JP2009281831A - Fluorescence analyzer and analysis method - Google Patents

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Hamamatsu Photonics Kk
浜松ホトニクス株式会社
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a fluorescence analyzer and an analysis method capable of executing properly fluorescence analysis of a sample. <P>SOLUTION: This analyzer 1A is constituted of: an excitation light source 22 for irradiating excitation light to a measuring domain of the sample S; a beam splitter 30 for branching fluorescence from a fluorescence probe in the measuring domain; first and second photodetectors 31, 32 for detecting branched fluorescence components respectively; a photon counting part 35 for counting in time series, the number of photons detected respectively by the photodetectors 31, 32, and acquiring first and second measurement data F<SB>A</SB>(t), F<SB>B</SB>(t); and a measuring control part 50 including an analysis data generation part 51 and a measurement result analysis part 52. The generation part 51 generates photon number analysis data n<SB>AB</SB>(t) wherein, in the case of F<SB>A</SB>×F<SB>B</SB>=0, n<SB>AB</SB>=0, and in the case of F<SB>A</SB>×F<SB>B</SB>>0, n<SB>AB</SB>=f(F<SB>A</SB>, F<SB>B</SB>) in terms of a prescribed function f, and the analysis part 52 performs fluorescence analysis relative to the analysis data. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、測定試料中の蛍光プローブから発生する蛍光を検出して、測定試料についての解析を行う蛍光解析装置、及び蛍光解析方法に関するものである。 The present invention detects the fluorescence emitted from the fluorescent probe in the measurement sample, the fluorescence analyzer for analyzing the measurement sample, and to a fluorescence analysis method.

蛍光相関分光法(FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy)は、極低濃度の蛍光物質が存在する測定試料溶液中の微小領域に励起光を照射して測定領域とし、測定領域内で発生した蛍光の強度を時系列的に測定して自己相関関数を求めることで、試料中での蛍光物質の並進拡散運動等の情報を得るものである(例えば特許文献1〜3参照)。 Fluorescence correlation spectroscopy (FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy) is irradiated with excitation light to micro-region of the measurement sample solution extremely low concentration of the fluorescent substance is present as the measurement region, the intensity of fluorescence generated in the measurement region time series measured and by obtaining the autocorrelation function, and obtains information of the translational diffusion motion or the like of the fluorescent substance in the sample (for example, see Patent documents 1 to 3). このような蛍光解析法は、例えば臨床診断における免疫分析に適用可能である。 Such fluorescence analysis method is applicable to immunoassay for example in clinical diagnosis.
特開2007−20565号公報 JP 2007-20565 JP 特開2007−316017号公報 JP 2007-316017 JP 特開2006−17628号公報 JP 2006-17628 JP

上記した蛍光解析では、蛍光物質によって標識された分子プローブ(蛍光プローブ)を測定試料に加え、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を検出するとともに、その自己相関関数から並進拡散運動等についての情報を取得する。 The fluorescence analysis as described above, adding labeled molecular probe (fluorescent probe) to measure the sample by the fluorescent substance, detects the fluorescence from the fluorescent probe in the measurement region, for the translational diffusion motion etc. from the autocorrelation function to get the information. これにより、分析対象となる試料中の標的分子と、蛍光プローブとの反応量を知ることができ、測定試料についての情報を取得することができる。 Thus, the target molecule in the sample to be analyzed, it is possible to know the amount of reaction with the fluorescent probe, the information about the measurement sample can be acquired. このような試料解析方法は、ホモジニアス・アッセイにおける非分離型の計測方法であるため、ELISA法などのヘテロジニアス・アッセイに比べて、消耗品類の消費を少なくしてランニングコストを低減することが可能である。 Such sample analyzing method are the non-separated type of measuring method in homogeneous assay, as compared to heterogeneous assays such as an ELISA method, can be reduced, the running cost by reducing the consumption of consumables it is. また、解析装置の小型化、低価格化も可能である。 Further, miniaturization of the analysis device, a cost reduction is also possible.

一方、FCSなどの手法を用いた蛍光解析において、その測定感度や効率等のさらなる向上が求められている。 On the other hand, in the fluorescence analysis using techniques such as FCS, it has been demanded a further improvement of such measurement sensitivity and efficiency. そのような方法の1つとして、標的分子に対して複数個の蛍光プローブを凝集するように結合させ、それらの蛍光プローブからの蛍光を検出する蛍光解析方法が提案されている(例えば特許文献1、2参照)。 One such method, is bound to aggregate the plurality of fluorescent probes to the target molecule, the fluorescence analysis method for detecting fluorescence from their fluorescence probes has been proposed (e.g. Patent Document 1 , reference 2). しかしながら、このような方法では、複数個の蛍光プローブが結合した標的分子からの蛍光検出イベントと、それ以外のノイズイベントとの識別が難しいという問題がある。 However, in such a method, there is a fluorescence detection event, a problem that is difficult to distinguish from other noise events from the target molecule in which a plurality of fluorescent probes are bound.

本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を測定することによる測定試料の蛍光解析を好適に実行することが可能な蛍光解析装置、及び蛍光解析方法を提供することを目的とする。 The present invention, above problems has been made to solve the fluorescent suitably fluorescence analysis that can be performed fluorescence analysis of a measurement sample by measuring from the fluorescent probe in the measurement region device, and an object of the invention to provide a fluorescence analysis method.

このような目的を達成するために、本発明による蛍光解析装置は、(1)測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射手段と、(2)励起光照射手段によって励起光が照射された測定試料の測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を2つの蛍光成分に分岐する光分岐手段と、(3)分岐された一方の第1蛍光成分を検出する第1蛍光検出手段と、(4)分岐された他方の第2蛍光成分を検出する第2蛍光検出手段と、(5)第1蛍光検出手段及び第2蛍光検出手段でそれぞれ検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数して、第1光子数測定データF (t)及び第2光子数測定データF (t)を取得する光子計数手段と、(6)第1光子数測定データF (t)及び第2光子数測定データ To achieve the above object, the fluorescence analysis apparatus according to the present invention, (1) and the excitation light irradiating means for irradiating excitation light to the measurement area set for the sample, (2) the excitation light emitting means an optical branching means for branching the fluorescence emitted from the fluorescent probe in the measurement region of the measurement sample which excitation light is irradiated to the two fluorescent components by first detecting the (3) one of the branched first fluorescent component 1 and fluorescence detection means, (4) a second fluorescence detecting means for detecting a second fluorescence component of the other branched, the number of photons detected respectively (5) first fluorescence detecting means and the second fluorescence detecting means and counted in a time series at a predetermined count time width, and photon counting means for obtaining a first photon number measuring data F a (t) and the second photon number measurement data F B (t), (6 ) first number of photons measured data F A (t) and the second photon number measurement data (t)に基づいて、測定データF (t)、F (t)の少なくとも一方が0の場合に n AB (t)=0 Based on the B (t), the measured data F A (t), n AB (t) = 0 in the case of at least one of 0 F B (t)
となり、測定データF (t)、F (t)の両者が0でない場合に所定の関数fで n AB (t)=f(F (t)、F (t)) Next, the measurement data F A (t), n in F B (t) If they are not 0 to a predetermined function f AB (t) = f (F A (t), F B (t))
となる光子数解析データn AB (t)を生成する解析データ生成手段と、(7)解析データ生成手段によって生成された光子数解析データn AB (t)に対し、蛍光プローブを含む測定試料の測定結果についての蛍光解析を行う測定結果解析手段とを備えることを特徴とする。 An analysis data generation means for generating a composed photon number analysis data n AB (t), (7 ) to analyze the number of photons analysis generated by the data generating means data n AB (t), the measurement sample containing a fluorescent probe characterized in that it comprises a measurement result analyzing means for performing fluorescence analysis of the measurement results.

また、本発明による蛍光解析方法は、(1)測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射ステップと、(2)励起光照射ステップで励起光が照射された測定試料の測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を2つの蛍光成分に分岐する光分岐ステップと、(3)分岐された一方の第1蛍光成分を検出する第1蛍光検出ステップと、(4)分岐された他方の第2蛍光成分を検出する第2蛍光検出ステップと、(5)第1蛍光検出ステップ及び第2蛍光検出ステップでそれぞれ検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数して、第1光子数測定データF (t)及び第2光子数測定データF (t)を取得する光子計数ステップと、(6)第1光子数測定データF (t)及び第2光子数測定データ The fluorescent analysis method according to the invention, (1) an excitation light irradiation step of irradiating excitation light to the measurement area set for the measurement sample, the measurement of the excitation light is irradiated by (2) excitation light irradiation step a light branching step of branching the fluorescence emitted from the fluorescent probe in the measurement region of the sample into two fluorescent components, a first fluorescence detection step of detecting a (3) one of the branched first fluorescent component, (4 ) a second fluorescence detection step of detecting the second fluorescent component of the other branched, (5) time series number of photons detected respectively by the first fluorescence detection step and the second fluorescent detecting step at a predetermined counting time width to be counted, and photon counting step of acquiring a first photon number measuring data F a (t) and the second photon number measurement data F B (t), (6 ) a first photon number measurement data F a (t ) and the second photon number measurement data (t)に基づいて、測定データF (t)、F (t)の少なくとも一方が0の場合に n AB (t)=0 Based on the B (t), the measured data F A (t), n AB (t) = 0 in the case of at least one of 0 F B (t)
となり、測定データF (t)、F (t)の両者が0でない場合に所定の関数fで n AB (t)=f(F (t)、F (t)) Next, the measurement data F A (t), n in F B (t) If they are not 0 to a predetermined function f AB (t) = f (F A (t), F B (t))
となる光子数解析データn AB (t)を生成する解析データ生成ステップと、(7)解析データ生成ステップにおいて生成された光子数解析データn AB (t)に対し、蛍光プローブを含む測定試料の測定結果についての蛍光解析を行う測定結果解析ステップとを備えることを特徴とする。 An analysis data generation step of generating photon number analysis data n AB (t) to be a, (7) with respect to the analysis data generation photon number generated in step analysis data n AB (t), the measurement sample containing a fluorescent probe characterized in that it comprises a measurement result analysis step of performing a fluorescence analysis measurement results.

上記した蛍光解析装置、及び蛍光解析方法においては、励起光照射系及び蛍光検出系によって測定試料中に微小な測定領域を設定する。 Fluorescence analyzer as described above, and in the fluorescence analysis method, to set a small measurement region in the measurement sample by the excitation light irradiation system and a fluorescence detection system. また、測定領域内の蛍光プローブで発生する蛍光に対して光分岐手段を設けるとともに、蛍光検出系として第1、第2蛍光検出手段を設置して第1、第2光子数測定データF (t)、F (t)を取得する。 Further, provided with the optical branching unit with respect to the fluorescence emitted by the fluorescent probe in the measurement area, first as a fluorescence detection system, first established a second fluorescence detecting means, the second photon number measuring data F A ( t), to acquire the F B (t). そして、それらの測定データを直接に蛍光解析に用いるのではなく、F (t)・F (t)=0のときに0となる解析データn AB (t)を生成して蛍光解析を行っている。 Then, instead of using directly the fluorescent analyzing those measurement data, the generated fluorescent analyzing 0. The analytical data n AB (t) at the time of F A (t) · F B (t) = 0 Is going.

このような構成では、光子数測定データF (t)、F (t)に代えて光子数解析データn AB (t)を用いることにより、第1、第2蛍光検出手段での蛍光検出の同時性を考慮した形で蛍光解析を実行することができる。 In such a configuration, the number of photons measured data F A (t), by using a photon number analysis data n AB (t) in place of the F B (t), first, fluorescence detection in the second fluorescence detecting means it is possible to perform fluorescence analysis in the form of considering concurrency. これにより、例えば、複数個の蛍光プローブが結合した標的分子からの蛍光検出イベントと、それ以外のノイズイベントとの識別精度を向上するなど、測定試料の蛍光解析の精度を向上することが可能となる。 Thus, for example, a fluorescence detection event from the target molecule in which a plurality of fluorescent probes are bound, such as to improve the identification accuracy of the other noise event, it is possible to improve the accuracy of the fluorescence analysis of a measurement sample Become.

ここで、測定試料に対する蛍光解析に用いられる励起光、蛍光については、励起光は単一波長領域の励起光であり、第1蛍光成分及び第2蛍光成分は同一波長領域の蛍光成分である構成を用いることが可能である。 Here, the excitation light, fluorescence in a fluorescent analysis of the measurement sample, the excitation light is the excitation light of a single wavelength region, the first fluorescent component and the second fluorescent component is a fluorescent component of the same wavelength region structure it is possible to use. このような構成は、測定試料に加える蛍光プローブとして1種類の蛍光プローブのみを用いるとともに、試料に含まれる標的分子に2個以上の同一種類の蛍光プローブが結合する場合の蛍光解析に好適に適用することができる。 Such a configuration is preferably applied to the fluorescence analysis of a case with use of only one kind of fluorescent probe as a fluorescent probe added to the sample, in which two or more identical types of fluorescent probes to a target molecule contained in the sample to bind can do.

