JP2009528055A - Ａｄｉｒ関連遺伝子多型とその適用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、幹細胞移植、免疫療法及び腫瘍性疾患の予防の分野に関する。天然発生するｈＡＤＩＲアレルの転写物のヌクレオチド配列に存在するオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記アミノ酸配列がＭＨＣクラスＩ又はIIの副組織適合結合ペプチドを含むペプチドを提供する。
Description
本発明は、医療分野に関し、より詳しくは、幹細胞移植と、免疫療法と、腫瘍性疾患の予防とに関する。
同種幹細胞移植（ＳＣＴ）は、血液がんの患者の根治治療の実現可能性を秘めている。（非特許文献１及び２参照）。化学療法や、移植前のレジメンの調整として患者に施療される抗体治療及び／又は放射線治療の抗がん効果に加え、同種移植片対腫瘍（allogeneic graft versus tumor）（ＧｖＴ）免疫反応性は、かかる治療における根治治療の実現可能性に顕著に寄与するものである（非特許文献３及び４参照）。ＨＬＡがマッチしたＳＣＴ後のＧｖＴ反応性は、ドナー由来のＴ細胞により仲介されることが示されてきた（非特許文献４参照）。
ドナー由来のアロ反応性Ｔ細胞（Alloreactive T-cells）は、有益なＧｖＴ効果を仲介するだけでなく、同種ＳＣＴ後に重大な悪影響をもたらす合併症である、移植片対宿主拒絶反応（ＧｖＨＤ）の発生の原因ともなる（非特許文献５参照）。幹細胞移植片のＴ細胞が欠乏すると、ＧｖＨＤとＧｖＴの双方の効果が排除される（非特許文献６及び７参照）。抗腫瘍反応は、ドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）による移植後の再発性悪性血液疾患の場合に再導入することもできる。ＤＬＩの施療が延期されることは、深刻なＧｖＨＤのリスクの軽減と関連付けられてきたが、ＧｖＴとＧｖＨＤの両方とも、ＤＬＩに応答する患者において未だしばしば関連があるとされる（非特許文献８及び９参照）。臨床的観察によれば、著しい抗腫瘍効果は、しばしばＧｖＨＤに関連付けられるが、ＧｖＨＤ非存在下でも、よりわずかな抗腫瘍反応性も観察されうることが示されている（非特許文献１０参照）。
ＨＬＡがマッチした同種ＳＣＴ後のＧｖＨＤとＧｖＴの両方の反応性の主要な標的は、副組織適合抗原（minor histocompatibility antigens）（ｍＨａｇ）である（非特許文献１１参照）。副組織適合抗原（ｍＨａｇ）は、被検者のゲノムの遺伝子多型による異なるアミノ酸組成物を含む細胞タンパク質に由来する免疫原性ペプチドに含まれるエピトープである。ｍＨａｇは、それゆえ、「自己（self）」のＨＬＡ分子との関連において認識される、ドナーとレシピエントにより異なった形で発現されるペプチドである。ｍＨａｇは、タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子多型によるペプチドの相違のあるプロセッシングにより、ＨＬＡ分子に存在するペプチド配列における直接的な遺伝子多型により、又は、ドナーとアクセプターにおけるＨＬＡ分子における相違、すなわち「非自己（non-self）」の関連における同一ペプチドの認識により生じることもある。同種のＨＬＡがマッチした幹細胞移植（ＳＣＴ）のドナーとレシピエント間のｍＨａｇにおける差異が、移植片対白血病／リンパ腫（ＧＶＬ）反応性を含む、所望されていない移植片拒絶若しくは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ)、及び所望されている移植片対腫瘍（ＧＶＴ）を含む、同種免疫応答に関与するｍＨａｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激を導く。
ｍＨａｇに対する免疫応答の臨床症状は、かかる抗原をコードするタンパク質の組織特異的発現により測定することができる。多数の組織で構成的に発現するｍＨａｇは、組み合わされたアロ反応性のＧｖＨＤとＧｖＬの応答の標的として提案されてきた（非特許文献１２及び１３参照）。造血器起源の悪性細胞を含む、造血細胞系列に限定される抗原に対して指示されるＴ細胞応答は、深刻なＧｖＨＤなしにＧＶＴ反応性（非特許文献１４〜１８参照）を仲介することができる。しかしながら、一定の条件下で、様々な組織において広範に発現しうる抗原は、別の条件下では、比較的特異的なＧｖＴ応答の標的となりうる（非特許文献１０及び１９参照）。特に、免疫応答が、様々な組織で広範に発現しているｍＨａｇｓに対して指示される場合には、ＧＶＴ反応性の誘導は、ＧＶＨＤの進展と一致する場合もある。ＧＶＴは、標的構造に対して特異的、又は腫瘍細胞で過剰発現されるＴ細胞の誘導により、ＧＶＨＤから分離することができる。さらに、ＨＡ−１（非特許文献１６参照）、ＨＡ−２（非特許文献２０及び２１参照）、及びＢＣＬ２Ａ１（非特許文献１４参照）などの造血起源の細胞に発現が限定されている抗原は、ＧＶＴの特異的な標的として供してもよい。これらの抗原に特異的なＴ細胞は、レシピエント起源の造血システムの、悪性及び通常の細胞の両方を破壊するものである。同種ＳＣＴ後、造血幹細胞は、これらのＴ細胞により認識されないドナー由来の細胞によって代替されたので、患者の通常のドナー造血が、影響を受けることはない。
腫瘍関連抗原の同定と、腫瘍特異的免疫応答に対する理解の高まりは、がん治療の戦略としての細胞免疫療法を進展させるための新たな可能性を提供するものである。しかしながら、多くの臨床試験の結果は、限られた数の患者においてのみ臨床反応が観察されたので、納得の行かないものであった（非特許文献２２及び２３参照）。ワクチン接種プロトコルは、がん患者の全生存率の改善を導くものではなかった。これらのワクチン接種戦略の主要な障害は、ほとんどの場合、未変異自己タンパク質が標的になっていることにある。患者においては、これらの自己抗原に特異的なＴ細胞は、おそらくアネルギー（anergic）で、寛容化されており、又は末梢部若しくは中央部の選定過程（peripheral or central selection process）により低親和性である。それゆえ、ＧｖＨＤの存在下又は非存在下において同種ＳＣＴ後の細胞免疫療法介入に最適に応答する患者由来のｍＨａｇの特性解析は、ＧｖＨＤとＧｖＬの発症機序のよりよい理解を導き、特異的な抗腫瘍Ｔ細胞治療、抗原及び薬剤の開発を導きうるものである。
血液腫瘍を根絶できる高結合性（high-avidity）Ｔ細胞応答は、同種セッティングにおいて作製できる。悪性血液疾患においては、同種ＨＬＡがマッチした造血幹細胞移植(ＳＣＴ)は、Ｔ細胞−仲介移植片対腫瘍（ＧＶＴ）免疫応答の誘導による同種免疫療法のためのプラットホームを提供する。ＧＶＴ反応性の臨床上の可能性は、同種ＳＣＴ後の再発性白血病の患者におけるドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）の施療による完全な寛解の誘導により示されてきた（非特許文献８及び９参照）。同種セッティングにおける免疫療法では、ドナー起源のＴ細胞が、レシピエントの自己抗原に対する低反応性により選択されないので、効果的なＴ細胞応答の誘導が可能になる。それゆえ、腫瘍又はレシピエント特異的抗原に対する高親和性Ｔ細胞は、ＳＣＴの最中又はその後に患者に施療されたＴ細胞の接種液（inoculum）において見い出すことができる。腫瘍反応性Ｔ細胞応答の主要標的は、ドナーとレシピエントが、異種であり、指定された副組織適合抗原（ｍＨａｇ）(非特許文献１０参照)であり、又はプロテイナーゼ−３のなどの過剰発現したタンパク質（非特許文献２４参照）である遺伝子多型タンパク質である。
インビボにおける役割を果たす腫瘍関連Ｔ細胞応答の適当な抗原は、同種造血ＳＣＴ後の良好な臨床反応を示す患者の分析により同定することができる。ＧＶＨＤが無く又はわずかしかなく、ＤＬＩに応答する再発性血液がんの患者におけるＴ細胞応答の標的構造の特徴付けは、がんの免疫療法に対する臨床的に関連する腫瘍特異的標的の同定をもたらすこともある。
いくつかのｍＨａｇは、非特許文献２５〜３１及び米国特許６，５２１，５９８号明細書によると、Ｘ染色体によりコードされるそのホモログと比較して遺伝子多型アミノ酸を含む又はＸにホモログを有さないＹ染色体（Ｈ−Ｙ抗原）に位置する遺伝子に由来するものである。これらの雄性特異的なｍＨａｇは、性別がミスマッチで、ＨＬＡがマッチした同種ＳＣＴにおいて役割を果たすことが示されてきた（非特許文献３１参照）。常染色体遺伝子における遺伝子多型は、ｍＨａｇをコードすることも説明されてきた。ＨＡ−３（非特許文献１３参照）、ＨＡ−８（非特許文献１２参照）、及びＵＧＴ２Ｂ１７（非特許文献３２参照）などのかかるｍＨａｇのいくつかは、広範な組織分布を提示する一方、国際公開０３／０４７６０６号パンフレットにおけるＨＡ−１（非特許文献１６参照）、及び米国特許５，７７０，２０１号明細書におけるＨＡ−２（非特許文献１２及び１５参照）、並びにＨＢ−１（非特許文献１７参照）及びＢＣＬ２Ａ１（非特許文献１４参照）の発現は、造血起源細胞に限定される。造血‐限定ｍＨａｇに対して誘導されるＴ細胞応答は、ＧＶＬ反応性を好み、ＧＶＨＤの進行（development）を減少させる場合もある。しかしながら、ＨＡ−１のような造血特異的ｍＨａｇのミスマッチが、ＧＶＨＤに関連付けられ、おそらく、Ｈａｇ陽性抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対するＴ細胞応答が、広範に発現するｍＨａｇへのＴ細胞応答の誘導を導く局所炎症を引き起こす、ＧＶＨＤの多段階の進行によるからであるとも説明されてきた。
ｍＨａｇｓの差次的発現又は認識のメカニズムのいくつかが説明されてきた。遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）は、タンパク質におけるアミノ酸置換をもたらすこともある。遺伝子多型は、ＨＢ−１（非特許文献１７参照）とＢＣＬ２Ａ１（非特許文献１４参照）に示されるように、ＴＣＲ接触残基に影響を及ぼしうる。遺伝子多型は、メッセンジャーのスプライシングに影響を及ぼし、又は、抗原プロセシング経路において変化をもたらすことができ、例えば、ＨＡ−３（非特許文献１３参照）に示されるようなプロテアソーム切断、及び、ＨＡ−８（非特許文献１２参照）に示されるようなＴＡＰトランスロケーションを挙げることができる。抗原のプロセッシング、提示、又は認識に影響を及ぼすアミノ酸相違に次いで、差次的ｍＨａｇｓ発現は、同義遺伝子ファミリーのメンバー（非特許文献３２参照）の欠失に起因することが説明されてきた。
本発明の目的は、同種幹細胞移植の関連において、改良された特性を有する腫瘍性疾患の治療のための新規のｍＨａｇｓを同定することである。
国際公開０３／０４７６０６号パンフレット
米国特許５，７７０，２０１号明細書
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（発明の概要）
近年、本発明者らは、同種ＳＣＴ後の再発性悪性血液疾患を、ＤＬＩで治療した多くの患者について非常に詳細に研究した。臨床におけるＧｖＴ応答の最中に、腫瘍反応性Ｔ細胞を、悪性腫瘍細胞を含む骨髄による特異的活性化に反応するインターフェロンγを産生することができる能力に基づき単離した。ＤＬＩとインターフェロンαを用いた移植後、再発多発性ミエローマをＤＬＩで治療している患者の一人から、患者から悪性腫瘍多発性ミエローマ細胞を認識することができるドミナントＴ細胞クローンが単離された。臨床反応時には、患者は、ＧｖＨＤを患っていたが、インターフェロンの中止とプレドニゾンによる短期治療後に消散した。患者は、完全に回復し、現時点で４年経っているが、いまだにＧｖＦＤはなく、完全に回復している。
近年、本発明者らは、同種ＳＣＴ後の再発性悪性血液疾患を、ＤＬＩで治療した多くの患者について非常に詳細に研究した。臨床におけるＧｖＴ応答の最中に、腫瘍反応性Ｔ細胞を、悪性腫瘍細胞を含む骨髄による特異的活性化に反応するインターフェロンγを産生することができる能力に基づき単離した。ＤＬＩとインターフェロンαを用いた移植後、再発多発性ミエローマをＤＬＩで治療している患者の一人から、患者から悪性腫瘍多発性ミエローマ細胞を認識することができるドミナントＴ細胞クローンが単離された。臨床反応時には、患者は、ＧｖＨＤを患っていたが、インターフェロンの中止とプレドニゾンによる短期治療後に消散した。患者は、完全に回復し、現時点で４年経っているが、いまだにＧｖＦＤはなく、完全に回復している。
かかるＴ細胞クローンに認識されるｍＨＡｇの生化学的特性により、抗原が、ヒトＡＴＰ依存性インターフェロン応答性／Ｔｏｒｓｉｎ３Ａ(ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ)遺伝子によりコードされる遺伝的遺伝子多型に由来することが解明された。かかる遺伝子は、多発性ミエローマ細胞においても、別の造血器腫瘍においても、同様に非造血器腫瘍細胞系においても、高度に発現することが見い出された。通常の非悪性細胞の認識は、定常状態下では些細なものであるが、インターフェロンによる標的細胞集団の活性化により、Ｔ細胞クローンによる認識が増加した。これらの結果に基づくと、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子によりコードされるｍＨａｇに対するＴ細胞応答は、強いＧｖＴ反応性を導きうるが、標的組織の活性化状態によってはＧｖＨＤをも導きうることが明らかである。ＧｖＨＤは、しかしながら、既に指摘したようにコントロール可能である。
