptides. Examples of chemical modifications include, but are not limited to, alkylation, acylation, deamidation, esterification, phosphorylation and glycosylation of the peptide backbone and / or amino acid side chains.

「ＧＬＰ−１断片」は、本明細書で挙げられるＧＬＰ−１ペプチドの切頭形態またはその改変体または誘導体を指す。典型的には、断片は本明細書で示されるＧＬＰ−１ペプチドに対して１、２、３、４または５個のアミノ酸単位で切頭される。切頭はアミノ末端および／またはカルボキシル末端であってよい。   A “GLP-1 fragment” refers to a truncated form of a GLP-1 peptide listed herein or a variant or derivative thereof. Typically, the fragment is truncated by 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid units relative to the GLP-1 peptide shown herein. The truncation may be amino terminal and / or carboxyl terminal.

特定の組成物での使用に好適なＧＬＰ−１ペプチドの多数の例が、例えば、米国特許第６，３２９，３３６号；同第６，７０３，３６５号；同第５，７０５，４８３号；同第５，９７７，０７１号；同第６，１３３，２３５号；同第６，４１０，５１３号；同第６，３８８，０５３号；同第６，３５８，９２４号；同第５，５１２，５４９号；同第６，００６，７５３号；同第５，５４５，６１８号；同第５，１１８，６６６号；同第５，１２０，７１２号；同第５，６１４，４９２号；同第５，９５８，９０９号；同第６，１６２，９０７号；同第６，８４９，７０８号；同第６，８２８，３０３号；同第６，２８４，７２７号；同第６，３４４，１８０号；同第６，５０６，７２４号；同第６，８５８，５７６号；同第６，８８４，５７９号；同第６，５２８，４８６号；同第５，８４６，９３７号；同第５，９９０，０７７号；同第６，７７０，６２０号；同第６，６２０，９１０号；同第５，５４５，６１８号；同第６，５６９，８３２号；および第６，２６８，３４３号に述べられており、これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される。特定の組成物において抗グルカゴン抗体に結合可能な他のＧＬＰ−１ペプチドが、例えば、以下の米国特許出願公開：第２００４／００５３３７０号；同第２００４／０１２７３９９号；同第２００３／０２２１２０１号；同第２００３／０２２６１５５号；同第２００４／００２３３３４号；同第２００４／０１４３１０４号；同第２００５／０１０７３１８号；同第２００４／０１０６５４７号；同第２００４／０１７６３０７号；同第２００４／００５２８６２号；同第２００４／００８２５０７号；同第２００４／０１４６９８５号；同第２００４／００５３３７０号；同第２００３／０１９９６７２号；および第２００１／００１１０７１号に開示されており、これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される。特定の組成物において使用可能な更に別のＧＬＰ−１ペプチドが、例えば、以下のＰＣＴ出願公開：ＷＯ００／３４３３１；ＷＯ００３４３３２；ＷＯ０２／４６２２７；ＷＯ０３／０６００７１；ＷＯ２００５／００３２９６；ＷＯ０３／０１８５１６；ＷＯ０１／９８３３１；ＷＯ０３／０５９９３４；ＷＯ２００４／０７８７７７；ＷＯ９９／３０７３１；ＷＯ９８／４３６５８；ＷＯ００／１６７９７；ＷＯ００／１５２２４；ＷＯ０３／１０３５７２；ＷＯ０３／０８７１３９；ＷＯ２００４／１１０４７２；ＷＯ０３／０１８５１６；ＷＯ２００５／０００８９２；ＷＯ０３／０２８６２６；ＷＯ２００４／０２０４０４；ＷＯ２００４／０２０４０５；ＷＯ２００４／０１９８７２；ＷＯ０３／０２０７４６；ＷＯ２００４／０９４４６１；ＷＯ９１／１１４５７；ＷＯ８７／０６９４１；ＷＯ９０／１１２９６；ＷＯ００／３４３３２；ＷＯ２００４／０９３８２３；ＷＯ０３／０４０３０９；ＷＯ２００４／０２２００４；ＷＯ９９／６４０６１；ＷＯ０３／０１１８９２；ＷＯ２００４／０２９０８１；ＷＯ２００４／００５３４２；ＷＯ９０／０１５４０；ＷＯ０２／２２１５１；ＷＯ９９／４３３４１；ＷＯ９６／２９３４２；ＷＯ９８／０８８７１；ＷＯ９９／４３７０５；ＷＯ９９／４３７０６；ＷＯ９９／４３７０７；ＷＯ９９／４３７０８；ＷＯ２００４／１０５７８１；ＷＯ２００４／１０５７９０；ＷＯ２００５／０２７９７８；ＷＯ０４／０７４３１５；ＷＯ２００５／０２８５１６；およびＷＯ２００５／０４６７１６に述べられている。いくつかの組成物において使用可能な更なるＧＬＰ−１ペプチドが、欧州特許第０７３３６４４号；同第１３６４９６７号；同第０６９９，６８６号；同第０６１９３２２号；同第１０８３９２４号；同第０５１２０４２号；および第１０６１９４６号に述べられており、これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される。   Numerous examples of GLP-1 peptides suitable for use in certain compositions are described, for example, in US Pat. Nos. 6,329,336; 6,703,365; 5,705,483; 5,977,071; 6,133,235; 6,410,513; 6,388,053; 6,358,924; 5,512 No. 6,549,618; No. 5,545,618; No. 5,118,666; No. 5,120,712; No. 5,614,492; No. 5,958,909; No. 6,162,907; No. 6,849,708; No. 6,828,303; No. 6,284,727; No. 6,344, No. 180; No. 6,506,724; No. 6,858,576; No. 6,884,57 No. 6,528,486; No. 5,846,937; No. 5,990,077; No. 6,770,620; No. 6,620,910; No. 5 , 545,618; 6,569,832; and 6,268,343, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Other GLP-1 peptides that can bind to anti-glucagon antibodies in certain compositions include, for example, the following US Patent Application Publication Nos. 2004/0053370; 2004/0127399; 2003/0222101; No. 2004/0226155; No. 2004/0023334; No. 2004/0143104; No. 2005/0107318; No. 2004/0106547; No. 2004/0176307; No. 2004/0052862; No. 2004/0052862; 2004/0082507; 2004/0146985; 2004/0053370; 2003/0199672; and 2001/0011071, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Incorporated. Additional GLP-1 peptides that can be used in certain compositions are disclosed, for example, in the following PCT application publications: WO 00/34331; WO 0034332; WO 02/46227; WO 03/060071; WO 2005/003296; WO 03/018516; WO03 / 059934; WO2004 / 077871; WO99 / 30731; WO98 / 43658; WO00 / 16797; WO00 / 15224; WO03 / 103572; WO03 / 0887139; WO2004 / 110472; WO03 / 018516; WO2005 / 000892; WO03 / 028626; WO2004 / 020405; WO2004 / 019872; WO03 / 020746; WO2004 / No. 94461; WO 91/11457; WO 87/06941; WO 90/11296; WO 00/34332; WO 2004/093823; WO 03/040309; WO 2004/022004; WO 99/64061; WO 03/011892; WO 2004/029081; WO99 / 43341; WO96 / 29342; WO98 / 08871; WO99 / 43705; WO99 / 43706; WO99 / 43707; WO99 / 43708; WO2004 / 105781; WO2004 / 105790; WO2005 / 077315; 028516; and WO 2005/046716Additional GLP-1 peptides that can be used in some compositions are EP 0733644; 1364967; 0699,686; 0619322; 1083924; 0512042; And each of these are incorporated herein by reference in their entirety.

いくつかの組成物に存在する特定のＧＬＰ−１ペプチドは、式Ｉのアミノ酸配列（配列番号９２）：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１（式Ｉ、配列番号９２）
を含み、式中、
Ｒ１はＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
位置１におけるＸａａは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンであり；
位置２におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ｂＡｌａ（２−アミノプロピオン酸）、Ａｓｐ、Ａｌａ、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、２−アミノイソ酪酸またはα−α−二置換アミノ酸であり；
位置３におけるＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり；
位置５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置６におけるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
位置７におけるＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり；
位置８におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置９におけるＸａａは、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり；
位置１０におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
位置１１におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置１２におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１３におけるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１４におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１５におけるＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１６におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１７におけるＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１８におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１９におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２０におけるＸａａは、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２１におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２２におけるＸａａは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２３におけるＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２４におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２５におけるＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２６におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置２７におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２８におけるＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
位置２９におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３０におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
位置３１におけるＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３２におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓであるか、あるいは省略され；
位置３３におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであるか、あるいは省略され；
位置３４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｔｈｒであるか、あるいは省略され；
位置３５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３６におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３７におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
但し、位置３２、３３、３４、３５、３６または３７におけるアミノ酸が省略される場合、該アミノ酸の各アミノ酸下流も省略され、化合物はＧＬＰ−１活性を有する。従って、例えば、位置３２におけるアミノ酸が省略される場合、位置３３〜３７にもアミノ酸はない。同様に、位置３３におけるアミノ酸が省略される場合、位置３４〜３７にもアミノ酸はない。また、位置３４におけるアミノ酸が省略される場合、位置３５〜３７にアミノ酸はない、などという具合である。 A particular GLP-1 peptide present in some compositions is the amino acid sequence of Formula I (SEQ ID NO: 92):
Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Xaa 4 -Xaa 5 -Xaa 6 -Xaa 7 -Xaa 8 -Xaa 9 -Xaa 10 -Xaa 11 -Xaa 12 -Xaa 13 -Xaa 14 -Xaa 15 -Xaa 16 -Xaa 17 -Xaa 18 -Xaa 19 -Xaa 20 -Xaa 21 -Xaa 22 -Xaa 23 -Xaa 24 -Xaa 25 -Xaa 26 -Xaa 27 -Xaa 28 -Xaa 29 -Xaa 30 -Xaa 31 -Xaa 32 -Xaa 33 -Xaa 34 -Xaa 35 -Xaa 36 -Xaa 37 -C (O) -R 1 (Formula I, SEQ ID NO: 92)
Including
R 1 is OR 2 or NR 2 R 3 ;
R 2 and R 3 are independently hydrogen or (C 1 -C 8 ) alkyl;
Xaa at position 1 is L-histidine, D-histidine, desamino-histidine, 2-amino-histidine, 3-hydroxy-histidine, homohistidine, α-fluoromethyl-histidine or α-methyl-histidine;
Xaa at position 2 is Gly, bAla (2-aminopropionic acid), Asp, Ala, 1-amino-cyclopentanecarboxylic acid, 2-aminoisobutyric acid or α-α-disubstituted amino acid;
Xaa at position 3 is Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 4 is Gly, Thr or His;
Xaa at position 5 is Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 6 is His, Trp, Phe or Tyr;
Xaa at position 7 is Thr or Gly;
Xaa at position 8 is Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 9 is Asp, Asn or Glu;
Xaa at position 10 is Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp or Lys;
Xaa at position 11 is Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 12 is Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid Or homoglutamic acid;
Xaa at position 13 is Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 14 is Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr, Asn, Gln, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid or Homoglutamic acid;
Xaa at position 15 is Glu, Asp, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 16 is Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid Yes;
Xaa at position 17 is Gln, Asn, Arg, Glu, Asp, Lys, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 18 is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homo Glutamic acid;
Xaa at position 19 is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid Yes;
Xaa at position 20 is Lys, homolysine, Arg, Gln, Glu, Asp, Thr, His, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 21 is Leu, Glu, Asp, Thr, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 22 is Phe, Trp, Asp, Glu, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 23 is Ile, Leu, Val, Ala, Phe, Asp, Glu, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 24 is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 25 is Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp, Asn or Lys;
Xaa at position 26 is Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 27 is Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp, Asn or Lys;
Xaa at position 28 is Asn, Lys, Arg, Glu, Asp or His;
Xaa at position 29 is Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 30 is Gly, Arg, Lys, Glu, Asp, Thr, Asn or His;
Xaa at position 31 is Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 32 is Thr, Gly, Asn, Ser, Lys or omitted;
Xaa at position 33 is Gly, Asn, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Leu, Phe, Pro or omitted;
Xaa at position 34 is Gly, Thr or omitted;
Xaa at position 35 is Thr, Asn, Gly or is omitted;
Xaa at position 36 is Gly or omitted;
Xaa at position 37 is Gly or omitted;
However, when an amino acid at position 32, 33, 34, 35, 36 or 37 is omitted, the amino acid downstream of the amino acid is also omitted, and the compound has GLP-1 activity. Thus, for example, if the amino acid at position 32 is omitted, there are no amino acids at positions 33-37. Similarly, if the amino acid at position 33 is omitted, there are no amino acids at positions 34-37. Also, if the amino acid at position 34 is omitted, there are no amino acids at positions 35-37, and so forth.

特定の組成物では、ＧＬＰ−１ペプチドは、下記表６に示されるような配列番号１〜３５もしくは配列番号１２６の任意のアミノ酸配列またはエキセンジン−３もしくはエキセンジン−４（配列番号１２７）を含む。一部の他の組成物におけるＧＬＰ−１ペプチドは、１、２、３、４もしくは５以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７を含み、但し、改変体はＧＬＰ−１活性（例えば、インスリン向性活性）を有する。更に別の組成物では、ＧＬＰ−１ペプチドは、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。   In a particular composition, the GLP-1 peptide comprises any amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-35 or SEQ ID NO: 126 as shown in Table 6 below, or exendin-3 or exendin-4 (SEQ ID NO: 127). The GLP-1 peptide in some other compositions comprises SEQ ID NO: 1-35, SEQ ID NO: 126 or SEQ ID NO: 127, including 1, 2, 3, 4 or 5 or fewer conservative amino acid substitutions, but modified The body has GLP-1 activity (eg, insulinotropic activity). In yet another composition, the GLP-1 peptide has at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90% or 95% sequence identity with SEQ ID NO: 1-35, SEQ ID NO: 126 or SEQ ID NO: 127. Have.

表６   Table 6

Figure 2009534424
Ｃ．抗体とＧＬＰ−１化合物との結合
上記のように、抗グルカゴン抗体とＧＬＰ−１化合物に関連して「結合される（ｌｉｎｋｅｄ）」という用語が用いられる際、これら２つの分子はリンカーによって接合される（ｊｏｉｎｅｄ）場合もあれば、そうでない場合もある。特定の実施形態では、リンカーが抗体と化合物との間のスペーサーとして機能するように用いられる場合、種々の異なる化学構造を用いることができる。例えば、特定の実施形態では、リンカーはペプチド結合によって結合したアミノ酸残基を含み、即ち、リンカーはペプチドを含む。従って、特定の実施形態では、リンカーはこれらの終点間のすべての数を含む１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチドである。リンカーにおいて用いられるアミノ酸残基は従来型または非従来型アミノ酸残基でよい。特定の実施形態では、リンカーにおけるアミノ酸残基は別の態様でグリコシル化および／または誘導体化され得る。特定の実施形態では、リンカーにおけるアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。特定の実施形態では、リンカーはグリシンおよび／またはアラニンなどの立体的に障害されないアミノ酸残基の過半数を含む。従って、特定の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン（例えば、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）およびポリアラニンから選択される。特定の典型的なリンカーには、限定されないが、
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号９７）；
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号９８）；
（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号９９）；
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号１００）；および
ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＡｌａＰｒｏ（配列番号１３０）
が含まれる。
Figure 2009534424
 C. Binding of Antibody to GLP-1 Compound As noted above, when the term “linked” is used in reference to an anti-glucagon antibody and a GLP-1 compound, the two molecules are joined by a linker. It may or may not be joined. In certain embodiments, a variety of different chemical structures can be used when the linker is used to function as a spacer between the antibody and the compound. For example, in certain embodiments, the linker comprises amino acid residues joined by peptide bonds, ie the linker comprises a peptide. Thus, in certain embodiments, the linker is a peptide having 1-20 amino acid residues, including all numbers between these endpoints. The amino acid residues used in the linker may be conventional or non-conventional amino acid residues. In certain embodiments, amino acid residues in the linker can be glycosylated and / or derivatized in another manner. In certain embodiments, the amino acid residue in the linker is selected from glycine, alanine, proline, asparagine, glutamine and lysine. In certain embodiments, the linker comprises a majority of sterically unhindered amino acid residues such as glycine and / or alanine. Thus, in certain embodiments, the linker is selected from polyglycine (eg, (Gly) 4 , (Gly) 5 ), poly (Gly-Ala) and polyalanine. Certain exemplary linkers include, but are not limited to:
(Gly) 3 Lys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 97);
(Gly) 3 AsnGlySer (Gly) 2 (SEQ ID NO: 98);
(Gly) 3 Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 99);
GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 100); and GlyGlyGlyAlaPro (SEQ ID NO: 130)
Is included.

上記の表記について説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。特定の実施形態では、リンカーはＧｌｙ残基とＡｌａ残基との組合せを含む。特定の実施形態では、リンカーは１０またはそれ以下のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、リンカーはこれらの終点間のすべての数を含む１１〜３０個のアミノ酸残基を含む。 To describe the above notation, for example, (Gly) 3 Lys (Gly) 4 means Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. In certain embodiments, the linker comprises a combination of Gly and Ala residues. In certain embodiments, the linker comprises 10 or fewer amino acid residues. In certain embodiments, the linker comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acid residues. In certain embodiments, the linker comprises 11-30 amino acid residues, including all numbers between these endpoints.

本明細書で提供されるような組成物において用いることができる特定のリンカーの更なる例には、ＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＧＧＧＧＧＧ（配列番号３６）；ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号３７）；およびＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号３８）が含まれる。   Further examples of specific linkers that can be used in compositions as provided herein include GSGSATGGGSSTAGSSGSGSATGGGGGG (SEQ ID NO: 36); GSGGGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGGGGG (SEQ ID NO: 37); and SGGGGSGGGGSGGGGGGGGGGGGG .

特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、２つのポリペプチドを単一コード配列にクローニングするのに用いられる制限酵素部位から生じ得る。特定の実施形態では、制限酵素部位は１つまたは両方のポリペプチドのコード配列に付加される。特定の実施形態では、このようなリンカーのアミノ酸配列は、少なくとも部分的に、クローニング処理に対して選択される制限酵素部位により決定する。   In certain embodiments, the peptide linker can arise from restriction enzyme sites used to clone two polypeptides into a single coding sequence. In certain embodiments, restriction enzyme sites are added to the coding sequence of one or both polypeptides. In certain embodiments, the amino acid sequence of such a linker is determined, at least in part, by the restriction enzyme site selected for the cloning process.

特定の実施形態では、非ペプチドリンカーが提供される。特定の典型的な非ペプチドリンカーには、限定的ではないが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ｓ＝２〜２０）などのアルキルリンカーが含まれる。このようなアルキルリンカーは、特定の実施形態では、更に、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの非立体障害基を含むが、これに限定されない置換を含む。非限定的な典型的非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカー In certain embodiments, non-peptide linkers are provided. Specific exemplary non-peptide linker, but are not limited to, -NH- (CH 2) s -C (O) - (s = 2~20) include alkyl linkers such. Such alkyl linkers, in certain embodiments, may further include non-sterically hindered groups such as lower alkyl (eg C 1 -C 6 ) lower acyl, halogen (eg Cl, Br), CN, NH 2 , phenyl, etc. Including, but not limited to, substitutions. A non-limiting typical non-peptide linker is a PEG linker

Figure 2009534424
であり、式中、ｎはリンカーが１００〜５０００ｋＤの分子量を有するような数である。特定の実施形態では、ｎは、リンカーがこれらの終点間の全ポイントを含む１００〜５００ｋＤの分子量を有するような数である。
Figure 2009534424
 Where n is a number such that the linker has a molecular weight of 100-5000 kD. In certain embodiments, n is a number such that the linker has a molecular weight of 100-500 kD, including all points between these endpoints.

特定の実施形態では、リンカーは２つのポリペプチドを互いに結合するのに用いられる化学的および／または酵素的プロセスから生じ得る。ポリペプチドを結合するための特定の例示的な化学的および／または酵素的プロセスが、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ Ｃａｔａｌｏｇ（２００３／２００４）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に述べられている。
Ｄ．ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の具体例
提供される組成物の一部の具体例は、抗体がＡＧ１５９の１つもしくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲ（配列番号７６〜７８）および１つもしくはそれ以上の重鎖ＣＤＲ（配列番号８４〜８６）を含み、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１ペプチドあるいは本明細書で開示される他の任意のＧＬＰ−１ペプチドに結合（例えば、融合）した例である。他の組成物では、抗体はＡＧ１５９の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域（それぞれ、配列番号７９、８３）を含み、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１ペプチドあるいは本明細書で開示される他の任意のＧＬＰ−１ペプチドに融合される。更に別の組成物では、抗体はＡＧ１５９の成熟重鎖（配列番号８２または８９）および／または成熟軽鎖（配列番号４０）を含み、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１ペプチドあるいは本明細書で開示される他の任意のＧＬＰ−１ペプチドに融合される。 In certain embodiments, the linker can result from a chemical and / or enzymatic process used to join two polypeptides together. Certain exemplary chemical and / or enzymatic processes for conjugating polypeptides are described, for example, in Pierce Applications Handbook and Catalog (2003/2004) (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). .
D. Specific Examples of GLP-1 Compound / Antibody Compositions Some specific examples of provided compositions include one or more light chain CDRs (SEQ ID NOs: 76-78) and one or more Or a light chain variable region and / or a heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-35, SEQ ID NO: 126 or SEQ ID NO: 127, or Examples of binding (eg, fusion) to any other GLP-1 peptide disclosed herein. In other compositions, the antibody comprises the light chain variable region and / or heavy chain variable region of AG159 (SEQ ID NOs: 79, 83, respectively), wherein the light chain variable region and / or heavy chain variable region is SEQ ID NO: 1- 35, fused to a GLP-1 peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 126 or SEQ ID NO: 127, or any other GLP-1 peptide disclosed herein. In yet another composition, the antibody comprises the mature heavy chain of AG159 (SEQ ID NO: 82 or 89) and / or the mature light chain (SEQ ID NO: 40), wherein the light chain variable region and / or heavy chain variable region is SEQ ID NO: 1-35, GLP-1 peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 126 or 127, or any other GLP-1 peptide disclosed herein.

これまで詳細に上述したように、これらのＧＬＰ−１ペプチドはＡＧ１５９抗体または断片に種々の異なる方法で結合することができ、例えば、多数のＧＬＰ−１ペプチド（同一または互いに異なる）が異なる数および位置にて抗体に結合されるような方法が含まれる。   As described in detail above, these GLP-1 peptides can bind to the AG159 antibody or fragment in a variety of different ways, for example, a number of different GLP-1 peptides (identical or different from each other) and Methods such as binding to an antibody at a location are included.

