JP2009296909A - Method for dissolving three-dimensional cross-linked body - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体成分を保持、保存、及び輸送するための三次元架橋体の溶解方法に関する。 The present invention relates to a method for dissolving a three-dimensional crosslinked body for holding, storing and transporting biological components.
一般的に細胞や組織などの生体成分を生きた状態で固定化することは、バイオエンジニアリングを基盤としたバイオテクノロジーや再生医療の産業化のためには重要な技術である。通常、生体成分の一つである動物細胞の保存には凍結保存液に細胞、組織を分散させてガラスやプラスチック製の凍結保存用チューブに入れ、凍結保存されるのが一般的である（非特許文献１参照）。
これらの保存液に細胞を分散させたバイアルに封入して凍結させて液体窒素中で保存するのが一般的であるが、凍結時には急速冷凍してはならず、徐々に温度を下げて凍結させる必要がある。その目的のために液体窒素を徐々に供給し、１分間に１℃から２分間に１℃温度降下をする専用の凍結装置が市販されている。
このような凍結装置は高額であるため簡便法として、イソプロピルアルコールを−８０℃以下の超低温冷凍庫に入れた場合の温度降下が１分１℃に近いことを利用してバイアルを凍結する方法や、バイアルをまず冷蔵庫（４℃）、次に−２０℃の冷凍庫に１時間、−８０℃の超低温冷凍庫で一晩かけて凍結する方法などがある。
しかし、厳密に温度管理して液体窒素保存しても、解凍後の細胞生存率が著しく悪い（数％以下、ほとんど生存している細胞がいない）細胞がかなり存在している。特に初代細胞や、生殖細胞、融合細胞、遺伝子導入細胞等、重要な機能を持つ細胞群において、解凍後の細胞生存率が著しく悪い細胞が多く存在する。これらの細胞は保存することができないため必要な時に必要な実験ができない。
また、解凍後の細胞もすぐに培養容器に播種して培養を開始しないと継時的に細胞の活きが悪化していくことが知られている。
In general, immobilizing biological components such as cells and tissues in an alive state is an important technology for biotechnology based on bioengineering and industrialization of regenerative medicine. In general, animal cells, which are one of the biological components, are generally stored in a cryopreservation solution by dispersing the cells and tissues in a cryopreservation tube made of glass or plastic. Patent Document 1).
In general, cells are dispersed in these storage solutions and sealed in liquid nitrogen and then stored in liquid nitrogen. However, when freezing, they should not be frozen quickly, but gradually frozen at lower temperatures. There is a need. For this purpose, a dedicated freezing apparatus is commercially available that gradually supplies liquid nitrogen and drops the temperature from 1 ° C. per minute to 1 ° C. per 2 minutes.
Since such a freezing apparatus is expensive, as a simple method, a method of freezing a vial using the fact that the temperature drop when isopropyl alcohol is put in an ultra-low temperature freezer of −80 ° C. or less is close to 1 ° C. for 1 minute, There is a method in which the vial is first frozen in a refrigerator (4 ° C.), then in a freezer at −20 ° C. for 1 hour, and in an ultra-low temperature freezer at −80 ° C. overnight.
However, even if the temperature is strictly controlled and stored in liquid nitrogen, there are quite a few cells with a very poor cell viability after thawing (less than a few percent, almost no cells are alive). In particular, in a cell group having an important function such as a primary cell, a germ cell, a fused cell, or a gene-transferred cell, there are many cells that have extremely poor cell viability after thawing. Since these cells cannot be preserved, the necessary experiments cannot be performed when necessary.
In addition, it is known that the cell activity deteriorates over time unless cells after thawing are immediately seeded in a culture vessel and the culture is started.
又、凍結液として使用されるジメチルスルホシキド自体は、細胞に対して毒性を持っており長時間暴露することは好ましくない。また、細胞によっては凍結時に加えるジメチルスルホシキドにより変性を受けることもあり（ヒト由来急性骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０細胞はジメチルスルホキシドにより好中球様細胞へ分化誘導が惹起される）、本来ならば使用を控えたい試薬である。そのため種々の細胞凍結保存液が研究、開発されている。
このような努力によって細胞、組織保存技術は進んできたにもかかわらず凍結保存が効かない細胞は多数存在しており、これらの細胞を安定して培養することはバイオテクノロジーの発展に寄与するものである。
In addition, dimethyl sulfoxide used as a frozen solution is toxic to cells and is not preferable to be exposed for a long time. In addition, some cells may be denatured by dimethylsulfoxide added at the time of freezing (human-derived acute myeloid leukemia cell line HL-60 cells are induced to differentiate into neutrophil-like cells by dimethylsulfoxide), It is a reagent that should not be used. Therefore, various cell cryopreservation solutions have been researched and developed.
Many efforts have been made to preserve cells and tissues through such efforts, but there are many cells that cannot be cryopreserved. Stable culturing of these cells contributes to the development of biotechnology. It is.
また、生体成分の安定した保存には、保存中に多く生じる変性を防ぐ必要がある。
細胞は通常、４〜３７℃では保存することはできず、上記の細胞保存液を加えても保存開始時から細胞死が発生し、２４時間以内にほとんどの細胞が死滅する。３７℃では細胞は培養によって維持するしか方法はないが、培養には毎日の観察、培地交換等の世話が必要で、保存とは言いがたい。また、培養中に細胞が変質したり、長期培養が不可能な細胞が存在する等、保存することは困難である。
細胞や組織などの生体成分を維持するには、超低温での冷凍保存しか方法はないが、それでは保存できない生体成分が多数存在しており、安定して生体成分を保存、保持可能な方法が渇望されている。例えば、細胞では、肝実質細胞、膵島細胞、ミクログリア細胞などの機能分化を果たした細胞群や、造血幹細胞、ヒトES細胞、ヒトｉＰＳ細胞、サルES細胞等の幹細胞群、卵子やEC細胞などの保存が困難である。これらの細胞は非常に有用な細胞であり、安定した保存方法の開発が望まれている。
In addition, in order to stably store biological components, it is necessary to prevent denaturation that frequently occurs during storage.
Normally, cells cannot be stored at 4 to 37 ° C., and even when the above cell storage solution is added, cell death occurs from the beginning of storage, and most cells die within 24 hours. At 37 ° C., cells can only be maintained by culturing, but culturing requires daily observation, medium exchange, etc., and cannot be said to be preserved. In addition, it is difficult to preserve the cells because the cells are altered during the culture, or there are cells that cannot be cultured for a long time.
The only way to maintain biological components such as cells and tissues is by cryopreservation at ultra-low temperatures, but there are many biological components that cannot be stored, and there is a craving for a method that can stably store and retain biological components. Has been. For example, in the cells, cell groups that have undergone functional differentiation such as liver parenchymal cells, pancreatic islet cells, microglia cells, stem cell groups such as hematopoietic stem cells, human ES cells, human iPS cells, monkey ES cells, eggs, EC cells, etc. It is difficult to save. These cells are very useful cells, and development of a stable storage method is desired.
