JP2009519244A - 多価キメラｏｓｐｃワクシノーゲンおよび診断用抗原 - Google Patents
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Abstract
【課題】 ライム病に対するワクチンおよび診断薬を創る。
【解決手段】 ライム病のためのワクチンとして、また診断薬として用いるキメラ多価組換えタンパク質を提供する。このキメラタンパク質は、外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域および／またはアルファヘリックス５領域からのエピトープ類を含む。このＯｓｐＣタイプ類は、哺乳類ボレリア感染と関連づけられ得る。
【選択図】図９Ａ
【解決手段】 ライム病のためのワクチンとして、また診断薬として用いるキメラ多価組換えタンパク質を提供する。このキメラタンパク質は、外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域および／またはアルファヘリックス５領域からのエピトープ類を含む。このＯｓｐＣタイプ類は、哺乳類ボレリア感染と関連づけられ得る。
【選択図】図９Ａ
Description
本発明は、概括的には、ライム病のためのワクチンおよび診断薬に関する。より詳しくいうと、本発明は、哺乳類感染に関連する外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）のループ５および／またはアルファヘリックス５領域／ドメインの免疫優性エピトープ類を含むキメラ多価組換えタンパク質を提供する。
ライム病は、北アメリカおよびヨーロッパで最もよくみられる節足動物が媒介する疾患である。それは、スピロヘータ類ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ガリニイ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）およびボレリア・アフゼリイ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）によって引き起こされる。哺乳類への伝染は、感染したマダニ属ダニ〔Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒら、１９８２、Ｂｅｎａｃｈら、１９８３〕に咬まれることにより、起こる。かなりの罹患率がライム病に結び付けられており、米国およびヨーロッパでは、人口の３％までが毎年感染する地域もある〔Ｆａｈｒｅｒら、１９９１〕。感染の結果多全身性炎症性疾患となり、遊走性紅斑、低い発熱、関節痛、筋肉痛、および頭痛を含むこともある初期症状を有する〔Ｓｔｅｅｒｅら、１９７７ａ〕。後期臨床症状は重篤とることがあり、一部に関節炎〔Ｓｔｅｅｒｅら、１９７７ａ；Ｅｉｆｆｅｒｔら、１９９８；Ｓｔｅｅｒｅら、２００４〕、心臓炎〔Ａｓｃｈら、１９９４；Ｎａｇｉら、１９９６ Ｂａｒｔｈｏｌｄら、１９９１〕および神経系合併症〔ＮａｃｈｍａｎおよびＰｏｎｔｒｅｌｌｉ、２００３；ＣｏｙｌｅおよびＳｃｈｕｔｚｅｒ ２００２〕を含む。さらに、ライム病は、ダニにさらされることの懸念から屋外レクリエーションおよび社会活動の減少によりあらわれる重大な社会経済的コストを伴っている。
薬学経済研究では、毎年の疾病リスクが１％を越える公衆において特にライム病ワクチンに対する明らかな必要性があることを示している〔Ｍｅｌｔｚｅｒら、１９９９；Ｓｈａｄｉｃｋら、２００１〕。しかし、現時点では、ワクチンは市販されていない。最初のヒトライム病ワクチンは、ＯｓｐＡに基づくＬＹＭＥｒｉｘであった（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；しかし、その在任期間は短く、売り上げ低下を引き合いに出して、市場から２００２年、自発的に撤退した。売り上げの低下は、現実的であるか想定に過ぎないかはともかくとして、ＨＬＡ−ＤＲ４陽性レシピエントで理論的に出現するかもしれない慢性炎症性関節炎などの起こりうる副作用への懸念に起因するものと判断できる〔Ｋａｌｉｓｈら、１９９３〕。新しいＯｓｐＡに基づくワクシノーゲン類が現在開発されており、この潜在的合併症を低下させる〔Ｋｏｉｄｅら、２００５；Ｗｉｌｌｅｔｔら、２００４〕一方で、ＯｓｐＡに基づくワクチンの実現性についてまだ問題が残っている。ひとつは、長期防御を維持するために必要なブーストの頻度という問題である。ＯｓｐＡはダニ中腸で発現し、ダニ摂食で急激に下方制御され、哺乳類では発現しない〔Ｇｉｌｍｏｒｅ，２００１；Ｓｃｈｗａｎら、１９９５〕。ＯｓｐＡに基づくワクチン類の作用機構は、ダニ内部のスピロヘータ類を標的とすることおよびそれらの伝播を防止することである〔ｄｅ Ｓｉｌｖａら、１９９９〕。伝染はダニ摂食４８時間以内に起こるので、有効な防御は、抗ＯｓｐＡ抗体類の高い循環力価に依存し、頻繁なブーストを必要とする。ＯｓｐＡに基づくワクチン類に関連した固有の問題は、初期感染時に高レベルで発現しかつ殺菌性抗体を惹起する抗原類を使用することで回避できる。
ＯｓｐＣは、ライム病ワクチン開発でかなりの注目を浴びてきた。それは、前記のボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ｓｅｎｓｕ ｌａｔｏ）コンプレックスの単離物類中普遍的な２６ｋｂの環状プラスミド上にコードされている２２ｋＤａの表面露出リポタンパク質である。その発現は、ダニ摂食で誘発され、初期哺乳類感染時に維持され〔Ｓｃｈｗａｎ，２００４〕、それは、感染中遺伝的に安定である〔Ｈｏｄｚｉｃら、２０００；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、１９９４〕。抗ＯｓｐＣ抗体類は、感染に対して防御するものの、前記ワクシノーゲンと配列が近縁であるＯｓｐＣを発現する株類に対してのみ防御することが明らかにされた〔Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９６；Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔら、１９９７；ＧｉｌｍｏｒｅおよびＭｂｏｗ，１９９９；Ｍａｔｈｉｅｓｅｎら、１９９８；Ｓｃｈｅｉｂｌｈｏｆｅｒら、２００３；Ｊｏｂｅら、２００３；Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅら、１９９８；Ｗａｌｌｉｃｈら、２００１；Ｍｂｏｗら、１９９９；Ｐｒｏｂｅｒｔら、１９９７；Ｂｒｏｗｎら、２００５；ＰｒｏｂｅｒｔおよびＬｅＦｅｂｖｒｅ １９９４〕。ＯｓｐＣ配列類の分析で、文字命名（ＡからＵまで）により区別した約２１個のＯｓｐＣ系統発生的なクラスター類またはタイプ類が明らかになった〔Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９；Ｗａｎｇら、１９９９〕。クラスター１個の内部における配列の変動は一般的に２％未満であるが、ＯｓｐＣタイプ類では、２２％も高くなりうる〔Ｗａｎｇら、１９９９；Ｔｈｅｉｓｅｎら、１９９５；ＢｒｉｓｓｏｎおよびＤｙｋｈｕｉｚｅｎ，２００４〕。このようなタイプ間におけるエピトープ類の変動は、単一のＯｓｐＣタイプによるワクチン接種で得られる防御範囲が限定されることを説明する可能性が非常に高い。
ＤｕｎｎおよびＬｕｆｔ名義の米国特許６，２４８，５６２（２００１年６月１９日付）は、同一および／または異なるボレリア種からの対応のおよび／または非対応のタンパク質類由来の少なくとも２個のポリペプチド類から構成されるキメラボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）タンパク質類を記載している。前記キメラタンパク質類に取り込まれたこのキメラポリペプチド類は、ボレリアのいかなる株からのいかなるボレリアタンパク質にも由来し、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、ＯｓｐＤ、ｐ１２、ｐ３９、ｐ４１、ｐ６６およびｐ９３を含む。このキメラタンパク質類は、ボレリア感染に対する免疫診断試薬類としておよびワクチン免疫原として使用できる。しかし、ＯｓｐＣタンパク質類中に存在するループ５およびアルファ５エピトープ類についての言及はない。
両者ともにＬｉｖｅｙ名義で付与された米国特許６，８７２，５５０および６，４８６，１３０（それぞれ、２００５年３月２９日付および２００２年１１月２６日付）は、ライム病に対するワクチン類としての用途のための構築体類を記載しており、それらは、ＯｓｐＣ抗原類を含有している。しかし、これらの特許においてループ５およびアルファ５エピトープ類の特性解析については、言及されていない。
Ｄａｔｔｗｙｌｅｒ名義の米国特許７，００８，６２５（２００６年３月７日付）は、単一のタンパク質内部にあるさまざまなボレリア株類および／またはタンパク質類の抗原性ポリペプチド類を開示している。前記キメラボレリアタンパク質類は、外表面タンパク質ＯｓｐＡおよび外表面タンパク質ＯｓｐＣのポリペプチド断片類から構成されている。これらのタンパク質類は、ライム・ボレリオシスに対して有効であり、また免疫診断試薬類のためにも有効である。しかし、ループ５およびアルファ５エピトープ類の特性解析については、言及されていない。
刊行物“リコンビナントキメリックボレリアプロテインズ・フォー・ダイアグノシス・オブ・ライムディジーズ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｂｏｒｒｅｌｉａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｌｙｍｅ Ｄｉｓｅａｓｅ）”（Ｍａｒｉａ Ｊ．Ｃ．Ｇｏｍｅｓ−Ｓｏｌｅｃｋｉら、２０００。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：２５３０−２５３５）は、前記２つの特許類に関連している。前記著者らは、組換えキメラ類を工学的に作製し、それぞれが、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（ボレリア・ブルグドルフェリ）の重要な抗原性タンパク質類の部分であるＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、フラゲリン（Ｆｌａまたはｐ４１）およびタンパク質ｐ９３を含む。この刊行物は診断に関しているが、最後のパラグラフでワクシノーゲンへの適用を記載している。前記著者らは、前記重要エピトープ類の遺伝的可変性をさらに研究してより優れたキメラ類を作製できることを述べているが、ＯｓｐＣのループ５およびアルファ５エピトープ類については、言及していない。
BUCKLES et al. "Analysis ofantibody response in humans to the type A OspC loop 5 domain and assessment ofthe potential utility of the loop 5 epitope in lyme disease vaccinedevelopment." Clinical and Vaccine Immunology. October 2006, Vol.13,No.10, pages 1162-1165.
KUMARAN et al. "Crystal structureof outer surface protein C (OspC) from the Lyme disease spirochete, Borreliaburgdorferi." The EMBO Journal, 2001, Vol.20, No.5, pages 971-978.
ＷＯ ００／７８９６６
ＵＳＰ ６ ８７２ ５５０
前記先行技術はこれまで、ライム病の予防用および／または治療用の複数ＯｓｐＣタイプ類に対する広い防御を付与するワクチンを提供できなかった。
本発明は、ライム病のためのワクチンおよび診断薬としての用途のためのキメラ多価組換えタンパク質を提供する。本発明は、一部ではあるが、数種の異なるＯｓｐＣ系統発生群類（タイプ類）由来の新規防御性エピトープ類の発見と特性解析に基づいており、それらのそれぞれは、哺乳類（例 ヒト）ライム病感染に関係している。これらのエピトープ類の同定が、異なるＯｓｐＣ感染性タイプ類からの複数エピトープ類を含むキメラタンパク質またはタンパク質類の構築を可能とした。従って、このキメラ組換えタンパク質は、ワクチンとして使用すると、それらＯｓｐＣタイプ類を発現し哺乳類ライム病に関連する複数のボレリア株類に対する広い防御を惹起する。さらに、前記キメラタンパク質は、前記エピトープ類に対する抗体類を有する個体を識別し、従って、ある個体がライム病の原因となる物質に暴露したかまたは感染したかどうかを決定するための診断手段として有用である。本発明のいくつかの態様において、前記エピトープ類は、Ｂ細胞エピトープ類であるかおよび／または免疫優性エピトープ類である。
本発明の目的は、２種以上の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域またはアルファヘリックス５領域から、または両者からのエピトープ類を含むキメラ組換えタンパク質を提供することである。１態様において、前記ＯｓｐＣタイプ類は、Ｓｍａｒ、ＰＬｉ、Ｈ１３、ＰＦｉＭ、ＳＬ１０、ＰＭｉｔ、ＰＫｉ、Ｐｂｅｓ、ＨＴ２２、Ｐｋｏ、ＰＬｊ７、ＶＳ４６１、ＤＫ１５、ＨＴ２５、Ａ、７２ａ、Ｆ、Ｅ、Ｍ、Ｄ、Ｕ、Ｉ、Ｌ、Ｈ、Ｓｚｉｄ、ＰＨｅｚ、ＰＷａ、Ｂ、Ｋ、ＮおよびＣから構成される群から選択される。１態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、ＯｓｐＣタイプ類Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む。別の態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、ＯｓｐＣタイプ類Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む。さらに別の態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、配列番号７５または配列番号２４９中で示される主要アミノ酸配列を有している。いくつかの態様において、前記ＯｓｐＣタイプ類は、侵襲性ボレリア感染と関連している。
本発明はさらに、その必要がある個体においてボレリアに対する免疫応答を惹起する方法を提供する。前記方法は、前記個体に対して２種以上の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域またはアルファヘリックス５領域からのまたは両者からのエピトープ類を含むキメラ組換えタンパク質を投与する段階を含む。本発明の１態様において、前記ＯｓｐＣタイプ類は、Ｓｍａｒ、ＰＬｉ、Ｈ１３、ＰＦｉＭ、ＳＬ１０、ＰＭｉｔ、ＰＫｉ、Ｐｂｅｓ、ＨＴ２２、Ｐｋｏ、ＰＬｊ７、ＶＳ４６１、ＤＫ１５、ＨＴ２５、Ａ、７２ａ、Ｆ、Ｅ、Ｍ、Ｄ、Ｕ、Ｉ、Ｌ、Ｈ、Ｓｚｉｄ、ＰＨｅｚ、ＰＷａ、Ｂ、Ｋ、ＮおよびＣから構成される群から選択される。本発明の１態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、ＯｓｐＣタイプ類Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む。別の態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、ＯｓｐＣタイプ類Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む。さらに別の態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、配列番号７５または配列番号２４９中で示される一次アミノ酸配列を有している。いくつかの態様において、前記ＯｓｐＣタイプ類は、侵襲性ボレリア感染と関連している。
本発明はさらに、ある個体がボレリアに暴露したかまたは感染したかどうかを確認する方法を提供する。前記方法は、１）前記個体から生体サンプルを得ること；２）前記生体サンプルを少なくとも１種の組換えキメラタンパク質、すなわち２種以上の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域またはアルファヘリックス５領域からのまたは両者からのエピトープ類を含む少なくとも１種の組換えキメラタンパク質に暴露させること；および３）前記生体サンプル中の抗体類が前記少なくとも１種のキメラタンパク質に結合するかどうかを決定することを含み、抗体結合の検出がボレリアに対する過去の暴露または感染を表す。本発明の１態様において、前記ＯｓｐＣタイプ類は、Ｓｍａｒ、ＰＬｉ、Ｈ１３、ＰＦｉＭ、ＳＬ１０、ＰＭｉｔ、ＰＫｉ、Ｐｂｅｓ、ＨＴ２２、Ｐｋｏ、ＰＬｊ７、ＶＳ４６１、ＤＫ１５、ＨＴ２５、Ａ、７２ａ、Ｆ、Ｅ、Ｍ、Ｄ、Ｕ、Ｉ、Ｌ、Ｈ、Ｓｚｉｄ、ＰＨｅｚ、ＰＷａ、Ｂ、Ｋ、ＮおよびＣから構成される群から選択される。本発明の１態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、ＯｓｐＣタイプ類Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む。本発明の別の態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、ＯｓｐＣタイプ類Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む。本発明のさらに別の態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、配列番号７５または配列番号２４９中で示される一次アミノ酸配列を有している。本発明のいくつかの態様において、前記ＯｓｐＣタイプ類は、侵襲性ボレリア感染と関連している。
本発明はさらに、２種以上の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域またはアルファヘリックス５領域からのまたは両者からのエピトープ類を含むキメラ組換えタンパク質に対する抗体類を提供する。本発明の１態様において、前記ＯｓｐＣタイプ類は、Ｓｍａｒ、ＰＬｉ、Ｈ１３、ＰＦｉＭ、ＳＬ１０、ＰＭｉｔ、ＰＫｉ、Ｐｂｅｓ、ＨＴ２２、Ｐｋｏ、ＰＬｊ７、ＶＳ４６１、ＤＫ１５、ＨＴ２５、Ａ、７２ａ、Ｆ、Ｅ、Ｍ、Ｄ、Ｕ、Ｉ、Ｌ、Ｈ、Ｓｚｉｄ、ＰＨｅｚ、ＰＷａ、Ｂ、Ｋ、ＮおよびＣから構成される群から選択される。本発明の１態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、ＯｓｐＣタイプ類Ａ、Ｂ、ＫおよびＤ由来のエピトープ類を含む。別の態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、ＯｓｐＣタイプ類Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む。さらに本発明の別の態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、配列番号７５または配列番号２４９中で示される一次アミノ酸配列を有している。いくつかの態様において、前記ＯｓｐＣタイプ類は、侵襲性ボレリア感染と関連している。前記抗体類は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであってもよい。本発明の１態様において、前記抗体は、ボレリアスピロヘータ類に対して殺菌性である。
本発明は、さらにキメラ組換えタンパク質類の免疫原性カクテルを提供する。前記カクテルにおける各キメラ組換えタンパク質は、２種以上の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域またはアルファヘリックス５領域からのまたは両者からのエピトープ類を含む。
ヒトライム病の予防手段および診断手段として使用できるキメラ組換えタンパク質を提供する。
本発明は、ヒトライム病感染に関連するＯｓｐＣタイプ類の新規防御性、タイプ特異的エピトープ類の同定と特性解析に基づいている。この新規エピトープ類は、ＯｓｐＣのカルボキシル末端の半分にある２個のドメイン類（領域類）内部に局在している。いずれのドメインも、これまで、免疫原性が高いとして同定されたことはなかった。第１のドメイン（本文で、“アルファヘリックス５領域／ドメイン”または“アルファ５領域／ドメイン”または“ヘリックス５領域／ドメイン”と称する）は、残基１６０と２００の間に局在し、ループ６の一部、アルファヘリックス５および非構造化Ｃ末端ドメインを含む二次的構造要素類を含有している（Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）。第２のドメイン（本文で“ループ５領域／ドメイン”）は、残基１３１と１５９の間に局在し、アルファヘリックス３の一部、ループ５およびアルファヘリックス４を含む二次構造要素類を含有している（Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）。これらの領域類のそれぞれは、本発明の実施で使用できる少なくとも１個のエピトープを含んでいる。これらの２個のドメイン類からのエピトープ類、またはこれらの２個の領域内部からの抗原性ペプチド類またはポリペプチド類は、本発明の実施において単独でまたは好適にはあるキメラ免疫原中の他のエピトープ類と組み合わせて使用することができる。本発明のいくつかの態様において、前記エピトープ類は、免疫優性エピトープ類である。通常は、前記エピトープ類はＢ細胞エピトープ類であるが、Ｔ細胞エピトープ類も排除するものではない。
前記新規エピトープ類の発見およびこのエピトープ類の異なるＯｓｐＣタイプ類へのマッピングにより、多数のＯｓｐＣタイプ類からの複数の線状、タイプ特異的免疫優性エピトープ類を含む多価キメラタンパク質類の構築が可能となった。ワクチンとして使用すると、前記の多価（ポリバレント）組換えキメラタンパク質は、前記のキメラタンパク質におけるそれらに対応するＯｓｐＣタイプ類を発現するボレリアスピロヘータ類による感染に対して、すなわち極めて感染性の高いそれらのボレリアによる感染に対して広い防御を惹起する。さらに、前記キメラタンパク質は、前記キメラタンパク質に含まれるエピトープ類に対する抗体を有する個体を同定し、かつある個体がライム病の原因物質に暴露したかおよび／または感染したかどうかを決定する診断手段として有用である。
本発明の理解を容易にするため、下記の定義を示す：
抗原：ある抗体によって結合された実体を称しかつ前記抗体の産生を誘発する実体を称するために歴史的に使用されてきた用語。さらに現在の用途では、抗原の意味を、抗体によって結合された実体に限定しており、一方単語“免疫原”は、抗体産生を誘発する実体のために用いられている。本文で検討した実体は免疫原性でありかつ抗原性である場合、免疫原または抗原のいずれかとしてそれに言及するのは、通常は、その意図した用途に従って行われるであろう。用語“抗原”、“免疫原”および“エピトープ”は、この明細書では相互変換可能な形で用いる。
Ｂ細胞エピトープ：Ｂ細胞レセプターによって認識され、分泌された抗体によって結合できる抗原上の特異的化学ドメイン。この用語は、“抗原決定基”と相互交換可能である。
免疫優性エピトープ：主要なあるいは非常に強力な免疫応答を誘発する分子上のエピトープ。
線状エピトープ：ペプチド結合によって結合されたアミノ酸類の単一の、中断されていない連続的鎖を含むエピトープで、ペプチドあるいはポリペプチドを形成する。このようなエピトープは、その一次構造によってすなわち前記鎖中のアミノ酸類の線状配列によって記述できる。
立体構造的エピトープ：アミノ酸類の切断されていない線状配列の部分ではないが前記タンパク質の二次、三次および／または四次相互作用により前記エピトープ中において他の残基類に近接させてある少なくともいくつかのアミノ酸類で構成されるエピトープ。このような残基類は、一次配列に関して前記エピトープ中の他の残基類から離れて局在できるが、タンパク質折り畳みにより前記立体構造的エピトープ中で他の残基類の近くに空間的に局在できる。
ループ５領域／ドメイン：図２３に示したタイプＡ ＯｓｐＣ配列類の残基類１３１から１５９と並ぶ残基類を含むＯｓｐＣの領域。前記領域に含まれる株Ｂ３１ ＯｓｐＣ二次構造要素類は、アルファヘリックス３、ループ５、およびアルファヘリックス４の部分であり、Ｋｕｍａｒａｎら（２００１）が定義している。
アルファヘリックス５領域／ドメイン：図２３に示した株Ｂ３１（ＯｓｐＣタイプＡ）配列のアミノ酸類１６０乃至２００と並ぶ残基類と図２３に示さなかった前記タンパク質のＣ末端部分（Ｂ３１配列のアミノ酸類２０１−２２０）を含むＯｓｐＣの領域。この領域に含まれる株Ｂ３１ ＯｓｐＣ二次構造要素類は、ループ６の部分、アルファヘリックス５、および構造化されていないＣ末端ドメインであり、Ｋｕｍａｒａｎら（２００１）が定義している。
タンパク質：ペプチド結合によって共有結合された約１００個以上のアミノ酸類の線状配列。
ポリペプチド：ペプチド結合によって共有結合された約２０個から約１００個のアミノ酸類の線状配列。
ペプチド：ペプチド結合によって共有結合された約２０個以下のアミノ酸類の線状配列。
用語“タンパク質”、“ポリペプチド”および“ペプチド”は、本文で相互交換可能に使用してある。
キメラタンパク質：その一次配列が、天然の単一分子でともに出現することはない複数ペプチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質配列類を含む組換えタンパク質。
キメラタンパク質の価数（例 “多価”または“ポリバレント”）とは、前記キメラワクシノーゲンに含まれるＯｓｐＣタイプ特異的エピトープ保有ポリペプチド類の数を称する。たとえば、二価キメラは、タイプＡのアルファヘリックス５およびタイプＢのアルファヘリックス５から構成されるか、またはタイプＡのアルファヘリックス５およびタイプＡのループ５から構成される。各ポリペプチドエピトープ保有領域中には、複数の明確なエピトープ類があることもある。
元々のすなわち天然すなわち野生型配列：ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸類の天然に見られる配列。
組換えペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸：クローニング、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）等のような分子生物学技術を用いて産生させたかおよび／または操作されたペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸。
タイプ特異的：単一系統発生群に主に関連。
侵襲性感染：ＯｓｐＣタンパク質は、ＯｓｐＣタイプを有するボレリアがヒト感染時にダニ咬み傷による当初の接種部位を取り囲む皮膚以外の位置（例 血漿、脳脊髄液等）から単離されたならば、“侵襲性感染に関連する”と言われる。
本発明はしたがって、前記のループ５および／またはアルファヘリックス５領域類からの複数の線状エピトープ類を含む組換えキメラタンパク質類を提供し、それらのうちの少なくとも２個は侵襲性感染に関連する互いに異なるＯｓｐＣタイプ類からである。好適には、約２乃至約２０、および好適には約６乃至約１０の互いに異なるＯｓｐＣタイプ類を表わす抗原性エピトープ類が、単一のキメラタンパク質に含まれる。通常は前記エピトープ類の少なくとも２個は、一次配列が互いに異なりかつ異なるＯｓｐＣタイプ類から派生しているが、あるキメラに単一タイプのエピトープの複数コピーを含むことまたは同一ＯｓｐＣタイプの元来の配列に基づくかあるいはそれに由来する数種の配列類を含むことも可能である。あるキメラにおける線状エピトープ類の総数はやや変動することもあるが、一般的に、その範囲は約１０乃至２０であろう。本発明の１態様において、免疫優性エピトープ類は、ＯｓｐＣタイプ類、Ｓｍａｒ、ＰＬｉ、Ｈ１３、ＰＦｉＭ、ＳＬ１０、ＰＭｉｔ、ＰＫｉ、Ｐｂｅｓ、ＨＴ２２、Ｐｋｏ、ＰＬｊ７、ＶＳ４６１、ＤＫ１５、ＨＴ２５、Ａ、７２ａ、Ｆ、Ｅ、Ｍ、Ｄ、Ｕ、Ｉ、Ｌ、Ｈ、Ｓｚｉｄ、ＰＨｅｚ、ＰＷａ、Ｂ、Ｋ、ＮおよびＣの２種以上から選択される。１態様において、前記キメラタンパク質は４価で、タイプ類Ａ、Ｂ、ＫおよびＤ由来のエピトープ類を含む。別の態様において、前記キメラタンパク質は８価であり、ＯｓｐＣタイプ類Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む。しかし、当業者は、ＯｓｐＣタイプ類の他の組み合わせからのエピトープ類も、結果として生成したキメラが適切な免疫応答を産生しおよび／またはライム病防止においてワクチンとして有効である限りにおいて、同様に使用できることを理解するであろう。他の適切な組み合わせの例は、１）Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｄ；２）Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｃ；３）Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｄ；および４）Ｃ、Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｄを含むがそれらに限定されない。
いくつかの態様においては、ループ５およびアルファヘリックス５領域類は両者とも含まれるであろう。例えば、“Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｄ”構築体は、ＯｓｐＣタイプ類Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、ＫおよびＤのそれぞれのループ５およびヘリックス５領域類を両者ともに含むこともできる。しかし、これは常にそうであるとは限らない。例えば、タイプＡのループ５領域とＥ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ｂ、ＫおよびＤのアルファヘリックス５領域類が含まれることもある；または、各ＯｓｐＣタイプのループ５領域のみが含まれることもある；またはアルファヘリックス５領域のみが含まれることもある；または他の組み合わせが含まれることもある（例 タイプＥ、Ｎ、ＩおよびＣのループ５領域とタイプ類Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｄのアルファヘリックス５領域）。多くのこのような組み合わせを当業者は思い付くであろうし、そのような変形したものも包含することを意図している。
さらに、あるキメラ内部のエピトープ類の直線的順序も変動し得る。一般的に、アミノからカルボキシル末端までの順序は、“ループ５領域、アルファヘリックス５領域、ループ５領域、アルファヘリックス５領域…”等であろう。例えば、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｄ構築体の場合、好適な順序は、前記キメラの長さに沿って“Ｅタイプループ５領域、Ｅタイプアルファヘリックス５領域；Ｎタイプループ５領域、Ｎタイプアルファヘリックス５領域；Ｉタイプループ５領域、Ｉタイプアルファヘリックス５領域…”等であり、異なるＯｓｐＣタイプ類および／または異なるドメイン類は任意に中性リンカー配列類によって分離されている。しかし、この順序は、例えば前記キメラに含ませるために選択した要素類に応じて変えることもできる。ＯｓｐＣタイプ類およびドメイン類のいかなる順序も、結果として生成したキメラが適切な免疫応答を産生しおよび／またはライム病予防におけるワクチンとして有効であること、または診断に有効に使用できる限りにおいて、使用することができる。例示的キメラ配列類の例は、図２５Ａ−Ｊに示される。ボレリア数株類からのＯｓｐＣのタンパク質およびＤＮＡアクセス番号に対する重要なキーを図２６に表形式で示した。
前記キメラタンパク質に含まれるアミノ酸配列類は、アルファヘリックス５および／またはループ５領域類またはそれらの抗原性断片類を含むことができる。“抗原性断片”とは、感染時に認識される少なくとも１個の線状エピトープを含む一次ＯｓｐＣ配列のセグメントを意味する。このようなエピトープは、ＯｓｐＣの組換えタンパク質サブユニット中で発現すると、細胞表面で発現した野生型タンパク質の結合に類似した方法で感染誘発抗体類を結合する能力を保持する。それぞれの抗原性断片は、１個を超える明白なエピトープを含むことがあるであろう。当業者は、あるエピトープに対する抗体類の親和性すなわち結合力の測定がやや不正確であること、およびこの親和性／結合力は、免疫応答時に例えばアフィニティ成熟／体細胞の超変異により有意に変化しうることを理解するであろう。しかし、一般的に、前記キメラタンパク質に対する抗体類結合の親和性／結合力は、天然の未変化アルファ５またはループ５によって発揮される親和性よりも、少なくとも約５０％、好適には約６０％、さらに好適には約７０％、はるかに好適には約８０％、最も好適には約９０−１００％またはそれ以上の範囲にある。一般的に、前記キメラタンパク質類に含まれる抗原性配列類は、アミノ酸類約２０乃至約１００個、好適には約３０乃至約７０個を含むであろうし、前記キメラタンパク質類それ自体は、アミノ酸類を総計約１６０乃至約８００個、好適には約２４０乃至約５６０個を含むであろう。さらに、前記の抗原性配列類は、本文で“エピトープ類”と称されることがあるが、それらが完全な“天然”エピトープを含んでも含まなくてもよく、ただし、それらが本文に記載の抗体結合特性を有する限りにおいてである。
これとは別に、適切な抗原断片類または抗原性配列類またはエピトープ類は、あるキメラタンパク質に取り込まれた時、前記キメラタンパク質を投与した宿主における前記エピトープに対する適当な抗体産生を惹起できる能力によって識別することもできる。当業者は、抗体力価定義が変わりうることを理解するであろう。本文で、“力価”とは、試験タンパク質１００ｎｇを塗布したＥＬＩＳＡウェル上における利用可能な結合部位の半分を結合するであろう抗血清の逆希釈度であると理解される。一般的に、適切な抗体産生は、約１００乃至約１００，０００の範囲、好適には約１０，０００乃至約１００，０００の範囲にある抗体力価を特徴とする。これとは別に、特に診断アッセイにおいて、前記“力価”は、バックグランドの結合レベルの約３倍はなくてはならない。例えば、“陽性”とみなすためには、試験における反応性が未感染個体の血清中で検出された反応性を少なくとも３倍は超えていなければならない。好適には、前記抗体応答は防御性で、すなわち、ワクチン無接種の宿主に比較して、後でボレリアに暴露するワクチン接種宿主における疾患症状の発現を防止するかまたは低減する。