提供される特定の例示的な組成物が表６に挙げられている。これらの特定の組成物が、単に、本明細書で述べられる一般的組成物の具体例を示すために提供され、また、組成物がこれらの特定の形態に限定されないということが理解されるべきである。表６の最初の縦列は組成物の一般構造を示す。一般的ではあっても必ずしもそうではないが、本明細書で採用されている省略形はＬＣ：ＨＣであり、軽鎖形態がコロンの前に挙げられ、重鎖形態がコロンの後に挙げられている。上記に示したように、天然ＧＬＰ−１配列に対する変更は、括弧で示され、形態：ｘ位置番号ｙを有し、ｘは天然ＧＬＰ−１配列での表示位置番号におけるアミノ酸であり、ｙはこの位置で置換されるアミノ酸である。多重置換は順方向スラッシュ（／）により分離される。Ｃ末端に付加されるアミノ酸はプラス記号（＋）、続いて、付加の位置で示される。ＧＬＰ−１ペプチドがＬＣに結合される場合、これはＧＬＰ−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５と表示され、ＧＬＰ−１ペプチドはコロンの左側に挙げられている。ＧＬＰ−１ペプチドがＨＣに結合される場合、これはＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ−ＡＧ１５９と表示され、即ち、ＧＬＰ−１ペプチドはコロンの右側に挙げられている。ＧＬＰ−１ペプチドおよびＡＧ１５９抗体の軽鎖または重鎖はリンカー（配列番号３６〜３８）を介して融合される。   Specific exemplary compositions that are provided are listed in Table 6. It should be understood that these specific compositions are merely provided to illustrate specific examples of the general compositions described herein, and that the compositions are not limited to these specific forms. It is. The first column in Table 6 shows the general structure of the composition. Although common, but not necessarily, the abbreviation employed herein is LC: HC, where the light chain form is listed before the colon and the heavy chain form is listed after the colon. Yes. As indicated above, changes to the native GLP-1 sequence are shown in parentheses and have the form: x position number y, x is the amino acid at the indicated position number in the native GLP-1 sequence, and y is The amino acid substituted at this position. Multiple permutations are separated by a forward slash (/). Amino acids added to the C-terminus are indicated by a plus sign (+) followed by an additional position. If the GLP-1 peptide is bound to LC, it is denoted as GLP-AG159LC: AG15, and the GLP-1 peptide is listed on the left side of the colon. If the GLP-1 peptide is bound to HC, it is denoted AG159LC: GLP-AG159, ie the GLP-1 peptide is listed on the right side of the colon. The light chain or heavy chain of the GLP-1 peptide and the AG159 antibody are fused via a linker (SEQ ID NOs: 36-38).

これらの特定の組成物では、ＡＧ１５９抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプであることが示されるが、他の任意の免疫グロブリンアイソタイプであってもよい。これらの融合では、ＧＬＰ−１ペプチドのカルボキシ末端がリンカー（例えば、配列番号３６〜３８）を介してＡＧ１５９抗体のアミノ末端に融合される。しかし、上述のように、ＧＬＰ−１ペプチドは他の位置および他の配向にて結合され得る。   In these particular compositions, the AG159 antibody is shown to be an IgG1 or IgG2 isotype, but may be any other immunoglobulin isotype. In these fusions, the carboxy terminus of the GLP-1 peptide is fused to the amino terminus of the AG159 antibody via a linker (eg, SEQ ID NOs: 36-38). However, as noted above, GLP-1 peptides can be bound in other positions and in other orientations.

特定の組成物は、配列番号４１〜７４または配列番号１２９のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチド融合を含む。特定の組成物では、軽鎖ポリペプチド融合はＡＧ１５９の重鎖（配列番号８２または８９）と対をなす。いくつかの組成物は配列番号４１〜７４の同一の二対の軽鎖融合およびＡＧ１５９の同一の二対の重鎖を含み、四量体構造を有する抗体を形成する。   Certain compositions comprise a light chain polypeptide fusion having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41-74 or SEQ ID NO: 129. In certain compositions, the light chain polypeptide fusion is paired with the heavy chain of AG159 (SEQ ID NO: 82 or 89). Some compositions comprise the same two pairs of light chain fusions of SEQ ID NOs: 41-74 and the same two pairs of heavy chains of AG159, forming an antibody having a tetrameric structure.

ＧＬＰ−１ペプチド（例えば、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７）が軽鎖ではなく、ＡＧ１５９の重鎖ポリペプチド（配列番号８２または８９）に融合されることを除き、他の組成物は同様である。このような重鎖ポリペプチド融合はＡＧ１５９の軽鎖（配列番号４０または７５）と対をなすことができ、いくつかの組成物は同一の二対の重鎖融合およびＡＧ１５９の同一の二対の軽鎖を含み、四量体構造を有する抗体を形成する。   Other than that the GLP-1 peptide (eg, SEQ ID NO: 1-35, SEQ ID NO: 126 or SEQ ID NO: 127) is fused to the heavy chain polypeptide of AG159 (SEQ ID NO: 82 or 89) rather than the light chain, The composition is similar. Such heavy chain polypeptide fusions can be paired with the light chain of AG159 (SEQ ID NO: 40 or 75), and some compositions are identical two pairs of heavy chain fusions and two identical pairs of AG159. An antibody comprising a light chain and having a tetrameric structure is formed.

詳細に上述したように、本明細書で提供されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、抗体および／またはＧＬＰ−１ペプチドが本明細書の表に挙げられるものの改変体であるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む。変更は抗体および／またはＧＬＰ−１ペプチドにおいて可能である。従って、例えば、特定の組成物は、表１〜４または７に挙げられる鎖のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を有するポリペプチド鎖を含む。他の組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以下のアミノ酸置換を含む、表７のポリペプチドを含み、典型的には、その置換は上述のような保存的置換である。   As described in detail above, the GLP-1 compounds / antibody compositions provided herein are GLP-1 compounds wherein the antibodies and / or GLP-1 peptides are variants of those listed in the tables herein. / Include antibody composition. Alterations are possible in antibodies and / or GLP-1 peptides. Thus, for example, a particular composition is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% or 99% identical to the amino acid sequence of a chain listed in Tables 1-4 or 7 A polypeptide chain having a sex is included. Other compositions comprise the polypeptide of Table 7, comprising no more than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acid substitutions, typically the substitutions described above. Such conservative substitutions.

別の実施形態では、配列番号４１〜７４または配列番号１２８または１２９の任意の１つに示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。   In another embodiment, a polypeptide comprising an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 41-74 or any one of SEQ ID NO: 128 or 129 is provided.

表７   Table 7

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Ｅ．任意の構成要素
いくつかの組成物では、ＧＬＰ−１化合物および／または抗グルカゴン抗体は追加の構成要素を含むように改変される。例えば、ＧＬＰ−１化合物または抗体は１つ以上の水溶性ポリマーに結合され得る。好適な水溶性ポリマーまたはその混合物には、限定されないが、Ｎ結合またはＯ結合炭水化物、糖類（例えば、キトサン、キサンタンゴム、セルロースおよびその誘導体、アカシアゴム、カラヤゴム、グアーゴム、カラギーナンおよびアガロースなどの多糖類）、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（タンパク質を誘導体化するのに用いられているＰＥＧ形態を含み、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチリングリコールが含まれる）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン）、セルロースまたは他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン、ポリビニルアルコールならびに前述のコポリマーが含まれる。
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 E. Optional Components In some compositions, the GLP-1 compound and / or anti-glucagon antibody is modified to include additional components. For example, a GLP-1 compound or antibody can be conjugated to one or more water soluble polymers. Suitable water-soluble polymers or mixtures thereof include, but are not limited to, N-linked or O-linked carbohydrates, sugars (eg, polysaccharides such as chitosan, xanthan gum, cellulose and derivatives thereof, acacia gum, karaya gum, guar gum, carrageenan and agarose. ), Phosphate, polyethylene glycol (PEG) (including PEG forms used to derivatize proteins, including mono- (C 1 -C 10 ), alkoxy- or aryloxy-polyethylene glycol) ), Monomethoxy-polyethylene glycol, dextran (eg, low molecular weight dextran of about 6 kD), cellulose or other carbohydrate-based polymers, poly- (N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer, poly Included are propylene oxide / ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols (eg glycerol), polyoxyethylene-polyoxypropylene, polyvinyl alcohol and the aforementioned copolymers.

特定の組成物では、ＧＬＰ−１化合物は好適な二価金属カチオンと複合体を形成する。ＧＬＰ−１化合物の二価金属複合体は懸濁液として皮下投与することができ、一般に、このようなＧＬＰ−１化合物の複合体が生理的ｐＨほどの水溶液に不溶性であるため、インビボにて放出速度が低下する。ＧＬＰ−１化合物と複合体を形成するのに好適な二価金属カチオンの非限定例には、Ｚｎ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｃｄ＋＋、Ｎｉ＋＋などが含まれる。ＧＬＰ−１化合物の二価金属複合体は、例えば、参考として本明細書に援用されるＷＯ０１／９８３３１に述べられているような手法を用いて得ることができる。
ＩＶ．核酸
本明細書で述べられるような抗体の１鎖もしくは両鎖またはＧＬＰ−１ペプチドと抗グルカゴン抗体の１鎖との融合をコードする核酸、ならびにこのような抗体または融合体の断片、誘導体、突然変異タンパク質もしくは改変体をコードする核酸も提供される。ポリペプチドまたは抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ、あるいは増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマーまたはシークエンシングプライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチドも提供される。核酸は任意の長さでよい。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれ以上のヌクレオチド長でよく、かつ／あるいは１つ以上のさらなる配列、例えば、調節配列を含むことができ、かつ／あるいはより大きな核酸の一部、例えば、ベクターでよい。核酸は一本鎖または二本鎖でよく、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチドならびにそれらの人工的改変体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。 In certain compositions, the GLP-1 compound forms a complex with a suitable divalent metal cation. GLP-1 compound divalent metal complexes can be administered subcutaneously as a suspension, and in general, such GLP-1 compound complexes are insoluble in aqueous solutions at physiological pH and therefore in vivo. Release rate is reduced. Non-limiting examples of divalent metal cations suitable for forming a complex with a GLP-1 compound include Zn ++ , Mn ++ , Fe ++ , Ca ++ , Co ++ , Cd ++ , Ni ++ and the like. A divalent metal complex of a GLP-1 compound can be obtained, for example, using a technique as described in WO01 / 98331, which is incorporated herein by reference.
IV. Nucleic acids Nucleic acids encoding fusions of one or both chains of an antibody as described herein or a GLP-1 peptide and one chain of an anti-glucagon antibody, as well as fragments, derivatives, suddenly of such antibodies or fusions Nucleic acids encoding mutant proteins or variants are also provided. Sufficient polynucleotides are also provided for use as hybridization probes, PCR primers or sequencing primers to identify, analyze, mutate or amplify polynucleotides encoding the polypeptide or antibody chain. The nucleic acid can be of any length. The nucleic acid is, for example, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750. , 1,000, 1,500, 3,000, 5,000 or more nucleotides in length and / or can include one or more additional sequences, eg, regulatory sequences, and / or larger It may be part of a nucleic acid, for example a vector. Nucleic acids can be single-stranded or double-stranded and can include RNA and / or DNA nucleotides and artificial variants thereof (eg, peptide nucleic acids).

抗体ポリペプチド（例えば、重鎖もしくは軽鎖、可変ドメインのみまたは完全長）をコードするＤＮＡは、グルカゴンまたはその免疫原性断片で免疫化されたマウスのＢ細胞から単離され得る。ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手法により単離され得る。ファージ提示は公知の手法の別例であり、これにより、抗体の誘導体が調製され得る。一手法では、対象抗体の構成要素であるポリペプチドは、任意の好適な組換え発現系において発現され、発現ポリペプチドは組み合わされて抗体分子を形成する。   DNA encoding an antibody polypeptide (eg, heavy or light chain, variable domain only or full length) can be isolated from B cells of mice immunized with glucagon or an immunogenic fragment thereof. DNA can be isolated by conventional techniques such as polymerase chain reaction (PCR). Phage display is another example of a known technique whereby antibody derivatives can be prepared. In one approach, the polypeptide that is a component of the subject antibody is expressed in any suitable recombinant expression system and the expressed polypeptides are combined to form the antibody molecule.

別の態様では、本発明のポリペプチドまたはその一部（例えば、１つもしくはそれ以上のＣＤＲまたは１つもしくはそれ以上の可変領域ドメイン）をコードする核酸を含むベクターが提供される。ベクターの例には、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム性哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが含まれる。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に好適な形態での本発明の核酸を含み得る。組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含み、これは発現する核酸に機能的に結合される。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する調節配列（ＳＶ４初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示する調節配列（例えば、組織特異的調節配列、Ｖｏｓｓら、１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７，Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７を参照；それらの全体が参考として本明細書に援用される）ならびに特定の処置または病状に応答してヌクレオチド配列の誘導発現を指示する調節配列（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ）プロモーターならびに原核細胞系および真核細胞系におけるｔｅｔ応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター）（同文献参照）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者には理解されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され、これにより、本明細書で述べるような核酸にコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを生成することができる。   In another aspect, a vector comprising a nucleic acid encoding a polypeptide of the invention or a portion thereof (eg, one or more CDRs or one or more variable region domains) is provided. Examples of vectors include, but are not limited to, plasmids, viral vectors, non-episomal mammalian vectors and expression vectors such as recombinant expression vectors. A recombinant expression vector of the invention can comprise a nucleic acid of the invention in a form suitable for expression of the nucleic acid in a host cell. A recombinant expression vector contains one or more regulatory sequences selected based on the host cell used for expression, which is operably linked to the nucleic acid to be expressed. Regulatory sequences are regulatory sequences that direct the constitutive expression of nucleotide sequences in many types of host cells (SV4 early gene enhancer, Rous sarcoma virus promoter and cytomegalovirus promoter), and the expression of nucleotide sequences only in certain host cells. Indicating regulatory sequences (see, eg, tissue specific regulatory sequences, Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11: 287, Maniatis et al., 1987, Science 236: 1237; incorporated herein by reference in their entirety. As well as regulatory sequences that direct the inducible expression of nucleotide sequences in response to specific treatments or conditions (eg, metallothionin promoters in mammalian cells and prokaryotic cell systems). And tet-responsive and / or streptomycin-responsive promoters in eukaryotic cell systems) (see ibid.). It will be appreciated by those skilled in the art that the design of the expression vector can depend on factors such as the choice of host cell to be transformed, the level of expression of the desired protein, and the like. The expression vectors of the present invention can be introduced into a host cell, thereby producing a protein or peptide, including a fusion protein or peptide encoded by a nucleic acid as described herein.

別の態様では、本発明は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））であってよい。ベクターＤＮＡは従来の形質転換またはトランスフェクション手法により、原核細胞または真核細胞に導入することができる。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのため、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション法に依って、極少数の細胞が外来性ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることが既知である。一般的に、これらの不可欠構成要素（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を同定し、選択するため、選択可能マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性のための）をコードする遺伝子が対象遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与する選択可能マーカーを含む。導入核酸を安定にトランスフェクトされた細胞は、他の方法の中でも特に、薬物選択により同定することができる（例えば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、一方で、他の細胞は死滅する）。
Ｖ．抗体の調製
提供される非ヒト抗体は、例えば、任意の抗体産生動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバまたは非ヒト霊長動物（例えば、サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えば、チンパンジー））に由来し得る。非ヒト抗体は、例えば、インビトロでの細胞培養および細胞培養ベースの用途または抗体に対する免疫応答が生じないか、もしくは顕著でないか、防止可能であるか、懸案事項でないか、もしくは所望される他の任意の用途において用いることができる。本発明の特定の実施形態では、抗体はヒトグルカゴンで免疫化することにより作製され得る。抗体はポリクローナル、モノクローナルであってよく、あるいは組換えＤＮＡを発現させることにより宿主細胞において合成され得る。 In another aspect, the present invention provides a host cell into which a recombinant expression vector of the present invention has been introduced. The host cell may be any prokaryotic cell (eg, E. coli) or eukaryotic cell (eg, yeast, insect or mammalian cell (eg, CHO cell)). Vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells via conventional transformation or transfection techniques. For stable transfection of mammalian cells, it is known that very few cells can integrate foreign DNA into their genome, depending on the expression vector and transfection method used. Generally, in order to identify and select these integral components, a gene encoding a selectable marker (eg, for resistance to antibiotics) is introduced into the host cell along with the gene of interest. Preferred selectable markers include selectable markers that confer resistance to drugs such as G418, hygromycin and methotrexate. Cells stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified by drug selection, among other methods (eg, cells incorporating a selectable marker gene survive, while other cells die). To do).
V. Preparation of Antibodies Non-human antibodies provided can be, for example, any antibody-producing animal, such as a mouse, rat, rabbit, goat, donkey or non-human primate (eg, monkey (eg, cynomolgus or rhesus monkey) or ape (eg, , Chimpanzee)). Non-human antibodies can be used, for example, in vitro cell culture and cell culture-based applications or other immune responses to antibodies that are not or are not significant, preventable, not a concern, or desired It can be used in any application. In certain embodiments of the invention, antibodies can be made by immunizing with human glucagon. Antibodies can be polyclonal, monoclonal, or can be synthesized in host cells by expressing recombinant DNA.

完全ヒト抗体は、上述のように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を免疫化することにより、あるいはヒト抗体のレパートリーを発現しているファージディスプレイライブラリーを選択することにより、調製され得る。   Fully human antibodies can be prepared by immunizing transgenic animals containing human immunoglobulin loci, as described above, or by selecting a phage display library expressing a repertoire of human antibodies. .

モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は種々の手法により作製することができ、従来のモノクローナル抗体法、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法が含まれる。あるいは、モノクローナル抗体を作製する他の手法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を用いることができる。ハイブリドーマを調製するのに好適な動物系の１つはマウス動物系であり、これは十二分に確立した手法である。融合のための免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコルおよび技法は、当該分野で公知である。このような手法では、免疫化マウス由来のＢ細胞は、好適な不死化された融合パートナー、例えば、マウス動物骨髄腫細胞株と融合される。所望により、マウスの代わりに更にラットまたは他の哺乳動物を免疫化することができ、このような動物由来のＢ細胞をマウス動物骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマを形成することができる。あるいは、マウス以外の供給源由来の骨髄腫細胞株が用いられ得る。ハイブリドーマを作製するための融合手法も周知である。   Monoclonal antibodies (mAbs) can be made by a variety of techniques, including conventional monoclonal antibody methods such as the standard somatic cell hybridization method of Kohler and Milstein, 1975, Nature 256: 495. Alternatively, other techniques for making monoclonal antibodies can be used, such as viral or oncogenic transformation of B lymphocytes. One suitable animal system for preparing hybridomas is the murine animal system, which is a well-established procedure. Immunization protocols and techniques for isolation of immunized splenocytes for fusion are known in the art. In such an approach, B cells from the immunized mouse are fused with a suitable immortalized fusion partner, such as a mouse animal myeloma cell line. If desired, rats or other mammals can be further immunized instead of mice, and B cells from such animals can be fused with mouse animal myeloma cell lines to form hybridomas. Alternatively, myeloma cell lines from sources other than mice can be used. Fusion techniques for producing hybridomas are also well known.

提供される単鎖抗体は、アミノ酸橋（短いペプチドリンカー）を介して重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片（例えば、配列番号７９および８３）を結合することにより形成され得、単一ポリペプチド鎖が生じる。このような単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）は、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡを、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡｓ間に融合することにより調製され得る。生じたポリペプチドは折り畳んで抗原結合モノマーを形成することができ、あるいは２つの可変ドメイン間の可撓性リンカーの長さに依存し、マルチマー（例えば、二量体、三量体または四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔら、１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；Ｋｏｒｔｔら、２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。異なるＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを結合することにより、異なるエピトープに結合するマルチマーｓｃＦｖｓを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら、２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。単鎖抗体の作製のために開発された技法は、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９；Ｗａｒｄら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４，ｄｅ Ｇｒａａｆら、２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７に述べられている技法を含む。 Provided single chain antibodies can be formed by joining heavy and light chain variable domain (Fv region) fragments (eg, SEQ ID NOs: 79 and 83) via amino acid bridges (short peptide linkers) A polypeptide chain is generated. Such single chain Fvs (scFvs) can be prepared by fusing DNA encoding a peptide linker between DNAs encoding two variable domain polypeptides (V L and V H ). The resulting polypeptide can be folded to form an antigen binding monomer, or can be multimeric (eg, dimer, trimer or tetramer depending on the length of the flexible linker between the two variable domains. ) (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10: 423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 95-108). By combining a polypeptide comprising a different V L and V H, it is possible to form multimers scFvs that bind to different epitopes (Kriangkum et al, 2001, Biomol.Eng.18: 31-40). Techniques developed for the production of single chain antibodies are described in US Pat. No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879; Ward et al., 1989, Nature 334: 544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178: 379-87.

１つのサブクラスである本明細書で提供される抗体は、サブクラス転換法を用いて異なるサブクラス由来の抗体に変換することができる。従って、例えば、ＩｇＧ抗体はＩｇＭ抗体に由来し得、その逆も同様である。このような技法は、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体と異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関連する生物特性も示す新規抗体の調製を可能にする。組換えＤＮＡ法が用いられ得る。このような手法では、特定の抗体ポリペプチドをコードするクローンＤＮＡ、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡが用いられ得る。例えば、Ｌａｎｔｔｏら、２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６を参照されたい。更に、ＩｇＧ４が所望される場合、ＩｇＧ４抗体における不均一性をもたらし得るＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するため、Ｂｌｏｏｍら、１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：４０７；参照して本明細書に援用される）に報告されているように、ヒンジ領域に点突然変異（ＣＰＳＣＰ−＞ＣＰＰＣＰ）を導入することも望まれ得る。   Antibodies provided herein that are one subclass can be converted to antibodies from different subclasses using subclass conversion methods. Thus, for example, an IgG antibody can be derived from an IgM antibody and vice versa. Such techniques allow for the preparation of new antibodies that have the antigen binding properties of a given antibody (parent antibody) but also exhibit biological properties associated with a different antibody isotype or subclass than the parent antibody. Recombinant DNA methods can be used. In such a procedure, clone DNA encoding a specific antibody polypeptide, for example, DNA encoding a constant domain of an antibody of a desired isotype can be used. See, for example, Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178: 303-16. In addition, if IgG4 is desired, see Bloom et al., 1997, Protein Science 6: 407; herein to reduce the tendency to form intra-H chain disulfide bonds that can lead to heterogeneity in IgG4 antibodies. It may also be desirable to introduce a point mutation (CPSCP-> CPPCP) in the hinge region, as reported in (incorporated).

異なる性質（即ち、抗体が結合する抗原に対する異なる親和性）を有する抗体を得る技法も公知である。鎖シャッフリングと称されるこのような技法の１つは、免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーを糸状バクテリオファージの表面上に提示することを含み、ファージディスプレイと称されることが多い。Ｍａｒｋｓら、１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９に報告されているように、鎖シャッフリングはハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高親和性抗体を調製するのに用いられている。   Techniques for obtaining antibodies with different properties (ie, different affinities for the antigen to which the antibody binds) are also known. One such technique, referred to as chain shuffling, involves displaying an immunoglobulin variable domain gene repertoire on the surface of filamentous bacteriophages and is often referred to as phage display. Chain shuffling has been used to prepare high affinity antibodies to the hapten 2-phenyloxazol-5-one, as reported by Marks et al., 1992, BioTechnology, 10: 779.

本明細書で述べられる抗体および断片の機能的および／または生化学的特性の実質的な改変は、（ａ）例えば、シート構造またはヘリカル構造としての置換の領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性あるいは（ｃ）側鎖の嵩高さを維持することへの影響が有意に異なる、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列における置換をなすことによって果たされ得る。「保存的アミノ酸置換」は、当該位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷への影響をほとんどまたは全く有さない、天然アミノ酸残基の非天然残基との置換を含み得る。更に、また、アラニン走査突然変異誘発について過去に述べられているように、ポリペプチドにおける任意の天然残基がアラニンに置換され得る。   Substantial modification of the functional and / or biochemical properties of the antibodies and fragments described herein can include (a) the structure of the molecular backbone in the region of substitution, eg, as a sheet structure or a helical structure, (b) It can be accomplished by making substitutions in the heavy and light chain amino acid sequences that have significantly different effects on maintaining the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site or (c) bulkiness of the side chain. A “conservative amino acid substitution” can include a substitution of a natural amino acid residue with a non-natural residue that has little or no effect on the polarity or charge of the amino acid residue at that position. In addition, any natural residue in the polypeptide can be replaced with alanine, as also described previously for alanine scanning mutagenesis.