無数のヒトＳＮＰと他の遺伝子多型が同定されてきたが、ｍＨＡｇは、実際極めて珍しく、特に現時点までに同定されたｍＨＡｇをコードしている常染色体遺伝子は、ほんのわずかである（非特許文献１０及び１９参照）。本発明により提供される新規ｍＨＡｇは常染色体であり、性別と結び付いたｍＨＡｇｓよりも適用範囲が広い。現在同定されているｍＨＡｇの別の明白な利点は、集団における相対分布であり、白人集団においては５０／５０程度と推測される。遺伝子多型の発生頻度が高いことは、適合性があり、マッチする移植片−ドナーと移植片−アクセプターとの組合せを見い出すことをより容易にし、その組合せは幹細胞移植(ＳＣＴ)及び／又はＤＬＩ輸注などのＨＬＡ組成物に関する移植目的として容認できるが、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａアレルにおいては相違するものである。
ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子産物は普遍的に発現し、特に増殖細胞や組織においては、相当レベルの発現が検出され、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３ＡをコードしているｍＨＡｇが、造血又は他の起源の悪性腫瘍と戦うための免疫応答を引き出すより魅力的な候補となることが報告されている。遺伝子のインターフェロンの応答性（responsiveness）は、全身性（systemic）免疫応答及び／又はＧｖＨＤが問題となった場合に、免疫応答をブーストし、発現を弱めることが要求される場合に、局所的又は全身にわたる抗原の発現をコントロールし、増加させることができる。
（発明の詳細な説明）
第一の実施態様では、本発明は天然に存在するｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａアレルの転写物のヌクレオチド配列に存在するオープンリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記アミノ酸配列が遺伝子多型のＭＨＣクラスＩ又はII副組織適合（minor histocompatibility）結合配列及び／又はペプチドを含む、ペプチドを提供する。
第一の実施態様では、本発明は天然に存在するｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａアレルの転写物のヌクレオチド配列に存在するオープンリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記アミノ酸配列が遺伝子多型のＭＨＣクラスＩ又はII副組織適合（minor histocompatibility）結合配列及び／又はペプチドを含む、ペプチドを提供する。
本発明によるペプチド又はペプチドフラグメントは、配列番号１に示される核酸配列である、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子によりコードされている。ＭＨＣ結合ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２〜５(通常及び代替リーディングフレームにおける配列番号１によりコードされる)の任意のアミノ酸の内１又は複数のアミノ酸残基における遺伝子多型、より好ましくは、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子（配列番号１）における一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子によりコードされているＳＮＰは、イントロンを含めたヒトｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子において現時点で同定されているＳＮＰの群から選択されることが好ましい(表Ａ：ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ)。特に、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子のエキソンコード配列における７８、６７２、７４０、７５２、及び８５６ヌクレオチドにおける変異（changes）が、本発明の関連における適用において好ましい。
ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ核酸配列における任意のＳＮＰ、特に以下の表Ａに示される任意のＳＮＰを用いることが好ましい。
表Ａのバリデーション凡例:
１ ｒｅｆＳＮＰクラスターに対する多重、独立提出によるバリデーション
２ 頻度又は遺伝子型データによるバリデーション:少なくとも２つの染色体において観察されるマイナーアレル
３ サブミッター確定によるバリデーション
４ 全てのアレルは、少なくとも二つの個々の染色体において観察された。
５ ハップマップ計画により遺伝子型を同定した
１ ｒｅｆＳＮＰクラスターに対する多重、独立提出によるバリデーション
２ 頻度又は遺伝子型データによるバリデーション:少なくとも２つの染色体において観察されるマイナーアレル
３ サブミッター確定によるバリデーション
４ 全てのアレルは、少なくとも二つの個々の染色体において観察された。
５ ハップマップ計画により遺伝子型を同定した
本発明のペプチドは、通常、約８〜１２アミノ酸長であり、ＨＬＡ分子に直接適合するには十分小さいが、より大きく１２〜５０以上のアミノ酸であってもよく、細胞取込み、及び、ＭＨＣ分子の溝（groove）における提示前のプロテオソームや輸送による細胞内のプロセッシング後にのみＨＬＡ分子により提示されてもよい。ペプチドは、分解を防ぎ、安定性又は取込みを増加させるためにＮ及び／又はＣ末端がキャップされていても、修飾されていてもよい。本発明によるペプチドを含むｍＨａｇは、一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子産物を含むことが好ましい。ＳＮＰは、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａのコード領域又はエキソンに含まれてもよいし、イントロン配列に位置してもよく、実施例に示されているようにスプライシングに影響を及ぼすこともあり、メッセンジャーの暗号や代替翻訳産物に影響を及ぼすこともある。本発明によるペプチドは、配列番号２〜５のアミノ酸配列（ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子産物）に示されるｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子によりコードされる任意のリーディングフレームによりコードされてもよい。配列番号２と配列番号３は、通常のリーディングフレーム（＋３フレーム、それぞれＡＴＧ翻訳開始コドンより前のアミノ酸を有するものと、有さないもの）を示す。配列番号４は、配列番号１の代替＋２リーディングフレームを示し、配列番号５は、代替＋１リーディングフレームを示す。ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子における代替リーディングフレーム、すなわち＋１フレームと＋２フレームが、転写及び翻訳のための代替開始部位の多数を包含し、暗号翻訳産物を産出する。本発明は、これらの代替リーディングフレームと翻訳産物においても、ｍＨＡｇが存在し、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａがコードする遺伝子多型により作製されることを示す。それゆえ、本発明の一実施態様では、配列番号２〜５の、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上の連続したアミノ酸を含む、又はからなるペプチドが提供され、ペプチドコード核酸配列は、少なくとも一つのＳＮＰ（好ましくは表ＡのＳＮＰ）を含む。
特定の実施態様では、本発明のペプチドは、ＭＨＣ分子に結合することができるペプチドであり、本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスII分子に関連していてもよい。本発明によるペプチドのひとつは、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆとして特定されている。かかるペプチドは、アミノ酸配列ＳＶＡＰＡＬＡＬＦＰＡ（配列番号４のアミノ酸１８〜２８）を含み、又は、からなり、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子(配列番号１)のヌクレオチド７８のＳＮＰにより、２６位置のＳｅｒがアミノ酸Ｐｈｅに置換されている。本発明による使用のためには、既知の遺伝子多型が、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３ＡにコードされるｍＨａｇ遺伝子多型をもたらし、免疫応答、移植片対白血病若しくは移植片対腫瘍応答を生じさせるために有用であるか否かは、遺伝子構造、特に移植片‐ドナー及び移植片‐アクセプター／レシピエント両方のＨＬＡアイソタイプと、ＭＨＣ遺伝子構造におけるそれぞれの相違とに依存することとなろう。ドナーとレシピエントが、それぞれのｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａアレルに関して同一であるが、ＨＬＡアイソタイプにおいては異なるという特別な状況にあったとしても、Ｔ細胞が外来抗原として異なるＨＬＡアレル（すなわち「非自己」の構造として）と関連する自己抗原を認識すれば、免疫応答を生じさせることができる。ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａに対するかかる抗原反応の適用は、本発明の範囲内である。
本発明によるペプチドを含むｍＨＡｇは、例えば、Ｔ細胞レセプターと結合又は相互作用するため、或いはかかるＴ細胞レセプターを単離し、クローンするため、或いは任意にある種のＨＬＡアイソタイプ分子と関連して、本発明のｍＨａｇやペプチドに結合能を有する抗体を免疫化し、選択するために、Ｔ細胞免疫応答を惹起し、増強するために、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスII分子に含まれ、用いられ、又は適用されてもよい。
別の実施態様では、本発明は、本発明のｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子多型と本発明によるｍＨＡｇを含むペプチドをコードする核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、本発明のペプチドを産出する手段として、あるいは被検者における免疫応答、特に望ましい移植片対腫瘍応答を誘導し、加速し、遷延し、増強するための医薬組成物又はＤＮＡワクチンとして有用でありうる。一実施態様では、被検者は、移植片‐ドナーであってもよく、別の実施態様では、被検者は、移植片‐レシピエントであってもよい。好ましくは、本発明の核酸は、プラスミド、コスミド、ＲＮＡ若しくはＤＮＡのファージ若しくはウイルス、又は任意の別の複製可能な核酸分子などの核酸ベクターに含まれていてもよく、（制御可能な）プロモーター、イニシエーター、ターミネーター及び／又はエンハンサーなどの制御配列に作動可能なように連結していることが最も好ましい。
別の実施態様では、本発明は、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子多型にコードされるｍＨａｇを含むペプチドと相互作用できるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）分子を提供し、特に任意に、発現及び／又はクローニングのための核酸分子ベクターに包含される、そのようなＴ細胞レセプターなどをコードする核酸分子を提供する。本発明によるＴＣＲは、ＨＬＡ分子の関連で及び／又はＨＬＡ分子により提示されている場合は、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａにコードされる遺伝子多型ｍＨＡｇを含むペプチドと、好ましくは生細胞においてインビトロ又はインビボで、相互作用できることが好ましい。Ｔ細胞レセプターや、特に本発明によるＴＣＲをコードする核酸は、例えば、Ｔ細胞を別のＴ細胞に移動して、新規なＴ細胞クローンを作製するために適用されてもよい。かかるＴＣＲクローニング法によっては、リンパ球のドナーなどの本質的に同種ドナーの遺伝子構造であるＴ細胞クローンが提供されてもよい。本発明によるペプチドを含むｍＨａｇを認識することができるＴ細胞クローンを提供する方法は、好ましくはＳＣＴ及び／又はＤＬＩレシピエント被検者である、移植片レシピエントにおけるヒトｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子多型ｍＨａｇを発現する腫瘍細胞を特異的に標的することができるように、作製してもよい。それゆえ本発明は、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ遺伝子におけるリーディングフレームによりコードされる遺伝子多型ｍＨａｇと相互作用できるＴ細胞レセプターをコードし、発現するＴリンパ球を、好ましくはＨＬＡ分子の関連において提供する。Ｔリンパ球は、リコンビナントでもよいし、自然選択されたものでもよい。本発明のＴリンパ球は、本発明の方法及び医薬組成物のため使用してよいし、使用方法において使用してもよい。本明細書は、それゆえ、本発明の細胞傷害性Ｔリンパ球を産生するための少なくとも２つの方法を提供する。かかる方法は、免疫応答の誘因を助長する状況下で、未分化リンパ球と遺伝子多型ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ副組織適合抗原とを接触させるステップを含み、それは例えば、本発明のペプチドを用いて移植片を受け取る患者において、インビトロやインビトロで行われてもよい。あるいは、インビトロで遺伝子多型ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ副組織適合抗原と特異的に相互作用させるためにＴＣＲをコードする遺伝子を移植片レシピエント又は移植片ドナーから得られる宿主細胞及び／又は宿主リンパ球にクローニングすることにより行われてもよく、任意に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に分化する。かかる遺伝子は前述の方法で得られた細胞又はｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ ｍＨＡｇに対する免疫応答を呈している被検者から得てもよい。