光子数測定データから解析データへのデータ変換については、具体的には例えば、解析データ生成において、測定データF (t)、F (t)の両者が0でない場合に、測定データF (t)、F (t)の相乗平均となる関数fで n AB (t)=√(F (t)・F (t)) If the data conversion from the photon number measuring data to the analysis data, specifically, for example, in the analysis data generation, the measurement data F A (t), both the F B (t) is not zero, the measurement data F A (t), F B in geometric mean become function f (t) n AB (t) = √ (F a (t) · F B (t))
によって光子数解析データn AB (t)を生成することが好ましい。 It is preferred to generate a photon number analysis data n AB (t) by. このように相乗平均を用いて解析データを求めることにより、蛍光検出の同時性が考慮された蛍光解析を好適に実行することができる。 By obtaining the analysis data thus using the geometric mean can be suitably performed fluorescence analysis simultaneity of fluorescence detection have been considered. また、この方法では、測定データF 、F の少なくとも一方が0の場合においても、相乗平均の上記関数√(F ・F )でn AB =0となる。 Further, in this method, the measurement data F A, even when at least one of the 0 F B, the n AB = 0 in the geometric mean of the function √ (F A · F B) .

あるいは、解析データ生成において、測定データF (t)、F (t)の両者が0でない場合に、測定データF (t)、F (t)の調和平均となる関数fで n AB (t)=2/{1/F (t)+1/F (t)} Alternatively, the analysis data generation, the measurement data F A (t), with F if both the B (t) is not zero, the measurement data F A (t), F B (t) harmonic mean become function f n AB (t) = 2 / { 1 / F A (t) + 1 / F B (t)}
によって光子数解析データn AB (t)を生成する構成を用いても良い。 It may be used an arrangement for generating photon number analysis data n AB (t) by. このように調和平均を用いて解析データを求めることにより、相乗平均の場合と同様に、蛍光検出の同時性が考慮された蛍光解析を好適に実行することができる。 By obtaining the analysis data thus harmonic average using, as in the case of the geometric mean can be suitably performed fluorescence analysis simultaneity of fluorescence detection have been considered.

光子数解析データを用いた蛍光解析については、具体的には、測定結果解析において、光子数解析データn AB (t)に対し、蛍光解析として、自己相関解析またはフォトンバースト解析の少なくとも一方を行うことが好ましい。 For fluorescence analysis using photon number analysis data, specifically, performed in the measurement result analysis, to photon number analysis data n AB (t), as a fluorescent analysis, at least one of the autocorrelation analysis or photon burst analysis it is preferable. このように、自己相関解析法、フォトンバースト解析法、あるいはそれらを組み合わせた解析法を用いることにより、測定試料の蛍光解析を精度良く実行することができる。 Thus, the autocorrelation analysis, photon burst analysis, or by using an analysis method that combines them, the fluorescence analysis of a measurement sample can be accurately performed.

また、測定結果解析において、光子数解析データn AB (t)を所定のビン時間幅でビニングし、ビニングされた解析データに対して蛍光解析を行う構成としても良い。 The measurement in the results analysis, and binning the photon number analysis data n AB (t) at a given bin duration may be configured to perform fluorimetric analysis on binned analysis data. この場合、具体的な測定条件等に応じて解析データのビン時間幅を設定することにより、蛍光解析の精度を向上することができる。 In this case, by setting the bin duration of the analysis data in accordance with the specific measurement conditions and the like, it is possible to improve the accuracy of the fluorescence analysis.

本発明の蛍光解析装置及び解析方法によれば、試料中に設定された測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光に対して光分岐手段を設けるとともに、第1、第2蛍光検出手段を設置して第1、第2光子数測定データF (t)、F (t)を取得し、それらの測定データから少なくとも一方が0の場合にn AB =0となる解析データn AB (t)を生成して蛍光解析を行うことにより、2つの検出手段での蛍光検出の同時性を考慮した形で蛍光解析を実行して、測定試料の蛍光解析の精度を向上することが可能となる。 According to the fluorescence analysis apparatus and analysis method of the present invention, it is provided with the optical branching unit with respect to the fluorescence from the fluorescent probe in the measurement area set in the sample, first established a second fluorescence detecting means first, second photon number measurement data F a Te (t), F B acquires (t), from at least one of these measurement data is n AB = 0 in the case of 0 analysis data n AB (t) to produce the by performing fluorescence analysis, run fluorescence analysis in consideration of the shape of the simultaneity of fluorescence detection in two detection means, it becomes possible to improve the accuracy of the fluorescence analysis of a measurement sample.

以下、図面とともに本発明による蛍光解析装置、及び蛍光解析方法の好適な実施形態について詳細に説明する。 Hereinafter, the fluorescence analysis apparatus according to the present invention in conjunction with the accompanying drawings, and will be described in detail preferred embodiments of the fluorescence analysis method. なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。 The same reference numerals are assigned to the same elements in the description of the drawings, without redundant description. また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。 The dimensional ratios in the drawings do not always match those explained.

図1は、本発明による蛍光解析装置の一実施形態の構成を概略的に示す図である。 Figure 1 is a diagram schematically showing a configuration of an embodiment of a fluorescence analysis apparatus according to the present invention. 本実施形態による蛍光解析装置1Aは、測定試料Sに対して設定された測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を検出して時系列の光子数測定データを取得し、得られた測定データに対して所定の蛍光解析を行うことで測定試料Sについての情報を取得するものである。 Fluorescence analysis apparatus 1A according to the present embodiment acquires the number of photons measured data of time series by detecting the fluorescence emitted from the fluorescent probes in the set measurement area with respect to the measurement sample S, the obtained measurement data it is intended to obtain information about the sample S by performing predetermined fluorescence analysis on. 以下においては、試料S中にあって測定対象となる蛍光物質(蛍光物質によって標識された分子等を含む)を「蛍光プローブ」とする。 In the following, the fluorescent substance to be measured be in the sample S (including the labeled molecule such as a fluorescent substance) and "fluorescent probe".

本蛍光解析装置1Aによる解析対象の一例としては、図2に示す標的分子(ターゲット物質)T、及び蛍光プローブP1、P2を含むものが挙げられる。 As an example of analyzed according fluorescent analyzer 1A include those comprising a target molecule (target substance) T, and the fluorescent probe P1, P2 shown in FIG. 図2の模式図は、生体分子などの標的分子Tに対する蛍光プローブPの特異的結合を利用して標的分子Tについての情報を取得するホモジニアス・アッセイの一例を示すものである。 Schematic diagram of FIG. 2 shows an example of a homogeneous assay which utilizes the specific binding of fluorescent probes P to the target molecule T, such as biomolecules to obtain information about the target molecule T.

具体的には、図2においては、3個所の認識部位t1〜t3を有する標的分子Tを含む試料(図2(a))に対し、認識部位t1に特異的に結合する認識部位を有する蛍光標識された分子プローブP1、及び認識部位t2に特異的に結合する認識部位を有する蛍光標識された分子プローブP2(図2(b))を蛍光プローブとして混合し、図2(c)に示すようにそれらを反応させて、蛍光解析の対象となる溶液状の測定試料Sとする。 Fluorescent Specifically, in FIG. 2, to the sample (FIG. 2 (a)) containing a target molecule T having a recognition site t1~t3 of three positions, having a recognition site which specifically binds to a recognition site t1 Fluorescently labeled molecular probe P2 having a recognition site which specifically binds to a labeled molecular probe P1, and recognition sites t2 (FIG. 2 (b)) were mixed as fluorescent probes, as shown in FIG. 2 (c) the reacted them, the solution form of the measurement sample S to be fluorescent analysis.

このような試料Sにおいて、蛍光プローブP1、P2が同一種類の分子プローブである場合、または蛍光プローブP1、P2の蛍光物質が同一種類の物質である場合、試料Sで発生する蛍光は単一波長領域の蛍光となる。 In such a sample S, when a fluorescent probe P1, P2 are the same type of molecular probes, or a fluorescent substance of a fluorescent probe P1, P2 are the same type of material, fluorescence single wavelength generated by the sample S the fluorescence of the area. 以下においては、標的分子Tに対して複数個の同一種類の蛍光プローブが結合する場合を主な蛍光解析の対象として想定する。 In the following, a plurality of identical types of fluorescent probes is assumed that binds a target of the main fluorescence analysis for the target molecule T. 以下、本実施形態による解析装置1Aの構成について、蛍光解析方法とともに説明する。 Hereinafter, the configuration of the analysis apparatus 1A according to the present embodiment will be described along with the fluorescent analysis method.

図1に示す蛍光解析装置1Aは、試料ホルダ10と、対物レンズ20と、ダイクロイックミラー21と、励起光源22と、光フィルタ23と、反射ミラー24と、結像レンズ25と、ピンホール26と、コリメートレンズ27と、ビームスプリッタ30と、光検出器31、32とを備えており、これらの各要素が本蛍光解析装置1Aにおける蛍光顕微鏡部を構成している。 Fluorescence analysis apparatus 1A shown in FIG. 1, a sample holder 10, an objective lens 20, a dichroic mirror 21, an excitation light source 22, an optical filter 23, a reflecting mirror 24, an imaging lens 25, a pinhole 26 , a collimator lens 27, a beam splitter 30, and a light detector 31, each of these elements constitutes a fluorescence microscope portion in the fluorescence analysis apparatus 1A. また、この蛍光顕微鏡部の各要素に加えて、本蛍光解析装置1Aは、検出信号処理部33、34と、光子計数部35と、測定制御部50とを備えている。 In addition to the elements of the fluorescence microscope, the fluorescence analysis apparatus 1A includes a detection signal processing section 33, a photon counting unit 35, and a measurement control unit 50.

試料ホルダ10は、蛍光測定及び解析の対象となる蛍光プローブを含む測定試料Sを保持する試料保持手段であり、その底面がスライドグラスとして機能する容器によって構成されている。 Sample holder 10 is a sample holding means for holding a sample S containing a fluorescent probe to be fluorescence measurements and analysis, and is constituted by a container in which the bottom surface serves as a slide glass. また、この試料ホルダ10に対し、所定位置に対物レンズ20が設置されている。 Further, with respect to the sample holder 10, the objective lens 20 is installed in a predetermined position. 対物レンズ20としては、例えば水浸(液浸)系の対物レンズを好適に用いることができる。 The objective lens 20, can be suitably used, for example, water immersion (immersion) system of the objective lens. また、このような対物レンズ20に対し、試料ホルダ10は、その形状が対物レンズ20の作動距離に対応するように構成されている。 Further, with respect to such an objective lens 20, the sample holder 10, its shape is configured to correspond to the working distance of the objective lens 20.

図1に示す構成では、対物レンズ20、ダイクロイックミラー21、及び励起光源22によって、測定試料Sの測定領域に励起光を照射する励起光照射手段が構成されている。 In the configuration shown in FIG. 1, the objective lens 20, the dichroic mirror 21, and the excitation light source 22, the excitation light irradiating means for irradiating excitation light to the measurement region of the measurement sample S is formed. 励起光源22としては、例えばレーザ光源を好適に用いることができる。 The excitation light source 22, can be suitably used for example a laser light source. 励起光源22から供給された励起レーザ光は、ダイクロイックミラー21によって反射され、対物レンズ20を介して集光されつつ、試料ホルダ10内の測定試料Sへとビームスポットとして照射される(励起光照射ステップ)。 Excitation laser light supplied from the pumping light source 22 is reflected by the dichroic mirror 21, while being condensed through the objective lens 20, is irradiated as a beam spot to the measuring sample S in the sample holder 10 (excitation light irradiation step). 励起光源22の例としては、波長473nm、532nm、または635nmのレーザ光を供給するレーザ光源を用いることができる。 Examples of the excitation light source 22, wavelength 473 nm, 532 nm, or a laser beam of 635nm may be used a laser light source for supplying.

また、図1に示す構成では、対物レンズ20、光フィルタ23、反射ミラー24、結像レンズ25、ピンホール26、コリメートレンズ27、ビームスプリッタ30、第1光検出器31、及び第2光検出器32によって蛍光検出手段が構成されている。 In the configuration shown in FIG. 1, the objective lens 20, optical filter 23, the reflection mirror 24, an imaging lens 25, pinhole 26, collimating lens 27, beam splitter 30, the first light detector 31, and a second photodetecting fluorescence detection means is constituted by a vessel 32. 測定試料Sの蛍光プローブからの蛍光は対物レンズ20によって収集され、ダイクロイックミラー21を透過し、さらに光フィルタ23を通過した後、反射ミラー24によってビームスプリッタ30に向けて反射される。 Fluorescence from the fluorescent probe of the measurement sample S is collected by the objective lens 20, transmitted through the dichroic mirror 21, after further passing through the optical filter 23, it is reflected toward the beam splitter 30 by the reflecting mirror 24. 光フィルタ23としては、例えば、試料Sからの散乱光、迷光等の余分な光成分を除去するための、測定対象の蛍光プローブの蛍光スペクトルに合わせて選択されたバンドパスフィルタを用いることができる。 The optical filter 23, for example, can be used scattered light from the sample S, for removing excess light components of stray light or the like, a band-pass filter selected in accordance with the fluorescence spectrum of the measured fluorescent probe .

反射ミラー24によって光路が変更された蛍光は、結像レンズ25及びピンホール26を順に通過し、コリメートレンズ27によって平行光束とされた後に、ビームスプリッタ30へと入射する。 Fluorescence whose optical path is changed by the reflection mirror 24, passes through the imaging lens 25 and the pinhole 26 in order, into a parallel beam by a collimator lens 27, and enters the beam splitter 30. ピンホール26は、結像レンズ25によって集光される蛍光に対して共焦点となる位置に設置されており、焦点外れの光を除去して、試料S中に形成されたビームスポットの測定領域からの蛍光のみを通過させる構成となっている。 Pinhole 26 is installed in position where the confocal relative fluorescence is condensed by the imaging lens 25, by removing the light of defocus, the measurement region of the beam spot formed on the sample S It has become fluorescent only a structure to pass from.