この目的のために、ホスホリルコリン基とボロン酸基を同時に有するポリマーが、多価水酸基を持つ化合物と効果的に可逆的な共有結合を生成して、三次元の架橋体を形成することを利用し、生体成分を固定化する方法がある（特許文献１参照）。この方法によると常温、常圧という生体成分に対して温和な条件のもと、ポリマーネットワークを生成させ、そのハイドロゲルネットワーク内に生体成分を包括固定し、これにより生体成分は高い活性を維持できることが記載されている。この三次元架橋体を溶解させるための方法として、水酸基を有する化合物としてグルコース等の糖を添加することでボロン酸と水酸基による共有結合を解くことは可能である。
例えば、三次元架橋体を物理的に砕きながら直接グルコース等の糖の粉末をふりかけ、長時間放置して三次元架橋体を溶解することも可能である。しかし、高濃度の糖溶液中に細胞や組織などの生体成分を暴露することによる悪影響が存在し、細胞や組織において周囲の糖が高濃度状態で長時間になると細胞内の水分が浸透圧により細胞外に出て細胞の萎縮が観察された。又、グルコース等の糖類の水溶液を添加して、長時間攪拌することで三次元架橋体を溶解することが可能である。しかし、細胞や組織などの生体成分を三次元架橋体内に封入している場合においては、長時間にわたる攪拌は、その内容物たる細胞や組織などの生体成分にとって悪影響を及ぼすため、できる限り短時間において三次元構造体の溶解を完了することが必要である。
For example, it is possible to directly sprinkle sugar powder such as glucose while physically crushing the three-dimensional crosslinked body and leave it for a long time to dissolve the three-dimensional crosslinked body. However, there is an adverse effect of exposing biological components such as cells and tissues to high-concentration sugar solutions. Cell atrophy was observed outside the cell. Moreover, it is possible to dissolve a three-dimensional crosslinked body by adding an aqueous solution of sugars such as glucose and stirring for a long time. However, when biological components such as cells and tissues are encapsulated in the three-dimensional cross-linked body, stirring for a long time has an adverse effect on biological components such as cells and tissues that are the contents of the components, so it is as short as possible. It is necessary to complete the dissolution of the three-dimensional structure.
本発明の目的は、生体成分を三次元架橋体であるハイドロゲル内に包括固定化させたものを、保存、輸送後に容易に三次元架橋体を溶解せしめ内容物の生体成分を回収するための方法を提供することである。 An object of the present invention is to recover a biological component of a content by easily dissolving a three-dimensional cross-linked body after storage and transportation of a bio-component that is comprehensively immobilized in a hydrogel that is a three-dimensional cross-linked body. Is to provide a method.
本発明は以下の通りである。
（１）生体成分を固定化した三次元架橋体の溶解方法であって、前記三次元架橋体が水溶性ポリマー溶液と水溶性化合物溶液とを混合して形成させたものであり、複数の水酸基を含有する化合物を含む溶解用溶液と接触させて溶解させることを特徴とする三次元架橋体の溶解方法。
（２）前記水溶性ポリマー及び前記水溶性化合物が水酸基を有し、水酸基同士の結合による可逆的共有結合の生成により三次元架橋体を形成するものである（１）記載の三次元架橋体の溶解方法。
（３）前記水溶性ポリマーがホスホリルコリン基及びフェニルボロン酸基を含有するポリマーであり、前記水溶性化合物が多価水酸基を有する化合物である（２）記載の三次元架橋体の溶解方法。
（４）前記多価水酸基を有する化合物が単糖類、二糖類、多糖類、低分子多価アルコール、及びポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも一つである（３）記載の三次元架橋体の溶解方法。
（５）前記複数の水酸基を含有する化合物が、糖アルコールである（４）記載の三次元架橋体の溶解方法。
（６）前記糖アルコールが、キシリトール、マンニトール、又はマルチトールである（５）記載の三次元架橋体の溶解方法。
（７）前記生体成分が、細胞、細胞により構築した細胞三次元組織体、生殖細胞、遺伝子改変細胞、及び生体由来の組織から選ばれる少なくとも一つである（１）〜（６）いずれか記載の三次元架橋体の溶解方法。
The present invention is as follows.
(1) A method for dissolving a three-dimensional crosslinked body in which a biological component is immobilized, wherein the three-dimensional crosslinked body is formed by mixing a water-soluble polymer solution and a water-soluble compound solution, and a plurality of hydroxyl groups A method for dissolving a three-dimensional cross-linked product, wherein the solution is dissolved by bringing it into contact with a dissolving solution containing a compound containing.
(2) The three-dimensional crosslinked product according to (1), wherein the water-soluble polymer and the water-soluble compound have a hydroxyl group, and a three-dimensional crosslinked product is formed by generating a reversible covalent bond by bonding between hydroxyl groups. Dissolution method.
(3) The method for dissolving a three-dimensional crosslinked product according to (2), wherein the water-soluble polymer is a polymer containing a phosphorylcholine group and a phenylboronic acid group, and the water-soluble compound is a compound having a polyvalent hydroxyl group.
(4) The method for dissolving a three-dimensional crosslinked product according to (3), wherein the compound having a polyvalent hydroxyl group is at least one selected from monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, low-molecular polyhydric alcohols, and polyvinyl alcohol.
(5) The method for dissolving a three-dimensional crosslinked product according to (4), wherein the compound containing a plurality of hydroxyl groups is a sugar alcohol.
(6) The method for dissolving a three-dimensional crosslinked product according to (5), wherein the sugar alcohol is xylitol, mannitol, or maltitol.
(7) Any one of (1) to (6), wherein the biological component is at least one selected from a cell, a cell three-dimensional tissue constructed by the cell, a germ cell, a genetically modified cell, and a biological tissue. Method for dissolving the three-dimensional cross-linked product.
本発明の三次元架橋体の溶解方法に従えば、三次元架橋体内に細胞等の生体成分を固定化し保存した後に、容易に三次元構造体を溶解することができ、細胞等の生体成分を短時間で回収することが可能である。これにより従来凍結保存が不可能であった細胞群も安定して保存することが可能となる。更に、凍結することなく常温付近で固定化された生体成分は高い活性を維持できるため、バイオ産業や再生医療における細胞、組織等の保存に有効に利用できる。 According to the method for dissolving a three-dimensional crosslinked body of the present invention, a biological component such as a cell is fixed and stored in the three-dimensional crosslinked body, and then the three-dimensional structure can be easily dissolved. It can be recovered in a short time. This makes it possible to stably store a cell group that could not be cryopreserved in the past. Furthermore, since biological components immobilized at around normal temperature without freezing can maintain high activity, they can be effectively used for storage of cells, tissues, etc. in the bio industry and regenerative medicine.
本発明は、生体成分を固定化した三次元架橋体の溶解方法であって、三次元架橋体が水溶性ポリマー溶液と水溶性化合物溶液とを混合して形成させたものであり、複数の水酸基を含有する化合物を含む溶解用溶液と接触させて溶解させることを特徴とする三次元架橋体の溶解方法である。 The present invention is a method for dissolving a three-dimensional crosslinked body in which a biological component is immobilized, wherein the three-dimensional crosslinked body is formed by mixing a water-soluble polymer solution and a water-soluble compound solution. It is a method for dissolving a three-dimensional crosslinked product, wherein the solution is dissolved by bringing it into contact with a dissolving solution containing a compound containing.