さらに別の実施態様では、本発明は、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａタンパク質を発現する悪性腫瘍を治療するための、医薬品及び／又は薬剤といった新しい手段を提供する。薬剤は、悪性腫瘍の成長を少なくとも減少させるために、好ましくは悪性腫瘍のサイズを減少させるために、さらに好ましくは悪性腫瘍を根絶させるために十分な量を悪性腫瘍に患っている患者又は被検者に投与されるものである。治療される患者又は被検者は、ヒトが好ましく、好ましい実施態様では、ＳＣＴ等の移植を経験しているヒトの被検者である。本発明により治療される悪性腫瘍は、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａを発現している任意の腫瘍性疾患であり、白血病、リンパ腫、及び（多発性）骨髄腫、及び全ての固形がん（solid tumors）を含み、（良性）アデノーマ及びポリープから湿潤がん及び／又は転移性がんに及ぶ。ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａを発現している固形がんも、本発明による治療に特に適切である。
本発明の方法と手段は、例えば、任意に化学療法、放射線治療法、又は別の抗がん治療を受けた後に造血幹細胞移植(ＳＣＴ)やドナーリンパ球輸注(ＤＬＩ)のような同種幹細胞移植を経験した被検者に適用するために特に適切である。移植片は、ＨＬＡがマッチしていることが好ましいが、必ずしも必要ではなく、移植組織又は移植片のレシピエントにおいて存在する少なくともひとつのｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａアレルを含まない同種移植片ドナーから得られた移植片を含み、それゆえ、移植片由来のリンパ球により「外来の」又は「非自己」とみなされる。あるいは、ドナーとレシピエントは、同一のｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａアレルを有して、ＨＬＡがミスマッチでもよく、ＨＬＡのミスマッチは、異なるＨＬＡコンテクストにおいてｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａペプチドを提示することにより、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ特異的移植片対腫瘍応答を誘導することができ、「非自己」抗原として移植片由来Ｔ細胞により認識される。ＨＬＡ又はｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａアレル用のドナーとレシピエント被検者の遺伝子型は、熟練者であれば任意のいくつかの基準、教科書の技術を用いて行うことができる日常的な手順であり、例えば、ＤＮＡ配列決定、アレル特異的ＰＣＲ技術を挙げることができるがこれらに限定されず、任意で制限酵素分析、ＮＡＳＢＡ，ＤＮＡフィンガープリント、ＲＦＬＰ解析、アレル特異的抗体を用いるアッセイと組み合わせることができる。
本発明のペプチドは、以前定義したようにｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａにコードされる遺伝子多型ｍＨａｇ、又は、ｍＨＡｇ及びＨＬＡ分子と関連する本発明のペプチドと相互作用することができるＴ細胞レセプターを保持しているリンパ球を含み、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａを発現する悪性腫瘍を罹患している被検者を治療するための医薬組成物や薬剤の製造のために使用されてもよい。本発明による医薬組成物は、特に望ましい移植片対腫瘍Ｔ細胞免疫応答において、治療を受ける被検者に効果的な免疫応答を引き出し、加速し、増強し又は遷延させることを補助するものとなろう。移植片対腫瘍応答は、血液がんの化学療法後、手術可能な固形がんの場合の放射線治療後、化学療法後又は外科的切除後の微小残存病変の除去又は転移に特に適切である。移植片対腫瘍応答は、移植片対血液がん応答が好ましい。固形がんに対する移植片対腫瘍応答は、可欠な又は置換可能な器官又は組織におけるこれらの腫瘍に適用されるのが好ましく、重大な悪影響なしに移植片対宿主及び／又は移植片対腫瘍免疫応答により完全に根絶されることもある。かかる器官又は組織としては、精巣、腎臓、卵巣、胸腺／組織、前立腺、甲状腺、頸部、子宮、骨髄及び膵臓を挙げることができる。特定の実施態様では、本発明の方法と薬剤は、インターフェロンガンマや、特にインターフェロンアルファ、インターフェロンベータ等のインターフェロンタイプＩなどのインターフェロンの投与又は誘導と組み合わせてもよい。これらのインターフェロンは、治療されている被検者においてｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａの発現を誘導し、抗原レベルを増加させることにより、ｍＨＡｇに対する免疫応答を開始させ、増強させる手助けをしている。本発明は、治療の第一の手段として又はアジュバント又はフォローアップ治療として用いることができる。
特定の実施態様では、移植片（幹）細胞、特に骨髄／リンパ球幹細胞は、ドナーの移植組織の採取の前に、レシピエントに移植片を移植後のｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３ＡｍＨａｇを提示している腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫応答を開始し、刺激し、増強し又は加速させるために、本発明によるｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３ＡｍＨａｇを含むペプチド若しくはタンパク質及び／又は医薬組成物と接触させることにより、前処理してもよい。
本発明による薬剤と医薬組成物は、当該技術分野において慣習となっていて、例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21ndEdition, 2005, University of Sciences in Philadelphiaに記載されているような、周知の医薬的に許容される賦形剤（excipients）を用いて処方してもよい。特に、Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience 2004に記載されている免疫モジュレーターのような免疫調節化合物やアジュバントは、熟練者により適切に選択され、適用されてもよい。
さらに別の実施態様では、本発明は、抗体、好ましくはヒト抗体若しくはヒト化抗体、又はそれらのフラグメントであって、遺伝子多型ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ副組織適合抗原、ＨＬＡ分子の関連で選択される抗原に特異的な抗体を提供する。本発明による抗体は、治療用又は医薬用の目的に用いてもよく、抗腫瘍免疫反応を補助してもよいが、ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ ｍＨａｇが腫瘍又は腫瘍細胞により提示されているか、あるいは、どの遺伝子多型ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａ ｍＨａｇが、被検者の（腫瘍）サンプル、組織、又は器官において発現及び／又は提示されているかを調べるために腫瘍又は腫瘍細胞をモニターする診断目的に用いてもよい。本発明の抗体は、ＨＬＡ分子に関連して任意に、遺伝子多型ｈＡＤＩＲ／ＴＯＲ３Ａペプチドと結合し、又は相互作用することができることが好ましい。抗体は、任意の別のほ乳類において誘起される抗体であってもよく、従来技術を用いてヒト化してもよい。本発明の抗体は、従来技術を用いて直接的又は間接的に標識してもよい。適切な標識には、蛍光部位（ＧＦＰ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、ローダミン等）、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、放射性標識（３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ及びその他）、免疫原性又は別のハプテンやタグ（ビオチン、ジゴキシゲニン、ＨＡ、6Ｈｉｓ、ＬｅｘＡ、Ｍｙｃ及びその他）が含まれる。
本発明による抗体とペプチドは、インターロイキン及び／又はＩＦＮ−γの誘導などのテトラマー染色又はサイトカイン反応の手段として移植抗腫瘍反応をモニターするために用いられてもよい。
本明細書及びクレームにおいて、「含む（comprise）」なる動詞及びその活用形は、非限定的な意味で用いられ、その語に続く事項を包含すると同時に、具体的に述べられていない事項を排除しないことを意味する。さらに、「１つの（a又はan）なる不定冠詞を用いて、ある要素に言及している場合、その文脈が、それがその要素のたった一つ唯一のものであることを明確に要求していない限り、その要素が複数存在する可能性が排除されない。
（材料と方法）
［ＣＴＬ作製と培養］
ＨＬＡ−Ａ２拘束性（restricted）ｍＨａｇ特異的ＣＴＬクローンＲＤＲ２が、ＩＦＮ−ｙ分泌アッセイを用いて、再発性ＭＭの治療としてＳＣＴ後のＤＬＩの臨床反応時に患者の末梢血液サンプルから単離された(Kloosterboer et al. Leukemia, 2005, 19: 83-90)。ＣＴＬクローンＲＤＲ２とアロＨＬＡ‐Ａ２コントロールクローンＭＢＭ１３が、照射された（５０Ｇｙ)同種ＰＢＭＮＣと、患者由来ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶ ＬＣＬ) とをペニシリン−ストレプトマイシン(Cambrex社製)、Ｌ−グルタミン（Cambrex社製）３ｍＭ、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）(Cambrex社製)、５％プールヒト血清１００Ｕ／ｍｌのＩＬ２(Chiron社製, Amsterdam, The Netherlands)及び０．８μg／ｍｌのフィト血球凝集素（phytohaemagglutinin）（ＰＨＡ)(Remel社製, Dartford, UK)で補完されたＩｓｃｏｖｅ改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）において、刺激することで展開した。
［ＣＴＬ作製と培養］
ＨＬＡ−Ａ２拘束性（restricted）ｍＨａｇ特異的ＣＴＬクローンＲＤＲ２が、ＩＦＮ−ｙ分泌アッセイを用いて、再発性ＭＭの治療としてＳＣＴ後のＤＬＩの臨床反応時に患者の末梢血液サンプルから単離された(Kloosterboer et al. Leukemia, 2005, 19: 83-90)。ＣＴＬクローンＲＤＲ２とアロＨＬＡ‐Ａ２コントロールクローンＭＢＭ１３が、照射された（５０Ｇｙ)同種ＰＢＭＮＣと、患者由来ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶ ＬＣＬ) とをペニシリン−ストレプトマイシン(Cambrex社製)、Ｌ−グルタミン（Cambrex社製）３ｍＭ、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）(Cambrex社製)、５％プールヒト血清１００Ｕ／ｍｌのＩＬ２(Chiron社製, Amsterdam, The Netherlands)及び０．８μg／ｍｌのフィト血球凝集素（phytohaemagglutinin）（ＰＨＡ)(Remel社製, Dartford, UK)で補完されたＩｓｃｏｖｅ改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）において、刺激することで展開した。
［標的細胞集団］