ビームスプリッタ30は、蛍光を分岐する光分岐手段であり、励起光が照射された測定試料Sの測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を2つの蛍光成分に分岐する(光分岐ステップ)。 Beam splitter 30 is an optical branching means for branching fluorescence branches the fluorescence from the fluorescent probe in the measurement region of the measurement sample S the excitation light is irradiated to the two fluorescent components (light branching step). すなわち、ビームスプリッタ30は、試料Sからの蛍光の個々の光子を第1光検出器31への光路または第2光検出器32への光路のいずれか一方へと導くことで、蛍光を2つの蛍光成分に分岐する。 That is, the beam splitter 30, by directing a fluorescence of individual photons from the sample S to either of the optical path to the first light detector 31 an optical path or the second optical detector 32 to the fluorescence of two branches to the fluorescent moiety. このようなビームスプリッタ30としては、例えば蛍光を50:50の分岐比で2つの蛍光成分に等分割するものが用いられる。 Such a beam splitter 30, for example, is used which is equally divided fluorescence into two fluorescent components in the branching ratio of 50:50.

ビームスプリッタ30で分岐された一方の第1蛍光成分(ビームスプリッタ30を透過した光子)は第1蛍光検出手段を構成する光検出器31によって検出され、検出信号が出力される(第1蛍光検出ステップ)。 First fluorescent component of one branched by the beam splitter 30 (photons transmitted through the beam splitter 30) is detected by the photodetector 31 constituting the first fluorescence detection means, the detection signal is output (first fluorescence detection step). また、ビームスプリッタ30で分岐された他方の第2蛍光成分(ビームスプリッタ30で反射された光子)は第2蛍光検出手段を構成する光検出器32によって検出され、検出信号が出力される(第2蛍光検出ステップ)。 The second fluorescent component of the other split by the beam splitter 30 (photons reflected by the beam splitter 30) is detected by a photodetector 32 constituting the second fluorescence detection means, the detection signal is output (the 2 fluorescence detection step). 光検出器の具体例としては、光電子増倍管を用いることができる。 Specific examples of the light detector can be used photomultiplier tubes. また、光フィルタ23からレンズ27までの各光学要素は、第1、第2蛍光検出手段で共用されている。 Further, each optical element from the optical filter 23 to the lens 27, first, is shared by the second fluorescence detecting means.

以上の励起光照射手段及び蛍光検出手段により、試料Sにおいて微小な測定領域を設定し、励起光を照射するとともに、測定領域からの蛍光を検出する共焦点光学系による蛍光顕微鏡が構成されている。 The above excitation light illumination means and fluorescence detection means, set the small measurement area in the sample S, as well as the excitation light, fluorescence microscopy is constituted by a confocal optical system for detecting fluorescence from the measurement region . また、本実施形態の蛍光顕微鏡は、試料Sからの蛍光に対し、光分岐手段、及びそれに対応する2つの蛍光検出手段を含んで構成されている。 The fluorescent microscope according to the present embodiment, with respect to the fluorescence from the sample S, an optical branching unit, and is configured to include two fluorescent detecting means corresponding thereto.

ここで、上記構成の蛍光顕微鏡によって測定試料S中に設定される測定領域は、例えば1fl(フェムトリットル)程度の極微小領域である。 Here, the measurement area set in the measurement sample S by fluorescence microscopy of the configuration is very small regions of, for example, about 1 fl (femtoliter). また、試料Sに含まれる蛍光プローブの分子濃度の一例を1nMとすると、測定領域内での蛍光プローブの平均分子数は、6・10 23 ×1・10 −9 ×1・10 −15 =0.6個である。 Moreover, when an example of a molecular concentration of the fluorescent probes contained in the sample S with 1 nM, average number of molecules of fluorescent probes in the measurement region is, 6 · 10 23 × 1 · 10 -9 × 1 · 10 -15 = 0 is a .6 pieces. また、図2に例示したホモジニアス・アッセイでは、標的分子の濃度は例えば1pM程度である。 Further, the homogeneous assay as illustrated in FIG. 2, the concentration of the target molecule is, for example, about 1 pM. ただし、これらの数値は測定領域等の設定の一例であり、具体的な設定は個々の場合で異なる。 However, these figures are an example of settings such as the measurement region, the specific configuration is different in each case.

第1、第2光検出器31、32から出力された検出信号は、それぞれ第1、第2検出信号処理部33、34へと入力される。 First, the detection signal outputted from the second optical detector 31 and 32, first respectively inputted to the second detection signal processing section 33. 検出信号処理部33、34は、例えばプリアンプなどの信号増幅回路及び波高弁別器などの信号処理回路によって構成され、光検出器31、32からの検出信号に対して所定の信号処理を行って、光検出器31、32のそれぞれでの単一光子検出イベントを示す検出パルス信号列を生成し出力する。 Detection signal processing section 33 is configured by, for example, the signal processing circuit such as a signal amplifier circuit and the wave height discriminator, such as a preamplifier, by performing predetermined signal processing on the detection signal from the photodetector 31, generating a detection pulse signal train indicating the single photon detection events at each of the photodetectors 31 and 32 and outputs.

信号処理部33、34からの検出パルス信号列は光子計数部35へと入力される。 Detection pulse signal train from the signal processing unit 33 is input to the photon counting unit 35. 光子計数部35は、蛍光解析に用いる測定データを取得する計数手段であり、光検出器31、32からの検出信号(処理部33、34からの信号列)に基づいて、検出光子数を所定の計数時間幅で計数して、時系列の第1、第2光子数測定データF (t)、F (t)を生成する(光子計数ステップ)。 Photon counting unit 35 is a counting means for obtaining the measurement data to be used for fluorescence analysis, based on the detection signal from the photodetector 31, 32 (signal sequence from the processing unit 33), a predetermined number of detected photons and counted in the count time width, the first time series, second photon number measuring data F a (t), and generates a F B (t) (photon counting step). これにより、試料Sに対する単一光子計数による蛍光測定が可能となる。 This allows fluorescence measurement by a single photon counting for the sample S. ここで、以下において、第1光検出器での検出結果に関する量を添え字「A」で示し、第2光検出器での検出結果に関する量を添え字「B」で示す。 Here, in the following, the amounts indicated subscript in letter "A" relates to the detection result in the first light detector, shown amounts letter "B" accompanied by a related detection result in the second light detector.

本解析装置1Aにおいては、光子計数部35での計数時間幅が蛍光解析のビン幅の初期条件(最小ビン幅)となる。 In the present analysis apparatus 1A, counting time width at the photon counting unit 35 is the initial condition of the bin width of the fluorescence analysis (minimum bin width). また、光子計数部35としては、具体的には例えば、マルチチャンネルスケーラ(MCS)を用いることができる。 As the photon counting unit 35, specifically, for example, it can be used multichannel scaler (MCS). また、光子計数部35での計数時間幅となるMCSの時間分解能は、例えば200nsec(ナノ秒)以下である。 The time resolution of the MCS to be counting time width at the photon counting unit 35 is, for example 200 nsec (nanoseconds) or less.

光子計数部35において生成された時系列の光子数測定データF (t)、F (t)は測定制御部50に入力され、この測定制御部50において、測定データに対して蛍光解析が行われる。 Photon number of the time series generated in the photon counting unit 35 measures data F A (t), F B (t) is input to the measurement control unit 50, in the measurement control unit 50, the fluorescence analysis for the measurement data It takes place. 本実施形態による測定制御部50は、解析データ生成部51と、測定結果解析部52とを有している。 Measurement control unit 50 according to the present embodiment, the analysis data generation unit 51, and a measurement result analyzer 52. このような測定制御部50は、例えば、蛍光解析用のソフトウェアが動作する制御用コンピュータによって構成することができる。 Such measurement control unit 50, for example, can be constituted by a control computer software for fluorescence analysis is operated.

解析データ生成部51は、光子数測定データF (t)、F (t)から、蛍光解析に用いる光子数解析データn AB (t)を生成する(解析データ生成ステップ)。 Analyzing the data generator 51, the number of photons measured data F A (t), from the F B (t), to generate a photon number analysis data n AB (t) used for the fluorescence analysis (analysis data generation step). 具体的には、生成部51は、測定データF (t)、F (t)に基づいて、測定データの少なくとも一方が0の場合(F ・F =0)に n AB (t)=0 Specifically, generator 51, the measurement data F A (t), based on F B (t), when at least one of the measurement data is 0 (F A · F B = 0) in n AB (t ) = 0
となり、測定データの両者が0でない場合(F ・F >0)に所定の関数fで n AB (t)=f(F (t)、F (t)) , And when both measurement data is not 0 (F A · F B> 0) to a predetermined function f n AB (t) = f (F A (t), F B (t))
となる光子数解析データn AB (t)を生成する。 Generating a become photon number analysis data n AB (t).

具体的な光子数解析データとしては、好ましくは、測定データF (t)、F (t)の相乗平均を用い、下記の式(1) Specific number of photons analysis data, preferably, using the geometric mean of the measured data F A (t), F B (t), the following formula (1)

によって解析データn AB (t)を生成する方法を用いることができる。 Method of generating an analysis data n AB (t) by can be used. なお、相乗平均の場合、その定義式で測定データの少なくとも一方が0の場合にn AB =0となる条件が満たされるため、その場合も含めて上記式(1)で解析データが定義される。 In the case of the geometric mean, for n AB = 0 and becomes the condition is satisfied, the analysis data in the case including the above formula (1) is defined when at least one of the measured data by the defining equation is zero .

測定結果解析部52は、必要な蛍光解析を行う解析手段であり、生成部51で生成された解析データn AB (t)に対し、蛍光プローブを含む測定試料Sの測定結果についての蛍光解析を行う(測定結果解析ステップ)。 The measurement result analyzing unit 52 is an analysis means for performing fluorescence analysis required to analyze data n AB generated by the generator 51 (t), the fluorescence analysis of the measurement results of the measurement sample S containing a fluorescent probe do (measurement results analysis step). これにより、例えば試料S中にある標的分子の情報など、測定試料Sについての必要な情報を取得することができる。 Thus, it is possible, for example, information of a target molecule present in the sample S, to obtain the necessary information about the sample S.

上記実施形態による蛍光解析装置、及び蛍光解析方法の効果について説明する。 Fluorescence analyzer device according to the embodiment, and the effects of fluorescence analysis methods will be described.

図1に示した蛍光解析装置1A、及び蛍光解析方法においては、対物レンズ20、励起光源22、及び光検出器31、32等を含む励起光照射系及び蛍光検出系によって試料S中に微小な測定領域を設定する。 In the fluorescence analysis apparatus 1A, and the fluorescence analysis method shown in FIG. 1, the objective lens 20, a minute in the sample S by the excitation light source 22, and the excitation light irradiation system includes an optical detector 31 and 32 and the fluorescence detection system to set the measurement area. また、測定領域内の蛍光プローブで発生する蛍光に対してビームスプリッタ30を設けるとともに蛍光検出系として第1、第2蛍光検出手段を設置して、第1光子数測定データF (t)及び第2光子数測定データF (t)を取得する。 The first as a fluorescence detection system is provided with the beam splitter 30 with respect to the fluorescence emitted by the fluorescent probe in the measurement area, by installing a second fluorescence detecting means, the first photon number measurement data F A (t) and obtaining a second photon number measuring data F B (t). そして、測定データF (t)、F (t)からF (t)・F (t)=0のときにn AB (t)=0となる解析データn AB (t)を生成して蛍光解析を行っている。 Then, generating measurement data F A (t), F B (t) from F A (t) · F B (t) = 0 becomes n AB (t) = 0 when the analysis data n AB (t) We are subjected to fluorescence analysis by.

このような構成では、光子数測定データF (t)、F (t)に代えて光子数解析データn AB (t)を用いることにより、第1、第2光検出器31、32での蛍光検出の同時性を考慮した形で蛍光解析を実行することができる。 In such a configuration, the number of photons measured data F A (t), by using a F B number of photons instead of (t) analysis data n AB (t), first, in the second optical detector 31 it is possible to perform fluorescence analysis in the form of considering the simultaneity of the fluorescence detection. これにより、例えば、複数個の蛍光プローブが結合した標的分子からの蛍光検出イベントと、それ以外のノイズイベントとの識別精度を向上するなど、試料Sの蛍光解析の精度を向上することが可能となる。 Thus, for example, a fluorescence detection event from the target molecule in which a plurality of fluorescent probes are bound, such as to improve the identification accuracy of the other noise event, it is possible to improve the accuracy of the fluorescence analysis of the sample S Become.

蛍光解析の励起光、蛍光については、励起光は単一波長領域の励起光であり、第1、第2蛍光成分は同一波長領域の蛍光成分である構成を用いることが可能である。 Excitation light of the fluorescence analysis, the fluorescence, the excitation light is the excitation light of a single wavelength region, the first, second fluorescent component may be used a configuration a fluorescent component of the same wavelength region. このような構成は、図2に関して上述したように、測定試料Sに加える蛍光プローブとして1種類の蛍光プローブのみを用いるとともに、試料Sに含まれる標的分子に2個以上の同一種類の蛍光プローブが結合する場合の蛍光解析に好適に適用することができる。 Such an arrangement, as described above with respect to FIG. 2, with using only one type of fluorescent probe as a fluorescent probe added to the sample S, is 2 or more identical types of fluorescent probes to a target molecule contained in the sample S it can be suitably applied to a fluorescence analysis when bound. また、図1の解析装置1Aでは、このような解析対象に対応して、単一の励起光源22を用いている。 Further, the analysis apparatus 1A of FIG. 1, in response to such an analysis target employs a single excitation light source 22.