本発明によるひとつの例示的キメラタンパク質のアミノ酸配列を、図９Ｂに示している。この例示的態様において、前記キメラは、タイプＡ ＯｓｐＣからのループ５領域アミノ酸配列類とＯｓｐＣ タイプＢ、ＫおよびＤのアルファヘリックス５領域類配列類を含む。この場合、前記のタイプＡ ＯｓｐＣ配列は、株ＬＤＰ５６からであり、ヌクレオチドアクセス番号はＥＦ０５３５１３でありタンパク質アクセス番号はＡＢＫ４１０５４である；前記タイプＢ ＯｓｐＣは、株ＬＤＰ７３からであり、ヌクレオチドアクセス番号はＥＦ０５３５２５でありかつタンパク質アクセス番号はＡＢＫ４１０６６である；タイプＫ ＯｓｐＣは、株ＬＤＰ８９からであり、ヌクレオチドアクセス番号はＥＦ０５３５２３であり、タンパク質アクセス番号はＡＢＫ４１０６４である；および前記タイプＤ ＯｓｐＣは株ＬＤＰ１１６からであり、ヌクレオチドアクセス番号はＥＦ０５３５２７であり、かつタンパク質アクセス番号はＡＢＫ４１０６８である。当業者は、多くのボレリア株類からのＯｓｐＣが公知であるかまたは発見でき、本発明の実施に使用できることを理解するであろう。
当業者は、本発明のいくつかの態様において、本発明のキメラタンパク質に含ませるために選択したアミノ酸配列類が、直接、ＯｓｐＣタンパク質の元来のすなわち天然の配列の一次アミノ酸配列に対応するが、それが必ずしもそうでない場合もあることを理解するであろう。本発明のキメラタンパク質に含まれるエピトープのアミノ酸配列は、少し変化させることができ、それでもなお、本発明における使用に適しているであろう。例えば、ある保存的アミノ酸置換も、エピトープの免疫応答惹起能力に有害な影響を及ぼすことなく、行うことができるであろう。当業者は、例えば陽電荷アミノ酸を別の陽電荷アミノ酸に置換すること；陰電荷アミノ酸を別の陰電荷アミノ酸と置換すること；疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸と置換することなど、このような保存的置換の性質を理解するであろう。このような置換または本発明のキメラタンパク質に含まれるエピトープの配列を変化させることは、結果として生成したエピトープが適切な免疫応答を惹起する機能を有している限りにおいて、本発明に包含されるとみなされる。さらに、本発明のキメラタンパク質に含まれるアミノ酸配列類は、全長天然エピトープまたはエピトープ含有ドメインを包含する必要はない。当業者は、エピトープであることが公知であるかまたはエピトープ類を含むことが公知であるアミノ酸配列類の切断形態も、さまざまな理由から本発明における使用に好適であることを理解するであろう。このように置換されているかまたはそうでない場合には変化させてあるアミノ酸配列類は、本文で、元来の野生型すなわち天然配列に“基づくか”あるいは“由来する”と称される。一般的に、線状エピトープを“誘導した”かまたは線状エピトープを“基づかせた”ＯｓｐＣタンパク質類は、天然に出現するＯｓｐＣタンパク質類である。これらの天然ＯｓｐＣタンパク質類は、これとは別に、天然すなわち野生型タンパク質類と称される。
一次配列に対するこのような変更は、さまざまな理由のいずれのためにも導入でき、例えば、プロテアーゼ切断部位の削減または導入、溶解度の上昇または低下、折り畳み、イオン性相互作用、塩ブリッジ類等のような分子内あるいは分子間相互作用を促進するかまたは低下させるなどの理由からであり、それらは、そうでない場合には、キメラの長さ方向に沿ってそれぞれのエピトープ類の提示とアクセス可能性を妨害することもある。このような変化は全て、エピトープが派生したもとのＯｓｐＣタイプに対する防御性抗体反応を惹起するべく結果として生成したアミノ酸配列が機能する限りにおいて、本発明に包含されるとみなされる。一般的に、このような置換した配列類は、天然タンパク質中の対応配列と少なくとも約５０％同一であろうし、前記野生型配列と好適には約６０乃至７０、さらに好適には７０乃至８０、または８０乃至９０％同一であろうし、好適には、約９５乃至１００％同一であろう。
本発明のいくつかの態様において、前記キメラワクシノーゲン中のそれぞれの線状エピトープ類は、性質が幾分なりとも中性である介在配列類によって互いに分離されており、すなわち、それらは、ボレリアに対してそれ自体の中でおよびそれ自体の力で免疫応答を惹起するのではない。このような配列類は、あるキメラのエピトープ類の間に存在することもあれば存在しないこともある。もし存在するならば、それらは、例えば、前記エピトープ類の分離に役立ち、前記エピトープ類の互いからの立体的単離に寄与する。これとは別に、このような配列類は、組換え処理操作例えばクローニング操作の単なるアーティファクトであることもある。このような配列類は、典型的には、リンカーまたはスペースペプチド類として公知であり、それらの多くの例が、当業者に公知である。例えば、Ｃｒａｓｔｏ、Ｃ．Ｊ．およびＪ．Ａ．Ｆｅｎｇ．２０００．ＬＩＮＫＥＲ：融合タンパク質類のためのリンカー配列類産生プログラムを参照。非構造化リンカー類を記載した参考書であるプロテインエンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）１３（５）：３０９−３１２。構造化（例 ヘリカル）配列リンカー類は、また、例えば、その二次構造を有することが公知の既存の配列類を用いてまたは前記リンカー類設計のための基本的公知の生化学的原則類を用いても、設計できる。さらに、他の要素類も、前記キメラタンパク質類中には存在でき、例えば、リーダー配列類すなわちタンパク質の精製または検出を促進する前記タンパク質に“タグを付ける”配列類であり、その例は、ヒスチジンタグ類、検出タグ類（例 Ｓ−タグ、またはＦｌａｇ−タグ）、公知のＴ細胞エピトープ含有配列類のような他の抗原性アミノ酸配列類およびタンパク質安定化モチーフ類等が含まれるがそれらに限定されない。さらに、前記キメラタンパク質類は、例えば、アミド化、スルホニル化、脂質化、または当業者に公知の他の技術類によって化学的に修飾することもできる。
本発明はさらに、本発明のキメラタンパク質類をコードする核酸配列類を提供する。このような核酸類には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのハイブリッド類等が含まれる。さらに、本発明は、このようなコードする配列類を含むか宿しているベクター類を包含する。適切なベクター類の例には、プラスミド類、コスミド類、ウイルスに基づくベクター類、発現ベクター類等が含まれるが、それらに限定されない。好適な態様において、前記ベクターは、プラスミド発現ベクターであろう。
本発明のキメラタンパク質類は、いかなる適切な方法でも産生させることができ、それらの多くは、当業者に公知である。例えば、前記タンパク質類は、化学的に合成できるか、または、組換えＤＮＡ技術を（例 菌細胞中において、細胞培養物（哺乳類、酵母または昆虫細胞）中において、植物類または植物細胞中において、または細胞非含有原核または真核細胞に基づく発現系中において、他のインビトロ系によって、等）用いて産生させることができる。本発明はまた、特にライム病（ライム・ボレリオシス（Ｌｙｍｅ ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ））として出現した時においてボレリア感染を防止するかまたは処置するワクチンとして利用することもできる免疫応答惹起における使用のための組成物類を提供する。免疫応答を惹起するとは、抗原投与が特異的抗体類の合成を起こすか（上記の力価で）および／または細胞性増殖を起こすことを意味しており、それらは、３Ｈチミジン取り込みによって測定される。“ワクチン”とは、ワクチン無接種（例 添加物のみ）対照生物に比較して、免疫応答を惹起し、その結果、ボレリアによるチャレンジに対して防御し、全体的にまたは部分的にボレリア感染に関連した症状（すなわち、ライム病の症状）を防止するかまたは停止させる。前記組成物類は、本文に述べたような１種以上の実質的に精製された組換えキメラタンパク質類および薬理学的に適切な担体を含む。前記組成物中の複数のキメラタンパク質類は、同一であっても異なってもよく、すなわち、前記組成物は、異なるキメラ類の“カクテル”であってもよく、または、ある組成物は、単一タイプのキメラを含む。ワクチンとしての用途のための上記組成物類の調製は、当業者に周知である。典型的には、液状溶液類または懸濁液類のいずれかとし調製されるが、錠剤、丸剤および粉末剤等のような固体形状も考慮される。投与前液体中における溶液または懸濁液に適した固体形状も同様に調製できる。前記調製物はまた、懸濁化することもできる。上記活性成分類は、薬学的に許容できかつ前記活性成分と相溶性の賦形剤類と混合することもできる。適切な賦形剤類は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、またはそれらの組み合わせである。さらに、前記組成物は、湿潤化また懸濁化剤類、ｐＨ緩衝剤類等のような少量の補助物質類を含むことができる。本発明のワクチン調製物類はさらに、アジュバントを含むことができ、その適切な例は、セピック（Ｓｅｐｐｉｃ）、クイル（Ｑｕｉｌ）Ａ、アルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）等を含むがそれらに限定されない。もし前記組成物の経口形態を投与することを望むならば、さまざまな粘稠剤類、芳香剤類、希釈剤類、懸濁剤類、分散補助剤類または結合剤等を添加できる。本発明の組成物は、前記組成物を投与に適した形状で提供するためにこのような付加的成分類のいずれも含むことができる。前記処方類における最終的なキメラタンパク質の量は、変えることができる。しかし、一般的に、前記製剤類中における量は、約０．０１−９９重量／容量％である。
前記方法類は、薬理学的に許容できる担体中にキメラ組換えタンパク質を含む組成物を哺乳類に投与することを必要とする。本発明のワクチン調製物類は、当業者に周知の多くの適切な手段のいずれによっても投与でき、注入によって、吸入によって、経口によって、経鼻的に、前記キメラタンパク質を含有する食品摂取によって等のような手段を含むがそれらに限定されない。好適な態様において、投与様式は、皮下または筋肉内である。さらに、前記組成物類は、免疫系をブーストする物質類、化学療法剤類等のような他の治療手段類と連携させて投与することもできる。
本発明は、ボレリアに対する免疫応答を惹起しかつ哺乳類においてボレリア感染に対してワクチン接種する方法類を提供する。１態様において、前記哺乳類はヒトである。しかし、当業者は、このようなワクチン接種が同様に望ましい他の哺乳類も存在することを理解するであろうし、例えば、前記調製物類は、また、獣医学目的のために使用することもできる。例には、イヌ、ネコ等のようなコンパニオン“ペット類”；家畜、ウマ、牡牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ等のような食料源となりかつ労働およびレクリエーション用にもなる動物類；ボレリアの貯蔵場所として作用する野生動物類（例 マウス、シカ）さえも含むがそれらに限定されない。本発明はまた、診断薬および本発明のキメラタンパク質類内部に含まれるエピトープ類に対する抗体類を有するヒトを識別するために前記診断薬を用いる方法を提供する。ボレリア暴露の疑いがあるかまたはボレリア暴露のリスクのある個体（例 ヒト、シカ、またはボレリアスピロヘータ類による感染の疑いのある他の哺乳類）から得た生体サンプルを、本発明のキメラタンパク質類に接触させる。公知の方法論を用いて、前記キメラタンパク質と前記生体サンプル中の抗体類の間における結合反応の有無を、検出する。陽性の結果（結合が起こり、したがって、抗体類が存在する）は、前記個体がボレリアに暴露したことがあるかおよび／または感染していることを示唆する。この関係からして、分析目標に応じて、ＯｓｐＣタイプ類の問題のいずれのサブセットに対しても特異的なキメラ類が構築でき、すなわち、あらゆる可能なＯｓｐＣタイプ類は、前記診断薬キメラに含まれることもあるし含まれないこともある。
さらに、本発明の診断薬の様相は、臨床的使用または家庭での使用に限定されず、例えば、ダニ類から単離されたボレリアスピロヘータ類を同定し、ＯｓｐＣタイプ類の地理的分布を調べること、等、研究手段として実験室での用途に対しても貴重なものであろう。
本発明は、本文に開示したエピトープ類および／またはキメラタンパク質類に対する抗体類も包含する。このような抗体類は、ポリクローナル、モノクローナルまたはキメラであってもよく、当業者に公知のいかなる方法でも産生させることができる。本発明の好適な態様において、前記抗体類は殺菌性であり（殺ボレリア性）、すなわち、前記抗体類に対してボレリアスピロヘータ類を暴露させて前記スピロヘータ類を死滅させる。このような抗体類は、例えば、ボレリアに対する過去の暴露を診断するための検出試薬類として、ボレリア研究のためのキット中試薬として、ボレリア感染を処置するため等、さまざまに使用できる。
（実施例）
下記の実施例は、本発明のさまざまな態様を例示するために提供するが、いかなる意味でも限定するものとみなすべきではない。
下記の実施例は、本発明のさまざまな態様を例示するために提供するが、いかなる意味でも限定するものとみなすべきではない。
侵襲性ヒトライム病単離物中におけるＯｓｐＣタイプ多様性の実証とＯｓｐＣ抗体応答の特異性を定義するこれまで特性解析されていないエピトープ類の同定
はじめに
ライム病は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ガリニイ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）またはボレリア・アフゼリイ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）に感染したイクソデス（Ｉｘｏｄｅｓ）ダニ類による咬み傷を通じてヒトに伝染する。外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）は、伝染過程に関連しかつおそらく哺乳類における初期感染の確立にも関与する重要な毒性因子と考えられている（Ｇｒｉｍｍら、２００４；Ｐａｒｌら、２００４；Ｓｃｈｗａｎら、１９９５）。ＯｓｐＣは、約２２ｋＤａの表面露出性のプラスミドにコードされた可変リポタンパク質である（Ｆｕｃｈｓら、１９９２；Ｍａｒｃｏｎｉら、１９９３；Ｓａｄｚｉｅｎｅら、１９９３）。結晶構造は、３種のＯｓｐＣタンパク質類について明らかになっている（Ｅｉｃｋｅｎら、２００１；Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）。前記タンパク質は大部分がヘリカルであり、５個のアルファへリックスが可変性のループで連結されている。前記ループは、リガンド結合ドメインを形成すると仮説を立てられてきた（Ｅｉｃｋｅｎら、２００１；Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）。証拠は、ＯｓｐＣがスピロへータのダニ中腸からの転移を唾液腺中の未同定レセプター類に結合するアドヒシンとして作用することによって促進するかもしれないことを示唆している（Ｐａｌら、２００４）。ＯｓｐＣのオルソログが再燃性発熱群の数種で同定され、このＯｓｐＣ関連タンパク質類が他のボレリア種においても同様の役割を果たしている可能性を示唆している（Ｍａｒｃｏｎｉら、１９９３；Ｍａｒｇｏｌｉｓら、１９９４）。ＯｓｐＣ発現は環境的に制御されており、ダニ摂食により誘発され、ＯｓｐＣは、哺乳類における初期感染時の主要抗原である（Ａｌｖｅｒｓｏｎら、２００３；Ｓｃｈｗａｎら、１９９８；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、１９９５）。転写は、ＲｐｏＮ／Ｓ制御ネットワークによって少なくとも部分的には制御されている（Ｈｕｂｎｅｒら、２００１）。伝播時および初期感染時におけるＯｓｐＣ発現の一時的性質の正確な詳細については、互いに矛盾する報告があることに留意せねばならない（Ｏｈｎｉｓｈｉら、２００１；Ｓｃｈｗａｎら、１９９５）。
はじめに
ライム病は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ガリニイ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）またはボレリア・アフゼリイ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）に感染したイクソデス（Ｉｘｏｄｅｓ）ダニ類による咬み傷を通じてヒトに伝染する。外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）は、伝染過程に関連しかつおそらく哺乳類における初期感染の確立にも関与する重要な毒性因子と考えられている（Ｇｒｉｍｍら、２００４；Ｐａｒｌら、２００４；Ｓｃｈｗａｎら、１９９５）。ＯｓｐＣは、約２２ｋＤａの表面露出性のプラスミドにコードされた可変リポタンパク質である（Ｆｕｃｈｓら、１９９２；Ｍａｒｃｏｎｉら、１９９３；Ｓａｄｚｉｅｎｅら、１９９３）。結晶構造は、３種のＯｓｐＣタンパク質類について明らかになっている（Ｅｉｃｋｅｎら、２００１；Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）。前記タンパク質は大部分がヘリカルであり、５個のアルファへリックスが可変性のループで連結されている。前記ループは、リガンド結合ドメインを形成すると仮説を立てられてきた（Ｅｉｃｋｅｎら、２００１；Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）。証拠は、ＯｓｐＣがスピロへータのダニ中腸からの転移を唾液腺中の未同定レセプター類に結合するアドヒシンとして作用することによって促進するかもしれないことを示唆している（Ｐａｌら、２００４）。ＯｓｐＣのオルソログが再燃性発熱群の数種で同定され、このＯｓｐＣ関連タンパク質類が他のボレリア種においても同様の役割を果たしている可能性を示唆している（Ｍａｒｃｏｎｉら、１９９３；Ｍａｒｇｏｌｉｓら、１９９４）。ＯｓｐＣ発現は環境的に制御されており、ダニ摂食により誘発され、ＯｓｐＣは、哺乳類における初期感染時の主要抗原である（Ａｌｖｅｒｓｏｎら、２００３；Ｓｃｈｗａｎら、１９９８；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、１９９５）。転写は、ＲｐｏＮ／Ｓ制御ネットワークによって少なくとも部分的には制御されている（Ｈｕｂｎｅｒら、２００１）。伝播時および初期感染時におけるＯｓｐＣ発現の一時的性質の正確な詳細については、互いに矛盾する報告があることに留意せねばならない（Ｏｈｎｉｓｈｉら、２００１；Ｓｃｈｗａｎら、１９９５）。
ＯｓｐＣは、有意な遺伝的および抗原性多様性を示す（Ｔｈｅｉｓｅｎら、１９９５；Ｔｈｅｉｓｅｎら、１９９３）。ＯｓｐＣ系統発生群２１種（以下ＯｓｐＣと称する）の輪郭が述べられている（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９；Ｗａｎｇら、１９９９）。ＯｓｐＣタイプ類は、文字命名（ＡからＵ）で区別している。前記データベース中にある数百のＯｓｐＣアミノ酸配列類の分析は、ＯｓｐＣタイプ類での多様性が３０％と高く、ひとつのタイプ内では一般的に６％未満である。Ｓｅｉｎｏｓｔらは、ＯｓｐＣタイプＡ、Ｂ、ＩおよびＫとヒトにおける侵襲性感染との間の相関を仮説として提示している（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）。Ｌａｇａｌらはまた、一重鎖立体構造多形分析によって明らかになった特定のｏｓｐＣ変異体類は、侵襲性ヒト感染と相関すると報告した（Ｌａｇａｌら、２００３）。しかし、Ａｌｇｈａｆｅｒｉおよび共同研究者らによる最近の研究では、この相関の強さを問題にしている（Ａｌｇｈａｆｅｒｉら、２００５）。ＯｓｐＣタイプすなわち配列および宿主―病原体相互作用の機能に及ぼす影響は、研究の重要かつ豊穣な領域を示している。ＯｓｐＣは、ライム病ワクチン開発での使用で研究されてきた（Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔら、１９９７；Ｇｉｌｍｏｒｅら、２００３；Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９９ａ；Ｐｒｏｂｅｒｔら、１９９４；Ｔｈｅｉｓｅｎら、１９９３；Ｗｉｌｓｋｅら、１９９６）。しかし、ＯｓｐＣ変異とＯｓｐＣの抗原性構造についての知識が限定されていることが、こうした努力を複雑にしてきた。ＯｓｐＣは防御性能力を有してはいるが、同一株に対してのみである（Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔら、１９９７；Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９９；Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９９ｂ；ＰｒｏｂｅｒｔおよびＬｅＦｅｂｖｒｅ、１９９４；Ｗｉｌｓｋｅら、１９９６）。このことは、前記防御性エピトープ類が、配列が極めて可変性である前記タンパク質の領域内部に属することを示唆している。
本研究の目標は、幾重にも重なるものであった。最初に、ＯｓｐＣタイプと侵襲性感染の間の推定上の相関を評価することを、メリーランド州の一定の患者群から回収した侵襲性および非侵襲性単離物類のＯｓｐＣタイプを決定することによって、行った。第２に、ＯｓｐＣに対する抗体応答をさらに理解するための試みの中で、前記応答がタイプ特異的であるかどうか決定しようとした。最後に、ＯｓｐＣの抗原性構造の明確化を、マウスにおいて感染時の抗体応答を惹起するエピトープ類を同定することによって、行った。本文に示したデータは、侵襲性感染に関連したＯｓｐＣタイプ類の数が過去に前提していたよりも大きいことを示唆している（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）。さらに、我々は、これまで特性解析されていないエピトープ類を２種同定し、ＯｓｐＣに対する抗体応答がタイプ特異的であるようだということを明らかにした。これらの分析は、ライム病病因論におけるＯｓｐＣの役割についての我々の理解を深めかつＯｓｐＣに基づくワクチンの構築を促進する重要な情報を提供する。
実験操作
菌単離物類、感染血清の培養および産生
メリーランド州ヒト患者から回収したライム病単離物類を、これらの分析で使用した（表１）。患者は、本研究前にインフォームドコンセントを提出し、Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより承認された。スピロヘータ類は、３３℃においてＢＳＫ−Ｈ完全培地（Ｓｉｇｍａ）で培養し、暗視野顕微鏡法でモニタリングし、遠心分離により採取した。クローン群は、先に記載されているようにサブサーフェィスプレーティングによって一部の単離物類のために作製した（Ｓｕｎｇら、２０００）。各コロニー類のｏｓｐＣタイプを決定するため、（下記に述べるように）ｏｓｐＣ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、配列決定し、比較配列分析を行った。公知タイプのＯｓｐＣタンパク質類を発現するクローン群シリーズに対する抗血清を産生させるため、スピロヘータ類１０３を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、Ｃ３Ｈ−ＨｅＪマウスに針を接種した（皮下、肩甲骨の間；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）。前記マウスの感染は、先に記載されているように（Ｚｈａｎｇら、２００５）ｆｌａＢ遺伝子を標的とするプライマー類を用いて接種第２または４週後に耳穿孔生検物のリアルタイムＰＣＲによって、確認した。血液は各マウスから尾部の切断により第０、２、４および８週時点で採取し、感染血清を採取した。これらの分析で使用した付加的抗血清と感染血清は先に記載されている（ＭｃＤｏｗｅｌｌら、２００２）。
菌単離物類、感染血清の培養および産生
メリーランド州ヒト患者から回収したライム病単離物類を、これらの分析で使用した（表１）。患者は、本研究前にインフォームドコンセントを提出し、Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより承認された。スピロヘータ類は、３３℃においてＢＳＫ−Ｈ完全培地（Ｓｉｇｍａ）で培養し、暗視野顕微鏡法でモニタリングし、遠心分離により採取した。クローン群は、先に記載されているようにサブサーフェィスプレーティングによって一部の単離物類のために作製した（Ｓｕｎｇら、２０００）。各コロニー類のｏｓｐＣタイプを決定するため、（下記に述べるように）ｏｓｐＣ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、配列決定し、比較配列分析を行った。公知タイプのＯｓｐＣタンパク質類を発現するクローン群シリーズに対する抗血清を産生させるため、スピロヘータ類１０３を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、Ｃ３Ｈ−ＨｅＪマウスに針を接種した（皮下、肩甲骨の間；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）。前記マウスの感染は、先に記載されているように（Ｚｈａｎｇら、２００５）ｆｌａＢ遺伝子を標的とするプライマー類を用いて接種第２または４週後に耳穿孔生検物のリアルタイムＰＣＲによって、確認した。血液は各マウスから尾部の切断により第０、２、４および８週時点で採取し、感染血清を採取した。これらの分析で使用した付加的抗血清と感染血清は先に記載されている（ＭｃＤｏｗｅｌｌら、２００２）。
ＤＮＡ単離、ＯｓｐＣタイピングおよびコンピュータ利用の構造解析
前記ＯｓｐＣタイプを決定するため、総ＤＮＡを先に記載されているように各株から単離し（Ｍａｒｃｏｎｉら、２００３）、ＯｓｐＣ２０（＋）ＬＩＣおよびＯｓｐＣ２１０（−）ＬＩＣプライマー類によるＰＣＲのためのテンプレートとして用いた（表２）。ＰＣＲは、下記のサイクル条件下でエクスパンドハイフィデリティ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った：初期変性は９４℃で２分間；９４℃で１５秒、５０℃で３０秒、６８℃で６０秒を１０サイクル；９４℃で１５秒、５０℃で３０秒、６８℃で６０秒に、最終２０サイクル目のそれぞれに５秒追加する；最終伸長は６８℃で７分間。キアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて増幅物類を回収し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し一重鎖オーバーハング類を産生させ、ｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にアニーリングさせ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換した。これらの操作類のための方法は、前記製造業者の説明に従って進めた。コロニーをアンピシリン耐性について選択し（５０μｇｍｌ−１）、ＰＣＲによってｏｓｐＣインサートをスクリーニングした。選択したコロニーをＬＢ培地（Ｆｉｓｈｅｒ）に移し、振動させながら（３００ｒｐｍ）３７℃で培養し、キアフィルター・ミディ・プラスミド・アイソレーション・キット類〔ＱｉａＦｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）〕を用いてプラスミドを単離した。ｏｓｐＣインサート類を、作業毎の料金支払いという方式で配列決定した（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。決定した配列類を、デフォルトパラメータ類によるＣｌｕｓｔａｌＸ（３５）を用いて、翻訳し並べた。ＯｓｐＣタイプを決定するため、隣接する結合ツリーを作成し、ブーツストラップ値を計算した（１０００回試行）。結果として生成した系統発生図を、Ｎ−Ｊプロッターで見えるようにした、前記データベースで利用可能な追加のＯｓｐＣ配列類もこの分析に含めた。ＯｓｐＣの構造モデルを、ＮＣＢＩ分子モデルデータベースファイル類１ＧＧＱ、１Ｆ１Ｍ、および１Ｇ５Ｚ （４、１５）およびｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ＣＮ３Ｄ／ｃｎ３ｄ．ｓｈｔｍｌで入手可能なソフトウェアＣＮ３Ｄを用いて作成した。
前記ＯｓｐＣタイプを決定するため、総ＤＮＡを先に記載されているように各株から単離し（Ｍａｒｃｏｎｉら、２００３）、ＯｓｐＣ２０（＋）ＬＩＣおよびＯｓｐＣ２１０（−）ＬＩＣプライマー類によるＰＣＲのためのテンプレートとして用いた（表２）。ＰＣＲは、下記のサイクル条件下でエクスパンドハイフィデリティ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った：初期変性は９４℃で２分間；９４℃で１５秒、５０℃で３０秒、６８℃で６０秒を１０サイクル；９４℃で１５秒、５０℃で３０秒、６８℃で６０秒に、最終２０サイクル目のそれぞれに５秒追加する；最終伸長は６８℃で７分間。キアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて増幅物類を回収し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し一重鎖オーバーハング類を産生させ、ｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にアニーリングさせ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換した。これらの操作類のための方法は、前記製造業者の説明に従って進めた。コロニーをアンピシリン耐性について選択し（５０μｇｍｌ−１）、ＰＣＲによってｏｓｐＣインサートをスクリーニングした。選択したコロニーをＬＢ培地（Ｆｉｓｈｅｒ）に移し、振動させながら（３００ｒｐｍ）３７℃で培養し、キアフィルター・ミディ・プラスミド・アイソレーション・キット類〔ＱｉａＦｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）〕を用いてプラスミドを単離した。ｏｓｐＣインサート類を、作業毎の料金支払いという方式で配列決定した（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。決定した配列類を、デフォルトパラメータ類によるＣｌｕｓｔａｌＸ（３５）を用いて、翻訳し並べた。ＯｓｐＣタイプを決定するため、隣接する結合ツリーを作成し、ブーツストラップ値を計算した（１０００回試行）。結果として生成した系統発生図を、Ｎ−Ｊプロッターで見えるようにした、前記データベースで利用可能な追加のＯｓｐＣ配列類もこの分析に含めた。ＯｓｐＣの構造モデルを、ＮＣＢＩ分子モデルデータベースファイル類１ＧＧＱ、１Ｆ１Ｍ、および１Ｇ５Ｚ （４、１５）およびｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ＣＮ３Ｄ／ｃｎ３ｄ．ｓｈｔｍｌで入手可能なソフトウェアＣＮ３Ｄを用いて作成した。
組換えタンパク質類の作成
全長ＯｓｐＣおよび短く切断したＯｓｐＣを作成するため、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）Ｂ３１ＭＩのタイプＡ ｏｓｐＣ配列類（Ｆｒａｓｅｒら、１９９７）に基づき、プライマー類を設計した。前記プライマー類は、リガーゼ非依存性クローニング（ＬＩＣ）かつ発現ベクターであるｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中へのアニーリングを可能とするテイル配列類を有している。全てのＬＩＣ操作類は、先に記載されているようにした（Ｈｏｖｉｓら、２００４）。全構築体類の配列を確認するため、組換えプラスミド類を、ＱｉａＦｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ Ｐｌａｓｍｉｄ精製キット類（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）から精製し、その挿入物類を配列決定した（ＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ）。
全長ＯｓｐＣおよび短く切断したＯｓｐＣを作成するため、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）Ｂ３１ＭＩのタイプＡ ｏｓｐＣ配列類（Ｆｒａｓｅｒら、１９９７）に基づき、プライマー類を設計した。前記プライマー類は、リガーゼ非依存性クローニング（ＬＩＣ）かつ発現ベクターであるｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中へのアニーリングを可能とするテイル配列類を有している。全てのＬＩＣ操作類は、先に記載されているようにした（Ｈｏｖｉｓら、２００４）。全構築体類の配列を確認するため、組換えプラスミド類を、ＱｉａＦｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ Ｐｌａｓｍｉｄ精製キット類（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）から精製し、その挿入物類を配列決定した（ＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析
タンパク質類は、先に記載されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１２．５％クライテリオンプレキャストゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ）（Ｂｉｏｒａｄ）中で分離し、かつ、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上でイムノブロッティングした（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００２）。組換えタンパク質類の発現はＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合物（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて確認した。この発現によって、本研究で用いた全ての組換えタンパク質類の保有Ｎ末端Ｓ−タグ融合物を検出する。このＨＲＰ結合Ｓ−タンパク質を、希釈度１：１０，０００で用いた。イムノブロット分析のため、感染マウスから採取した血清を１：１０００の希釈度で用いた。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧは、二次（Ｐｉｅｒｃｅ）として作用し、希釈度１：１０，０００で用いた。全般的イムノブロット方法は、先に記載されている通りであった（Ｍｅｔｔｓら、２００３）。