本発明に使用する水溶性ポリマーは、ホスホリルコリン基及びフェニルボロン酸基を含有するポリマーであることが好ましい。
ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を含有するポリマーは、ホスホリルコリン基を含有するモノマーと、フェニルボロン酸基を有するモノマーを液状で混合し、ラジカル発生剤の存在下でラジカル重合反応させることにより製造することができる。更に、ゲル化させた際の容器基材への結合性を該ポリマーに付与する目的等のため、必要ならば他のモノマーを加えて多元共重合体とすることも可能である。
The water-soluble polymer used in the present invention is preferably a polymer containing a phosphorylcholine group and a phenylboronic acid group.
A polymer containing a phosphorylcholine group and a phenylboronic acid group should be produced by mixing a monomer containing a phosphorylcholine group and a monomer having a phenylboronic acid group in a liquid state and subjecting it to a radical polymerization reaction in the presence of a radical generator. Can do. Further, for the purpose of imparting the polymer with binding properties to the container base material when gelled, it is possible to add other monomers if necessary to form a multi-component copolymer.
ホスホリルコリン基を含有するモノマーとしては、ビニル基やアリル基などの炭素−炭素二重結合を重合性基として有し、かつホスホリルコリン基を同一分子中に有する化合物であることが好ましい。
例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、（２−メタクリロイルオキシルエチル−２’−（トリメリチルアンモニア）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート等が挙げられるが、特に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が好ましい。
The monomer containing a phosphorylcholine group is preferably a compound having a carbon-carbon double bond such as a vinyl group or an allyl group as a polymerizable group and having a phosphorylcholine group in the same molecule.
For example, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, (2-methacryloyloxylethyl-2 ′-(trimerityl ammonia) ethyl phosphate, 2- (meth) acryloyloxyethyl-2 ′-(trimethylammonio) ethyl phosphate, and the like can be given. However, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) is particularly preferable.
フェニルボロン酸基を有するモノマーとしては、ビニル基やアリル基などの炭素−炭素二重結合を重合性基として有し、かつホフェニルボロン酸基を同一分子中に有する化合物であることが好ましい。
例えば、ｐ−ビニルフェニルボロン酸、ｍ−ビニルフェニルボロン酸、ｐ−（メタ）アクリロイルオキシルフェニルボロン酸、ｍ−（メタ）アクリロイルオキシフェニルボロン酸、ｐ−（メタ）アクリルアミドフェニルボロン酸、ｐ−ビニルオキシフェニルボロン酸、ｍ−ビニルオキシフェニルボロン酸、ビニルウレタンフェニルボロン酸などが挙げられるが、ｐ−ビニルフェニルボロン酸又はｍ−ビニルフェニルボロン酸が好ましい。
The monomer having a phenylboronic acid group is preferably a compound having a carbon-carbon double bond such as a vinyl group or an allyl group as a polymerizable group and having a phophenylboronic acid group in the same molecule.
For example, p-vinylphenylboronic acid, m-vinylphenylboronic acid, p- (meth) acryloyloxylphenylboronic acid, m- (meth) acryloyloxyphenylboronic acid, p- (meth) acrylamidophenylboronic acid, p- Examples thereof include vinyloxyphenyl boronic acid, m-vinyloxyphenyl boronic acid, vinyl urethane phenyl boronic acid, and p-vinyl phenyl boronic acid or m-vinyl phenyl boronic acid is preferable.
他のモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸ナトリウム、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリロニトリル、（メタ）アクリルアミド、ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の親水性モノマー、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、スチレン、酢酸ビニル等の疎水性モノマー、（３−メタクリロイルオキシプロピル）トリメトキシシラン等のアルキルオキシシラン基を有するモノマー、シロキサン基を有するモノマー、グリシジルメタクリレート等のグリシジル基を含むモノマー、アリルアミン、アミノエチル（メタ）アクリレート等のアミノ基を有するモノマー、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基、チオール基、ハロゲン基、メトキシ基、エポキシ基、スクシンイミド基、マレイミド基を有するモノマーを挙げることができる。 Examples of other monomers include (meth) acrylic acid, sodium (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerol (meth) acrylate, N-vinylpyrrolidone, acrylonitrile, (meth) acrylamide, and vinylbenzene. Hydrophilic monomers such as sodium sulfonate, hydrophobic monomers such as methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, lauryl (meth) acrylate, dodecyl (meth) acrylate, styrene, vinyl acetate, ( 3-methacryloyloxypropyl) monomers having an alkyloxysilane group such as trimethoxysilane, monomers having a siloxane group, monomers having a glycidyl group such as glycidyl methacrylate, allylamine, aminoethyl (Meth) A monomer having an amino group such as acrylate, a carboxyl group, a hydroxyl group, an aldehyde group, a thiol group, a halogen group, a methoxy group, an epoxy group, succinimide group, and a monomer having a maleimide group.
前記の内、特に好ましいモノマーの組み合わせは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下ＭＰＣと略す）、ｐ−ビニルフェニルボロン酸、及びブチル（メタ）アクリレートによる３元共重合体である。
ラジカル発生剤としては、アゾビスイソブチロニトリル、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）等の脂肪族アゾ化合物、過酸化ベンゾイルやこはく酸パーオキシド等の過酸化物が好ましい。
Among these, a particularly preferable monomer combination is a terpolymer of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (hereinafter abbreviated as MPC), p-vinylphenylboronic acid, and butyl (meth) acrylate.
As the radical generator, aliphatic azo compounds such as azobisisobutyronitrile, 4,4′-azobis (4-cyanopentanoic acid), and peroxides such as benzoyl peroxide and succinic acid peroxide are preferable.
ポリマー中の組成モル分率は、モノマー混合溶液の組成で制御することができる。ホスホリルコリン基を有するモノマー単位のモル分率の範囲は０．０１〜０．９９であり、好ましくは０．３０〜０．７０の範囲であり、さらに好ましくは０．４５〜０．６０の範囲である。ポリマー中のフェニルボロン基を有するモノマー単位のモル分率の範囲は０．０１〜０．９９であり、好ましくは０．０３〜０．５０の範囲であり、さらに好ましくは０．３０〜０．４０の範囲である。 The composition mole fraction in the polymer can be controlled by the composition of the monomer mixed solution. The range of the molar fraction of the monomer unit having a phosphorylcholine group is 0.01 to 0.99, preferably 0.30 to 0.70, more preferably 0.45 to 0.60. is there. The range of the molar fraction of the monomer unit having a phenylboron group in the polymer is 0.01 to 0.99, preferably 0.03 to 0.50, and more preferably 0.30 to 0.00. A range of 40.
また、該ポリマーの分子量はゲル浸透クロマトグラフィーで測定し、ポリエチレンオキシドを標準物質として換算し、その範囲は、１，０００〜１０，０００，０００であり、好ましくは１０，０００〜１，０００，０００、さらに好ましくは、２０，０００〜３００，０００である。分子量が上限値を超えると、水媒体への溶解性が低下する可能性がある。 The molecular weight of the polymer is measured by gel permeation chromatography, and polyethylene oxide is converted as a standard substance. The range is 1,000 to 10,000,000, preferably 10,000 to 1,000,000. 000, more preferably 20,000 to 300,000. When the molecular weight exceeds the upper limit value, the solubility in an aqueous medium may be reduced.