標的細胞の認識が、細胞毒性アッセイと、ＩＮＦ−γ分泌を用いたレスポンダー細胞（responder cells）の刺激より測定された。様々な細胞集団が両方にアッセイにおいて用いられた。ＰＨＡ芽球細胞は、０．８ μｇ／ｍｌＰＨＡで刺激し、続いて１００Ｕ／ｍｌのＩＬ２と１０％ＦＢＳとにより補完されたＩＭＤＭにおいて培養してＰＢＭＮＣ‘sから作製された。ＥＢＶ ＬＣＬは、１０％ＦＢＳで補完されたＩＭＤＭにおいて培養された。ＨＬＡ‐Ａ２＋リンパ芽（lymphoblastoid）プロセッシング欠損細胞系Ｔ２(Alexander et al. Immunogenetics 1989;29:380-388)が、１０％ＦＢＳで補完されたＩＭＤＭにおいて培養された。Ｈｅｌａ／Ａ２は、ＨｅｌａＴｋ細胞におけるＬＺＲＳにおいてＨＬＡ‐Ａ＊０２０１のレトロウイルス導入により作製され、１０％ＦＢＳで補完されたＩＭＤＭにおいて培養された。付着性固形がん細胞系ＴＴ, ＢｒｏｗｎＭＣＦ７とＣａｓｋｉが、１０％ＦＢＳで補完されたＲＰＭＩで培養された。間葉細胞は、１０％ＦＢＳで補完された低グルコースダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ)(Invitrogen社製, Paysley, Scotland)において接着細胞を培養することにより、骨髄細胞から作製された(Noort et al., 2002, J. Exp. Med. 30:870-878)。刺激細胞（stimulaotercells）のインターフェロンモデュレーションがＩＦＮ−α２ａ(Roche社製, Woerden, The Netherlands)の添加により行われた。
標的細胞の認識が、細胞毒性アッセイと、ＩＮＦ−γ分泌を用いたレスポンダー細胞（responder cells）の刺激より測定された。様々な細胞集団が両方にアッセイにおいて用いられた。ＰＨＡ芽球細胞は、０．８ μｇ／ｍｌＰＨＡで刺激し、続いて１００Ｕ／ｍｌのＩＬ２と１０％ＦＢＳとにより補完されたＩＭＤＭにおいて培養してＰＢＭＮＣ‘sから作製された。ＥＢＶ ＬＣＬは、１０％ＦＢＳで補完されたＩＭＤＭにおいて培養された。ＨＬＡ‐Ａ２＋リンパ芽（lymphoblastoid）プロセッシング欠損細胞系Ｔ２(Alexander et al. Immunogenetics 1989;29:380-388)が、１０％ＦＢＳで補完されたＩＭＤＭにおいて培養された。Ｈｅｌａ／Ａ２は、ＨｅｌａＴｋ細胞におけるＬＺＲＳにおいてＨＬＡ‐Ａ＊０２０１のレトロウイルス導入により作製され、１０％ＦＢＳで補完されたＩＭＤＭにおいて培養された。付着性固形がん細胞系ＴＴ, ＢｒｏｗｎＭＣＦ７とＣａｓｋｉが、１０％ＦＢＳで補完されたＲＰＭＩで培養された。間葉細胞は、１０％ＦＢＳで補完された低グルコースダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ)(Invitrogen社製, Paysley, Scotland)において接着細胞を培養することにより、骨髄細胞から作製された(Noort et al., 2002, J. Exp. Med. 30:870-878)。刺激細胞（stimulaotercells）のインターフェロンモデュレーションがＩＦＮ−α２ａ(Roche社製, Woerden, The Netherlands)の添加により行われた。
［細胞傷害性アッセイ］
異常生殖（heterogonous）細胞集団において、ＣＴＬに誘導された集団の特異的細胞傷害性を測定するために、文献(Jedema I et al. Blood. 2004 Apr 103(7))のとおりＣＦＳＥベースの細胞傷害性アッセイを行った。概略としては、骨髄細胞又は末梢血液細胞は、２．５μのＭＣＦＳＥで標識され(Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)、１：１の比でＣＴＬクローンとインキュベートした。４時間、２４時間、そして４８時間後に、特異的細胞集団は、ＰＥ又はＡＰＣにより標識されたＣＤ１３８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４又はＣＤ１９抗原(Becton Dickinson社製、 Erembodegem-Aalst, Belgium)で対比染色された。死細胞を排除するためにヨウ化プロピジウム（Propodium iodide）が添加された。各サンプルの生存細胞数の定量化を可能とするため、１０４フローカウント フルオロスフィア(Coulter Corporation社製, Miami, USA)がフローサイトメトリー解析の直前に添加された。
異常生殖（heterogonous）細胞集団において、ＣＴＬに誘導された集団の特異的細胞傷害性を測定するために、文献(Jedema I et al. Blood. 2004 Apr 103(7))のとおりＣＦＳＥベースの細胞傷害性アッセイを行った。概略としては、骨髄細胞又は末梢血液細胞は、２．５μのＭＣＦＳＥで標識され(Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)、１：１の比でＣＴＬクローンとインキュベートした。４時間、２４時間、そして４８時間後に、特異的細胞集団は、ＰＥ又はＡＰＣにより標識されたＣＤ１３８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４又はＣＤ１９抗原(Becton Dickinson社製、 Erembodegem-Aalst, Belgium)で対比染色された。死細胞を排除するためにヨウ化プロピジウム（Propodium iodide）が添加された。各サンプルの生存細胞数の定量化を可能とするため、１０４フローカウント フルオロスフィア(Coulter Corporation社製, Miami, USA)がフローサイトメトリー解析の直前に添加された。
［５１Ｃｒリリースアッセイ］
標準５１Ｃｒリリースアッセイにおいて、ＣＴＬクローンの細胞傷害性が文献（Faber et al. 1992, J Exp Med 176: 1283-1289)のとおり行われた。標的細胞は、１００μのＣｉ Ｎａ２ ５１ＣｒＯ４(Amersham Biosciences社製、Freiburg, Germany)で、３７℃にて１時間標識され、洗浄され、１ｍｌあたり１０４〜５×１０４細胞に希釈され、１ウェルあたり１０３〜５×１０３標的細胞を得た。ＣＴＬが、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で添加され、４時間培養された。上清が採取され、マイクロプレートを含む固体シンチレーター(Perkin Elmer社製, Boston MA, USA)に移され、トップカウントカウンター(Perkin Elmer社製)でカウントされた。ＨＰＬＣで精製された天然ペプチド又は希釈された合成ペプチドは、ＣＴＬの添加前に、３７℃にて、５％ＣＯ２下で１〜２時間５１Ｃｒ標識Ｔ２又はドナーＥＢＶ ＬＣＬ細胞をロードすることにより反応性を試験した。
標準５１Ｃｒリリースアッセイにおいて、ＣＴＬクローンの細胞傷害性が文献（Faber et al. 1992, J Exp Med 176: 1283-1289)のとおり行われた。標的細胞は、１００μのＣｉ Ｎａ２ ５１ＣｒＯ４(Amersham Biosciences社製、Freiburg, Germany)で、３７℃にて１時間標識され、洗浄され、１ｍｌあたり１０４〜５×１０４細胞に希釈され、１ウェルあたり１０３〜５×１０３標的細胞を得た。ＣＴＬが、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で添加され、４時間培養された。上清が採取され、マイクロプレートを含む固体シンチレーター(Perkin Elmer社製, Boston MA, USA)に移され、トップカウントカウンター(Perkin Elmer社製)でカウントされた。ＨＰＬＣで精製された天然ペプチド又は希釈された合成ペプチドは、ＣＴＬの添加前に、３７℃にて、５％ＣＯ２下で１〜２時間５１Ｃｒ標識Ｔ２又はドナーＥＢＶ ＬＣＬ細胞をロードすることにより反応性を試験した。
［ＩＦＮ−γ分泌アッセイ］
ＣＴＬ刺激の定量化がＩＦＮ−γ分泌アッセイにより行われた。ＣＴＬは、様々なＰＢＭＮＣ細胞集団又はトランスフェクトされたＨｅｌａ／Ａ２細胞と共培養された。１０５刺激細胞と１０４ＣＴＬは、１０％ＦＢＳで補完されたＩＭＤＭで希釈され、９６ウェルマイクロタイタープレートで２４時間培養された。上清は回収され、ＩＦＮ−γは、標準ＥＬＩＳＡで測定された(Sanquin社製、Amsterdam, The Netherlands)。
ＣＴＬ刺激の定量化がＩＦＮ−γ分泌アッセイにより行われた。ＣＴＬは、様々なＰＢＭＮＣ細胞集団又はトランスフェクトされたＨｅｌａ／Ａ２細胞と共培養された。１０５刺激細胞と１０４ＣＴＬは、１０％ＦＢＳで補完されたＩＭＤＭで希釈され、９６ウェルマイクロタイタープレートで２４時間培養された。上清は回収され、ＩＦＮ−γは、標準ＥＬＩＳＡで測定された(Sanquin社製、Amsterdam, The Netherlands)。
［ペプチド単離、精製及び特性解析］
ＲＤＲ２により認識されるＥＢＶ ＬＣＬ由来のペプチドの精製は、文献のとおり行われた(den Haan et al. 1995, Science 268:1476-1480; Heemskerk et al. 2001, PNAS 98: 6806-6811)。概略としては、凍結細胞ペレットをＮＰ４０（Pierce社製, Rockford, USA)）を洗浄剤として用いて溶解した。高速遠心分離後、上清が、ＣＬ４Ｂセファローズビーズ(Amersham Biosciences社製, Uppsala, Sweden)でタンブルし、その後遠心分離して前処理された。上清は、プロテインＡビーズ(Amersham Biosciences社製)と共役（coupled）しているＢＢ７．２ＨＬＡ‐Ａ２抗体からなるアフィニティカラムを通過させた。１０％酢酸でＨＬＡ‐Ａ２ペプチド複合体を溶出及び分解した。ペプチドは、５ｋＤフィルター(Vivascience社製, Hannover, Germany)を通じて遠心分離によりＨＬＡ−Ａ２モノマーとβ２−ミクログロブリンより分離された。ろ液を含むペプチドは凍結乾燥された。ペプチド濃縮物は、０．１％ＴＦＡを含むＨ２０に溶解され、スマートシステム(Amersham Biosciences社製)に注入され、０．２ｍｌ／ｍｉｎにて、１０ｃｍ×２．１ｍｍＣ２／Ｃ１８ ３μｍの分子カラムのＲＰ‐ＨＰＬＣに供された。０．１％ＴＦＡを含む２０％〜５０％有機相の勾配が流出し、０．１ｍｌの画分が、シリコンが充填されたバイアルに回収され、−８０℃にて保存された。イソプロパノール又はアセトニトリルは、有機相として用いられた。画分は、ＣＴＬ添加前に５１Ｃｒ標識Ｔ２標的細胞に１〜５μｌのサンプルをロードすることで反応性が試験された。候補ペプチドの選択は、Ｑ−ＴＯＦ１マススペクトロメーター(Micromass社製, Manchester, UK)に直接連結したＬＣシステムの１５ｃｍ×７５μｍのＰｅｐｍａｐナノコラムに注入することで行われた。続いてペプチド配列解析が、ＨＣＴｐｌｕｓマススペクトロメーター(Bruker Daltronics社製, Bremen, Germany)により、選択されたマスの衝突活性化解離により行われた。
ＲＤＲ２により認識されるＥＢＶ ＬＣＬ由来のペプチドの精製は、文献のとおり行われた(den Haan et al. 1995, Science 268:1476-1480; Heemskerk et al. 2001, PNAS 98: 6806-6811)。概略としては、凍結細胞ペレットをＮＰ４０（Pierce社製, Rockford, USA)）を洗浄剤として用いて溶解した。高速遠心分離後、上清が、ＣＬ４Ｂセファローズビーズ(Amersham Biosciences社製, Uppsala, Sweden)でタンブルし、その後遠心分離して前処理された。上清は、プロテインＡビーズ(Amersham Biosciences社製)と共役（coupled）しているＢＢ７．２ＨＬＡ‐Ａ２抗体からなるアフィニティカラムを通過させた。１０％酢酸でＨＬＡ‐Ａ２ペプチド複合体を溶出及び分解した。ペプチドは、５ｋＤフィルター(Vivascience社製, Hannover, Germany)を通じて遠心分離によりＨＬＡ−Ａ２モノマーとβ２−ミクログロブリンより分離された。ろ液を含むペプチドは凍結乾燥された。ペプチド濃縮物は、０．１％ＴＦＡを含むＨ２０に溶解され、スマートシステム(Amersham Biosciences社製)に注入され、０．２ｍｌ／ｍｉｎにて、１０ｃｍ×２．１ｍｍＣ２／Ｃ１８ ３μｍの分子カラムのＲＰ‐ＨＰＬＣに供された。０．１％ＴＦＡを含む２０％〜５０％有機相の勾配が流出し、０．１ｍｌの画分が、シリコンが充填されたバイアルに回収され、−８０℃にて保存された。イソプロパノール又はアセトニトリルは、有機相として用いられた。画分は、ＣＴＬ添加前に５１Ｃｒ標識Ｔ２標的細胞に１〜５μｌのサンプルをロードすることで反応性が試験された。候補ペプチドの選択は、Ｑ−ＴＯＦ１マススペクトロメーター(Micromass社製, Manchester, UK)に直接連結したＬＣシステムの１５ｃｍ×７５μｍのＰｅｐｍａｐナノコラムに注入することで行われた。続いてペプチド配列解析が、ＨＣＴｐｌｕｓマススペクトロメーター(Bruker Daltronics社製, Bremen, Germany)により、選択されたマスの衝突活性化解離により行われた。