タンパク質類は、先に記載されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１２．５％クライテリオンプレキャストゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ）（Ｂｉｏｒａｄ）中で分離し、かつ、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上でイムノブロッティングした（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００２）。組換えタンパク質類の発現はＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合物（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて確認した。この発現によって、本研究で用いた全ての組換えタンパク質類の保有Ｎ末端Ｓ−タグ融合物を検出する。このＨＲＰ結合Ｓ−タンパク質を、希釈度１：１０，０００で用いた。イムノブロット分析のため、感染マウスから採取した血清を１：１０００の希釈度で用いた。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧは、二次（Ｐｉｅｒｃｅ）として作用し、希釈度１：１０，０００で用いた。全般的イムノブロット方法は、先に記載されている通りであった（Ｍｅｔｔｓら、２００３）。
結果
メリーランド州のヒトライム病患者から回収した単離物のｏｓｐＣタイピング分析
ｏｓｐＣは、メリーランド州ヒトライム病患者から回収した分析単離物類のそれぞれから増幅し、成功した。各増幅物の配列を決定し、比較配列分析を行ってＯｓｐＣタイプを決定した（図１）。Ａ（ｎ＝６）、Ｂ（ｎ＝１）、Ｃ（ｎ＝１）、Ｄ（ｎ＝１）、Ｈ（ｎ＝２），Ｋ（ｎ＝４），およびＮ（ｎ＝３）を含むいくつかの互いに異なるＯｓｐＣタイプ類の代表的なものを同定した。ＯｓｐＣタイプ類Ａ、Ｂ、ＩおよびＫのみがヒトにおける侵襲性感染に関連していると過去に報告されている（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）。本研究では、血液、臓器または脳脊髄液から回収したものとして侵襲性単離物を定義し、一方、非侵襲性単離物類は、皮膚から回収されたものであるが他の体部位には見られないものであった（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）。しかし、ここで、ＯｓｐＣタイプ類Ｃ、ＤおよびＮを発現するいくつかの単離物類が血液中から（ＬＤＰ８４、ＬＤＰ６３、ＬＤＰ１１６およびＬＤＰ１２０）または脳脊髄液から（ＬＤＣ８３）回収され、従って、侵襲性であることが明らかとなっている。この観察は、特定のＯｓｐＣタイプ類と侵襲性感染との相関が厳密なものではないかもしれないこと、および、この相関の強さを再評価する必要があることを示唆している。
メリーランド州のヒトライム病患者から回収した単離物のｏｓｐＣタイピング分析
ｏｓｐＣは、メリーランド州ヒトライム病患者から回収した分析単離物類のそれぞれから増幅し、成功した。各増幅物の配列を決定し、比較配列分析を行ってＯｓｐＣタイプを決定した（図１）。Ａ（ｎ＝６）、Ｂ（ｎ＝１）、Ｃ（ｎ＝１）、Ｄ（ｎ＝１）、Ｈ（ｎ＝２），Ｋ（ｎ＝４），およびＮ（ｎ＝３）を含むいくつかの互いに異なるＯｓｐＣタイプ類の代表的なものを同定した。ＯｓｐＣタイプ類Ａ、Ｂ、ＩおよびＫのみがヒトにおける侵襲性感染に関連していると過去に報告されている（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）。本研究では、血液、臓器または脳脊髄液から回収したものとして侵襲性単離物を定義し、一方、非侵襲性単離物類は、皮膚から回収されたものであるが他の体部位には見られないものであった（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）。しかし、ここで、ＯｓｐＣタイプ類Ｃ、ＤおよびＮを発現するいくつかの単離物類が血液中から（ＬＤＰ８４、ＬＤＰ６３、ＬＤＰ１１６およびＬＤＰ１２０）または脳脊髄液から（ＬＤＣ８３）回収され、従って、侵襲性であることが明らかとなっている。この観察は、特定のＯｓｐＣタイプ類と侵襲性感染との相関が厳密なものではないかもしれないこと、および、この相関の強さを再評価する必要があることを示唆している。
マウス感染時におけるＯｓｐＣに対する抗体応答のタイプ特異性の分析
感染時においてＯｓｐＣに対して惹起された抗体応答がタイプ特異的であるかどうかを決定するため、タイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、ＫおよびＮ組換えＯｓｐＣタンパク質類を、試験抗原としての用途のために作製した。この組換えタンパク質類をイムノブロッティングし、前記Ａ、ＢまたはＤ ＯｓｐＣタイプのボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類に感染したマウス（上記で決定）から採取した血清でスクリーニングした（図２）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における前記組換えタンパク質類の発現とタンパク質が等量負荷されていることを、Ｎ末端融合におけるＳ−タグを認識するＨＲＰ結合Ｓ−タンパク質によりイムノブロットをスクリーニングすることによって確認した。感染第２週に採取した抗ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）Ｂ３１ＭＩ抗血清（タイプＡ ＯｓｐＣ）でスクリーニングすると、強い反応性が、このタイプＡタンパク質でのみ検出された。ＯｓｐＣに対する強くかつ早期のＩｇＧ応答は、これまでの報告と一致している（Ｔｈｅｉｓｅｎら、１９９５；Ｗｉｌｓｋｅら、１９９３）。感染第８週に採取した血清もまた、主にタイプＡ ＯｓｐＣと反応したが、他のＯｓｐＣタイプ類との弱い交差免疫反応性が観察された。ＬＤＰ１１６およびＬＤＰ７３（それぞれ、ＯｓｐＣタイプＤおよびＤ単離物類）に感染したマウスにおけるＯｓｐＣに対するＡｂ応答もまた、タイプ特異的であった。ＯｓｐＣに対する抗体応答にはかなりの程度のタイプ特異性があること、および、この特異性は、インビボ免疫優性エピトープ類が前記タンパク質のタイプ特異的ドメイン類に局在していることを意味していると結論できる。
感染時においてＯｓｐＣに対して惹起された抗体応答がタイプ特異的であるかどうかを決定するため、タイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、ＫおよびＮ組換えＯｓｐＣタンパク質類を、試験抗原としての用途のために作製した。この組換えタンパク質類をイムノブロッティングし、前記Ａ、ＢまたはＤ ＯｓｐＣタイプのボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類に感染したマウス（上記で決定）から採取した血清でスクリーニングした（図２）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における前記組換えタンパク質類の発現とタンパク質が等量負荷されていることを、Ｎ末端融合におけるＳ−タグを認識するＨＲＰ結合Ｓ−タンパク質によりイムノブロットをスクリーニングすることによって確認した。感染第２週に採取した抗ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）Ｂ３１ＭＩ抗血清（タイプＡ ＯｓｐＣ）でスクリーニングすると、強い反応性が、このタイプＡタンパク質でのみ検出された。ＯｓｐＣに対する強くかつ早期のＩｇＧ応答は、これまでの報告と一致している（Ｔｈｅｉｓｅｎら、１９９５；Ｗｉｌｓｋｅら、１９９３）。感染第８週に採取した血清もまた、主にタイプＡ ＯｓｐＣと反応したが、他のＯｓｐＣタイプ類との弱い交差免疫反応性が観察された。ＬＤＰ１１６およびＬＤＰ７３（それぞれ、ＯｓｐＣタイプＤおよびＤ単離物類）に感染したマウスにおけるＯｓｐＣに対するＡｂ応答もまた、タイプ特異的であった。ＯｓｐＣに対する抗体応答にはかなりの程度のタイプ特異性があること、および、この特異性は、インビボ免疫優性エピトープ類が前記タンパク質のタイプ特異的ドメイン類に局在していることを意味していると結論できる。
マウスにおいて感染時に抗体応答を惹起するＯｓｐＣ線状エピトープ類の局在
感染時に抗体応答を惹起するタイプＡ ＯｓｐＣ線状エピトープ類を同定するため、数種の組換えＯｓｐＣ断片類を産生させ、α−Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｂ３１ＭＩ感染血清（第８週）によりスクリーニングした（図３）。Ｂ３１ＭＩは、ＯｓｐＣタイプＡ産生株である。前記組換えタンパク質類の発現は、ＨＲＰ結合Ｓ−タンパク質によるイムノブロッティングにより確認した。ＯｓｐＣの線状エピトープ類を局在化させるため、前記ＯｓｐＣ断片類のイムノブロットを感染血清でスクリーニングした。１種以上のエピトープ類を含有する２個のドメイン類を局在化し、そのうちのひとつは、アルファへリックス５の残基１６８と２０３の間のタンパク質のＣ末端半分の内部にあり、もうひとつは、ヘリックス３とループ５の残基１３６と１５０の間にある（以後、それぞれ、アルファ５およびループ５エピトープ類と称する）。これらのエピトープ類は、過去に文献で特性解析されていない。
感染時に抗体応答を惹起するタイプＡ ＯｓｐＣ線状エピトープ類を同定するため、数種の組換えＯｓｐＣ断片類を産生させ、α−Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｂ３１ＭＩ感染血清（第８週）によりスクリーニングした（図３）。Ｂ３１ＭＩは、ＯｓｐＣタイプＡ産生株である。前記組換えタンパク質類の発現は、ＨＲＰ結合Ｓ−タンパク質によるイムノブロッティングにより確認した。ＯｓｐＣの線状エピトープ類を局在化させるため、前記ＯｓｐＣ断片類のイムノブロットを感染血清でスクリーニングした。１種以上のエピトープ類を含有する２個のドメイン類を局在化し、そのうちのひとつは、アルファへリックス５の残基１６８と２０３の間のタンパク質のＣ末端半分の内部にあり、もうひとつは、ヘリックス３とループ５の残基１３６と１５０の間にある（以後、それぞれ、アルファ５およびループ５エピトープ類と称する）。これらのエピトープ類は、過去に文献で特性解析されていない。
ｏｓｐＣ配列分析とＯｓｐＣ構造のコンピュータモデリング
前記ループ５およびアルファ５エピトープ類が空間的に前記ＯｓｐＣタンパク質のどこにあるかを決定するため、Ｘ線結晶解析により決定した座標軸（Ｅｉｃｋｅｎら、２００１；Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）を評価し、リボンおよびスペースフィルモデルを、タイプＡ ＯｓｐＣの単量体およびまたは２量体形状について作成した（データは示さず）。タイプＩおよびＥ ＯｓｐＣタンパク質類の単量体形状もまた、モデル化した。これらの解析で、ループ５エピトープがタイプＡ、ＥおよびＩ ＯｓｐＣタンパク質類の単量体および二量体形状の両者の上で表面露出していることが明らかになった。もともとのＸ線結晶解析において、Ｎ−およびＣ末端の両者の一部は、前記組換えタンパク質の一部でないかあるいはモデル化できなかった。いずれにしても、決定した構造類は、Ｎ−およびＣ末端の両者ともに互いに近接し存在していることおよび細胞膜に近いことを示唆している。
前記ループ５およびアルファ５エピトープ類が空間的に前記ＯｓｐＣタンパク質のどこにあるかを決定するため、Ｘ線結晶解析により決定した座標軸（Ｅｉｃｋｅｎら、２００１；Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）を評価し、リボンおよびスペースフィルモデルを、タイプＡ ＯｓｐＣの単量体およびまたは２量体形状について作成した（データは示さず）。タイプＩおよびＥ ＯｓｐＣタンパク質類の単量体形状もまた、モデル化した。これらの解析で、ループ５エピトープがタイプＡ、ＥおよびＩ ＯｓｐＣタンパク質類の単量体および二量体形状の両者の上で表面露出していることが明らかになった。もともとのＸ線結晶解析において、Ｎ−およびＣ末端の両者の一部は、前記組換えタンパク質の一部でないかあるいはモデル化できなかった。いずれにしても、決定した構造類は、Ｎ−およびＣ末端の両者ともに互いに近接し存在していることおよび細胞膜に近いことを示唆している。
タイプ内レベルでループ５およびアルファ５エピトープ類内部における配列変動を評価するため、２２７個のＯｓｐＣ配列類を並べた。これらの分析で、ループ５およびアルファ５エピトープ類両者ともにタイプ間レベルでは極めて可変性であるが、あるタイプの内部では非常によく保存されていることが明らかになった。図４は、（表形式で）各ＯｓｐＣタイプについてループ５およびアルファ５ドメイン配列類を示し、各特定配列が解析したＯｓｐＣ配列類中に検出される頻度を示している。タイプ内レベルでのループ５の保存についての証拠として、５７種のタイプＡループ５エピトープ類の比較を行い、５３種が残基１個または２個でのみ異なる中心から離れた配列類と同一であることが明らかとなった。同様の観察が、アルファ５エピトープ類について指摘された。４３種のタイプＡ ＯｓｐＣ配列類のうち、４２種が残基１６８と２０３の間で同一であった。多くの場合、前記データベースで利用可能な配列類が部分的でかつ変動する量のＣ末端を欠いているので、より少ないアルファ５エピトープ配列類を分析したことに留意されたい。
ループ５エピトープに対する抗体応答がマウス個体に独自のものではないことの実証
ループ５のタイプ内保存とその実質的に短い長さから考えると、ループ５エピトープはキメラＯｓｐＣループ５に基づくワクシノーゲンの開発における用途のための優れた候補であるかもしれない。ループ５エピトープに対する抗体応答が感染時に普遍的に起こり、あるマウス個体に独自のものではなかったことを確認するため、ループ５を含有する１３０−１５０断片のイムノブロットをタイプＡ ＯｓｐＣ産生株類Ｂ３１ＭＩ、ＬＤＰ５６および５Ａ４に感染した数匹の追加マウスからの血清でスクリーニングした。全ての場合において、このエピトープを認識する抗体が検出された（図５）。ループ５に対する応答はＬＤＰ５６感染マウス２からの感染血清で弱かったが、より長く暴露させると、ループ５がこの動物で抗原性であることが明確になった。このことは、これらのエピトープ類に載せられた免疫応答が動物個体に独自のものではないことを明らかに示し、さらに、ワクチン開発におけるその用途可能性についての裏づけを与える。
ループ５のタイプ内保存とその実質的に短い長さから考えると、ループ５エピトープはキメラＯｓｐＣループ５に基づくワクシノーゲンの開発における用途のための優れた候補であるかもしれない。ループ５エピトープに対する抗体応答が感染時に普遍的に起こり、あるマウス個体に独自のものではなかったことを確認するため、ループ５を含有する１３０−１５０断片のイムノブロットをタイプＡ ＯｓｐＣ産生株類Ｂ３１ＭＩ、ＬＤＰ５６および５Ａ４に感染した数匹の追加マウスからの血清でスクリーニングした。全ての場合において、このエピトープを認識する抗体が検出された（図５）。ループ５に対する応答はＬＤＰ５６感染マウス２からの感染血清で弱かったが、より長く暴露させると、ループ５がこの動物で抗原性であることが明確になった。このことは、これらのエピトープ類に載せられた免疫応答が動物個体に独自のものではないことを明らかに示し、さらに、ワクチン開発におけるその用途可能性についての裏づけを与える。
考察
ＯｓｐＣは、ライム病病因に対する重要な寄与因子として明らかに確立されている（Ｇｒｉｍｍら、２００４；Ｐａｌら、２００４；Ｓｃｈｗａｎら、１９９５）。中腸から唾液腺までのライム病スピロヘータの移動時にそれが重要な役割を果たすことについて強力な証拠がある（Ｐａｌら、２００４）。さらに、感染初期においてそれが選択的に発現され、免疫優性抗原であり（Ｆｉｎｇｅｒｌｅら、１９９５；Ｓｃｈｗａｎら、１９９８；Ｗｉｌｓｋｅら、１９９３）、また他者によってライム病単離物の伝播能力において重要な決定因子であると仮説されている（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）。本研究の目標は、ＯｓｐＣタイプと侵襲性感染の間の潜在的相関を試験すること、ＯｓｐＣに対する抗体応答がタイプ特異的であるかどうかを決定すること、および感染時に提示される線状エピトープ類の局在化によってＯｓｐＣの抗原性構造を明確にすることであった。
ＯｓｐＣは、ライム病病因に対する重要な寄与因子として明らかに確立されている（Ｇｒｉｍｍら、２００４；Ｐａｌら、２００４；Ｓｃｈｗａｎら、１９９５）。中腸から唾液腺までのライム病スピロヘータの移動時にそれが重要な役割を果たすことについて強力な証拠がある（Ｐａｌら、２００４）。さらに、感染初期においてそれが選択的に発現され、免疫優性抗原であり（Ｆｉｎｇｅｒｌｅら、１９９５；Ｓｃｈｗａｎら、１９９８；Ｗｉｌｓｋｅら、１９９３）、また他者によってライム病単離物の伝播能力において重要な決定因子であると仮説されている（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）。本研究の目標は、ＯｓｐＣタイプと侵襲性感染の間の潜在的相関を試験すること、ＯｓｐＣに対する抗体応答がタイプ特異的であるかどうかを決定すること、および感染時に提示される線状エピトープ類の局在化によってＯｓｐＣの抗原性構造を明確にすることであった。
ＯｓｐＣの配列分析は、２１種の明白なＯｓｐＣタイプ類の輪郭を叙述し（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）、さらにこれらのうちの４種のみ（タイプ類Ａ，Ｂ、ＩおよびＫ）がヒトにおける侵襲性感染に関係していると仮定された（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）。しかし、最近の研究では、この推定上の相関に疑問がもたれている（Ａｌｇｈａｆｅｒｉら、２００５）。これをさらに解明するため、メリーランド州ヒトライム病患者から回収した侵襲性および非侵襲性ライム病単離物のＯｓｐＣタイプを決定した。これを達成するため、全長ｏｓｐＣ遺伝子をＰＣＲで増幅し、配列決定しかつ比較配列分析を行った。これらの分析では、この患者群における侵襲性ヒト感染に関連したＯｓｐＣタイプ類にはタイプＣ，ＤおよびＮが含まれることを明らかにした。タイプＩ ＯｓｐＣ産生株類は侵襲性ヒト感染に関連した主要タイプであると示唆されている（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）が、メリーランド州患者群で同定された侵襲性単離物のいずれもタイプＩ ｏｓｐＣを保有していなかった。同様に、Ａｌｇｈａｆｅｒｉらはまた、タイプＩ ＯｓｐＣ産生株類を検出しなかった（Ａｌｇｈａｆｅｒｉら、２００５）。まとめると、これらの２種の研究では、グレーターバルチモア地区において１８個の侵襲性単離物類を同定し、下記の内訳を有していた：Ａ、ｎ＝５；Ｂ、ｎ＝２；Ｃ、ｎ＝１；Ｄ、ｎ＝１；Ｈ、ｎ＝１；Ｋ、ｎ＝３およびＮ、ｎ＝７。従って、この地理的領域では、ＯｓｐＣタイプＡおよびＮ産生侵襲性単離物が主であるらしい。これらのデータは、４種のＯｓｐＣタイプ類のみがヒトにおける侵襲性感染に関連しているという仮説に異を唱えるものである。異なる地理的領域からのより大きな患者集団から回収した単離物類のさらなる分析が、ＯｓｐＣタイプ−侵襲性感染相関の有効性をさらに評価するために、またある定めた地理的領域における特定ＯｓｐＣタイプ類の優勢度に差異があるかどうかを決定するために、必要であろう。
明白なＯｓｐＣタイプ類の明示と関連させたＯｓｐＣのワクチン接種により提供される防御の変動（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）は、抗体応答がタイプ特異的であるかもしれない可能性を高めている。この仮説は、ＯｓｐＣによるワクチン接種が同一株に対してのみ防御することが分かったという事実によって裏付けられている（Ｂｏｃｋｅｎｓｔａｄｔら、１９９７；Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９９ａ；ＰｒｏｂｅｒｔおよびＬｅＦｅｂｖｒｅ、１９９４）。この報告までは、感染時におけるＯｓｐＣに対する抗体応答のタイプ特異性が直接評価されたことはなかった。これを解明するため、タイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、ＫおよびＮの全長組換えＯｓｐＣタンパク質類シリーズを、公知のＯｓｐＣタイプを発現するクローン群でマウス中に産生された感染血清でスクリーニングした。感染血清の使用は、インビボにおいて前記菌で特異的に提示されるエピトープ類に対する抗体応答に焦点を合わせて評価することを可能にするので、重要である。これらの分析は、ＯｓｐＣのＮおよびＣ末ドメイン内部で配列保存が強いにもかかわらず、分析したＯｓｐＣタイプ類に対する抗体応答がタイプ特異的であることを明らかにした。例えば、タイプＡまたはＤ株類に感染したマウスからの血清は、他のＯｓｐＣタイプ類とはほとんどまたは全く交差免疫反応性がなくタイプ特異的に免疫反応性であった。２１種のＯｓｐＣタイプ類全てに対する抗体応答を分析したわけではないが、上記に示したデータは、前記の保存ドメイン類は免疫優性ではないこと、および感染時に前記菌によって提示されたＯｓｐＣの線状エピトープ類が前記タンパク質の可変領域類（すなわち、タイプ特異的ドメイン類）に含まれることを示唆している。
ＯｓｐＣのエピトープ類を局在化するかまたは同定することを探求した研究はこれまでわずかしか公表されていない。線状構造および立体構造のエピトープ類の両者が同定されている。ＧｉｌｍｏｒｅとＭｂｏｗは、残基６個の短いリーダー配列を越えた独立したＮ末欠損と残基１３個のＣ末切断物が、モノクローナル抗体Ｂ５の結合を完全に破壊することを明らかにした（Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９５ａ；Ｇｉｌｍｏｒｅ，１９９８）。このことから、Ｂ５モノクローナル抗体が立体構造的に定義されたエピトープを認識すると結論された（Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９９ｂ）。この立体構造的に明確にされたエピトープ内部の抗体認識部位を含む残基類の詳細は同定されなかった。モノクローナル抗体Ｂ５で観察されたものと対照的に、細胞結合天然ＯｓｐＣのポリクローナル抗体応答の解析は、ＯｓｐＣの最後の１０個のＣ末残基類またはＮ末の伸長領域の欠損が、感染時に惹起されたＩｇＧによるＯｓｐＣ認識を完全に破壊しないことを明らかにした。結果におけるこうした差異は、おそらく、ポリクローナル抗体対モノクローナル抗体上での中心点を反映しているのであろう。このデータは、立体構造エピトープ類の存在を確かに排除しないが、ＯｓｐＣにも同様に線状エピトープ類があることを明らかに示している。Ｍａｔｈｉｅｓｏｎらは先の研究で、ＯｓｐＣにおける線状エピトープについて報告している（Ｍａｔｈｉｅｓｏｎら、１９９８）。彼らは、ＯｓｐＣのＣ末残基７個が欧州での神経系ボレリア症患者から採取した血清中ＩｇＭにより認識される線状エピトープを構成することを見出した。ＩｇＭ結合はこの報告で評価されていないが、ＯｓｐＣのＣ末残基１０個の欠損がＩｇＧ結合を完全に破壊しなかった。感染誘発ＩｇＧにより認識されるエピトープ類は、前記タンパク質中の数箇所の部位に局在するようである。しかし、このことは、Ｃ末エピトープが存在しないかあるいは感染時に惹起された抗体によって認識されないことを示唆するものではなく、むしろ、ＯｓｐＣ中のどこかほかに局在する付加的エピトープ類があることを示唆している。
より短いＯｓｐＣ断片類のイムノブロット分析により、ＯｓｐＣエピトープ類のより詳細な局在化が可能となった。ＯｓｐＣの抗原性領域は、２個の領域に局在化された。ひとつは残基１３６−１５０にわたり、もうひとつは、残基１６８乃至２１０にわたる。Ｘ線回折分析による座標を用いて作成した構造モデルでは、ループ５と命名した表面露出ループ内部に主に、残基１３６−１５０を配置している（Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）。ループ５はＯｓｐＣの単量体および二量体モデルの両者において表面露出しており、顕著な曲部の内部に位置している。組換えＯｓｐＣが実際には二量体を形成していることが明らかになっている一方、天然のＯｓｐＣがインビボで二量体またはそれより大きいオリゴマー類を形成しているかどうかはまだ決定されていない。ＯｓｐＣの二量体モデルは、３０％を超えて前記タンパク質を含む有意な埋没した界面を示唆している。この程度に埋没した界面は、前記単量体間の緊密な相互作用を示唆しており、前記タンパク質の二量体形状が生物学的に活性な形状であることを示唆するものであると考えられる〔Ｋｕｍａｒａｎら、２００１；Ｅｉｃｋｅｎら、２００１；Ｚｕｃｋｅｒｔら、２００１〕。ＯｓｐＣ二量体において、ループ５内部の残基類は、推定上の立体構造規定リガンド結合ポケットの一部であると予測され、それは、生物学的に重要であるかもしれない。この荷電ポケットは、グルタミン酸およびアスパラギン酸残基類のようなカルボニル基類を含むアミノ酸類によって内側を覆われている。結晶構造が、タイプＡ、Ｉ（Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）およびＥ（Ｅｉｃｋｅｎら、２００１）の３種のＯｓｐＣタンパク質類について決定されている。これらのタンパク質類の全てにおいて、この推定結合ポケットの溶媒構造は、驚くほど良好に保存されている。感染血清中において抗体に対するループ５のアクセス可能性は、このドメインが表面露出されかつ潜在的にリガンド結合に利用できるかも知れないという仮説を裏付ける。ループ５と前記推定上のリガンド結合ポケットの強いタイプ間構造保存にもかかわらず、このドメインの配列は、前記のタイプ間レベルにおいて極めて可変である。残基１６８乃至２１０にわたるアルファ５ドメインの配列もまた、このタイプ間レベルで可変であるが、ただし、最後の残基２０個では極めてよく保存されており、例外とする。タイプ内レベルで十分な保存が存在するかどうかを決定し、一連のタイプ特異的エピトープ類から構成されるキメラＯｓｐＣワクチンの構築を可能とするために、ＯｓｐＣ配列類を並べ、ツリー図を作成した。これらの分析により、前記ＯｓｐＣタイプは、配列２２７種について決定された（データを示さず）。ループ５とアルファ５エピトープ類の両者ともに、タイプ内レベルでよく保存されていることがわかった。例えば、タイプＡ ＯｓｐＣタンパク質類のループ５エピトープは、配列５７個のうちの５４で同じであり、一方、アルファ５エピトープはタイプＡ配列４３個のうちの４２で保存されていた。他のＯｓｐＣタイプ類においてもこれらのドメインがかなりよく保存されていることも同様に判明し、タイプＣからタイプＩ、Ｍ、ＮおよびＯは、ループ５およびアルファ５エピトープ類内部で絶対的なタイプ内保存を示した。
本研究は、侵襲性単離物中においてこれまで認識されていたよりもかなりＯｓｐＣ多様性があることを明らかにしている。本研究はまた、マウスにおけるＯｓｐＣに対する抗体応答が極めてタイプ特異的でありこれまで特性解析されていないループ５およびアルファ５エピトープ類によって定義されることを明らかにしている。初期の研究と本明細書に示したデータは、単一のＯｓｐＣタンパク質では多様な株類に対する防御を伝えないであろうということを示している（Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔら、１９９７）。ひとつの可能なワクチン接種手法は、組換えキメラＯｓｐＣワクシノーゲンの開発において本レポートで同定したエピトープ類を活用することである。ループ５エピトープまたはループ５とアルファ５エピトープ類の併用は、それらがヒトで一貫して抗原性であることが判明すれば、大きな見込みを与えるかも知れない。これらのエピトープ類は長さが比較的短く、線状でかつタイプ内レベルで高度に保存されている。これらの特徴に鑑み、極めて多様なライム病単離物類に対する防御を伝播することができるループ５−アルファ５キメラワクシノーゲンを構築することが技術的に可能であることを当然示している。
タイプＡ ＯｓｐＣループ５ドメインに対するヒトにおける抗体応答の分析とライム病ワクチン開発におけるループ５エピトープの潜在的用途の評価
ライム病スピロヘータ類の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）は、ダニ摂食で発現しかつ初期感染時に発現する２２ｋＤａの免疫優性（Ｆｕｃｈｓら、１９９２）抗原である（Ｓｃｈｗａｎら、１９９５）。ＯｓｐＣに対する強度の抗体応答が自然感染時には発動されるが、この応答は、ＯｓｐＣ産生が感染確立後まもなく停止するので細菌撲滅には至らない（Ｓｃｈｗａｎら、１９９５）。ＯｓｐＣは、重要な毒性因子としておよびライム病ワクチン開発のための強力な候補として出現した。しかし、ＯｓｐＣに基づくワクチンを開発する努力は、株中でのその不均一性により妨害された（Ｔｈｅｉｓｅｎら、１９９３；Ｗｉｌｓｋｅら、１９９６；Ｗｉｌｓｋｅら、１９９３）。ＯｓｐＣによるワクチン接種は高い防御性応答を惹起するが、多くの研究では、株特異的防御のみを報告している（Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔら、１９９７；Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９６；Ｍｂｏｗら、ｎ１９９９；Ｐｒｏｂｅｒｔら、１９９７；Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅら、１９９８；Ｓｃｈｅｉｂｌｈｏｆｅｒら、２００３）。最近の分析で、ＯｓｐＣの抗原性構造についての理解と株特異的防御の基礎についての意義深い洞察が得られた。２１種のＯｓｐＣタイプ類はＡからＵと命名され、明らかにされた（Ｌａｇａｌら、２００３；Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９；Ｗａｎｇら、１９９９）。特異的ＯｓｐＣタイプ類を産生するボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のクローン群でマウスを感染させることによって、初期感染時の前記抗体応答が主にＯｓｐＣタイプ特異的であることが明らかになった（実施例１参照）。このことは、初期感染時に提示された主なエピトープ類がＯｓｐＣのタイプ特異的ドメイン内部に存在する可能性を示唆している。初期の研究では前記２１種のＯｓｐＣタイプのうち４種のみが侵襲性感染と関連していると示唆している（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）一方、最近の研究では、追加のＯｓｐＣタイプ類を産生する単離物類もまた侵襲性感染を確立できることを明らかにした（Ａｌｇｈａｆｅｒｉら、２００５；実施例１）。しかし、タイプＡ ＯｓｐＣは、ヒトで侵襲性感染を起こす株類中で優勢であるようである。タイプＡ ＯｓｐＣのエピトープマッピング分析により、マウスで応答を惹起する前記優性線状エピトープ類のひとつが前記ループ５ドメイン内部に存在することが、明らかになった（実施例１参照）。前記ループ５ドメインはタイプ間レベルで高度に可変であるが、ある一定のタイプの配列類内部で保存されている（実施例１参照）。我々は、本研究で、前記エピトープの位置をさらに正確にし、未変性菌類上でのその表面露出を実証し、それが殺菌性抗体を惹起することを明確にする。
ライム病スピロヘータ類の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）は、ダニ摂食で発現しかつ初期感染時に発現する２２ｋＤａの免疫優性（Ｆｕｃｈｓら、１９９２）抗原である（Ｓｃｈｗａｎら、１９９５）。ＯｓｐＣに対する強度の抗体応答が自然感染時には発動されるが、この応答は、ＯｓｐＣ産生が感染確立後まもなく停止するので細菌撲滅には至らない（Ｓｃｈｗａｎら、１９９５）。ＯｓｐＣは、重要な毒性因子としておよびライム病ワクチン開発のための強力な候補として出現した。しかし、ＯｓｐＣに基づくワクチンを開発する努力は、株中でのその不均一性により妨害された（Ｔｈｅｉｓｅｎら、１９９３；Ｗｉｌｓｋｅら、１９９６；Ｗｉｌｓｋｅら、１９９３）。ＯｓｐＣによるワクチン接種は高い防御性応答を惹起するが、多くの研究では、株特異的防御のみを報告している（Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔら、１９９７；Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９６；Ｍｂｏｗら、ｎ１９９９；Ｐｒｏｂｅｒｔら、１９９７；Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅら、１９９８；Ｓｃｈｅｉｂｌｈｏｆｅｒら、２００３）。最近の分析で、ＯｓｐＣの抗原性構造についての理解と株特異的防御の基礎についての意義深い洞察が得られた。２１種のＯｓｐＣタイプ類はＡからＵと命名され、明らかにされた（Ｌａｇａｌら、２００３；Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９；Ｗａｎｇら、１９９９）。特異的ＯｓｐＣタイプ類を産生するボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のクローン群でマウスを感染させることによって、初期感染時の前記抗体応答が主にＯｓｐＣタイプ特異的であることが明らかになった（実施例１参照）。このことは、初期感染時に提示された主なエピトープ類がＯｓｐＣのタイプ特異的ドメイン内部に存在する可能性を示唆している。初期の研究では前記２１種のＯｓｐＣタイプのうち４種のみが侵襲性感染と関連していると示唆している（Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９）一方、最近の研究では、追加のＯｓｐＣタイプ類を産生する単離物類もまた侵襲性感染を確立できることを明らかにした（Ａｌｇｈａｆｅｒｉら、２００５；実施例１）。しかし、タイプＡ ＯｓｐＣは、ヒトで侵襲性感染を起こす株類中で優勢であるようである。タイプＡ ＯｓｐＣのエピトープマッピング分析により、マウスで応答を惹起する前記優性線状エピトープ類のひとつが前記ループ５ドメイン内部に存在することが、明らかになった（実施例１参照）。前記ループ５ドメインはタイプ間レベルで高度に可変であるが、ある一定のタイプの配列類内部で保存されている（実施例１参照）。我々は、本研究で、前記エピトープの位置をさらに正確にし、未変性菌類上でのその表面露出を実証し、それが殺菌性抗体を惹起することを明確にする。