対象抗体のアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、日常技術を適用することによって当業者により実施され得る。アミノ酸置換は、本明細書で提供される抗体の重要な残基を同定し、あるいはヒトグルカゴンに対するこれらの抗体の親和性を増減させるのに用いることができる。
ＶＩ．抗グルカゴン抗体の発現
抗グルカゴン抗体は多くの従来技法の任意の技法により調製することができる。例えば、抗グルカゴン抗体は、当該分野で公知の任意の手法を用いて組換え発現系により作製され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔら（ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）：およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい。 Amino acid substitutions (whether conservative or non-conservative) of the subject antibodies can be performed by those skilled in the art by applying routine techniques. Amino acid substitutions can be used to identify important residues of the antibodies provided herein or to increase or decrease the affinity of these antibodies for human glucagon.
VI. Expression of anti-glucagon antibodies Anti-glucagon antibodies can be prepared by any of a number of conventional techniques. For example, an anti-glucagon antibody can be produced by a recombinant expression system using any technique known in the art. For example, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyzes, Kennet et al. (Eds.) Plenum Press, New York (1980): and Antibodies: A Lab. See Cold Spring Harbor, NY (1988).

本発明の抗体はハイブリドーマ細胞株またはハイブリドーマ以外の細胞株において発現され得る。哺乳動物、昆虫または微生物宿主細胞を形質転換するのに、抗体をコードする発現構築物を用いることができる。形質転換はポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法を用いて実施することができ、例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は任意の目的で参考として本明細書に援用される）に例示されるように、当該分野で公知のトランスフェクション手法により、ポリヌクレオチドをウイルスまたはバクテリオファージにパッケージングし、宿主細胞に構築物を形質導入することを含む。用いられる至適形質転換手法はどのタイプの宿主細胞が形質転換されるかに依存する。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は当該分野で公知であり、限定されないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、核酸の正荷電脂質との混合およびＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションを含む。   The antibodies of the present invention can be expressed in hybridoma cell lines or cell lines other than hybridomas. Expression constructs encoding antibodies can be used to transform mammalian, insect or microbial host cells. Transformation can be performed using any known method for introducing polynucleotides into host cells, eg, US Pat. Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 and 4,959,455 (these patents are incorporated herein by reference for any purpose) by transfection techniques known in the art. Packaging the polynucleotide into a virus or bacteriophage and transducing the construct into a host cell. The optimal transformation technique used will depend on which type of host cell is being transformed. Methods for introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells are known in the art and include, but are not limited to, dextran-mediated transfection, calcium phosphate precipitation, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, electroporation, and the incorporation of polynucleotides into liposomes. Includes encapsulation, mixing of nucleic acids with positively charged lipids and direct microinjection of DNA into the nucleus.

典型的には、本発明の組換え発現構築物は、１つ以上の以下のもの：抗グルカゴン抗体の重鎖定常領域；重鎖可変領域；軽鎖定常領域；軽鎖可変領域；軽鎖または重鎖の１つもしくはそれ以上のＣＤＲを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。通常、ベクターは用いられる宿主細胞において機能的であるように選択される（即ち、ベクターは宿主細胞機構と適合性があり、遺伝子の増幅および／または発現が生じることを可能にする）。一部の実施形態では、ジヒドロ葉酸還元酵素などのタンパク質レポーターを用いて、タンパク質断片相補性アッセイを用いるベクターが用いられる（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号を参照；これは参考として本明細書に援用される）。好適な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社またはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（以前は「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社」）から購入することができる。本発明の抗体および断片をクローニングし、発現させるための他の有用なベクターには、ＢｉａｎｃｈｉおよびＭｃＧｒｅｗ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８４（４）：４３９−４４（２００３）（これは参考として本明細書に援用される）に報告されているベクターが含まれる。更なる好適な発現ベクターが、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．），１９９０，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（これは参考として本明細書に援用される）において考察されている。   Typically, a recombinant expression construct of the invention comprises one or more of the following: a heavy chain constant region of an anti-glucagon antibody; a heavy chain variable region; a light chain constant region; a light chain variable region; Nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising one or more CDRs of a chain are included. Typically, the vector is selected to be functional in the host cell used (ie, the vector is compatible with the host cell machinery and allows gene amplification and / or expression to occur). In some embodiments, a vector that uses a protein fragment complementation assay with a protein reporter such as dihydrofolate reductase is used (see, eg, US Pat. No. 6,270,964; this is incorporated herein by reference). Incorporated herein by reference). Suitable expression vectors can be purchased, for example, from Invitrogen Life Technologies or BD Biosciences (formerly “Clontech”). Other useful vectors for cloning and expressing antibodies and fragments of the invention include Bianchi and McGrew, Biotech Biotechnol Bioeng 84 (4): 439-44 (2003), which is incorporated herein by reference. The vectors reported in the above are included. Further suitable expression vectors are described, for example, in Methods Enzymol, vol. 185 (DV Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press, which is incorporated herein by reference.

通常、任意の宿主細胞において用いられる発現ベクターは、プラスミドもしくはウイルス維持のための配列ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。これらの配列は、集合的に「フランキング配列」と称され、通常、１つ以上の次の機能的に結合したヌクレオチド配列：プロモーター、１つもしくはそれ以上のエンハンサー配列、複製開始点、転写終止配列、ドナーおよびアクセプター・スプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域ならびに選択可能マーカー因子を含む。   Typically, the expression vector used in any host cell contains sequences for plasmid or virus maintenance and sequences for cloning and expression of foreign nucleotide sequences. These sequences are collectively referred to as “flanking sequences” and are usually one or more of the following functionally linked nucleotide sequences: promoter, one or more enhancer sequences, origin of replication, transcription termination Sequence, complete intron sequence including donor and acceptor splice sites, sequence encoding leader sequence for polypeptide secretion, ribosome binding site, polyadenylation sequence, polyline to insert nucleic acid encoding expressed polypeptide Contains the Kerr region as well as a selectable marker factor.

任意で、ベクターは、「タグ」コード配列、即ち、コード配列の５’または３’端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含み得、オリゴヌクレオチド配列はポリＨｉｓ（例えば、ヘキサＨｉｓ）またはこれに対して市販の抗体が存在する別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ））もしくはｍｙｃをコードする。通常、タグは発現と同時に抗体タンパク質に融合され、宿主細胞由来の抗体の親和性精製のための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、抗体を親和性マトリックスとしてのタグに対して用いて、カラムクロマトグラフィにより果たすことができる。任意で、タグは続いて種々の手段、例えば、切断のための特定のペプチダーゼを用いて、精製抗体ポリペプチドから除去することができる。   Optionally, the vector can include a “tag” coding sequence, ie, an oligonucleotide molecule located at the 5 ′ or 3 ′ end of the coding sequence, wherein the oligonucleotide sequence is polyHis (eg, hexa-His) or relative thereto. It encodes another “tag” in which a commercially available antibody is present, for example, FLAG®, HA (hemaglutinin from influenza virus) or myc. Usually, the tag is fused to the antibody protein simultaneously with expression and can serve as a means for affinity purification of the antibody from the host cell. Affinity purification can be accomplished, for example, by column chromatography using antibodies against the tag as an affinity matrix. Optionally, the tag can subsequently be removed from the purified antibody polypeptide using a variety of means, such as specific peptidases for cleavage.

発現ベクターにおけるフランキング配列は、同種（即ち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）、異種（即ち、宿主細胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（即ち、２つ以上の供給源由来のフランキング配列の組合せ）、合成または天然でよい。そのようなものとして、フランキング配列の供給源は任意の原核または真核生物、任意の脊椎または無脊椎生物あるいは任意の植物であってよく、但し、フランキング配列は宿主細胞機構において機能的であり、宿主細胞機構により活性化され得る。   The flanking sequences in the expression vector can be homologous (ie from the same species and / or strain as the host cell), heterologous (ie from a species other than the host cell species or strain), hybrid (ie from two or more sources). A combination of flanking sequences), synthetic or natural. As such, the source of the flanking sequence may be any prokaryotic or eukaryotic organism, any vertebrate or invertebrate organism or any plant, provided that the flanking sequence is functional in host cell machinery. Yes, it can be activated by host cell machinery.

本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該分野で周知の複数の方法の任意の方法により得られ得る。典型的には、本発明において有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によってこれまでに同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離することができる。場合により、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列が公知であり得る。本発明では、フランキング配列は、本明細書で述べられる、核酸合成またはクローニングのための方法を用いて合成され得る。   The flanking sequences useful in the vectors of the present invention can be obtained by any of a number of methods well known in the art. Typically, flanking sequences useful in the present invention have been previously identified by mapping and / or restriction endonuclease digestion and are therefore isolated from appropriate tissue sources using appropriate restriction endonucleases. be able to. In some cases, the complete nucleotide sequence of the flanking sequence may be known. In the present invention, flanking sequences can be synthesized using the methods for nucleic acid synthesis or cloning described herein.

すべてまたは一部分のみのフランキング配列が公知である場合、それは、ＰＣＲを用いて、かつ／あるいは同種または別種由来の好適なオリゴヌクレオチドおよび／またはフランキング配列断片を含むゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、得られ得る。フランキング配列が公知でない場合、フランキング配列を含むＤＮＡ断片が、例えば、コード配列または更には別の遺伝子もしくは遺伝子群を含み得る、より大きなＤＮＡ片から単離され得る。単離は制限エンドヌクレアーゼ消化によって達成され得、適切なＤＮＡ断片を生成し、次に、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ社、カリフォルニア州）または当業者には公知の他の方法を用いて単離する。この目的を果たすための好適な酵素の選択は、当業者には簡単に明らかとなるであろう。   If all or only a portion of the flanking sequence is known, it can be done using PCR and / or by screening a genomic library containing suitable oligonucleotides and / or flanking sequence fragments from the same or different species. Can be obtained. If the flanking sequence is not known, a DNA fragment containing the flanking sequence can be isolated from a larger piece of DNA that can include, for example, a coding sequence or even another gene or group of genes. Isolation can be accomplished by restriction endonuclease digestion to generate appropriate DNA fragments, followed by agarose gel purification, Qiagen® column chromatography (Chatsworth, Calif.) Or other known to those skilled in the art Isolate using method. The selection of a suitable enzyme to serve this purpose will be readily apparent to those skilled in the art.

通常、複製開始点は、特に、市販購入される原核細胞発現ベクターの一部であり、該開始点は宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。選択ベクターが複製開始点部位を含まない場合、複製開始点部位は公知の配列に基づいて化学的に合成され、ベクターにライゲーションされ得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）由来の複製開始点は大部分のグラム陰性菌に好適であり、種々の開始点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）が哺乳動物細胞においてベクターをクローニングするのに有用である。一般的に、哺乳動物の複製開始点は哺乳動物細胞発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０開始点は単に初期プロモーターを含むという理由から使用されることが多い）。   Usually, the origin of replication is in particular part of a commercially available prokaryotic expression vector, which is useful for the amplification of the vector in the host cell. If the selection vector does not contain an origin of replication site, the origin of replication site can be chemically synthesized based on a known sequence and ligated to the vector. For example, the origin of replication from plasmid pBR322 (New England Biolabs, Beverly, Mass.) Is suitable for most gram-negative bacteria, and various origins (eg, SV40, polyoma, adenovirus, vesicular stomatitis virus ( VSV) or papillomaviruses such as HPV or BPV) are useful for cloning vectors in mammalian cells. In general, a mammalian origin of replication is not required for mammalian cell expression vectors (eg, the SV40 origin is often used simply because it contains the early promoter).

通常、本発明の発現およびクローニングベクターは、宿主生物により認識されるとともに、抗グルカゴン抗体をコードする核酸に機能的に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（即ち、５’）に位置する非転写配列である。従来、プロモーターは２クラス：誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの一方に分類されている。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば、栄養素の有無または温度変化に応答してその制御下でＤＮＡからの転写のレベルの上昇を開始する。一方、構成的プロモーターは連続的遺伝子産物の産生を開始する；即ち、遺伝子発現に対する試験的制御はほとんどまたは全くない。種々の潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。好適なプロモーターは、制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、あるいはポリメラーゼ連鎖反応によりプロモーターを増幅し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することにより、抗グルカゴン抗体をコードするＤＮＡに機能的に結合される。   In general, the expression and cloning vectors of the present invention contain a promoter that is recognized by the host organism and operably linked to a nucleic acid encoding an anti-glucagon antibody. A promoter is a non-transcribed sequence located upstream (ie, 5 ') of the start codon of a structural gene (generally within about 100-1000 bp) that controls transcription of the structural gene. Traditionally, promoters are classified into one of two classes: inducible promoters and constitutive promoters. Inducible promoters initiate an increase in the level of transcription from DNA under their control in response to some change in culture conditions, such as the presence or absence of nutrients or a change in temperature. On the other hand, a constitutive promoter initiates production of a continuous gene product; that is, there is little or no experimental control over gene expression. Many promoters that are recognized by a variety of potential host cells are well known. Suitable promoters are functional for DNA encoding anti-glucagon antibodies by removing the promoter from source DNA by restriction enzyme digestion or amplifying the promoter by polymerase chain reaction and inserting the desired promoter sequence into the vector. Combined with

酵母宿主で用いるのに好適なプロモーターも当該分野で周知である。酵母プロモーターには酵母エンハンサーが有利に用いられる。哺乳動物細胞で用いる好適なプロモーターは周知であり、限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）を含む。他の好適な哺乳動物プロモーターは、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターを含む。   Suitable promoters for use with yeast hosts are also well known in the art. A yeast enhancer is advantageously used as the yeast promoter. Suitable promoters for use in mammalian cells are well known and include, but are not limited to, polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (eg, adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, Hepatitis B virus and most preferably simian virus 40 (SV40). Other suitable mammalian promoters include heterologous mammalian promoters, such as heat shock promoters and actin promoters.

本発明の組換え発現ベクターの実施に有用な特定のプロモーターは、限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核細胞発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）を含む。更に使用可能なものは、組織特異性を示すとともにトランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性を示すエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性を示すインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２）；精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞において活性を示すマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）；肝臓において活性を示すアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性を示すαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓において活性を示すα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄細胞において活性を示すβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳内オリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）；視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８）；ならびに、特に、リンパ球細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）である。   Specific promoters useful in the practice of the recombinant expression vectors of the invention include, but are not limited to, the SV40 early promoter region (Bernist and Chamber, 1981, Nature 290: 304-10); the CMV promoter; the Rous sarcoma virus 3 'long Promoters contained in terminal repeats (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-97); herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1444-45) A regulatory sequence of the metallothionine gene (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); a prokaryotic expression vector such as a β-lactamase promoter (Villa-Kamarov) 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-31); or tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21). -25). Further usable are the following animal transcriptional control regions that exhibit tissue specificity and are utilized in transgenic animals: the elastase I gene control region that is active in pancreatic acinar cells (Swift et al., 1984, Cell 38). Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); Insulin gene regulatory region showing activity in pancreatic β cells (Hanahan) , 1985, Nature 315: 115-22); mouse mammary tumor virus regulatory region active in testis, breast, lymphocytes and mast cells (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-95). ); An albumin gene regulatory region active in the liver (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-76); an alpha fetoprotein gene regulatory region active in the liver (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); α1-antitrypsin gene regulatory region active in the liver (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-71); bone marrow cells Β-globin gene regulatory region (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); active in brain oligodendrocyte cells Active myelin basic protein gene regulatory region (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-12); myosin light chain-2 gene regulatory region active in skeletal muscle (Sani, 1985, Nature 314: 283-86); thalamus Gonadotropin-releasing hormone gene regulatory region active in the lower part (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-78); and in particular, the immunoglobulin gene regulatory region active in lymphocyte cells (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647). -58; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7: 1436-44).

エンハンサー配列はベクターに挿入され、高等真核細胞において抗グルカゴン抗体をコードする核酸の転写を増大させ得る。エンハンサーは、通常、約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性因子であり、プロモーターに作用して転写を増大させる。エンハンサーは比較的に配向および位置独立性である。エンハンサーは転写単位の５’および３’側に見出されている。哺乳動物遺伝子から得られる複数のエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）。ウイルス由来のエンハンサー配列も用いることができる。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが、真核細胞プロモーターの活性のための典型的なエンハンサー因子である。エンハンサーは核酸分子の５’または３’位置にてベクター中にスプライシングされ得るが、通常、プロモーターの５’部位に配置される。   An enhancer sequence can be inserted into the vector to increase transcription of the nucleic acid encoding the anti-glucagon antibody in higher eukaryotic cells. An enhancer is usually a cis-acting factor of DNA having a length of about 10 to 300 bp, and acts on a promoter to increase transcription. Enhancers are relatively orientation and position independent. Enhancers are found on the 5 'and 3' sides of transcription units. A number of enhancer sequences are known (eg, globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin) derived from mammalian genes. Virus-derived enhancer sequences can also be used. The SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer, polyoma enhancer and adenovirus enhancer are typical enhancer elements for eukaryotic promoter activity. Enhancers can be spliced into the vector at the 5 'or 3' position of the nucleic acid molecule, but are usually located at the 5 'site of the promoter.

発現ベクターにおいて、通常、転写終止配列はポリペプチドコード領域端の３’に配置され、転写を終止する機能を果たす。通常、原核細胞における発現のために用いられる転写終止配列はＧ−Ｃに富む断片、続いてのポリＴ配列である。配列はライブラリーから容易にクローニングされ、あるいは更にはベクターの一部として市販購入されるが、本明細書で述べるような核酸合成法を用いて容易に合成することもできる。   In expression vectors, the transcription termination sequence is usually located 3 'to the end of the polypeptide coding region and functions to terminate transcription. Usually, the transcription termination sequence used for expression in prokaryotic cells is a GC rich fragment followed by a poly T sequence. Sequences are easily cloned from libraries or even commercially purchased as part of vectors, but can also be readily synthesized using nucleic acid synthesis methods such as those described herein.

選択可能マーカー遺伝子因子は、選択培養媒体中で増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。発現ベクターにおいて用いられる典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞に対して抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシンに対する耐性を付与し、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補い、あるいは（ｃ）複合媒体から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択可能マーカーの例には、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子が含まれる。原核宿主細胞および真核宿主細胞における選択に細菌のネオマイシン耐性遺伝子を用いることもできる。   The selectable marker gene factor encodes a protein necessary for the survival and growth of host cells grown in a selective culture medium. Typical selectable marker genes used in expression vectors include (a) confer resistance to prokaryotic host cells against antibiotics or other toxins such as ampicillin, tetracycline or kanamycin, and (b) auxotrophy of the cells It encodes a protein that compensates for the defect or (c) supplies important nutrients that cannot be obtained from the complex medium. Examples of selectable markers include kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene and tetracycline resistance gene. Bacterial neomycin resistance genes can also be used for selection in prokaryotic and eukaryotic host cells.

他の選択遺伝子は発現される遺伝子を増幅するのに用いることができる。増幅は、特定の選択条件下で細胞の生存および増殖を可能にするのに十分に高いレベルにて単一コピーで発現することができない遺伝子が、歴代の組換え細胞の染色体内にタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な増幅可能な選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモーターを含まないチミジンキナーゼが含まれる。これらのマーカーの使用では、哺乳動物細胞形質転換体は選択圧下に置かれ、ベクターに存在する選択遺伝子により、形質転換体のみが特異的に生存に適応する。媒体中の選択因子の濃度が連続的に高められる条件下で形質転換細胞を培養することにより、選択圧が課され、これにより、選択遺伝子が増幅された細胞のみの生存が可能となる。これらの状況下、選択遺伝子に隣接するＤＮＡ、例えば、本発明の抗体をコードするＤＮＡは、選択遺伝子と共増幅される。その結果、増量した抗グルカゴンポリペプチドが増幅ＤＮＡから合成される。   Other selection genes can be used to amplify the expressed gene. Amplification repeats a gene that cannot be expressed in a single copy at a high enough level to allow cell survival and proliferation under specific selection conditions in tandem within the chromosomes of successive recombinant cells. Process. Examples of amplifiable selectable markers suitable for mammalian cells include dihydrofolate reductase (DHFR) and promoter-free thymidine kinase. In the use of these markers, mammalian cell transformants are placed under selective pressure, and only the transformants are specifically adapted for survival due to the selection gene present in the vector. By culturing the transformed cells under conditions where the concentration of the selection factor in the medium is continuously increased, a selection pressure is imposed, thereby allowing only the cells in which the selection gene is amplified to survive. Under these circumstances, DNA adjacent to the selection gene, eg, DNA encoding the antibody of the present invention, is co-amplified with the selection gene. As a result, increased amounts of anti-glucagon polypeptide are synthesized from the amplified DNA.

通常、リボソーム結合部位は、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガルノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）を特徴とする。通常、因子はプロモーターの３’および発現されるポリペプチドのコード配列の５’に位置する。   Usually, the ribosome binding site is required for mRNA translation initiation and is characterized by a Shine-Dalgarno sequence (prokaryotes) or a Kozak sequence (eukaryotes). Usually, the factor is located 3 'of the promoter and 5' of the coding sequence of the expressed polypeptide.

場合により、例えば、真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される場合、グリコシル化または収率を向上させるため、種々のプレ配列を操作することができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更することができ、あるいはプロ配列を付加することができ、これもグリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）１位に、発現に伴う１つ以上の完全には除去されていない場合がある付加アミノ酸を有し得る。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される、１または２個のアミノ酸残基を有し得る。あるいは、一部の酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域にて切断する場合、わずかに切頭されているが活性形態の所望のポリペプチドを生じさせ得る。   In some cases, for example, where glycosylation is desired in a eukaryotic host cell expression system, various presequences can be engineered to improve glycosylation or yield. For example, the peptidase cleavage site of a particular signal peptide can be altered, or a prosequence can be added, which can also affect glycosylation. The final protein product may have one or more additional amino acids that may not be completely removed upon expression (relative to the first amino acid of the mature protein). For example, the final protein product may have one or two amino acid residues found at the peptidase cleavage site attached to the amino terminus. Alternatively, the use of some enzyme cleavage sites can result in the desired polypeptide in the active form, but being slightly truncated, if the enzyme cleaves at such a region within the mature polypeptide.

市販の発現ベクターが上述のような所望のフランキング配列の一部を欠く場合、これらの配列をベクターに個々にライゲーションすることにより、ベクターを改変することができる。ベクターが選択され、所望のように改変された後、抗グルカゴン抗体をコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入される。   If commercially available expression vectors lack some of the desired flanking sequences as described above, the vectors can be modified by individually ligating these sequences to the vector. After the vector is selected and modified as desired, a nucleic acid molecule encoding an anti-glucagon antibody is inserted into the appropriate site of the vector.

本発明の抗体またはその免疫学的に機能性の断片をコードする配列を含む完成ベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞に挿入される。抗グルカゴン−１抗体に対する発現ベクターの選択宿主細胞への形質転換は、周知の方法、例えば、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法または他の公知の技法を含む方法により達成され得る。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞型の関数である。これらの方法および他の好適な方法は当業者には周知である。   A complete vector containing a sequence encoding an antibody of the invention or an immunologically functional fragment thereof is inserted into a suitable host cell for amplification and / or polypeptide expression. Selection of an expression vector for anti-glucagon-1 antibody transformation into host cells can be accomplished by well-known methods such as transfection, infection, calcium chloride, electroporation, microinjection, lipofection, the DEAE-dextran method or other known methods. It can be achieved by methods including techniques. The method chosen is partly a function of the host cell type used. These methods and other suitable methods are well known to those skilled in the art.