［ＡＤＩＲ遺伝子の配列解析］
ＡＤＩＲ遺伝子が、ＲＤＲ２の標的であることが同定されたので、患者とドナーのサンプルが、配列解析によって解析された。トリゾール試薬（Invitrogen社製）を細胞ペレットに添加し、ｍＲＮＡが単離され、精製され、４μｇが、製造者の指示に従い、Ｍ‐ＭＬＶ逆転写酵素（Invitrogen社製)を用いて３７℃にて１時間ｃＤＮＡに逆転写された。ＡＤＩＲ遺伝子の１〜３２７ｎｔのＰＣＲ反応が、１．５ｍのＭＭｇＣｌ２、２５０μＭのｄＮＴＰ、８００ｎＭ のフォワードプライマー(５’‐ＣＴＡＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴ‐３’)、８００ｎＭのリバースプライマー(５’‐ＧＣＴＧＧＣＣＣＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧ‐３’)、２％ＤＭＳＯ及び１．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む５０μＬのＧｅｎｅＡｍｐIIＰＣＲバッファー内で行われた。アプライドバイオシステムズＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム２４００における増幅は、以下のプログラムにより行われた。すなわち９５℃にて２分と、９５℃にて１５秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて１分、その後７２℃にて７分の単一伸長ステップが３５サイクル行われた。配列反応が、Big Dye ターミネーターｖ３．１配列キット(Applied Biosystems社製, Foster City, CA, USA)と１μＭのリバースプライマーを用いて、９４℃にて３分、９６℃にて１０秒、及び５８℃にて５秒、６０℃にて４分を２５サイクルというプログラムにしたがって行われたＤＮＡの精製後、ＢＩ３１０シーケンサーを用いて配列決定が行われた。
ＡＤＩＲ遺伝子が、ＲＤＲ２の標的であることが同定されたので、患者とドナーのサンプルが、配列解析によって解析された。トリゾール試薬（Invitrogen社製）を細胞ペレットに添加し、ｍＲＮＡが単離され、精製され、４μｇが、製造者の指示に従い、Ｍ‐ＭＬＶ逆転写酵素（Invitrogen社製)を用いて３７℃にて１時間ｃＤＮＡに逆転写された。ＡＤＩＲ遺伝子の１〜３２７ｎｔのＰＣＲ反応が、１．５ｍのＭＭｇＣｌ２、２５０μＭのｄＮＴＰ、８００ｎＭ のフォワードプライマー(５’‐ＣＴＡＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴ‐３’)、８００ｎＭのリバースプライマー(５’‐ＧＣＴＧＧＣＣＣＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧ‐３’)、２％ＤＭＳＯ及び１．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む５０μＬのＧｅｎｅＡｍｐIIＰＣＲバッファー内で行われた。アプライドバイオシステムズＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム２４００における増幅は、以下のプログラムにより行われた。すなわち９５℃にて２分と、９５℃にて１５秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて１分、その後７２℃にて７分の単一伸長ステップが３５サイクル行われた。配列反応が、Big Dye ターミネーターｖ３．１配列キット(Applied Biosystems社製, Foster City, CA, USA)と１μＭのリバースプライマーを用いて、９４℃にて３分、９６℃にて１０秒、及び５８℃にて５秒、６０℃にて４分を２５サイクルというプログラムにしたがって行われたＤＮＡの精製後、ＢＩ３１０シーケンサーを用いて配列決定が行われた。
［ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆエピトープを含む構築物のトランスフェクション］
ドナー及び患者のＡＤＩＲ遺伝子を含むｃＤＮＡ由来の異なる構築物が、トランスフェクションアッセイのために作製された。患者由来のｃＤＮＡとドナー由来のｃＤＮＡの両方について、４つの異なるフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを用いてＰＣＲが行われた。フォワードプライマーは、隣接するＢｇｌII制限酵素認識部位を含み、配列がＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴより開始する１〜１８ＮＴの直後に続くか、又は通常のＯＲＦ(５’-ＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＣ-ＧＧＧ‐３')由来の天然ＡＴＧ、又は代替ＯＲＦ(５'-ＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＣＧＣ ＧＧＴＣＣＧＴＧ‐３')由来の天然ＡＴＧが続くＫｏｚａｋにより開始する。リバースプライマーは、ＮｏｔＩ制限酵素認識部位（５‘‐ＴＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧ‐３’）が続く、３０９〜３２７ｎｔにおいて選択された。ＰＣＲ産物は、消化バッファーであるバッファーＨ(Roche社製)内で、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌII(Roche社製, Mannheim, Germany)とＮｏｔＩ(Roche社製)で消化し、ＰＣＲ精製キット (Quiagen社製, Hilden, Germany)を用いて精製され、ラピッドＤＮＡライゲーションキット(Roche社製)を用いて、従前作製されたｐＣＲ３．１ 発現ベクター(Invitrogen社製)のＢａｍＨ１(Roche社製)とＮｏｔＩ部位にライゲートされた。ライゲートされたベクターは、コンピタントＥ．ｃｏｌｉを形質転換するために用いられ、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に蒔かれた。翌日、成長しているコロニーは採取され、アンピシリンを含むＬＢ培地で展開された。プラスミドは、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップ(Qiagen社製)を用いて精製された。ＨＬＡ−Ａ２で安定して形質導入されたＨｅｌａ細胞は、平底プレートの１ウェルあたり２×１０４細胞で播種された。２４時間後、１００ｎｇのプラスミドは、リポフェクタミン２０００試薬(Invitrogen社製, Carlsbad, CA, USA)と共にプレインキュベートされ、オプティメンI培地(Invitrogen社製, Paisley, Scotland)において、２×１０４Ｈｅｌａ／Ａ２細胞をトランスフェクトするために用いられた。１０４ＲＤＲ２細胞が添加された２４時間後に細胞が添加され、再び２４時間後に５０μＬの上清が採取され、ＥＬＩＳＡにおいてＩＦＮ−γの分泌が試験された。
ドナー及び患者のＡＤＩＲ遺伝子を含むｃＤＮＡ由来の異なる構築物が、トランスフェクションアッセイのために作製された。患者由来のｃＤＮＡとドナー由来のｃＤＮＡの両方について、４つの異なるフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを用いてＰＣＲが行われた。フォワードプライマーは、隣接するＢｇｌII制限酵素認識部位を含み、配列がＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴより開始する１〜１８ＮＴの直後に続くか、又は通常のＯＲＦ(５’-ＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＣ-ＧＧＧ‐３')由来の天然ＡＴＧ、又は代替ＯＲＦ(５'-ＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＣＧＣ ＧＧＴＣＣＧＴＧ‐３')由来の天然ＡＴＧが続くＫｏｚａｋにより開始する。リバースプライマーは、ＮｏｔＩ制限酵素認識部位（５‘‐ＴＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧ‐３’）が続く、３０９〜３２７ｎｔにおいて選択された。ＰＣＲ産物は、消化バッファーであるバッファーＨ(Roche社製)内で、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌII(Roche社製, Mannheim, Germany)とＮｏｔＩ(Roche社製)で消化し、ＰＣＲ精製キット (Quiagen社製, Hilden, Germany)を用いて精製され、ラピッドＤＮＡライゲーションキット(Roche社製)を用いて、従前作製されたｐＣＲ３．１ 発現ベクター(Invitrogen社製)のＢａｍＨ１(Roche社製)とＮｏｔＩ部位にライゲートされた。ライゲートされたベクターは、コンピタントＥ．ｃｏｌｉを形質転換するために用いられ、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に蒔かれた。翌日、成長しているコロニーは採取され、アンピシリンを含むＬＢ培地で展開された。プラスミドは、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップ(Qiagen社製)を用いて精製された。ＨＬＡ−Ａ２で安定して形質導入されたＨｅｌａ細胞は、平底プレートの１ウェルあたり２×１０４細胞で播種された。２４時間後、１００ｎｇのプラスミドは、リポフェクタミン２０００試薬(Invitrogen社製, Carlsbad, CA, USA)と共にプレインキュベートされ、オプティメンI培地(Invitrogen社製, Paisley, Scotland)において、２×１０４Ｈｅｌａ／Ａ２細胞をトランスフェクトするために用いられた。１０４ＲＤＲ２細胞が添加された２４時間後に細胞が添加され、再び２４時間後に５０μＬの上清が採取され、ＥＬＩＳＡにおいてＩＦＮ−γの分泌が試験された。
［ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ特異的Ｔ細胞のエクスビボの検出］
組換えビオチン化ＨＬＡ Ａ＊０２０１モノマーは、ＳＶＡＰＡＬＡＬＦＰＡ又はＳＶＡＰＡＬＡＬＳＰＡペプチドを有するβ２‐ミクログロブリン（microbglobulin）の存在下で、折りたたまれた（folded）。ストレプトアビジン−ＰＥとストレプトアビジン−ＡＰＣテトラマーは、文献(Altman et al. 1996 Science 274:94-96)のとおり、再び折りたたまれた複合体（refolded complex）とともに産生した。テトラマー複合体は、ＳＣＴとＤＬＩ後の特定の時点において採取された患者のサンプルを解凍したものを染色するために用いられた。細胞は、ＣＤ８ ＡＰＣ(Caltag社製, Burlingame, CA, USA)により対比染色され、フローサイトメトリーにより解析された。テトラマー陽性の場合は、シングルウェルでＦＡＣＳソートされ、展開され、細胞傷害性について試験された。
組換えビオチン化ＨＬＡ Ａ＊０２０１モノマーは、ＳＶＡＰＡＬＡＬＦＰＡ又はＳＶＡＰＡＬＡＬＳＰＡペプチドを有するβ２‐ミクログロブリン（microbglobulin）の存在下で、折りたたまれた（folded）。ストレプトアビジン−ＰＥとストレプトアビジン−ＡＰＣテトラマーは、文献(Altman et al. 1996 Science 274:94-96)のとおり、再び折りたたまれた複合体（refolded complex）とともに産生した。テトラマー複合体は、ＳＣＴとＤＬＩ後の特定の時点において採取された患者のサンプルを解凍したものを染色するために用いられた。細胞は、ＣＤ８ ＡＰＣ(Caltag社製, Burlingame, CA, USA)により対比染色され、フローサイトメトリーにより解析された。テトラマー陽性の場合は、シングルウェルでＦＡＣＳソートされ、展開され、細胞傷害性について試験された。
［ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ特異的Ｔ細胞のＴＣＲＢＶ解析］
細胞傷害性クローンのＴＣＲＢＶ発現は、ＴＣＲＢＶ７に対するＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体(Beckmann Coulter社製, Mijdrecht, The Netherlands)で染色することで測定された。ＴＣＲＢＶの配列は、文献(Kloosterboer FM et al. Leukemia 2004; 18(4))のとおり測定され、ＴＣＲ鎖（TCR chain）は、Arden et al., Immunogenetics 1995, 42の命名法により命名した。患者からの採取物におけるテトラマー陽性Ｔ細胞の対比染色は、ＴＣＲＢＶ７ ＦＩＴＣ抗体を用いて行われた。
