JP2009278867A - Method for determining dna methylation-inhibiting action - Google Patents

Method for determining dna methylation-inhibiting action Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting an inhibitor substance which simply and quickly inhibits the methylation of DNA without requiring a sample in a large quantity and which can advantageously be used for the screening for a DNA methylation inhibitor. <P>SOLUTION: The method comprises the processes of: mixing a test DNA having a methylation site therein and having a fluorescent label attached thereto, a substance to be tested, and a DNA-methylating enzyme; making the test DNA react with a methylation-sensitive active substance capable of selectively cleaving an unmethylated methylation site; measuring a fluorescence intensity of the test DNA after the reaction with the methylation-sensitive restriction enzyme; and determining whether the test DNA is cleaved or not with the methylation-sensitive active substance on the basis of the fluorescence intensity. The method is determined whether the substance to be tested is or not an inhibitor substance capable of inhibiting the methylation of the test DNA depending on whether the test DNA is or not cleaved. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）のメチル化を検出する方法に係り、より詳細には、種々の生体関連物質及びその他の物質がＤＮＡのメチル化を阻害する作用（ＤＮＡメチル化阻害作用）を有するか否か判定する方法に係る。   The present invention relates to a method for detecting methylation of DNA (deoxyribonucleic acid), and more specifically, the action of various biological substances and other substances to inhibit DNA methylation (DNA methylation inhibitory action). It relates to a method of determining whether or not to have.

ＤＮＡの塩基配列により決定される遺伝子の発現の制御機構をクロマチンの動的変動から解明しようとする研究分野（エピジェネティクス）に於いて、ＤＮＡのメチル化の有無が遺伝子発現のスイッチの一つになっているであろう、ということが明らかになってきた。現在までの研究によれば、（哺乳類の）ＤＮＡのプロモーター領域の塩基配列に於いて、シトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）の配列のうちのＣがメチル化されると、クロマチンが凝縮し、これにより、その近傍の遺伝子の発現スイッチがオフ（発現が停止される）となり、逆に、メチル化されたＤＮＡが脱メチル化されると、遺伝子の発現スイッチがオンとなり、遺伝子の発現が開始されるという機構が考えられている。かかるＤＮＡのメチル化による遺伝子発現の制御機構は、例えば、ｐ１６などのがん抑制遺伝子に於いても観察されており、ｐ１６の例では、ｐ１６遺伝子の上流の配列が正常細胞では非メチル化されているので、ｐ１６遺伝子が発現され、細胞のがん化が抑制されるが、がん細胞では、ｐ１６遺伝子の上流の配列がメチル化され、ｐ１６遺伝子の発現のスイッチがオフになっていることが報告されている。そこで、がん治療などの医療分野では、細胞のがん化に係る遺伝子のＤＮＡのメチル化又は脱メチル化を人為的に操作又は制御することによってがんを予防又は治療する新薬の開発が試みられており、例えば、メチル化されたｐ１６などのがん抑制遺伝子を脱メチル化することによって正常に発現させ、これにより、細胞を正常な状態へ戻すがん治療薬などが期待されている。   In the research field (epigenetics), which seeks to elucidate the regulation mechanism of gene expression determined by the nucleotide sequence of DNA from the dynamic variation of chromatin, the presence or absence of DNA methylation is one of the gene expression switches. It has become clear that it will be. According to research to date, in the nucleotide sequence of the promoter region of (mammalian) DNA, when C in the cytosine (C) -guanine (G) sequence is methylated, chromatin is condensed, As a result, the expression switch of the nearby gene is turned off (expression is stopped), and conversely, when the methylated DNA is demethylated, the gene expression switch is turned on and the gene expression starts. A mechanism is considered. Such a mechanism for controlling gene expression by DNA methylation has been observed in, for example, tumor suppressor genes such as p16. In the example of p16, the sequence upstream of the p16 gene is unmethylated in normal cells. Therefore, the p16 gene is expressed and the canceration of the cell is suppressed, but in the cancer cell, the sequence upstream of the p16 gene is methylated and the expression switch of the p16 gene is turned off. Has been reported. Therefore, in the medical field such as cancer treatment, development of a new drug for preventing or treating cancer by artificially manipulating or controlling DNA methylation or demethylation of genes involved in canceration of cells is attempted. For example, a cancer therapeutic agent that normally expresses by demethylating a tumor suppressor gene such as methylated p16 and thereby returns cells to a normal state is expected.