ここで、蛍光プローブとして2種類以上の蛍光プローブを用いる方法では、複数種類の蛍光プローブが均等に反応する必要があり、プローブの選定が難しい。 Here, in the method of using two or more kinds of fluorescent probes as a fluorescent probe, it is necessary to a plurality of types of fluorescent probes react evenly, it is difficult the selection of the probe. また、例えば各種類の蛍光プローブに対する測定領域の不一致などの問題を生じる場合もある(特許文献3参照)。 Also, for example, it may cause problems such as inconsistency of the measurement area for each type of fluorescent probe (see Patent Document 3). これに対して、1種類の蛍光プローブを用いる蛍光解析法では、これらの問題点がなく測定が容易であり、蛍光解析の精度を向上することも可能である。 In contrast, the fluorescence analysis method using one kind of fluorescent probe, these problems are easily without measuring, it is also possible to improve the accuracy of the fluorescence analysis.

光子数解析データを用いた蛍光解析の具体的な内容については、解析部52において、光子数解析データn ABに対し、自己相関解析またはフォトンバースト解析の少なくとも一方を行うことが好ましい。 The specific details of the fluorescence analysis using the number of photons analysis data, the analyzing unit 52, to the number of photons analysis data n AB, it is preferable that at least one of the self-correlation analysis or photon burst analysis. このように、自己相関解析法、フォトンバースト解析法、あるいはそれらを組み合わせた解析法を用いることにより、試料Sの蛍光解析を精度良く実行することができる。 Thus, the autocorrelation analysis, photon burst analysis, or by using them combined analysis, it is possible to accurately perform the fluorescence analysis of the sample S. また、解析部52において、解析データn ABを所定のビン時間幅でビニングし、ビニングされた解析データに対して蛍光解析を行う構成としても良い。 Further, the analysis unit 52, the analysis data n AB binned at a predetermined bin duration may be configured to perform fluorimetric analysis on binned analysis data. この場合、具体的な測定条件等に応じて解析データのビン時間幅を設定することにより、蛍光解析の精度を向上することができる。 In this case, by setting the bin duration of the analysis data in accordance with the specific measurement conditions and the like, it is possible to improve the accuracy of the fluorescence analysis.

図1に示した蛍光解析装置1A、及び解析装置1Aにおいて実行される蛍光解析方法について、さらに具体的に説明する。 Fluorescence analyzer 1A shown in FIG. 1, and a fluorescence analysis method executed in the analysis apparatus 1A, will be described more specifically.

まず、光子数測定データF (t)、F (t)を用いた一般的な蛍光解析について説明する。 First, the number of photons measured data F A (t), the general fluorescence analysis will be described which incorporates a F B (t). 試料Sに1種類の蛍光プローブを加えて測定した場合、光検出器31、32での測定結果による自己相関関数G(τ)は、光子数測定データF 、F に対して、それぞれ下記の式(2)、式(3) When measured by adding one kind of fluorescent probe to the sample S, the autocorrelation by the measurement result of the photodetector 31 and 32 function G (tau) is the number of photons measured data F A, with respect to F B, respectively below equation (2), formula (3)


によって求めることができる。 It can be obtained by.

また、光検出器31、32間の相互相関関数は、下記の式(4)、式(5) Further, the cross-correlation function between the optical detectors 31 and 32, the following equation (4), (5)


によって求められる。 It is determined by. ここで、これらの相関関数G AB (τ)、G BA (τ)の対称性 Here, the symmetry of these correlation functions G AB (τ), G BA (τ)

を考慮すると、下記の式(7)で定義される関数G (τ)=G CROSS (τ) In view of the function G C defined by the following equation (7) (τ) = G CROSS (τ)

を光検出器31、32間の相互相関関数として用いることができる。 Can be used as a cross-correlation function between the optical detector 31.

一般に、蛍光相関分光法における1成分系の波形解析では、自己相関、相互相関ともに相関関数G(τ)は、下記の式(8) In general, the waveform analysis of one-component in fluorescence correlation spectroscopy, autocorrelation correlation function G (tau) in the cross-correlation of both is the following formula (8)

によって求められる。 It is determined by. ここで、<N>は試料Sで共焦点光学系によって構築される測定領域内に滞在する蛍光プローブの平均分子数を示し、また、τ は拡散時定数、r 、z は構造パラメータ(ストラクチャパラメータ)、Tは三重項状態へと遷移する割合、λは三重項遷移の時定数をそれぞれ示している。 Here, <N> represents the average number of molecules of fluorescent probes to stay within the measurement region which is constructed by the confocal optical system with the sample S, also, tau D is the diffusion time constants, r 0, z 0 is the structural parameters (structure parameter), T represents the ratio of transition to the triplet state, lambda is a time constant of the triplet transitions, respectively. これらのパラメータは、取得された相関関数に対してフィッティング計算による波形解析を行うことで求めることができる。 These parameters can be determined by performing waveform analysis by fitting calculation with respect to the obtained correlation function.

式(7)、式(8)を用いる解析法は従来法であるが、測定データを直接用いずに解析データn ABを用いる図1に示した解析装置1Aにおいても、このような解析法によって平均分子数、並進拡散時定数、三重項に関するパラメータ等を解析することは、蛍光プローブの初期状態を把握する上で好適である。 Equation (7), although analysis using equation (8) is a conventional method, even in the analysis apparatus 1A shown in FIG. 1 using the analysis data n AB without direct measurement data, by such analysis method average number of molecules, the translational diffusion time constant, analyzing the parameters concerning triplet is suitable for understanding the initial state of the fluorescent probes. また、式(8)において三重項状態への遷移確率をT=0とすると、時間遅れτ=0のときに、G(τ)のy切片について G(τ=0)=1/<N> Also, the transition probability to the triplet state when the T = 0 in equation (8), when the time lag τ = 0, G (τ = 0) for the y-intercept of G (τ) = 1 / <N>
の関係が得られる。 Relationship is obtained. すなわち、相関関数G(τ)のy切片により、試料S中での蛍光プローブの濃度に対応する測定領域内での平均分子数<N>が求められる。 That is, the y-intercept of the correlation function G (tau), the average number of molecules in the measurement area corresponding to the concentration of the fluorescent probes in the sample S is <N> obtained.

ここで、式(7)に示した相互相関関数G (τ)は、1種類の蛍光プローブを用いて求められたものであるため、上記の式(8)で波形解析することができる。 Here, the cross-correlation function G C (tau) is shown in Formula (7), 1 for the type of those obtained by using a fluorescent probe, it is possible to waveform analysis by formula (8). このような蛍光解析法では、相互相関によって光検出器のノイズをキャンセルすることができる利点がある。 In such fluorescent analysis, there is an advantage that it is possible to cancel the noise of the photodetector by the cross-correlation. ただし、このように2つの光検出器を用いた相互相関では、1つの光検出器の場合に比べてSN比が1/√2倍に低下する。 However, such a cross-correlation using two photodetectors, SN ratio is reduced to a factor 1 / √2 as compared with the case of one photodetector.

次に、光子数解析データn AB (t)を用いた蛍光解析について説明する。 Next, a description will be given fluorescence analysis using the photon number analysis data n AB (t). ここで、図1の解析装置1Aにおいて、試料Sの測定領域内に1個の蛍光プローブのみが存在している場合には、光検出器31、32で同時に蛍光が検出されることはなく、光検出器31、32で同時に蛍光が検出された場合には、必ず複数個の蛍光プローブが測定領域内に存在するものとする。 Here, in the analysis device 1A of FIG. 1, when only one fluorescence probe in the measurement region of the sample S is present, not simultaneously the fluorescence is detected by the photodetector 31, If the fluorescence simultaneously by the light detector 31 is detected, it is assumed that always a plurality of fluorescent probes present in the measurement region.

この場合、上記の式(1)に示した相乗平均による解析データn AB (t) In this case, analysis by the geometric mean shown in the above equation (1) data n AB (t)
AB (t)=√(F (t)・F (t)) n AB (t) = √ ( F A (t) · F B (t))
を用いることにより、光子検出の同時性の観点から1個の蛍光プローブによる検出イベントを排除することができる。 By using, it is possible to eliminate detection event by one fluorescent probe from the viewpoint of the simultaneity of photon detection. また、この解析データでは、同時性の評価のため、測定データF 、F の一方または両方が0でn AB =0となる場合も除外せずに解析データを求める。 Further, in this analysis data for evaluation of simultaneity, measurement data F A, obtains the analysis data without excluding the case where one or both of the F B is n AB = 0 0. また、相乗平均による上記の解析データは、光分岐手段として分岐比1:1のビームスプリッタを用いた場合の蛍光解析において、特に好適に適用することができる。 Also, the analysis data according to the geometric mean is the branching ratio as the light branching means 1: In fluorescence analysis in the case of using the first beam splitter, can be particularly suitably applied.

この解析データn ABを時系列の光子数データとして、蛍光検出の同時性が加味された自己相関関数G new (τ)を求めると、下記の式(9) As the photon number data time series of this analysis data n AB, when determining the autocorrelation function G new the simultaneity of fluorescence detection is consideration (tau), the following equation (9)

となる。 To become. なお、相乗平均による解析データは実数データであるため、この式(9)の相関関数を求める演算も実数演算となる。 Incidentally, analysis data by geometric mean is because a real number data, operation is also a real number calculation for obtaining the correlation function of the equation (9). このような演算を含む蛍光解析は、測定制御部50でソフトウェア的に解析演算を行う構成において好適に実現することできる。 Fluorescence analysis comprising such operation can be realized suitably in the configuration for software to analyze operations at the measurement control unit 50.

式(9)の自己相関関数では、光子数データのビン時間幅が例えば1μsecと小さい場合にはn AB =0である確率が高いため、相関波形を求めることができない。 The autocorrelation function of Equation (9), because of the high probability that n AB = 0 if the bin duration of the photon number data, for example 1μsec and small, it is impossible to obtain a correlation waveform. これに対して、解析データn ABのビン時間幅をビニングで大きくしていくと、n AB =0の確率が次第に減少して相関波形が現れてくる。 In contrast, analyzes the bin time width of the data n AB is increased by binning the probability of n AB = 0 is emerge gradually decreases and correlation waveform. すなわち、上記の相関波形G new (τ)は、2つの光検出器31、32で取得される光子数データに対して任意のビン時間幅を設定したときに、そのビン幅内で光子が同時に検出される程度を示すものである。 That is, the correlation waveform G new (τ), when set to any bin time width with respect photon number data acquired by the two photodetectors 31 and 32, photons are simultaneously within the bin width It shows the extent to be detected.

また、自己相関関数G(τ)では、上記したように、そのy切片が蛍光プローブの平均分子数の逆数1/<N>に対応している。 Furthermore, the autocorrelation function G (tau), as described above, the y-intercept corresponds to the inverse of the average number of molecules of the fluorescent probe 1 / <N>. したがって、試料Sの測定領域内に蛍光プローブが多い場合には、それらが同時に観測される確率が高くなって相関波形のy切片が小さくなる。 Therefore, when a fluorescent probe is large in the measurement region of the sample S, y intercept of the correlation waveform is smaller they become a high probability to be observed simultaneously. 一方、蛍光プローブが少ない場合には、同時に観測される確率が低くなってy切片が大きくなる。 On the other hand, if a small fluorescent probe, y intercept increases is low probability of being observed at the same time. 蛍光検出の同時性を考慮した上記の相関関数G new (τ)は、一般的な相関関数G (τ)に対して、上記特性によって変動することとなる。 The above correlation function G new considering concurrency fluorescence detection (tau), to the general correlation function G C (tau), and thus vary the above properties.

なお、蛍光プローブの並進拡散運動等については、いずれの相関関数でも同じ運動を観測している。 Note that the translational diffusion motion, etc. of the fluorescent probe, and observed the same movement in any of the correlation function. このため、式(9)の相関関数G new (τ)の波形解析においても、相互相関関数G (τ)について求められた拡散時定数τ 、遷移割合T、及び時定数λの各パラメータを、同じパラメータ値で適用することが可能である。 Therefore, even in the waveform analysis of the correlation function G new new (tau) of the formula (9), the cross-correlation function G C (tau) diffusion time constant tau D obtained for the transition rate T, and the parameter of the time constant λ and it can be applied with the same parameter values.

上記の相関関数G new (τ)の導出において、解析データn ABのビン時間幅を蛍光プローブの濃度に対して適切に設定することにより、蛍光検出の同時性による制限によって測定領域内に滞在する見かけ上の分子数を少なく見積もることができる。 In the derivation of the correlation function G new (τ), by appropriately setting the bin time width analysis data n AB against the concentration of the fluorescent probe, to stay in the measurement region by the restriction due to the simultaneity of fluorescence detection We can underestimate the number of molecules of apparent. これは、測定領域内にある複数個の蛍光プローブからの蛍光を2つの光検出器で同時に検出する頻度が、ビン時間幅の大きさによって異なってくることによる。 This frequency of simultaneously detecting the fluorescence from a plurality of fluorescent probes in the measurement region by the two optical detectors, due to the fact that varies depending on the size of the bin time width. このビン時間幅については、光子計数部35での計数時間幅を初期ビン幅として取得された光子数データについて、必要に応じてビニングを行ってビン時間幅を設定、変更することが好ましい。 This for the bin time width, the counting time width for the acquired number of photons data as the initial bin width at photon counting unit 35, sets the bin time width by performing binning as necessary, it is preferable to change.