細胞傷害性クローンのＴＣＲＢＶ発現は、ＴＣＲＢＶ７に対するＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体(Beckmann Coulter社製, Mijdrecht, The Netherlands)で染色することで測定された。ＴＣＲＢＶの配列は、文献(Kloosterboer FM et al. Leukemia 2004; 18(4))のとおり測定され、ＴＣＲ鎖（TCR chain）は、Arden et al., Immunogenetics 1995, 42の命名法により命名した。患者からの採取物におけるテトラマー陽性Ｔ細胞の対比染色は、ＴＣＲＢＶ７ ＦＩＴＣ抗体を用いて行われた。
［定量ＰＣＲ］
定量リアルタイムＰＣＲ解析は、文献のとおり行われた(Mensink et al. 1998, Br J Haematol. 102: 768-774参照)。概略としては、総ＲＮＡが、製造者の指示に従い、トリゾール（Invitrogen社製）を用いて異なる細胞集団から単離された。ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡの合成の手順におけるバリエーションを正規化するために、０．５％マウス脾臓細胞が各細胞サンプルに添加された。ランダムプライムｃＤＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲ(ＡＭＶ)用ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット(Roche社製)を用いて、１μｇのｍＲＮＡから合成された。定量リアルタイムＰＣＲが、ＡＢＩ／ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Applied Biosystems社製）により、ｑＰＣＲコアキット(Eurogentec社製, Seraing, Belgium)を用いて行われた。ヒトＡＤＩＲとＰＢＧＤの結果は、マウスＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化され、一細胞あたりの遺伝子発現として表された。ｈＡＤＩＲのプライマーは、エキソン１〜３にわたり設計された。
フォワードプライマー ５’‐ＧＡＣＧＡＣＴＧＴＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡ‐３’,
リバースプライマー ５’‐ＣＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧ‐３’及び
プローブ ５’‐(ＴＥＴ)‐ＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＣＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴ‐(ＴＡＭＲＡ)‐３’。
ｈＰＢＧＤのプライマーとプローブは、
フォワードプライマー ５’‐ＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡ‐３'、
リバースプライマー ５’‐ＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＧＣＧＡＡＴＧ‐３’
及びプローブ ５’‐(ＴＥＴ)‐ＣＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＣＧＣＣ‐(ＴＡＭＲＡ)‐３’であった。
ｍＧＡＰＤＨのプライマーとプローブは:
フォワードプライマー ５’‐ＧＧＧＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡ‐３’，
リバースプライマー ５’‐ＡＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧ‐３’及びプローブ ５’‐(ＴＥＴ)‐ＴＣＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴ‐(ＴＡＭＲＡ)‐３’であった。
定量リアルタイムＰＣＲ解析は、文献のとおり行われた(Mensink et al. 1998, Br J Haematol. 102: 768-774参照)。概略としては、総ＲＮＡが、製造者の指示に従い、トリゾール（Invitrogen社製）を用いて異なる細胞集団から単離された。ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡの合成の手順におけるバリエーションを正規化するために、０．５％マウス脾臓細胞が各細胞サンプルに添加された。ランダムプライムｃＤＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲ(ＡＭＶ)用ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット(Roche社製)を用いて、１μｇのｍＲＮＡから合成された。定量リアルタイムＰＣＲが、ＡＢＩ／ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Applied Biosystems社製）により、ｑＰＣＲコアキット(Eurogentec社製, Seraing, Belgium)を用いて行われた。ヒトＡＤＩＲとＰＢＧＤの結果は、マウスＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化され、一細胞あたりの遺伝子発現として表された。ｈＡＤＩＲのプライマーは、エキソン１〜３にわたり設計された。
フォワードプライマー ５’‐ＧＡＣＧＡＣＴＧＴＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡ‐３’,
リバースプライマー ５’‐ＣＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧ‐３’及び
プローブ ５’‐(ＴＥＴ)‐ＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＣＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴ‐(ＴＡＭＲＡ)‐３’。
ｈＰＢＧＤのプライマーとプローブは、
フォワードプライマー ５’‐ＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡ‐３'、
リバースプライマー ５’‐ＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＧＣＧＡＡＴＧ‐３’
及びプローブ ５’‐(ＴＥＴ)‐ＣＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＣＧＣＣ‐(ＴＡＭＲＡ)‐３’であった。
ｍＧＡＰＤＨのプライマーとプローブは:
フォワードプライマー ５’‐ＧＧＧＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡ‐３’，
リバースプライマー ５’‐ＡＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧ‐３’及びプローブ ５’‐(ＴＥＴ)‐ＴＣＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴ‐(ＴＡＭＲＡ)‐３’であった。
（結果）
［高頻度で発現するｍＨａｇを認識するＨＬＡ‐Ａ２拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンの単離］
本発明者らは、既に再発性ＭＭ後にＤＬＩでの治療に成功した女性患者由来の様々なＴ細胞クローンの単離について説明した。ＣＴＬクローンは、ＳＣＴ前の患者から採取された、照射された骨髄細胞の刺激により、ＩＦＮ−ｙ産生細胞を直接クローニングして作製された。無関係のＥＢＶ ＬＣＬを用いたパネル研究及びＨＬＡアレル特異的抗体を用いたブロッキングの研究により、最も優勢なＣＴＬクローンによる認識は、ＨＬＡ‐Ａ２によって制限されることが示された。ＰＨＡ芽球細胞と無関係の同種ペアのＥＢＶ ＬＣＬの広範なパネル研究により、ＨＬＡ‐Ａ２拘束性Ｔ細胞クローンの大部分がＲＤＲ２を指名し、同一の認識パターンを提示し、試験されたすべてのＨＬＡ−Ａ２個体由来の標的の５７％を溶解した。すべてのＲＤＲ２クローンは、同一のＴＣＲ ＢＶ７Ｓ１、Ｎ領域及びＢＪ１Ｓ４を発現することが見い出され、これらは、同一のクローンＴ細胞(FM Kloosterboer et al.Leukemia. 2005 Jan;19(1)参照)に由来することが実証された。
［高頻度で発現するｍＨａｇを認識するＨＬＡ‐Ａ２拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンの単離］
本発明者らは、既に再発性ＭＭ後にＤＬＩでの治療に成功した女性患者由来の様々なＴ細胞クローンの単離について説明した。ＣＴＬクローンは、ＳＣＴ前の患者から採取された、照射された骨髄細胞の刺激により、ＩＦＮ−ｙ産生細胞を直接クローニングして作製された。無関係のＥＢＶ ＬＣＬを用いたパネル研究及びＨＬＡアレル特異的抗体を用いたブロッキングの研究により、最も優勢なＣＴＬクローンによる認識は、ＨＬＡ‐Ａ２によって制限されることが示された。ＰＨＡ芽球細胞と無関係の同種ペアのＥＢＶ ＬＣＬの広範なパネル研究により、ＨＬＡ‐Ａ２拘束性Ｔ細胞クローンの大部分がＲＤＲ２を指名し、同一の認識パターンを提示し、試験されたすべてのＨＬＡ−Ａ２個体由来の標的の５７％を溶解した。すべてのＲＤＲ２クローンは、同一のＴＣＲ ＢＶ７Ｓ１、Ｎ領域及びＢＪ１Ｓ４を発現することが見い出され、これらは、同一のクローンＴ細胞(FM Kloosterboer et al.Leukemia. 2005 Jan;19(1)参照)に由来することが実証された。
ＲＤＲ２は、あるＭＭ患者から単離されたので、本発明者らは、Ｔ細胞クローンによる溶解に対する彼女のＭＭ細胞の感受性を調査した。ＣＦＳＥに基づく細胞傷害性アッセイが行われ、患者由来の異種の骨髄サンプル内で比較的低頻度に存在するＭＭ細胞の溶解の定量的測定を可能にした。(I Jedema et al, Blood. 2004, 103(7)参照)。溶解は、エフェクター対標的の比が、１：１で４時間、エフェクター細胞と共に骨髄細胞を共培養した後に測定された。ＣＤ１３８は、悪性腫瘍のＭＭ細胞のマーカーとして用いられ、ＣＤ３は、非悪性腫瘍患者由来Ｔ細胞のマーカーとして用いられた。図１ａは、患者由来のＭＭ細胞が、顕著に溶解したのに対し、刺激を受けていない通常のＴ細胞の溶解は、弱かったことを示している。患者由来の活性Ｔ細胞(ＰＨＡ芽球細胞)とＥＢＶ ＬＣＬは、顕著に認識された。ＲＤＲ２による溶解に対する通常の造血細胞の感受性をさらに研究するために、アロＡ２クローンと比較したＨＬＡ‐Ａ２陽性ｍＨａｇ陽性ドナー由来の単核細胞亜集団（mononuclear cell subpopulations）のＲＤＲ２による認識に対する感受性が解析された。アロＡ２クローンとＲＤＲ２による、ＰＨＡ芽球細胞とＥＶＢ ＬＣＬの認識が類似していたのに対して、通常のＢ細胞とＴ細胞のＲＤＲ２が仲介した溶解は、アロＡ２が仲介した溶解と比較してより弱かった（図１ｂ参照）。さらに、単核細胞は、電磁ビーズ細胞ソーティングによりＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞, 単核細胞及びＢ細胞に単離され、ＩＦＮ−γリリースアッセイにおいて、ＲＤＲ２とアロＡ２ＣＴＬを刺激するために用いられた。刺激細胞亜集団のすべてが、アロＡ２ＣＴＬによりＩＦＮ−ｙ分泌を誘導することができた一方、ＲＤＲ２の刺激は、１０分の１以下だった（図１ｃ参照）。
結論として、ＲＤＲ２は、多発性ミエローマ細胞及び活性のあるＴ細胞とＢ細胞の顕著な溶解を引き起こすＨＬＡ‐Ａ２拘束性エピトープを認識した。対照的に、通常の非活性造血細胞の反応性は、直接細胞傷害性とインターフェロンγ分泌のいずれに測定されても比較的弱かった。
［ペプチドの精製と質量分光分析による同定］
ＣＴＬクローンＲＤＲ２によって、認識されるエピトープを同定するために、抗原を発現している８×１０１０ＥＢＶ ＬＣＬ細胞が溶解された。ペプチド−ＨＬＡ複合体は、ＨＬＡ‐Ａ２特異的ＢＢ７．２抗体が結合したプロテインＡカラムでアフィニティ精製された。１０％酢酸でペプチド−ＨＬＡ複合体を溶出及び分解した後、ＨＬＡ‐モノマーとβ２ミクログロブリンからペプチドを分離するために５ｋＤサイズ遠心分離が行われた。凍結乾燥後、ペプチド混合物は、有機溶媒としてイソプロパノールを用いてＲＰ‐ＨＰＬＣに供され、画分が回収された。５１Ｃｒで標識したＴ２細胞が、各画分の小サンプルでロードされた。ＲＤＲ２が添加され、単一の陽性画分を検出することができた。この画分は、続いて有機溶媒としてアセトニトリルを用いてＲＰ‐ＨＰＬＣに供され、分画された。画分は、反応性について試験され、再び陽性画分が見い出された。この画分において存在する最も多数を占める成分（abundantly present masses）を測定するために、画分の一部が、Ｑ‐ＴＯＦ１マススペクトロメーターに直接結合しているナノＬＣシステムに注入された。最も多数を占める成分は、ＨＣＴｐｌｕｓマススペクトロメーターで、衝突活性化解離により分画された。得られた画分パターンの解析は、いくつかの候補ペプチドの配列を導くものであり、続いて合成が行われた。ロイシンとイソロイシンは、候補ペプチドに存在する場合、画分スペクトルにおいては区別ができないので、合成反応においてロイシン又はイソロイシンが組み込まれる各位置で、両方のアミノ酸の混合物が用いられ、「Ｘ」と表示される望ましい位置でロイシン又はイソロイシンのいずれかを含むペプチドの混合物となる。合成ペプチドは、５１Ｃｒ標識Ｔ２細胞をロードするために用いられた。ＲＤＲ２による溶解は、［Ｍ＋２Ｈ]＋＋候補ペプチドにより、ｍ／ｚ＝５２８．８にて、ＳＶＡＰＡＸＡＸＦＰＡ配列は１０ｐＭという低いレベルで再構築された（データは示されず）。さらに、合成ペプチドＳＶＡＰＡＸＡＸＦＰＡは、衝突活性化解離マススペクトロメトリーによる分画に供され、溶出したペプチドと同一の画分を生じた（データは示されず）。