形質転換宿主細胞は適切な条件下で培養されると、抗グルカゴン抗体を合成し、これは、続いて、培養媒体から（宿主細胞が抗体を媒体に分泌する場合）、あるいは抗体を産生する宿主細胞から直接（抗体が分泌されない場合）回収することができる。適切な宿主細胞の選択は様々な因子、例えば、所望の発現レベル、活性に望ましく、もしくは必要なポリペプチドの改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）および生物活性分子への折り畳みの容易性に依存する。   When transformed host cells are cultured under appropriate conditions, they synthesize anti-glucagon antibodies, which are subsequently derived from the culture medium (if the host cell secretes the antibody into the medium) or the host producing the antibody. It can be recovered directly from the cell (if the antibody is not secreted). The selection of the appropriate host cell depends on a variety of factors, such as the desired expression level, activity desired or required polypeptide modification (eg, glycosylation or phosphorylation) and ease of folding into a bioactive molecule. To do.

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、限定されないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得られる多くの不死化細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）および他の多くの細胞株を含む。特定の実施形態では、特定のＤＮＡ構築物を発現させるのに最適な細胞株は、種々の細胞株を試験し、いずれが最大レベルの発現を有するとともにグルカゴン結合特性を有する抗体を産生するのかを決定することにより、選択され得る。
ＶＩＩ．例示的な治療有用性
ＧＬＰ−１に関連する種々の活性に照らし（背景技術を参照）、本明細書で述べられるＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、一般的に、１）インスリン放出を刺激し、２）血中グルコース濃度を低下させ、３）血漿中インスリン濃度を上昇させ、４）β細胞特異的遺伝子（例えば、ＧＬＵＴ−１トランスポーター、インスリン受容体およびヘキソキナーゼ−１）の転写を刺激し、５）β細胞のアポトーシスを阻害し、β細胞の増殖および複製を増大させることによってβ細胞量を増加させ、６）満腹感を誘発し、これにより、食物摂取を低減し、減量を促進し、７）胃液分泌を低下させ、８）胃排出を遅延させ、かつ、９）胃運動を低下させるのに用いることができる。 Mammalian cell lines that can be used as hosts for expression are well known in the art and include, but are not limited to, many immortal cell lines obtained from the American Type Culture Collection (ATCC), such as Chinese hamster ovary (CHO). ) Cells, HeLa cells, baby hamster kidney (BHK) cells, monkey kidney cells (COS), human hepatocellular carcinoma cells (eg, Hep G2) and many other cell lines. In certain embodiments, the optimal cell line for expressing a particular DNA construct is tested on various cell lines to determine which have the highest level of expression and produce antibodies with glucagon binding properties. Can be selected.
VII. Exemplary therapeutic utilities In light of various activities associated with GLP-1 (see background), compositions comprising GLP-1 compounds described herein generally 1) stimulate insulin release 2) decrease blood glucose concentration, 3) increase plasma insulin concentration, 4) stimulate transcription of β-cell specific genes (eg, GLUT-1 transporter, insulin receptor and hexokinase-1) 5) inhibit β-cell apoptosis, increase β-cell mass by increasing β-cell proliferation and replication, 6) induce satiety, thereby reducing food intake and promoting weight loss 7) reduce gastric secretion, 8) delay gastric emptying, and 9) reduce gastric motility.

従って、ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、限定されないが、Ｉ型もしくはＩＩ型糖尿病、耐糖能障害、インスリン抵抗性、潜在性自己免疫性成人型糖尿病（ＬＡＤＡ）、妊娠性糖尿病、代謝症候群および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）を含む、多くの異なる形態の糖尿病あるいはこれに密接に関連する疾患を処置するのに用いることができる。従って、ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、感染、ストレス、脳卒中に起因するインスリン感受性の低下または妊娠中に誘発される感受性の低下を有する患者を処置するのに用いることができる。処置可能な他のタイプの糖尿病は、糖尿病が別の内分泌性疾患、例えば、グルカゴノーマ、原発性アルドステロン症、クッシング症候群およびソマトスタチノーマに関連している糖尿病あるいは特定の薬物またはホルモン（例えば、エストロゲン含有医薬品、向精神薬、抗高血圧薬およびサイアザイド系利尿薬）の投与に起因して生じる糖尿病である。   Thus, compositions comprising GLP-1 compounds include, but are not limited to type I or type II diabetes, impaired glucose tolerance, insulin resistance, latent autoimmune adult diabetes (LADA), gestational diabetes, metabolic syndrome and It can be used to treat many different forms of diabetes or closely related diseases, including juvenile onset adult diabetes (MODY). Thus, compositions comprising GLP-1 compounds can be used to treat patients with reduced insulin sensitivity due to infection, stress, stroke or reduced sensitivity induced during pregnancy. Other types of diabetes that can be treated include diabetes or other drugs or hormones (eg, containing estrogen) where diabetes is associated with another endocrine disorder, such as glucagonoma, primary aldosteronism, Cushing's syndrome and somatostatinoma Diabetes mellitus resulting from the administration of drugs, psychotropic drugs, antihypertensive drugs, and thiazide diuretics.

ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、例えば、高血圧、冠動脈疾患、脂質異常症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症および高コレステロール血症および心筋梗塞を含む、種々の冠疾患ならびに脂質障害に関連する疾患を処置するのにも用いることができる。   Compositions comprising GLP-1 compounds are associated with various coronary diseases and lipid disorders including, for example, hypertension, coronary artery disease, dyslipidemia, cardiovascular disease, atherosclerosis and hypercholesterolemia and myocardial infarction Can also be used to treat certain diseases.

骨障害、骨粗鬆症および他の関連疾患もＧＬＰ−１化合物を含む組成物で処置することができる。   Bone disorders, osteoporosis and other related diseases can also be treated with compositions comprising GLP-1 compounds.

ＧＬＰ−１化合物を含む組成物で処置することができる更なる疾患には、肥満症、過敏性腸症候群、脳卒中、術後代謝変化、心筋梗塞）および高血糖症が含まれる。ＧＬＰ−１化合物は鎮静剤としても用いることができる。   Additional diseases that can be treated with compositions comprising GLP-1 compounds include obesity, irritable bowel syndrome, stroke, postoperative metabolic changes, myocardial infarction) and hyperglycemia. GLP-1 compounds can also be used as sedatives.

ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は予防的に用いることもでき、上記一覧のような疾患を発症するリスクを有する個体の処置を含む。具体例として、化合物は、非インスリン依存性糖尿病のリスクまたは肥満症になるリスクを有する個体に予防的に投与することができる。このような個体には、例えば、耐糖能障害を有する個体、過体重個体および前述の疾患に対する遺伝的素因を有する個体（例えば、糖尿病の既往を有する家族の個体）が含まれる。   Compositions comprising GLP-1 compounds can also be used prophylactically and include treatment of individuals at risk of developing the diseases as listed above. As a specific example, the compounds can be administered prophylactically to individuals at risk of non-insulin dependent diabetes or becoming obese. Such individuals include, for example, individuals with impaired glucose tolerance, overweight individuals and individuals with a genetic predisposition to the aforementioned diseases (eg, family individuals with a history of diabetes).

ＧＬＰ−１化合物を含む組成物で様々な異なる被験体を処置することができる。本明細書で用いられるような「被験体」または「患者」という用語は、通常、哺乳動物を指し、必ずしもその必要はないが、多くの場合、前述の疾患の一疾患のリスクにあり、あるいはリスクを有するヒトである。しかし、被験体は非ヒト霊長動物（例えば、類人猿、サル、ゴリラ、チンパンジー）であってもよい。被験体は霊長動物以外の哺乳動物、例えば、獣医動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタ）または実験動物（例えば、マウスまたはラット）であってもよい。
ＶＩＩ．医薬組成物
Ａ．組成物
本明細書で提供されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、治療有用性に関するセクションで挙げられた疾患の処置用に処方された医薬組成物中の活性成分として用いることができる。従って、開示されるＧＬＰ−１／抗体組成物は、上記一覧の用途を含む、様々な治療用途に用いる薬物の調製に用いることができる。 A variety of different subjects can be treated with a composition comprising a GLP-1 compound. The term “subject” or “patient” as used herein generally refers to a mammal, which is not necessarily required, but is often at risk for one disease of the aforementioned diseases, or A human at risk. However, the subject may be a non-human primate (eg, an ape, monkey, gorilla, chimpanzee). The subject may be a mammal other than a primate, such as a veterinary animal (eg, horse, cow, sheep or pig) or a laboratory animal (eg, mouse or rat).
VII. Pharmaceutical Composition A. Compositions The GLP-1 compound / antibody compositions provided herein can be used as an active ingredient in a pharmaceutical composition formulated for the treatment of the diseases listed in the section on therapeutic utility. Accordingly, the disclosed GLP-1 / antibody compositions can be used in the preparation of drugs for use in a variety of therapeutic applications, including those listed above.

ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物に加え、医薬組成物は、ＧＬＰ−１化合物が有用性を有する１つ以上の種々の疾患を処置するのに有用な１つ以上の他の治療剤も含むことができる。特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物と組み合わせることができる他の治療剤の一般的なクラスは、限定されないが、インスリン放出剤、グルカゴン分泌阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グルカゴン拮抗薬、抗肥満剤、カロリー摂取量を減少させる化合物、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、ステロイドもしくは非ステロイドホルモン、増殖因子および食物栄養素を含む。   In addition to the GLP-1 compound / antibody composition, the pharmaceutical composition also includes one or more other therapeutic agents useful for treating one or more various diseases for which the GLP-1 compound has utility. Can do. General classes of other therapeutic agents that can be combined with a particular GLP-1 compound / antibody composition include, but are not limited to, insulin release agents, glucagon secretion inhibitors, protease inhibitors, glucagon antagonists, anti-obesity agents , Compounds that reduce caloric intake, selective estrogen receptor modulators, steroidal or non-steroidal hormones, growth factors and dietary nutrients.

このようなさらなる治療剤は、例えば、高血糖症、糖尿病、高血圧、肥満症および骨障害を処置するための治療剤を含み得る。組成物中に含まれ得る、糖尿病を処置するための他の治療剤の例には、脂質障害を処置するのに用いられる治療剤が含まれる。このような治療剤の具体例には、限定されないが、胆汁酸金属イオン封鎖剤（例えば、コレスチラミン、リポスタビル、テトラヒドロリプスタチン）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、米国特許第４，３４６，２２７号；同第５，３５４，７７２号；同第５，１７７，０８０号；同第５，３８５，９２９号；および同第５，７５３，６７５号を参照）、ニコチン酸、ＭＴＰ阻害剤（例えば、米国特許第５，５９５，８７２号；同第５，７６０，２４６号；同第５，８８５，９８３号；および同第５，９６２，４４０号を参照）、リポキシゲナーゼ阻害剤、フィブリン酸誘導体、コレステロール吸収阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤（例えば、米国特許第４，８７１，７２１号；同第５，７１２，３９６号；および同第４，９２４，０２４号を参照）および回腸ナトリウム／胆汁酸共輸送体阻害剤が含まれる。組成物中に組み込むことができる他の抗糖尿病剤には、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ビグナイド、インスリン分泌促進剤、インスリン増感剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ＰＰＡＲ−α作動薬、ＰＰＡＲ−γ作動薬が含まれる。   Such additional therapeutic agents can include, for example, therapeutic agents for treating hyperglycemia, diabetes, hypertension, obesity and bone disorders. Examples of other therapeutic agents for treating diabetes that may be included in the composition include therapeutic agents used to treat lipid disorders. Specific examples of such therapeutic agents include, but are not limited to, bile acid sequestering agents (eg, cholestyramine, lipostavir, tetrahydrolipstatin), HMG-CoA reductase inhibitors (eg, US Pat. No. 4,346). No. 5,354,772; No. 5,177,080; No. 5,385,929; and No. 5,753,675), nicotinic acid, MTP inhibitors (See, eg, US Pat. Nos. 5,595,872; 5,760,246; 5,885,983; and 5,962,440), lipoxygenase inhibitors, fibric acid Derivatives, cholesterol absorption inhibitors, squalene synthase inhibitors (eg, US Pat. Nos. 4,871,721; 5,712,396; and 4,924, See No. 24) and include ileal sodium / bile acid cotransporter inhibitor. Other anti-diabetic agents that can be incorporated into the composition include meglitinide, thiazolidinedione, bignide, insulin secretagogue, insulin sensitizer, glycogen phosphorylase inhibitor, PPAR-α agonist, PPAR-γ agonist. included.

ＧＬＰ−１類似体のＮ末端での切断を阻害するため、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害剤も含まれ得る。   Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV activity may also be included to inhibit cleavage at the N-terminus of GLP-1 analogs.

一部の実施形態では、医薬組成物は、医薬的に許容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤と共に、１つまたは複数の有効量のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む。許容可能な処方材料は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。好ましい実施形態では、治療有効量のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む医薬組成物が提供される。   In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises one or more effective amounts of GLP-1 compounds together with pharmaceutically acceptable diluents, carriers, solubilizers, emulsifiers, preservatives and / or adjuvants. / Include antibody composition. Acceptable formulation materials are preferably non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed. In a preferred embodiment, a pharmaceutical composition is provided comprising a therapeutically effective amount of a GLP-1 compound / antibody composition.

特定の実施形態では、許容可能な処方材料は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。   In certain embodiments, acceptable formulation materials are preferably non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed.

特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘性、清澄性、色調、等張性、臭気性、無菌性、安定性、溶出または放出速度、吸着または侵入を改変し、維持し、あるいは保つための処方材料を含み得る。このような実施形態では、好適な処方材料は、限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗菌薬；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、芳香剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；張度増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール ソルビトール）；送達ビヒクル；希釈液；賦形剤ならびに／あるいは医薬補助剤を含む。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。 In certain embodiments, the pharmaceutical composition exhibits, for example, the pH, osmolality, viscosity, clarity, color, isotonicity, odor, sterility, stability, elution or release rate, adsorption or invasion of the composition. Formulation materials may be included to modify, maintain, or maintain. In such embodiments, suitable formulation materials include, but are not limited to, amino acids (eg, glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); antibacterial agents; antioxidants (eg, ascorbic acid, sodium sulfite or sodium bisulfite) ); Buffers (eg, borate, bicarbonate, Tris-HCl, citrate, phosphate or other organic acids); bulking agents (eg, mannitol or glycine); chelating agents (eg, ethylenediamine) Tetraacetic acid (EDTA)); complexing agents (eg caffeine, polyvinylpyrrolidone, β-cyclodextrin or hydroxypropyl-β-cyclodextrin); fillers; monosaccharides; disaccharides; and other carbohydrates (eg glucose Mannose or dextrin); protein (eg blood Clearing albumin, gelatin or immunoglobulin); colorants, fragrances and diluents; emulsifiers; hydrophilic polymers (eg polyvinylpyrrolidone); low molecular weight polypeptides; salt-forming counterions (eg sodium); preservatives (eg Benzalkonium chloride, benzoic acid, salicylic acid, thimerosal, phenethyl alcohol, methyl paraben, propyl paraben, chlorhexidine, sorbic acid or hydrogen peroxide); solvent (eg glycerin, propylene glycol or polyethylene glycol); sugar alcohol (eg mannitol or Sorbitol); suspending agents; surfactants or wetting agents (eg, Pluronics, PEG, sorbitan esters, polysorbate 20, polysorbate 80, polysorbates, tritons, trome (Min, lecithin, cholesterol, tyloxapal); stability enhancer (eg sucrose or sorbitol); tonicity enhancer (eg alkali metal halide, preferably sodium chloride or potassium chloride, mannitol sorbitol); delivery vehicle; dilution Liquid; containing excipients and / or pharmaceutical adjuvants. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 th Edition , (A.R.Gennaro, ed.), See 1990, Mack Publishing Company.

特定の実施形態では、至適医薬組成物は、例えば、対象投与経路、送達様式および所望の用量に依って、当業者により決定される。例えば、上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照されたい。特定の実施形態では、このような組成物は、抗体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度およびインビボでのクリアランス率に影響を及ぼし得る。   In certain embodiments, the optimal pharmaceutical composition will be determined by one skilled in the art depending upon, for example, the subject route of administration, delivery mode and desired dosage. See, for example, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES above. In certain embodiments, such compositions can affect the physical state, stability, in vivo release rate and clearance rate in vivo of the antibody.

特定の実施形態では、医薬組成物における主要なビヒクルまたは担体は本来水性であっても非水性であってもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、おそらく、非経口投与用の組成物において一般的な他の材料を補充された注射用の水、生理食塩水または人工脳脊髄液でよい。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水は、更なる例示的なビヒクルである。好ましい実施形態では、医薬組成物はｐＨ約７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、更に、ソルビトールまたはその好適な代替物を含み得る。特定の実施形態では、抗グルカゴン抗体組成物は、所望の純度を有する選択組成物を任意の処方材料（上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することにより、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態での保存用に調製され得る。更に、特定の実施形態では、ＧＬＰ−１／抗体組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方され得る。   In certain embodiments, the primary vehicle or carrier in the pharmaceutical composition may be aqueous in nature or non-aqueous. For example, a suitable vehicle or carrier is probably water for injection, saline or artificial cerebrospinal fluid supplemented with other materials common in compositions for parenteral administration. Neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin is a further exemplary vehicle. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition comprises a Tris buffer having a pH of about 7.0 to 8.5 or an acetate buffer having a pH of about 4.0 to 5.5, and further comprises sorbitol or a suitable alternative thereof. obtain. In certain embodiments, the anti-glucagon antibody composition can be stored in the form of a lyophilized cake or an aqueous solution by mixing the selected composition having the desired purity with any formulation material (REMINGTON'S PHARAMEUTICAL SCIENCES above). Can be prepared for. Further, in certain embodiments, the GLP-1 / antibody composition can be formulated as a lyophilizate using appropriate excipients such as sucrose.

医薬組成物は非経口送達用に選択することができる。あるいは、組成物は吸入または消化管を通じた送達、例えば、経口用に選択され得る。このような医薬的に許容可能な組成物の調製は当該分野の範囲内にある。   The pharmaceutical composition can be selected for parenteral delivery. Alternatively, the composition can be selected for inhalation or delivery through the gastrointestinal tract, eg, oral. The preparation of such pharmaceutically acceptable compositions is within the skill of the art.

処方成分は投与部位に対して許容可能な濃度にて存在することが好ましい。特定の実施形態では、生理的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、通常、約５〜約８の範囲のｐＨに組成物を維持するのに緩衝剤が用いられる。   The formulation components are preferably present in concentrations that are acceptable to the site of administration. In certain embodiments, a buffering agent is used to maintain the composition at a physiological or slightly lower pH, usually in the range of about 5 to about 8.

非経口投与が検討される場合、本発明において用いる治療用組成物は、医薬的に許容可能なビヒクル中のＧＬＰ−１化合物を含む所望の組成物を含む、発熱物質非含有の非経口的に許容可能な水溶液の形態にて提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、ＧＬＰ−１／抗体組成物が適切に保存された無菌等張液として処方される無菌蒸留水である。特定の実施形態では、調製は、デポー注射により送達可能な生成物の制御または持続放出を与えうる、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの薬物を含む所望の分子の処方を含み得る。特定の実施形態では、循環における持続時間を促進する作用を有するヒアルロン酸も用いられ得る。特定の実施形態では、所望のＧＬＰ−１／抗体組成物を導入するのに、埋め込み型薬物送達デバイスが用いられ得る。   When parenteral administration is contemplated, the therapeutic composition used in the present invention is a pyrogen-free parenterally, including the desired composition comprising the GLP-1 compound in a pharmaceutically acceptable vehicle. It can be provided in the form of an acceptable aqueous solution. A particularly suitable vehicle for parenteral injection is sterile distilled water formulated as a sterile isotonic solution in which the GLP-1 / antibody composition is suitably stored. In certain embodiments, the preparation is injectable microspheres, biodegradable particles, polymeric compounds (eg, polylactic acid or polyglycolic acid that can provide controlled or sustained release of the product deliverable by depot injection. ), May contain a formulation of the desired molecule comprising a drug such as beads or liposomes. In certain embodiments, hyaluronic acid that has the effect of promoting duration in the circulation may also be used. In certain embodiments, an implantable drug delivery device can be used to introduce the desired GLP-1 / antibody composition.

医薬組成物は吸入用に処方することができる。これらの実施形態では、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む医薬組成物は、吸入可能な乾燥粉末として有利に処方される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、エアロゾル送達用の噴射剤を用いても処方され得る。特定の実施形態では、溶液は噴霧状にされ得る。肺投与、従って、処方法が更に国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に述べられており、これは、参考として援用され、化学修飾されたタンパク質の肺送達について述べている。   The pharmaceutical composition can be formulated for inhalation. In these embodiments, the pharmaceutical composition comprising the GLP-1 compound / antibody composition is advantageously formulated as an inhalable dry powder. In preferred embodiments, the pharmaceutical composition may also be formulated with a propellant for aerosol delivery. In certain embodiments, the solution can be nebulized. Pulmonary administration and, therefore, processing methods are further described in International Patent Application No. PCT / US94 / 001875, which is incorporated by reference and describes pulmonary delivery of chemically modified proteins.

処方物を経口投与することができることも検討される。この様式で投与されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む医薬組成物は、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の調合に習慣的に用いられる担体の有無にかかわらず処方することができる。特定の実施形態では、バイオアベイラビリティが最大化され、全身移行前の分解が最小化される際に、消化管におけるポイントに処方物の活性部分を放出するようにカプセルが設計され得る。組成物の吸収を促進するため、追加の作用物質が含まれ得る。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤も用いられ得る。   It is also contemplated that the formulation can be administered orally. Pharmaceutical compositions comprising GLP-1 compound / antibody compositions administered in this manner can be formulated with or without carriers customarily used in the preparation of solid dosage forms such as tablets and capsules. In certain embodiments, capsules can be designed to release the active portion of the formulation to a point in the gastrointestinal tract when bioavailability is maximized and degradation prior to systemic transition is minimized. Additional agents can be included to facilitate absorption of the composition. Diluents, flavorings, low melting point waxes, vegetable oils, lubricants, suspending agents, tablet disintegrating agents, and binders may also be used.

医薬組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物中の１つまたは複数の有効量のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含むように提供されることが好ましい。錠剤を無菌水または別の適切なビヒクルに溶解することにより、単位剤形にて溶液が調製され得る。好適な賦形剤には、限定されないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸塩、ラクトースまたはリン酸カルシウム；あるいは結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム；あるいは潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが含まれる。   The pharmaceutical composition is preferably provided to contain one or more effective amounts of GLP-1 compound / antibody composition in a mixture with non-toxic excipients suitable for the manufacture of tablets. Solutions can be prepared in dosage unit form by dissolving the tablet in sterile water or another appropriate vehicle. Suitable excipients include, but are not limited to, inert diluents such as calcium carbonate, sodium carbonate or bicarbonate, lactose or calcium phosphate; or binders such as starch, gelatin or gum arabic; or lubricants, For example, magnesium stearate, stearic acid or talc is included.