ＯｓｐＣの免疫優性エピトープ類を定義しようとする多くの研究が、マウスで行われている（Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔら、１９９７；Ｇｉｌｍｏｒｅ、１９９６；Ｍｂｏｗら、１９９９；Ｐｒｏｂｅｒｔら、１９９４）。しかし、いくつかのエピトープ類に対する抗体応答は、ヒト対マウスおよび他の哺乳類で異なっていることが明らかとなった（Ｌｏｖｒｉｃｈら、２００５）。本研究の第一の目的は、ＯｓｐＣの前記ループ５ドメインがヒトにおいて感染時に惹起された抗体によって認識されるかどうかを決定することであった。理想的には、これらの分析は、タイプＡ産生株のクローン群に感染した個体から採取した血清で行われるであろう。個体が不均一または均一群に感染しているかどうかを絶対的に確実に決定することはできないので、我々は、タイプＡ特異的配列に対して応答を示す患者血清を識別することにした。これを成し遂げるため、遊走性紅斑（初期ライム病）患者から採取した血清サンプルパネルを、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってスクリーニングした。組換えタイプ（ｒ−タイプ）Ａ ＯｓｐＣおよびｒ−タイプＡ ＯｓｐＣサブフラグメント含有ループ５残基類１３０乃至１５０を用いて、９６ウェルプレートを塗布した（ｒ−タンパク質２５０ｎｇ／ウェル；０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４；４°Ｃで一晩）。前記プレートをブロックし（リン酸緩衝生理食塩水、０．５％Ｔｗｅｅｅｎ２０中１０％乾燥無脂乳、；３７°Ｃで２時間）、洗浄し、ヒトライム病患者血清（１：４００に希釈）を各ウェルに添加した（３７°Ｃ；１時間）。供給者（Ｓｉｇｍａ）の指示に従い、西洋わさびパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ；Ｓｉｇｍａ）（１：４０，０００希釈物の５０ｌ）を添加し（１時間；３７°Ｃ）、ＴＭＢ基質（３，３，５，５−テトラメチルベンチジン）を添加した。４５０ｎｍにおける光学密度値を、プレートリーダーを用いて決定した。さらに追加ウェルにウシ血清アルブミンを塗布し、陰性対照として使用した。アッセイは全て三重に行った。Ａ４５０平均値を標準偏差とともに示した。図６に示したように、血清サンプル数個は、全長タイプＡ ＯｓｐＣとループ５断片の両者に対して強いＩｇＧ応答を有していることがわかった。血清サンプル８と４４は、ループ５断片と最大強度の免疫反応性を示し、従って、さらに分析するために選択した。
前記ループ５ドメイン内部の感染誘発抗体により認識される残基類をさらに正確に画定するため、ＰｅｐＳｐｏｔアレイを患者８と４４の血清でスクリーニングし、さらに、タイプＡ ＯｓｐＣ産生株Ｂ３１ＭＩのクローン群に感染したマウスの血清でスクリーニングした（実施例１参照）。前記ＰｅｐＳｐｏｔアレイは、Ｗｈａｔｍａｎ５０セルロース膜にスポットしたタイプＡ ＯｓｐＣのループ５ドメインをカバーする１２個乃至１３個の残基重複ペプチド類（２個のアミノ酸段階）から構成されていた（１５０ｎｍｏｌ／ｃｍ２；ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍＢＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。前記ＰｅｐＳｐｏｔ膜をブロックし（トリス緩衝生理食塩水−０．５％Ｔｗｅｅｎ２０中５％乾燥無脂乳）、洗浄し、マウスおよびヒト血清サンプル（ブロック溶液でそれぞれ、１：１，０００および１：４００に希釈）でスクリーニングし、種特異的抗ＩｇＧ抗血清で抗体結合を検出した。免疫反応ドメインを構成する前記特異的残基類はマウスとヒトでわずかに異なるが、主要エピトープ類は、残基１３０乃至１４６内部に局在している（図７）。タイプＡ ＯｓｐＣ配列類中において、この領域は、アルファヘリックス３のＣ末領域とループ５のＮ末部分を包含している。
ＯｓｐＣの結晶構造は、空間的には、ループ５を前記タンパク質のある顕著な曲部に配置している（Ｅｉｃｋｅｎら、２００５；Ｋｕｍａｒａｎら、２００１；図２４）。このループは、潜在的リガンド結合ポケットの部分として仮定されている（Ｋｕｍａｒａｎら、２００１）。ループ５が細胞表面に現れておりかつインビトロで増殖中のスピロヘータ中で抗体にアクセス可能であるかを決定するため、蛍光免疫アッセイ（ＩＦＡｓ）を、抗ループ５抗血清を用いて実施した。ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）Ｂ３１ＭＩ（タイプＡ ＯｓｐＣ）、ボレリア・パルケリ（Ｂ．ｐａｒｋｅｒｉ）およびＳタグｒ−タイプＡループ５の全細胞溶解物類によるイムノブロット分析は、前記ループ５抗血清が特異的であることを実証し、ＩＦＡｓに対するこの抗血清の適切性を確立した。ＩＦＡにより分析した前記株類は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）Ｂ３１ＭＩ（タイプＡ ＯｓｐＣ）およびＬＤＰ７４（タイプＫ ＯｓｐＣ）から構成されていた。前記スピロヘータ類を３３℃で増殖させ、３７℃に３日間移し、ＯｓｐＣ発現を刺激した。ＩＦＡｓは、透過性を高めた細胞類（アセトン固定）、透過性を高めていない細胞類（風乾）、および先に記載（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００２）した標準的方法類により、実施した。このスライド類を、マウスループ５抗血清、マウス前免疫血清またはウサギ−フラゲリン抗血清の１：１，０００希釈物によりスクリーニングした。検出は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８−結合ヤギα−マウスＩｇＧまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８結合ヤギα−ウサギＩｇＧ（ブロック緩衝液中１０μｇｍｌ−１）を用いて、行った。スライドを、適切な場合にはローダミンまたはフルオレセインフィルターセットを用いてオリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡で、または、暗視野顕微鏡によって肉眼で見えるようにし、またオリンパスＭａｇｎａＦＩＲＥカメラを用いて写真撮影した。ＩＦＡによって観察された標識化は極めて特異的で、イムノブロット分析と一致していた；タイプＡ産生単離物を表面標識し、一方、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ＬＤＰ７４タイプＫ ＯｓｐＣは、標識しなかった（データを示さず）。さらに、高温でのＯｓｐＣの上方制御と一致して、ＩＦＡｓが、３３℃で増殖させた細胞よりも３７℃で増殖したスピロヘータ類の表面標識が顕著に高いことを明らかにした。内膜にアンカーしたペリプラズムタンパク質を認識する前記のα−ＦｌａＢ抗血清は、透過性を高めていない細胞類を標識しなかったが、アセトンで透過性を高めた細胞を容易に標識した（データを示さず）。この制御は、前記ループ５が実際には表面に露出していることおよびＩＦＡで用いた実験条件は細胞一体性を破壊せず、それによって、前記菌の表面に天然には提示されないエピトープ類を人工的に露出することを明確にした。
細胞表面でＯｓｐＣに効率的に結合するループ５抗血清の能力は、前記相互作用が殺菌性であるかもしれない可能性を高め、そのことは、全長ＯｓｐＣに対する抗体についても実証されている（Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔら、１９９７；Ｉｋｕｓｈｉｍａら、２０００；Ｊｏｂｅら、２００３；Ｌｏｖｒｉｃｈら、２００５；Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅら、１９９８）。ループ５標的抗体も同様に殺菌活性を示すかどうかを決定するため、３３℃または３７℃に移した温度で培養したボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類Ｂ３１ＭＩとＬＤＰ７４により殺アッセイを行った。前記スピロヘータ類は遠心分離によって採取し、洗浄し、５００ｌ当たり５×１０５細胞に調節し（ＢＳＫ−Ｈ培地中において）、１２．５μｌを、無菌の０．６５ｍｌ容量のミクロ遠心管中に入れた。次に、熱不活性化（５６℃；３０分）ループ５血清１０μｌを、モルモット補体（７．５μｌ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ、Ｍｏ．）とともにあるいはそれなしで添加し、前記成分類を３３または３７℃で８時間混合しインキュベーションした。総計７０μｌのＨ２Ｏを添加し、スピロヘータ類をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ＢａｃＬｉｇｈｔ染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｉｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）で製造業者の取扱説明に従い染色した。簡単に述べると、前記細胞に２種の染色液；ＳＹＴＯ９およびプロピジウムアイオダイドを添加する。これらの色素類は、生きている菌（すなわち、未変性膜を有する）と変成を受けた膜を有する菌とを区別できる。生きている菌はＳＹＴＯ９による染色により緑色の蛍光を発し、一方、死んでいるかまたは傷害を受けた菌はプロピジウムアイオダイドによる染色によって赤色蛍光を発する。前免疫熱不活性化血清（補体ありまたはなし）処理で観察された膜破壊を伴う細胞の基準値は、２５％であった。対照的に、前記α−ループ５抗血清に暴露した細胞の約７０％が膜破壊を示した。殺菌活性は補体依存性であることがわかった。抗ループ５抗体処理によりここで観察された泡状化効果は他の抗ＯｓｐＣ抗体類で報告されているものと一致している（Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔら、１９９７；Ｅｓｃｕｄｅｒｏら、１９９７）。また、高温でのＯｓｐＣの上方制御と一致して、死細胞の百分率は、３３℃で増殖させた菌よりも３７℃で増殖させたスピロヘータ中で一貫して高かった（データを示さず）。提示されたデータから、抗ループ５抗体が殺菌性であることが明白である。
論文数編が、ライム病ワクチン類開発を明確に強く正当化する強い理由を概括的に述べている（ＨａｎｓｏｎおよびＥｄｅｌｍａｎ，２００４でレビューされている）。しかし、現時点では、ワクチンは全く市販されていない。防御性の広いライム病ワクチンを開発しようとして、Ｂａｘｔｅｒは、１４種の互いに異なる全長ｒ−ＯｓｐＣタンパク質のワクチンカクテルを作製する戦略を追及した（ＨａｎｓｏｎおよびＥｄｅｌｍａｎ，２００４）。しかし、前記カクテルは、反応原性が容認できないとされた。この反応原性は、前記カクテル中の各ＯｓｐＣタイプタンパク質の独自の防御性エピトープ類に対する十分な応答を惹起するために大量のタンパク質を必要とした結果、生じたものであるのかもしれない。複数の全長タンパク質を用いるカクテルワクチン類についての潜在的問題は、保存された、無関連の非防御性エピトープ類に対する抗体応答が間違って出される可能性があることである。主要ＯｓｐＣタイプ類のそれぞれの天然提示免疫優性線状エピトープ類から構成されたキメラ、ｒ−ワクシノーゲンの開発を通してこの問題を克服することが可能である。この一般的概念は、異なる感染時期に発現したタンパク質由来のエピトープ類を用いてマラリアワクチン類を開発しようとする試みの中にその起源を有している（ＨａｎｓｏｎおよびＥｄｅｌｍａｎ，２００４）。同じ概念が、Ａ群連鎖球菌のための六価Ｍタンパク質ワクチンの開発に応用され（Ｄａｌｅ，１９９９）、さらに数種のそれ以外の病原体に対するワクチン類開発にも応用され、すばらしい成功を収めた（Ａｐｔａら、２００６；Ｃａｒｏ−Ａｇｕｉｌａｒら、２００５；Ｆａｎら、２００５；Ｈｏｒｖａｔｈら、２００５；Ｋｏｔｌｏｆｆら、２００５；ＭｃＮｅｉｌら、２００５；Ｗａｎｇら、２００５）。ＯｓｐＣの物理的および抗原性構造への新たな洞察を通じて、有効な、ｒ−多価キメラＯｓｐＣワクチンの開発が今や可能とみられる。この新しく同定されたループ５ドメインは、このようなワクチンに取り入れるのに適しており、理想的である。
ＯｓｐＣに基づく４価の組換えキメラワクシノーゲンの開発
ライム病は、北アメリカおよびヨーロッパで最もよく見られる節足動物伝播疾患である。現在では、ヒトで使用するための市販のワクチンは全くない。外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）は抗原性特性および発現特性を有し、そのために魅力的なワクチン候補となっている；しかし、配列不均一性がそのワクシノーゲンとしての使用を妨げてきた。配列分析を通じて、２１種の明確に画定されたＯｓｐＣ系統発生群類すなわち“タイプ類”（ＡからＵと命名）が同定された。本研究は、組換え４価のキメラワクシノーゲンの開発において、ヒトおよびマウス感染時に（先に同定ずみのタイプＡ ＯｓｐＣ線状エピトープ類とともに）ＯｓｐＣタイプ類Ｂ、ＫおよびＤにより提示された線状エピトープ類のマッピングとこれらのエピトープ類の活用を報告した。前記構築体はマウスにおいて非常に免疫原性で、誘発された抗体類は、インビトロ培養スピロヘータ類を表面標識した。ワクチン接種により、前記構築体に取り込まれたＯｓｐＣタイプ類のそれぞれを発現する株類に対して補体依存性の殺菌性抗体類を誘発したことは重要である。これらの結果は、有効で防御性の広い多価ＯｓｐＣ利用のライム病ワクチンが組換えキメラタンパク質として産生できることを示唆している。
ライム病は、北アメリカおよびヨーロッパで最もよく見られる節足動物伝播疾患である。現在では、ヒトで使用するための市販のワクチンは全くない。外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）は抗原性特性および発現特性を有し、そのために魅力的なワクチン候補となっている；しかし、配列不均一性がそのワクシノーゲンとしての使用を妨げてきた。配列分析を通じて、２１種の明確に画定されたＯｓｐＣ系統発生群類すなわち“タイプ類”（ＡからＵと命名）が同定された。本研究は、組換え４価のキメラワクシノーゲンの開発において、ヒトおよびマウス感染時に（先に同定ずみのタイプＡ ＯｓｐＣ線状エピトープ類とともに）ＯｓｐＣタイプ類Ｂ、ＫおよびＤにより提示された線状エピトープ類のマッピングとこれらのエピトープ類の活用を報告した。前記構築体はマウスにおいて非常に免疫原性で、誘発された抗体類は、インビトロ培養スピロヘータ類を表面標識した。ワクチン接種により、前記構築体に取り込まれたＯｓｐＣタイプ類のそれぞれを発現する株類に対して補体依存性の殺菌性抗体類を誘発したことは重要である。これらの結果は、有効で防御性の広い多価ＯｓｐＣ利用のライム病ワクチンが組換えキメラタンパク質として産生できることを示唆している。
材料および方法
ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類および培養
ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類Ｂ３１ＭＩ（タイプＡ ＯｓｐＣ）、ＬＤＰ７３（タイプＢ）、ＬＤＰ１１６（タイプＤ）およびＬＤＰ７４（タイプＫ）のクローン群〔実施例１参照〕を、先に記載されているようにサブサーフェィスプレーティングによって得た〔Ｓｕｎｇら、２０００〕。それぞれのクローン類のＯｓｐＣタイプは、ＰＣＲ増幅（Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ）およびｏｓｐＣのＤＮＡ配列決定により決定し、系統発生的分析によりタイプを振り分けた〔実施例１参照〕。スピロヘータ類は、完全ＢＳＫ−Ｈ培地（Ｓｉｇｍａ）中で先に述べたように３３または３７℃で培養した。
ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類および培養
ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類Ｂ３１ＭＩ（タイプＡ ＯｓｐＣ）、ＬＤＰ７３（タイプＢ）、ＬＤＰ１１６（タイプＤ）およびＬＤＰ７４（タイプＫ）のクローン群〔実施例１参照〕を、先に記載されているようにサブサーフェィスプレーティングによって得た〔Ｓｕｎｇら、２０００〕。それぞれのクローン類のＯｓｐＣタイプは、ＰＣＲ増幅（Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ）およびｏｓｐＣのＤＮＡ配列決定により決定し、系統発生的分析によりタイプを振り分けた〔実施例１参照〕。スピロヘータ類は、完全ＢＳＫ−Ｈ培地（Ｓｉｇｍａ）中で先に述べたように３３または３７℃で培養した。
リガーゼ非依存性クローニングと組換え（ｒ−）ＯｓｐＣタンパク質類の産生
全長タイプＢ、ＫおよびＤのＯｓｐＣと切断物および断片類シリーズとを、各単離物からの対応の遺伝子のＰＣＲ増幅によって産生させた。前記プライマー類は５´オーバーハングを有するように設計し、ｐＥＴ−３２Ｅｋ／ＬＩＣベクター中においてリガーゼ非依存性クローニング（ＬＩＣ）を行った（表３）〔実施例１〕。全てのＬＩＣ方法は、基本的に製造業者（Ｎｏｖａｇｅｎ）の説明書どおりに行った。簡単に述べると、一重鎖テイルの増幅および再生後、増幅物をｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣベクターでアニーリングし、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中に形質転換しそこで増殖させた。前記プラスミド類を回収し、挿入物の配列類をＤＮＡ配列決定によって確認した。タンパク質精製のため、精製したプラスミド類を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換し、対数増殖期に培養物にＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加後３時間インキュベーションし、タンパク質発現を誘発した。ｐＥＴ−３２Ｅｋ／ＬＣベクターからの発現によって付加されたＮ末融合物は、Ｔｒｘ−タグ、Ｓ−タグ、およびヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）モチーフを含んでいる。Ｈｉｓ−ｔａｇを活用し、ニッケルアフィニティクロマトグラフィにより前記ｒ−タンパク質類の精製を行った。簡単に述べると、細胞を融解させ、核酸および細胞壁ペプチドグリカンをそれぞれ、ベンゾナーゼヌクレアーゼとｒ−リゾチームによって分解した。製造業者（Ｎｏｖａｇｅｎ）の説明書どおりに、可溶性タンパク質類を遠心分離（１６０００×ｇで１５分間）によって透明にし、固定ニッケルカラムに流し、洗浄し、溶出させた。溶出されたタンパク質類を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で１０ｋＤａ分子量のカットオフ膜（Ｓｌｉｄ−ａ−ｌｙｚｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ）に対して十分に透析し、最終タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって定量し、前記調製物の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
全長タイプＢ、ＫおよびＤのＯｓｐＣと切断物および断片類シリーズとを、各単離物からの対応の遺伝子のＰＣＲ増幅によって産生させた。前記プライマー類は５´オーバーハングを有するように設計し、ｐＥＴ−３２Ｅｋ／ＬＩＣベクター中においてリガーゼ非依存性クローニング（ＬＩＣ）を行った（表３）〔実施例１〕。全てのＬＩＣ方法は、基本的に製造業者（Ｎｏｖａｇｅｎ）の説明書どおりに行った。簡単に述べると、一重鎖テイルの増幅および再生後、増幅物をｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣベクターでアニーリングし、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中に形質転換しそこで増殖させた。前記プラスミド類を回収し、挿入物の配列類をＤＮＡ配列決定によって確認した。タンパク質精製のため、精製したプラスミド類を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換し、対数増殖期に培養物にＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加後３時間インキュベーションし、タンパク質発現を誘発した。ｐＥＴ−３２Ｅｋ／ＬＣベクターからの発現によって付加されたＮ末融合物は、Ｔｒｘ−タグ、Ｓ−タグ、およびヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）モチーフを含んでいる。Ｈｉｓ−ｔａｇを活用し、ニッケルアフィニティクロマトグラフィにより前記ｒ−タンパク質類の精製を行った。簡単に述べると、細胞を融解させ、核酸および細胞壁ペプチドグリカンをそれぞれ、ベンゾナーゼヌクレアーゼとｒ−リゾチームによって分解した。製造業者（Ｎｏｖａｇｅｎ）の説明書どおりに、可溶性タンパク質類を遠心分離（１６０００×ｇで１５分間）によって透明にし、固定ニッケルカラムに流し、洗浄し、溶出させた。溶出されたタンパク質類を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で１０ｋＤａ分子量のカットオフ膜（Ｓｌｉｄ−ａ−ｌｙｚｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ）に対して十分に透析し、最終タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって定量し、前記調製物の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
イムノブロット分析：ＯｓｐＣタイプＢ、ＤおよびＫのエピトープマッピング
感染時関連エピトープ類のマッピングを可能とするため、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスをＯｓｐＣ タイプＢ、ＫまたはＤを発現するクローン群のスピロヘータ１０４で感染させ、血液を尾部出血によって第２週、第４週、第６週、第８週および第１２週に採取した。これらの血清を用いて、実施例１に記載のように精製したＯｓｐＣタンパク質および切断物類をスクリーニングした。ｒ−タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦに移し、前記のタイプ特異的マウス感染血清（第６週に採取）の１：１０００希釈物によってスクリーニングした。同様に、前記ｒ−タンパク質は、ＯｓｐＣタイプＢ、ＫまたはＤを発現するボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株（Ａｌｌｅｎ Ｓｔｅｅｒｅ博士が親切に供与してくれた）への感染が既知である患者からの血清（１：４００）でスクリーニングした。適切なＩｇＧ特異的西洋わさびパーオキシザーゼ（ＨＲＰ）結合ニ次抗体類を用い、結果を化学発光によって視覚化した。
感染時関連エピトープ類のマッピングを可能とするため、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスをＯｓｐＣ タイプＢ、ＫまたはＤを発現するクローン群のスピロヘータ１０４で感染させ、血液を尾部出血によって第２週、第４週、第６週、第８週および第１２週に採取した。これらの血清を用いて、実施例１に記載のように精製したＯｓｐＣタンパク質および切断物類をスクリーニングした。ｒ−タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦに移し、前記のタイプ特異的マウス感染血清（第６週に採取）の１：１０００希釈物によってスクリーニングした。同様に、前記ｒ−タンパク質は、ＯｓｐＣタイプＢ、ＫまたはＤを発現するボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株（Ａｌｌｅｎ Ｓｔｅｅｒｅ博士が親切に供与してくれた）への感染が既知である患者からの血清（１：４００）でスクリーニングした。適切なＩｇＧ特異的西洋わさびパーオキシザーゼ（ＨＲＰ）結合ニ次抗体類を用い、結果を化学発光によって視覚化した。
４価のキメラワクシノーゲンの構築と発現
タイプＡのループ５領域（ａａ１３１から１４９まで）とタイプＢ（ａａ１６０−２０１）、Ｋ（ａａ１６１−２０１）およびＤ（ａａ１６１−２０１）のアルファヘリックス５領域を、前記の４価試験ワクシノーゲン中に取り込ませるために選択した。各エピトープ含有領域を、上述のｒ−プラスミド類と表４に列挙したプライマー類からＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ条件は標準的であり、当初の２分間は９４℃における変性段階で、その後、９４℃における変性を１５秒間、５０℃におけるプライマーアニーリングを３０秒間、および伸長を７２℃で６０秒間を３５サイクル行い、最終伸長は７２℃で７分間とした。プライマー類は、ベクター特異的ＬＩＣテイル類で設計するかまたは５´オーバーハングとしての構造化されていないプロテアーゼ耐性リンカー配列類で設計した（図９Ａ）〔ＣｒａｓｔｏおよびＦｅｎｇ，２０００〕。全ての増幅物はＴＡＥ緩衝液を用いたアガロースゲル中での電気泳動で分析し、ゲル精製した（ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｑｉａｇｅｎ）。精製した産物をそれ以後のＰＣＲでテンプレートとして用いた。第２回目に、タイプＡループ５およびタイプＢアルファヘリックス５の増幅物を、テンプレートとして結合した。変性後、前記増幅物を、重複伸長を可能とするそれらの相補性リンカー配列類によりアニーリングし、その後の増幅では、前方タイプＡループ５および逆タイプＢアルファヘリックス５プライマー類を用いて行った。タイプＫおよびＤアルファヘリックス５配列類を同様に前記構築体に付加したが、最初の１０サイクルの後アニーリング温度を６０℃に高め、アニーリング特異性を高めた。最終産物を、Ｎ末ヘキサヒスチジンタグ融合物をコードするｐＥｔ−４６Ｅｋ／ＬＩＣ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にアニーリングし、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。ワクシノーゲン配列は、精製したプラスミドのＤＮＡ配列決定によって確認した。タンパク質発現と精製は、上記のようにして完了した。
タイプＡのループ５領域（ａａ１３１から１４９まで）とタイプＢ（ａａ１６０−２０１）、Ｋ（ａａ１６１−２０１）およびＤ（ａａ１６１−２０１）のアルファヘリックス５領域を、前記の４価試験ワクシノーゲン中に取り込ませるために選択した。各エピトープ含有領域を、上述のｒ−プラスミド類と表４に列挙したプライマー類からＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ条件は標準的であり、当初の２分間は９４℃における変性段階で、その後、９４℃における変性を１５秒間、５０℃におけるプライマーアニーリングを３０秒間、および伸長を７２℃で６０秒間を３５サイクル行い、最終伸長は７２℃で７分間とした。プライマー類は、ベクター特異的ＬＩＣテイル類で設計するかまたは５´オーバーハングとしての構造化されていないプロテアーゼ耐性リンカー配列類で設計した（図９Ａ）〔ＣｒａｓｔｏおよびＦｅｎｇ，２０００〕。全ての増幅物はＴＡＥ緩衝液を用いたアガロースゲル中での電気泳動で分析し、ゲル精製した（ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｑｉａｇｅｎ）。精製した産物をそれ以後のＰＣＲでテンプレートとして用いた。第２回目に、タイプＡループ５およびタイプＢアルファヘリックス５の増幅物を、テンプレートとして結合した。変性後、前記増幅物を、重複伸長を可能とするそれらの相補性リンカー配列類によりアニーリングし、その後の増幅では、前方タイプＡループ５および逆タイプＢアルファヘリックス５プライマー類を用いて行った。タイプＫおよびＤアルファヘリックス５配列類を同様に前記構築体に付加したが、最初の１０サイクルの後アニーリング温度を６０℃に高め、アニーリング特異性を高めた。最終産物を、Ｎ末ヘキサヒスチジンタグ融合物をコードするｐＥｔ−４６Ｅｋ／ＬＩＣ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にアニーリングし、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。ワクシノーゲン配列は、精製したプラスミドのＤＮＡ配列決定によって確認した。タンパク質発現と精製は、上記のようにして完了した。
４価のＡＢＫＤキメラワクシノーゲンによるマウスの免疫
６週齢の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ系統マウス１２匹を、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）に１：１比で懸濁した前記キメラワクシノーゲン５０μｇで免疫した。このワクシノーゲンを総量２００μｌ、腹腔内および皮下デポーに分けて投与した。対照マウス３匹には、ＣＦＡ中ＰＢＳの偽ワクチンを投与した。第２および第４週において、マウスにフロインドの不完全アジュバント中タンパク質５０μｇをブースターした。偽免疫マウスには、アジュバント中ＰＢＳを投与した。マウスは全て、第１回注入前および第６週時点で尾部に切り傷を付けて出血させた。
６週齢の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ系統マウス１２匹を、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）に１：１比で懸濁した前記キメラワクシノーゲン５０μｇで免疫した。このワクシノーゲンを総量２００μｌ、腹腔内および皮下デポーに分けて投与した。対照マウス３匹には、ＣＦＡ中ＰＢＳの偽ワクチンを投与した。第２および第４週において、マウスにフロインドの不完全アジュバント中タンパク質５０μｇをブースターした。偽免疫マウスには、アジュバント中ＰＢＳを投与した。マウスは全て、第１回注入前および第６週時点で尾部に切り傷を付けて出血させた。
ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンの免疫原性の評価
前記ワクシノーゲンの免疫原性は、イムノブロット分析とＥＬＩＳＡによって評価した。イムノブロットは、上記のようにして生じさせスクリーニングした。各精製ｒ−タンパク質（ＯｓｐＣタイプＡ、Ｂ、Ｋ、Ｄおよびキメラワクシノーゲン）の１μｇを、イムノブロットにより分析した。ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）由来の無関連Ｈｉｓタグ付きタンパク質であるｒ−ＢＢＮ３９（偽推理タンパク質ファミリ１６３）が、陰性対照として作用した。等量のタンパク質が負荷されたことを確認するため、１つのブロットは、抗ＨｉｓタグモノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）（１：２０００；Ｎｏｖａｇｅｎ）によりスクリーニングした。ワクチン接種に対する応答を評価するため、前記マウス抗ＡＢＫＤ抗血清の１：５００希釈物により同等のブロットをスクリーニングした。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：４００００希釈）は二次抗体として作用し、結合を化学発光によって視覚化した。ＥＬＩＳＡ分析は、ウェル１個当たり炭酸緩衝液（ｐＨ９．６；４℃で１６時間）中１００ｎｇのワクチン構築体またはｒ−ＯｓｐＣ（タイプＡ、Ｂ、ＫまたはＤ）を塗布した９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９０；Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて実施した。前記プレートをブロックし（０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ中１％ＢＳＡ（ＰＢＳ−Ｔ）；２時間）、ＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄し、系列希釈した抗ＡＢＫＤ抗血清（１００μｌ；１：５０乃至１：１０９３５０）を二重プレートのウェルに添加した（１時間）。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２００００）は二次抗体として作用し、ＡＢＴＳは発色原基質として作用した。吸光度を、反応速度が直線状である間に、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＥＬｘ８０８；Ｂｉｏｔｅｋ）で４０５ｎｍにおいて読み取った。力価は、吸光度曲線に対してパラメータ４個による対数式によるシグモイド曲線（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）に適合させることおよび最大吸光度プラトーの５０％に対応する希釈度逆数を計算することによって、計算した。
前記ワクシノーゲンの免疫原性は、イムノブロット分析とＥＬＩＳＡによって評価した。イムノブロットは、上記のようにして生じさせスクリーニングした。各精製ｒ−タンパク質（ＯｓｐＣタイプＡ、Ｂ、Ｋ、Ｄおよびキメラワクシノーゲン）の１μｇを、イムノブロットにより分析した。ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）由来の無関連Ｈｉｓタグ付きタンパク質であるｒ−ＢＢＮ３９（偽推理タンパク質ファミリ１６３）が、陰性対照として作用した。等量のタンパク質が負荷されたことを確認するため、１つのブロットは、抗ＨｉｓタグモノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）（１：２０００；Ｎｏｖａｇｅｎ）によりスクリーニングした。ワクチン接種に対する応答を評価するため、前記マウス抗ＡＢＫＤ抗血清の１：５００希釈物により同等のブロットをスクリーニングした。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：４００００希釈）は二次抗体として作用し、結合を化学発光によって視覚化した。ＥＬＩＳＡ分析は、ウェル１個当たり炭酸緩衝液（ｐＨ９．６；４℃で１６時間）中１００ｎｇのワクチン構築体またはｒ−ＯｓｐＣ（タイプＡ、Ｂ、ＫまたはＤ）を塗布した９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９０；Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて実施した。前記プレートをブロックし（０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ中１％ＢＳＡ（ＰＢＳ−Ｔ）；２時間）、ＰＢＳ−Ｔにより３回洗浄し、系列希釈した抗ＡＢＫＤ抗血清（１００μｌ；１：５０乃至１：１０９３５０）を二重プレートのウェルに添加した（１時間）。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２００００）は二次抗体として作用し、ＡＢＴＳは発色原基質として作用した。吸光度を、反応速度が直線状である間に、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＥＬｘ８０８；Ｂｉｏｔｅｋ）で４０５ｎｍにおいて読み取った。力価は、吸光度曲線に対してパラメータ４個による対数式によるシグモイド曲線（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）に適合させることおよび最大吸光度プラトーの５０％に対応する希釈度逆数を計算することによって、計算した。