上記の如き遺伝子発現機構やＤＮＡのメチル化に関する研究に於いて、ＤＮＡのメチル化の検出は、一般的には、ＤＮＡのＰＣＲによる増幅、ＤＮＡの適当な化学処理、電気泳動法などを用いて行われている。例えば、特許文献１は、ＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで化学処理してメチル化されていないシトシンをウラシルに変換した後、そのＤＮＡを、シトシンを含む領域を認識する制限酵素で処理し、しかる後、電気泳動により、ＤＮＡの長さで分離するという方法を開示している。この場合、メチル化されたシトシンは、亜硫酸水素ナトリウム処理でウラシルに変換されないので、メチル化されたシトシンを含むＤＮＡは、制限酵素により切断され、長さが短くなるので、電気泳動法により、検出されることになる。また、特許文献２では、亜硫酸水素ナトリウム処理されメチル化されていないシトシンがウラシルに置換されたＤＮＡに、シトシンを含む領域を認識するプライマーを添加してＰＣＲを行うことにより、メチル化されたシトシンを含むＤＮＡのみを増幅して、ＤＮＡのメチル化を検出するという方法が開示されている。
特表２００６−５００９０１公報 特表２００５−５０８８８５公報 In the research on gene expression mechanisms and DNA methylation as described above, DNA methylation is generally detected by PCR amplification of DNA, appropriate chemical treatment of DNA, electrophoresis, etc. Has been done. For example, Patent Document 1 discloses that after chemically treating DNA with sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine to uracil, the DNA is treated with a restriction enzyme that recognizes a region containing cytosine, and then, Disclosed is a method of separating by length of DNA by electrophoresis. In this case, methylated cytosine is not converted to uracil by sodium bisulfite treatment, so DNA containing methylated cytosine is cleaved by a restriction enzyme and shortened in length, so that it can be detected by electrophoresis. Will be. In Patent Document 2, methylated cytosine is obtained by performing PCR by adding a primer that recognizes a region containing cytosine to DNA in which cytosine that has been treated with sodium bisulfite and unmethylated cytosine is substituted with uracil. A method of amplifying only DNA containing DNA to detect DNA methylation is disclosed.
Special table 2006-500901 gazette Special table 2005-508885 gazette

上記のＤＮＡのメチル化の制御による新薬の開発の過程やＤＮＡのメチル化が係る遺伝子発現機構の探求の過程に於いては、ＤＮＡのメチル化を阻害する作用を有する物質（ＤＮＡメチル化阻害剤）を用いることが考えられる。新薬の開発に於いては、ＤＮＡメチル化阻害剤そのものが、正常な細胞に於いて発現されるべき遺伝子の塩基のメチル化を阻止する薬剤の主成分として利用され得る。また、遺伝子発現機構に於けるＤＮＡメチル化の役割を探求する場合には、ＤＮＡメチル化阻害剤は、実験に於いてＤＮＡのメチル化を人為的に操作するための試薬として用いることができる。従って、新規なＤＮＡメチル化阻害剤がより多く見出されれば、それだけ、新薬の開発や遺伝子発現機構の解明の可能性が大きくなることが期待される。   In the process of developing a new drug by controlling DNA methylation and the process of exploring the gene expression mechanism involved in DNA methylation, a substance having an action of inhibiting DNA methylation (DNA methylation inhibitor) ). In the development of new drugs, DNA methylation inhibitors themselves can be used as the main components of drugs that block the methylation of the bases of genes that are to be expressed in normal cells. In the case of searching for the role of DNA methylation in the gene expression mechanism, a DNA methylation inhibitor can be used as a reagent for artificially manipulating DNA methylation in experiments. Therefore, as more novel DNA methylation inhibitors are found, it is expected that the possibility of developing new drugs and elucidating the gene expression mechanism will increase.