持続または制御送達処方物中のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む処方物を含む、更なる医薬組成物が当業者には明らかであろう。他の種々の持続または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射を処方する技法も当業者には公知である。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい；これは、参考として援用され、医薬組成物の送達のための多孔性高分子微粒子の制御放出について述べている。持続放出型調製物は、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル形状の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出型マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第０５８４８１号に開示されているように；これらの各々は参考として援用される）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（上記Ｌａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号）を含み得る。持続放出型組成物は、当該分野で公知の複数の方法の任意の方法により調製可能なリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号；同第０８８，０４６号および第１４３，９４９号（参考として援用される）を参照されたい。   Additional pharmaceutical compositions will be apparent to those skilled in the art, including formulations comprising GLP-1 compound / antibody compositions in sustained or controlled delivery formulations. Techniques for formulating various other sustained or controlled delivery means such as liposome carriers, biodegradable microparticles or porous beads and accumulating injections are also known to those skilled in the art. See, for example, International Patent Application No. PCT / US93 / 00829; which is incorporated by reference and describes controlled release of porous polymeric microparticles for delivery of pharmaceutical compositions. Sustained release preparations may include molded articles, for example, semipermeable polymer matrices in the form of films or microcapsules. Sustained release matrices include polyesters, hydrogels, polylactides (as disclosed in US Pat. No. 3,773,919 and European Patent Application No. 058881, each of which is incorporated by reference), L- Copolymers of glutamic acid and γ ethyl-L-glutamate (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-556), poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), ethylene vinyl acetate (Langer et al. Above) or poly-D (-)-3-hydroxybutyric acid (European Patent Publication No. 133,988). Can be included. Sustained release compositions can also include liposomes that can be prepared by any of a number of methods known in the art. See, eg, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692; European Patent Publication Nos. 036,676; 088,046 and 143,949 (incorporated by reference).

通常、インビボ投与に用いられる医薬組成物は無菌調製物として提供される。滅菌は無菌濾過膜を通した濾過により成すことができる。組成物が凍結乾燥される際、この方法を用いた滅菌は凍結乾燥および復元の前後に行われ得る。非経口投与用の医薬組成物は凍結乾燥形態にて、あるいは溶液中に保存することができる。一般的に、非経口用組成物は、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって突き通すことが可能なストッパーを有する静注液バッグまたはバイアル内に入れられる。   Usually, pharmaceutical compositions used for in vivo administration are provided as sterile preparations. Sterilization can be accomplished by filtration through a sterile filtration membrane. When the composition is lyophilized, sterilization using this method can be performed before or after lyophilization and reconstitution. Pharmaceutical compositions for parenteral administration can be stored in lyophilized form or in solution. Generally, parenteral compositions are placed in a container having a sterile access port, for example, an intravenous bag or vial having a stopper that can be pierced by a hypodermic needle.

該医薬組成物が処方されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、結晶、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に保存され得る。このような処方物は即座に使用可能な形態または投与前に再構成される形態にて保存され得る。   Once the pharmaceutical composition is formulated, it can be stored in sterile vials as a solution, suspension, gel, emulsion, solid, crystal, or dehydrated or lyophilized powder. Such formulations can be stored either in a ready-to-use form or in a reconstituted form prior to administration.

単回投与単位を作製するためのキットも提供される。キットは各々、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性処方物を有する第２の容器を含む。本発明の特定の実施形態では、事前に充填されたシングルおよびマルチチャンバーシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
Ｂ．用量
上述のように、医薬組成物は予防的および／または治療的処置のために投与することができる。一般的に、「有効量」は、症状の重症度および／または頻度の低下または排除ならびに／あるいは損傷の改善または修復である、所望の効果を果たすのに十分であるが非毒性の活性成分（例えば、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物）の量である量を指す。「治療有効量」は、病態または症状を改善し、あるいは疾患または他の任意の望ましくない症状の進行を予防し、阻止し、遅延させ、または逆行させるのに十分である量を指す。「予防有効量」は、病態または症状の開始を予防し、阻止し、または遅延させるのに有効である量を指す。 Kits for making single dose units are also provided. Each kit includes a first container having a dry protein and a second container having an aqueous formulation. In certain embodiments of the invention, kits are provided that include pre-filled single and multi-chamber syringes (eg, liquid syringes and dispersion syringes).
B. Dosage As noted above, the pharmaceutical compositions can be administered for prophylactic and / or therapeutic treatments. In general, an “effective amount” is an active ingredient that is sufficient but non-toxic to achieve the desired effect, which is the reduction or elimination of the severity and / or frequency of symptoms and / or the improvement or repair of damage ( For example, an amount that is the amount of GLP-1 compound / antibody composition). A “therapeutically effective amount” refers to an amount that is sufficient to ameliorate a condition or symptom or prevent, prevent, delay, or reverse the progression of a disease or any other undesirable symptom. A “prophylactically effective amount” refers to an amount that is effective to prevent, prevent or delay the onset of a disease state or condition.

一般に、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の毒性および治療有効性は、細胞培養および／または実験動物における標準的な医薬的手順によって決定することができ、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な投与量）を求めることを含む。毒性作用と治療効果との投与量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が望ましい。 In general, the toxicity and therapeutic efficacy of GLP-1 compound / antibody compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures and / or laboratory animals, eg, LD 50 (for 50% of the population Deterministic doses) and ED 50 (therapeutically effective dose in 50% of the population). The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio LD 50 / ED 50. Compositions that exhibit high therapeutic indices are desirable.

細胞培養および／または動物試験から得られるデータは、ヒトに対する一連の用量を調剤するのに用いることができる。通常、活性成分の用量は、ほとんどあるいは全く毒性がないＥＤ５０を含む一連の循環濃度範囲内に並ぶ。使用剤形および使用投与経路に依存し、用量はこの範囲内で変動し得る。 Data obtained from cell culture and / or animal studies can be used to formulate a series of doses for humans. Usually, the dose of active ingredient falls within a range of circulating concentration ranges including ED 50 with little or no toxicity. Depending on the dosage form used and the route of administration, the dose may vary within this range.

活性成分の投与量は、担当臨床医によって評価することができる様々な因子、例えば、疾患の重症度、処置被験体の年齢およびサイズならびに個々の疾患自体に依存する。しかし、一般的には、投与されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物自体の総量は、通常、１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。他の処置レジメンでは、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は５０μｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日または１００μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日にて投与される。   The dosage of the active ingredient depends on various factors that can be assessed by the attending clinician, such as the severity of the disease, the age and size of the subject to be treated and the individual disease itself. In general, however, the total amount of GLP-1 compound / antibody composition itself administered is usually in the range of 1 μg / kg body weight / day to 100 mg / kg / day. In other treatment regimens, the GLP-1 compound / antibody composition is administered at 50 μg / kg / day to 5 mg / kg / day or 100 μg / kg / day to 1 mg / kg / day.

投与頻度は使用処方物中の個々の組成物の薬物動態パラメータに依存する。通常、臨床医は投与量が所望の効果に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、単回投与として、あるいは経時的に２または３回投与として（同量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい）、あるいは埋め込みデバイスまたはカテーテルによる継続注入として投与され得る。適切な投与量の更なる改善は、当業者により日常的になされ、当業者により日常的に実行される職務の範囲内にある。適切な用量は適切な用量応答データを用いることにより確認され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は長期間にわたって患者に投与することができる。組成物中の抗体の長期投与は、非ヒト動物におけるヒト抗原に対する抗体、例えば、非ヒト動物種において作製される非完全ヒト抗体または非ヒト抗体と一般的に関連する有害な免疫またはアレルギー応答を最小化する。
Ｃ．投与
本明細書で述べられる医薬組成物は種々の異なる方法で投与することができる。例として、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、経皮、髄腔内および頭蓋内投与法により、医薬的に許容可能な担体を含む組成物を投与することが含まれる。 The frequency of administration will depend on the pharmacokinetic parameters of the individual compositions in the formulation used. Usually, the clinician administers the composition until the dosage reaches the desired effect. Thus, the composition may be administered as a single dose, or as two or three doses over time (which may or may not contain the same amount of the desired molecule), or as a continuous infusion through an implantation device or catheter. . Further improvements in appropriate dosages are routinely made by those skilled in the art and are within the scope of duties routinely performed by those skilled in the art. Appropriate doses can be ascertained by using appropriate dose-response data. In certain embodiments, the pharmaceutical composition can be administered to the patient over an extended period of time. Long-term administration of the antibodies in the composition may cause adverse immune or allergic responses commonly associated with antibodies against human antigens in non-human animals, such as non-fully human antibodies or non-human antibodies made in non-human animal species. Minimize.
C. Administration The pharmaceutical compositions described herein can be administered in a variety of different ways. Examples are pharmaceutically acceptable by oral, intranasal, rectal, topical, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, subcutaneous, transdermal, intrathecal and intracranial administration methods. Administration of a composition comprising a carrier is included.

経口投与では、活性成分は、固体剤形、例えば、カプセル、錠剤および粉末にて、あるいは液体剤形、例えば、エリキシル、シロップおよび懸濁液にて投与することができる。活性成分は、不活性成分および粉末状担体、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムと共にゼラチンカプセルに封入することができる。所望の色調、風味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の所望の特徴を付与するために添加され得る付加不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタンおよび可食白色インクである。圧縮錠剤を作製するのに同様の希釈剤を用いることができる。錠剤およびカプセルは共に、長時間にわたる薬物の継続的放出を付与するため、持続放出型製品として製造することができる。圧縮錠剤は不快な風味を隠すため、および、大気から錠剤を保護するために、糖衣し、またはフィルムコーティングし、あるいは消化管における選択的崩壊のために腸溶コーティングすることができる。経口投与用の液体剤形は患者の受容を高めるため、着色および芳香を含むことができる。   For oral administration, the active ingredient can be administered in solid dosage forms such as capsules, tablets and powders, or in liquid dosage forms such as elixirs, syrups and suspensions. The active ingredient can be enclosed in gelatin capsules with inert ingredients and powdered carriers such as glucose, lactose, sucrose, mannitol, starch, cellulose or cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, sodium saccharine, talc, magnesium carbonate. it can. Examples of additional inert ingredients that can be added to impart the desired color, flavor, stability, buffer capacity, dispersion or other known desired characteristics include red iron oxide, silica gel, sodium lauryl sulfate, titanium dioxide and Edible white ink. Similar diluents can be used to make compressed tablets. Both tablets and capsules can be manufactured as sustained release products to provide continuous release of the drug over an extended period of time. Compressed tablets can be sugar coated or film coated to mask unpleasant flavor and protect the tablet from the atmosphere, or enteric coated for selective disintegration in the gastrointestinal tract. Liquid dosage forms for oral administration can contain coloring and aroma to increase patient acceptance.

活性成分は単独であるいは他の好適な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル処方物にすることができる（即ち、「噴霧状」にすることができる）。エアロゾル処方物は許容可能な加圧噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素中に入れることができる。   The active ingredient, alone or in combination with other suitable ingredients, can be made into aerosol formulations to be administered by inhalation (ie, can be “nebulized”). The aerosol formulation can be placed in an acceptable pressurized propellant such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen.

直腸投与に好適な処方物は、例えば、坐薬基剤を含むパッケージングされた活性成分からなる坐薬を含む。好適な坐薬基剤は天然もしくは合成トリグリセリドまたはパラフィン炭化水素を含む。さらに、例えば、液状トリグリセリド、ポリエチレングリコールまたはパラフィン炭化水素を含む基剤とパッケージングされた活性成分との組合せからなるゼラチン直腸カプセルを用いることも可能である。   Formulations suitable for rectal administration include, for example, suppositories consisting of packaged active ingredients containing a suppository base. Suitable suppository bases include natural or synthetic triglycerides or paraffin hydrocarbons. Furthermore, it is also possible to use gelatin rectal capsules consisting of a combination of a base containing, for example, liquid triglycerides, polyethylene glycols or paraffin hydrocarbons and a packaged active ingredient.

非経口投与、例えば、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）（関節内）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路に好適な処方物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および処方物を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張性無菌注射液ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液を含む。   Suitable formulations for parenteral administration, eg intra-articular (intra-articular), intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal and subcutaneous routes are antioxidants, buffers, bacteriostats and formulations Aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions that may contain solutes that are isotonic with the blood of the intended recipient and aqueous solutions that may contain suspending, solubilizing, thickening, stabilizing and preserving agents and Includes non-aqueous sterile suspensions.

医薬組成物を処方するのに用いられる成分は、高純度であって、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくとも国内食品（ＮＦ）グレード、一般的には分析グレード、より典型的には少なくとも医薬品グレード）ことが好ましい。更に、インビボでの使用を目的とする組成物は、通常、無菌である。所定の化合物が使用前に合成される必要がある限り、典型的に、生じる生成物は、合成または精製プロセスの間に存在し得る潜在的毒物、特に、エンドトキシンを実質的に含まない。非経口投与用の組成物も無菌で実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で作製される。   The ingredients used to formulate the pharmaceutical composition are of high purity and substantially free of potentially harmful contaminants (eg, at least national food (NF) grade, generally analytical grade, More typically, at least pharmaceutical grade) is preferred. In addition, compositions intended for in vivo use are usually sterile. As long as a given compound needs to be synthesized before use, the resulting product is typically substantially free of potential toxicants, particularly endotoxins, that may be present during the synthesis or purification process. Compositions for parenteral administration are also sterile and substantially isotonic and made under GMP conditions.

実施試験および得られた結果を含む以下の実施例は、単に例示的な目的として示されるものであり、本発明を限定するものと捉えるべきではない。   The following examples, including performance tests and results obtained, are given for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the invention.

実施例１：グルカゴンに対するヒトモノクローナル抗体の作製
グルカゴンに対する完全ヒトモノクローナル抗体は、各々がヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウス系を用いてＭｅｄａｒｅｘ社によって調製された。このようなモノクローナル抗体を調製する方法は、Ｃｈｅｎら（１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８１１−８２０）および国際特許出願公報第ＷＯ０１／０９１８７号（参考として援用される）の実施例１に述べられている。Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１）、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号および同第５，５４５，８０７号ならびに国際特許出願公報第ＷＯ０１／０９１８７号（参考として援用される）の実施例２も参照されたい。 Example 1 Production of Human Monoclonal Antibodies Against Glucagon Fully human monoclonal antibodies against glucagon were prepared by Medarex using transgenic mouse systems each expressing a human antibody gene. Methods for preparing such monoclonal antibodies are described in Chen et al. (1993, EMBO J. 12: 811-820) and Example 1 of International Patent Application Publication No. WO 01/09187 (incorporated by reference). Yes. Fishwild et al. (1996, Nature Biotechnology 14: 845-851), US Pat. Nos. 5,545,806, 5,625,825 and 5,545,807, and International Patent Application Publication No. WO 01/09187. See also Example 2 of the issue (incorporated by reference).

グルカゴンに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するため、ＨｕＭａｂマウスを精製組換えヒトグルカゴンで免疫化した。免疫化の方法は、国際特許出願公報第ＷＯ０４／０３５７４７；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９；上記Ｆｉｓｈｗｉｌｄらおよび国際特許出願公報第ＷＯ９８／２４８８４に述べられており、これらの各々の教示は参考として援用される）。   To generate fully human monoclonal antibodies against glucagon, HuMab mice were immunized with purified recombinant human glucagon. Methods of immunization are described in International Patent Application Publication No. WO 04/035747; Lonberg et al. (1994, Nature 368: 856-859; Fishwild et al. And International Patent Application Publication No. WO 98/24884, the teachings of each of these. Is incorporated by reference).

抗グルカゴンヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを用いて、ハイブリドーマ細胞においてモノクローナル抗体を産生させた。このようなハイブリドーマを生成する方法は、国際特許出願公報第ＷＯ０４／０３５７４７号において考察されている。ハイブリドーマのスクリーニングから選択した抗体をＡＧ１５９と指定した。その抗体を選択した理由の１つは、インビトロおよびインビボにてグルカゴンを中和し得るためであった。   Mice with sufficient titers of anti-glucagon human immunoglobulin were used to produce monoclonal antibodies in hybridoma cells. A method for producing such a hybridoma is discussed in International Patent Application Publication No. WO 04/035747. The antibody selected from the hybridoma screening was designated AG159. One reason for choosing the antibody was that it could neutralize glucagon in vitro and in vivo.

実施例２：抗グルカゴン抗体の軽鎖および重鎖のクローニング
グルカゴン結合モノクローナル抗体ＡＧ１５９を発現するハイブリドーマを供給源として用い、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総ＲＮＡを単離した。伸長アダプターを有するランダムプライマー（５’−ＧＧＣ ＣＧＧ ＡＴＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＡＮ ＮＮＮ ＮＮＴ−３’；配列番号１０１）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成し、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）を行った。 Example 2: Cloning of light chain and heavy chain of anti-glucagon antibody Total RNA was isolated using TRIzol® (Invitrogen) using a hybridoma expressing the glucagon-binding monoclonal antibody AG159 as a source. First strand cDNA was synthesized using a random primer having an extension adapter (5′-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3 ′; SEQ ID NO: 101), and 5 using a GeneRacer ™ kit (Invitrogen). 'RACE (rapid amplification of cDNA ends) was performed.

軽鎖をコードする完全なｃＤＮＡを調製するため、順方向プライマーはＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ネスト化プライマー（５’ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’；配列番号１０２）であり、逆方向プライマーは、ヒトκ鎖の３’非翻訳領域に見出されるｃＤＮＡ配列の保存領域を認識するように設計した（５’−ＧＧＧ ＧＴＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＧＧ−３’；配列番号１０３）。   The forward primer is a GeneRacer ™ nested primer (5′GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3 ′; SEQ ID NO: 102) and reverse primer to prepare complete cDNA encoding light chain Was designed to recognize a conserved region of the cDNA sequence found in the 3 ′ untranslated region of the human κ chain (5′-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3 ′; SEQ ID NO: 103).

可変領域重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するため、順方向プライマーはＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ネスト化プライマー（５’ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’；配列番号１０４）であり、逆方向プライマーは、ヒトＩｇＧ鎖のＦｃ領域におけるコード配列における保存領域を認識するように設計した（５’−ＴＧＡ ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＧＡ ＣＣＡ ＣＡＣ Ｇ−３’；配列番号１０５）。   The forward primer is a GeneRacer ™ nested primer (5′GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3 ′; SEQ ID NO: 104) and reverse primer to prepare cDNA encoding variable region heavy chain Was designed to recognize a conserved region in the coding sequence in the Fc region of the human IgG chain (5′-TGA GGA CGC TGA CCA CAC G-3 ′; SEQ ID NO: 105).

ＲＡＣＥ生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。コンセンサスＤＮＡ配列を決定し、完全長κ鎖および可変領域重鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計するのに用いた。   The RACE product was cloned into pCR4-TOPO and the DNA sequence was determined. The consensus DNA sequence was determined and used to design primers for PCR amplification of full-length kappa and variable region heavy chains.

ＶＫ−１シグナルペプチド配列（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡ ＲＣ；配列番号１０６）を含むように、成熟軽鎖をコードするＤＮＡ配列を伸長させるのに一連のプライマーを用いた。最初の５’プライマーはシグナルペプチドの最後の７個のアミノ酸および成熟軽鎖の１４個のアミノ酸をコードし（５’−ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＧＴ ＧＣＴ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＴＣ ＴＣＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＣＴ ＧＴＣ ＴＴＴ ＧＴＣ ＴＣ−３’；配列番号１０７）、３’逆方向プライマーはカルボキシル末端および終止コドンならびにＳａｌＩ制限部位をコードした（５’−ＣＴＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＣＴ Ｃ−３’；配列番号１０８）。シグナルペプチドの１５個のアミノ酸をコードする５’プライマー（５’−ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＧＧＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＧＣ ＴＧＡ ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＡＴ−３’；配列番号１０９）および前に使用したものと同じ逆方向プライマーを用いて、生じた生成物を更に増幅した。シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位および至適Ｋｏｚａｋ配列をコードする５’プライマー（５’−ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＧＧＧ−３’；配列番号１１０）および同一の逆方向プライマーを用いて、最終反応を行った。生じたＰＣＲ生成物を精製し、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、ゲルで単離し、哺乳動物発現ベクターｐＤＳＲａ１９にライゲーションした（国際出願公報第ＷＯ９０／４１３６３号を参照；任意の目的で参考として本明細書に援用される）。   A series of primers was used to extend the DNA sequence encoding the mature light chain to include the VK-1 signal peptide sequence (MDMRVPAQLLGLLLLLWLRGA RC; SEQ ID NO: 106). The first 5 ′ primer encodes the last 7 amino acids of the signal peptide and 14 amino acids of the mature light chain (5′-GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TGA AAT TGT GCT GAC CCA GTC TCC AGC CAC CCT GTC TTT GTC TC-3 ′; SEQ ID NO: 107), the 3 ′ reverse primer encoded a carboxyl terminus and stop codon and a SalI restriction site (5′-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3 ′; SEQ ID NO: 108). 5 'primer encoding 15 amino acids of the signal peptide (5'-CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TGC TGT GGC TGA GAG GTG CCA GAT-3'; SEQ ID NO: 109) and the same reverse as previously used The resulting product was further amplified using directional primers. 5 ′ primer encoding the amino terminus of the signal sequence, the XbaI restriction endonuclease site and the optimal Kozak sequence (5′-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGC TCA GCT CCT GGG-3 ′; SEQ ID NO: 110) and the same reverse primer, the final reaction was performed. The resulting PCR product was purified, digested with XbaI and SalI, gel isolated, and ligated into the mammalian expression vector pDSRa19 (see International Application Publication No. WO 90/41363; herein incorporated by reference for any purpose). ).