本発明に使用する水溶性化合物は、多価水酸基を有する化合物であることが好ましい。多価水酸基を有する化合物は水系溶媒に対して溶解し、均一な溶液となることが必要である。例としては、単糖類、二糖類、多糖類、低分子多価アルコール、ポリビニルアルコール等が挙げられるが、多糖類又はポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を選択することが構造の安定した三次元架橋体を構成するために好ましい。 The water-soluble compound used in the present invention is preferably a compound having a polyvalent hydroxyl group. The compound having a polyvalent hydroxyl group needs to be dissolved in an aqueous solvent to form a uniform solution. Examples include monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, low molecular weight polyhydric alcohols, polyvinyl alcohol, etc., but selecting polysaccharides or polyvinyl alcohol (PVA) constitutes a three-dimensional cross-linked body with a stable structure. This is preferable.
ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を含有するポリマーを含む溶液と、多価水酸基化合物を含む溶液を混合することで、三次元架橋体が製造できる。
三次元架橋体中に生体成分を捕捉し安定に保存するためには、溶媒は水系が好ましく、有機溶媒の使用は避けるべきである。また、溶媒のｐＨは７．０〜８．０であることが生理的に問題が生じないために望ましい。
ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するポリマー、及び多価水酸基化合物は水系溶媒に溶ける範囲の濃度で使用可能であるが、０．５〜２０重量％が好ましく、２．５〜１０重量％が更に好ましい。
A three-dimensional crosslinked product can be produced by mixing a solution containing a polymer containing a phosphorylcholine group and a phenylboronic acid group and a solution containing a polyvalent hydroxyl compound.
In order to capture and stably store biological components in the three-dimensional crosslinked body, the solvent is preferably an aqueous solvent and the use of an organic solvent should be avoided. Moreover, it is desirable that the pH of the solvent is 7.0 to 8.0 because no physiological problem occurs.
The polymer containing a phosphorylcholine group and a phenylboronic acid group at the same time, and the polyvalent hydroxyl compound can be used at a concentration in the range of being soluble in an aqueous solvent, preferably 0.5 to 20% by weight, preferably 2.5 to 10% by weight. Is more preferable.
三次元架橋体を形成するための温度は、生体成分を保存することから、０〜３７℃であることが好ましく、４~３７℃であることが更に好ましい。この範囲外の温度では生体成分に障害が生じる恐れがある。
水溶性ポリマー溶液に予め生体成分を分散して、この分散液に多価水酸基化合物を含む水溶液を混合し、三次元架橋体を形成することによって、生体成分を三次元架橋体内に封入することができる。
逆に多価水酸基化合物を含む水溶液に予め生体成分を分散して、この分散液に対して水溶性ポリマー溶液を混合し、三次元架橋体を形成することもできる。また、例えば培養容器上で培養した細胞の上で、水溶性ポリマー溶液と多価水酸基化合物を含む水溶液を混合して三次元架橋体を構築し、細胞を三次元架橋体内に包埋することもできる。
The temperature for forming the three-dimensional crosslinked body is preferably 0 to 37 ° C. and more preferably 4 to 37 ° C. in order to preserve biological components. If the temperature is outside this range, the biological components may be damaged.
Biocomponents can be encapsulated in a three-dimensional crosslinked body by dispersing a biological component in a water-soluble polymer solution in advance and mixing an aqueous solution containing a polyvalent hydroxyl compound in the dispersion to form a three-dimensional crosslinked body. it can.
Conversely, a biological component can be dispersed in advance in an aqueous solution containing a polyvalent hydroxyl compound, and a water-soluble polymer solution can be mixed with this dispersion to form a three-dimensional crosslinked product. In addition, for example, a three-dimensional crosslinked body may be constructed by mixing a water-soluble polymer solution and an aqueous solution containing a polyvalent hydroxyl compound on cells cultured in a culture vessel, and embedding the cells in the three-dimensional crosslinked body. it can.
上記のように形成された三次元架橋体を溶解させるための方法として、本発明では複数の水酸基を含有する化合物を含む溶解用溶液と接触する。
三次元架橋体がホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を含有するポリマーを含む溶液と、多価水酸基化合物を含む溶液から得られるものである場合、溶解用の複数の水酸基を含有する化合物としては、糖アルコールが好ましい。
糖アルコールは糖を還元した構造を有するものであり、グリセリン、エリトリトール、キシリトール、マンニトール、ラクチトール、ソルビトール、マルチトール等が挙げられるが、キシリトール、マンニトール、又はマルチトールが好ましい。
As a method for dissolving the three-dimensional crosslinked body formed as described above, in the present invention, a contact is made with a dissolving solution containing a compound containing a plurality of hydroxyl groups.
When the three-dimensional cross-linked product is obtained from a solution containing a polymer containing a phosphorylcholine group and a phenylboronic acid group and a solution containing a polyvalent hydroxyl group compound, Alcohol is preferred.
Sugar alcohol has a structure obtained by reducing sugar, and includes glycerin, erythritol, xylitol, mannitol, lactitol, sorbitol, maltitol, and the like, xylitol, mannitol, or maltitol is preferred.
糖を用いた場合、例えば、４０〜８０ｗ／ｖ％濃度のグルコース水溶液、４０〜６０ｗ／ｖ％濃度のガラクトース溶液を三次元構造体の容量に対して４〜１０倍量加え、攪拌することで７〜１４日で三次元構造体を溶解することが可能である。また、この操作は５０℃のオーブン内で行うことにより時間を半分にすることが可能である。しかしながら、細胞や組織などの生体成分を三次元架橋体内に封入している場合においては、長時間にわたる加熱や攪拌は、その内容物たる細胞や組織などの生体成分にとって悪影響を及ぼす。例えば、３７℃以上の加熱は、細胞や組織の熱ストレスによる破壊をもたらし本来の正常な機能を発揮できなくなる。また、攪拌により細胞にずり応力を与え続けることは、多くの細胞にとって好ましい環境ではなく、加熱、攪拌操作はできる限り避けるべきである。
糖アルコールの溶液を使用した場合は、３７℃以下の条件において短時間で三次元架橋体を溶解が可能である。
When sugar is used, for example, an aqueous glucose solution having a concentration of 40 to 80 w / v% and a galactose solution having a concentration of 40 to 60 w / v% are added 4 to 10 times the volume of the three-dimensional structure and stirred. It is possible to dissolve the three-dimensional structure in 7 to 14 days. Further, this operation can be halved by performing it in an oven at 50 ° C. However, when biological components such as cells and tissues are encapsulated in the three-dimensional crosslinked body, heating and stirring for a long time adversely affects biological components such as cells and tissues that are the contents. For example, heating at 37 ° C. or higher results in destruction of cells and tissues due to thermal stress, and the original normal function cannot be exhibited. Further, continuing to apply shear stress to cells by stirring is not a favorable environment for many cells, and heating and stirring operations should be avoided as much as possible.