解析データn ABを用いた蛍光解析の上記性質は、標的分子に対して複数個の蛍光プローブが凝集するように結合する場合の蛍光解析に特に有効である。 The nature of the fluorescent analysis using analysis data n AB is particularly effective for fluorescence analysis when a plurality of the fluorescent probe binds to aggregated to a target molecule. この場合、試料Sに加える蛍光プローブを多くすることにより、複数個の蛍光プローブが結合した標的分子による蛍光検出イベントが増加する。 In this case, by increasing the fluorescence probe added to the sample S, fluorescence detection event by the target molecule in which a plurality of fluorescent probes are bound to increase. また、複数個の蛍光プローブの標的分子への結合によって並進拡散運動が変化するため、FCSによる蛍光解析において標的分子の検出能力が向上される。 Moreover, since a change in translational diffusion motion by binding to a target molecule of a plurality of fluorescent probes, detection capability of the target molecule can be improved in the fluorescence analysis by FCS. また、フリーの蛍光プローブについては、測定領域内に複数個が滞在する場合でも滞在タイミングがずれて同時性が小さくなるため、ビン時間幅の設定によって、フリーの蛍光プローブによるイベントを効果的に除外することが可能である。 Also, the free fluorescent probe, since the simultaneity shifted stay time even when a plurality stays decreases in the measurement area, by setting the bin time width, the event by free fluorophores effectively excluded it is possible to.

標的分子に複数個の蛍光プローブが結合する場合のFCSによる蛍光解析では、相関関数G(τ)は下記の式(10)、式(11) The fluorescence analysis by FCS in the case of binding a plurality of fluorescent probes to a target molecule, the correlation function G (tau) is the following formula (10), formula (11)


によって求められる。 It is determined by. ここで、式(10)、式(11)において、添え字iは標的分子に対する蛍光プローブの結合状態が異なる場合の各蛍光成分を示している。 Here, equation (10), in equation (11), the subscript i indicates the respective fluorescent component when bound state of the fluorescent probe to the target molecule are different. また、αは蛍光の発光効率に関する係数である。 Moreover, alpha is a coefficient relating to the luminous efficiency of fluorescence. また、式(11)の相関波形成分では、三重項に関する波形部分を省略している。 Further, the correlation waveform component of formula (11), are omitted waveform portion relating triplet.

蛍光プローブとして1種類の分子プローブのみを用い、図1の解析装置1Aで取得された測定データを式(7)の相互相関関数G (τ)によって解析する場合、係数α は正の整数の値をとり、それに応じて平均分子数<N >がそれぞれ求められる。 If only the used one type of molecular probe as a fluorescent probe and analyzed by cross-correlation function G C (tau) of the formula (7) Measurement data obtained by the analysis device 1A of FIG. 1, the coefficient alpha i is a positive integer takes a value, the average number of molecules <N i> are respectively obtained accordingly. 例えば、標的分子に対して蛍光プローブが最大で2個までしか結合しない場合、式(10)の相関関数G(τ)は下記の式(12) For example, if the fluorescent probe to the target molecule is not bound only Up to two, wherein the correlation function (10) G (tau) following equation (12)

となる。 To become. ここで、添え字i=1はフリーの蛍光プローブによる蛍光成分を示し、i=2は標的分子に蛍光プローブが1個結合した場合の蛍光成分を示し、i=3は標的分子に蛍光プローブが2個結合した場合の蛍光成分を示している。 Here, the subscript i = 1 represents the fluorescent component by free fluorescent probe, i = 2 represents the fluorescence component when the fluorescent probe bound one to the target molecule, i = 3 is a fluorescent probe to a target molecule It shows the fluorescence component when two combined. また、この場合の蛍光プローブの総分子数<N>は、下記の式(13) The total number of molecules of the fluorescent probes in this case <N> to, the following equation (13)

によって求められる。 It is determined by.

これらの式(12)、式(13)を用い、式(7)の相互相関関数G (τ)について各相関波形成分g (τ)の係数を求めることによって、試料Sにおける蛍光プローブの状態、及び標的分子の量などについての情報を取得することができる。 These formulas (12), using equation (13), by determining the coefficients of the correlation waveform components g i (tau) for the cross-correlation function G C of formula (7) (tau), fluorescent probes in the sample S state, and it is possible to obtain information about such as the amount of target molecule. ただし、このような蛍光解析において、標的分子の量が少なくフリーの蛍光プローブが多い場合には、相関波形は主にフリーの蛍光プローブによる蛍光成分によって表されることとなり、標的分子についての情報を充分な精度で取得することが困難となる。 However, in such fluorescence analysis, if the amount is less free fluorescent probes of the target molecule is large, the correlation waveform will be represented mainly by the fluorescent component by free fluorescent probes, the information about the target molecule it is difficult to obtain with sufficient accuracy.

このような場合、測定データF 、F による相関関数G (τ)に代えて、解析データn ABによる相関関数G new (τ)を用いることにより、標的分子の情報を好適に取得することができる。 In this case, the measurement data F A, in place of the correlation function G C (tau) by F B, by using a correlation function G new by analyzing data n AB (τ), preferably to obtain information of the target molecule be able to. すなわち、蛍光検出の同時性が考慮された相関関数G new (τ)では、フリーの蛍光プローブ、及び標的分子に1個のみ結合した蛍光プローブの分子数が低く見積もられるため、標的分子に蛍光プローブが2個結合した分子数<N >を精度良く定量することができる。 That is, the simultaneity is considered correlation function G new fluorescence detection (tau), since the free fluorescent probes, and the number of molecules of the fluorescent probe bound only one target molecule underestimate, fluorescent probe to the target molecule There two bound number of molecules of <N 3> can be accurately quantified.

また、式(1)に示した光子数解析データn AB (t)自体については、試料Sの測定領域内に複数個の蛍光プローブが同時に滞在する場合の蛍光ゆらぎに相当している。 Also, the number of photons analysis data n AB (t) itself shown in Formula (1), a plurality of fluorescent probes in the measurement region of the sample S is equivalent to fluorescence fluctuations when staying at the same time. このため、蛍光解析については、上記した自己相関解析以外にも、解析データに対してフォトンバースト解析(光子数データでの検出光子数についての解析)を行うことによっても、標的分子の情報等を取得することが可能である。 Thus, for fluorescence analysis, in addition to the autocorrelation analysis described above also, by carrying out the photon burst analysis (analysis for detecting the number of photons in the photon number data) to the analysis data, the information of a target molecule such as it is possible to get. なお、解析データのフォトンバースト解析については、具体的には後述する。 Note that the photon burst analysis analysis data, specifically described below.

ここで、標的分子Tに対する蛍光プローブPの特異的結合(図2参照)を利用するホモジニアス・アッセイでは、具体的には例えば、標的分子を含む試料Sに対し、(1)反応前の蛍光プローブの評価工程、(2)標的分子と蛍光プローブとの反応工程、及び(3)反応後の蛍光の評価工程の3つの工程によって蛍光解析が行われる。 Here, in the homogeneous assay utilizing specific binding of fluorescent probes P to the target molecule T (see FIG. 2), specifically, for example, to the sample S containing the target molecule, (1) before the reaction of the fluorescent probe process of evaluation, (2) step of the reaction with the target molecule and the fluorescent probe, and (3) fluorescence analysis by three steps of the evaluation process of fluorescence after the reaction is carried out. この場合、反応前の評価工程(1)では、式(7)の相互相関関数G (τ)を求め、式(8)を適用して波形解析を行って必要なパラメータの値を決定する。 In this case, the process of evaluation before the reaction (1), obtains a cross-correlation function G C (tau) of the formula (7), to determine the values of the parameters required by performing waveform analysis by applying equation (8) . さらに、式(1)の解析データ、及び式(9)の相関関数G new (τ)による解析を行い、反応前の状態の初期値を求めるとともに、同時性を評価する上で重要となる蛍光解析用のビン時間幅を設定する。 Furthermore, the analysis data of the formula (1), and analyzed by the correlation function G new new (tau) of the formula (9), made with obtaining the initial value of the previous state reaction, it is important in evaluating the simultaneous fluorescence setting the bin time width for analysis.

また、反応後の評価工程(3)では、先に求めた蛍光解析用のビン時間幅を適用して式(1)、式(9)による解析を行い、さらに、相関波形に対して式(10)、式(11)を用いた波形解析を行うことにより、試料Sでの標的分子の量を見積もることができる。 Further, in the evaluation step after the reaction (3), by applying the bin time width for fluorescence analysis previously obtained formula (1), analyzed by Equation (9), further wherein relative correlation waveform ( 10), by performing waveform analysis using equation (11), it is possible to estimate the amount of target molecules in the sample S. あるいは、波形解析に代えて、式(1)の解析データに対してフォトンバースト解析を行っても良い。 Alternatively, in place of the waveform analysis, it may be performed photon burst analysis on the analysis data of the formula (1). なお、ビン時間幅の設定方法等については、具体的には後述する。 Note that the like configuring the bin time width, in particular be described later.

また、自己相関関数G(τ)の算出においては、一定のビン時間幅で演算を行わず、時間遅れτに応じてビン幅を変えて相関関数を求めるマルチプルタウ方式を用いても良い。 In the calculation of the autocorrelation function G (tau), without operation at constant bin duration may be used a multiple tau method for obtaining the correlation function by changing the bin width in accordance with the time delay tau. すなわち、一般的な自己相関関数は、下記の式(14) That is, the typical autocorrelation function, the following equation (14)

によって求められるが、時間遅れτが例えば100nsec〜1secの範囲全体で一定のビン幅100nsecの分解能を適用すると演算量が膨大となり、また、時間遅れτが大きい領域で求められる波形のSN比が劣化する場合がある。 Although determined by the time lag τ, for example, to apply the resolution of certain bin width 100nsec over a range of 100nsec~1sec calculation amount becomes enormous, also, SN ratio of the waveform obtained by the time lag τ is large area degradation there is a case to be.

これに対し、時間遅れτが大きい領域でビン時間幅が大きくなるように、時間遅れτに応じてビン幅を変えるマルチプルタウ方式によれば、相関波形の演算量を低減するとともに、時間遅れτが大きい領域でのSN比を改善することができる。 In contrast, as the bin time width increases with time delay tau is large area, according to the multiple tau method of changing the bin width in accordance with the time delay tau, while reducing the calculation amount of the correlation waveform, time delay tau it is possible to improve the SN ratio in the region is large. 具体的には例えば、初期ビン幅が100nsの時系列の測定データに対して解析演算を行う場合、τ=1μsでは初期ビン幅100nsのままで演算を行い、τ=1msではビン幅が1μsとなるようにビニングした光子数データを用いて演算を行う方法を用いることができる。 Specifically, for example, if the initial bin width analyzes operation on the measured data of the time series of 100ns, performs an operation while the initial bin width 100ns at tau = 1 [mu] s, the bin width in tau = 1 ms and a 1 [mu] s photon number data binning so it is possible to use a method of performing calculation using.

一般には、相関関数の算出において、時間遅れτが小さい領域で適用する最小ビン幅を設定し、時間遅れτが大きい領域では最小ビン幅を整数倍したビン時間幅でビニングして相関関数を算出する方法を用いることができる。 Generally, calculation in the calculation of the correlation function, and sets the minimum bin width to be applied is in a small region time delay tau, the correlation function by binning the minimum bin width an integral multiple bins time width in the time delay tau is large area how to can be used. このような演算方法は、測定制御部50でソフトウェア的に蛍光解析を行う構成において好適に実現することできる。 Such calculation method can be realized favorably in the configuration for software to fluorescence analysis by the measurement control unit 50. すなわち、ソフトウェア的に解析する構成では、解析演算に対する自由度が大きく、また、蛍光測定後にデータ処理を実行できることから、例えば解析条件を変えて何回も演算を繰り返すなど、様々な蛍光解析を行うことが可能である。 That is, in the configuration in which software analysis, large flexibility for analyzing operation, also, because it can perform data processing after fluorescence measurement, for example, be repeated operations many times by changing the analysis condition, performs various fluorescence analysis It is possible.

次に、解析データn AB及び相関関数G new (τ)による蛍光解析について、その具体例とともにさらに説明する。 Next, the fluorescence analysis by analyzing data n AB and correlation function G new (τ), further described in conjunction with specific examples. 以下においては、蛍光解析における測定データF 、F の初期ビン幅となる光子計数部35での計数時間幅を100nsとする。 In the following, measured in fluorescence analysis data F A, the counting time width at the photon counting unit 35 as the initial bin width of F B and 100 ns. また、相関関数の算出においては、基本的に上記したマルチプルタウ方式を用いるものとする。 In the calculation of the correlation function, it is assumed that basically using multiple tau method described above.