抗ＡＢＫＤ抗体応答の免疫グロブリンイソタイププロフィール特性
抗ＡＢＫＤ抗体応答のイソタイププロフィールは、キメラ構築体１００ｎｇをウェル１個当たり二重ＥＬＩＳＡプレートに塗布することによって評価した。前記プレートを、上記のように洗浄し、ブロックした。ワクチン接種マウス１２匹から採取した抗ＡＢＫＤ抗血清は、二重に分析した（１００μＬ；１：１００００；１時間）。結合したワクシノーゲン特異的Ｉｇは、イソタイプ特異的ビオチン化二次抗体類とインキュベーションする（１時間；マウスイソタイピングキット；Ｚｙｍｅｄ）ことによって、検出した。結合したビオチン化抗体は、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（３０分）と前記発色原基質ＡＢＴＳにより検出した。インキュベーションは全て室温で完了した。
抗ＡＢＫＤ抗体応答のイソタイププロフィールは、キメラ構築体１００ｎｇをウェル１個当たり二重ＥＬＩＳＡプレートに塗布することによって評価した。前記プレートを、上記のように洗浄し、ブロックした。ワクチン接種マウス１２匹から採取した抗ＡＢＫＤ抗血清は、二重に分析した（１００μＬ；１：１００００；１時間）。結合したワクシノーゲン特異的Ｉｇは、イソタイプ特異的ビオチン化二次抗体類とインキュベーションする（１時間；マウスイソタイピングキット；Ｚｙｍｅｄ）ことによって、検出した。結合したビオチン化抗体は、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（３０分）と前記発色原基質ＡＢＴＳにより検出した。インキュベーションは全て室温で完了した。
間接的免疫蛍光アッセイ類（ＩＦＡ）
前記ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンに取り込まれたエピトープ類がインビトロ培養ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｏｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の表面に提示されるかどうかを決定するため、ＩＦＡアッセイを実行した。ＯｓｐＣ産生を最大にするため、タイプＡ、Ｂ、ＫまたはＤ ＯｓｐＣを産生するクローン群の培養物を３３から３７℃に温度移動させた。密度の濃い（約１０７−１０８細胞ｍＬ−１）培養物５ｍＬからスピロヘータを遠心分離（７０００×ｇ、１５分間）によって採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ５ｍＬ中に再度懸濁し、１００μＬを、装填したスライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上の２ｃｍ２エリアに展開した。スライド１セットを風乾し、もうひとつのセットは、アセトン固定した。前記スライド類をブロックし（１時間；ＰＢＳ−Ｔ中３％ＢＳＡ）、次に抗ＡＢＫＤ抗血清の前免疫血清の１：１００希釈物またはウサギ抗フラゲリン抗血清の１：１０００希釈物によりスクリーニングした（１時間）。結合した抗体をＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ５６８結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１０μｇｍＬ−１ブロッキングバッファー）により検出した。スライドをＰＢＳ−Ｔ中で各段階の間に３回洗浄し、全てのインキュベーションを室温において暗所湿潤チェンバー中で１時間行った。スライドをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で据え付け、適切な場合にはローダミンまたはフルオレセインフィルターセットを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１蛍光顕微鏡上で視覚化するかまたは暗視野顕微鏡によって視覚化し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＭａｇｎａＦｉｒｅデジタルカメラを用いて写真撮影した。
前記ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンに取り込まれたエピトープ類がインビトロ培養ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｏｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の表面に提示されるかどうかを決定するため、ＩＦＡアッセイを実行した。ＯｓｐＣ産生を最大にするため、タイプＡ、Ｂ、ＫまたはＤ ＯｓｐＣを産生するクローン群の培養物を３３から３７℃に温度移動させた。密度の濃い（約１０７−１０８細胞ｍＬ−１）培養物５ｍＬからスピロヘータを遠心分離（７０００×ｇ、１５分間）によって採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ５ｍＬ中に再度懸濁し、１００μＬを、装填したスライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上の２ｃｍ２エリアに展開した。スライド１セットを風乾し、もうひとつのセットは、アセトン固定した。前記スライド類をブロックし（１時間；ＰＢＳ−Ｔ中３％ＢＳＡ）、次に抗ＡＢＫＤ抗血清の前免疫血清の１：１００希釈物またはウサギ抗フラゲリン抗血清の１：１０００希釈物によりスクリーニングした（１時間）。結合した抗体をＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ５６８結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１０μｇｍＬ−１ブロッキングバッファー）により検出した。スライドをＰＢＳ−Ｔ中で各段階の間に３回洗浄し、全てのインキュベーションを室温において暗所湿潤チェンバー中で１時間行った。スライドをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で据え付け、適切な場合にはローダミンまたはフルオレセインフィルターセットを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１蛍光顕微鏡上で視覚化するかまたは暗視野顕微鏡によって視覚化し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＭａｇｎａＦｉｒｅデジタルカメラを用いて写真撮影した。
殺菌活性の評価
ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）を死滅させる抗ＡＢＫＤ抗血清の能力を、インビトロで評価した。上述のように３３から３７℃に温度移動させたスピロヘータ類を、ＢＳＫ−Ｈ培地で３回洗浄し、細胞密度を約１０６細胞ｍＬ−１に調整した。細胞８μＬを、モルモット補体（Ｓｉｇｍａ）８μＬと各試験血清４μＬ（５６℃で熱不活性化；３０分）と混合した。対照は、補体を含まず熱不活性化抗ＡＢＫＤ抗血清を含むか、補体のみを含むか、熱不活性化前免疫血清プールを補体とともに含んでいた。反応容量総計は、必要に応じてＢＳＫ−Ｈ培地を添加して２０μＬとし、サンプルを３７℃で１８時間インキュベーションした。死滅はＢａｃＬｉｇｈｔ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて評価し、フルオレセインおよびローダミンフィルターセットを備えたＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１蛍光顕微鏡を用いて５つの高電力視野において生および死／傷害細胞の手動による計数を行った。
ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）を死滅させる抗ＡＢＫＤ抗血清の能力を、インビトロで評価した。上述のように３３から３７℃に温度移動させたスピロヘータ類を、ＢＳＫ−Ｈ培地で３回洗浄し、細胞密度を約１０６細胞ｍＬ−１に調整した。細胞８μＬを、モルモット補体（Ｓｉｇｍａ）８μＬと各試験血清４μＬ（５６℃で熱不活性化；３０分）と混合した。対照は、補体を含まず熱不活性化抗ＡＢＫＤ抗血清を含むか、補体のみを含むか、熱不活性化前免疫血清プールを補体とともに含んでいた。反応容量総計は、必要に応じてＢＳＫ−Ｈ培地を添加して２０μＬとし、サンプルを３７℃で１８時間インキュベーションした。死滅はＢａｃＬｉｇｈｔ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて評価し、フルオレセインおよびローダミンフィルターセットを備えたＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１蛍光顕微鏡を用いて５つの高電力視野において生および死／傷害細胞の手動による計数を行った。
結果
マウスおよびヒトで感染時に提示されたＯｓｐＣタイプ類Ｂ、ＤおよびＫのエピトープ類の同定
ＯｓｐＣタイプ類Ａ，Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｈ，Ｉ，Ｋ，およびＮが、侵襲性感染を有すると決定された患者から今日まで回収されてきている〔Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９；実施例１；Ａｌｇｈａｆｅｒｉら、２００５〕。これらのＯｓｐＣタイプ類のうちの４種（Ａ，Ｂ、ＫおよびＤ）を選択し、多価キメラＯｓｐＣワクチンの用途という概念の検証を確立した。感染時に提示された前記エピトープ類はタイプＡＯｓｐＣについてのみ同定されていたので、本研究での第一段階は、ＯｓｐＣタイプＢ、ＫおよびＤの感染関連エピトープ類を同定することであった。これを成し遂げるため、各タイプの切断物および断片類のイムノブロットを、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のクローン群で感染したマウスから得た血清でスクリーニングするか（ＯｓｐＣタイプＢ、ＫおよびＤ）またはＯｓｐＣタイプＢ、ＫまたはＤを産生するボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株類に少なくとも部分的には感染していることが決定しているヒトライム病患者からの血清でスクリーニングした（私信、Ａｌｌｅｎ Ｓｔｅｅｒｅ博士およびＫａｔｈｒｙｎ Ｊｏｎｅｓ）。第６週におけるマウス中での抗体応答は、タイプ特異的であった；しかし、ヒト血清の一部はタイプ間で交差免疫反応性を示し（データを示さず）、このことは、これらの患者が混合スピロヘータ群におそらく感染したことを示唆している。ＯｓｐＣタイプＢについて、マウス感染血清について前記エピトープ類はアルファヘリックス５（ａａ１７５と２００の間）に局在していた。ヒト感染血清は同様に局在している断片（ａａ１６４−１８５）と反応し、タイプＢのアルファヘリックス５領域が抗原性であることを示唆している。タイプＫ ＯｓｐＣにおいて、エピトープ類は、前記マウスでａａ１４８と１６０の間にマッピングされ、ヒトではアルファヘリックス５領域（ａａ１６０と１７５の間）にマッピングされた。ＯｓｐＣタイプＤエピトープ類はマウスおよびヒトでアルファヘリックス５領域（ａａ１６７と１８０の間）にマッピングされたが、ヒト血清で認識される複数の追加エピトープ類もあった。これらのデータは、ＯｓｐＣタイプ類Ｂ、ＫおよびＤのアルファヘリックス５領域が前記４価のＡＢＫＤワクシノーゲン構築体に取り込むための適切な選択であることを示唆している。
マウスおよびヒトで感染時に提示されたＯｓｐＣタイプ類Ｂ、ＤおよびＫのエピトープ類の同定
ＯｓｐＣタイプ類Ａ，Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｈ，Ｉ，Ｋ，およびＮが、侵襲性感染を有すると決定された患者から今日まで回収されてきている〔Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９；実施例１；Ａｌｇｈａｆｅｒｉら、２００５〕。これらのＯｓｐＣタイプ類のうちの４種（Ａ，Ｂ、ＫおよびＤ）を選択し、多価キメラＯｓｐＣワクチンの用途という概念の検証を確立した。感染時に提示された前記エピトープ類はタイプＡＯｓｐＣについてのみ同定されていたので、本研究での第一段階は、ＯｓｐＣタイプＢ、ＫおよびＤの感染関連エピトープ類を同定することであった。これを成し遂げるため、各タイプの切断物および断片類のイムノブロットを、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のクローン群で感染したマウスから得た血清でスクリーニングするか（ＯｓｐＣタイプＢ、ＫおよびＤ）またはＯｓｐＣタイプＢ、ＫまたはＤを産生するボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株類に少なくとも部分的には感染していることが決定しているヒトライム病患者からの血清でスクリーニングした（私信、Ａｌｌｅｎ Ｓｔｅｅｒｅ博士およびＫａｔｈｒｙｎ Ｊｏｎｅｓ）。第６週におけるマウス中での抗体応答は、タイプ特異的であった；しかし、ヒト血清の一部はタイプ間で交差免疫反応性を示し（データを示さず）、このことは、これらの患者が混合スピロヘータ群におそらく感染したことを示唆している。ＯｓｐＣタイプＢについて、マウス感染血清について前記エピトープ類はアルファヘリックス５（ａａ１７５と２００の間）に局在していた。ヒト感染血清は同様に局在している断片（ａａ１６４−１８５）と反応し、タイプＢのアルファヘリックス５領域が抗原性であることを示唆している。タイプＫ ＯｓｐＣにおいて、エピトープ類は、前記マウスでａａ１４８と１６０の間にマッピングされ、ヒトではアルファヘリックス５領域（ａａ１６０と１７５の間）にマッピングされた。ＯｓｐＣタイプＤエピトープ類はマウスおよびヒトでアルファヘリックス５領域（ａａ１６７と１８０の間）にマッピングされたが、ヒト血清で認識される複数の追加エピトープ類もあった。これらのデータは、ＯｓｐＣタイプ類Ｂ、ＫおよびＤのアルファヘリックス５領域が前記４価のＡＢＫＤワクシノーゲン構築体に取り込むための適切な選択であることを示唆している。
４価のキメラＯｓｐＣワクシノーゲンの構築、発現および精製
タイプＢ、ＫおよびＤについて上に定義したアルファヘリックス５エピトープ類および先の研究〔実施例１〕で明確にしたタイプＡループ５エピトープを用いて、多価キメラｒ−ワクシノーゲンを産生させたが、それは４種のエピトープ含有領域類から構成されている。前記エピトープ類を短く、構造化されていないプロテアーゼ耐性リンカー配列類によって結合した（図９Ｂ）。組換えワクシノーゲンは、長さがアミノ酸１６９個であり、分子量１８．０ｋＤａで、等電点６．４９である。その構造は、主にヘリカルであること〔Ｇａｓｔｅｉｇｅｒら、２００５；Ｋｎｅｌｌｅｒら、１９９０〕および高い安定係数を有していること〔Ｇｕｒｕｐｒａｓａｄら、１９９０〕が予測されている。ＰＢＳによる透析の後、組換えワクシノーゲンの沈降がややあった；しかし、約５００μｇｍＬ−１は可溶性のままであり、この可溶性タンパク質を全実験で用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ワクシノーゲンタンパク質の分析で、単一バンド１８ｋＤａ分子量が明らかになり、夾雑タンパク質は皆無であった。
タイプＢ、ＫおよびＤについて上に定義したアルファヘリックス５エピトープ類および先の研究〔実施例１〕で明確にしたタイプＡループ５エピトープを用いて、多価キメラｒ−ワクシノーゲンを産生させたが、それは４種のエピトープ含有領域類から構成されている。前記エピトープ類を短く、構造化されていないプロテアーゼ耐性リンカー配列類によって結合した（図９Ｂ）。組換えワクシノーゲンは、長さがアミノ酸１６９個であり、分子量１８．０ｋＤａで、等電点６．４９である。その構造は、主にヘリカルであること〔Ｇａｓｔｅｉｇｅｒら、２００５；Ｋｎｅｌｌｅｒら、１９９０〕および高い安定係数を有していること〔Ｇｕｒｕｐｒａｓａｄら、１９９０〕が予測されている。ＰＢＳによる透析の後、組換えワクシノーゲンの沈降がややあった；しかし、約５００μｇｍＬ−１は可溶性のままであり、この可溶性タンパク質を全実験で用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ワクシノーゲンタンパク質の分析で、単一バンド１８ｋＤａ分子量が明らかになり、夾雑タンパク質は皆無であった。
マウスにおけるＡＢＫＤキメラワクシノーゲンの免疫原性
ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンおよびその個々の成分エピトープ類に対する抗体応答を評価するため、フロインドアジュバント中ワクシノーゲンをＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに投与した。血清をワクチン接種（ｎ＝１２）および偽（ＰＢＳ＋アジュバント）免疫マウス（ｎ＝３）から採取し、ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンおよびタイプＡ、ＢおよびＫの全長ｒ−ＯｓｐＣタンパク質類との反応性を評価した。ウェスタンブロット分析は、抗ＡＢＫＤ抗血清がワクシノーゲンタンパク質およびタイプＡ、ＢおよびＫのｒ−ＯｓｐＣと強く反応することを明らかにした。対比的に、前記キメラ構築体のＣ末ＯｓｐＣタイプＤエピトープとの反応性は実質的により弱かった（図１０）。陰性対照タンパク質（ｒ−ＢＢＮ３９）との反応はいずれの血清にもなく、偽ワクチン接種マウスの血清は前記タンパク質のいずれとも反応しなかった。定量的ＥＬＩＳＡに基づく血清反応性の力価検定は、ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンタンパク質に対して高力価のＩｇＧ応答を明らかにし、平均力価は２７，８００であった（図１１Ａ）。タイプ特異的エピトープ類に対する反応性の力価検定は、固定全長ｒ−ＯｓｐＣタンパク質類との結合を評価することによって行った。前記それぞれのエピトープ類に対する抗体力価における有意な差が観察された（図１１Ｂ）。エピトープ特異的力価が前記ワクシノーゲンのＣ末端に対して近くなるとともに低下することは注目に値する。
ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンおよびその個々の成分エピトープ類に対する抗体応答を評価するため、フロインドアジュバント中ワクシノーゲンをＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに投与した。血清をワクチン接種（ｎ＝１２）および偽（ＰＢＳ＋アジュバント）免疫マウス（ｎ＝３）から採取し、ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンおよびタイプＡ、ＢおよびＫの全長ｒ−ＯｓｐＣタンパク質類との反応性を評価した。ウェスタンブロット分析は、抗ＡＢＫＤ抗血清がワクシノーゲンタンパク質およびタイプＡ、ＢおよびＫのｒ−ＯｓｐＣと強く反応することを明らかにした。対比的に、前記キメラ構築体のＣ末ＯｓｐＣタイプＤエピトープとの反応性は実質的により弱かった（図１０）。陰性対照タンパク質（ｒ−ＢＢＮ３９）との反応はいずれの血清にもなく、偽ワクチン接種マウスの血清は前記タンパク質のいずれとも反応しなかった。定量的ＥＬＩＳＡに基づく血清反応性の力価検定は、ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンタンパク質に対して高力価のＩｇＧ応答を明らかにし、平均力価は２７，８００であった（図１１Ａ）。タイプ特異的エピトープ類に対する反応性の力価検定は、固定全長ｒ−ＯｓｐＣタンパク質類との結合を評価することによって行った。前記それぞれのエピトープ類に対する抗体力価における有意な差が観察された（図１１Ｂ）。エピトープ特異的力価が前記ワクシノーゲンのＣ末端に対して近くなるとともに低下することは注目に値する。
抗ＡＢＫＤ抗血清の免疫グロブリンイソタイププロフィール
免疫グロブリンイソタイププロフィールは、ワクチン特異的抗体類の潜在的エフェクター機能の評価に重要である。前記ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンによって誘発された免疫グロブリン重鎖クラススイッチングを評価するため、イソタイププロフィールをＥＬＩＳＡによって決定した。優勢なイソタイプはＩｇＧ１であり、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂのレベルはわずかに低かった。前記第６週の血清は、限定されたレベルのみのＩｇＭ，ＩｇＧ３またはＩｇＡを示した（図１２）。
免疫グロブリンイソタイププロフィールは、ワクチン特異的抗体類の潜在的エフェクター機能の評価に重要である。前記ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンによって誘発された免疫グロブリン重鎖クラススイッチングを評価するため、イソタイププロフィールをＥＬＩＳＡによって決定した。優勢なイソタイプはＩｇＧ１であり、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂのレベルはわずかに低かった。前記第６週の血清は、限定されたレベルのみのＩｇＭ，ＩｇＧ３またはＩｇＡを示した（図１２）。
間接的免疫蛍光アッセイ
前記ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンの各エピトープに対して惹起された抗体のボレリア細胞表面でＯｓｐＣに結合する能力は、間接的免疫蛍光顕微鏡法によって評価した。特異的表面標識が、タイプＡ、Ｂ、ＫおよびＤのＯｓｐＣを産生する細胞で観察された（データを示さず）。蛍光シグナルの強度はタイプ特異的力価と一致しており、最も強度の高い蛍光は、ＯｓｐＣタイプＡまたはＢを保有する細胞で観察された。タイプＫまたはＤを保有する細胞の蛍光は強度がより低く、染色はパッチ状であり、前記細胞に斑点のある外観を付与した。マッチさせた前免疫血清でプローブした細胞では、全く反応性が見られなかった。空気固定細胞に対する抗フラゲニン抗体の表面標識の欠如は、前記細胞の外表面が未変性であり前記の検出されたエピトープ類が前記細胞表面で天然に提示されることを確認するために役立った。予測通り、アセトンで透過性をあげた細胞は抗フラゲニン抗体で標識された（データを示さず）。
前記ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンの各エピトープに対して惹起された抗体のボレリア細胞表面でＯｓｐＣに結合する能力は、間接的免疫蛍光顕微鏡法によって評価した。特異的表面標識が、タイプＡ、Ｂ、ＫおよびＤのＯｓｐＣを産生する細胞で観察された（データを示さず）。蛍光シグナルの強度はタイプ特異的力価と一致しており、最も強度の高い蛍光は、ＯｓｐＣタイプＡまたはＢを保有する細胞で観察された。タイプＫまたはＤを保有する細胞の蛍光は強度がより低く、染色はパッチ状であり、前記細胞に斑点のある外観を付与した。マッチさせた前免疫血清でプローブした細胞では、全く反応性が見られなかった。空気固定細胞に対する抗フラゲニン抗体の表面標識の欠如は、前記細胞の外表面が未変性であり前記の検出されたエピトープ類が前記細胞表面で天然に提示されることを確認するために役立った。予測通り、アセトンで透過性をあげた細胞は抗フラゲニン抗体で標識された（データを示さず）。
ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンによるワクチン接種が殺菌性抗体を誘発することの実証
抗ＡＢＫＤ抗血清の殺菌活性をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔアッセイを用いて評価した〔Ｔｉｌｙら、２００１；Ｌｅｄｉｎら、２００５；Ｅｌｉａｓら、２０００；Ｍｏｎｔｇｏｍａｅｒｙら、２００６；Ｅｌｉａｓら、２００２；Ｓｈｉｎら、２００４〕。殺菌活性は、前記キメラワクチン構築体に含めた全タイプのＯｓｐＣを保有する株に対して検出された。抗ＡＢＫＤ抗血清とともにインキュベーションし、有意な細胞凝集を誘発させた。生および死細胞両者ともに前記凝集物内部に存在していた。細胞を凝集物内部で計数することはもともと難しいので、生および死細胞の百分率を、凝集していない遊離細胞のみを計数することによって、求めた。４種のＯｓｐＣタイプ類全てのために、殺菌アッセイに用いた培養物中の死細胞のバックグランドレベルは約２０−３０％であった。死細胞のこのバックグランドレベルは、ＯｓｐＣ発現を上方制御するために培養物を３３から３７℃に移した後で、我々の研究室で一貫して観察された。殺菌アッセイにおいて、死滅は補体依存性に出現し、死細胞の百分率はバックグランドレベルから５６乃至９０％に有意に増加する。全ての場合において、死細胞の数は、前記対照のいずれかで観察された死細胞の数の少なくとも２倍であった。補体のみでは、死滅を惹起しなかった。プールした前免疫血清により惹起された殺菌活性は全くなく、前記ワクシノーゲンに対する特異的免疫応答が殺菌活性に必要であることを示唆している。
抗ＡＢＫＤ抗血清の殺菌活性をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔアッセイを用いて評価した〔Ｔｉｌｙら、２００１；Ｌｅｄｉｎら、２００５；Ｅｌｉａｓら、２０００；Ｍｏｎｔｇｏｍａｅｒｙら、２００６；Ｅｌｉａｓら、２００２；Ｓｈｉｎら、２００４〕。殺菌活性は、前記キメラワクチン構築体に含めた全タイプのＯｓｐＣを保有する株に対して検出された。抗ＡＢＫＤ抗血清とともにインキュベーションし、有意な細胞凝集を誘発させた。生および死細胞両者ともに前記凝集物内部に存在していた。細胞を凝集物内部で計数することはもともと難しいので、生および死細胞の百分率を、凝集していない遊離細胞のみを計数することによって、求めた。４種のＯｓｐＣタイプ類全てのために、殺菌アッセイに用いた培養物中の死細胞のバックグランドレベルは約２０−３０％であった。死細胞のこのバックグランドレベルは、ＯｓｐＣ発現を上方制御するために培養物を３３から３７℃に移した後で、我々の研究室で一貫して観察された。殺菌アッセイにおいて、死滅は補体依存性に出現し、死細胞の百分率はバックグランドレベルから５６乃至９０％に有意に増加する。全ての場合において、死細胞の数は、前記対照のいずれかで観察された死細胞の数の少なくとも２倍であった。補体のみでは、死滅を惹起しなかった。プールした前免疫血清により惹起された殺菌活性は全くなく、前記ワクシノーゲンに対する特異的免疫応答が殺菌活性に必要であることを示唆している。
考察
いくつかの研究は、ライム病スピロヘータ類のＯｓｐＣの潜在的ワクシノーゲンとしての潜在的用途を探求している。ＯｓｐＣによるワクチン接種は防御性の抗体応答を惹起したが、防御は、主に株特異的であると報告されている〔Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９６；Ｓｃｈｅｉｂｌｈｏｆｅｒら、２００３；Ｗａｌｌｉｃｈら、２００１；Ｂｒｏｗｎら、２００５；ＰｒｏｂｅｒｔおよびＬｅＦｅｂｖｒｅ、１９９４；Ｇｉｌｍｏｒｅら、２００３〕。複数のＯｓｐＣタンパク質のカクテルを用いてより広い防御を惹起しようとする試みは成功しなかった。Ｂａｘｔｅｒは、１４種の互いに異なる全長ＯｓｐＣ変異体から構成されるＯｓｐＣカクテルを試験した；しかし、それらは、各変異体の独自ドメインに対して十分な抗体力価を惹起できなかった−もし広い防御を伝達しようとするならばこれは必須である。さらに、容認できない反応原性も報告されていた〔Ｈａｎｓｏｎら、２００４〕。カクテルワクチン類についての一般的問題は、感染時に天然には提示されずかつ防御性抗体を惹起しないエピトープ類に対する抗体応答が潜在的に誤って指示されることである。キメラワクチン類の産生は、ｒ−タンパク質の単純カクテルを用いて遭遇する問題を回避できる別の手法を提供する。一連の免疫優性エピトープ類から構成されるキメラワクチン類は、マラリア〔Ｈａｎｓｏｎら、２００４；Ｃａｒｏ−Ａｇｕｉｌａｒら、２００５；〕、Ａ群連鎖球菌〔ＭｃＮｅｉｌら、２００５；Ｄａｌｅら、２００５；Ｈｕら、２００２；Ｄａｌｅ，１９９９；Ｋｏｔｌｏｆｆら、２００５；Ｈｏｒｖａｔｈら、２００５〕および数種のウイルス類〔Ａｐｔら、２００６；ＦａｎおよびＭｅｉ、２００５；Ｗａｎｇら、２００５；Ｂｏｕｃｈｅら、２００５〕に対するワクチンの開発で探求されてきた。もし多価ＯｓｐＣワクチンが広く防御性であらねばならないとするならば、前記ワクシノーゲン中に十分なアレイのエピトープ類を取り込ませて多様な株類に対しての防御性応答を惹起させることが必要であろう。このようなワクシノーゲンの構築により前進する能力が、ＡからＵと命名した２１種の明確なＯｓｐＣタイプ類を明確にした系統発生分析によって非常に高められ〔Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９〕、そのうちサブセット１個のみがヒトにおける侵襲性感染と相関していた〔Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９；実施例１；Ａｌｇｈａｆｅｒｉら、ｎ２００５〕。
いくつかの研究は、ライム病スピロヘータ類のＯｓｐＣの潜在的ワクシノーゲンとしての潜在的用途を探求している。ＯｓｐＣによるワクチン接種は防御性の抗体応答を惹起したが、防御は、主に株特異的であると報告されている〔Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９６；Ｓｃｈｅｉｂｌｈｏｆｅｒら、２００３；Ｗａｌｌｉｃｈら、２００１；Ｂｒｏｗｎら、２００５；ＰｒｏｂｅｒｔおよびＬｅＦｅｂｖｒｅ、１９９４；Ｇｉｌｍｏｒｅら、２００３〕。複数のＯｓｐＣタンパク質のカクテルを用いてより広い防御を惹起しようとする試みは成功しなかった。Ｂａｘｔｅｒは、１４種の互いに異なる全長ＯｓｐＣ変異体から構成されるＯｓｐＣカクテルを試験した；しかし、それらは、各変異体の独自ドメインに対して十分な抗体力価を惹起できなかった−もし広い防御を伝達しようとするならばこれは必須である。さらに、容認できない反応原性も報告されていた〔Ｈａｎｓｏｎら、２００４〕。カクテルワクチン類についての一般的問題は、感染時に天然には提示されずかつ防御性抗体を惹起しないエピトープ類に対する抗体応答が潜在的に誤って指示されることである。キメラワクチン類の産生は、ｒ−タンパク質の単純カクテルを用いて遭遇する問題を回避できる別の手法を提供する。一連の免疫優性エピトープ類から構成されるキメラワクチン類は、マラリア〔Ｈａｎｓｏｎら、２００４；Ｃａｒｏ−Ａｇｕｉｌａｒら、２００５；〕、Ａ群連鎖球菌〔ＭｃＮｅｉｌら、２００５；Ｄａｌｅら、２００５；Ｈｕら、２００２；Ｄａｌｅ，１９９９；Ｋｏｔｌｏｆｆら、２００５；Ｈｏｒｖａｔｈら、２００５〕および数種のウイルス類〔Ａｐｔら、２００６；ＦａｎおよびＭｅｉ、２００５；Ｗａｎｇら、２００５；Ｂｏｕｃｈｅら、２００５〕に対するワクチンの開発で探求されてきた。もし多価ＯｓｐＣワクチンが広く防御性であらねばならないとするならば、前記ワクシノーゲン中に十分なアレイのエピトープ類を取り込ませて多様な株類に対しての防御性応答を惹起させることが必要であろう。このようなワクシノーゲンの構築により前進する能力が、ＡからＵと命名した２１種の明確なＯｓｐＣタイプ類を明確にした系統発生分析によって非常に高められ〔Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９〕、そのうちサブセット１個のみがヒトにおける侵襲性感染と相関していた〔Ｓｅｉｎｏｓｔら、１９９９；実施例１；Ａｌｇｈａｆｅｒｉら、ｎ２００５〕。
ＯｓｐＣのエピトープ構造の詳細な理解がキメラワクシノーゲンの開発には必要である。ＯｓｐＣエピトープ位置についてはいくつか過去に報告されている〔Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９６；Ｊｏｂｅら、２００３；Ｌｏｖｒｉｃｈら、２００５〕。２件の研究では、殺菌性抗体類惹起に関与しているエピトープがＯｓｐＣのＣ末ドメイン内部に存在することを報告している〔Ｊｏｂｅら、２００３；Ｌｏｖｒｉｃｈら、２００５〕；しかし、このドメインは実質的に保存されているので、前記Ｃ末に対する抗体類が広く防御性でない理由は明確ではない。Ｍａｔｈｅｉｓｅｎらは、また、前記Ｃ末端が前記抗体応答の主な標的であると示唆し、欧州における神経ボレリア症患者の血清と全長ＯｓｐＣとの反応性が、アミノ酸１０個のＣ末切断形との反応性よりも高いことを記載している〔Ｍａｔｈｉｅｓｅｎら、１９９８〕。このことから、彼らは、Ｃ末エピトープ類があるに違いないと結論する一方、前記試験抗原は未知のタイプの単一ＯｓｐＣ変異体で構成されていたので、前記Ｃ末端がより広い範囲を認識することは、このドメインがより高く保存されているからにちがいなく、このＣ末端が免疫優性であることを必ずしも示唆していないと結論した。Ｇｉｌｍｏｒｅらは変性させたものではなく非変性のｒ−ＯｓｐＣによりマウスを免疫すると、相同性単離物によるチャレンジに対して防御を付与することを明らかにし〔Ｇｉｌｍｏｒｅら、１９９６；ＧｉｌｍｏｒｅおよびＭｂｏｗ，１９９９〕、防御性エピトープ類が立体構造的に明確にできるかもしれないことを示唆している。別の分析で、Ｇｉｌｍｏｒｅらは、単一ＯｓｐＣタイプ（タイプＡ）由来の限られた数のＯｓｐＣ切断物類の受動免疫を付与する抗ＯｓｐＣモノクローナル抗体との免疫反応性を分析した〔ＧｉｌｍｏｒｅおよびＭｂｏｗ，１９９９〕。Ｎ末端またはＣ末端のいずれかの欠損は、ｍＡｂによる前記ｒ−タンパク質類の検出を排除し、さらに立体構造的または不連続エピトープの存在を示唆している。ｍＡｂにより認識されるエピトープが免疫優性で自然感染時に関連しているかどうかまたは前記の異なるＯｓｐＣタイプ類間で保存されているかどうかは、明らかでない。タイプＡ ＯｓｐＣの線状免疫優性エピトープ類が最近マッピングされループ５およびアルファヘリックス５領域内部に存在していることがわかった〔実施例１〕。前記タイプＡループ５エピトープを含むｒ−タンパク質は、マウスで殺菌性抗体類を惹起し、それぞれのタイプ特異的エピトープ類がワクチン開発で活用できる可能性がでてきた〔実施例２参照〕。この報告では、初期感染時に提示されるＯｓｐＣタイプＢ、ＫおよびＤのエピトープ類をマッピングし、これらのエピトープ類に基づく４価のキメラワクシノーゲンを構築した。このＡＢＫＤキメラワクシノーゲンは、マウスで非常に免疫原性があり、細胞表面でＯｓｐＣを結合し補体依存性にタイプＡ、Ｂ、ＫおよびＤ ＯｓｐＣを産生する株を有効に死滅させる抗体類を惹起した。