When a sugar alcohol solution is used, the three-dimensional crosslinked product can be dissolved in a short time under conditions of 37 ° C. or lower.
溶解用溶液の溶媒としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、Ｈａｎｋ‘ｓ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液などの緩衝液、または最低必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｆ１２）、ライボビッツＬ１５培地（Ｌ１５）などの細胞培養液が好ましい。
特に細胞培養液を用いることが特に好ましく、これは三次元架橋体が溶解した後、細胞や組織が培地成分中に存在することでその生体機能の維持に有利であるからである。培地は血清無添加であっても、血清添加の状態でもどちらでも良く、血清添加の場合は１〜２０ｗ／ｖ％の濃度が一般的であり好ましい。また培養液中に１〜１０ｗ／ｖ％の濃度でアルブミンを加えることにより細胞のダメージを緩和することも可能である。
As a solvent for the lysis solution, a buffer solution such as phosphate buffer (PBS), Hank's buffer, Tris buffer, or the minimum essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Ham F12 medium ( Cell culture media such as F12) and Leibovitz L15 medium (L15) are preferred.
In particular, it is particularly preferable to use a cell culture solution because the cells and tissues are present in the medium components after the three-dimensional crosslinked body is dissolved, which is advantageous for maintaining the biological function. The medium may be either serum-free or serum-added, and in the case of serum addition, a concentration of 1 to 20 w / v% is common and preferable. It is also possible to alleviate cell damage by adding albumin at a concentration of 1 to 10 w / v% in the culture solution.
溶解用溶液中の複数の水酸基を含有する化合物の濃度は、高濃度であることが短時間で三次元架橋体を溶解させるために好ましい。例えば、キシリトール、マルチトールでは４０〜８５ｗ／ｖ％の濃度が好ましく、更に好ましくは６０〜８０ｗ／ｖ％の濃度である。又、マンニトールでは４０〜６５ｗ／ｖ％の濃度が好ましく、更に好ましくは５０〜６０ｗ／ｖ％の濃度である。他の種類の糖アルコールを用いる場合も、その糖が溶解できる最大濃度に近いところでの使用が最も好ましい。 The concentration of the compound containing a plurality of hydroxyl groups in the dissolution solution is preferably a high concentration in order to dissolve the three-dimensional crosslinked body in a short time. For example, in the case of xylitol and maltitol, a concentration of 40 to 85 w / v% is preferable, and a concentration of 60 to 80 w / v% is more preferable. In mannitol, a concentration of 40 to 65 w / v% is preferable, and a concentration of 50 to 60 w / v% is more preferable. Even when other types of sugar alcohols are used, the use at a position close to the maximum concentration at which the sugar can be dissolved is most preferable.
これらの溶解用溶液は作製した後、滅菌することも可能である。特に細胞や、組織を包埋した三次元架橋体を溶解するにあたっては、雑菌等の汚染から細胞、組織を守る必要があるため、滅菌は必須である。滅菌には各種の方法が可能であるが、もっとも好ましくはフィルターを用いた濾過滅菌である。この場合、完全除菌のため０．２２μｍの孔径のものがもっとも好ましい。 These dissolving solutions can be prepared and then sterilized. In particular, when lysing a three-dimensional crosslinked body in which cells or tissues are embedded, sterilization is essential because it is necessary to protect the cells and tissues from contamination with various bacteria. Although various methods are possible for sterilization, filtration sterilization using a filter is most preferable. In this case, a 0.22 μm pore diameter is most preferable for complete sterilization.
溶解用溶液の添加量に関しては条件にもよるので特に定めるものではないが、三次元架橋体の容量の当倍量から５倍量を用いることが好ましく、より好ましく３〜５倍量である。この分量を用いた場合、５〜３０分で三次元架橋体を完全に溶解することが可能である。 The amount of dissolution solution added is not particularly defined because it depends on the conditions, but it is preferably from 5 to 5 times, more preferably 3 to 5 times the volume of the three-dimensional crosslinked body. When this amount is used, the three-dimensional crosslinked product can be completely dissolved in 5 to 30 minutes.
三次元架橋体を溶解させるためには、三次元架橋体に溶解用溶液を添加して接触させ、ピペッティング等の操作により短時間攪拌することが好ましい。 In order to dissolve the three-dimensional crosslinked body, it is preferable to add a solution for dissolution to the three-dimensional crosslinked body and bring them into contact with each other and stir for a short time by an operation such as pipetting.
《実施例１》
（１）ポリマーの作製
ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸を同時に含有するポリマーの合成を以下の方法で行った。
フラスコに２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）５．３ｇを秤量し、エタノール３０ｇを仕込み、攪拌しながら容器内をアルゴンガス置換した。ｐ−ビニルフェニルボロン酸（ＶＰＢＡ）０．４４ｇ、ブチル（メタ）アクリレート（ＢＭＡ）１．３ｇおよび２,２’−アゾビスイソブチロニトリル０．０５ｇを添加し、均一なるように攪拌、密栓した後、６０℃に加温、４８時間反応させた。得られた反応溶液をジエチルエーテル／クロロホルム（８／２）溶液に滴下し固体ポリマーを得た。ポリマーのＮＭＲ分析の結果、ＭＰＣ／ＶＰＢＡ／ＢＭＡ＝５３／１１／３６（モル比）であった。また分子量は、２７，０００であった。本共重合体をＰＭＢＶと略す。
多価水酸基化合物は、市販のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）平均重合度５００（和光純薬製、１６０−０３０５５）を用いた。
ＰＶＡを加温した超純水に溶かして１０ｗｔ％溶液を作製した。これを０．２μｍの滅菌済み濾過フィルター（東洋紡製、ADVANTEC３９１２２１２、）を通して濾過滅菌した。ＰＭＢＶをウシ胎児血清（インビトロジェン社製、１００９９−１４１）１０％含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン社製、１１８８５−０８４）で溶解し、５ｗｔ％溶液を作製し、同じく濾過滅菌した。
（２）細胞培養
市販のゼラチンコート３５ｍｍ径シャーレ（住友ベークライト製、ＭＳ−００３５Ｇ）に市販凍結フィーダー細胞（リプロセル製、ＲＣＨＥＦＣ００１）を３７℃の温浴で急速解凍した後、１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地で洗浄した後、１×１０5細胞／ｍＬに調整した後、細胞分散液を１ｍＬ分注し３７℃炭酸ガス培養機で２４時間培養した。
市販マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞）（ＤＳファーマバイオメディカル製、Ｒ−ＰＭＥＦ−Ｎ）の凍結バイアルを３７℃の温浴で急速解凍した後、市販のＥＳ細胞用調整済み培地（ＤＳファーマバイオメディカル製、Ｒ−ＥＳ−１０１）で５×１０5細胞／ｍＬに調整した後、先に培養しているフィーダー細胞上に播種し、３７℃炭酸ガス培養機で毎日培地交換しながら５日間培養した。
培養したマウスＥＳ細胞の培地を除去し５ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で洗浄した後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液０．５ｍＬ添加して、３０秒静置、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を除去。さらに２分間静置して細胞の剥離を確認後、培地５ｍＬに分散させ回収した。
回収したＥＳ細胞をトリパンブルーで染色して細胞数を計測し、ＰＭＢＶ溶液に１×１０5細胞／ｍＬになるように分散させた。
（３）細胞保存
１５ｍＬ遠沈管に、０．５ｍＬの１０ｗｔ％ＰＶＡ溶液を０．５ｍＬ分注し、さらにその上から細胞分散させたＰＭＢＶ溶液を０．５ｍＬ分注し、直ちに混合して３７℃炭酸ガス培養機内で保存した。ゲル化は混合後直ちに発生し、３０分間の静置で完全にゲル化した。ゲル内にＥＳ細胞が保持されていることは光学顕微鏡観察により確認した。
（４）ゲル溶解、細胞の回収、再培養
キシリトール（東京化成製、Ｘ００１８）をライボビッツＬ−１５倍地（インビトロジェン社製、１１４１５−０６４）で８０ｗ／ｖ％に調整した。５日間保存後のゲルに調製したキシリトール溶液を１ｍＬ加えて、３０回ピペッティングしゲルを完全に溶解させた。さらに８ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加えて混合した後、１０００ｒｐｍで１分遠心し、細胞をペレットで回収した。
得られた細胞ペレットに２ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加え、一部を（５０μＬ）をトリパンブルーで染色して生細胞数及び死細胞数を血球計算板にて計測した。残りの細胞分散液は、フィーダー細胞上に播種し培養を開始し、翌日、形態観察を行った。
Example 1
(1) Production of polymer A polymer containing a phosphorylcholine group and phenylboronic acid at the same time was synthesized by the following method.