ＣＴＬクローンＲＤＲ２によって、認識されるエピトープを同定するために、抗原を発現している８×１０１０ＥＢＶ ＬＣＬ細胞が溶解された。ペプチド−ＨＬＡ複合体は、ＨＬＡ‐Ａ２特異的ＢＢ７．２抗体が結合したプロテインＡカラムでアフィニティ精製された。１０％酢酸でペプチド−ＨＬＡ複合体を溶出及び分解した後、ＨＬＡ‐モノマーとβ２ミクログロブリンからペプチドを分離するために５ｋＤサイズ遠心分離が行われた。凍結乾燥後、ペプチド混合物は、有機溶媒としてイソプロパノールを用いてＲＰ‐ＨＰＬＣに供され、画分が回収された。５１Ｃｒで標識したＴ２細胞が、各画分の小サンプルでロードされた。ＲＤＲ２が添加され、単一の陽性画分を検出することができた。この画分は、続いて有機溶媒としてアセトニトリルを用いてＲＰ‐ＨＰＬＣに供され、分画された。画分は、反応性について試験され、再び陽性画分が見い出された。この画分において存在する最も多数を占める成分（abundantly present masses）を測定するために、画分の一部が、Ｑ‐ＴＯＦ１マススペクトロメーターに直接結合しているナノＬＣシステムに注入された。最も多数を占める成分は、ＨＣＴｐｌｕｓマススペクトロメーターで、衝突活性化解離により分画された。得られた画分パターンの解析は、いくつかの候補ペプチドの配列を導くものであり、続いて合成が行われた。ロイシンとイソロイシンは、候補ペプチドに存在する場合、画分スペクトルにおいては区別ができないので、合成反応においてロイシン又はイソロイシンが組み込まれる各位置で、両方のアミノ酸の混合物が用いられ、「Ｘ」と表示される望ましい位置でロイシン又はイソロイシンのいずれかを含むペプチドの混合物となる。合成ペプチドは、５１Ｃｒ標識Ｔ２細胞をロードするために用いられた。ＲＤＲ２による溶解は、［Ｍ＋２Ｈ]＋＋候補ペプチドにより、ｍ／ｚ＝５２８．８にて、ＳＶＡＰＡＸＡＸＦＰＡ配列は１０ｐＭという低いレベルで再構築された（データは示されず）。さらに、合成ペプチドＳＶＡＰＡＸＡＸＦＰＡは、衝突活性化解離マススペクトロメトリーによる分画に供され、溶出したペプチドと同一の画分を生じた（データは示されず）。
［ＲＤＲ２認識の遺伝子多型の原因遺伝子の同定］
ＥＭＢＬヌクレオチドデータベースの６フレーム翻訳に対するＳＶＡＰＡＸＡＸＦＰＡ配列は、ブラストサーチにより、ＴＯＲ３Ａとしても知られているＡＤＩＲ遺伝子の代替ＯＲＦ由来の１３〜２３アミノ酸であるＳＶＡＰＡＬＡＬＦＰＡと１００％同一であることが明らかになった(Dron et al. 2002, Genomics 79: 315-325参照)。ＡＤＩＲの７８ヌクレオチドのＣからＴにおける公知の一塩基多型（ＳＮＰ）は、溶出したペプチドの９位置に対応する、２１位置におけるセリン（Ｓ）からフェニルアラニン（Ｆ）への代替転写物におけるアミノ酸残基の変化をもたらす(図２ａ参照)。ペプチドの両方が合成され、Ｔ２細胞にロードされた。ＳＶＡＰＡＬＡＬ‐Ｆ‐ＰＡペプチドは、ＲＤＲ２に認識されたが、ＳＶＡＰＡＬＡＬ‐Ｓ‐ＰＡは認識されなかった（図２ｂ参照)。患者とドナーの細胞由来のＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写され、ＳＮＰに隣接するプライマーを用いて増幅し、３２７ｎｔフラグメントをもたらした。このフラグメントの配列解析により、ドナーがＣＣホモで、患者がＣＴへテロであったことを明らかにした。患者のタイプ遺伝子多型Ｔであって、ドナータイプがＣＣではないこの遺伝子が、ＲＤＲ２の認識の原因であることを示すために、ドナーと患者の両方から構築物が作製された。ＲＤＲ２は、通常開始コドンの５’上流により制御される代替ＯＲＦから生じるペプチドを認識するので、３つの異なるフォワードプライマーが構成された。第一のプライマーは、通常の開始コドンで選択され、それゆえ代替開始コドンを欠いている。第二のプライマーは、転写の開始点で選択され、それゆえ両方とも天然の開始コドンを提供する。第三のプライマーは、代替開始コドンにおいて選択され、通常の開始コドンをも包含した。第二のプライマーを別として、すべての他のプライマーは、ＡＴＧ開始コドンに隣接するＫｏｚａｋ配列を包含した。構築物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１とレポーター遺伝子であるＮＧＦ−レセプターを含むＬＺＲＳベクターでＨｅｌａ細胞に一時的に安定に導入された。患者由来の構築物は、ＲＤＲ２ＣＴＬにより、ＩＦＮ−γリリースを誘導した。さらに、通常のＯＲＦ開始コドンのみを含み代替ＯＲＦ開始コドンを欠いている構築物のトランスフェクションは、ＣＴＬ認識の顕著な減少を示した(図２ｃ参照)。ドナー由来の構築物すべては、ＲＤＲ２によるＩＮＦ−γの誘導ができなかった（データは示されず）。次に、７４人の無関係のＨＬＡ−Ａ２陽性被検者のパネルが、遺伝子多型を決定し、ＲＤＲ２によるＰＨＡ芽球細胞の溶解に対する感受性を判断するためにシークエンシングにより解析された。この特異的ＳＮＰの存在とＣＴＬ反応性の１００％の相関関係は、ＡＤＩＲ遺伝子における７８ｎｔのＣからＴへのＳＮＰが、ＲＤＲ２により認識されるｍＨａｇエピトープＳＶＡＰＡＬＡＬＦＰＡを作製することを証明した（表１参照）。このｍＨａｇは、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆと特定された。
ＥＭＢＬヌクレオチドデータベースの６フレーム翻訳に対するＳＶＡＰＡＸＡＸＦＰＡ配列は、ブラストサーチにより、ＴＯＲ３Ａとしても知られているＡＤＩＲ遺伝子の代替ＯＲＦ由来の１３〜２３アミノ酸であるＳＶＡＰＡＬＡＬＦＰＡと１００％同一であることが明らかになった(Dron et al. 2002, Genomics 79: 315-325参照)。ＡＤＩＲの７８ヌクレオチドのＣからＴにおける公知の一塩基多型（ＳＮＰ）は、溶出したペプチドの９位置に対応する、２１位置におけるセリン（Ｓ）からフェニルアラニン（Ｆ）への代替転写物におけるアミノ酸残基の変化をもたらす(図２ａ参照)。ペプチドの両方が合成され、Ｔ２細胞にロードされた。ＳＶＡＰＡＬＡＬ‐Ｆ‐ＰＡペプチドは、ＲＤＲ２に認識されたが、ＳＶＡＰＡＬＡＬ‐Ｓ‐ＰＡは認識されなかった（図２ｂ参照)。患者とドナーの細胞由来のＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写され、ＳＮＰに隣接するプライマーを用いて増幅し、３２７ｎｔフラグメントをもたらした。このフラグメントの配列解析により、ドナーがＣＣホモで、患者がＣＴへテロであったことを明らかにした。患者のタイプ遺伝子多型Ｔであって、ドナータイプがＣＣではないこの遺伝子が、ＲＤＲ２の認識の原因であることを示すために、ドナーと患者の両方から構築物が作製された。ＲＤＲ２は、通常開始コドンの５’上流により制御される代替ＯＲＦから生じるペプチドを認識するので、３つの異なるフォワードプライマーが構成された。第一のプライマーは、通常の開始コドンで選択され、それゆえ代替開始コドンを欠いている。第二のプライマーは、転写の開始点で選択され、それゆえ両方とも天然の開始コドンを提供する。第三のプライマーは、代替開始コドンにおいて選択され、通常の開始コドンをも包含した。第二のプライマーを別として、すべての他のプライマーは、ＡＴＧ開始コドンに隣接するＫｏｚａｋ配列を包含した。構築物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１とレポーター遺伝子であるＮＧＦ−レセプターを含むＬＺＲＳベクターでＨｅｌａ細胞に一時的に安定に導入された。患者由来の構築物は、ＲＤＲ２ＣＴＬにより、ＩＦＮ−γリリースを誘導した。さらに、通常のＯＲＦ開始コドンのみを含み代替ＯＲＦ開始コドンを欠いている構築物のトランスフェクションは、ＣＴＬ認識の顕著な減少を示した(図２ｃ参照)。ドナー由来の構築物すべては、ＲＤＲ２によるＩＮＦ−γの誘導ができなかった（データは示されず）。次に、７４人の無関係のＨＬＡ−Ａ２陽性被検者のパネルが、遺伝子多型を決定し、ＲＤＲ２によるＰＨＡ芽球細胞の溶解に対する感受性を判断するためにシークエンシングにより解析された。この特異的ＳＮＰの存在とＣＴＬ反応性の１００％の相関関係は、ＡＤＩＲ遺伝子における７８ｎｔのＣからＴへのＳＮＰが、ＲＤＲ２により認識されるｍＨａｇエピトープＳＶＡＰＡＬＡＬＦＰＡを作製することを証明した（表１参照）。このｍＨａｇは、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆと特定された。
［ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ特異的ＣＴＬのテトラマー染色とＦＡＣＳソーティング］
ペプチドＬＢ−ＡＤＩＲ−１ＦとペプチドＳＶＡＰＡＬＡＬ‐Ｓ−ＰＡの両方は、組換えＨＬＡ Ａ＊０２０１分子に結合することができ、テトラマー複合体が産生された。ＲＤＲ２は、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆテトラマーに特異的に結合したが、コントロールのＳＶＡＰＡＬＡＬ−Ｓ−ＰＡテトラマーと、無関係なＨＡ−１コントロールテトラマーは、陰性であった（データは示されず）。ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆテトラマーは、ＤＬＩの前後に患者から採取された一連の血液サンプルを解析するために用いられた。血清パラプロテインレベルは疾患活動性のマーカーとして解析された。ＬＢ−ＡＤＩＲ−１特異的Ｔ細胞は、ＤＬＩ前は検出されなかった一方、ＤＬＩの７週間後に高い数値のＬＢ−ＡＤＩＲ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された(図３ａ参照)。ＬＢ−ＡＤＩＲ−１特異的Ｔ細胞の出現は、急性ＧＶＨＤグレードIIの進展と完全な寛解とに一致した。ＧＶＨＤは、体重１ｋｇあたり１ｍｇのプレドニソロン及びシクロスポリンＡにより治療に成功した。テトラマー陽性Ｔ細胞は、ＦＡＣＳソーティングによりクローン的に単離され、展開された。すべてのテトラマー陽性ＣＴＬクローンは、患者のＥＢＶ細胞とＬＢ−ＡＤＩＲ−１ＦでパルスされているドナーＥＢＶ細胞との両方を溶解することができた（データは示されず）。ＲＤＲ２のＴＣＲによる性質決定によれば、解析された４４の成長クローンのうち４３におけるＢＶ７Ｓ１のＶ−ベータとＢＪ１Ｓ４のＪ領域を用いることができることが示された。しかしながら、ひとつのクローンはＴＣＲＢＶ６Ｓ４を発現した(図３ｂ参照)。ＤＬＩ後７週間の患者のサンプルの解析により、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ陽性Ｔ細胞が低いパーセンテージであると、ＴＣＲ−ＢＶ７に対する抗体が染色されないことが明らかになった(図３ｃ参照)。本来のＲＤＲ２、新たに単離されたＴＣＲと同一のＢＶ７Ｓ１クローン、及びＴＣＲ ＢＶ６Ｓ４発現クローンの機能性の比較が行われた。本来のＲＤＲ２と新たに単離されたＢＶ７Ｓ１クローンの細胞傷害性は、類似していた一方（データは示されず）、ＢＶ６Ｓ４クローンは、明らかにＴ２細胞でロードされるペプチドの認識の減少を示した。ＨＬＡ‐Ａ２陽性及びＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ発現ＥＢＶ ＬＣＬ細胞が標的細胞として用いられた場合、ＢＶ６Ｓ４クローンは再度、より弱い細胞傷害性を示した(図３ｅ参照)。同様の結果がＰＨＡ芽球細胞を用いて得られた（データは示されず）。
ペプチドＬＢ−ＡＤＩＲ−１ＦとペプチドＳＶＡＰＡＬＡＬ‐Ｓ−ＰＡの両方は、組換えＨＬＡ Ａ＊０２０１分子に結合することができ、テトラマー複合体が産生された。ＲＤＲ２は、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆテトラマーに特異的に結合したが、コントロールのＳＶＡＰＡＬＡＬ−Ｓ−ＰＡテトラマーと、無関係なＨＡ−１コントロールテトラマーは、陰性であった（データは示されず）。ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆテトラマーは、ＤＬＩの前後に患者から採取された一連の血液サンプルを解析するために用いられた。血清パラプロテインレベルは疾患活動性のマーカーとして解析された。ＬＢ−ＡＤＩＲ−１特異的Ｔ細胞は、ＤＬＩ前は検出されなかった一方、ＤＬＩの７週間後に高い数値のＬＢ−ＡＤＩＲ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された(図３ａ参照)。ＬＢ−ＡＤＩＲ−１特異的Ｔ細胞の出現は、急性ＧＶＨＤグレードIIの進展と完全な寛解とに一致した。ＧＶＨＤは、体重１ｋｇあたり１ｍｇのプレドニソロン及びシクロスポリンＡにより治療に成功した。テトラマー陽性Ｔ細胞は、ＦＡＣＳソーティングによりクローン的に単離され、展開された。すべてのテトラマー陽性ＣＴＬクローンは、患者のＥＢＶ細胞とＬＢ−ＡＤＩＲ−１ＦでパルスされているドナーＥＢＶ細胞との両方を溶解することができた（データは示されず）。ＲＤＲ２のＴＣＲによる性質決定によれば、解析された４４の成長クローンのうち４３におけるＢＶ７Ｓ１のＶ−ベータとＢＪ１Ｓ４のＪ領域を用いることができることが示された。しかしながら、ひとつのクローンはＴＣＲＢＶ６Ｓ４を発現した(図３ｂ参照)。ＤＬＩ後７週間の患者のサンプルの解析により、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ陽性Ｔ細胞が低いパーセンテージであると、ＴＣＲ−ＢＶ７に対する抗体が染色されないことが明らかになった(図３ｃ参照)。本来のＲＤＲ２、新たに単離されたＴＣＲと同一のＢＶ７Ｓ１クローン、及びＴＣＲ ＢＶ６Ｓ４発現クローンの機能性の比較が行われた。本来のＲＤＲ２と新たに単離されたＢＶ７Ｓ１クローンの細胞傷害性は、類似していた一方（データは示されず）、ＢＶ６Ｓ４クローンは、明らかにＴ２細胞でロードされるペプチドの認識の減少を示した。ＨＬＡ‐Ａ２陽性及びＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ発現ＥＢＶ ＬＣＬ細胞が標的細胞として用いられた場合、ＢＶ６Ｓ４クローンは再度、より弱い細胞傷害性を示した(図３ｅ参照)。同様の結果がＰＨＡ芽球細胞を用いて得られた（データは示されず）。