図3は、光子数測定データに対して得られる相関関数を示すグラフである。 Figure 3 is a graph showing the correlation function obtained for the number of photons measured data. 図3において、グラフ(a)は、光検出器31での測定データF から式(2)によって算出された自己相関関数G (τ)を示している。 3, graph (a) shows the measurement data F A of the photodetector 31 is calculated by the equation (2) the autocorrelation function G A (tau). また、グラフ(b)は、光検出器31、32での測定データF 、F から式(7)によって算出された相互相関関数G (τ)を示している。 A graph (b), the measurement data F A of the photodetector 31 shows a cross-correlation function calculated by the equation (7) from F B G C (τ). これらの相関関数は、いずれも最小ビン幅を100nsとしたマルチプルタウ方式によって算出されている。 These correlation functions are calculated by multiple tau manner both with the minimum bin width and 100 ns. また、図3では、図1の解析装置1Aで3秒間の蛍光測定を10回繰り返して得られた測定データから求められる相関関数を示している。 Further, FIG. 3 shows the correlation function obtained from the measurement data obtained by repeating 10 times the fluorescence measurements 3 seconds in the analysis unit 1A in FIG.

図3の自己相関関数のグラフ(a)では、τ=1μs程度までの速い時間領域では光検出器のアフターパルスノイズが重畳された波形となっており、1μs以降の相関波形についてのみ、有効に解析することができる。 In the graph (a) of the autocorrelation function of FIG. 3, tau = has a waveform after pulse noise of the photodetector is superposed fast time domain up to about 1 [mu] s, the correlation waveform after 1 [mu] s only, effectively it can be analyzed. また、相互相関関数のグラフ(b)では、三重項状態への遷移過程が充分に観測されており、この相関波形を解析することで蛍光プローブの状態を正確に知ることができる。 Further, the graph of the cross-correlation function (b), triple and transition processes to excited state is sufficiently observed, it is possible to know the state of the fluorescent probe by analyzing the correlation waveform accurately. 蛍光測定における平均光子検出数は、第1光検出器31で35.3kcps、第2光検出器32で32.9kcpsであり、ビームスプリッタ30による蛍光の分岐比は約52:48となっている。 The average photon detection number in fluorescence measurements, 35.3Kcps the first light detector 31, a 32.9kcps in the second light detector 32, the branching ratio of the fluorescence by the beam splitter 30 is about 52:48 . また、グラフ(b)の相関波形について、式(8)で波形フィッティングを行った場合、各パラメータの値は <N>:21.4 Moreover, the correlation waveform of the graph (b), when carried out waveform fitting with equation (8), the value of each parameter <N>: 21.4
τ :0.256ms τ D: 0.256ms
T:0.123 T: 0.123
λ:0.396μs λ: 0.396μs
/z :0.2 r 0 / z 0: 0.2
と求められ、この場合の平均分子数は<N>=21.4となっている。 Determined to be the average number of molecules in this case is a <N> = 21.4.

図3と同一の測定データF 、F について、式(1)の解析データn ABを求め、さらに式(9)の同時性を考慮した相関関数G new (τ)を算出した結果を図4に示す。 Figure 3 the same measurement data F A, the F B, the analysis obtains the data n AB, further drawing the result of calculating the correlation function G new new (tau) of the concurrency considering equation (9) in equation (1) 4 to show. 図4においては、ビニングによって初期ビン幅100nsよりも大きい所定の時間幅を最小ビン幅としてマルチプルタウ方式によって算出された相関関数を示している。 In Figure 4, it shows a correlation function calculated by the multiple tau scheme a large predetermined time width than the initial bin width 100ns as minimum bin width by binning. また、図4において、グラフA1、A2、A3、A4は、それぞれ最小ビン幅を6.4μs、25.6μs、102.4μs、409.6μsとしたときの相関関数を示している。 Further, in FIG. 4, graph A1, A2, A3, A4 are, 6.4Myuesu a minimum bin width, respectively, 25.6μs, 102.4μs, shows the correlation function when the 409.6Myuesu. ここで、例えばビン幅6.4μsの光子数データは、初期ビン幅100nsの光子数データを64個ずつ加算するビニング処理によって得られる。 Here, for example, photon number data bin width 6.4μs is obtained by binning processing of adding photon number data of the initial bin width 100ns by 64. また、初期ビン幅よりも大きい時間幅を最小ビン幅としているのは、最小ビン幅100nsでは同時性を考慮することでほとんどのビンの計数値が0になってしまうためである。 Also, the initial bin larger time width than is the minimum bin width is because the count value of the most bottles by considering the simultaneity in minimum bin width 100ns becomes 0.

図4のグラフA1〜A4より、相関関数G new (τ)を求める際の最小ビン幅を大きくすることにより、1/<N>に相当する相関関数のy切片が小さくなり、測定領域内での同時性が考慮された蛍光プローブの平均分子数<N>が増加することがわかる。 From the graph A1~A4 in FIG 4, by increasing the minimum bin width for obtaining the correlation function G new (τ), 1 / y intercept of the correlation function corresponding to <N> is reduced, in a measurement region it can be seen that the average number of molecules of fluorescent probes simultaneity is considered a <N> is increased. この図4の相関関数に対し、分子数<N>以外のパラメータについて図3のグラフ(b)で求めた上記のパラメータ値を適用して波形フィッティングによる解析を行うことにより、グラフA1〜A4のそれぞれについて各最小ビン幅での平均分子数<N>が求められる。 To the correlation function of FIG. 4, the number of molecules by performing analysis by applying to waveform fitting the parameter values ​​obtained in the graph shown in FIG. 3 (b) for the parameters other than <N>, the graph A1~A4 the average number of molecules in each minimum bin width <N> obtained for each.

図5は、相関関数G new (τ)から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。 Figure 5 is a graph showing the bin width dependence of the number of molecules obtained from the correlation function G new (τ). 図5において、横軸はマルチプルタウ方式による相関関数の算出での最小ビン時間幅(sec)を示し、縦軸は各最小ビン幅での相関関数のy切片から求められる平均分子数<N>を示している。 5, the horizontal axis represents the minimum bin time width in calculation of the correlation function by multiple tau scheme (sec), the vertical axis represents the average number of molecules obtained from the y-intercept of the correlation function at each minimum bin width <N> the shows. ここで、光子数解析データn ABでは、時系列の測定データにおいて計数値が0のビンが存在することを前提として同時性を評価している。 Here, we assess concurrency in photon number analysis data n AB, that the count value in the measurement data of the time series is present 0 bins assumption. このため、ビニング処理によってビン時間幅当たりの蛍光量が増えて計数値が0となる頻度が低くなる時間領域、例えば図5においてビン幅が0.3ms以上の領域では、解析データn ABを求めて同時性を評価する効果が充分に得られていない。 Therefore, the time domain the frequency count value is increasing fluorescence amount per bin time width by binning process becomes 0 is low, in the region bin width is not less than 0.3ms in FIG. 5 for example, obtains the analysis data n AB effect to evaluate the simultaneity of Te is not sufficiently obtained.

一方、例えばビン幅を6.4μsとした場合の相関関数G new (τ)では、図3のグラフ(b)の相関関数G (τ)で21.4個であった平均分子数<N>が6.1個まで減少している。 On the other hand, for example, the correlation function G new when the bin width was 6.4μs (τ), the correlation function G C (tau) the average number molecular was 21.4 pieces in the graph of FIG. 3 (b) <N > it has been reduced to 6.1 pieces. これは、解析データn ABで蛍光検出の同時性を考慮することにより、試料Sの測定領域内にある見かけ上の分子数が少なく見積もられたことを示すものである。 This can be achieved by considering the simultaneity of the fluorescence detected by the analysis data n AB, is an indication that the number of molecules of apparent in the measurement region of the sample S is underestimated. このような解析条件は、上述したように、標的分子に対して複数個の蛍光プローブが凝集するように結合する場合の蛍光解析において、複数個のフリーの蛍光プローブによるバックグラウンドイベントの影響が低減されるなどの点で特に有効である。 Such analysis conditions, as described above, the fluorescence analysis of case binding so as to aggregate a plurality of fluorescent probes to the target molecule, the effect of background events by a plurality of free fluorescent probes reduction it is particularly effective in terms of being.

図6は、光子数測定データに対して得られる相関関数の他の例を示すグラフである。 Figure 6 is a graph showing another example of the correlation function obtained for the number of photons measured data. 図6のグラフは、図3の場合よりも蛍光プローブの濃度が低い条件で蛍光測定を行って得られた相互相関関数G (τ)を示している。 Graph of Figure 6 shows the cross-correlation function obtained by performing the fluorescence measurement G C (tau) in low conditions the concentration of the fluorescent probe than in FIG. このグラフにおいて、蛍光測定における平均光子検出数は、第1光検出器31で2.3kcps、第2光検出器32で2.2kcpsであり、ビームスプリッタ30による蛍光の分岐比は約51:49となっている。 In this graph, the average photon detection number in fluorescence measurements, 2.3Kcps the first light detector 31, a 2.2kcps in the second light detector 32, the branching ratio of the fluorescence by the beam splitter 30 is about 51:49 It has become. また、図6のグラフの相関波形について、式(8)で波形フィッティングを行った場合、各パラメータの値は <N>:1.66 Moreover, the correlation waveform of the graph of FIG. 6, when performing waveform fitting with equation (8), the value of each parameter <N>: 1.66
τ :0.256ms τ D: 0.256ms
T:0.247 T: 0.247
λ:2.28μs λ: 2.28μs
/z :0.2 r 0 / z 0: 0.2
と求められ、この場合の平均分子数は<N>=1.66となっている。 Determined to be the average number of molecules in this case is a <N> = 1.66.

図7は、図6と同一の測定データについて、相関関数G new (τ)から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。 7, the same measurement data and 6 is a graph showing the bin width dependence of the number of molecules obtained from the correlation function G new (τ). このグラフにおいて、例えばビン幅を6.4μsとした場合の相関関数G new (τ)では、図6の相関関数G (τ)で1.66個であった平均分子数<N>が0.27個まで減少している。 In this graph, for example, the correlation function G new when the bin width was 6.4μs (τ), the correlation function G C (tau) the average number molecular which was 1.66 units in the Figure 6 is <N> 0 It has been reduced to .27 pieces. これらの図5、図7のグラフからわかるように、蛍光解析において光子数測定データ、解析データをビニングする場合のビン時間幅については、相関関数から求められる分子数のビン幅依存性を参照してビン時間幅を設定することが好ましい。 These 5, as can be seen from the graph of FIG. 7, for the bin time width when binning photon number measurement data, the analysis data in the fluorescence analysis, with reference to the bin width dependence of the number of molecules obtained from the correlation function it is preferable to set the bottle time width Te. また、分子数のビン幅依存性は、蛍光プローブの濃度等の条件によって変化するが、条件が同じであれば再現性は高いと考えられる。 Further, the bin width dependence number of molecules will vary depending on conditions such as the concentration of the fluorescent probe, reproducibility if the conditions are the same is considered to be high.

次に、光子数測定データF 、F から解析データn ABへのデータ変換について説明する。 Next, the number of photons measured data F A, the data conversion from F B to the analysis data n AB will be described. 同時性を考慮した解析データは、一般には、F ・F =0の場合に Analysis data considering concurrency is generally in the case of F A · F B = 0

となり、F ・F >0の場合に所定の関数fで Next, in the case of F A · F B> 0 at a predetermined function f

となるように求められる。 It is asked in such a way that. また、F ・F >0の場合の解析データの具体的な算出方法としては、上記に例示した相乗平均による解析データn AB Further, F as a specific calculating method of analyzing data in the case of A · F B> 0, the analytical data n AB by geometric means illustrated above

を用いることができる。 It can be used. これにより、蛍光検出の同時性が考慮された蛍光解析を好適に実行することができる。 Thus, it is possible to suitably perform the fluorescence analysis simultaneity of fluorescence detection have been considered. また、この方法では、F ・F =0の場合においても、相乗平均の上記関数でn AB =0となる。 Further, in this method, in the case of F A · F B = 0 also, the n AB = 0 in the above function of the geometric mean.

また、F ・F >0の場合の解析データの他の算出方法としては、相加平均による解析データn AB As another calculation method for analyzing data in the case of F A · F B> 0 is analyzed by the arithmetic mean data n AB

を用いることができる。 It can be used. なお、この方法では、相加平均の上記関数ではF 、F の一方のみが0の場合にn AB =0とならない。 In this way, the above function of the arithmetic mean does not become F A, when only one of the F B is 0 and n AB = 0. このため、F ・F =0の場合については、別にn AB =0と定義する。 Therefore, for the case of F A · F B = 0, apart defined as n AB = 0.

あるいは、F ・F >0の場合の解析データのさらに他の算出方法としては、調和平均による解析データn AB Alternatively, as still another method of calculating the analysis data in the case of F A · F B> 0, the analysis by harmonic mean data n AB

を用いることができる。 It can be used. これにより、相乗平均の場合と同様に、蛍光検出の同時性が考慮された蛍光解析を好適に実行することができる。 Thus, as in the case of the geometric mean can be suitably performed fluorescence analysis simultaneity of fluorescence detection have been considered. また、この方法でも、F ・F =0の場合については、別にn AB =0と定義する。 Also in this method, for the case of F A · F B = 0, apart defined as n AB = 0.

あるいは、F ・F >0の場合の解析データのさらに他の算出方法としては、測定データの積による解析データn AB Alternatively, F As another calculation method for analyzing data in the case of A · F B> 0, the analysis by the product of the measured data data n AB

を用いても良い。 It may also be used. ただし、この積による解析データは、他の相乗平均、相加平均、調和平均による解析データとは性質が異なっている。 However, the analysis data according to this product, the other geometric mean, arithmetic mean, is different in nature from the analytical data by the harmonic mean.