新規なＤＮＡメチル化阻害剤を見出すためには、或る物質がＤＮＡメチル化阻害作用を有しているか否かを判別し又は確認する必要がある。しかしながら、従来の技術に於いて、或る物質のＤＮＡメチル化阻害作用の有無を比較的簡便に判定する方法、或いは、ＤＮＡメチル化阻害剤のスクリーニングするための方法は確立されていない。或る物質のＤＮＡメチル化阻害作用の有無の判定は、その物質の存在下でメチル化酵素処理されたＤＮＡ中に於いてメチル化された部位を検出することにより為されるが、上記に例示した従前のＤＮＡのメチル化部位の検出方法は、そもそも、ＤＮＡのメチル化のパターンの判別、即ち、ＤＮＡ中のどの塩基がメチル化されているかを詳細に検出するための方法であり、処理過程に時間と労力を要するともに、多量の試料を要するので、或る物質のＤＮＡメチル化阻害作用の有無の判定や種々の被検物質に於けるＤＮＡメチル化阻害剤のスクリーニングの方法には適していない。もし比較的簡便に且迅速に、任意の物質のＤＮＡメチル化阻害作用の有無の判定を行えることができるようになれば、新規なＤＮＡメチル化阻害剤を見出すことが、従前に比してより容易になるであろう。また、かかる新規な方法に於いては、多量の試料を要しないことが好ましい。   In order to find a novel DNA methylation inhibitor, it is necessary to determine or confirm whether a certain substance has a DNA methylation inhibitory action. However, in the prior art, a method for determining the presence or absence of a DNA methylation inhibitory action of a substance in a relatively simple manner or a method for screening for a DNA methylation inhibitor has not been established. The presence or absence of a DNA methylation inhibitory effect of a substance is determined by detecting a methylated site in DNA that has been subjected to methylase treatment in the presence of the substance. The conventional method for detecting a methylation site of DNA is originally a method for discriminating a DNA methylation pattern, that is, for detecting in detail which base in DNA is methylated. Is time consuming and labor intensive, and requires a large amount of sample. Therefore, it is suitable for the determination of the presence or absence of DNA methylation inhibitory activity of a certain substance and the screening method for DNA methylation inhibitors in various test substances. Absent. If it becomes possible to determine the presence or absence of the DNA methylation inhibitory effect of any substance relatively easily and quickly, finding a new DNA methylation inhibitor is more difficult than before. It will be easy. In such a novel method, it is preferable that a large amount of sample is not required.

かくして、本発明の一つの目的は、多量の試料を要せず、比較的簡便に且迅速に、任意の物質のＤＮＡメチル化阻害作用の有無の判定する方法を提供することである。   Thus, an object of the present invention is to provide a method for determining the presence or absence of DNA methylation inhibitory activity of an arbitrary substance in a relatively simple and rapid manner without requiring a large amount of sample.

また、本発明のもう一つの目的は、ＤＮＡメチル化阻害作用の有無の判定する方法に於いて有利に用いられるＤＮＡのメチル化を検出する方法を提供することである。   Another object of the present invention is to provide a method for detecting DNA methylation that is advantageously used in a method for determining the presence or absence of DNA methylation inhibitory activity.