In a flask, 5.3 g of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) was weighed, charged with 30 g of ethanol, and the inside of the container was purged with argon gas while stirring. Add 0.44 g of p-vinylphenylboronic acid (VPBA), 1.3 g of butyl (meth) acrylate (BMA) and 0.05 g of 2,2′-azobisisobutyronitrile, and stir and seal tightly until uniform Then, the mixture was heated to 60 ° C. and reacted for 48 hours. The obtained reaction solution was added dropwise to a diethyl ether / chloroform (8/2) solution to obtain a solid polymer. As a result of NMR analysis of the polymer, it was MPC / VPBA / BMA = 53/11/36 (molar ratio). The molecular weight was 27,000. This copolymer is abbreviated as PMBV.
As the polyvalent hydroxyl compound, a commercially available polyvinyl alcohol (PVA) average degree of polymerization of 500 (manufactured by Wako Pure Chemicals, 160-03055) was used.
PVA was dissolved in heated ultrapure water to prepare a 10 wt% solution. This was sterilized by filtration through a 0.2 μm sterilized filtration filter (Toyobo, ADVANTEC 3912212). PMBV was dissolved in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, manufactured by Invitrogen, 11885-084) containing 10% fetal bovine serum (Invitrogen, 10099-141) to prepare a 5 wt% solution, which was also sterilized by filtration.
(2) Cell culture A commercially available gelatin-coated 35 mm diameter petri dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., MS-0035G) was rapidly thawed in a 37 ° C. warm bath with commercially available frozen feeder cells (manufactured by Reprocell, RCHEFC001), followed by Dulbecco containing 10% fetal bovine serum. After washing with the modified Eagle medium and adjusting to 1 × 10 5 cells / mL, 1 mL of the cell dispersion was dispensed and cultured in a 37 ° C. carbon dioxide incubator for 24 hours.
A frozen vial of commercially available mouse embryonic stem cells (mouse ES cells) (DS Pharma Biomedical, R-PMEF-N) was rapidly thawed in a 37 ° C. warm bath, and then a commercially available conditioned medium for ES cells (DS Pharma Biomedical) Ltd., was adjusted to 5 × 10 5 cells / mL in R-ES-101), it was seeded on feeder cells in culture before, were cultured for 5 days with medium change every day at 37 ° C. CO incubator .
After removing the cultured mouse ES cell medium and washing with 5 mL of phosphate buffer (PBS (−)), 0.5 mL of trypsin / EDTA solution was added, and left still for 30 seconds to remove the trypsin / EDTA solution. After further standing for 2 minutes and confirming cell detachment, it was dispersed in 5 mL of medium and collected.
The collected ES cells were stained with trypan blue to count the number of cells, and dispersed in a PMBV solution so as to be 1 × 10 5 cells / mL.
(3) Cell preservation 0.5 mL of 0.5 mL of 10 wt% PVA solution is dispensed into a 15 mL centrifuge tube, and 0.5 mL of PMBV solution in which cells are dispersed is further dispensed, and immediately mixed to 37 ° C. Stored in a carbon dioxide incubator. Gelation occurred immediately after mixing and was completely gelled by standing for 30 minutes. It was confirmed by light microscope observation that ES cells were retained in the gel.
(4) Gel lysis, cell recovery, and re-culture Xylitol (Tokyo Kasei Co., Ltd., X0018) was adjusted to 80 w / v% with Leibovitz L-15 medium (Invitrogen, 11415-064). 1 mL of the prepared xylitol solution was added to the gel after storage for 5 days, and pipetting was performed 30 times to completely dissolve the gel. Further, 8 mL of the adjusted medium for ES cells was added and mixed, and then centrifuged at 1000 rpm for 1 minute, and the cells were collected as a pellet.
2 mL of the adjusted medium for ES cells was added to the obtained cell pellet, a part (50 μL) was stained with trypan blue, and the number of viable cells and dead cells were counted with a hemocytometer. The remaining cell dispersion was seeded on feeder cells and started to culture, and the morphology was observed the next day.
《実施例２》
（１）ポリマーの作製は、実施例１に同様に行なった。
（２）細胞培養は、実施例１に同様に行なった。
（３）細胞保存は、実施例１に同様に行なった。
（４）ゲル溶解、細胞の回収、再培養
Ｄ−マンニトール（東京化成製、Ｍ００４４）をライボビッツＬ−１５倍地（インビトロジェン社製、１１４１５−０６４）で６０ｗ／ｖ％に調整した。５日間保存後のゲルに調製したＤ−マンニトール溶液を５ｍＬ加えて、３０回ピペッティングしゲルを溶解させた。さらに８ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加えて混合した後、１０００ｒｐｍで１分遠心し、細胞をペレットで回収した。
得られた細胞ペレットに２ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加え、一部を（５０μＬ）をトリパンブルーで染色して生細胞数及び死細胞数を血球計算板にて計測した。残りの細胞分散液は、フィーダー細胞上に播種し培養を開始し、翌日、形態観察を行った。
Example 2
(1) Production of the polymer was carried out in the same manner as in Example 1.
(2) Cell culture was performed in the same manner as in Example 1.
(3) Cell preservation was performed in the same manner as in Example 1.
(4) Gel lysis, cell recovery, and re-culture D-mannitol (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., M0044) was adjusted to 60 w / v% with Leibovitz L-15 medium (manufactured by Invitrogen, 11415-064). 5 mL of the prepared D-mannitol solution was added to the gel after storage for 5 days, and the gel was dissolved by pipetting 30 times. Further, 8 mL of the adjusted medium for ES cells was added and mixed, and then centrifuged at 1000 rpm for 1 minute, and the cells were collected as a pellet.