ＶＫ−１シグナルペプチド配列（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡ ＲＣ；配列番号１０６）を含むように、成熟重鎖をコードするＤＮＡ配列を伸長させるのに一連のプライマーを用いた。最初の５’プライマーはシグナルペプチドの最後の７個のアミノ酸および成熟重鎖の６個のアミノ酸をコードし（５’−ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＧＡ Ｇ−３’；配列番号１１１）、３’逆方向プライマーは天然センス鎖ＢｓｍＢＩ部位を含む可変領域のカルボキシル末端をコードした（５’−ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＧＡＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＧＴＴ ＣＣ−３’；配列番号１１２）。シグナルペプチドの１５個のアミノ酸をコードする５’プライマー（５’−ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＧＧＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＧＣ ＴＧＡ ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＡＴ−３’；配列番号１１３）および前に使用したものと同じ逆方向プライマーを用いて、生じた生成物を更に増幅した。シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位および至適Ｋｏｚａｋ配列をコードする５’プライマー（５’−ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＧＧＧ−３’；配列番号１１４）および前述の逆方向プライマーを用いて、最終反応を行った。生じたＰＣＲ生成物を精製し、ＸｂａＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ゲルで単離し、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクターｐＤＳＲａ１９にライゲーションした。
ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）ＡＧ１５９抗体鎖融合遺伝子の構築
上流ＸｂａＩ部位をコードするＤＮＡ配列、至適Ｋｏｚａｋ配列、ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）ペプチドおよびリンカー配列および独特の制限部位を含むＡＧ１５９ ＬＣもしくはＨＣ ｃＤＮＡの一部を、Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ社（テキサス州ヒューストン）により合成した（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＧＧＧＧＧＧ；配列番号１１５）。κ鎖に対する天然の独特なＫｐｎＩ部位を用い、合成遺伝子由来のＸｂａＩ−ＫｐｎＩ断片を用いてＡＧ１５９κ鎖ｐＤＳＲａ１９構築物における同義断片を置換し、ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＬＣ融合遺伝子を得た。同様に、ＡＧ１５９重鎖ＤＮＡ配列における天然の独特なＰｖｕＩＩ部位を用い、合成ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）ＤＮＡ配列をＸｂａＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、ＡＧ１５９重鎖構築物における同義断片を置換するのに用いてＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＩｇＧ１重鎖融合遺伝子を作製した。 A series of primers was used to extend the DNA sequence encoding the mature heavy chain to include the VK-1 signal peptide sequence (MDMRVPAQLLGLLLLLWLRGA RC; SEQ ID NO: 106). The first 5 ′ primer encodes the last 7 amino acids of the signal peptide and the 6 amino acids of the mature heavy chain (5′-GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TCA GGT GCA GCT GGT GGA G-3 ′; sequence No. 111) The 3 ′ reverse primer encoded the carboxyl terminus of the variable region containing the natural sense strand BsmBI site (5′-GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG GTT CC-3 ′; SEQ ID NO: 112). 5 'primer encoding the 15 amino acids of the signal peptide (5'-CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TGC TGT GGC TGA GAG GTG CCA GAT-3'; SEQ ID NO: 113) and the same reverse as previously used The resulting product was further amplified using directional primers. 5 ′ primer encoding the amino terminus of the signal sequence, the XbaI restriction endonuclease site and the optimal Kozak sequence (5′-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGC TCA GCT CCT GGG-3 ′; SEQ ID NO: 114) and the reverse primer described above, the final reaction was performed. The resulting PCR product was purified, digested with XbaI and BsmBI, isolated on gel and ligated into the mammalian expression vector pDSRa19 containing the human IgG1 constant region.
Construction of GLP-I (A2G) AG159 antibody chain fusion gene The DNA sequence encoding upstream XbaI site, optimal Kozak sequence, GLP-I (A2G) peptide and linker sequence and AG159 LC or HC cDNA containing unique restriction sites A portion was synthesized by Picoscript (Houston, Tex.) (MDMRVPACLLLGLLLWLRGARCHCHGEFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGSTGGSSTASSSGSGSATGGGGGG; SEQ ID NO: 115). The natural unique KpnI site for the kappa chain was used to replace the synonymous fragment in the AG159 kappa chain pDSRa19 construct with a synthetic gene-derived XbaI-KpnI fragment, resulting in a GLP-I (A2G) -AG159 LC fusion gene. Similarly, using the natural unique PvuII site in the AG159 heavy chain DNA sequence, the synthetic GLP-I (A2G) DNA sequence is cleaved with XbaI and PvuII and used to replace synonymous fragments in the AG159 heavy chain construct. -I (A2G) -AG159 IgG1 heavy chain fusion gene was prepared.

ＩｇＧ１定常領域を含むＢｓｍＢＩ−ＳａｌＩ断片を、ＰＣＲによって増幅されたＩｇＧ２定常領域に置換することにより、ＡＧ１５９の重鎖定常領域のアイソタイプをＩｇＧ１からＩｇＧ２に転換し、遺伝子の５’および３’末端に同様の制限部位を生成した。
ＡＧ１５９κ軽鎖およびＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９κ軽鎖発現プラスミドの構築
完全長ＡＧ１５９ ＬＣを、プライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、クローニングを目的として遺伝子の一端に新規制限部位を導入した。５’プライマーは、ＳａｌＩ制限部位、至適Ｋｏｚａｋ配列およびＶＫ−１シグナル配列のアミノ末端を含み（５’−ＡＡＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＣＴ−３’；配列番号１１６）、一方、３’プライマーはカルボキシル末端および終止コドンならびにＮｏｔＩ制限部位をコードした（５’−ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡ−３’；配列番号１１７）。生じた断片を精製し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、発現ベクターｐＤＣ３２３およびｐＤＳＲα２４にクローニングした。ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＬＣ構築物をテンプレートとして用いて同じプロセスを実施した。
ＡＧ１５９ ＩｇＧ１，ＡＧ１５９ ＩｇＧ２，ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＩｇＧ１およびＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＩｇＧ２の重鎖発現プラスミドの構築
ＳａｌＩ部位、至適Ｋｏｚａｋ配列およびシグナル配列（上述の配列番号１０６）のアミノ末端をコードする５’プライマーならびにカルボキシル末端、終止コドンおよびＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマーを用いたＰＣＲにより、上述のＡＧ１５９ ＩｇＧ１重鎖可変領域を増幅した（５’−ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＴＡ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＡ−３’；配列番号１１８）。生じたＰＣＲ断片を精製し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲルで単離し、発現ベクターｐＤＣ３２４およびｐＤＳＲα２４にクローニングした。上述のＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＩｇＧ１、ＡＧ１５９ ＩｇＧ２およびＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＩｇＧ２構築物をテンプレートとして用いて同じプロセスを実施した。
異種ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９κ鎖突然変異体の構築
融合タンパク質からのタンパク質分解的切断に対してＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）ペプチドを保護するため、ＰＣＲを用いた部位特異的突然変異（ｍｕｔａｇｅｎｅｉｓ）により、変更を行った。ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９κ鎖ＤＮＡ配列をテンプレートとして用いて、ＰＣＲを行い、リンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列に新規ＢａｍＨＩ制限部位を導入した。ＢａｍＨＩ部位を含む順方向プライマー（５’−ＧＣＴ ＴＧＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＡＡＡ ＧＧＴ ＣＧＴ ＧＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＣ ＡＧＣ ＧＣＴ−３’；配列番号１１９）および前述のＫｐｎＩ部位を含む配列領域に対してアニーリングした逆方向プライマー（５’−ＡＧＧ ＴＴＴ ＣＴＧ ＴＴＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＧＣ−３’；配列番号１２０）を用いて、リンカーおよびＡＧ１５９ ＬＣの最初の３５個のアミノ酸をコードする領域を増幅した。ＸｂａＩ制限部位の上流のベクタープロモーター領域においてアニーリングした５’プライマー（５’−ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＣＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＴＧ−３’’；配列番号１２１）を、所望の変更およびＢａｍＨＩ制限部位を含む特異的３’プライマー（５’−ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＧＣ ＧＡＴ ＧＡＡ−３’；配列番号１２２）、（５’−ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＴＴ ＡＡＣ ＣＡＧ ＣＣＡ−３’；配列番号１２３）、（５’−ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＧＣ ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＧＣ−３’；配列番号１２４）、（５’−ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＴ ＧＧＧ ＡＧＧ ＣＧＧ ＡＧＣ ＡＣＣ ＡＣＴ ＡＣＴ ＣＧＧ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＧＣ ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ−３’；配列番号１２５）と組み合わせた。別個のＰＣＲ生成物を精製し、適切な制限酵素（ＸｂａＩとＢａｍＨＩまたはＢａｍＨＩとＫｐｎＩ）で消化し、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化されたＡＧ１５９ ＬＣ ＤＮＡを含む発現ベクターｐＤＳＲα２０にライゲーションした。 By replacing the BsmBI-SalI fragment containing the IgG1 constant region with the IgG2 constant region amplified by PCR, the isotype of the heavy chain constant region of AG159 was converted from IgG1 to IgG2, and at the 5 ′ and 3 ′ ends of the gene. Similar restriction sites were generated.
Construction of AG159κ light chain and GLP-I (A2G) -AG159κ light chain expression plasmid Full-length AG159 LC was amplified by PCR using primers and a new restriction site was introduced at one end of the gene for cloning purposes. The 5 ′ primer contains a SalI restriction site, an optimal Kozak sequence and the amino terminus of the VK-1 signal sequence (5′-AAC CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT-3 ′; SEQ ID NO: 116 ) Whereas the 3 ′ primer encoded a carboxyl terminus and a stop codon and a NotI restriction site (5′-AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAA CAC TCT CCC CTG TTG AA-3 ′; SEQ ID NO: 117). The resulting fragment was purified, digested with SalI and NotI, and cloned into expression vectors pDC323 and pDSRα24. The same process was performed using the GLP-I (A2G) -AG159 LC construct as a template.
Construction of AG159 IgG1, AG159 IgG2, GLP-1 (A2G) -AG159 IgG1 and GLP-1 (A2G) -AG159 IgG2 heavy chain expression plasmids SalI site, optimal Kozak sequence and signal sequence (SEQ ID NO: 106 above) The above-mentioned AG159 IgG1 heavy chain variable region was amplified by PCR using the 5 ′ primer encoding the amino terminus and the 3 ′ primer encoding the carboxyl terminus, stop codon and NotI restriction site (5′-AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GA-3 ′; SEQ ID NO: 118). The resulting PCR fragment was purified, digested with SalI and NotI, isolated on gel and cloned into expression vectors pDC324 and pDSRα24. The same process was performed using the GLP-1 (A2G) -AG159 IgG1, AG159 IgG2 and GLP-1 (A2G) -AG159 IgG2 constructs described above as templates.
Construction of heterologous GLP-1 (A2G) -AG159 kappa chain mutant Site-directed mutagenesis using PCR to protect the GLP-1 (A2G) peptide against proteolytic cleavage from the fusion protein The change was made. PCR was performed using the GLP-1 (A2G) -AG159 kappa chain DNA sequence as a template, and a new BamHI restriction site was introduced into the DNA sequence encoding the linker peptide. A forward primer containing a BamHI site (5′-GCT TGG CTG GTT AAA GGT CGT GGC GGA TCC GGC AGC GCT-3 ′; SEQ ID NO: 119) and a reverse primer annealed to a sequence region containing the aforementioned KpnI site ( 5′-AGG TTT CTG TTG GTA CCA GGC-3 ′; SEQ ID NO: 120) was used to amplify the linker and the region encoding the first 35 amino acids of AG159 LC. A 5 ′ primer (5′-TTT CAG GTC CCG GAT CCG GTG-3 ″; SEQ ID NO: 121) annealed in the vector promoter region upstream of the XbaI restriction site was added to the specific 3 ′ containing the desired changes and the BamHI restriction site. Primer (5'-GCT GCC GGA TCC GCC ACC ACC ATT TTT CAG CCA AGC GAT GAA-3 '; SEQ ID NO: 122), (5'-GCT GCC GGA TCC GCC ACC ACC TTT AAC CAGCCA-3'; SEQ ID NO: 123 ), (5′-GCT GCC GGA TCC CAG CCA AGC GAT GAA TTC TTT AGC-3 ′; SEQ ID NO: 124), (5′-GCT GCC GGA TCC GCT GGG AGG CGG AGC ACT ACT GCG GTT CTT CAG CCA AGC GAT GAA TTC-3 '; in combination with SEQ ID NO: 125). Separate PCR products were purified and digested with the appropriate restriction enzymes (XbaI and BamHI or BamHI and KpnI) and ligated into the expression vector pDSRα20 containing AG159 LC DNA digested with XbaI and KpnI.

実施例３：インビトロアッセイ
グルカゴン受容体機能性レポーターのアッセイ
中和活性を有する化合物／抗体組成物を同定するため、ヒトまたはラットグルカゴン受容体を発現するレポーター細胞株を作製した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現増強により、ｃＡＭＰ濃度の上昇を測定した。簡潔に述べると、サイクリックＡＭＰ濃度によって調節されるルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を保持することに加え、ラットまたはヒトグルカゴン受容体を発現するＣＨＯＫ１細胞を、アッセイの２日前にプレーティングし、次に、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。アッセイ前の夜間に細胞を洗浄し、媒体を、０．５％プロテアーゼ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清非含有媒体に取り換え、次いで、一晩培養した。ヒトまたはラットグルカゴン受容体を発現する細胞それぞれについて、０．５％プロテアーゼ非含有ＢＳＡおよび１００μＭ ＩＢＭＸを含む媒体にて３７℃で６時間、細胞を１ｎＭまたは０．１ｎＭグルカゴンを含む一連の濃度の試験される組成物に曝した。ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、ルシフェラーゼ活性について細胞溶解物をアッセイした。ルシフェラーゼ活性はＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オハイオ州Ｍａｒｉｅｔｔａ）を用いて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、得られた化合物濃度曲線の非線形回帰分析を行った。「ＩＣ５０」はグルカゴン刺激性活性が５０％低下する時点での化合物／抗体組成物の濃度を表す。
ＧＬＰ−１受容体機能性レポーターのアッセイ
ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の効力を比較するため、ヒトまたはマウスＧＬＰ−１受容体を発現するレポーター細胞株を作製した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現増強により、ｃＡＭＰ濃度の上昇を測定した。簡潔に述べると、サイクリックＡＭＰ濃度によって調節されるルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を保持することに加え、マウスまたはヒトＧＬＰ−１受容体を発現するＣＨＯＫ１細胞を、アッセイの２日前にプレーティングし、次に、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。アッセイ前の夜間に細胞を洗浄し、媒体を、０．５％プロテアーゼ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清非含有媒体に取り換え、次に、一晩培養した。０．５％プロテアーゼ非含有ＢＳＡおよび１００μＭ ＩＢＭＸを含む媒体にて３７℃で６時間、細胞を一連の濃度の試験される組成物またはＧＬＰ−１に曝した。ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、ルシフェラーゼ活性について細胞溶解物をアッセイした。ルシフェラーゼ活性はＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オハイオ州Ｍａｒｉｅｔｔａ）を用いて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、得られた化合物濃度曲線の非線形回帰分析を行った。「ＩＣ５０」は最大活性の５０％が得られる時点でのＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の濃度を表す。
膜調製
ヒトまたはマウスＧＬＰ−１受容体（あるいはラットまたはヒトグルカゴン受容体）を発現するＣＨＯＫ１細胞を、ＰＢＳを用いた１５０ｍｍ培養皿から採取した。１５００ｒｐｍで１０分、細胞を沈降させた。電動式ガラス装着Ｔｅｆｌｏｎホモジナイザを用いて、１５ｍｌの氷冷スクロース緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３２Ｍスクロース、アジ化ナトリウム０．２５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）中で生じたペレットを均質化した。そのホモジネートを４８，０００×ｇ、４℃で１０分、遠心分離し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて２５ｍｌアッセイ緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ非含有ＢＳＡ１０ｍｇ／ｍｌ、ＳＴＩ ０．１ｍｇ／ｍｌおよびＰｅｆａｂｌｏｃ ０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、次に、４８，０００×ｇで１０分、再度遠心分離した。ペレットをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒを用いて１５ｍｌアッセイ緩衝剤中で３回目にて均質化し、再度、４８，０００×ｇで１０分、遠心分離した。生じたペレットを湿重量濃度４ｍｇ／ｍｌにてアッセイ緩衝剤中で再懸濁させた。
リガンド結合アッセイ
９６ウェルＵ底プレートにて結合アッセイを行った。総容量１００μｌにて一連の濃度の試験される組成物またはＧＬＰ−１（またはグルカゴン）で、０．２ｎＭ １２５Ｉ−ＧＬＰ−１（または０．２ｎＭ １２５Ｉ−グルカゴン）を含むアッセイ緩衝剤（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マサチューセッツ州ボストン）中で膜（組織２００μｇ）を室温で２時間インキュベートした。さらに、１μＭ非標識ＧＬＰ−１存在下で非特異的結合を評価した。０．５％ポリエチレンイミンに予め浸漬したＵｎｆｉｌｔｅｒ−９６ ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルタープレート（ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ １９６ Ｐａｃｋａｒｄ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、コネティカット州Ｓｈｅｌｔｏｎ）を通した迅速な濾過により、反応を終了し、次に、３００μｌの低温５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションおよび蛍光計数器（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、コネティカット州Ｓｈｅｌｔｏｎ）を用いて結合放射能を定量した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、得られた濃度曲線の非線形回帰分析を行った。「ＩＣ５０」は最大の特異的１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（または１２５Ｉ−グルカゴン）結合を５０％低下させる化合物の濃度を表す。 Example 3: In vitro assay Glucagon receptor functional reporter assay To identify compound / antibody compositions with neutralizing activity, reporter cell lines expressing human or rat glucagon receptors were generated. Increased cAMP concentration was measured by enhanced expression of the luciferase reporter gene. Briefly, in addition to retaining a luciferase reporter gene construct that is regulated by cyclic AMP concentration, CHOK1 cells expressing rat or human glucagon receptor were plated 2 days prior to the assay and then 5 The cells were cultured at 37 ° C. under% CO 2 . Cells were washed at night prior to the assay, and the medium was replaced with serum-free medium containing 0.5% protease-free bovine serum albumin (BSA) and then incubated overnight. For each cell expressing human or rat glucagon receptor, a series of concentrations of cells containing 1 nM or 0.1 nM glucagon for 6 hours at 37 ° C. in medium containing 0.5% protease-free BSA and 100 μM IBMX. Exposure to the composition. Cell lysates were assayed for luciferase activity using a luciferase assay system (Promega Corporation, Madison, Wis.). Luciferase activity was measured using a Luminoskan Ascent (Thermo Electron Corporation, Marietta, Ohio). Nonlinear regression analysis of the resulting compound concentration curves was performed using GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). “IC 50 ” represents the concentration of the compound / antibody composition at which the glucagon stimulatory activity is reduced by 50%.
GLP-1 Receptor Functional Reporter Assay To compare the efficacy of GLP-1 compound / antibody compositions, reporter cell lines expressing human or mouse GLP-1 receptors were generated. Increased cAMP concentration was measured by enhanced expression of the luciferase reporter gene. Briefly, in addition to retaining a luciferase reporter gene construct that is regulated by cyclic AMP concentration, CHOK1 cells expressing mouse or human GLP-1 receptor were plated 2 days prior to the assay, and then The cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 . Cells were washed at night prior to the assay, and the medium was replaced with serum-free medium containing 0.5% protease-free bovine serum albumin (BSA) and then incubated overnight. Cells were exposed to a series of concentrations of the composition to be tested or GLP-1 in media containing 0.5% protease free BSA and 100 μM IBMX at 37 ° C. for 6 hours. Cell lysates were assayed for luciferase activity using a luciferase assay system (Promega Corporation, Madison, Wis.). Luciferase activity was measured using a Luminoskan Ascent (Thermo Electron Corporation, Marietta, Ohio). Nonlinear regression analysis of the resulting compound concentration curves was performed using GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). “IC 50 ” represents the concentration of GLP-1 compound / antibody composition at which 50% of maximum activity is obtained.
Membrane preparation CHOK1 cells expressing human or mouse GLP-1 receptor (or rat or human glucagon receptor) were harvested from 150 mm culture dishes using PBS. Cells were sedimented at 1500 rpm for 10 minutes. The resulting pellet was homogenized in 15 ml ice-cold sucrose buffer (25 mM Tris-HCl, 0.32 M sucrose, sodium azide 0.25 g / L, pH 7.4) using a motorized glass fitted Teflon homogenizer. . The homogenate was centrifuged at 48,000 × g for 10 minutes at 4 ° C. and 25 ml assay buffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2 , protease-free BSA 10 mg / ml using Tissue-Tearor (Biospec Products). , STI 0.1 mg / ml and Pefabloc 0.1 mg / ml, pH 7.4) and then centrifuged again at 48,000 × g for 10 minutes. The pellet was homogenized a third time in 15 ml assay buffer using Tissue-Tearor and again centrifuged at 48,000 × g for 10 minutes. The resulting pellet was resuspended in assay buffer at a wet weight concentration of 4 mg / ml.
Ligand binding assay Binding assays were performed in 96 well U-bottom plates. Assay buffer (PerkinElmer) containing 0.2 nM 125 I-GLP-1 (or 0.2 nM 125 I-glucagon) at a series of concentrations to be tested or GLP-1 (or glucagon) in a total volume of 100 μl. Membranes (200 μg of tissue) were incubated for 2 hours at room temperature in Life Sciences, Boston, Mass. Furthermore, nonspecific binding was evaluated in the presence of 1 μM unlabeled GLP-1. The reaction was terminated by rapid filtration through Unfilter-96 GF / C glass fiber filter plates (FilterMate 196 Packard Harvester, PerkinElmer, Shelton, Conn.) Presoaked in 0.5% polyethyleneimine, then 300 μl Washed 3 times with cold 50 mM Tris-HCl (pH 7.4). Bound radioactivity was quantified using a TopCount microplate scintillation and fluorescence counter (Packard Instrument Company, PerkinElmer, Shelton, Conn.). Nonlinear regression analysis of the resulting concentration curves was performed using GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). “IC 50 ” represents the concentration of a compound that reduces the maximum specific 125 I-GLP-1 (or 125 I-glucagon) binding by 50%.

実施例４：ＡＧ１５９抗体のグルカゴン中和活性
抗体可変領域をｃＤＮＡからクローニングし、ハイブリドーマから精製した抗体の質量分光学的分析によって確認した。クローニングしたＡＧ１５９が受容体結合および受容体活性化アッセイにおいてグルカゴン中和活性を有し、かつ糖尿病マウスモデルにおいて血中グルコースを低下させることを実証した（図１１〜１３）。図１１では、グルカゴン刺激性レポーター活性のＡＧ１５９による中和を示す。組換えグルカゴン受容体を発現する細胞を、一連の濃度のＡＧ１５９または対照ＩｇＧに加え、０．１ｎＭグルカゴンでインキュベートした。このアッセイにおけるＡＧ１５９のＩＣ５０は４ｎＭである（図１１）。図１２では、グルカゴン受容体を組換え的に発現する細胞の粗膜画分を、一連の用量のＡＧ１５９または対照抗体と共に２００ｐＭ １２５Ｉ−グルカゴンでインキュベートした。この１２５Ｉ−グルカゴン結合アッセイにおけるＡＧ１５９のＩＣ５０は０．２ｎＭである（図１２）。図１３はＡＧ１５９に応答したｏｂ／ｏｂマウスにおいて測定したグルコース濃度を示す。 Example 4: Glucagon neutralizing activity of AG159 antibody The antibody variable region was cloned from cDNA and confirmed by mass spectroscopic analysis of the antibody purified from the hybridoma. We have demonstrated that cloned AG159 has glucagon neutralizing activity in receptor binding and receptor activation assays and lowers blood glucose in a diabetic mouse model (FIGS. 11-13). FIG. 11 shows neutralization of glucagon-stimulated reporter activity by AG159. Cells expressing recombinant glucagon receptor were added to a series of concentrations of AG159 or control IgG and incubated with 0.1 nM glucagon. The IC 50 of AG159 in this assay is 4 nM (FIG. 11). In FIG. 12, a crude membrane fraction of cells that recombinantly express glucagon receptor was incubated with 200 pM 125 I-glucagon with a series of doses of AG159 or a control antibody. The IC 50 for AG159 in this 125 I-glucagon binding assay is 0.2 nM (FIG. 12). FIG. 13 shows the glucose concentration measured in ob / ob mice in response to AG159.