本発明によれば、上記の課題を解決する新規なＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法が提供される。本発明の方法は、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡと、ＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質であるか否かが判定されるべき被検物質と、ＤＮＡメチル化酵素とを混合する過程と、その後、試験ＤＮＡに非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれかを選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させる過程と、メチル化感受性制限酵素を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程と、測定された蛍光強度に基づいて試験ＤＮＡがメチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程とを含み、試験ＤＮＡが切断されたか否かにより被検物質がＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質であるか否かを判定することを特徴する。なお、かかる構成に於いて、一つの態様として、典型的には、メチル化感受性作用物質は、非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位を切断するメチル化感受性作用物質であり、蛍光強度に基づいて試験ＤＮＡがメチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程に於いて、試験ＤＮＡが切断されたと判定された場合に、被検物質がＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質であると判定するようになっていてよい。また、メチル化感受性作用物質は、後に例示される如き、公知のメチル化感受性制限酵素（非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位を切断する制限酵素）であってよく、二種類以上のメチル化感受性作用物質又は制限酵素が同時に用いられてもよい。   According to the present invention, a novel method for detecting an inhibitor that inhibits methylation of DNA that solves the above-described problems is provided. The method of the present invention comprises a test DNA, which is a double-stranded DNA having a restriction enzyme recognition site containing a methylation site and having a fluorescent label added thereto, and whether it is an inhibitor that inhibits DNA methylation. The process of mixing the test substance to be judged and DNA methylase, and then the restriction including the restriction enzyme recognition site containing the methylation site in the unmethylated state or the methylation site in the methylation state in the test DNA Based on the process of applying a methylation sensitive agent that selectively cleaves one of the enzyme recognition sites, the process of measuring the fluorescence intensity of the test DNA to which the methylation sensitive restriction enzyme is applied, and the measured fluorescence intensity Determining whether the test DNA has been cleaved by a methylation-sensitive agent, and inhibiting whether the test substance inhibits DNA methylation depending on whether the test DNA has been cleaved Features to determine whether or not the quality. In such a configuration, as one aspect, typically, the methylation-sensitive agent is a methylation-sensitive agent that cleaves a restriction enzyme recognition site including a methylation site in an unmethylated state, In the process of determining whether or not the test DNA is cleaved by the methylation-sensitive agent based on the fluorescence intensity, the test substance inhibits DNA methylation when it is determined that the test DNA is cleaved. It may be determined that the substance is an inhibitory substance. The methylation-sensitive agent may be a known methylation-sensitive restriction enzyme (restriction enzyme that cleaves a restriction enzyme recognition site including a methylation site in an unmethylated state) as exemplified later, The above methylation sensitive agents or restriction enzymes may be used simultaneously.