2 mL of the adjusted medium for ES cells was added to the obtained cell pellet, a part (50 μL) was stained with trypan blue, and the number of viable cells and dead cells were counted with a hemocytometer. The remaining cell dispersion was seeded on feeder cells and started to culture, and the morphology was observed the next day.
《実施例３》
（１）ポリマーの作製は、実施例１に同様に行なった。
（２）細胞培養は、実施例１に同様に行なった。
（３）細胞保存は、実施例１に同様に行なった。
（４）ゲル溶解、細胞の回収、再培養
マルチトール（東京化成製、Ｍ０６０１）をライボビッツＬ−１５倍地（インビトロジェン社製、１１４１５−０６４）で８０ｗ／ｖ％に調整した。５日間保存後のゲルに調製したマルチトール溶液を２．５ｍＬ加えて、３０回ピペッティングしゲルを溶解させた。さらに８ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加えて混合した後、１０００ｒｐｍで１分遠心し、細胞をペレットで回収した。
得られた細胞ペレットに２ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加え、一部を（５０μＬ）をトリパンブルーで染色して生細胞数及び死細胞数を血球計算板にて計測した。残りの細胞分散液は、フィーダー細胞上に播種し培養を開始し、翌日、形態観察を行った。
Example 3
(1) Production of the polymer was carried out in the same manner as in Example 1.
(2) Cell culture was performed in the same manner as in Example 1.
(3) Cell preservation was performed in the same manner as in Example 1.
(4) Gel lysis, cell recovery, and re-culture Maltitol (manufactured by Tokyo Chemical Industry, M0601) was adjusted to 80 w / v% with Leibovitz L-15 medium (manufactured by Invitrogen, 11415-064). 2.5 mL of the prepared maltitol solution was added to the gel after storage for 5 days, and the gel was dissolved by pipetting 30 times. Further, 8 mL of the adjusted medium for ES cells was added and mixed, and then centrifuged at 1000 rpm for 1 minute, and the cells were collected as a pellet.
2 mL of the adjusted medium for ES cells was added to the obtained cell pellet, a part (50 μL) was stained with trypan blue, and the number of viable cells and dead cells were counted with a hemocytometer. The remaining cell dispersion was seeded on feeder cells and started to culture, and the morphology was observed the next day.
《比較例１》
（１）ポリマーの作製は、実施例１に同様に行なった。
（２）細胞培養は、実施例１に同様に行なった。
（３）細胞保存は、実施例１に同様に行なった。
（４）ゲル溶解、細胞の回収、再培養
ガラクトース（和光純薬製、０７５−０００３５）をライボビッツＬ−１５倍地（インビトロジェン社製、１１４１５−０６４）で６０ｗ／ｖ％に調整した。５日間保存後のゲルに調製したガラクトース溶液を１ｍＬ加えて、３０回ピペッティングしゲルを溶解させたが、完全に溶解し切れなかった。さらに８ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加えて混合した後、１０００ｒｐｍで１分遠心し、細胞を溶解し切れなかったゲルの断片と一緒にペレットで回収した。
得られた細胞ペレットに２ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加え、一部を（５０μＬ）をトリパンブルーで染色して生細胞数及び死細胞数を血球計算板にて計測した。残りの細胞分散液は、フィーダー細胞上に播種し培養を開始し、翌日、形態観察を行った。
<< Comparative Example 1 >>
(1) Production of the polymer was carried out in the same manner as in Example 1.
(2) Cell culture was performed in the same manner as in Example 1.
(3) Cell preservation was performed in the same manner as in Example 1.
(4) Gel lysis, cell recovery, and re-culture Galactose (manufactured by Wako Pure Chemicals, 075-00035) was adjusted to 60 w / v% with Leibovitz L-15 medium (manufactured by Invitrogen, 11415-064). 1 mL of the prepared galactose solution was added to the gel after storage for 5 days, and the gel was dissolved by pipetting 30 times, but it was not completely dissolved. Further, 8 mL of the adjusted medium for ES cells was added and mixed, and then centrifuged at 1000 rpm for 1 minute, and the cells were collected in a pellet together with the gel fragments that could not be lysed.
2 mL of the adjusted medium for ES cells was added to the obtained cell pellet, a part (50 μL) was stained with trypan blue, and the number of viable cells and dead cells were counted with a hemocytometer. The remaining cell dispersion was seeded on feeder cells and started to culture, and the morphology was observed the next day.
《比較例２》
（１）ポリマーの作製は、実施例１に同様に行なった。
（２）細胞培養は、実施例１に同様に行なった。
（３）細胞保存は、実施例１に同様に行なった。
（４）ゲル溶解、細胞の回収、再培養
グルコース（和光純薬製、５９５−０４６６１）をライボビッツＬ−１５倍地（インビトロジェン社製、１１４１５−０６４）で６０ｗ／ｖ％に調整した。５日間保存後のゲルに調製したグルコース溶液を１ｍＬ加えて、３０回ピペッティングしゲルを溶解させたが、完全に溶解し切れなかった。さらに８ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加えて今後した後、１０００ｒｐｍで１分遠心し、細胞を溶解し切れなかったゲルの断片と一緒にペレットで回収した。
得られた細胞ペレットに２ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加え、一部を（５０μＬ）をトリパンブルーで染色して生細胞数及び死細胞数を血球計算板にて計測した。残りの細胞分散液は、フィーダー細胞上に播種し培養を開始し、翌日、形態観察を行った。
<< Comparative Example 2 >>
(1) Production of the polymer was carried out in the same manner as in Example 1.
(2) Cell culture was performed in the same manner as in Example 1.
(3) Cell preservation was performed in the same manner as in Example 1.
(4) Gel lysis, cell recovery, and re-culture Glucose (manufactured by Wako Pure Chemicals, 595-04661) was adjusted to 60 w / v% with Leibovitz L-15 medium (manufactured by Invitrogen, 11415-064). 1 mL of the prepared glucose solution was added to the gel after storage for 5 days, and the gel was dissolved by pipetting 30 times, but it was not completely dissolved. After further adding 8 mL of conditioned medium for ES cells, the mixture was centrifuged at 1000 rpm for 1 minute, and the cells were collected in a pellet together with the gel fragments that could not be completely lysed.
2 mL of the adjusted medium for ES cells was added to the obtained cell pellet, a part (50 μL) was stained with trypan blue, and the number of viable cells and dead cells were counted with a hemocytometer. The remaining cell dispersion was seeded on feeder cells and started to culture, and the morphology was observed the next day.