一般には、解析データn AB (t)の算出において、F ・F >0の場合には、相乗平均、相加平均、調和平均、または積のいずれかとなる関数f(F 、F )で解析データn ABを求めることが好ましく、特に、相乗平均、相加平均、または調和平均のいずれかとなる関数f(F 、F )で解析データn ABを求めることが好ましい。 In general, in the calculation of the analysis data n AB (t), F in the case of A · F B> 0 is the geometric mean, arithmetic mean, and one of the harmonic mean or product, the function f (F A, F B it is preferable to obtain the analysis data n AB at), in particular, the geometric mean, arithmetic mean or harmonic mean is either a function f (F a,, it is preferable to obtain the analysis data n AB in F B).

図8は、相関関数から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。 Figure 8 is a graph showing the bin width dependence of the number of molecules obtained from the correlation function. 図8において、グラフ(a)は図5に示した蛍光プローブの濃度が高い場合のグラフに対応し、グラフ(b)は図7に示した濃度が低い場合のグラフに対応している。 8, the graph (a) corresponds to the graph when the concentration of the fluorescent probe shown in FIG. 5 high, the graph (b) corresponds to the graph when low concentrations shown in FIG. また、グラフ(a)において、グラフB1、B2、B3、B4は、それぞれ解析データの算出に相乗平均、相加平均、調和平均、積を用いた場合の分子数<N>を示している。 Further, in the graph (a), the graph B1, B2, B3, B4 is the geometric mean for the calculation of each analysis data, arithmetic mean, harmonic mean, indicating the number of molecules in the case of using the product <N>. グラフ(b)におけるグラフC1、C2、C3、C4についても同様である。 The same applies to the graph C1, C2, C3, C4 in the graph (b).

また、図9は、図8のグラフ(a)に示した蛍光プローブの濃度が高い条件における、光子数解析データに対して得られる相関関数を示すグラフである。 9 is a graph showing the concentration of the fluorescent probe in the high condition shown in the graph (a) of FIG. 8, the correlation function obtained for the number of photons analysis data. 図9において、グラフ(a)は、ビン幅を6.4μsとした場合の相関関数を示し、グラフD1、D2、D3、D4は、それぞれ解析データの算出に相乗平均、相加平均、調和平均、積を用いた場合の相関関数を示している。 9, the graph (a) is a bin width shows the correlation function in the case of a 6.4Myuesu, graphs D1, D2, D3, D4 is the geometric mean for the calculation of each analysis data, arithmetic mean, harmonic mean shows the correlation function in the case of using the product. また、図9のグラフ(b)は、ビン幅を102.4μsとした場合の相関関数を示し、グラフE1、E2、E3、E4は、それぞれ解析データの算出に相乗平均、相加平均、調和平均、積を用いた場合の相関関数を示している。 Further, the graph of FIG. 9 (b), the bin width shows the correlation function in the case of a 102.4Myuesu, graph E1, E2, E3, E4 are geometric mean for the calculation of each analysis data, arithmetic mean, harmonic mean, it shows the correlation function in the case of using the product.

これらのグラフに示すように、相乗平均、相加平均、及び調和平均による解析データを用いた場合は、いずれも分子数<N>のビン幅依存性について同様の傾向を示している。 As shown in these graphs, geometric mean, arithmetic mean, and in the case of using the analysis data by harmonic average, shows a similar trend for the bin width dependence of any number of molecules <N>. 一方、積による解析データを用いた場合は、自己相関演算において平均強度とゆらぎとが同じように変動するため、相関波形のy切片、及びそれによって求められる分子数<N>は、ほぼ一定値を示す結果となっている。 On the other hand, in the case of using the analysis data by product, since the average intensity and the fluctuations in the self correlation operation varies in the same way, y intercept of the correlation waveform, and the number of molecules obtained by it <N> to, substantially constant value It has become a results showing. また、上記のいずれの場合でも、相関関数(図9参照)については、分子数<N>以外のパラメータについて、相互相関関数から求めたパラメータ値を適用して波形フィッテイングによる解析を行うことが可能である。 Further, even if any of the above, the correlation function (see FIG. 9), the parameters other than the number of molecules <N>, is possible to perform analysis by waveform fitting by applying the parameter value obtained from the cross-correlation function possible it is.

図8のグラフ(a)に示す例では、上記したように相乗、相加、調和平均について同様の傾向を示している。 In the example shown in the graph of FIG. 8 (a), the synergy as described above, additive, shows a similar trend for the harmonic mean. これは、この測定例では光検出器31、32での平均光子検出数が35.3kcps、32.9kcpsであり、例えば6.4μsのビン幅では平均計数値が0.22となる。 This mean photon detection number of the optical detector 31 and 32 in this measurement example 35.3Kcps, a 32.9Kcps, average count is 0.22 in example 6.4μs bin width. このため、各ビンでの計数値の多くが0、1、2のいずれかとなり、光検出器間の検出の偏りについて、相乗、相加、調和平均で大きな差が無いことによる。 Therefore, many of the count value in each bin is either 0, 1, 2, the deviation of detection between the photodetector, synergistic, additive, due to the lack significant difference in harmonic mean. これらの相乗、相加、調和平均のうちでは、蛍光ゆらぎを過剰に評価しないことから、相乗平均、及び調和平均が特に解析データの算出に適していると考えられる。 These synergistic, additive, among harmonic mean, since it does not excessively evaluate the fluorescence fluctuations, geometric mean, and harmonic mean is considered to be particularly suitable for the calculation of the analysis data.

次に、光子数解析データn AB (t)のフォトンバースト解析について説明する。 Next, a description will be given photon bursts analysis of photon number analysis data n AB (t). フォトンバースト解析は、時系列の光子数データに対し、その各ビンでの検出光子数及びその時間変化について解析することで、測定領域内での蛍光プローブの個数等についての情報を得る解析方法である。 Photon burst analysis, when to photon number data series, in that by analyzing the detection photon number and the time variation of each bin, the analysis method for obtaining a fluorescence information about the number etc. of the probe in the measurement region is there.

図10は、時系列の光子数データでの計数値(ビン当たりの検出光子数)の分布の一例を示すグラフである。 Figure 10 is a graph showing an example of a distribution when the count value in the photon number data series (detected photons per bottle). 図10に示す計数値分布は、図3〜図5に示した蛍光プローブの濃度が高い場合の測定結果によるものである。 Count value shown in FIG. 10 the distribution is due to the measurement results when the concentration of the fluorescent probe shown in FIGS. 3 to 5 higher. 図10のグラフ(a)は、光検出器31、32での測定データF 、F を加算した光子数データにおいて、ビニングによってビン幅を307.2μsとしたときの計数値分布を示している。 Graph of FIG. 10 (a), the measurement data F A of the photodetector 31, the number of photons data obtained by adding F B, shows the count distribution when the bin width was 307.2μs by binning there. ここで、この図10の測定例では、測定データF 、F での平均光子検出数を加算すると68.2kcpsとなり、分子数が<N>=21.4であることから、1分子当たりの蛍光強度は約3.2kcpsである。 Here, in the measurement example of FIG. 10, the measurement data F A, next 68.2kcps when adding the mean photon detection Number of F B, the number of molecules because it is <N> = 21.4, per molecule the fluorescence intensity is about 3.2kcps. 上記のビン幅は、この蛍光強度を考慮し、蛍光プローブ1分子に対応する計数値が約1となるように選択している。 It said bin width, the fluorescence intensity was considered, the count value corresponding to the fluorescent probe molecule is selected to be approximately 1. このため、グラフ(a)において、そのピーク計数値はおよそ21となっている。 Therefore, in the graph (a), the peak count has become approximately 21.

一方、図10のグラフ(b)は、ビン幅6.4μsで相乗平均による解析データn ABを求め、さらにビニングによってビン幅を307.2μsとしたときの計数値分布を示している。 On the other hand, the graph of FIG. 10 (b), obtains the analysis data n AB by geometric mean with bin width 6.4Myuesu, further illustrates the count value distribution when the bin width was 307.2μs by binning. この場合、測定データF 、F の平均という点でいうと、計数値0.5が蛍光プローブ1分子に相当することとなる。 In this case, the measurement data F A, say in terms of the average of the F B, so that the count value 0.5 corresponds to a fluorescent probe molecule. このグラフ(b)では、計数値が5以上で2つ以上のビンをまたいで発光するような現象について、その識別が容易になる。 In the graph (b), the phenomenon such as count emits across more than one bottle at 5 or higher, it facilitates the identification. すなわち、図10の例では、例えば10個程度の蛍光プローブが標的分子に凝集、結合する反応系の場合、測定データのグラフ(a)ではフリーの蛍光プローブによるイベントに埋もれてしまい識別が困難であるが、蛍光検出の同時性が考慮された解析データのグラフ(b)ではそれらを識別することが可能である。 That is, in the example of FIG. 10, for example about ten fluorescent probe aggregation target molecule, in the case of the reaction system to bind, is difficult identification buried in the event with a fluorescent probe free in the graph (a) of the measurement data the case, it is possible to identify them in the graph (b) of analysis data simultaneity of fluorescence detection have been considered.

図11は、光子数データでの計数値の分布の他の例を示すグラフである。 Figure 11 is a graph showing another example of the distribution of the count value at the photon number data. 図11に示す計数値分布は、図6、図7に示した蛍光プローブの濃度が低い場合の測定結果によるものである。 Count value distribution shown in FIG. 11, FIG. 6, is due to the measurement results when a low concentration of the fluorescent probe shown in FIG. 図11のグラフ(a)、(b)は、それぞれ図10のグラフ(a)、(b)と同様に求められた計数値分布を示している。 Graph of FIG. 11 (a), (b) is a graph, respectively, in FIG 10 (a), shows the count distribution obtained in the same manner as (b). ここで、この図11の測定例では、測定データF 、F での平均光子検出数を加算すると4.5kcpsとなり、分子数が<N>=1.66であることから、1分子当たりの蛍光強度は約2.6kcpsである。 Here, in the measurement example of FIG. 11, the measurement data F A, next 4.5kcps when adding the mean photon detection Number of F B, the number of molecules because it is <N> = 1.66, per molecule the fluorescence intensity is about 2.6kcps. このとき、上記のビン幅では、蛍光プローブ1分子に対応する計数値は約0.8となっている。 At this time, in the bin width, the count value corresponding to the fluorescent probe molecule is about 0.8.

図11のグラフ(b)では、計数値1の頻度が142、計数値2の頻度が1となっており、その他のイベントは全て計数値が0となっている。 In graph (b) of FIG. 11, the frequency count value 1 142, has become the frequency of the count value 2 is a 1, other events are all count has become zero. このような測定結果では、上記した307.2μsのビン幅で例えば計数値0.4を基準としてフォトンバースト解析を行うことが可能である。 In such measurements, it is possible to perform photon burst analysis based on the bin width, for example, count 0.4 307.2μs described above.

標的分子に対して複数個の蛍光プローブが結合する反応系では、解析データn ABが0よりも大きくなる確率は非常に高い。 In the reaction system in which a plurality of fluorescent probe binds to the target molecule, the probability of the analysis data n AB is greater than 0 is very high. このため、相乗平均などによる解析データを用いることで、フリーの蛍光プローブなどによるバックグラウンドイベントを低減した形での蛍光解析が可能となる。 Accordingly, by using the analysis data by geometric mean etc., it is possible to fluorescence analysis in the form of reduced background events due free fluorescent probes. ただし、フォトンバースト解析は相対的な評価であるため、濃度が既知の測定試料についてあらかじめ測定を行って検量線を作成し、その検量線を参照して解析を行うことが好ましい。 However, since the photon burst analysis is relative evaluation, the concentration to prepare a calibration curve by performing a pre-measurement for known measurement sample, it is preferable to perform the analysis with reference to the calibration curve. また、同時性を考慮した解析データの算出方法については、フォトンバースト解析においても、相乗、相加、調和平均のいずれを用いても大きな差は無かった。 As for the method of calculating the analysis data in consideration of simultaneity, even photon burst analysis, synergistic, additive, large differences using any of the harmonic mean did. また、積については、分散が大きくなる傾向があるため、解析データの算出方法としては相乗平均等が適しているものと考えられる。 As for the product, because there is a tendency that dispersibility becomes large, it is considered that the geometric mean or the like is suitable as the method of calculating the analysis data.

本発明による蛍光解析装置、及び蛍光解析方法は、上記実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。 Fluorescence analyzer and fluorescence analysis method according to the present invention is not limited to the above embodiments and configuration examples, and various modifications are possible. 例えば、蛍光測定に用いられる蛍光顕微鏡等の装置構成については、図1はその一例を示すものであり、具体的には様々な構成を用いて良い。 For example, for the device structure of a fluorescence microscope or the like used for fluorescence measurements, Figure 1 shows an example thereof, may be used various configurations specifically. また、上記した蛍光解析法は、測定試料に1種類の蛍光プローブのみを加える場合以外にも、様々な条件での蛍光測定に対して適用可能である。 The fluorescent analysis method described above, in addition to the case where the sample is added thereto only one type of fluorescent probe is also applicable to fluorescence measurement in various conditions. また、上記した蛍光解析装置及び解析方法は、フリーの蛍光プローブの影響を抑制できることから、例えば分子間相互作用における結合力が弱い反応系に対する蛍光解析法として有効であると考えられ、これまでELISA法等に適用できなかった抗原抗体反応の組合せについても適用できる可能性がある。 The fluorescent analysis apparatus and analysis method described above, since it can suppress the influence of free fluorescent probes, for example, binding forces in interaction between molecules is considered to be effective as a fluorescent analysis for weak reaction system so far ELISA it may be possible to apply the combination of antigen-antibody reactions that could not be applied to the law or the like.