上記の本発明の構成によれば、まず、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有する試験ＤＮＡが予め準備される。本発明の場合、検査されるべき対象は、ＤＮＡメチル化阻害作用を有しているかもしれない被検物質であるから、使用されるＤＮＡは、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有していれば、任意のものでよいことは理解されるべきである。そして、かかる試験ＤＮＡと、被検物質と、ＤＮＡメチル化酵素とを混合すると、もし被検物質がＤＮＡメチル化阻害作用を有していなければ、ＤＮＡメチル化酵素により試験ＤＮＡのメチル化されることとなるが、被検物質がＤＮＡメチル化阻害作用を有していれば、メチル化部位がメチル化されていない状態（非メチル化状態）で保存されることとなる。従って、その後、試験ＤＮＡに非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位を選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させると、被検物質がＤＮＡメチル化阻害物質であれば、試験ＤＮＡがメチル化部位を含む制限酵素認識部位で切断され、被検物質がＤＮＡメチル化阻害物質でなければ、メチル化部位がメチル化されているので、試験ＤＮＡが切断されないこととなる。（或いは、試験ＤＮＡにメチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位を選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させれば、被検物質がＤＮＡメチル化阻害物質であるとき、試験ＤＮＡがメチル化部位を含む制限酵素認識部位で切断されず、被検物質がＤＮＡメチル化阻害物質でないときには、メチル化部位がメチル化されているので、試験ＤＮＡが切断される。）かくして、被検物質がＤＮＡメチル化阻害物質であるか否かは、本発明に於いては、試験ＤＮＡがメチル化感受性作用物質により切断されたか否かを検出するだけで決定できることとなる。   According to the above configuration of the present invention, first, a test DNA having a restriction enzyme recognition site including a methylation site is prepared in advance. In the case of the present invention, since the subject to be examined is a test substance that may have a DNA methylation inhibitory activity, the DNA used has a restriction enzyme recognition site including a methylation site. It should be understood that any may be used. Then, when such test DNA, test substance, and DNA methylase are mixed, if the test substance has no DNA methylation inhibiting action, the test DNA is methylated by the DNA methylase. However, if the test substance has a DNA methylation-inhibiting action, the methylated site is stored in an unmethylated state (unmethylated state). Therefore, after that, when a methylation sensitive agent that selectively cleaves a restriction enzyme recognition site including a methylation site in an unmethylated state is allowed to act on the test DNA, if the test substance is a DNA methylation inhibitor, If the test DNA is cleaved at a restriction enzyme recognition site including a methylation site and the test substance is not a DNA methylation inhibitor, the methylation site is methylated, and thus the test DNA is not cleaved. (Alternatively, if a methylation sensitive agent that selectively cleaves a restriction enzyme recognition site containing a methylated site in the methylated state is allowed to act on the test DNA, the test substance can be tested when it is a DNA methylation inhibitor. When the DNA is not cleaved at a restriction enzyme recognition site containing a methylation site and the test substance is not a DNA methylation inhibitor, the methylation site is methylated, so that the test DNA is cleaved). In the present invention, whether or not the test substance is a DNA methylation inhibitor can be determined only by detecting whether or not the test DNA has been cleaved by a methylation-sensitive agent.

メチル化感受性作用物質により試験ＤＮＡが切断されたか否かは、本発明では、上記の構成から理解される如く、試験ＤＮＡに蛍光標識を予め付加しておき、メチル化感受性作用物質による処理後に測定された試験ＤＮＡの（蛍光標識の）蛍光強度に基づいて決定される。当業者にとって理解される如く、或るタンパク質やＤＮＡなどの分子に蛍光標識を付加しておけば、その分子の構造、大きさ、運動の変化が蛍光標識の蛍光強度に基づいて検出できる。本発明の場合、メチル化感受性作用物質による処理により、試験ＤＮＡが切断されると、即ち、試験ＤＮＡの構造が変化すると、蛍光標識が付加されたＤＮＡ分子の大きさが変化し、或いは、分子の運動状態が変化するので、かかる試験ＤＮＡの構造の変化がＤＮＡに付加された蛍光標識の蛍光強度の種々の挙動の変化に反映される。従って、メチル化感受性作用物質による処理後の試験ＤＮＡの蛍光強度の測定から、試験ＤＮＡが切断されたか否かが比較的容易に特定でき、これにより、被検物質がＤＮＡメチル化阻害物質であったか否かが判定できることとなる。   Whether or not the test DNA has been cleaved by the methylation-sensitive agent is determined in the present invention by adding a fluorescent label to the test DNA in advance and treating it with the methylation-sensitive agent as understood from the above configuration. Determined based on the fluorescence intensity (of the fluorescent label) of the test DNA. As understood by those skilled in the art, if a fluorescent label is added to a molecule such as a protein or DNA, a change in the structure, size, and movement of the molecule can be detected based on the fluorescence intensity of the fluorescent label. In the case of the present invention, when the test DNA is cleaved by treatment with a methylation-sensitive agent, that is, when the structure of the test DNA is changed, the size of the DNA molecule to which the fluorescent label is added changes, or the molecule Thus, the change in the structure of the test DNA is reflected in various behavioral changes in the fluorescence intensity of the fluorescent label added to the DNA. Therefore, from the measurement of the fluorescence intensity of the test DNA after treatment with a methylation-sensitive agent, it can be relatively easily determined whether or not the test DNA has been cleaved, so that the test substance was a DNA methylation inhibitor. It can be determined whether or not.