《比較例３》
一般的な細胞凍結保存を比較例とした。
（１）細胞凍結保存液の調整
ＥＳ細胞用調整済み培地に対して１０ｖ／ｖ％になるようにジメチルスルホキシドを加えて凍結保存液を調製した。具体的には９ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地に対して１ｍＬのジメチルスルホキシドを加えてよく混合した物を準備した。
（２）細胞培養
市販のゼラチンコート３５ｍｍ径シャーレ（住友ベークライト製、ＭＳ−００３５Ｇ）に市販凍結フィーダー細胞（リプロセル製、ＲＣＨＥＦＣ００１）を３７℃の温浴で急速解凍した後、１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地で洗浄した後、１×１０5細胞／ｍＬに調整した後、細胞分散液を１ｍＬ分注し３７℃炭酸ガス培養機で２４時間培養した。
市販マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞）（ＤＳファーマバイオメディカル製、Ｒ−ＰＭＥＦ−Ｎ）の凍結バイアルを３７℃の温浴で急速解凍した後、市販のＥＳ細胞用調整済み培地（ＤＳファーマバイオメディカル製、Ｒ−ＥＳ−１０１）で５×１０5細胞／ｍＬに調整した後、先に培養しているフィーダー細胞上に播種し、３７℃炭酸ガス培養機で毎日培地交換しながら５日間培養した。
培養したマウスＥＳ細胞の培地を除去し５ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で洗浄した後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液０．５ｍＬ添加して、３０秒静置、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を除去。さらに２分間静置して細胞の剥離を確認後、培地５ｍＬに分散させ回収した。
回収したＥＳ細胞をトリパンブルーで染色して細胞数を計測し、細胞凍結保存液に１×１０5細胞／ｍＬになるように分散させた。
１ｍＬの細胞分散液を凍結保存用チューブ（住友ベークライト製、ＭＳ−４６０１）に入れ、最初４℃の冷蔵庫で２０分、−２０℃の冷凍庫で２時間、−８０℃の冷凍庫に一晩入れて凍結させ、その後液体窒素中で保管した。
（３）解凍、細胞の回収、再培養
液体窒素中に５日間保管した凍結保存チューブの細胞を取り出し、３７℃の温浴で急速解凍した。細胞溶液をあらかじめ９ｍＬの培地を入れた１５ｍＬの遠沈管に移してよく混合し、１０００ｒｐｍで１分遠心し、細胞をペレットで回収した。
得られた細胞ペレットに２ｍＬのＥＳ細胞用調整済み培地を加え、一部を（５０μＬ）をトリパンブルーで染色して生細胞数及び死細胞数を血球計算板にて計測した。残りの細胞分散液は、フィーダー細胞上に播種し培養を開始し、翌日、形態観察を行った。
<< Comparative Example 3 >>
General cell cryopreservation was used as a comparative example.
(1) Preparation of cell cryopreservation solution A cryopreservation solution was prepared by adding dimethyl sulfoxide so as to be 10 v / v% with respect to the adjusted medium for ES cells. Specifically, 1 mL of dimethyl sulfoxide was added to 9 mL of conditioned medium for ES cells and mixed well.
(2) Cell culture A commercially available gelatin-coated 35 mm diameter petri dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., MS-0035G) was rapidly thawed in a 37 ° C. warm bath with commercially available frozen feeder cells (manufactured by Reprocell, RCHEFC001), followed by Dulbecco containing 10% fetal bovine serum. After washing with the modified Eagle medium and adjusting to 1 × 10 5 cells / mL, 1 mL of the cell dispersion was dispensed and cultured in a 37 ° C. carbon dioxide incubator for 24 hours.
A frozen vial of commercially available mouse embryonic stem cells (mouse ES cells) (DS Pharma Biomedical, R-PMEF-N) was rapidly thawed in a 37 ° C. warm bath, and then a commercially available conditioned medium for ES cells (DS Pharma Biomedical) Ltd., was adjusted to 5 × 10 5 cells / mL in R-ES-101), it was seeded on feeder cells in culture before, were cultured for 5 days with medium change every day at 37 ° C. CO incubator .
After removing the cultured mouse ES cell medium and washing with 5 mL of phosphate buffer (PBS (−)), 0.5 mL of trypsin / EDTA solution was added, and left still for 30 seconds to remove the trypsin / EDTA solution. After further standing for 2 minutes and confirming cell detachment, it was dispersed in 5 mL of medium and collected.
The collected ES cells were stained with trypan blue to count the number of cells, and dispersed in a cell cryopreservation solution at 1 × 10 5 cells / mL.
Place 1 mL of the cell dispersion in a cryopreservation tube (MS-4601, manufactured by Sumitomo Bakelite), first 20 minutes in a refrigerator at 4 ° C, 2 hours in a freezer at -20 ° C, and overnight in a freezer at -80 ° C. Frozen and then stored in liquid nitrogen.
(3) Thawing, cell recovery, and re-culture The cells in a cryopreservation tube stored for 5 days in liquid nitrogen were taken out and rapidly thawed in a 37 ° C. warm bath. The cell solution was transferred to a 15 mL centrifuge tube containing 9 mL of medium in advance, mixed well, centrifuged at 1000 rpm for 1 minute, and the cells were collected as a pellet.
2 mL of the adjusted medium for ES cells was added to the obtained cell pellet, a part (50 μL) was stained with trypan blue, and the number of viable cells and dead cells were counted with a hemocytometer. The remaining cell dispersion was seeded on feeder cells and started to culture, and the morphology was observed the next day.
実施例、比較例の結果を表1に示す。細胞回収率は、ゲルが完全に溶解した実施例１，２，３において９５％以上と高くなった。また、凍結保存においても完全に溶解できるので細胞の回収率は９５％と高い値になった。一方、ゲルが完全に溶け切らなかった比較例１，２では、ゲルの破片に細胞がトラップされて回収率が著しく低い値となった。
生存率は、比較例３以外は生存率７０％以上であった。比較例３では凍結保存しているので凍結溶解時の細胞ダメージが大きく生存率が悪くなったと考えられる。
細胞回収率と生存率を掛け合わせた、保存開始時の細胞に対し、回収できた生細胞数を求めた最終細胞生存率は、ゲルに保存し本発明に従って溶解した実施例１，２，３において７５％以上の高い生存率を示した。
The results of Examples and Comparative Examples are shown in Table 1. The cell recovery rate was as high as 95% or more in Examples 1, 2, and 3 where the gel was completely dissolved. In addition, since the cells could be completely lysed even in cryopreservation, the cell recovery rate was as high as 95%. On the other hand, in Comparative Examples 1 and 2 in which the gel was not completely dissolved, the cells were trapped in the gel fragments, and the recovery rate was extremely low.
The survival rate was 70% or more except in Comparative Example 3. In Comparative Example 3, since it was stored frozen, the cell damage during freezing and thawing was large, and it was considered that the survival rate deteriorated.
The final cell viability obtained by multiplying the cell recovery rate and the survival rate, and determining the number of viable cells recovered from the cells at the start of storage, was stored in a gel and lysed according to the present invention. Showed a high survival rate of 75% or more.
また翌日以降の細胞形態は、ＥＳ細胞に特徴的な細胞コロニーが観察された。これによって保存回収された細胞が、保存前と同等のＥＳ細胞特有の形態を示し細胞として安定していることを確認した。 In addition, cell colonies characteristic of ES cells were observed after the next day. As a result, it was confirmed that the cells collected and recovered showed stable morphology as cells that exhibited the same morphology of ES cells as that before storage.
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2008
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