［認識のためのＡＤＩＲ遺伝子発現と修飾］
ＡＤＩＲ遺伝子についての従前の研究により、ＩＦＮ−αが遺伝子発現を増強することができることが示されてきた(Dron et al., 2002、上記参照)。それゆえ、ＲＤＲ２によるＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆの認識に対するＩＦＮ−αの効果は、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１発現ドナーのＭＮＣを用いて研究された。ＭＮＣは、ＣＴＬ ＲＤＲ２を１：１の割合で添加する前に、１０００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−αの非存在下と存在下で４８時間、前培養された。最大の認識は、合成ペプチド飽和濃度でパルスされたＭＮＣについて試験をすることで決定された。細胞傷害性は、４時間のＣＦＳＥ‐アッセイにおいて測定され(図４ａ参照)、ＩＦＮ−γリリースは、２４時間後に測定された(図４ｂ参照)。ＩＮＦ‐αは、溶解と刺激能の両方の感受性を増強した。間葉幹細胞を発現するＬＢ−ＡＤＩＲ−１ＦとＥＢＶ ＬＣＬは、細胞傷害性アッセイにおいて標的細胞として用いられた。１０％ＦＢＳ中で連続培養した活性ＭＳＣと０．２％ＦＢＳ中で４８時間前培養した静止ＭＳＣの両方のＲＤＲ２溶解が４時間後と２０時間後に測定された（図４ｃ参照)。ＥＢＶ ＬＣＬの強力な溶解が４時間後に観察されたのに対し、活性ＭＳＣの溶解は弱かった。静止ＭＳＣは、ＲＤＲ２により溶解されなかった。インキュベーションを延長したところ、ＥＢＶ ＬＣＬと活性ＭＳＣ両方の溶解は同程度となったが、それでも静止ＭＳＣは、ＲＤＲ２溶解に対して感受性が減少していることが示された。ＡＤＩＲ遺伝子発現は、定量ＰＣＲを行うことで測定された。各細胞サンプルに一定パーセンテージの０．５％マウス脾臓細胞が添加された。各サンプルは、ＡＤＩＲ、ＰＢＧＤ及びマウスＧＡＰＤＨの発現についてアッセイされた。ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡ合成における差異を排除するためにＡＤＩＲとＰＢＧＤの両方の発現レベルがマウスＧＡＰＤＨ発現レベルに正規化された。静止細胞において、ＡＤＩＲとＰＢＧＤの両方のｍＲＮＡレベルは、ＰＨＡ芽球細胞、ＥＢＶ ＬＣＬ、及びＭＳＣにおいて培養されるレベルと比較して弱く、活性化と培養条件とによる遺伝子発現における全般的な増加を示すものであった（表２参照）。さらに、新鮮分離したドナーＭＮＣは、回収２４時間前及び４８時間前に５００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−αでインキュベートした。ＡＤＩＲのｍＲＮＡ発現におけるＩＦＮ−α依存性増加が観察された（表３参照）。結果として、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１抗原とＡＤＩＲ遺伝子発現の両方が、定常状態においては比較的弱く、細胞の活性化の最中には強力にアップレギュレートされうることが示された。
ＡＤＩＲ遺伝子についての従前の研究により、ＩＦＮ−αが遺伝子発現を増強することができることが示されてきた(Dron et al., 2002、上記参照)。それゆえ、ＲＤＲ２によるＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆの認識に対するＩＦＮ−αの効果は、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１発現ドナーのＭＮＣを用いて研究された。ＭＮＣは、ＣＴＬ ＲＤＲ２を１：１の割合で添加する前に、１０００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−αの非存在下と存在下で４８時間、前培養された。最大の認識は、合成ペプチド飽和濃度でパルスされたＭＮＣについて試験をすることで決定された。細胞傷害性は、４時間のＣＦＳＥ‐アッセイにおいて測定され(図４ａ参照)、ＩＦＮ−γリリースは、２４時間後に測定された(図４ｂ参照)。ＩＮＦ‐αは、溶解と刺激能の両方の感受性を増強した。間葉幹細胞を発現するＬＢ−ＡＤＩＲ−１ＦとＥＢＶ ＬＣＬは、細胞傷害性アッセイにおいて標的細胞として用いられた。１０％ＦＢＳ中で連続培養した活性ＭＳＣと０．２％ＦＢＳ中で４８時間前培養した静止ＭＳＣの両方のＲＤＲ２溶解が４時間後と２０時間後に測定された（図４ｃ参照)。ＥＢＶ ＬＣＬの強力な溶解が４時間後に観察されたのに対し、活性ＭＳＣの溶解は弱かった。静止ＭＳＣは、ＲＤＲ２により溶解されなかった。インキュベーションを延長したところ、ＥＢＶ ＬＣＬと活性ＭＳＣ両方の溶解は同程度となったが、それでも静止ＭＳＣは、ＲＤＲ２溶解に対して感受性が減少していることが示された。ＡＤＩＲ遺伝子発現は、定量ＰＣＲを行うことで測定された。各細胞サンプルに一定パーセンテージの０．５％マウス脾臓細胞が添加された。各サンプルは、ＡＤＩＲ、ＰＢＧＤ及びマウスＧＡＰＤＨの発現についてアッセイされた。ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡ合成における差異を排除するためにＡＤＩＲとＰＢＧＤの両方の発現レベルがマウスＧＡＰＤＨ発現レベルに正規化された。静止細胞において、ＡＤＩＲとＰＢＧＤの両方のｍＲＮＡレベルは、ＰＨＡ芽球細胞、ＥＢＶ ＬＣＬ、及びＭＳＣにおいて培養されるレベルと比較して弱く、活性化と培養条件とによる遺伝子発現における全般的な増加を示すものであった（表２参照）。さらに、新鮮分離したドナーＭＮＣは、回収２４時間前及び４８時間前に５００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−αでインキュベートした。ＡＤＩＲのｍＲＮＡ発現におけるＩＦＮ−α依存性増加が観察された（表３参照）。結果として、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１抗原とＡＤＩＲ遺伝子発現の両方が、定常状態においては比較的弱く、細胞の活性化の最中には強力にアップレギュレートされうることが示された。
［ＭＭ細胞、白血病性芽球及び固形がん細胞系に対するＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆの発現］
免疫療法用の標的としてＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆの適用性を調査するため、悪性血液疾患に対するＲＤＲ２の反応性を調査した。ＨＬＡ‐Ａ２陽性ＭＭと白血病細胞のパネルが、ＲＤＲ２溶解とＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ遺伝子多型についての配列解析に供された。ＭＭにおいて最も顕著な認識が見い出されたが、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ ＳＮＰを発現している白血病細胞もまた溶解された（図５ａ参照）。固形がん株を発現しているＳＮＰ陽性ＨＬＡ‐Ａ２のパネルが、ＲＤＲ２による溶解への感受性について試験された。メラノーマＢＲＯＷＮ、子宮頸がんＣＡＳＫＩ、乳がんＭＣＦ‐７、及び神経芽球細胞腫ＴＴは、すべて、アロＡ２特異的コントロールクローンによる溶解と同程度のレベルでＲＤＲ２により溶解されることができた（図５ｂ参照）。
免疫療法用の標的としてＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆの適用性を調査するため、悪性血液疾患に対するＲＤＲ２の反応性を調査した。ＨＬＡ‐Ａ２陽性ＭＭと白血病細胞のパネルが、ＲＤＲ２溶解とＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ遺伝子多型についての配列解析に供された。ＭＭにおいて最も顕著な認識が見い出されたが、ＬＢ−ＡＤＩＲ−１Ｆ ＳＮＰを発現している白血病細胞もまた溶解された（図５ａ参照）。固形がん株を発現しているＳＮＰ陽性ＨＬＡ‐Ａ２のパネルが、ＲＤＲ２による溶解への感受性について試験された。メラノーマＢＲＯＷＮ、子宮頸がんＣＡＳＫＩ、乳がんＭＣＦ‐７、及び神経芽球細胞腫ＴＴは、すべて、アロＡ２特異的コントロールクローンによる溶解と同程度のレベルでＲＤＲ２により溶解されることができた（図５ｂ参照）。
Claims (18)
- 天然ｈＡＤＩＲアレルの転写物のヌクレオチド配列に存在するオープンリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を含むペプチドであって、アミノ酸配列がＭＨＣクラスＩ又はIIの副組織適合結合ペプチド多型を含むことを特徴とするペプチド。
- ＭＨＣ結合ペプチドのアミノ酸配列が、ｈＡＤＩＲ遺伝子において一塩基多型（ＳＮＰ）による配列番号１でコードされるアミノ酸残基における多型を含むことを特徴とする請求項１記載のペプチド。
- ペプチドをコードする核酸配列が、表Ａの一塩基多型（ＳＮＰ）を含むことを特徴とする請求項１又は２記載のペプチド。
- リーディングフレームが、配列番号３〜５のアミノ酸配列から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
- ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスII分子と関連していることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
- 請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項５に定義されるＭＨＣ結合ペプチドと相互作用することができるＴＣＲレセプター。
- 核酸ベクター内に任意に含まれることを特徴とする、請求項７に定義されるＴＣＲレセプターをコードする核酸分子。
- 請求項７に定義されるＴ細胞レセプターを含むＴリンパ球。
- 請求項８に定義される核酸分子を含み、請求項７に定義されるＴＣＲを任意に提示する宿主細胞。
- ｈＡＤＩＲ遺伝子を発現している悪性腫瘍を患っている被検者の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜５のいずれかに定義されるペプチド、又は、請求項９若しくは１０に定義される細胞の使用。
- 被検者が、同種造血幹細胞移植を受けていることを特徴とする請求項１１記載の使用。
- 悪性腫瘍が、造血器悪性腫瘍であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の使用。
- 悪性腫瘍が、可欠器官又は組織に存在又は由来する固形腫瘍であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の使用。
- 可欠器官又は組織が、骨髄、脾臓、睾丸、腎臓、卵巣、胸部、前立腺、甲状腺、頸部、子宮、及び膵臓からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の使用。
- ｉ)請求項１〜５のいずれかに定義される抗原ペプチド；
ii)請求項９又は１０に定義される細胞；
iii)請求項１〜５のいずれかに定義される核酸分子及び／又はペプチドをコードするベクター；
iv)請求項７に定義されるＴＣＲをコードする遺伝子及び／又はベクター；
のうち少なくとも一つと、少なくとも一つの医薬的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。 - ＨＬＡ分子と任意に関連している抗原である、ｈＡＤＩＲ副組織適合抗原多型に特異的なヒト又はヒト化抗体。
- 配列番号１のヌクレオチド７８、６７２、７４０、７５２、８５６、１４５４、１７６１及び／又は２０１１のＳＮＰを含むｈＡＤＩＲヌクレオチド配列によりコードされるｈＡＤＩＲｍＨａｇに結合することができ、ＭＨＣクラスＩ又はII分子と任意に関連していることを特徴とする請求項１７記載の抗体。
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