４価のキメラ試験ワクシノーゲンを開発しようとする我々の努力の第一段階は、マウスおよびヒトにおいて感染時に提示されるＯｓｐＣタイプＢ、ＫおよびＤの線状エピトープ類を同定することであった。これらの分析は、基本的に、タイプＡ ＯｓｐＣのループ５およびアルファヘリックス５エピトープ類を同定した実施例１に記載のようにして行った。簡単に述べると、タイプＢ、ＫおよびＤ ＯｓｐＣ切断物および断片類の大きなパネルをクローン単離物に感染したマウスからおよび対応するＯｓｐＣタイプを発現する株に少なくとも部分的に感染したヒトからの血清によりスクリーニングした。詳細なエピトープマッピングは、実験的に感染したマウスからの血清を用いて可能であった；しかし、自然感染ヒトにおいて、抗体応答は、より広いエピトープアレイに対してであった。これは驚くべきことではなく、おそらく、初期感染時に菌細胞表面に正常では提示されないＯｓｐＣエピトープ類に対する抗体応答が拡大したことを反映している。新しいエピトープ類のいくつかはＯｓｐＣの保存ドメイン類（例 アルファヘリックス１）に由来しているであろうが、この新しいエピトープ類は菌細胞死と膜からのＯｓｐＣ放出によりアクセス可能となるのであろう。このことは、エピトープマッピングにおいてヒト血清サンプルの使用を必要とする但し書き；すなわち、感染の正確な期間は通常わからず感染群のクローン性が疑わしいという但し書きを示している〔Ｗａｎｇら、１９９９；Ｒｕｚｉｃ−Ｓａｂｌｊｉｃら、２００６；Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒら、１９９９；Ｇｕｔｔｍａｎら、１９９６；Ｒｉｊｐｋｅｍａら、１９９７〕。いずれにしても、前記ヒト血清サンプルの分析から、アルファヘリックス５領域内部のエピトープ類が感染時、ＯｓｐＣタイプＡ、Ｂ、ＫまたはＤを産生する株類によって認識されることは明白である。さらに、いくつかの異なるＯｓｐＣタイプ産生株中でアルファヘリックス５に対する応答が一貫していることは、このＯｓｐＣドメインの機能的関連性を示唆するものであろう。
アルファヘリックス５およびループ５領域配列類はＯｓｐＣタイプ間で可変であるものの、これらの領域は各タイプ内部で非常によく保存されている〔実施例１参照〕。このことは、キメラワクチンという文脈で、限られた数のＯｓｐＣエピトープ類のみが広い防御を実行するために必要なのであろうということを示唆している。広く防御性のあるワクシノーゲンの開発における第一段階として、タイプＡループ５エピトープおよびＯｓｐＣタイプＢ、ＫおよびＤからのアルファヘリックス５エピトープ類を、試験ワクシノーゲンの開発に用いた。これらのエピトープ類を含む領域を、リンカー配列をコードするように設計したプライマー類によりＰＣＲで増幅した。このことにより前記キメラ構築体の創生においてＰＣＲ重複伸長の使用が可能となり、短くて構造化されておらずプロテアーゼ耐性のアミノ酸配列類により前記エピトープ類を分離する手段を提供した〔ＣｒａｓｔｏおよびＦｅｎｇ，２０００〕。実験的ＯｓｐＣに基づく４価のＡＢＫＤキメラワクシノーゲンを本研究で開発し、それは、試験マウス全てで一定した高力価のＩｇＧ抗体応答を惹起した（ｎ＝１２）。さらに、前記ワクシノーゲンは、各取り込みエピトープに対して抗体を惹起した。前記エピトープ特異的力価は前記構築体内部におけるエピトープ位置により影響を受けるようであることは関心の集まるところである。Ｎ末エピトープ（タイプＡのループ５）からＣ末エピトープ（タイプＤのアルファヘリックス５）まで力価が漸次低下していった。Ｃ末端エピトープ類に対して力価の低下という現象はまた、溶連菌Ｍ−タンパク質に基づくキメラワクチンの初期研究で報告された〔Ｄａｌｅら、１９９３；Ｄａｌｅら、１９９６〕。力価に対する位置特異的効果の土台は明白ではないが、Ｃ末端構造のインビボ分解または変化によるのかも知れない〔Ｄａｌｅら、１９９９〕。
ボレリア感染に対する防御のために必要なＴｈサイトカイン応答と関連するイムノグロブリンイソタイプパターンは完全に解明されたわけではないが〔Ｋｒａｉｃｚｙら、２０００；Ｗｉｄｈｅら、２００４；Ｋｅａｎｅ−Ｍｙｅｒｓら、１９９５；Ｋｅａｎｅ−Ｍｙｅｒｓら、１９９６；Ｋｅａｎｅ−ＭｙｅｒｓおよびＮｉｃｋｅｌｌ，１９９５〕、このパターンを決定することは、ワクシノーゲン開発において重要な段階であり前記ワクシノーゲンのさまざまな構築物類の潜在的防御能力に関する重要な情報が提供できるであろう。前記応答のイソタイププロフィールは、ＥＬＩＳＡによって決定し、混合Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカイン応答に関連した重鎖Ｉｇイソタイプ類が観察された。本研究で注目したクラススイッチングは、前記ワクシノーゲンに取り込ませた限定したＴ細胞エピトープが存在しなくても、適切なＴ細胞ヘルプを意味している。マウス（Ｈ２Ａｋ／Ｈ２Ｅｋ）およびヒト（ＨＬＡ−ＤＲＢ１）タイプＩＩ ＭＨＣサブセットのための予想ペプチド結合アルゴリズムを用いたワクシノーゲン配列分析は、全ての利用可能な対立遺伝子類に結合すると予測された前記ワクシノーゲン中の潜在的Ｔ細胞エピトープ類を暴露した〔Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、１９９９；Ｚｈａｎｇら、２００５〕。前記予測された結合ペプチド類のひとつはＬＡＮＳＶＫＥＬＴで、それは、前記構築体内部で３回繰り返しされており、この繰り返しが、Ｔｈ応答惹起に際し重要であるのかもしれない〔Ｊｉａｎｇら、１９９９；Ａｈｌｂｏｒｇら、１９９８；Ｋｊｅｒｒｕｌｆら、１９９７；Ｔｈｅｉｓｅｎら、２０００〕。潜在的Ｔ細胞エピトープ類の分析は網羅的ではなかったが、前記予測は、前記キメラワクシノーゲンがマウスにおいてＴリンパ球ヘルプを惹起できることを示唆する我々のデータの裏づけとなる。さらに、そのことは、この構築体が乱雑なＴ細胞エピトープ配列を取り込む必要がなくヒトにおいてそうする可能性があるかもしれないことを意味している。このイソタイププロフィールの産生においてフロインドアジュバントの重要性は公知ではないが、前記応答類とイソタイププロフィール類は、ヒトでの使用に適したミョウバンまたは他のアジュバント類の文脈において評価する必要があるであろう〔ｔｅｎ Ｈａｇｅｎら、１９９３；Ｌｉｎｄｂｌａｄ，２００４；ＰｅｔｒｏｖｓｋｙおよびＡｇｕｉｌａｒ，２００４；Ｂｒｅｗｅｒら、１９９９；ＭｃＮｅｅｌａおよびＭｉｌｌｓ，２００１〕。さらに、前記キメラワクシノーゲンのエピトープ順序または構造の改変により、免疫応答を追跡してインビボ防御を最大にする機構が提供できるであろう〔Ｔｏｎｇｒｅｎら、２００５；Ｃａｉら、ｎ２００４〕。
ワクチン開発の観点から前記ワクシノーゲンに対する前記応答が生産的であるためには、惹起された抗体が未変化のボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）細胞の表面に結合でき菌死滅を起こすことができなければならない。ＩＦＡ分析は、ＯｓｐＣタイプＡ、Ｂ、ＫおよびＤを産生する株類の細胞表面が強く標識されることを明らかにした。タイプＤエピトープに対する抗体力価はより多くのＮ末エピトープ類に対して惹起された力価よりも確かに有意に低いとはいうものの、タイプＤを産生する株類の表面標識は簡単に明らかになった。ＯｓｐＣタイプ培養物類のそれぞれにおける細胞サブセットは、抗ＡＢＫＤ抗血清で標識されないことが観察され、そのことは、それらの細胞がＯｓｐＣを発現していなかったことを意味している。しかし、インビボにおいて、全てとはいわないまでもほとんどの細胞がダニから哺乳類への伝染時および初期哺乳類感染時にＯｓｐＣを発現していることが実証されている〔Ｇｉｌｍｏｒｅら、２００１；Ｚｈｏｎｇら、１９９７〕。殺細胞を行う抗ＡＢＫＤ抗体の能力も、評価した。ワクチン接種マウス由来血清は、補体依存性にタイプＡ、Ｂ、ＫおよびＤ ＯｓｐＣタンパク質類を発現するスピロヘータ類を効率的に死滅させた。前記ＯｓｐＣタイプ類の全てで１００％未満の死滅であったが、このことは、ある群の細胞におけるインビトロＯｓｐＣ発現の不均一性の関数であるようで、それは、インビボで十分に説明されてきた現象である〔Ｓｃｈｗａｎら、１９９５；ＳｃｈｗａｎおよびＰｉｅｓｍａｎ，２０００；Ｈｕら、１９９６〕。
この実施例では、新規ｒ−キメラ多価ＯｓｐＣに基づくライム病ワクシノーゲンの構築と概念の検証を記載している。エピトープに基づくｒ−キメラタンパク質の使用により、同一構築体中で複数のＯｓｐＣタイプ類を網羅できるようになり、関連のないタンパク質ドメインに対して間違って誘導された免疫応答という潜在的問題を回避する。活発な感染時に認識される線状エピトープ類のマッピングは、キメラワクチン開発の重大な要件であり、このことは、ヒトにおける侵襲性感染に関連した４種のＯｓｐＣタイプ類について完了し、成功した。前記ワクシノーゲンに含ませたエピトープ類は、ボレリア細胞表面でＯｓｐＣを結合できかつ補体媒介菌死滅を行うタイプ特異的ＩｇＧ抗体類を惹起した。
キメラ多価ライム病ワクチンの免疫原性向上を意図した変異体類に対する免疫応答
本研究で我々は、前記構築体の溶解度を向上させ、エピトープ配置、エピトープ反復および推定Ｃ末安定化タグ類を含ませることの免疫応答に及ぼす潜在的インパクトを評価することを目指した。これらの分析では、防御性の広いＯｓｐＣワクチンのためおよび一般的キメラワクチン類の構築のためのデザイン戦略について新しい洞察を示す。
本研究で我々は、前記構築体の溶解度を向上させ、エピトープ配置、エピトープ反復および推定Ｃ末安定化タグ類を含ませることの免疫応答に及ぼす潜在的インパクトを評価することを目指した。これらの分析では、防御性の広いＯｓｐＣワクチンのためおよび一般的キメラワクチン類の構築のためのデザイン戦略について新しい洞察を示す。
材料および方法
組換えＯｓｐＣの発現と精製
タイプＡ、Ｂ、ＫおよびＤの組換え全長ＯｓｐＣタンパク質を、先に記載したようにして作製した〔実施例１および２を参照〕。簡単に述べると、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類Ｂ３１ＭＩ（タイプＡ ＯｓｐＣ）、ＬＤＰ７３（タイプＢ）、ＬＤＰ７４（タイプＫ）およびＬＤＰ１１６（タイプＤ）のクローン群からのｏｓｐＣ遺伝子を、５´オーバーハングを有するプライマー類を用いてＰＣＲで増幅させ、ｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中でリガーゼ非依存性クローニング（ＬＩＣ）を行った〔実施例１〕。一重鎖テイルの増幅と再生の後、増幅物をｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣベクターにアニーリングし、それをＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換し増殖させた。挿入配列をＤＮＡ配列決定（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）により確認した後、タンパク質発現をＩＰＴＧ（１ｍＭ）により誘発させた。タンパク質類は、ｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣ発現タグでコードされたヘキザヒスチジンモチーフを用いてニッケルアフィニティクロマトグラフィにより精製した（Ｎｏｖａｇｅｎ）。イミダゾール溶出タンパク質類を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）により１０ｋＤａ分子量カットオフ膜（Ｓｌｉｄ−ａ−ｌｙｚｅｒ，Ｐｉｅｒｃｅ）に対して十分に透析し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより前記調製物の純度を評価した。
組換えＯｓｐＣの発現と精製
タイプＡ、Ｂ、ＫおよびＤの組換え全長ＯｓｐＣタンパク質を、先に記載したようにして作製した〔実施例１および２を参照〕。簡単に述べると、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類Ｂ３１ＭＩ（タイプＡ ＯｓｐＣ）、ＬＤＰ７３（タイプＢ）、ＬＤＰ７４（タイプＫ）およびＬＤＰ１１６（タイプＤ）のクローン群からのｏｓｐＣ遺伝子を、５´オーバーハングを有するプライマー類を用いてＰＣＲで増幅させ、ｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中でリガーゼ非依存性クローニング（ＬＩＣ）を行った〔実施例１〕。一重鎖テイルの増幅と再生の後、増幅物をｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣベクターにアニーリングし、それをＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換し増殖させた。挿入配列をＤＮＡ配列決定（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）により確認した後、タンパク質発現をＩＰＴＧ（１ｍＭ）により誘発させた。タンパク質類は、ｐＥＴ−３２ Ｅｋ／ＬＩＣ発現タグでコードされたヘキザヒスチジンモチーフを用いてニッケルアフィニティクロマトグラフィにより精製した（Ｎｏｖａｇｅｎ）。イミダゾール溶出タンパク質類を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）により１０ｋＤａ分子量カットオフ膜（Ｓｌｉｄ−ａ−ｌｙｚｅｒ，Ｐｉｅｒｃｅ）に対して十分に透析し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより前記調製物の純度を評価した。
ＡＢＫＤワクチン変異体類の構築、発現および精製
前記ワクチン構築体での特異的エピトープ類に対するＩｇＧ力価低下の潜在的メカニズムを探求しその解決策を調べるため、原ワクチンの複数変異体類を構築した。ワクチン変異体類は全て、先に記載のＡＢＫＤワクシノーゲン〔実施例３〕の配列に基づいており、同一エピトープ含有配列類を含んでいる。これらには、タイプＡのループ５領域（アミノ酸（ａａ）１３１から１４９まで）およびタイプＢ（ａａ１６０−２０１）、Ｋ（ａａ１６１−２０１）およびＤ（ａａ１６１−２０１）のアルファヘリックス５領域類を含んでいた（図１３挿入図）。このＡＢＫＤｐｐａおよびＡＢＫＤｇｇは、それぞれ、原ＡＢＫＤ構築体のＣ末端にＰｒｏ−Ｐｒｏ―ＡｌａまたはＧｌｙ―Ｇｌｙモチーフを付加した。これらの構築体類の両者はともに、前記元来のＡＢＫＤ構築体を、前記の適切なアミノ酸類をコードする５´オーバーハングにより前記モチーフを付加する逆プライマー類（表５）を用いて増幅させることによって作製した（図１３Ａ）。他のワクチン変異体類は、元来のＡＢＫＤワクシノーゲン構築に使用したそれらと類似の重複アニーリングと伸長技術によって作製した〔実施例３〕。前記ＡＢＫＤＤ構築体は、非構造化プロテアーゼ耐性リンカーをコードする３´テイル配列を有する逆プライマー類を用いて前記ＡＢＫＤ構築体を再度増幅させることによって、作製した。これによって、ＰＣＲ産物を、５´末端の相補性リンカーをコードする配列により増幅させておいたタイプＤ ＯｓｐＣエピトープ含有配列にアニーリングさせ、その後アニーリングした構築体の重複伸長と増幅を行うことができた（図１３Ｂ）。このＡＤＢＫ構築体は、別々に増幅させたタイプＡおよびＤエピトープを含有する領域を互いにアニーリングさせ、次に、原ＡＢＫＤ構築体から増幅させたタイプＢおよびＫヘリックス５エピトープ領域類で増幅させ、作製した（図１３Ｃ）。ＡＤＢＫＤ構築体は、ＡＢＫＤおよびＡＤＢＫ配列類からの増幅物をアニーリングさせることによって作製した（図１３Ｄ）。全ての場合において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃、２分間の最初の変性段階の後９４℃１５秒の変性、５０℃３０秒のプライマーアニーリングおよび７２℃６０秒の伸長を３５サイクル、最後に７２℃における伸長を７分間用いるＧｏＴａｇ Ｇｒｅｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により完了した。これらのワクシノーゲン類構築に使用したプライマー類全てを、表５に示した。全てのＰＣＲ産物類は、その後のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用する前にゲル精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。最終増幅物類は、リガーゼ非依存性クローニングによって前記のｐＥＴ−４６ Ｅｋ／ＬＩＣベクターにアニーリングし、Ｎｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。コロニーは、Ｔ７プライマー類を用いて挿入物をスクリーニングし、プラスミドを回収し（Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＤＮＡ配列決定により前記挿入物を確認した。組換えタンパク質が発現し上記のようにして精製した。精製後、ワクチンタンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）または１００ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭアルギニン、５０ｍＭグルタミン酸を含有するｐＨ８の緩衝液（Ａｒｇ／Ｇｌｕ緩衝液）を３回交換しながら１０ｋＤａ分子量カットオフ膜（Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ，Ｐｉｅｒｃｅ）に対して透析した〔Ｇｏｌｏｖａｎｏｖら、２００４〕。前記構築体類の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
前記ワクチン構築体での特異的エピトープ類に対するＩｇＧ力価低下の潜在的メカニズムを探求しその解決策を調べるため、原ワクチンの複数変異体類を構築した。ワクチン変異体類は全て、先に記載のＡＢＫＤワクシノーゲン〔実施例３〕の配列に基づいており、同一エピトープ含有配列類を含んでいる。これらには、タイプＡのループ５領域（アミノ酸（ａａ）１３１から１４９まで）およびタイプＢ（ａａ１６０−２０１）、Ｋ（ａａ１６１−２０１）およびＤ（ａａ１６１−２０１）のアルファヘリックス５領域類を含んでいた（図１３挿入図）。このＡＢＫＤｐｐａおよびＡＢＫＤｇｇは、それぞれ、原ＡＢＫＤ構築体のＣ末端にＰｒｏ−Ｐｒｏ―ＡｌａまたはＧｌｙ―Ｇｌｙモチーフを付加した。これらの構築体類の両者はともに、前記元来のＡＢＫＤ構築体を、前記の適切なアミノ酸類をコードする５´オーバーハングにより前記モチーフを付加する逆プライマー類（表５）を用いて増幅させることによって作製した（図１３Ａ）。他のワクチン変異体類は、元来のＡＢＫＤワクシノーゲン構築に使用したそれらと類似の重複アニーリングと伸長技術によって作製した〔実施例３〕。前記ＡＢＫＤＤ構築体は、非構造化プロテアーゼ耐性リンカーをコードする３´テイル配列を有する逆プライマー類を用いて前記ＡＢＫＤ構築体を再度増幅させることによって、作製した。これによって、ＰＣＲ産物を、５´末端の相補性リンカーをコードする配列により増幅させておいたタイプＤ ＯｓｐＣエピトープ含有配列にアニーリングさせ、その後アニーリングした構築体の重複伸長と増幅を行うことができた（図１３Ｂ）。このＡＤＢＫ構築体は、別々に増幅させたタイプＡおよびＤエピトープを含有する領域を互いにアニーリングさせ、次に、原ＡＢＫＤ構築体から増幅させたタイプＢおよびＫヘリックス５エピトープ領域類で増幅させ、作製した（図１３Ｃ）。ＡＤＢＫＤ構築体は、ＡＢＫＤおよびＡＤＢＫ配列類からの増幅物をアニーリングさせることによって作製した（図１３Ｄ）。全ての場合において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃、２分間の最初の変性段階の後９４℃１５秒の変性、５０℃３０秒のプライマーアニーリングおよび７２℃６０秒の伸長を３５サイクル、最後に７２℃における伸長を７分間用いるＧｏＴａｇ Ｇｒｅｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により完了した。これらのワクシノーゲン類構築に使用したプライマー類全てを、表５に示した。全てのＰＣＲ産物類は、その後のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用する前にゲル精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。最終増幅物類は、リガーゼ非依存性クローニングによって前記のｐＥＴ−４６ Ｅｋ／ＬＩＣベクターにアニーリングし、Ｎｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。コロニーは、Ｔ７プライマー類を用いて挿入物をスクリーニングし、プラスミドを回収し（Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＤＮＡ配列決定により前記挿入物を確認した。組換えタンパク質が発現し上記のようにして精製した。精製後、ワクチンタンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）または１００ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭアルギニン、５０ｍＭグルタミン酸を含有するｐＨ８の緩衝液（Ａｒｇ／Ｇｌｕ緩衝液）を３回交換しながら１０ｋＤａ分子量カットオフ膜（Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ，Ｐｉｅｒｃｅ）に対して透析した〔Ｇｏｌｏｖａｎｏｖら、２００４〕。前記構築体類の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
ワクチン変異体類によるマウスの免疫
６週齢の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを前記６種のワクシノーゲン変異体類のそれぞれで免疫した（マウス３匹／構築体）。前記変異体類の免疫原性は互いに匹敵するものであったので、前記タンパク質をモルベースで投与し、ワクシノーゲンマス１単位当たりのエピトープ類の数の差を補償するのが望ましかった。各マウスに対して、免疫１回当たり約２．８ナノモルのタンパク質を投与したが、それは、構築体類ＡＢＫＤ，ＡＢＫＤｐｐａ，ＡＢＫＤｇｇおよびＡＤＢＫの５０μｇまたは構築体類ＡＢＫＤＤおよびＡＤＢＫＤの６２．５μｇとなる。マウスは、完全フロインドアジュバント中ワクチンで免疫し、次に、第２週および第４週においてフロインドの不完全アジュバントをブーストした。第１回免疫の前および第６週において、尾部切傷により全マウスから血清を採取した。総計およびエピトープ特異的抗体力価に及ぼすアジュバントの効果を決定するため、またイソタイププロフィールに及ぼすアジュバントの効果を決定するため、マウス（６匹／アジュバント）を、上記のようにフロインドアジュバント中に懸濁したかまたはミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ，Ｐｉｅｒｃｅ）上に吸着させたＡＢＫＤワクシノーゲンにより免疫し、血清を第６週に尾部切傷によって採取した。
６週齢の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを前記６種のワクシノーゲン変異体類のそれぞれで免疫した（マウス３匹／構築体）。前記変異体類の免疫原性は互いに匹敵するものであったので、前記タンパク質をモルベースで投与し、ワクシノーゲンマス１単位当たりのエピトープ類の数の差を補償するのが望ましかった。各マウスに対して、免疫１回当たり約２．８ナノモルのタンパク質を投与したが、それは、構築体類ＡＢＫＤ，ＡＢＫＤｐｐａ，ＡＢＫＤｇｇおよびＡＤＢＫの５０μｇまたは構築体類ＡＢＫＤＤおよびＡＤＢＫＤの６２．５μｇとなる。マウスは、完全フロインドアジュバント中ワクチンで免疫し、次に、第２週および第４週においてフロインドの不完全アジュバントをブーストした。第１回免疫の前および第６週において、尾部切傷により全マウスから血清を採取した。総計およびエピトープ特異的抗体力価に及ぼすアジュバントの効果を決定するため、またイソタイププロフィールに及ぼすアジュバントの効果を決定するため、マウス（６匹／アジュバント）を、上記のようにフロインドアジュバント中に懸濁したかまたはミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ，Ｐｉｅｒｃｅ）上に吸着させたＡＢＫＤワクシノーゲンにより免疫し、血清を第６週に尾部切傷によって採取した。
ワクチン変異体類によって誘発されたエピトープ特異的ＩｇＧ力価の評価
各ワクシノーゲンの免疫原性はウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡの両者によって評価した。ウェスタンブロットのため、タイプＡ、Ｂ、Ｋ、Ｄのｒ−ＯｓｐＣを還元性サンプル緩衝液中１レーン当たり５００ｎｇで載せ、１２．５％ＳＤＳ―ＰＡＧＥゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ，Ｂｉｏｒａｄ）中で電気泳動し、ＰＶＤＦ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にエレクトロブロットした。このブロットを、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）中１％ＢＳＡでブロックした。前記ブロットを、ＰＢＳ−Ｔ中各抗血清の１：２５００希釈物で１時間プローブし、次に３回洗浄した。等量のタンパク質が確実に載せられたことを確認するため、ブロット１個は、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（１：２０００；Ｎｏｖａｇｅｎ）によりスクリーニングした。二次検出は、パーオキシダーゼ結合ヤギ−抗マウスＩｇＧの１：４００００希釈物および化学発光（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ，Ｐｉｅｒｃｅ）によって行った。定量的分析のため、ＯｓｐＣタイプ特異的ＩｇＧ力価は、ＥＬＩＳＡ分析によって決定した。タイプＡ、Ｂ、Ｋ、またはＤのｒ−ＯｓｐＣを、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９０；Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に炭酸緩衝液中（ｐＨ９．６）１００ｎｇ／ウェルで４℃において１６時間塗布しておいた。前記プレートをブロックし（０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中１％ＢＳＡ；２時間）、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、系列希釈した抗ワクシノーゲン抗血清（１００μＬ）を二重プレートのウェルに添加した（１時間）。ＨＲＰ結合ヤギ−抗マウスＩｇＧ（１：２００００）は、二次抗体として作用し、ＡＢＴＳは、発色原基質として作用した。吸光度を、反応速度が直線状である間にＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＥＬｘ８０８；Ｂｉｏｔｅｋ）により４０５ｎｍで読み取り、力価は、パラメータ４個の対数式により吸光度曲線にシグモイド曲線を合わせて計算した（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）。力価は、最大吸光度プラトーの５０％に対応する希釈度の逆数として報告する。
各ワクシノーゲンの免疫原性はウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡの両者によって評価した。ウェスタンブロットのため、タイプＡ、Ｂ、Ｋ、Ｄのｒ−ＯｓｐＣを還元性サンプル緩衝液中１レーン当たり５００ｎｇで載せ、１２．５％ＳＤＳ―ＰＡＧＥゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ，Ｂｉｏｒａｄ）中で電気泳動し、ＰＶＤＦ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にエレクトロブロットした。このブロットを、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）中１％ＢＳＡでブロックした。前記ブロットを、ＰＢＳ−Ｔ中各抗血清の１：２５００希釈物で１時間プローブし、次に３回洗浄した。等量のタンパク質が確実に載せられたことを確認するため、ブロット１個は、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（１：２０００；Ｎｏｖａｇｅｎ）によりスクリーニングした。二次検出は、パーオキシダーゼ結合ヤギ−抗マウスＩｇＧの１：４００００希釈物および化学発光（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ，Ｐｉｅｒｃｅ）によって行った。定量的分析のため、ＯｓｐＣタイプ特異的ＩｇＧ力価は、ＥＬＩＳＡ分析によって決定した。タイプＡ、Ｂ、Ｋ、またはＤのｒ−ＯｓｐＣを、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９０；Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に炭酸緩衝液中（ｐＨ９．６）１００ｎｇ／ウェルで４℃において１６時間塗布しておいた。前記プレートをブロックし（０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中１％ＢＳＡ；２時間）、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、系列希釈した抗ワクシノーゲン抗血清（１００μＬ）を二重プレートのウェルに添加した（１時間）。ＨＲＰ結合ヤギ−抗マウスＩｇＧ（１：２００００）は、二次抗体として作用し、ＡＢＴＳは、発色原基質として作用した。吸光度を、反応速度が直線状である間にＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＥＬｘ８０８；Ｂｉｏｔｅｋ）により４０５ｎｍで読み取り、力価は、パラメータ４個の対数式により吸光度曲線にシグモイド曲線を合わせて計算した（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）。力価は、最大吸光度プラトーの５０％に対応する希釈度の逆数として報告する。
エピトープ特異的イムノグロブリンイソタイププロフィールの決定
ＡＢＫＤ、ＡＢＫＤＤ、およびＡＤＢＫＤワクチン変異体構築体類に対する抗体応答のイソタイププロフィールは、ＥＬＩＳＡによって評価した。９６ウェルプレートに、タイプＡ、Ｂ、ＫおよびＤのｒ−ＯｓｐＣを１００ｎｇ／ウェルで塗布した。このプレートを上記のようにしてブロックし洗浄した。抗ワクシノーゲン抗血清を前記プレートに添加し、二重に分析した（１００μＬ；１：１００００；１時間）。結合したエピトープ特異的Ｉｇを、イソタイプ特異的ビオチン化二次抗体類とインキュベーションして、検出した（１時間；マウスイソタイピングキット；Ｚｙｍｅｄ）。前記の二次抗体類は、パーオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（３０分）と発色原基質ＡＢＴＳにより検出した。インキュベーションは全て、室温で完了した。
ＡＢＫＤ、ＡＢＫＤＤ、およびＡＤＢＫＤワクチン変異体構築体類に対する抗体応答のイソタイププロフィールは、ＥＬＩＳＡによって評価した。９６ウェルプレートに、タイプＡ、Ｂ、ＫおよびＤのｒ−ＯｓｐＣを１００ｎｇ／ウェルで塗布した。このプレートを上記のようにしてブロックし洗浄した。抗ワクシノーゲン抗血清を前記プレートに添加し、二重に分析した（１００μＬ；１：１００００；１時間）。結合したエピトープ特異的Ｉｇを、イソタイプ特異的ビオチン化二次抗体類とインキュベーションして、検出した（１時間；マウスイソタイピングキット；Ｚｙｍｅｄ）。前記の二次抗体類は、パーオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（３０分）と発色原基質ＡＢＴＳにより検出した。インキュベーションは全て、室温で完了した。
ワクチン特異的Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生の決定
免疫マウス由来の脾臓細胞のサイトカイン応答を、Ａｂｕｏｄｅｈら〔１９９９〕の方法を変形したものを用いてワクシノーゲンによりインビトロで再刺激し評価した。ワクチン接種マウスは、ＣＯ２麻酔によって安楽死させ、脾臓を無菌的に取り出しＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）に入れた。各ワクチン構築体により免疫したマウス３匹からの脾臓をまとめ、ゲージＮｏ．２２の針を用いて脾臓カプセル中にＲＰＭＩを繰り返し注入することで細胞を採取した。細胞懸濁液を５０ｍＬの遠心管に移し、細胞を２００×ｇで５分間採取した。赤血球は、８．３ｍｇ／ｍＬ塩化アンモニウム（Ｒ−７７５７、Ｓｉｇｍａ）３ｍＬに１分間暴露させ融解させた。次に、この塩化アンモニウムをＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ）２０ｍＬで希釈し、細胞を遠心分離し３回洗浄した。細胞を１０％ＦＣＳ，１００μｇｍＬ−１ストレプトマイシン、１００ＵｍＬ−１ペニシリン、２．５μｇｍＬ−１アンホテリシンＢを含むＲＰＭＩ１０ｍＬ中に再懸濁した。細胞をトリパンブルーで染色し生存を評価し、血球計で計数し、細胞懸濁液全てを１０７細胞ｍＬ−１に調整した。細胞を１０７細胞／ウェルで２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５２６）中にアリコットとして入れた（１２ウェル／ワクシノーゲンタイプ）。３重ウェルを５または１０μｇｍＬ−１の免疫ワクシノーゲンで刺激した。対照は、無関連タンパク質であるウシ血清アルブミン１０μｇｍＬ−１で刺激した３重ウェルと無刺激ウェル（タンパク質なし）を含んでいた。全プレートを３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベーションし、次に、上清を採取し−８０℃で凍結し、サイトカイン類のＥＬＩＳＡ定量を待った。