実施例５：インビボアッセイ
供給血中グルコースに関して組成物を更に検討するため、このスクリーニングではｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルを用い、血中グルコース濃度がベースライン濃度に戻るまで１、２、４、６および２４時間時に、あるいは２４時間毎にこの測定をモニタリングした。ｄｂ／ｄｂマウスはＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社からＪＡＸ（登録商標）ＧＥＭＭ（登録商標）系−偶発突然変異コンジェニックマウスとして市販されており、糖尿病偶発突然変異（Ｌｅｐｒｄｂ）と同型である。これらのマウスは３〜４週齢頃に識別可能に肥満になる。この試験に加わるための本発明者らの各マウスに対する選択基準は、少なくとも３００ｍｇ／ｄＬの血中グルコースである。８．５週齢（長期１〜２週試験用）から約１０〜１１週齢（急性１〜３日試験用）のｄｂ／ｄｂマウスに、各被験分子を１回（急性試験）あるいは複数回（長期試験）注射した。試験当日、午前９時（ベースライン値）にマウスの採血を行い、次に、即座に注射担当者に手渡し、次に、注射担当者は適切なＧＬＰ−１構築物または陽性／陰性対照を注射する。次に、摂食行為に関連する血中グルコース濃度の変動性を制限するため、餌を与えずに新鮮ケージ内にマウスを入れる。通常、１時間、４時間、６時間および２４時間時の血中グルコース濃度を測定する。２４時間時において血中グルコース値が開始時未満であると、血中グルコースがベースライン濃度に戻るまで２４時間ごとに血中グルコース濃度を測定する。６時間時後、マウスに通常の餌を与えた。 Example 5: In vivo assay To further examine the composition with respect to fed blood glucose, this screen uses a db / db diabetic mouse model and 1, 2, 4, 6 and until the blood glucose concentration returns to baseline concentration. This measurement was monitored at 24 hours or every 24 hours. The db / db mouse is commercially available from The Jackson Laboratories as a JAX® GEMM® line-incident mutation congenic mouse and is isomorphic to a diabetic incident mutation (Lepr db ). These mice become distinguishably obese around 3-4 weeks of age. The selection criteria for each of our mice to participate in this study is at least 300 mg / dL blood glucose. Each test molecule is applied once (acute test) or multiple times to db / db mice from 8.5 weeks of age (for long-term 1-2 weeks test) to about 10-11 weeks of age (for acute 1-3 day test) (Long term study) Injection. On the day of the test, the mice are bled at 9 am (baseline value) and then immediately handed to the injection officer who then injects the appropriate GLP-1 construct or positive / negative control. . The mice are then placed in a fresh cage without food to limit variability in blood glucose levels associated with feeding. Usually, blood glucose concentration at 1 hour, 4 hours, 6 hours and 24 hours is measured. If the blood glucose value is less than the start time at 24 hours, the blood glucose concentration is measured every 24 hours until the blood glucose returns to the baseline concentration. After 6 hours, the mice were fed normal food.

１０〜１２週齢のＣ５７Ｂ１６（正常な細身）マウスを用いた。これらのマウスは任意の供給メーカー、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社またはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社を通じて市販されており、正常であるとみなされる。「細身」という用語は、これらのマウスを肥満型ｄｂ／ｄｂマウスと対比するのに用いられる。Ｃ５７Ｂ１６マウスを体重に関して無作為化した。ベースライン血中グルコースを測定するため、午前９時の採血を行い、化合物またはＰＢＳを投与し、その後、餌を与えずにケージ内にマウスを入れた。４〜５時間後、２ｇ／ｋｇのグルコース投与量を用いて腹腔内グルコース負荷試験（グルコース負荷試験ではグルコースを代謝する体能を測定する）を行った。血中グルコース濃度はグルコース負荷の投与後３０分および９０分時ならびに２４時間時あるいは血中グルコース濃度が初期値に回復するまで測定した。これらの試験から、グルコースを用いる際の陰性対照ＰＢＳと対照的なＧＬＰ−１作用の増強効果が認められる。   C57B16 (normal slender) mice aged 10-12 weeks were used. These mice are marketed through any vendor, for example, Jackson Laboratories or Charles River, and are considered normal. The term “slender” is used to contrast these mice with obese db / db mice. C57B16 mice were randomized with respect to body weight. To measure baseline blood glucose, blood was collected at 9 am, administered compound or PBS, and then placed in cages without food. After 4 to 5 hours, an intraperitoneal glucose tolerance test was performed using a glucose dose of 2 g / kg (in the glucose tolerance test, the ability to metabolize glucose is measured). The blood glucose concentration was measured at 30 and 90 minutes and 24 hours after administration of the glucose load or until the blood glucose concentration recovered to the initial value. From these tests, the potentiating effect of GLP-1 action in contrast to the negative control PBS when using glucose is observed.

実施例６：ＡＧ１５９抗体の結合活性
抗体可変領域をｃＤＮＡからクローニングし、ハイブリドーマから精製した抗体の質量分光学的分析によって確認した。クローニングしたＡＧ１５９が受容体結合および受容体活性化アッセイにおいてグルカゴン中和活性を有することを実証した。ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）（配列番号１２６）をＡＧ１５９の軽鎖または重鎖のＮ末端と融合した（上記実施例２を参照）。プラスミドをＣＨＯ細胞に同時トランスフェクションし、完全長融合タンパク質を生成した。生じた抗体構造は、ＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２であった。インビトロでの分析により（実施例３を参照）、この２つの融合タンパク質は同等の結合（ヒト受容体に対してＩＣ５０５〜１０ｎＭ）および活性化（ヒト受容体の活性化ではＥＣ５０＝０．１ｎＭ、マウス動物受容体では５ｎＭ）を有することが示された。更に、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）を軽鎖と融合した抗体構築物は、グルカゴン存在下でヒト受容体を活性化することも示された。さらに、融合抗体がＧＬＰ−１受容体存在下で依然としてグルカゴンを中和する活性を示すことを立証した。これらのインビトロデータは、融合ＧＬＰ−１類似体が二機能性であることを示した。 Example 6: Binding activity of AG159 antibody The antibody variable region was cloned from cDNA and confirmed by mass spectroscopic analysis of the antibody purified from the hybridoma. Cloned AG159 was demonstrated to have glucagon neutralizing activity in receptor binding and receptor activation assays. GLP (A2G) (SEQ ID NO: 126) was fused to the N-terminus of AG159 light or heavy chain (see Example 2 above). The plasmid was co-transfected into CHO cells to produce a full length fusion protein. The resulting antibody structures were AG159LC: GLP (A2G) -AG159 IgG2 and GLP (A2G) -AG159 LC: AG159 IgG2. By in vitro analysis (see Example 3), the two fusion proteins have equivalent binding (IC 50 5-10 nM for human receptor) and activation (EC 50 = 0 for human receptor activation) .1 nM, 5 nM for mouse animal receptors). Furthermore, an antibody construct fused with GLP (A2G) with a light chain has also been shown to activate human receptors in the presence of glucagon. Furthermore, it was demonstrated that the fusion antibody still exhibits activity to neutralize glucagon in the presence of the GLP-1 receptor. These in vitro data indicated that the fused GLP-1 analog is bifunctional.

更に詳細には、ＧＬＰ（Ａ２６）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）をアッセイし、構築物がグルカゴン存在下でＧＬＰ−１受容体結合特性を維持するかを決定した。０、１、１０または１００ｎＭグルカゴンを加え、上述のようにリガンド結合アッセイを行った。図１に示すように、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９はグルカゴン存在下でヒトＧＬＰ−１受容体への１２５Ｉ−ＧＬＰ−１の結合に匹敵する。 More specifically, GLP (A26) -AG159LC: AG159 IgG2 (GLP (A2G) -AG159) was assayed to determine if the construct maintained GLP-1 receptor binding properties in the presence of glucagon. 0, 1, 10 or 100 nM glucagon was added and the ligand binding assay was performed as described above. As shown in FIG. 1, GLP (A2G) -AG159 is comparable to 125 I-GLP-1 binding to the human GLP-1 receptor in the presence of glucagon.

別の試験では、グルカゴン存在下でのＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性について、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９を評価した。一連のグルカゴン濃度を加え、上述の実施例３のようにＧＬＰ−１Ｒレポーターアッセイを行った。図２に示すように、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９はグルカゴン存在下でヒトＧＬＰ−１受容体を活性化する。このグラフではグルカゴン単独による（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９を含まない）ＧＬＰ−１受容体の活性化の用量応答曲線も示している（−−−−−）。   In another study, GLP (A2G) -AG159 was evaluated for GLP-1 receptor agonist activity in the presence of glucagon. A series of glucagon concentrations were added and the GLP-1R reporter assay was performed as in Example 3 above. As shown in FIG. 2, GLP (A2G) -AG159 activates the human GLP-1 receptor in the presence of glucagon. The graph also shows a dose response curve for activation of the GLP-1 receptor (without GLP (A2G) -AG159) by glucagon alone (-----).

図２に提示するデータは図３と異なる形態で示されている。図３では、残余活性がグルカゴンに起因するように、特定のＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９濃度（グルカゴンを含まない）に起因する活性を、それぞれのＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９濃度に関し、グルカゴンの全投与量に対する総活性から差し引いた。図３に示すように、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９の存在は、用量依存的にグルカゴンに誘発される活性を低下させる。   The data presented in FIG. 2 is shown in a different form from FIG. In FIG. 3, the activity due to a particular GLP (A2G) -AG159 concentration (without glucagon) is shown for each GLP (A2G) -AG159 concentration, so that the residual activity is due to glucagon. Subtracted from the total activity against the amount. As shown in FIG. 3, the presence of GLP (A2G) -AG159 reduces glucagon-induced activity in a dose-dependent manner.

実施例７：異種ＧＬＰ−１類似体を含む抗体融合体による結果
上記実施例において説明したように、ＧＬＰ−１化合物とＡＧ１５９との様々な融合体を調製し、それらの結合能の試験を行った。下記表８は天然ＧＬＰ−１のＣ末端が修飾された複数の融合タンパク質の結果を示す（融合のための配列は表１および７に一覧表示されている）。 Example 7: Results with antibody fusions containing heterologous GLP-1 analogs As described in the above examples, various fusions of GLP-1 compounds and AG159 were prepared and tested for their binding ability. It was. Table 8 below shows the results for multiple fusion proteins in which the C-terminus of native GLP-1 was modified (sequences for fusion are listed in Tables 1 and 7).

表８   Table 8

Figure 2009534424
タンパク質分解を低減するため、グリコシル化コンセンサス部位（ＮＴＸ）の導入が切断部位を保護するかを検討する目的で、上述のように一連の置換改変体ＧＬＰ−１類似体を設計した。さらに、グルタミンのヘリカル構造性向が切断特性からの精製および保護を伴ったより安定したペプチドを促進し得るという理論により、選択位置においてグルタミン残基に置換した。これらのＧＬＰ−１類似体をＡＧ１５９の軽鎖と融合し、試験を行った（これらの融合のための配列は表１および７に一覧表示されている）。表９に結果を示す。
Figure 2009534424
 In order to reduce proteolysis, a series of substitutional variant GLP-1 analogs were designed as described above in order to investigate whether the introduction of a glycosylation consensus site (NTX) protects the cleavage site. Furthermore, glutamine residues were substituted at selected positions due to the theory that the helical structural propensity of glutamine could promote a more stable peptide with purification and protection from cleavage properties. These GLP-1 analogs were fused with the light chain of AG159 and tested (sequences for these fusions are listed in Tables 1 and 7). Table 9 shows the results.

表９：グルタミンおよびグリコシル化ＧＬＰ−１化合物／抗体融合体   Table 9: Glutamine and glycosylated GLP-1 compound / antibody fusions

Figure 2009534424
Figure 2009534424

Figure 2009534424
実施例８：インビボでの結果
ＡＧ１５９および異種ＧＬＰ−１類似体を含む多くの異種融合分子を用いて試験を行い、時間の関数として血中グルコース濃度を低下させるそれらの能力を判定した。これらの試験は実施例３に記載するように行い、Ｄｂ／ｄｂマウスに異なる組成物を１回注射した（異なる類似体の配列は表１および７に示されている）。
Figure 2009534424
 Example 8: In Vivo Results A number of heterologous fusion molecules including AG159 and heterologous GLP-1 analogs were tested to determine their ability to reduce blood glucose levels as a function of time. These studies were performed as described in Example 3 and Db / db mice were injected once with different compositions (different analog sequences are shown in Tables 1 and 7).

図４は種々のＧＬＰ−１化合物／ＡＧ１５９融合の結果を示す。抗体融合体は、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）または以下のＡＧ１５９の軽鎖（ＬＣ）と融合したＧＬＰ−１ペプチドの１つを含んだ：Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ（配列番号２８）、Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ（配列番号２３）、Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号９）およびＡ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号１２）。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９ ＩｇＧ２重鎖と組み合わせ、以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２。投与量は１２ｕｇ／マウスであった。これらの融合のための配列は上記表１および７に一覧表示されている。   FIG. 4 shows the results of various GLP-1 compound / AG159 fusions. The antibody fusion included one of the following GLP-1 peptides fused to GLP (A2G) or the following AG159 light chain (LC): A2G / K28N / R30T (SEQ ID NO: 28), A2G / Q17N / A19T ( SEQ ID NO: 23), A2G / V10Q / V27Q (SEQ ID NO: 9) and A2G / W25Q / V27Q (SEQ ID NO: 12). These LC fusions were combined with AG159 IgG2 heavy chain to give the following antibodies (these tests were performed): GLP (A2G / K28N / R30T) -AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G / Q17N / A19T)- AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G / V10Q / V27Q) -AG159LC: AG159 IgG2 and GLP (A2G / W25Q / V27Q) -AG159LC: AG159 IgG2. The dose was 12 ug / mouse. The sequences for these fusions are listed in Tables 1 and 7 above.

図４において認められるように、血中グルコースは大部分の類似体に関して１時間時に低下し、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２が最大の血中グルコース低下作用を示した。血中グルコース濃度は単回注射の２４後にベースラインに戻った。最大効果は単回注射の４〜６時間後に認められた。   As can be seen in FIG. 4, blood glucose drops at 1 hour for most analogs, with GLP (A2G) -AG159LC: AG159 IgG2 and GLP (A2G / K28N / R30T) -AG159LC: AG159 IgG2 maximal It showed blood glucose lowering action. Blood glucose levels returned to baseline 24 after a single injection. Maximum effect was observed 4-6 hours after a single injection.

ＡＧ１５９ＬＣと融合した別の一連のＧＬＰ−１ペプチドを用いて、別の一連の試験を行った。試験された抗体融合体は以下のＧＬＰ−１ペプチドを含んだ：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）（配列番号１２６）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）（配列番号３１）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）（配列番号２９）およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）（配列番号２８）。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９ ＩｇＧ２重鎖と組み合わせ、以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２。この例における投与量は１ｍｇ／ｋｇであった。   Another series of tests was performed with another series of GLP-1 peptides fused to AG159LC. The antibody fusions tested included the following GLP-1 peptides: GLP (A2G) (SEQ ID NO: 126), GLP (A2G / G31N / + G32 / + T33) (SEQ ID NO: 31), GLP (A2G / G29N / G31) / T) (SEQ ID NO: 29) and GLP (A2G / K28N / R30T) (SEQ ID NO: 28). These LC fusions were combined with AG159 IgG2 heavy chain to give the following antibodies (these tests were performed): GLP (A2G) -AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G / G31N / + G32 / + T33) -AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G / G29N / G31 / T) -AG159LC: AG159 IgG2 and GLP (A2G / K28N / R30T) -AG159LC: AG159 IgG2. The dose in this example was 1 mg / kg.

図５において認められるように、各被験類似体では、血中グルコースは単回注射後の最初の６時間低下し、単回注射の２４時間後にベースラインに戻った。最大効果は単回注射の４〜６時間後に認められた。   As can be seen in FIG. 5, for each test analog, blood glucose dropped for the first 6 hours after a single injection and returned to baseline 24 hours after the single injection. Maximum effect was observed 4-6 hours after a single injection.

実施例９：応答曲線
実施例３に記載したようなｄｂ／ｄｂマウスを用いてインビボでの用量応答測定を行った。一試験で用いた組成物はＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）がＡＧ１５９のＬＣと融合した組成物であり、抗体ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２を得た（配列については表８を参照）。投与量は７ｕｇ、１２ｕｇまたは２５ｕｇであった。 Example 9: Response curve In vivo dose response measurements were performed using db / db mice as described in Example 3. The composition used in one test was a composition in which GLP-1 (A2G) was fused with the LC of AG159, and antibody GLP (A2G) -AG159LC: AG159 IgG2 was obtained (see Table 8 for sequences). The dose was 7 ug, 12 ug or 25 ug.

図６において認められるように、血中グルコース濃度は用量依存的に低下することが見出された。これらの結果は組成物が作用機序に基づいて作用するということも示している。   As can be seen in FIG. 6, the blood glucose concentration was found to decrease in a dose-dependent manner. These results also indicate that the composition works based on the mechanism of action.

ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）類似体（配列番号４）をＡＧ１５９ ＬＣと融合し、抗体ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＨＣ ＩｇＧ２が得られた組成物を用いて、正常マウスにおいて別の用量応答試験を行った。この組成物の用量応答は、グルコース負荷試験（図７）時のグルコース注射後３０分時点ならびに抗体組成物の注射後２４および４８時間後でより明らかであった。この用量応答は正常血糖マウスにおいて実施したため、多少、最小限の効果である。高血糖動物モデル（ｄｂ／ｄｂマウス）においてよりも、血中グルコースが正常な動物モデルにおいて血中グルコースを低下させることはより手腕が問われる。   Another dose response study in normal mice using a composition in which a GLP (A2G / R30G) analog (SEQ ID NO: 4) was fused with AG159 LC and the antibody GLP (A2G / R30G) AG159LC: AG159 HC IgG2 was obtained. Went. The dose response of this composition was more apparent at 30 minutes after glucose injection during the glucose tolerance test (FIG. 7) and 24 and 48 hours after injection of the antibody composition. Since this dose response was performed in normoglycemic mice, it was somewhat minimally effective. Lowering blood glucose in an animal model with normal blood glucose is more challenging than in a hyperglycemic animal model (db / db mouse).

実施例１０：ＬＣ対ＨＣと融合したＧＬＰ−１のインビボでの比較
この試験は、ＧＬＰ−１化合物のＡＧ１５９のＬＣまたはＨＣへの結合が活性差をもたらすかを判定するように設計した。被験構築物は、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）をＡＧ１５９のＬＣまたはＨＣのいずれかに結合し、以下の２つの抗体構築物ＧＬＰ（Ａ２Ｇ） ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＬＣ）およびＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ−１−ＡＧ１５９ ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＨＣ）として得られたものであった。図８において認められるように、両構築物は血中グルコース濃度を低下させるのに本質的に同等に有効であった。 Example 10: In Vivo Comparison of GLP-1 Fused with LC vs. HC This test was designed to determine whether binding of GLP-1 compound to AG159 LC or HC resulted in a difference in activity. The test constructs bound GLP (A2G) to either AG159 LC or HC, and the following two antibody constructs GLP (A2G) AG159LC: AG159 IgG2 (GLP (A2G) -AG159 LC) and AG159LC: GLP-1 -It was obtained as AG159 IgG2 (GLP (A2G) -AG159 HC). As can be seen in FIG. 8, both constructs were essentially equally effective in reducing blood glucose levels.

実施例１０：細身マウスＧＴＴ試験
ＧＬＰ−１類似体Ａ２Ｇ／Ｒ３０ＧをＡＧ１５９と融合して抗体構築物ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＨＣ ＩｇＧ２または単にＲ３０Ｇとして得られた融合タンパク質に関して別の試験を行った（配列については表１および７を参照）。この試験は、Ｒ３０Ｇが正常マウスにおいて長期間、血中グルコースを低下し得るかを判定するために行った。有効性枠に関する読み取りを増加できるように、試験設計にグルコース負荷試験を加えた。 Example 10: Slender mouse GTT test GLP-1 analog A2G / R30G was fused with AG159 to perform another test on the fusion protein obtained as antibody construct GLP (A2G / R30G) AG159LC: AG159 HC IgG2 or simply R30G. (See Tables 1 and 7 for sequences). This test was performed to determine whether R30G can lower blood glucose in normal mice for long periods of time. A glucose tolerance test was added to the study design so that the reading on the efficacy window could be increased.

Ｃ５７Ｂ１６マウスを体重に関して無作為化した。午前９時の採血を行ってベースライン血中グルコース濃度を定量し、それからＲ３０ＧまたはＰＢＳを投与した。４〜５時間の絶食後、投与量２ｇ／ｋｇを用いて腹腔内グルコース負荷試験を行った。血中グルコース濃度は、グルコース負荷後３０分および９０分時ならびに血中グルコース濃度が初期値に回復するまで２４時間毎に測定した。図９に示すように、Ｒ３０Ｇ組成物を用いた処置により、耐糖能が向上した。   C57B16 mice were randomized with respect to body weight. Blood was collected at 9 am to quantify baseline blood glucose levels, and then R30G or PBS was administered. After fasting for 4-5 hours, an intraperitoneal glucose tolerance test was performed using a dose of 2 g / kg. The blood glucose concentration was measured at 30 and 90 minutes after glucose loading and every 24 hours until the blood glucose concentration returned to the initial value. As shown in FIG. 9, glucose tolerance was improved by treatment with the R30G composition.

実施例１２：多回投与試験
あるＧＬＰ−１化合物に関する問題点は、多回注射後に有効性を失いうるということである（タキフィラキシーの判定）。ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＨＣ ＩｇＧ２抗体または単にＲ３０Ｇを用いて別の試験を行い、それがこの分子にも当てはまるかを判定した。実施例５に記載のように、１日目に細身マウスにおいてＲ３０Ｇを注射した。１回目の注射の４時間後、最大有効性を示すためにグルコース負荷試験を行った。２日および３日目のビヒクルまたは化合物を注射した。４日目にビヒクルまたは化合物の注射の４時間後、２回目のグルコース負荷試験を行った。 Example 12: Multiple dose study A problem with certain GLP-1 compounds is that they can lose efficacy after multiple injections (determination of tachyphylaxis). Another test was performed using GLP (A2G / R30G) AG159LC: AG159 HC IgG2 antibody or simply R30G to determine if it applies to this molecule. As described in Example 5, R30G was injected on day 1 in slender mice. A glucose tolerance test was performed 4 hours after the first injection to show maximum efficacy. Day 2 and day 3 vehicles or compounds were injected. On day 4, a second glucose tolerance test was performed 4 hours after vehicle or compound injection.

図１０に示すように、顕著なタキフィラキシーが認められないことは明らかであった。従って、Ｒ３０Ｇは１回目のグルコース負荷試験時と同様に、２回目のグルコース負荷試験時に血中グルコースを低下させるのに有効であった。   As shown in FIG. 10, it was clear that no significant tachyphylaxis was observed. Therefore, R30G was effective in lowering blood glucose during the second glucose tolerance test, as in the first glucose tolerance test.

本明細書で述べた実施例および実施形態は単に例示を目的とするものであり、また、それらに照らした種々の改変または変更は当業者に示唆されるものであって、本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであると理解される。本明細書で引用した文献、特許および特許出願はすべて、個々の文献、特許または特許出願が参考としてそのように援用されることを具体的かつ個別的に示唆されるかのようにと同じ程度に、あらゆることを目的としてそれらの全体が参考として本明細書に援用される。   The examples and embodiments described herein are for illustrative purposes only, and various modifications or changes in light of them are suggested to those skilled in the art and are within the spirit and scope of the present application. As well as within the scope of the appended claims. All documents, patents, and patent applications cited herein are to the same extent as if each document, patent or patent application was specifically and individually suggested to be incorporated by reference. Are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.