より具体的には、上記の本発明のいくつかの態様に於いては、蛍光強度の測定に基づいて、メチル化感受性作用物質を作用させる過程の前後の蛍光標識が付加された部位を有するＤＮＡの大きさの変化を検出することにより、メチル化感受性作用物質処理後の試験ＤＮＡの切断の有無が判定されるようになっていてよい。また、試験ＤＮＡは、メチル化部位と蛍光標識の付加された部位との距離がその試験ＤＮＡの長さの半分以下となるよう調製され、メチル化感受性作用物質処理後に試験ＤＮＡが切断された場合に、蛍光標識の付加されたＤＮＡの長さの変化又はそれによるＤＮＡ分子の運動の変化が大きく捉えられるようになっていてもよい。更にまた、試験ＤＮＡに二つ以上の蛍光標識を付加することにより、それら二つの蛍光強度の測定に基づいて、試験ＤＮＡの切断に伴って試験ＤＮＡ上の蛍光標識が別々のＤＮＡの断片に分かれることを検出するなどして、試験ＤＮＡの切断の有無を捉えるようになっていてもよい。   More specifically, in some embodiments of the present invention described above, based on the measurement of fluorescence intensity, a DNA having a site to which a fluorescent label is added before and after the process of acting a methylation sensitive agent. By detecting a change in the size of the test DNA, the presence or absence of cleavage of the test DNA after treatment with the methylation-sensitive agent may be determined. In addition, when test DNA is prepared such that the distance between the methylated site and the site to which the fluorescent label is added is less than half the length of the test DNA, and the test DNA is cleaved after treatment with a methylation sensitive agent In addition, a change in the length of the DNA to which the fluorescent label is added or a change in the movement of the DNA molecule due thereto may be captured greatly. Furthermore, by adding two or more fluorescent labels to the test DNA, the fluorescent label on the test DNA is divided into separate DNA fragments as the test DNA is cleaved based on the measurement of the two fluorescence intensities. For example, the presence or absence of cleavage of the test DNA may be detected.

メチル化感受性作用物質による蛍光標識された試験ＤＮＡの切断の有無を検出する蛍光強度の測定方法は、具体的には、蛍光相関分光法、蛍光偏光解消法など、蛍光標識された分子の大きさの変化に伴う分子運動の変化を検出できる任意の蛍光測定方法であってよい。また、試験ＤＮＡに二種類以上の蛍光標識を付加させた場合には、後で詳細に説明される如く、蛍光相互相関分光法を用いて試験ＤＮＡの切断の有無を測定するようになっていてもよい。なお、上記以外の試験ＤＮＡの構造の変化又は大きさの変化を検出できる任意の蛍光測定分析技術が、本発明に於いて採用されてよいことは理解されるべきであり、そのような場合も本発明の範囲に属する。   The fluorescence intensity measurement method for detecting the presence or absence of cleavage of the fluorescently labeled test DNA by a methylation sensitive agent is specifically the size of the fluorescently labeled molecule such as fluorescence correlation spectroscopy or fluorescence depolarization. Any fluorescence measurement method that can detect a change in molecular motion associated with a change in the number of molecules may be used. In addition, when two or more kinds of fluorescent labels are added to the test DNA, the presence or absence of cleavage of the test DNA is measured using fluorescence cross-correlation spectroscopy as will be described in detail later. Also good. It should be understood that any fluorometric analysis technique that can detect changes in the structure or size of the test DNA other than those described above may be employed in the present invention. It belongs to the scope of the present invention.