免疫マウス由来の脾臓細胞のサイトカイン応答を、Ａｂｕｏｄｅｈら〔１９９９〕の方法を変形したものを用いてワクシノーゲンによりインビトロで再刺激し評価した。ワクチン接種マウスは、ＣＯ２麻酔によって安楽死させ、脾臓を無菌的に取り出しＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）に入れた。各ワクチン構築体により免疫したマウス３匹からの脾臓をまとめ、ゲージＮｏ．２２の針を用いて脾臓カプセル中にＲＰＭＩを繰り返し注入することで細胞を採取した。細胞懸濁液を５０ｍＬの遠心管に移し、細胞を２００×ｇで５分間採取した。赤血球は、８．３ｍｇ／ｍＬ塩化アンモニウム（Ｒ−７７５７、Ｓｉｇｍａ）３ｍＬに１分間暴露させ融解させた。次に、この塩化アンモニウムをＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ）２０ｍＬで希釈し、細胞を遠心分離し３回洗浄した。細胞を１０％ＦＣＳ，１００μｇｍＬ−１ストレプトマイシン、１００ＵｍＬ−１ペニシリン、２．５μｇｍＬ−１アンホテリシンＢを含むＲＰＭＩ１０ｍＬ中に再懸濁した。細胞をトリパンブルーで染色し生存を評価し、血球計で計数し、細胞懸濁液全てを１０７細胞ｍＬ−１に調整した。細胞を１０７細胞／ウェルで２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５２６）中にアリコットとして入れた（１２ウェル／ワクシノーゲンタイプ）。３重ウェルを５または１０μｇｍＬ−１の免疫ワクシノーゲンで刺激した。対照は、無関連タンパク質であるウシ血清アルブミン１０μｇｍＬ−１で刺激した３重ウェルと無刺激ウェル（タンパク質なし）を含んでいた。全プレートを３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベーションし、次に、上清を採取し−８０℃で凍結し、サイトカイン類のＥＬＩＳＡ定量を待った。
Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン類ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のレベルを定量するため、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ（ＥＬＩＳＡ−Ｍａｘ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を製造業者の説明に従い用いた。簡単に述べると、捕捉抗体を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに塗布し、プレートをブロックし、各培養上清１００μＬを二重に、前記プレート中で２時間インキュベーションした。ＩＬ―４検出のため、未希釈培養上清を用い、一方ＩＦＮ−γのため、前記上清を希釈せずおよびＰＢＳで１：２０に希釈して試験した。標準曲線は、公知濃度の各サイトカインを含むサンプルを用いて、作成した。結合サイトカイン類の検出は、ビオチン化二次抗体と次にＨＲＰ結合ストレプトアビジンにより行い、比色検出は、ＴＭＢ基質を用いて行った。
結果
変異体ワクチン構築体類の構築、発現および精製
５´オーバーハングを有するプライマー類ならびに重複アニーリングおよび伸長ＰＣＲ技術を用いて、元来のＡＢＫＤワクチンの変異体類５種を作製した（図１３）。前記構築体類の全てのＤＮＡ配列類を確認した。前記ワクシノーゲン類の選択した物理化学的性質を表６に示した〔Ｇａｓｔｅｉｇｅｒら、２００５〕。ニッケルクロマトグラフィによる組換えワクシノーゲン類の精製後、ＰＢＳ透析中に有意な割合のｒ−タンパク質が沈降することがわかった。このことは、ＡＢＫＤワクシノーゲンの最初の報告でも注目されていた〔実施例３〕。分子量の大きい構築体類ＡＢＫＤＤおよびＡＤＢＫＤはＰＢＳ中溶解度が高いが、ｒ−タンパク質沈降は、さらに有意であった。そうした理由のため、改良透析緩衝液（Ａｒｇ／Ｇｌｕ緩衝液）をＧｏｌｏｖａｎｏｖらの研究〔２００４〕に基づき開発した。前記緩衝液のｐＨは、ＰＢＳのそれ（ｐＨ７．４）からｐＨ８．０まで高め、緩衝液ｐＨとｒ−タンパク質のｐＩとの間の差異を高めた（ｐＩ ６．４９または６．８５）。さらに、塩濃度は、１５０ｍＭから１００ｍＭまで低下させ、５０ｍＭアルギニンと５０ｍＭグルタミン酸を添加した。この緩衝液を用いると、前記ｒ−タンパク質のいずれの沈降も全く見られず、可溶性タンパク質濃度の顕著な上昇があった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化されたように、前記ｒ−タンパク質は純粋で、分解産物を全く含んでいなかった（図１４）。
変異体ワクチン構築体類の構築、発現および精製
５´オーバーハングを有するプライマー類ならびに重複アニーリングおよび伸長ＰＣＲ技術を用いて、元来のＡＢＫＤワクチンの変異体類５種を作製した（図１３）。前記構築体類の全てのＤＮＡ配列類を確認した。前記ワクシノーゲン類の選択した物理化学的性質を表６に示した〔Ｇａｓｔｅｉｇｅｒら、２００５〕。ニッケルクロマトグラフィによる組換えワクシノーゲン類の精製後、ＰＢＳ透析中に有意な割合のｒ−タンパク質が沈降することがわかった。このことは、ＡＢＫＤワクシノーゲンの最初の報告でも注目されていた〔実施例３〕。分子量の大きい構築体類ＡＢＫＤＤおよびＡＤＢＫＤはＰＢＳ中溶解度が高いが、ｒ−タンパク質沈降は、さらに有意であった。そうした理由のため、改良透析緩衝液（Ａｒｇ／Ｇｌｕ緩衝液）をＧｏｌｏｖａｎｏｖらの研究〔２００４〕に基づき開発した。前記緩衝液のｐＨは、ＰＢＳのそれ（ｐＨ７．４）からｐＨ８．０まで高め、緩衝液ｐＨとｒ−タンパク質のｐＩとの間の差異を高めた（ｐＩ ６．４９または６．８５）。さらに、塩濃度は、１５０ｍＭから１００ｍＭまで低下させ、５０ｍＭアルギニンと５０ｍＭグルタミン酸を添加した。この緩衝液を用いると、前記ｒ−タンパク質のいずれの沈降も全く見られず、可溶性タンパク質濃度の顕著な上昇があった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化されたように、前記ｒ−タンパク質は純粋で、分解産物を全く含んでいなかった（図１４）。
ワクチン変異体類の免疫原性
ＡＢＫＤワクチン変異体類の相対的免疫原性を評価するため、マウスをフロインドアジュバント中前記変異体類のそれぞれで免疫した。前記血清のエピトープ特異的反応性はウェスタンブロットにより評価した。このウェスタンブロットでは、前記血清を用いて前記４種のタイプのそれぞれのＰＶＤＦ−固定ｒ−ＯｓｐＣをプローブした。前記タンパク質が前記ブロット上に等量ずつ載せられたことを、タグ特異的マウス−ａ−Ｈｉｓタグモノクローナル抗体との反応性によって評価し、確認した。免疫マウスからの血清は、ｒ−ＯｓｐＣタンパク質類のそれぞれとの反応性レベルにおいてワクシノーゲン依存性差異を明確にした（図１５Ａ）。ＡＢＫＤｐｐａおよびＡＢＫＤｇｇ変異体類によりワクチン接種したマウスにおいてタイプＤヘリックス５エピトープとの反応性低下があり、ＡＤＢＫ変異体との反応性低下が最も顕著であった。定量的にこうした変動を評価するため、前記構築体中に含まれるＯｓｐＣタイプ特異的エピトープ類のそれぞれとのＩｇＧ反応性の力価検定は、ＥＬＩＳＡによって、再度固定化抗原類として前記４種のタイプのそれぞれの全長ｒ−ＯｓｐＣを用いて行った。前記力価は、主に、定性的ウェスタンブロット知見によく類似しており、それぞれのエピトープ類に対する免疫血清の反応性にワクチン特異的差異があることを実証した（図１５Ｂ）。最も顕著な差異は、タイプＤエピトープとの反応性で見られ、特に低い力価は、ＡＢＫＤｐｐａ，ＡＢＫＤｇｇおよびＡＤＢＫ変異体類について観察された。
ＡＢＫＤワクチン変異体類の相対的免疫原性を評価するため、マウスをフロインドアジュバント中前記変異体類のそれぞれで免疫した。前記血清のエピトープ特異的反応性はウェスタンブロットにより評価した。このウェスタンブロットでは、前記血清を用いて前記４種のタイプのそれぞれのＰＶＤＦ−固定ｒ−ＯｓｐＣをプローブした。前記タンパク質が前記ブロット上に等量ずつ載せられたことを、タグ特異的マウス−ａ−Ｈｉｓタグモノクローナル抗体との反応性によって評価し、確認した。免疫マウスからの血清は、ｒ−ＯｓｐＣタンパク質類のそれぞれとの反応性レベルにおいてワクシノーゲン依存性差異を明確にした（図１５Ａ）。ＡＢＫＤｐｐａおよびＡＢＫＤｇｇ変異体類によりワクチン接種したマウスにおいてタイプＤヘリックス５エピトープとの反応性低下があり、ＡＤＢＫ変異体との反応性低下が最も顕著であった。定量的にこうした変動を評価するため、前記構築体中に含まれるＯｓｐＣタイプ特異的エピトープ類のそれぞれとのＩｇＧ反応性の力価検定は、ＥＬＩＳＡによって、再度固定化抗原類として前記４種のタイプのそれぞれの全長ｒ−ＯｓｐＣを用いて行った。前記力価は、主に、定性的ウェスタンブロット知見によく類似しており、それぞれのエピトープ類に対する免疫血清の反応性にワクチン特異的差異があることを実証した（図１５Ｂ）。最も顕著な差異は、タイプＤエピトープとの反応性で見られ、特に低い力価は、ＡＢＫＤｐｐａ，ＡＢＫＤｇｇおよびＡＤＢＫ変異体類について観察された。
ワクチン変異体特異的イムノグロブリン類のイソタイププロフィール
変異体ワクシノーゲン類により誘発された免疫応答をより詳細に理解するため、エピトープ特異的力価によって決定された最大ワクチン強度の前記３種の変異体類（ＡＢＫＤ、ＡＢＫＤＤ、ＡＤＢＫＤ）についてエピトープ特異的イムノグロブリンイソタイププロフィールを完成した。一般的に、前記抗原特異的イムノグロブリン類中にＩｇＧ１、少量のＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ、および非常に少量のＩｇＧ３またはＩｇＭが優勢であったが、このパターンは先に記載されている〔実施例３〕（図１６）。全てのエピトープ類および全てのワクチン変異体類について、Ｉｇイソタイプのパターンは類似であるが、ただひとつ例外がある。ＡＢＫＤまたはＡＤＢＫＤ変異体で免疫したマウスよりもＡＢＫＤＤで免疫したマウスにおいて、タイプＫおよびＤエピトープ特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂのより強い反応性があった。
変異体ワクシノーゲン類により誘発された免疫応答をより詳細に理解するため、エピトープ特異的力価によって決定された最大ワクチン強度の前記３種の変異体類（ＡＢＫＤ、ＡＢＫＤＤ、ＡＤＢＫＤ）についてエピトープ特異的イムノグロブリンイソタイププロフィールを完成した。一般的に、前記抗原特異的イムノグロブリン類中にＩｇＧ１、少量のＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ、および非常に少量のＩｇＧ３またはＩｇＭが優勢であったが、このパターンは先に記載されている〔実施例３〕（図１６）。全てのエピトープ類および全てのワクチン変異体類について、Ｉｇイソタイプのパターンは類似であるが、ただひとつ例外がある。ＡＢＫＤまたはＡＤＢＫＤ変異体で免疫したマウスよりもＡＢＫＤＤで免疫したマウスにおいて、タイプＫおよびＤエピトープ特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂのより強い反応性があった。
ワクチン特異的Ｔリンパ球によるＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン産生
ＡＢＫＤワクシノーゲン中における変異によって誘発されたサイトカイン環境およびＴｈ１／Ｔｈ２バランスの潜在的インパクトを評価するため、マウス脾臓細胞をインビトロで、マウスを免疫した前記ワクシノーゲンで再刺激した。ＩＦＮ−γの誘発レベルにおいて、異なる免疫をしたマウス間で顕著な差が観察された。全てのワクチン変異体類は、培養上清中におけるＩＦＮ−γのレベル上昇と関連していた。ただし、ＡＤＢＫおよびＡＤＢＫＤは、他のワクシノーゲン類によって誘発されたものよりも２乃至３倍高いレベルであった（図１７）。全ての場合において、両者は抗原誘発ＩＦＮ−γの５μｇｍＬ−１および１０μｇｍＬ−１濃度で、レベルは０．５乃至８．６ｎｇ／ｍＬの範囲であった。無刺激脾臓細胞またはウシ血清アルブミンで刺激した脾臓細胞からの細胞培養上清は、全て、このアッセイの検出限界である１５．６ｐｇ／ｍＬ未満のＩＦＮ−γを有していた。ワクチン刺激または対照培養上清のいずれにおいても、ＩＬ−４は検出されず、この濃度が本アッセイの検出限界２．０ｐｇ／ｍＬ未満であることを示唆している。
ＡＢＫＤワクシノーゲン中における変異によって誘発されたサイトカイン環境およびＴｈ１／Ｔｈ２バランスの潜在的インパクトを評価するため、マウス脾臓細胞をインビトロで、マウスを免疫した前記ワクシノーゲンで再刺激した。ＩＦＮ−γの誘発レベルにおいて、異なる免疫をしたマウス間で顕著な差が観察された。全てのワクチン変異体類は、培養上清中におけるＩＦＮ−γのレベル上昇と関連していた。ただし、ＡＤＢＫおよびＡＤＢＫＤは、他のワクシノーゲン類によって誘発されたものよりも２乃至３倍高いレベルであった（図１７）。全ての場合において、両者は抗原誘発ＩＦＮ−γの５μｇｍＬ−１および１０μｇｍＬ−１濃度で、レベルは０．５乃至８．６ｎｇ／ｍＬの範囲であった。無刺激脾臓細胞またはウシ血清アルブミンで刺激した脾臓細胞からの細胞培養上清は、全て、このアッセイの検出限界である１５．６ｐｇ／ｍＬ未満のＩＦＮ−γを有していた。ワクチン刺激または対照培養上清のいずれにおいても、ＩＬ−４は検出されず、この濃度が本アッセイの検出限界２．０ｐｇ／ｍＬ未満であることを示唆している。
抗体力価およびイソタイププロフィールに及ぼすアジュバントタイプの効果
前記ワクシノーゲンに対する応答に及ぼすアジュバントタイプの効果を決定するため、マウスを、フロインドアジュバント類に懸濁したかまたはアルミニウムに吸着させたＡＢＫＤタンパク質で免疫した。ワクシノーゲン全体に対するＩｇＧ力価および各成分エピトープに対するＩｇＧ力価は、アルミニウムアジュバントで免疫したマウスでわずかに低かったが、前記応答の全般的パターンは前記２種のアジュバント類で同様であった（図１８Ａ）。ＩｇＧ１のレベルが類似していたにもかかわらず、ミョウバンで免疫したマウスは、ワクシノーゲン特異的ＩｇＧ３，ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂで低下していた（図１８Ｂ）。エピトープ特異的イソタイププロフィール類は、ワクシノーゲン全体を用いて見られたプロフィールと非常に類似していた（データを示さず）。
前記ワクシノーゲンに対する応答に及ぼすアジュバントタイプの効果を決定するため、マウスを、フロインドアジュバント類に懸濁したかまたはアルミニウムに吸着させたＡＢＫＤタンパク質で免疫した。ワクシノーゲン全体に対するＩｇＧ力価および各成分エピトープに対するＩｇＧ力価は、アルミニウムアジュバントで免疫したマウスでわずかに低かったが、前記応答の全般的パターンは前記２種のアジュバント類で同様であった（図１８Ａ）。ＩｇＧ１のレベルが類似していたにもかかわらず、ミョウバンで免疫したマウスは、ワクシノーゲン特異的ＩｇＧ３，ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂで低下していた（図１８Ｂ）。エピトープ特異的イソタイププロフィール類は、ワクシノーゲン全体を用いて見られたプロフィールと非常に類似していた（データを示さず）。
考察
複数Ｂ細胞エピトープ類を含有するキメラタンパク質の使用は、ワクチン開発において、全タンパク質多価ワクシノーゲン類およびペプチド結合物類に対して大きな利点を有している。防御性エピトープ配列類のみを含ませると、親分子中またはペプチド担体上の無関連エピトープ類に対する応答が間違って誘導される可能性を低下させる。このことは、ＯｓｐＣによるのと同様に、前記組換えワクシノーゲン中で免疫優性である大きな保存ドメイン類があるが、感染時に前記菌によって提示されないならば、重要である〔実施例１；Ｋｕｍａｒａｎら、２００１；Ｅｉｃｋｅｎら、２００１〕。このようなエピトープ類は、防御性免疫応答の産生に関連していない。しかし、新規タンパク質の創生には、エピトープ類を妨害するかまたはタンパク質安定性と溶解度に影響を及ぼすことができる分子間および分子内相互作用を考慮することが必要である。この実施例において、我々は、ＯｓｐＣに基づく組換え、多価キメラライム病ワクシノーゲンの研究を拡大した。原ＡＢＫＤワクチンはマウスで極めて免疫原性であり、誘発されたＩｇＧは、菌細胞表面で天然のＯｓｐＣを結合し補体依存性死滅を惹起した〔実施例３〕。こうした成功にもかかわらず、前記ＡＢＫＤ構築体は、改良を要する２つの要因を有しており、それは、ｒ−タンパク質産生を妨害し保存安定性に影響を及ぼしうるＰＢＳ中における溶解度不良と、前記タンパク質中におけるそれぞれのエピトープ類に対するＩｇＧ力価における差異である。具体的には、前記エピトープと前記ワクチンＣ末端との近さに関連して、力価は減少した。本研究の目標は、ワクシノーゲン溶解度を高めること、かつ、エピトープ配置、エピトープ繰り返しおよび全体としておよびエピトープ特異的免疫応答を高めるための安定化モチーフの含有の点で異なっている改良ワクシノーゲン類を使用することであった。
複数Ｂ細胞エピトープ類を含有するキメラタンパク質の使用は、ワクチン開発において、全タンパク質多価ワクシノーゲン類およびペプチド結合物類に対して大きな利点を有している。防御性エピトープ配列類のみを含ませると、親分子中またはペプチド担体上の無関連エピトープ類に対する応答が間違って誘導される可能性を低下させる。このことは、ＯｓｐＣによるのと同様に、前記組換えワクシノーゲン中で免疫優性である大きな保存ドメイン類があるが、感染時に前記菌によって提示されないならば、重要である〔実施例１；Ｋｕｍａｒａｎら、２００１；Ｅｉｃｋｅｎら、２００１〕。このようなエピトープ類は、防御性免疫応答の産生に関連していない。しかし、新規タンパク質の創生には、エピトープ類を妨害するかまたはタンパク質安定性と溶解度に影響を及ぼすことができる分子間および分子内相互作用を考慮することが必要である。この実施例において、我々は、ＯｓｐＣに基づく組換え、多価キメラライム病ワクシノーゲンの研究を拡大した。原ＡＢＫＤワクチンはマウスで極めて免疫原性であり、誘発されたＩｇＧは、菌細胞表面で天然のＯｓｐＣを結合し補体依存性死滅を惹起した〔実施例３〕。こうした成功にもかかわらず、前記ＡＢＫＤ構築体は、改良を要する２つの要因を有しており、それは、ｒ−タンパク質産生を妨害し保存安定性に影響を及ぼしうるＰＢＳ中における溶解度不良と、前記タンパク質中におけるそれぞれのエピトープ類に対するＩｇＧ力価における差異である。具体的には、前記エピトープと前記ワクチンＣ末端との近さに関連して、力価は減少した。本研究の目標は、ワクシノーゲン溶解度を高めること、かつ、エピトープ配置、エピトープ繰り返しおよび全体としておよびエピトープ特異的免疫応答を高めるための安定化モチーフの含有の点で異なっている改良ワクシノーゲン類を使用することであった。
先の研究では、ＰＢＳ透析後の組換えワクシノーゲンの有意な沈降が注目された〔実施例３〕。この溶解度不良はワクシノーゲン産生を限定したばかりでなくワクチン免疫原性にも影響を及ぼしたであろう。ＰＢＳ透析後のＡＢＫＤ構築体の最大濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであり、はるかに小さいことが多かった。ＯｓｐＣ結晶構造は、ヘリックス５エピトープ領域が天然ＯｓｐＣタンパク質類中の単量体内４−ヘリカルバンドルに関与していることを示唆している〔Ｋｕｍａｒａｎら、２００１；Ｅｉｃｋｅｎら、２００１〕。このことは、ワクシノーゲンタンパク質類内部およびその間で露出した疎水性ヘリカル面で相互作用があることにつながり、それが、次に沈降につながっているのかもしれない。透析緩衝液に対してＡｒｇとＧｌｕを添加することが、前記組換えワクシノーゲンタンパク質類の全ての溶解度を４乃至１００倍だけ高めることがわかった（表７）。この溶解度上昇の基になったのは、ＡｒｇとＧｌｕが、ＡｒｇとＧｌｕの側鎖の脂肪族部分と相互作用することによって、露出した対立荷電の残基類および疎水性残基類の両者と相互作用するからであろう〔Ｇｏｌｏｖａｎｏｖら、２００４〕。Ａｒｇ／Ｇｌｕ緩衝液中で透析したＡＢＫＤ構築体で免疫したマウスは、ＰＢＳに対して透析したＡＢＫＤワクシノーゲンで免疫したそれらよりも顕著に高い力価を有していた〔実施例３〕。Ａｒｇ／Ｇｌｕ緩衝液は、より有効な折り畳みパターンを起こすかあるいは分子間または分子内相互作用をより低下させるかし、それによって、Ｂ細胞レセプター類に対してエピトープ類の接近を良好とするであろう。ｒ−タンパク質へＡｒｇまたはＧｌｕが吸着されても、エピトープ認識を阻害しなかった。前記Ａｒｇ／Ｇｌｕ緩衝液は、インビトロでプロテアーゼ類の活性に対して保護することが報告されている〔Ｇｏｌｏｖａｎｏｖら、２００４〕。ＰＢＳ―またはＡｒｇ／Ｇｌｕ透析サンプルのいずれでもタンパク質分解性の明確な分解はないが、タンパク質分解性切断に対するインビボ保護を、排除できない。ＡｒｇおよびＧｌｕを含む緩衝液に対する透析は、有意な分子間相互作用を有する他の新規キメラタンパク質類に適用できる有用な手段であるのかも知れない。
免疫応答不良とＣ末エピトープ位置との関連は、先に、キメラ溶連菌Ｍタンパク質ワクシノーゲン中で報告されており、おそらく、前記Ｃ末端と関連した構造的問題によりまたはカルボキシペプチダーゼ類によるタンパク質加水分解酵素による分解によるのかも知れない〔Ｄａｌｅら、１９９３；Ｄａｌｅら、１９９６；Ｄａｌｅら、１９９９〕。数多くの方法が、プロテアーゼ活性からペプチド類および組換えタンパク質類を保護するために提案されており、Ｃ末端のアミド化またはＰＥＧ化、前記アミノ（Ｎ）末端のアセチル化、および保護製アミノ酸モチーフの添加などが含まれる〔Ｂｒｉｃｋｅｒｈｏｆｆら、１９９９；Ｐｏｗｅｌｌら、１９９２；Ｌｅｅら、２００５；Ａｌｖａｒｅｚら、２００４；Ｋａｗａｒａｓａｋｉら、２００３；Ｗａｌｋｅｒら、２００３〕。アミノ酸モチーフ類は、カルボキシペプチダーゼの作用を阻害することによってタンパク質のＣ末端を安定化させることも報告されている；しかし、保護するそれらの能力は、数種のタンパク質でしか評価されていない。２種の安定化モチーフ類が、ＡＢＫＤワクシノーゲンに対する抗体応答を増強するそれらの能力について評価されている。２個の中性、親水性Ｇｌｙ残基類の添加は、それぞれ疎水性および塩基性Ｃ末アミノ酸類に対して特異性を有するカルボキシペプチダーゼＣおよびＤの活性を低下させることができる〔Ａｌｖａｒｅｚら、２００４；Ｋａｗａｒａｓａｋｉら、２００３；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎおよびｂｒｅｄａｍ、１９９４〕。Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａモチーフの添加は、近接した、大きなプロリン残基類を介してのカルボキシペプチダーゼ進行を立体的に阻害できるかもしれない〔Ｗａｌｋｅｒら、２００３〕。
ＡＢＫＤキメラワクシノーゲンに対する抗体応答に及ぼすこれらのモチーフ類の添加のインパクトを評価するため、マウスをＡＢＫＤｇｇまたはＡＢＫＤｐｐａ構築体類によって免疫した。いずれの場合も、前記血清は、無修飾ＡＢＫＤ構築体により免疫したものに比較して、１種以上のエピトープ類に対して小さな平均ＩｇＧ力価を有していた。ＡＢＫＤｐｐａ構築体は、タイプＤ特異的ＩｇＧの力価低下を示したが、ただし、このことは主に通常の分布から外れたものがひとつあったことに起因していた。前記ＡＢＫＤｇｇ構築体は、タイプＫおよびＤエピトープ類に対して力価低下を示した。ＩｇＧ力価に基づき、これらのモチーフ類のいずれの使用にも全く利点がなかった。プロテアーゼ保護によるいかなる利点もＡｒｇ／Ｇｌｕ緩衝液によって付与された類似の保護によって隠蔽された可能性もあるが、Ｃ末エピトープ類に対する力価の低下は、これらのモチーフ類が当然耐性を付与するはずのカルボキシペプチダーゼ類の作用に媒介されていないようである〔Ｇｏｌｏｖａｎｏｖら、２００４〕。
Ｃ末エピトープに対する免疫応答不良に関与する可能性のある構造因子を調べるため、数種の追加構築体類を新たに作製した。前記のキメラ溶連菌ワクチンにおいて、Ｃ末端でＮ末エピトープを反復させると、前者のＣ末エピトープを“保護”したが、そのメカニズムは不明である〔Ｄａｌｅら、１９９９；Ｄａｌｅら、２００５；Ｈｕら、２００２；ＭｃＮｅｉｌら、２００５〕。その成功に基づき、ＡＢＫＤワクシノーゲンの類似変異体類を開発した。ＡＢＫＤＤ構築体を作製し、タイプＤエピトープに対する応答が第２のＣ末タイプＤエピトープによって保護できるかどうかを評価した。前記力価低下が主にＣ末エピトープ位置によるのかどうかを評価するため、タイプＤエピトープをＮ末に２番目に近い位置（ＡＤＢＫ）に移動させた。最後に、ＡＤＢＫＤ構築体を用いて、反復Ｃ末エピトープによる保護を評価し、ＡＢＫＤＤにより、特異的免疫応答に及ぼす繰り返しエピトープの効果を評価した。ＡＢＫＤＤワクシノーゲンにおけるエピトープ反復は、タイプＤ特異的ＩｇＧ力価を倍増したが、同時に、隣接するタイプＫエピトープに対する力価低下を起こした。タイプＤエピトープをＡＤＢＫ構築体中でよりＮ末寄りの位置に配置した時、タイプＤ特異的ＩｇＧ力価が有意に減少した。さらに、ＡＤＢＫ構築体中におけるＣ末タイプＫエピトープに対する反応性はＡＢＫＤ中におけるそれをしのぎ、向上した。Ｃ末タイプＤエピトープ（ＡＤＢＫＤ）を添加しても、このタイプＫ特異的力価は向上しなかった；しかし、それは、タイプＤエピトープに対する力価の倍増というわけではないが有意な向上をもたらした。これらの結果は、タイプＤエピトープのＣ末位置が内部位置よりも好適であること、および、追加の“保護性”Ｃ末エピトープによるＣ末エピトープの明白な保護はないことを示唆している。このワクシノーゲン中におけるエピトープ特異的力価の一次決定因子は、Ｃ末端にそれが近接していることではなく、前記キメラタンパク質の３次構造による可能性が高い。
ワクシノーゲン誘発Ｉｇイソタイプ類は、インビボ保護有効性に因果関係を有しているのかもしれない。前記エピトープ類またはそれらの順序を改変させることによって、イソタイププロフィールを改変し〔Ｔｏｎｇｒｅｎら、２００５〕、従って抗体エフェクター機能を改変することも可能である。エピトープ特異的イソタイププロフィールを測定するため、最も見込みのあるワクシノーゲン類（ＡＢＫＤ、ＡＢＫＤＤ、ＡＤＢＫＤ）に対する抗血清をタイプＡ、Ｂ、ＫまたはＤの固定ｒ−ＯｓｐＣに結合させ、この結合した抗体をイソタイプ特異的抗血清で検出した。ＡＢＫＤワクシノーゲンについて先に報告しているように〔実施例３〕、有力なイソタイプはＩｇＧ１であり、前記構築体に応じてややより低いレベルのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂがあり、ＩｇＭおよびＩｇＧ３は低レベルであった。前記エピトープ特異的Ｉｇイソタイププロフィールは、ＡＢＫＤおよびＡＤＢＫＤ抗血清で類似しており、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂレベルがＮ末からＣ末エピトープに向かって低下しており、総ＩｇＧ力価を模倣していた。前記のＡＢＫＤＤは、タイプＫ特異的総ＩｇＧ力価はより低いにもかかわらず、前記エピトープ類全てで一定レベルのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂを有していた。
ＡＢＫＤワクシノーゲンは、補体依存性殺菌性抗体類を惹起する〔実施例３〕。マウスにおいて、ＩｇＧ１は補体を活性化せず〔Ｄａｎｇｌら、１９８８；ＭｉｌｅｔｉｃおよびＦｒａｎｋ、１９９５〕、前記主要な誘発イソタイプが保護性でないかもしれないことを示唆している。ＯｓｐＡ特異的ＩｇＧ１は補体非依存性メカニズムによって殺ボレリア性であると報告されている〔Ｍｕｎｓｏｎら、２０００〕が、ＡＢＫＤワクシノーゲン誘発抗体類による菌死滅は補体依存性である〔実施例３〕。惹起されたイソタイププロフィールは、ライム病研究のための標準的動物モデルであるＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの使用により影響を受けることもある。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ系統マウスとＢＡＬＢ／ｃ系統マウスの間の体液性免疫の差が、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）感染時に注目されており、特に総ＩｇＧレベルにおいて、また特にＩｇＧ２ａレベルにおいて注目されてきており、両者ともにＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスでより高い〔Ｙａｎｇら、１９９２；Ｋｅａｎｅ−ＭｙｅｒｓおよびＮｉｃｋｅｌｌ、１９９５〕。さらに、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ系統マウスはＴＬＲ−４を欠失しており、ボレリアがリポ多糖を産生しないので、このことはワクチン接種によるかまたは感染時におけるライム病防御にとって重大であるとは予測されていない〔Ｔａｋａｙａｍａら、１９８７；Ｂａｒｔｈｏｌｄら、１９９０〕。
一般的に体液性ボレリア殺菌活性が補体依存性であるので、Ｔｈ１サイトカイン応答の惹起は、多くの細菌疾患でそうであるように、有効であるかもしれない（〔ＳｐｅｌｌｂｅｒｇおよびＥｄｗａｒｄｓ，２００１〕でレビュー）。活発な感染時、Ｔｈサイトカイン類は、ライム病およびその続発症の発生と消散に密接に関わっている。いくつかの研究では、ＩＬ−４はボレリア殺菌抗体応答の発生に重大なサイトカインではないとしており〔Ｍｕｎｓｏｎら、２０００；Ｐｏｔｔｅｒら、２０００；Ｃｈｒｉｓｔｉｅら、２０００；Ｓａｔｏｓｋａｒら、２０００−６４〕、Ｔｈ１タイプ応答が防御に関連しているかもしれないことを黙示している。さらに、ＩＦＮ−γ分泌Ｔｈ１細胞がライム病関連心臓炎の消散を促進する〔Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔら、２００１；Ｋｅｌｌｅｈｅｒら、１９９８〕。それとは逆に、関節炎の重篤度と皮膚スピロヘータの量が感染時ｒ−ＩＬ−４の投与により低下し、α−ＩＬ−４抗体投与により増加する〔Ｋｅａｎｅ−ＭｙｅｒｓおよびＮｉｃｋｅｌｌ、１９９５；Ｋｅａｎｅ−Ｍｙｅｒｓら、１９９６〕。ＩＦＮ−γの産生は、自然感染時において慢性ライム病の発生に関連しており〔Ｗｉｄｈｅら、２００４〕、さらに、ライム関節炎において関節腫脹の程度にも関連している〔Ｇｒｏｓｓら、１９９８〕。ＩＦＮ−γはまた、インビトロリンパ節培養物から誘発された殺ボレリア性の抗ＯｓｐＡ抗体類の産生阻害にも関連していた〔Ｍｕｎｓｏｎら、２００２〕。ワクチン接種により誘発されたＴｈサイトカイン環境を調べるため、マウス脾臓細胞をインビトロでワクシノーゲンにより再刺激し、Ｔｈ１（ＩＦＮ−γ）およびＴｈ２（ＩＬ−４）サイトカイン類をＥＬＩＳＡにより定量した。ＩＦＮ−γは、ワクシノーゲンで再刺激した細胞の上清で検出されたが、構築体に応じて濃度は異なっていた。対比的に、ＩＬ−４は、脾臓細胞上清のいずれでも検出されなかった。ＡＢＫＤ、ＡＢＫＤｐｐａおよびＡＢＫＤＤ構築体類はすべて、同様のＩＦＮ−γ濃度を有していた。ＡＤＢＫＤは、およそ２倍のＩＦＮ−γ濃度を有し、ＡＤＢＫははるかに高いレベルを有していた。再刺激細胞上清中ＩＦＮ−γレベルと総エピトープ特異的血清ＩｇＧ力価またはイソタイププロフィールには明白な相関はなかった。
サイトカインおよび関連するＩｇイソタイププロフィール類は、免疫アジュバントの選択により変化させることができた。フロインドの完全アジュバントは、Ｔｈ１サイトカイン応答と関連づけられており〔Ｃｒｉｂｂｓら、２００３；ＳｈｉｂａｋｉおよびＫａｔｚ、２００２〕、ＩｇＧ２ａレベルを高めるかもしれない。ヒト用に現在唯一容認されているアジュバントは、ミョウバンで、それは、Ｔｈ２サイトカイン類の分泌を高めることが既知である〔Ｃｒｉｂｂｓら、２００３；Ｂｒｅｗｅｒら、１９９９；Ｌｉｎｄｂｌａｄ，２００４；ＰｅｔｒｏｖｓｋｙおよびＡｇｕｉｌａｒ、２００４〕。ミョウバンで免疫したマウスにおいて、前記ワクシノーゲンとその成分エピトープ類に対するＩｇＧ力価の予測された通りの中程度の低下が、フロインドのアジュバントと比較して注目された。さらに、ＩｇＧ１に比較してＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂイソタイプ類が比例して大きく減少した。このことは、このアジュバントによりＴｈ１サイトカイン応答が低下するものと予測されたことと一致している。しかし、前記ワクシノーゲンは、補体固定の可能な抗体類を実際に惹起し続け、前記構築体に対するかなりの変化またはアジュバントの修飾が有効応答に必要でないかもしれないことを示唆している。
我々はこの実施例で、潜在的キメラ多価ライム病ワクシノーゲンに対する改変を検討したが、それらは、誘発された体液性免疫応答を最適化することを意図していた。前記構築体の免疫原性の有意な改善は、Ａｒｇ／Ｇｌｕ緩衝液に対しての透析によりその溶解度を高めることによって、行った。このことは、タンパク質相互作用を低下させ、インビボでのエピトープ露出を高くした〔Ｔｈｅｉｓｅｎら、２０００〕。プロテアーゼ防御性のＣ末モチーフの添加あるいは“防御性”Ｃ末エピトープ類の添加はいずれも、前記ワクシノーゲンに対する免疫応答を改善しなかった。エピトープ類を再度並べ替えることにより、移動させたエピトープに対する免疫応答が実質的に低下することになった。このワクチン構築体中の成分エピトープ類に対する免疫応答の差異は、前記タンパク質のプロテアーゼ消化に対する耐性よりもむしろ、前記タンパク質の構造に主に依存しているようである。さらに、あるワクシノーゲンによって惹起されたＴｈサイトカイン類およびＩｇＧイソタイプ類はキメラ構築体の構造によっておよびアジュバント製剤によって改変できることについて証拠がある。本研究では、キメラワクシノーゲン類に対する次善の免疫応答の基盤およびそれらの応答を改善できる方法に関しての重要な情報をもたらす。
利用可能なＯｓｐＣ配列類の分析による防御性の広い多価キメラライム病ワクチンの可能性の実証