本発明は、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を測定することによる測定試料の蛍光解析を好適に実行することが可能な蛍光解析装置、及び蛍光解析方法として利用可能である。 The present invention, fluorescence fluorescence analyzer which is capable of suitably executing the fluorescence analysis of a sample by measuring from the fluorescent probe in the measurement area, and is available as a fluorescent analysis method.

蛍光解析装置の一実施形態の構成を示す図である。 It is a diagram showing a configuration of an embodiment of a fluorescence analyzer. 蛍光解析装置による解析対象の一例を示す図である。 Is a diagram showing an example of analyzed by fluorescence analyzer. 光子数測定データに対して得られる相関関数を示すグラフである。 Is a graph showing the correlation function obtained for the number of photons measured data. 同時性を考慮した光子数解析データに対して得られる相関関数を示すグラフである。 It is a graph showing the correlation function obtained for the number of photons analysis data in consideration of simultaneity. 相関関数から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。 Is a graph showing the bin width dependence of the number of molecules obtained from the correlation function. 光子数測定データに対して得られる相関関数を示すグラフである。 Is a graph showing the correlation function obtained for the number of photons measured data. 相関関数から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。 Is a graph showing the bin width dependence of the number of molecules obtained from the correlation function. 相関関数から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。 Is a graph showing the bin width dependence of the number of molecules obtained from the correlation function. 同時性を考慮した光子数解析データに対して得られる相関関数を示すグラフである。 It is a graph showing the correlation function obtained for the number of photons analysis data in consideration of simultaneity. 光子数データでの計数値の分布を示すグラフである。 Is a graph showing the distribution of the count value in the photon number data. 光子数データでの計数値の分布を示すグラフである。 Is a graph showing the distribution of the count value in the photon number data.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1A…蛍光解析装置、S…測定試料、10…試料ホルダ、20…対物レンズ、21…ダイクロイックミラー、22…励起光源、23…光フィルタ、24…反射ミラー、25…結像レンズ、26…ピンホール、27…コリメートレンズ、 1A ... fluorescent analyzer, S ... sample, 10 ... sample holder, 20 ... objective lens, 21 ... dichroic mirror, 22 ... pumping light source, 23 ... optical filter, 24 ... reflecting mirror, 25 ... imaging lens 26 ... pin Hall, 27 ... the collimating lens,
30…ビームスプリッタ、31…第1光検出器、32…第2光検出器、33…第1検出信号処理部、34…第2検出信号処理部、35…光子計数部、50…測定制御部、51…解析データ生成部、52…測定結果解析部。 30 ... beam splitter, 31 ... first optical detector, 32 ... second optical detector, 33 ... first detection signal processing section, 34 ... second detection signal processing section, 35 ... photon counting unit, 50 ... measurement control unit 51: analysis data generation unit, 52 ... measurement result analysis unit.

Claims (13)

  1. 測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射手段と、 Excitation light irradiating means for irradiating excitation light to the measurement area set for the measurement sample,
    前記励起光照射手段によって前記励起光が照射された前記測定試料の前記測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を2つの蛍光成分に分岐する光分岐手段と、 An optical branching means for branching the fluorescence emitted from the fluorescent probe in the measurement region of the measurement sample in which the excitation light is irradiated by the excitation light illumination means into two fluorescent components,
    分岐された一方の第1蛍光成分を検出する第1蛍光検出手段と、 A first fluorescence detecting means for detecting a first fluorescence One component branched,
    分岐された他方の第2蛍光成分を検出する第2蛍光検出手段と、 A second fluorescence detecting means for detecting a second fluorescence component of the other branched,
    前記第1蛍光検出手段及び前記第2蛍光検出手段でそれぞれ検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数して、第1光子数測定データF (t)及び第2光子数測定データF (t)を取得する光子計数手段と、 And counted in a time series in at the detected number of photons predetermined counting time width each of the first fluorescence detecting means and the second fluorescence detecting means, the first photon number measurement data F A (t) and a second photon a photon-counting means for obtaining the number measurement data F B (t),
    前記第1光子数測定データF (t)及び前記第2光子数測定データF (t)に基づいて、測定データF (t)、F (t)の少なくとも一方が0の場合に n AB (t)=0 On the basis of the first photon number measurement data F A (t) and the second photon number measurement data F B (t), the measured data F A (t), when at least one of F B (t) is 0 n AB (t) = 0
    となり、測定データF (t)、F (t)の両者が0でない場合に所定の関数fで n AB (t)=f(F (t)、F (t)) Next, the measurement data F A (t), n in F B (t) If they are not 0 to a predetermined function f AB (t) = f (F A (t), F B (t))
    となる光子数解析データn AB (t)を生成する解析データ生成手段と、 An analysis data generation means for generating a composed photon number analysis data n AB (t),
    前記解析データ生成手段で生成された前記光子数解析データn AB (t)に対し、前記蛍光プローブを含む前記測定試料の測定結果についての蛍光解析を行う測定結果解析手段とを備えることを特徴とする蛍光解析装置。 The relative analysis the number of photons generated by the data generating means analyzing data n AB (t), and characterized in that it comprises a measurement result analyzing means for performing fluorescence analysis of the measurement results of the measurement sample containing the fluorescent probe fluorescence analyzer for.
  2. 前記解析データ生成手段は、測定データF (t)、F (t)の両者が0でない場合に、測定データF (t)、F (t)の相乗平均となる関数fで n AB (t)=√(F (t)・F (t)) The analysis data generation unit, when both the measured data F A (t), F B (t) is not 0, n in the measurement data F A (t), F B (t) of the geometric mean to become the function f AB (t) = √ (F A (t) · F B (t))
    によって前記光子数解析データn AB (t)を生成することを特徴とする請求項1記載の蛍光解析装置。 Fluorescence analyzer device according to claim 1, wherein the generating the photon number analysis data n AB (t) by.
  3. 前記解析データ生成手段は、測定データF (t)、F (t)の両者が0でない場合に、測定データF (t)、F (t)の調和平均となる関数fで n AB (t)=2/{1/F (t)+1/F (t)} The analysis data generation unit, when both the measured data F A (t), F B (t) is not 0, n in the measurement data F A (t), the harmonic mean of F B (t) function f AB (t) = 2 / { 1 / F A (t) + 1 / F B (t)}
    によって前記光子数解析データn AB (t)を生成することを特徴とする請求項1記載の蛍光解析装置。 Fluorescence analyzer device according to claim 1, wherein the generating the photon number analysis data n AB (t) by.
  4. 前記測定結果解析手段は、前記光子数解析データn AB (t)に対し、前記蛍光解析として、自己相関解析またはフォトンバースト解析の少なくとも一方を行うことを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項記載の蛍光解析装置。 The measurement result analyzing means, with respect to the photon number analysis data n AB (t), as the fluorescence analysis, any one of the preceding claims, characterized in that performing at least one of the self-correlation analysis or photon burst analysis fluorescence analysis apparatus according one paragraph.
  5. 前記測定結果解析手段は、前記光子数解析データn AB (t)を所定のビン時間幅でビニングし、ビニングされた解析データに対して前記蛍光解析を行うことを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項記載の蛍光解析装置。 The measurement result analyzing means, claims 1 to 4, characterized in that the fluorescent analysis the photon number analysis data n AB (t) is binned predetermined bin duration, relative binned analysis data fluorescence analysis apparatus according to any one claim of.
  6. 前記励起光は単一波長領域の励起光であり、前記第1蛍光成分及び前記第2蛍光成分は同一波長領域の蛍光成分であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項記載の蛍光解析装置。 The excitation light is the excitation light of a single wavelength region, the first fluorescent component and the second fluorescent component according to one of claims 1 to 5, characterized in that a fluorescent component of the same wavelength region fluorescence analysis device.
  7. 測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射ステップと、 An excitation light irradiation step of irradiating excitation light to the measurement area set for the measurement sample,
    前記励起光照射ステップで前記励起光が照射された前記測定試料の前記測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を2つの蛍光成分に分岐する光分岐ステップと、 A light branching step of branching the fluorescence emitted from the fluorescent probes in the excitation light irradiating the measurement region of the measurement sample in which the excitation light is irradiated in step two fluorescent components,
    分岐された一方の第1蛍光成分を検出する第1蛍光検出ステップと、 A first fluorescence detection step of detecting the first fluorescent One component branched,
    分岐された他方の第2蛍光成分を検出する第2蛍光検出ステップと、 A second fluorescence detection step of detecting the second fluorescent component of the other branched,
    前記第1蛍光検出ステップ及び前記第2蛍光検出ステップでそれぞれ検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数して、第1光子数測定データF (t)及び第2光子数測定データF (t)を取得する光子計数ステップと、 The counted in a time series in the first fluorescence detection step and the second fluorescence detection respectively detected photon number a predetermined counting time width in step, the first photon number measurement data F A (t) and a second photon a photon counting acquiring several measurement data F B (t),
    前記第1光子数測定データF (t)及び前記第2光子数測定データF (t)に基づいて、測定データF (t)、F (t)の少なくとも一方が0の場合に n AB (t)=0 On the basis of the first photon number measurement data F A (t) and the second photon number measurement data F B (t), the measured data F A (t), when at least one of F B (t) is 0 n AB (t) = 0
    となり、測定データF (t)、F (t)の両者が0でない場合に所定の関数fで n AB (t)=f(F (t)、F (t)) Next, the measurement data F A (t), n in F B (t) If they are not 0 to a predetermined function f AB (t) = f (F A (t), F B (t))
    となる光子数解析データn AB (t)を生成する解析データ生成ステップと、 An analysis data generation step of generating photon number analysis data n AB (t) to be,
    前記解析データ生成ステップで生成された前記光子数解析データn AB (t)に対し、前記蛍光プローブを含む前記測定試料の測定結果についての蛍光解析を行う測定結果解析ステップとを備えることを特徴とする蛍光解析方法。 The relative analysis the number of photons generated in the data generation step analysis data n AB (t), and characterized in that it comprises a measurement result analysis step of performing a fluorescence analysis measurement results of the measurement sample containing the fluorescent probe fluorescence analysis method to.
  8. 前記解析データ生成ステップにおいて、測定データF (t)、F (t)の両者が0でない場合に、測定データF (t)、F (t)の相乗平均となる関数fで n AB (t)=√(F (t)・F (t)) In the analysis data generation step, the measurement data F A (t), if both the F B (t) is not 0, n in the measurement data F A (t), F B (t) of the geometric mean to become the function f AB (t) = √ (F A (t) · F B (t))
    によって前記光子数解析データn AB (t)を生成することを特徴とする請求項7記載の蛍光解析方法。 Fluorescence analyzing method according to claim 7, wherein the generating the photon number analysis data n AB (t) by.
  9. 前記解析データ生成ステップにおいて、測定データF (t)、F (t)の両者が0でない場合に、測定データF (t)、F (t)の調和平均となる関数fで n AB (t)=2/{1/F (t)+1/F (t)} In the analysis data generation step, the measurement data F A (t), if both the F B (t) is not 0, n in the measurement data F A (t), the harmonic mean of F B (t) function f AB (t) = 2 / { 1 / F A (t) + 1 / F B (t)}
    によって前記光子数解析データn AB (t)を生成することを特徴とする請求項7記載の蛍光解析方法。 Fluorescence analyzing method according to claim 7, wherein the generating the photon number analysis data n AB (t) by.
  10. 前記測定結果解析ステップにおいて、前記光子数解析データn AB (t)に対し、前記蛍光解析として、自己相関解析またはフォトンバースト解析の少なくとも一方を行うことを特徴とする請求項7〜9のいずれか一項記載の蛍光解析方法。 In the measurement result analyzing step, with respect to the photon number analysis data n AB (t), as the fluorescence analysis, claim 7, characterized in that performing at least one of the self-correlation analysis or photon burst analysis fluorescence analysis method according one paragraph.
  11. 前記測定結果解析ステップにおいて、前記光子数解析データn AB (t)を所定のビン時間幅でビニングし、ビニングされた解析データに対して前記蛍光解析を行うことを特徴とする請求項7〜10のいずれか一項記載の蛍光解析方法。 In the measurement result analysis step, according to claim 7 to 10 characterized in that the fluorescent analysis the photon number analysis data n AB (t) is binned predetermined bin duration, relative binned analysis data fluorescence analysis method according to any one claim of.
  12. 前記励起光は単一波長領域の励起光であり、前記第1蛍光成分及び前記第2蛍光成分は同一波長領域の蛍光成分であることを特徴とする請求項7〜11のいずれか一項記載の蛍光解析方法。 The excitation light is the excitation light of a single wavelength region, the first fluorescent component and the second fluorescent component according to any one of claims 7 to 11, characterized in that the fluorescent component of the same wavelength region the method of fluorescence analysis.
  13. 前記測定試料に加える前記蛍光プローブとして1種類の蛍光プローブのみを用いるとともに、前記測定試料に含まれる標的分子に2個以上の同一種類の前記蛍光プローブが結合する場合の前記蛍光解析に適用されることを特徴とする請求項7〜12のいずれか一項記載の蛍光解析方法。 With use of only one type of fluorescent probe as the fluorescent probe is added to the sample is applied to the fluorescent analysis of when two or more same type of the fluorescent probe binds to a target molecule contained in the sample fluorescence analysis method according to any one of claims 7 to 12, characterized in that.
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