グルカゴン存在下でＧＬＰ−１受容体結合特性を維持し得るかを判定するためのＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）構築物のアッセイを示すグラフである。０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭのグルカゴンを加え、実施例に記載のようにリガンド結合アッセイを行った。FIG. 6 is a graph showing an assay of a GLP (A2G) -AG159LC: AG159 IgG2 (GLP (A2G) -AG159) construct to determine whether it can maintain GLP-1 receptor binding properties in the presence of glucagon. 0 nM, 1 nM, 10 nM or 100 nM glucagon was added and the ligand binding assay was performed as described in the Examples. グルカゴン存在下でのＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を判定するためのアッセイを示すグラフである。このグラフではグルカゴン単独による（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９を含まない）ＧＬＰ−１受容体の活性化の用量応答曲線も示している（−−−−−）。FIG. 2 is a graph showing an assay for determining GLP-1 receptor agonist activity of GLP (A2G) -AG159LC: AG159 IgG2 (GLP (A2G) -AG159) in the presence of glucagon. The graph also shows a dose response curve for activation of the GLP-1 receptor (without GLP (A2G) -AG159) by glucagon alone (-----). ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）の存在が、グルカゴンに誘発される活性を用量依存的に低下させることを示すグラフである。FIG. 6 is a graph showing that the presence of GLP (A2G) -AG159LC: AG159 IgG2 (GLP (A2G) -AG159) reduces glucagon-induced activity in a dose-dependent manner. ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）がＡＧ１５９の軽鎖と融合した構築物）および他の種々の抗体融合体の結果を示すグラフである。抗体融合体は、ＡＧ１５９の軽鎖（ＬＣ）と融合した以下のＧＬＰ−１ペプチド：Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ（配列番号２８）、Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ（配列番号２３）、Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号９）およびＡ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号１２）；を含んだ。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９ ＩｇＧ２重鎖と対にして以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２。投与量は１２ｕｇ／マウスであった。FIG. 5 is a graph showing the results of GLP (A2G) -AG159LC: AG159 IgG2 (construct in which GLP (A2G) is fused to the light chain of AG159) and various other antibody fusions. The antibody fusion consists of the following GLP-1 peptides fused to the light chain (LC) of AG159: A2G / K28N / R30T (SEQ ID NO: 28), A2G / Q17N / A19T (SEQ ID NO: 23), A2G / V10Q / V27Q ( SEQ ID NO: 9) and A2G / W25Q / V27Q (SEQ ID NO: 12). These LC fusions were paired with AG159 IgG2 heavy chain to give the following antibodies (these tests were performed): GLP (A2G / K28N / R30T) -AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G / Q17N / A19T) -AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G / V10Q / V27Q)-AG159LC: AG159 IgG2 and GLP (A2G / W25Q / V27Q)-AG159LC: AG159 IgG2. The dose was 12 ug / mouse. 、血中グルコースが、試験された組成物の各々について、単回注射後の最初の６時間低下し、単回注射の２４時間後にベースライン濃度に戻ったことを示すグラフである。試験された抗体融合体はＡＧ１５９の軽鎖（ＬＣ）と融合した以下のＧＬＰ−１ペプチド：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）（配列番号１２６）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）（配列番号３１）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）（配列番号２９）およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）（配列番号２８）；を含んだ。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９ ＩｇＧ２重鎖と対にして以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２。FIG. 5 is a graph showing that blood glucose dropped for the first 6 hours after a single injection and returned to baseline concentration 24 hours after a single injection for each of the compositions tested. The antibody fusions tested were the following GLP-1 peptides fused with the light chain (LC) of AG159: GLP (A2G) (SEQ ID NO: 126), GLP (A2G / G31N / + G32 / + T33) (SEQ ID NO: 31), GLP (A2G / G29N / G31 / T) (SEQ ID NO: 29) and GLP (A2G / K28N / R30T) (SEQ ID NO: 28); These LC fusions were paired with AG159 IgG2 heavy chain to give the following antibodies (these tests were performed): GLP (A2G) -AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G / G31N / + G32 / + T33) -AG159LC : AG159 IgG2, GLP (A2G / G29N / G31 / T) -AG159LC: AG159 IgG2 and GLP (A2G / K28N / R30T) -AG159LC: AG159 IgG2. ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２が用量依存的に血中グルコース濃度を低下させたことを示すグラフである。It is a graph which shows that GLP (A2G) -AG159LC: AG159 IgG2 reduced the blood glucose level in a dose-dependent manner. ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）がＡＧ１５９の軽鎖と融合し、そしてＡＧ１５９の重鎖と対になって抗体融合ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２を与える組成物を用いてグルコース負荷試験によってチャレンジされた正常マウスにおいて行われた、用量応答試験を示すグラフである。GLP (A2G / R30G) is fused with the light chain of AG159 and challenged by a glucose tolerance test with a composition that pairs with the heavy chain of AG159 to give the antibody fusion GLP (A2G / R30G) -AG159LC: AG159 IgG2 2 is a graph showing a dose response test performed in normal mice. 生じる抗体がそれぞれ、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２（図８ではＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＬＣと称される）およびＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＩｇＧ２（図８ではＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ ＨＣと称される）であるように、ＡＧ１５９のＬＣまたはＨＣのいずれかに対するＧＬＰ（Ａ２Ｇ）の結合における活性差を示すグラフである。両構築物は血中グルコース濃度を低下させるのに同等に有効であった。The resulting antibodies are GLP (A2G) -AG159LC: AG159 IgG2 (referred to in FIG. 8 as GLP (A2G) -AG159 LC) and AG159LC: GLP (A2G) -AG159 IgG2 (in FIG. 8, GLP (A2G) -AG159). (Referred to as HC) is a graph showing the difference in activity of GLP (A2G) binding to either AG159 LC or HC. Both constructs were equally effective in reducing blood glucose levels. ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２で処置されたマウスにおける血中グルコース濃度を示すグラフである。血中グルコースは、血中グルコース濃度が初期値に戻るまで、グルコース負荷試験の間において２４時間毎に測定した。FIG. 2 is a graph showing blood glucose concentration in mice treated with GLP (A2G / R30G) AG159LC: AG159 IgG2. Blood glucose was measured every 24 hours during the glucose tolerance test until the blood glucose concentration returned to the initial value. ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９ ＩｇＧ２で処置されたマウスにおけるタキフィラキシー試験の結果を示すグラフである。FIG. 6 is a graph showing the results of tachyphylaxis test in mice treated with GLP (A2G / R30G) AG159LC: AG159 IgG2. グルカゴン刺激性レポーター活性のＡＧ１５９による中和を示すグラフである。It is a graph which shows neutralization by AG159 of glucagon stimulation reporter activity. ＡＧ１５９がヒトグルカゴン受容体に対する１２５Ｉ−グルカゴンの結合を破壊することを示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing that AG159 disrupts 125 I-glucagon binding to the human glucagon receptor. ＡＧ１５９がｏｂ／ｏｂマウスにおいて血中グルコース低下させることを示すグラフである。It is a graph which shows that AG159 reduces blood glucose in an ob / ob mouse | mouth.

Claims (47)

（ａ）グルカゴンに結合する抗体と、
（ｂ）グルカゴンに結合する該抗体に結合したＧＬＰ−１化合物と
を含み、該ＧＬＰ−１化合物がＧＬＰ−１活性を有する、組成物。 (A) an antibody that binds to glucagon;
(B) a composition comprising a GLP-1 compound bound to the antibody that binds to glucagon, wherein the GLP-1 compound has GLP-1 activity. 前記抗体が中和抗体である、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the antibody is a neutralizing antibody. （ａ）前記抗体が、（ｉ）重鎖可変領域および（ｉｉ）軽鎖可変領域を含み、
（ｂ）前記ＧＬＰ−１化合物が、該重鎖可変領域または該軽鎖可変領域に結合される、請求項１に記載の組成物。 (A) the antibody comprises (i) a heavy chain variable region and (ii) a light chain variable region;
(B) The composition of claim 1, wherein the GLP-1 compound is bound to the heavy chain variable region or the light chain variable region. 前記ＧＬＰ−１化合物が前記軽鎖可変領域に結合される、請求項３に記載の組成物。 4. The composition of claim 3, wherein the GLP-1 compound is bound to the light chain variable region. 前記ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端が、前記軽鎖可変領域のアミノ末端に結合される、請求項４に記載の組成物。 5. The composition of claim 4, wherein the carboxy terminus of the GLP-1 compound is linked to the amino terminus of the light chain variable region. 前記ＧＬＰ−１化合物と前記軽鎖可変領域とがリンカーによって結合される、請求項３に記載の組成物。 4. The composition of claim 3, wherein the GLP-1 compound and the light chain variable region are joined by a linker. 前記ＧＬＰ−１化合物が前記重鎖可変領域に結合される、請求項３に記載の組成物。 4. The composition of claim 3, wherein the GLP-1 compound is bound to the heavy chain variable region. 前記ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端が、前記重鎖可変領域のアミノ末端に結合される、請求項７に記載の組成物。 8. The composition of claim 7, wherein the carboxy terminus of the GLP-1 compound is linked to the amino terminus of the heavy chain variable region. 前記ＧＬＰ−１化合物と前記重鎖可変領域とがリンカーによって結合される、請求項８に記載の組成物。 9. The composition of claim 8, wherein the GLP-1 compound and the heavy chain variable region are linked by a linker. 前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とが化学的結合体化により結合される、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the antibody and the GLP-1 compound are bound by chemical conjugation. 前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とが合成リンカーを介して結合される、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the antibody and the GLP-1 compound are linked via a synthetic linker. 前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とがペプチドリンカーを介して結合される、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the antibody and the GLP-1 compound are bound via a peptide linker. 前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とが融合タンパク質を形成する、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the antibody and the GLP-1 compound form a fusion protein. 前記抗体が複数のＧＬＰ−１化合物に結合される、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein the antibody is bound to a plurality of GLP-1 compounds. 前記抗体が多数の異なるＧＬＰ−１化合物に結合される、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein the antibody is conjugated to a number of different GLP-1 compounds. 前記ＧＬＰ−１化合物が、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein the GLP-1 compound comprises a GLP-1 peptide having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 1 and having GLP-1 activity. 前記ＧＬＰ−１化合物が、５以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の組成物。 17. The composition of claim 16, wherein the GLP-1 compound has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 comprising 5 or fewer conservative amino acid substitutions. 前記ＧＬＰ−１化合物がエキセンジン分子を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the GLP-1 compound comprises an exendin molecule. 前記ＧＬＰ−１化合物がエキセンジン３またはエキセンジン４を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the GLP-1 compound comprises exendin 3 or exendin 4. 前記ＧＬＰ−１化合物が、エキセンジン−３またはエキセンジン−４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein the GLP-1 compound has at least 90% sequence identity with exendin-3 or exendin-4. 前記ＧＬＰ−１化合物が、式Ｉのアミノ酸配列（配列番号９２）
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１（式Ｉ、配列番号９２）
（式中、
Ｒ１はＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
位置１におけるＸａａは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンであり；
位置２におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ｂＡｌａ（２−アミノプロピオン酸）、Ａｓｐ、Ａｌａ、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、２−アミノイソ酪酸またはα−α−二置換アミノ酸であり；
位置３におけるＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり；
位置５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置６におけるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
位置７におけるＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり；
位置８におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置９におけるＸａａは、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり；
位置１０におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
位置１１におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置１２におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１３におけるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１４におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１５におけるＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１６におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１７におけるＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１８におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１９におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２０におけるＸａａは、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２１におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２２におけるＸａａは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２３におけるＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２４におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２５におけるＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２６におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置２７におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２８におけるＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
位置２９におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３０におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
位置３１におけるＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３２におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓであるか、あるいは省略され；
位置３３におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであるか、あるいは省略され；
位置３４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｔｈｒであるか、あるいは省略され；
位置３５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３６におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３７におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
但し、位置３２、３３、３４、３５、３６または３７におけるアミノ酸が省略される場合、該アミノ酸の各アミノ酸下流も省略される）
を含むＧＬＰ−１ペプチドを含み、該化合物が、ＧＬＰ−１活性を有する、請求項に記載の組成物。 The GLP-1 compound has the amino acid sequence of Formula I (SEQ ID NO: 92)
Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Xaa 4 -Xaa 5 -Xaa 6 -Xaa 7 -Xaa 8 -Xaa 9 -Xaa 10 -Xaa 11 -Xaa 12 -Xaa 13 -Xaa 14 -Xaa 15 -Xaa 16 -Xaa 17 -Xaa 18 -Xaa 19 -Xaa 20 -Xaa 21 -Xaa 22 -Xaa 23 -Xaa 24 -Xaa 25 -Xaa 26 -Xaa 27 -Xaa 28 -Xaa 29 -Xaa 30 -Xaa 31 -Xaa 32 -Xaa 33 -Xaa 34 -Xaa 35 -Xaa 36 -Xaa 37 -C (O) -R 1 (Formula I, SEQ ID NO: 92)
(Where
R 1 is OR 2 or NR 2 R 3 ;
R 2 and R 3 are independently hydrogen or (C 1 -C 8 ) alkyl;
Xaa at position 1 is L-histidine, D-histidine, desamino-histidine, 2-amino-histidine, 3-hydroxy-histidine, homohistidine, α-fluoromethyl-histidine or α-methyl-histidine;
Xaa at position 2 is Gly, bAla (2-aminopropionic acid), Asp, Ala, 1-amino-cyclopentanecarboxylic acid, 2-aminoisobutyric acid or α-α-disubstituted amino acid;
Xaa at position 3 is Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 4 is Gly, Thr or His;
Xaa at position 5 is Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 6 is His, Trp, Phe or Tyr;
Xaa at position 7 is Thr or Gly;
Xaa at position 8 is Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 9 is Asp, Asn or Glu;
Xaa at position 10 is Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp or Lys;
Xaa at position 11 is Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 12 is Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid Or homoglutamic acid;
Xaa at position 13 is Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 14 is Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr, Asn, Gln, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid or Homoglutamic acid;
Xaa at position 15 is Glu, Asp, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 16 is Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid Yes;
Xaa at position 17 is Gln, Asn, Arg, Glu, Asp, Lys, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 18 is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homo Glutamic acid;
Xaa at position 19 is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid Yes;
Xaa at position 20 is Lys, homolysine, Arg, Gln, Glu, Asp, Thr, His, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 21 is Leu, Glu, Asp, Thr, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 22 is Phe, Trp, Asp, Glu, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 23 is Ile, Leu, Val, Ala, Phe, Asp, Glu, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 24 is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Lys, homolysine, ornithine, 4-carboxy-phenylalanine, β-glutamic acid, β-homoglutamic acid or homoglutamic acid;
Xaa at position 25 is Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp, Asn or Lys;
Xaa at position 26 is Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 27 is Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp, Asn or Lys;
Xaa at position 28 is Asn, Lys, Arg, Glu, Asp or His;
Xaa at position 29 is Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 30 is Gly, Arg, Lys, Glu, Asp, Thr, Asn or His;
Xaa at position 31 is Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys;
Xaa at position 32 is Thr, Gly, Asn, Ser, Lys or omitted;
Xaa at position 33 is Gly, Asn, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Leu, Phe, Pro or omitted;
Xaa at position 34 is Gly, Thr or omitted;
Xaa at position 35 is Thr, Asn, Gly or is omitted;
Xaa at position 36 is Gly or omitted;
Xaa at position 37 is Gly or omitted;
(However, when an amino acid at position 32, 33, 34, 35, 36 or 37 is omitted, each amino acid downstream of the amino acid is also omitted.)
The composition of claim 1, wherein the compound has GLP-1 activity. 前記ＧＬＰ−１化合物が、５以下の保存的アミノ酸置換を含む、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。 24. The GLP-1 compound of claim 21, comprising a GLP-1 peptide comprising any amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-35, SEQ ID NO: 126 or SEQ ID NO: 127, comprising no more than 5 conservative amino acid substitutions. Composition. 前記ＧＬＰ−１化合物が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。 23. The composition of claim 21, wherein the GLP-1 compound comprises a GLP-1 peptide comprising any amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-35, SEQ ID NO: 126 or SEQ ID NO: 127. 前記抗体が：
（ａ）配列番号７９と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；あるいは
（ｂ）配列番号８３と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；あるいは
（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨ
を含む、請求項１に記載の組成物。 The antibody is:
(A) a light chain variable region (VL) having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 79; or (b) a heavy chain variable region (VH) having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 83; or (C) VL of (a) and VH of (b)
The composition of claim 1 comprising: 前記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、請求項２４に記載の組成物。 25. The composition of claim 24, wherein the antibody consists of two identical VHs and two identical VLs. 前記抗体が、配列番号７９と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬおよび配列番号８３と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨを含む、請求項２４に記載の組成物。 25. The composition of claim 24, wherein the antibody comprises a VL having at least 95% sequence identity with SEQ ID NO: 79 and a VH having at least 95% sequence identity with SEQ ID NO: 83. 前記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、請求項２６に記載の組成物。 27. The composition of claim 26, wherein the antibody consists of two identical VHs and two identical VLs. 前記抗体が、配列番号７９のアミノ酸配列を有するＶＬおよび配列番号８３のアミノ酸配列を有するＶＨを含む、請求項２４に記載の組成物。 25. The composition of claim 24, wherein the antibody comprises a VL having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and a VH having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83. 前記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、請求項２８に記載の組成物。 29. The composition of claim 28, wherein the antibody consists of two identical VHs and two identical VLs. 前記抗体が：
（ａ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｂ）配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖；あるいは
（ｃ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、請求項１に記載の組成物。 The antibody is:
(A) a light chain comprising any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 40-81;
(B) a heavy chain comprising any amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 or 82-91; or (c) a light chain comprising any amino acid sequence of SEQ ID NO: 40-81 and any amino acid of SEQ ID NO: 39 or 82-91 The composition of claim 1 comprising a heavy chain comprising a sequence. 前記抗体が二本の同一軽鎖および二本の同一重鎖からなる、請求項３０に記載の組成物。 32. The composition of claim 30, wherein the antibody consists of two identical light chains and two identical heavy chains. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１、２４または３０に記載の組成物。 31. The composition of claim 1, 24 or 30, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 前記抗体が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または（Ｆａｂ’）２である、請求項１、２４または３０に記載の組成物。 31. The composition of claim 1, 24 or 30, wherein the antibody is scFv, Fab, Fab ′, or (Fab ′) 2 . 前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１、２４または３０に記載の組成物。 31. The composition of claim 1, 24 or 30, wherein the antibody is a human antibody or a humanized antibody. ＧＬＰ−１ペプチドに結合されたグルカゴン結合抗体軽鎖可変領域を含む、ポリペプチド。 A polypeptide comprising a glucagon-binding antibody light chain variable region conjugated to a GLP-1 peptide. 配列番号４１〜７４または１２９の任意のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のポリペプチド。 36. The polypeptide of claim 35, comprising any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 41-74 or 129. 請求項３６に記載のポリペプチドを含む、グルカゴンに結合する抗体。 An antibody that binds to glucagon, comprising the polypeptide of claim 36. ＧＬＰ−１化合物に結合されたグルカゴン結合抗体重鎖可変領域を含む、ポリペプチド。 A polypeptide comprising a glucagon-binding antibody heavy chain variable region conjugated to a GLP-1 compound. 配列番号１２８のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のポリペプチド。 40. The polypeptide of claim 38, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128. 請求項３９に記載のポリペプチドを含む、グルカゴンに結合する抗体。 An antibody that binds to glucagon, comprising the polypeptide of claim 39. 医薬的に許容可能な担体ならびに有効量の請求項１、２４または３０に記載の組成物を含む、医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an effective amount of the composition of claim 1, 24 or 30. 代謝障害を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の請求項４１に記載の医薬組成物を該被験体に投与する工程を含み、該代謝障害が、糖尿病、肥満症および代謝症候群の群から選択される、方法。 42. A method for treating a subject having a metabolic disorder, comprising the step of administering to said subject an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 41, wherein said metabolic disorder comprises diabetes, obesity and metabolism. A method selected from the group of syndromes. 被験体においてインスリンの発現を増強するための方法であって、有効量の請求項４１に記載の医薬組成物を該被験体に投与する工程を含む、方法。 42. A method for enhancing insulin expression in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 41. 被験体においてインスリン分泌を促進するための方法であって、有効量の請求項４１に記載の医薬組成物を該被験体に投与する工程を含む、方法。 42. A method for promoting insulin secretion in a subject comprising administering to the subject an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 41. 代謝障害を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の請求項１、２４または３０に記載の組成物を該被験体に投与する工程を含み、該代謝障害が、糖尿病、肥満症および代謝症候群の群から選択される、方法。 A method for treating a subject having a metabolic disorder comprising the step of administering to said subject an effective amount of the composition of claim 1, 24 or 30, wherein said metabolic disorder comprises diabetes, obesity Selected from the group of diseases and metabolic syndrome. 被験体においてインスリンの発現を増強するための方法であって、有効量の請求項１、２４または３０に記載の組成物を該被験体に投与する工程を含む、方法。 32. A method for enhancing insulin expression in a subject, comprising administering an effective amount of the composition of claim 1, 24 or 30 to the subject. 被験体においてインスリン分泌を促進するための方法であって、有効量の請求項１、２４または３０に記載の組成物を該被験体に投与する工程を含む、方法。 32. A method for promoting insulin secretion in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the composition of claim 1, 24 or 30.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016523900A (en) * 2013-06-24 2016-08-12 ハンファ ケミカル コーポレーションＨａｎｗｈａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Antibody-drug conjugates with improved stability and uses thereof
JP2019500013A (en) * 2015-10-28 2019-01-10 ユーハン・コーポレイションＹＵＨＡＮ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Dual function protein and pharmaceutical composition comprising the same
US11560416B2 (en) 2017-04-21 2023-01-24 Yuhan Corporation Method for producing dual function proteins and its derivatives

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010122090A1 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Glaxo Group Limited Fgfr1c antibody combinations
ES2625735T3 (en) 2009-12-16 2017-07-20 Novo Nordisk A/S GLP-1 analogs and derivatives
JP2013529076A (en) 2010-05-11 2013-07-18 アベオ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Anti-FGFR2 antibody
CN102718858B (en) * 2011-03-29 2014-07-02 天津药物研究院 Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analogue monomer and dimer, preparation method therefor and application thereof
EP2785740A1 (en) 2011-12-02 2014-10-08 Eli Lilly and Company Anti-glucagon antibodies and uses thereof
KR20170062466A (en) 2014-09-16 2017-06-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Anti-glucagon antibodies and uses thereof
KR20190044079A (en) 2016-08-30 2019-04-29 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Methods for the treatment of severe insulin resistance by interfering with glucagon receptor signaling
US20190248888A1 (en) 2016-10-20 2019-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of lowering blood glucose levels
EP3672620A1 (en) 2017-08-22 2020-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating urea cycle disorders by interfering with glucagon receptor signaling
CN110357959B (en) * 2018-04-10 2023-02-28 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 GCGR antibody, fusion protein of GCGR antibody and GLP-1, and pharmaceutical composition and application of GCGR antibody and fusion protein

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5424286A (en) * 1993-05-24 1995-06-13 Eng; John Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same
JP2003522099A (en) * 1998-02-27 2003-07-22 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ GLP-1 derivative of GLP-1 having a delayed action profile and exendin
EP1572892A4 (en) * 2001-10-18 2007-08-22 Bristol Myers Squibb Co Human glucagon-like-peptide-1 mimics and their use in the treatment of diabetes and related conditions

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016523900A (en) * 2013-06-24 2016-08-12 ハンファ ケミカル コーポレーションＨａｎｗｈａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Antibody-drug conjugates with improved stability and uses thereof
JP2019500013A (en) * 2015-10-28 2019-01-10 ユーハン・コーポレイションＹＵＨＡＮ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Dual function protein and pharmaceutical composition comprising the same
US11560416B2 (en) 2017-04-21 2023-01-24 Yuhan Corporation Method for producing dual function proteins and its derivatives

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