防御性の広いキメラ構築体のさらなる開発を促進するため、我々はデータベースで利用可能なＯｓｐＣ配列類の系統発生的分析を行った。分析したＯｓｐＣのセグメントは、残基２０から２００（Ｂ３１ＭＩ配列のための番号付けを使用）までにわたっていた。前記データベースにおけるより短い配列はこれらの分析から除外し、ボレリア株の２８０種からの配列類を残し、分析に使用した。各配列のＯｓｐＣタイプ命名は、アラインメント（ＰＡＭ４０スコアリングマトリックス）およびペア規模での同一性マトリックス分析により決定した。先の研究と同じく、９５％以上の配列同一性を示す配列類は、同じＯｓｐＣタイプに属するとみなした（Ａｔｔｉｅら、２００６；Ｗａｎｇら、１９９９）（図１９）。配列比較物の明白な二項分布が観察され、互いに異なるＯｓｐＣタイプ配列類の間での平均配列同一性は６５％で、タイプ内では＞９７％同一であった。Ｗａｎｇら（１９９９）によって記述された２１のタイプの他に、さらにクラスター１７種も明らかになった。我々は、３配列未満しか含まないクラスター類にはＯｓｐＣタイプ命名を割り当てなかった。新しいＯｓｐＣタイプの命名に際して、我々は既存のＯｓｐＣタイプ命名ＡからＵ（Ｗａｎｇら、１９９９）までを維持することを選択し、追加のタイプは各クラスター内部に含まれるプロトタイプ株に基づいて命名した。分析した配列２８０のうち、２０２はＯｓｐＣタイプ類に振り分けられ、それらの全てがライム病の原因となっている種由来であった。ＯｓｐＣタイプに振り分けなかった配列７８種は、ライム病の原因となっているスピロヘータ類（５１単離物）および他のボレリア種（２７種）の両者を含んでいた。各ＯｓｐＣ配列を得た単離物の地理的および生物学的起源を、表の形式で図２０に示した。ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類の大半は北アメリカ由来であり（８０％）、ヨーロッパ（１６％）およびアジア（４％）由来のものの数は少なかった。ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ＯｓｐＣ配列類の５３％、ボレリア・アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）ＯｓｐＣ配列類の４８％およびボレリア・ガリニイ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）ＯｓｐＣ配列類の７９％は、ヒトから採取した単離物類に起源を有していた。ヒト単離物由来のボレリア・ガリニイ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）ＯｓｐＣ配列類が主に脳脊髄液（ＣＦＳ）由来（６８％）であり、一方、ボレリア・アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）単離物類は主に皮膚由来（８３％）であった。対比的に、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）由来のＯｓｐＣ配列類は、ヒト皮膚（５１％）、血漿（３０％）およびＣＦＳ（１９％）から回収した単離物由来であった。これらの知見は、これらの生物が原因の疾病の公知パターンと一致し、本報告で評価したＯｓｐＣ配列類のサンプルが、ライム病スピロヘータ類の真の集団を表すことを示唆している。
防御性の広いキメラ構築体のさらなる開発を促進するため、我々はデータベースで利用可能なＯｓｐＣ配列類の系統発生的分析を行った。分析したＯｓｐＣのセグメントは、残基２０から２００（Ｂ３１ＭＩ配列のための番号付けを使用）までにわたっていた。前記データベースにおけるより短い配列はこれらの分析から除外し、ボレリア株の２８０種からの配列類を残し、分析に使用した。各配列のＯｓｐＣタイプ命名は、アラインメント（ＰＡＭ４０スコアリングマトリックス）およびペア規模での同一性マトリックス分析により決定した。先の研究と同じく、９５％以上の配列同一性を示す配列類は、同じＯｓｐＣタイプに属するとみなした（Ａｔｔｉｅら、２００６；Ｗａｎｇら、１９９９）（図１９）。配列比較物の明白な二項分布が観察され、互いに異なるＯｓｐＣタイプ配列類の間での平均配列同一性は６５％で、タイプ内では＞９７％同一であった。Ｗａｎｇら（１９９９）によって記述された２１のタイプの他に、さらにクラスター１７種も明らかになった。我々は、３配列未満しか含まないクラスター類にはＯｓｐＣタイプ命名を割り当てなかった。新しいＯｓｐＣタイプの命名に際して、我々は既存のＯｓｐＣタイプ命名ＡからＵ（Ｗａｎｇら、１９９９）までを維持することを選択し、追加のタイプは各クラスター内部に含まれるプロトタイプ株に基づいて命名した。分析した配列２８０のうち、２０２はＯｓｐＣタイプ類に振り分けられ、それらの全てがライム病の原因となっている種由来であった。ＯｓｐＣタイプに振り分けなかった配列７８種は、ライム病の原因となっているスピロヘータ類（５１単離物）および他のボレリア種（２７種）の両者を含んでいた。各ＯｓｐＣ配列を得た単離物の地理的および生物学的起源を、表の形式で図２０に示した。ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）単離物類の大半は北アメリカ由来であり（８０％）、ヨーロッパ（１６％）およびアジア（４％）由来のものの数は少なかった。ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ＯｓｐＣ配列類の５３％、ボレリア・アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）ＯｓｐＣ配列類の４８％およびボレリア・ガリニイ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）ＯｓｐＣ配列類の７９％は、ヒトから採取した単離物類に起源を有していた。ヒト単離物由来のボレリア・ガリニイ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）ＯｓｐＣ配列類が主に脳脊髄液（ＣＦＳ）由来（６８％）であり、一方、ボレリア・アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）単離物類は主に皮膚由来（８３％）であった。対比的に、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）由来のＯｓｐＣ配列類は、ヒト皮膚（５１％）、血漿（３０％）およびＣＦＳ（１９％）から回収した単離物由来であった。これらの知見は、これらの生物が原因の疾病の公知パターンと一致し、本報告で評価したＯｓｐＣ配列類のサンプルが、ライム病スピロヘータ類の真の集団を表すことを示唆している。
さらに系統発生分析を進めるため、分析した配列セットを、同一配列を排除して７４にまで減らした。次に、これらの配列を並べて、ブーツストラッピング付きのＰｈｙｌｉｐ（ｖ．３．６６）系統発生パッケージを用いて分析した（ｎ＝１０００）。距離は、Ｄａｙｈｏｆｆ ＰＡＭマトリックスを用いて２０から２００、２０から１３０および１３１から２００にわたる領域について計算し、隣接部結合によってツリーを新たに作製した。ボレリア・ヘルムシイ（Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ）ＯｓｐＣオーソログ（Ｖｍｐ３３）配列は、外集団として作用した（Ｍａｒｇｏｌｉｓら、１９９４）。コンセンサスツリーを、多数決原理によって作成した（グループに含めるため、カットオフを５０％とした）。Ｄａｙｈｏｆｆ ＰＡＭモデルによる最尤法によって、このコンセンサスツリーについて距離を再計算した（図２１）。
ＯｓｐＣの２０−２００ａａセグメントで作製したコンセンサスツリーは、末端節部で十分にサポートされており、決定した全てのＯｓｐＣタイプ類は予想通りのクラスタリングであった。より奥深くの分枝のいくつかについてはこのブーツストラップ分析でサポートが十分ではなかったが（図２１Ａ）、前記配列での伸長同一領域類がそれらの系統発生分化をわずかにしているので、このことは予測されないことではない。ＯｓｐＣの２０−２００および２０−１３０アミノ酸セグメントを用いて作製したコンセンサスツリーは、主に種同一性に基づき類似の系統発生クラスタリングを示した（図２１Ａ，２１Ｂ）。しかし、アミノ酸類１３１−２００を用いて作製したコンセンサスツリー（図２１Ｃ）は、ブーツストラップ分析でのサポートが十分でなく有意に異なるクラスタリングパターンをもたらした。この観察は、ｏｓｐＣ遺伝子の短いセグメント間での組換えが、異なるＯｓｐＣタイプ類の株で起こったという仮説と一致している。ＯｓｐＣタイプ類の間でのＯｓｐＣの短いセグメントの組換えの証拠は、具体的配列で見ることができる。例えば、ボレリア・アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）ＯｓｐＣタイプＰＬｊ７の配列は、Ｐｋｉクラスターを形成するボレリア・ガリニイ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）ＯｓｐＣ配列で見られたものと同一の領域を、アミノ酸２０−１３０ドメイン内部に有している。ＰＬｊ７の１３１−２００領域では、超可変ループ５およびループ６領域が、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ＯｓｐＣタイプ類のそれぞれＦおよびＭに見られるものと同じモチーフ類を有している。組換えについての上記以外の証拠は、ＳｉｍＰｌｏｔ（ｖ．３．５．１）を用いたブーツスキャニングから生じていた（Ｌｏｌｅら、１９９９）。ブーツスキャニングにおいて、潜在的組換えを、スライディングウィンドウ（ベースウィンドウ４０、ベースステップインターバル１０）内部の配列セグメントの系統発生ツリーを作製する（Ｋｉｍｕｒａモデル、Ｔｓ／Ｔｖ比＝２．０、隣接部結合）ことによって評価する。ツリーをブーツストラップさせ（ｎ＝１００）、そのウィンドウ内部での配列分類をサポートする順序変更ずみのツリーの数を報告する。組換えの証拠は、通常は、順序変更ずみのツリーの＞７０％が一つのウィンドウ内部に配列をまとめてクラスタリングするとき根拠ありとみなす。上記タイプにおいて（図２２）もそれ以外の多数のＯｓｐＣタイプ類（データを示さず）においても、組換え可能性の証拠が見出された。
ＯｓｐＣ可変性が超変異によるよりはむしろ既存のＯｓｐＣタイプ類相間での交換によって起こることの証拠は、防御性の広いワクシノーゲンに取り入れるために必要なＯｓｐＣタイプ特異的エピトープ類の絶対数に限りがあることの証拠である。現在マッピングされている線状エピトープ類は全てＯｓｐＣのＣ末領域（ａａ１３１−２００）内に含まれるので、キメラワクシノーゲンに必要なエピトープ類の理論数を明確にすることが可能である。この領域を前記の７４種の代表的配列類中で調べることによって、独自のエピトープ含有領域の数を、同一であるかまたはアミノ酸１つだけの変化を含む配列の排除により、３４に減らすことができる（図２２）。いくつかのエピトープ類は２種以上のＯｓｐＣタイプに対して防御を伝達できるかもしれないので、この数はさらにエピトープマッピングによって限定することができる。必要エピトープ数をさらに少なくすることは、ヒト疾患、さらに具体的には侵襲性ヒト疾患に関連したＯｓｐＣタイプ類のみを考慮することによってもできるであろう（実施例１参照）。ＯｓｐＣエピトープ類サブセットに対するワクチン接種の理論的問題は、前記ワクシノーゲンに含まれないタイプに対する選択を誘導する潜在的可能性で、それらの稀な対立遺伝子類を保有する群の分画を増大させることになることである。しかし、ヒトは偶然の宿主であるに過ぎないので、ワクチン接種がダニベクターまたは哺乳類保菌者中において特異的ＯｓｐＣタイプ類を発現する株の群分布を有意に変える可能性はないであろう。
要約すると、広範囲にわたるＯｓｐＣデータベースの性質のために徹底した分析が実施でき、新規ＯｓｐＣタイプを明確にしかつそれらの単離頻度とヒト疾患との関連に関する情報を提供できた。上記データは、防御性の広いキメラワクシノーゲンに取り込ませるために必要なＯｓｐＣエピトープ含有配列の数が限定されていることおよびキメラワクシノーゲンの開発が可能であることを示唆している。
８価のキメラの構築
８価の構築体ＥＮＩＣＡＢＫＤを下記に示し、この構築体のいくつかの性質を、ＰＲＯＴＰＡＲＡＭプログラムによって計算し示した。“Ｌ＃”と命名したセグメントは、リンカー配列である。“ＲＳ”は、前記構築体作製に使用した制限部位の位置を示している。
８価の構築体ＥＮＩＣＡＢＫＤを下記に示し、この構築体のいくつかの性質を、ＰＲＯＴＰＡＲＡＭプログラムによって計算し示した。“Ｌ＃”と命名したセグメントは、リンカー配列である。“ＲＳ”は、前記構築体作製に使用した制限部位の位置を示している。
分子量：４１２６３．７
理論的等電点：６．５２
アミノ酸組成：
Ａｌａ （Ａ） ５１ １３．３％
Ａｒｇ （Ｒ） ２ ０．５％
Ａｓｎ （Ｎ） ２０ ５．２％
Ａｓｐ （Ｄ） ２５ ６．５％
Ｃｙｓ （Ｃ） ０ ０．０％
Ｇｌｎ （Ｑ） ５ １．３％
Ｇｌｕ （Ｅ） ４２ １０．９％
Ｇｌｙ （Ｇ） ２１ ５．５％
Ｈｉｓ （Ｈ） １２ ３．１％
Ｉｌｅ （Ｉ） ７ １．８％
Ｌｅｕ （Ｌ） ４６ １２．０％
Ｌｙｓ （Ｋ） ６２ １６．１％
Ｍｅｔ （Ｍ） ７ １．８％
Ｐｈｅ （Ｆ） ７ １．８％
Ｐｒｏ （Ｐ） ５ １．３％
Ｓｅｒ （Ｓ） ２７ ７．０％
Ｔｈｒ （Ｔ） ２６ ６．８％
Ｔｒｐ （Ｗ） ０ ０．０％
Ｔｙｒ （Ｙ） ０ ０．０％
Ｖａｌ （Ｖ） １９ ４．９％
陰電荷残基類（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）の総数：６７
陽電荷残基類（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）の総数：６４
原子組成：
炭素 Ｃ １７８７
水素 Ｈ ２９８３
窒素 Ｎ ５０１
酸素 Ｏ ５９７
イオウ Ｓ ７
式：Ｃ１７８７Ｈ２９８３Ｎ５０１Ｏ５９７Ｓ７
総原子数：５８７５
推定半減期：
検討した配列のＮ末端は、Ａ（Ａｌａ）である。
推定半減期：４．４時間（インビトロでの哺乳類赤血球）。
＞２０時間（インビボでの酵母）。
＞１０時間（インビボでの大腸菌）。
不安定性係数：
不安定性係数（ＩＩ）はコンピュータ計算で１２．５８である。
このことは、前記タンパク質を安定として分類する。
脂肪族係数：８１．４６
ヒドロパティのグランドアベレッジ（ＧＲＡＶＹ）：−０．６６８
Ａｌａ （Ａ） ５１ １３．３％
Ａｒｇ （Ｒ） ２ ０．５％
Ａｓｎ （Ｎ） ２０ ５．２％
Ａｓｐ （Ｄ） ２５ ６．５％
Ｃｙｓ （Ｃ） ０ ０．０％
Ｇｌｎ （Ｑ） ５ １．３％
Ｇｌｕ （Ｅ） ４２ １０．９％
Ｇｌｙ （Ｇ） ２１ ５．５％
Ｈｉｓ （Ｈ） １２ ３．１％
Ｉｌｅ （Ｉ） ７ １．８％
Ｌｅｕ （Ｌ） ４６ １２．０％
Ｌｙｓ （Ｋ） ６２ １６．１％
Ｍｅｔ （Ｍ） ７ １．８％
Ｐｈｅ （Ｆ） ７ １．８％
Ｐｒｏ （Ｐ） ５ １．３％
Ｓｅｒ （Ｓ） ２７ ７．０％
Ｔｈｒ （Ｔ） ２６ ６．８％
Ｔｒｐ （Ｗ） ０ ０．０％
Ｔｙｒ （Ｙ） ０ ０．０％
Ｖａｌ （Ｖ） １９ ４．９％
陰電荷残基類（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）の総数：６７
陽電荷残基類（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）の総数：６４
原子組成：
炭素 Ｃ １７８７
水素 Ｈ ２９８３
窒素 Ｎ ５０１
酸素 Ｏ ５９７
イオウ Ｓ ７
式：Ｃ１７８７Ｈ２９８３Ｎ５０１Ｏ５９７Ｓ７
総原子数：５８７５
推定半減期：
検討した配列のＮ末端は、Ａ（Ａｌａ）である。
推定半減期：４．４時間（インビトロでの哺乳類赤血球）。
＞２０時間（インビボでの酵母）。
＞１０時間（インビボでの大腸菌）。
不安定性係数：
不安定性係数（ＩＩ）はコンピュータ計算で１２．５８である。
このことは、前記タンパク質を安定として分類する。
脂肪族係数：８１．４６
ヒドロパティのグランドアベレッジ（ＧＲＡＶＹ）：−０．６６８
試験哺乳類に投与すると、このキメラタンパク質構築体は、顕著な免疫応答を惹起することが判明し、ライム病発生から保護する。
本発明をその好適な態様の観点から記載してきたが、当業者は本発明が付属の請求の範囲の真意と範囲内で変更し実行できることを理解するであろう。したがって、本発明は、上記に述べたような態様類に限定されず、本文に示した明細書の真意と範囲内の全ての変更とその均等物も含むべきである。
ヒトライム病の予防用ワクチンおよび診断薬に対する永年にわたる需要を満たすことができる。
（各図中の用語の対応訳）
［図２］
HRP-S-Protein ＨＲＰ−Ｓタンパク質
2 wks 第２週
8 wks 第８週
6 wks 第６週
［図３Ｂ］［図３Ｃ］
HRP-S-Protein ＨＲＰ−Ｓタンパク質
?-B31M1 infection serum ？−Ｂ３１ＭＩ感染血清
［図４Ａ］［図４Ｂ］
Loop 5 epitope ループ５エピトープ
Alpha 5 epitope(s) アルファ５エピトープ（類）
OspC type ＯｓｐＣタイプ
Sequences aa136-150 配列類ａａ１３６−１５０
# of sequences 配列類の＃
SEQ ID NO 配列番号
［図５］
Full length 全長
Loop 5 ループ５
wk 4 （第４週）
wk 6 （第６週）
wk 8 （第８週）
［図６］
Patient Serum Number 患者血清番号
［図７Ａ］
Mouse-α-B31MI infection serum
#1 マウス―α―Ｂ３１ＭＩ感染血清＃１
Human early serum #8 ヒト初期血清＃８
［図８］
r-type loop 5 ｒ−タイプＡループ５
B. parkeri ボレリア・パルケリ
B. burgdorferi ボレリア・ブルグドルフェリ
［図９Ａ］
Plasmid プラスミド
Template テンプレート
Primers プライマー類
Product 生成物
round 1 第１回
round 2 第２回
round 3 第３回
round 4 第４回
Type A loop 5 (19aa) タイプＡループ５（１９ａａ）
link リンク１
Type B helix 5 (42aa) タイプＢヘリックス５（４２ａａ）
Type K helix 5 (41aa) タイプＫヘリックス５（４１ａａ）
［図９Ｂ］
HIS tag/EI site ＨＩＳ ｔａｇ／ＥＩ部位
［図１０］
rBBn39 (control) ｒＢＢｎ３９（対照）
ABKD chimeric ＡＢＫＤキメラ
Mouse-anti-His tag mAb マウス抗Ｈｉｓ ｔａｇ ｍＡｂ
Mouse 3A 6wk serum マウス３Ａ 第６週血清
Mouse 6B 6wk serum マウス６Ｂ 第６週血清
［図１１Ａ］
1/Dilution １／希釈度
［図１１Ｂ］
Log(titer) 対数（力価）
ABKD chimeric ＡＢＫＤキメラ
Coating antigen 塗布抗原
［図１２］
OD405 (mean ±SD) ＯＤ４０５（平均±ＳＤ）
Antibody Isotype 抗体イソタイプ
［図１３Ｅ］
Type A Loop 5 タイプＡループ５
Type B Helix 5 タイプＢヘリックス５
Type K Helix 5 タイプＫヘリックス５
Type D Helix 5 タイプＤヘリックス５
［図１５Ｂ］
Titer 力価
vs ABKD＊ 対ＡＢＫＤ＊
vs ABKD 対ＡＢＫＤ
［図１７］
Vaccine ワクチン
［図１８Ａ］
Antigen 抗原
Titer (mean ±SEM) 力価（平均±ＳＥＭ）
［図１８Ｂ］
Isotype イソタイプ
OD（４０５）(mean ±SD) ＯＤ（４０５）（平均±ＳＤ）
［図１９］
Sequence Identity (％) 配列同一性（％）
Pairwise Comparisons (％ of total) 対規模の比較（総計に対する％）
［図２０Ａ］
OspC Type ＯｓｐＣタイプ
Borrelia species ボレリア種
Assigned 振り分け
B. burgdorferi ボレリア・ブルグドルフェリ
B. garinii ボレリア・ガリニイ
B. afzlii ボレリア・アフゼリ
other species 他の種
Unassigned 非振り分け
Totals 総計
* For letter-assigned OspC types, an
example strain is given in parentheses.
＊ 文字命名ＯｓｐＣタイプについて、例示株を括弧に示した。
B. bissettii ボレリア・ビセチイ
B. japonica ボレリア・ジャポニカ
B. andersonii ボレリア・アンデルソニイ
B. tanukii ボレリア・タヌキイ
B. valaisiana ボレリア・バライシアナ
B. species ボレリア種
［図２０Ｂ］
Geographic Region 地理領域
OspC Type ＯｓｐＣタイプ
North America 北アメリカ
Europe ヨーロッパ
Russia ロシア
Asia アジア
Not provided 提供ナシ
Assigned 振り分け
Unassigned 非振り分け
Totals 総計
* For letter-assigned OspC types, an
example strain is given in parentheses.
＊ 文字命名ＯｓｐＣタイプについて、例示株を括弧に示した。
［図２０Ｃ］
OspC Type ＯｓｐＣタイプ
Isolated from 単離起源
Human Skin ヒト皮膚
Human Blood ヒト血液
Human CSF ヒトＣＳＦ
Other animal 他の動物
Tick ダニ
Not provided 提供されず
Assigned 振り分け
Unassigned 非振り分け
Totals 総計
* For letter-assigned OspC types, an
example strain is given in parentheses.
＊ 文字命名ＯｓｐＣタイプについて、例示株を括弧に示した。
［図２２］
Nucleotide Position ヌクレオチド位置
Permuted trees 順序を入れ替えたツリー
［図２３］
SEQ ID NO 配列番号
Sp 種
Strain 株
OspC type ＯｓｐＣタイプ
Epitope Region Sequence エピトープ領域配列
［図２５Ａ］〜［図２５Ｊ］
Construct 構築体
［図２６］
Strain 株
Protein accession # タンパク質アクセス番号
DNA accession # ＤＮＡアクセス番号
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［図２］
HRP-S-Protein ＨＲＰ−Ｓタンパク質
2 wks 第２週
8 wks 第８週
6 wks 第６週
［図３Ｂ］［図３Ｃ］
HRP-S-Protein ＨＲＰ−Ｓタンパク質
?-B31M1 infection serum ？−Ｂ３１ＭＩ感染血清
［図４Ａ］［図４Ｂ］
Loop 5 epitope ループ５エピトープ
Alpha 5 epitope(s) アルファ５エピトープ（類）
OspC type ＯｓｐＣタイプ
Sequences aa136-150 配列類ａａ１３６−１５０
# of sequences 配列類の＃
SEQ ID NO 配列番号
［図５］
Full length 全長
Loop 5 ループ５
wk 4 （第４週）
wk 6 （第６週）
wk 8 （第８週）
［図６］
Patient Serum Number 患者血清番号
［図７Ａ］
Mouse-α-B31MI infection serum
#1 マウス―α―Ｂ３１ＭＩ感染血清＃１
Human early serum #8 ヒト初期血清＃８
［図８］
r-type loop 5 ｒ−タイプＡループ５
B. parkeri ボレリア・パルケリ
B. burgdorferi ボレリア・ブルグドルフェリ
［図９Ａ］
Plasmid プラスミド
Template テンプレート
Primers プライマー類
Product 生成物
round 1 第１回
round 2 第２回
round 3 第３回
round 4 第４回
Type A loop 5 (19aa) タイプＡループ５（１９ａａ）
link リンク１
Type B helix 5 (42aa) タイプＢヘリックス５（４２ａａ）
Type K helix 5 (41aa) タイプＫヘリックス５（４１ａａ）
［図９Ｂ］
HIS tag/EI site ＨＩＳ ｔａｇ／ＥＩ部位
［図１０］
rBBn39 (control) ｒＢＢｎ３９（対照）
ABKD chimeric ＡＢＫＤキメラ
Mouse-anti-His tag mAb マウス抗Ｈｉｓ ｔａｇ ｍＡｂ
Mouse 3A 6wk serum マウス３Ａ 第６週血清
Mouse 6B 6wk serum マウス６Ｂ 第６週血清
［図１１Ａ］
1/Dilution １／希釈度
［図１１Ｂ］
Log(titer) 対数（力価）
ABKD chimeric ＡＢＫＤキメラ
Coating antigen 塗布抗原
［図１２］
OD405 (mean ±SD) ＯＤ４０５（平均±ＳＤ）
Antibody Isotype 抗体イソタイプ
［図１３Ｅ］
Type A Loop 5 タイプＡループ５
Type B Helix 5 タイプＢヘリックス５
Type K Helix 5 タイプＫヘリックス５
Type D Helix 5 タイプＤヘリックス５
［図１５Ｂ］
Titer 力価
vs ABKD＊ 対ＡＢＫＤ＊
vs ABKD 対ＡＢＫＤ
［図１７］
Vaccine ワクチン
［図１８Ａ］
Antigen 抗原
Titer (mean ±SEM) 力価（平均±ＳＥＭ）
［図１８Ｂ］
Isotype イソタイプ
OD（４０５）(mean ±SD) ＯＤ（４０５）（平均±ＳＤ）
［図１９］
Sequence Identity (％) 配列同一性（％）
Pairwise Comparisons (％ of total) 対規模の比較（総計に対する％）
［図２０Ａ］
OspC Type ＯｓｐＣタイプ
Borrelia species ボレリア種
Assigned 振り分け
B. burgdorferi ボレリア・ブルグドルフェリ
B. garinii ボレリア・ガリニイ
B. afzlii ボレリア・アフゼリ
other species 他の種
Unassigned 非振り分け
Totals 総計
* For letter-assigned OspC types, an
example strain is given in parentheses.
＊ 文字命名ＯｓｐＣタイプについて、例示株を括弧に示した。
B. bissettii ボレリア・ビセチイ
B. japonica ボレリア・ジャポニカ
B. andersonii ボレリア・アンデルソニイ
B. tanukii ボレリア・タヌキイ
B. valaisiana ボレリア・バライシアナ
B. species ボレリア種
［図２０Ｂ］
Geographic Region 地理領域
OspC Type ＯｓｐＣタイプ
North America 北アメリカ
Europe ヨーロッパ
Russia ロシア
Asia アジア
Not provided 提供ナシ
Assigned 振り分け
Unassigned 非振り分け
Totals 総計
* For letter-assigned OspC types, an
example strain is given in parentheses.
＊ 文字命名ＯｓｐＣタイプについて、例示株を括弧に示した。
［図２０Ｃ］
OspC Type ＯｓｐＣタイプ
Isolated from 単離起源
Human Skin ヒト皮膚
Human Blood ヒト血液
Human CSF ヒトＣＳＦ
Other animal 他の動物
Tick ダニ
Not provided 提供されず
Assigned 振り分け
Unassigned 非振り分け
Totals 総計
* For letter-assigned OspC types, an
example strain is given in parentheses.
＊ 文字命名ＯｓｐＣタイプについて、例示株を括弧に示した。
［図２２］
Nucleotide Position ヌクレオチド位置
Permuted trees 順序を入れ替えたツリー
［図２３］
SEQ ID NO 配列番号
Sp 種
Strain 株
OspC type ＯｓｐＣタイプ
Epitope Region Sequence エピトープ領域配列
［図２５Ａ］〜［図２５Ｊ］
Construct 構築体
［図２６］
Strain 株
Protein accession # タンパク質アクセス番号
DNA accession # ＤＮＡアクセス番号
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Claims (28)
- ２種以上の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域またはアルファヘリックス５領域、または両者からのエピトープ類を含むキメラ組換えタンパク質。
- 前記ＯｓｐＣタイプ類がＳｍａｒ、ＰＬｉ、Ｈ１３、ＰＦｉＭ、ＳＬ１０、ＰＭｉｔ、ＰＫｉ、Ｐｂｅｓ、ＨＴ２２、Ｐｋｏ、ＰＬｊ７、ＶＳ４６１、ＤＫ１５、ＨＴ２５、Ａ、７２ａ、Ｆ、Ｅ、Ｍ、Ｄ、Ｕ、Ｉ、Ｌ、Ｈ、Ｓｚｉｄ、ＰＨｅｚ、ＰＷａ、Ｂ、Ｋ、Ｎ、およびＣから構成される群から選択される請求項１記載のキメラ組換えタンパク質。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、ＯｓｐＣタイプ類Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む請求項２記載のキメラ組換えタンパク質。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、ＯｓｐＣタイプ類Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む請求項２記載のキメラ組換えタンパク質。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、配列番号７５または配列番号２４９によって表される一次アミノ酸配列を有する請求項１記載のキメラ組換えタンパク質。
- 前記ＯｓｐＣタイプ類が侵襲性ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染に関連している請求項１記載のキメラ組換えタンパク質。
- ボレリアに対する免疫応答を必要としている個体においてそれを惹起するための方法であって、
前記個体に対して２種以上の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域またはアルファヘリックス５領域、または両者からのエピトープ類を含むキメラ組換えタンパク質を投与する過程を含むことを特徴とする方法。 - 前記ＯｓｐＣタイプ類がＳｍａｒ、ＰＬｉ、Ｈ１３、ＰＦｉＭ、ＳＬ１０、ＰＭｉｔ、ＰＫｉ、Ｐｂｅｓ、ＨＴ２２、Ｐｋｏ、ＰＬｊ７、ＶＳ４６１、ＤＫ１５、ＨＴ２５、Ａ、７２ａ、Ｆ、Ｅ、Ｍ、Ｄ、Ｕ、Ｉ、Ｌ、Ｈ、Ｓｚｉｄ、ＰＨｅｚ、ＰＷａ、Ｂ、Ｋ、Ｎ、およびＣから構成される群から選択される請求項７記載の方法。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、ＯｓｐＣタイプ類Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む請求項７記載の方法。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、ＯｓｐＣタイプ類Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む請求項７記載の方法。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、配列番号７５または配列番号２４９によって表される一次アミノ酸配列を有する請求項７記載の方法。
- 前記ＯｓｐＣタイプ類が侵襲性ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染に関連している請求項７記載の方法。
- 個体がボレリアに暴露したかまたはボレリアに感染したかまたはその両者であるかどうかを確認するための方法であって、
前記個体から生体サンプルを得る過程と、
前記生体サンプルを少なくとも１種の組換えキメラタンパク質、すなわち２種以上の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域またはアルファヘリックス５領域、または両者からのエピトープ類を含む少なくとも１種の組換えキメラタンパク質に暴露させる過程と、
前記生体サンプル中における抗体類が前記少なくとも１種の組換えキメラタンパク質に結合するかどうかを決定する過程と
を含み、
抗体結合検出がボレリアに対する過去の暴露または感染を表すことを特徴とする方法。 - 前記ＯｓｐＣタイプ類がＳｍａｒ、ＰＬｉ、Ｈ１３、ＰＦｉＭ、ＳＬ１０、ＰＭｉｔ、ＰＫｉ、Ｐｂｅｓ、ＨＴ２２、Ｐｋｏ、ＰＬｊ７、ＶＳ４６１、ＤＫ１５、ＨＴ２５、Ａ、７２ａ、Ｆ、Ｅ、Ｍ、Ｄ、Ｕ、Ｉ、Ｌ、Ｈ、Ｓｚｉｄ、ＰＨｅｚ、ＰＷａ、Ｂ、Ｋ、Ｎ、およびＣから構成される群から選択される請求項１３記載の方法。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、ＯｓｐＣタイプ類Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む請求項１３記載の方法。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、ＯｓｐＣタイプ類Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む請求項１３記載の方法。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、配列番号７５または配列番号２４９によって表される一次アミノ酸配列を有する請求項１３記載の方法。
- 前記ＯｓｐＣタイプ類が侵襲性ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染に関連している請求項１３記載の方法。
- ２種以上の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域またはアルファヘリックス５領域または両者からのエピトープ類を含むキメラ組換えタンパク質に対する抗体。
- 前記ＯｓｐＣタイプ類がＳｍａｒ、ＰＬｉ、Ｈ１３、ＰＦｉＭ、ＳＬ１０、ＰＭｉｔ、ＰＫｉ、Ｐｂｅｓ、ＨＴ２２、Ｐｋｏ、ＰＬｊ７、ＶＳ４６１、ＤＫ１５、ＨＴ２５、Ａ、７２ａ、Ｆ、Ｅ、Ｍ、Ｄ、Ｕ、Ｉ、Ｌ、Ｈ、Ｓｚｉｄ、ＰＨｅｚ、ＰＷａ、Ｂ、Ｋ、Ｎ、およびＣから構成される群から選択される請求項１９記載の抗体。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、ＯｓｐＣタイプ類Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む請求項１９記載の抗体。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、ＯｓｐＣタイプ類Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｂ、ＫおよびＤからのエピトープ類を含む請求項１９記載の抗体。
- 前記キメラ組換えタンパク質が、配列番号７５または配列番号２４９によって表される一次アミノ酸配列を有する請求項１９記載の抗体。
- 前記ＯｓｐＣタイプ類が侵襲性ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染に関連している請求項１９記載の抗体。
- 前記抗体がポリクローナルである請求項１９記載の抗体。
- 前記抗体がモノクローナルである請求項１９記載の抗体。
- 前記抗体がボレリアスピロヘータ類に対して殺菌性である請求項１９記載の抗体。
- キメラ組換えタンパク質類の免疫原性カクテルであって、前記カクテル中の各キメラ組換えタンパク質が２種以上の外表面タンパク質Ｃ（ＯｓｐＣ）タイプ類のループ５領域またはアルファヘリックス５領域または両者からのエピトープ類を含むことを特徴とするカクテル。
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