ところで、上記の本発明のＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法に於ける、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡを用いて、一連の反応を施した後、メチル化感受性作用物質による試験ＤＮＡの切断の有無を試験ＤＮＡの蛍光測定に基づいて決定するという特徴は、或る酵素がＤＮＡメチル化活性を有しているか否かを検出することにも適用できる。従って、本発明の別の態様によれば、酵素のＤＮＡメチル化活性を検出する方法であって、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡと、ＤＮＡメチル化活性を有するか否かが判定されるべき被検酵素とを混合する過程と、その後、試験ＤＮＡに非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれかを選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させる過程と、メチル化感受性制限酵素を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程と、蛍光強度に基づいて試験ＤＮＡがメチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程とを含み、試験ＤＮＡが切断された否かによって被検酵素がＤＮＡをメチル化する活性と有しているか否かを判定することを特徴とする方法が提供される。この方法は、ＤＮＡメチル化酵素を被検酵素に置き換え、ＤＮＡメチル化阻害作用を有するか否かが判定される被検物質を混合しない点に於いて、前記のＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法と異なるだけであることは理解されるべきである。   By the way, in the method for detecting an inhibitor that inhibits methylation of the DNA of the present invention described above, the test is a double-stranded DNA having a restriction enzyme recognition site containing a methylation site and having a fluorescent label added thereto. The characteristic of determining whether or not a test DNA is cleaved by a methylation-sensitive agent after a series of reactions using DNA is based on the fluorescence measurement of the test DNA is that an enzyme has DNA methylation activity. It is also applicable to detecting whether or not Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting DNA methylation activity of an enzyme, comprising a double-stranded DNA having a restriction enzyme recognition site containing a methylation site and having a fluorescent label added thereto. A process of mixing a test DNA with a test enzyme to be determined whether or not it has DNA methylation activity, and then a restriction enzyme recognition site or methyl containing a methylation site in an unmethylated state in the test DNA A process of acting a methylation sensitive agent that selectively cleaves any restriction enzyme recognition site including a methylation site in a methylated state, and a process of measuring the fluorescence intensity of a test DNA to which the methylation sensitive restriction enzyme is applied And determining whether the test DNA has been cleaved by the methylation-sensitive agent based on the fluorescence intensity. The test enzyme measures the DNA depending on whether the test DNA has been cleaved. Wherein the determining whether it has an activity to Le of is provided. This method replaces the DNA methylase with a test enzyme, and inhibits the above-mentioned DNA methylation in that the test substance to be determined whether or not it has a DNA methylation inhibitory effect is not mixed. It should be understood that this is only different from the method of detecting the substance.

また、上記の本発明のＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法に於ける特徴は、或るタンパク質等の物質がＤＮＡを脱メチル化する酵素活性を有しているか否かを検出することにも適用できる。従って、本発明の別の態様によれば、酵素の脱ＤＮＡメチル化活性を検出する方法であって、メチル化されたメチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡと、ＤＮＡ脱メチル化活性を有するか否かが判定されるべき被検酵素とを混合する過程と、その後、試験ＤＮＡに非メチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれかを選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させる過程と、メチル化感受性制限酵素を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程と、蛍光強度に基づいて試験ＤＮＡがメチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程とを含み、試験ＤＮＡが切断された否かによって被検酵素がＤＮＡを脱メチル化する活性と有しているか否かを判定することを特徴とする方法が提供される。この方法は、試験ＤＮＡが予めメチル化され、ＤＮＡメチル化酵素を被検酵素に置き換え、ＤＮＡメチル化阻害作用を有するか否かが判定される被検物質を混合しない点に於いて、前記のＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法と異なるだけであることは理解されるべきである。   The above-described method for detecting an inhibitor that inhibits methylation of DNA according to the present invention is characterized by detecting whether a substance such as a protein has an enzyme activity for demethylating DNA. It can also be applied. Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting the deDNA methylation activity of an enzyme, having a restriction enzyme recognition site containing a methylated methylation site, and having a fluorescent label added thereto. A process of mixing a test DNA that is a double-stranded DNA with a test enzyme to be judged whether or not it has DNA demethylation activity, and then the test DNA contains an unmethylated methylation site A process of acting a methylation sensitive agent that selectively cleaves either a restriction enzyme recognition site or a restriction enzyme recognition site including a methylation site in a methylated state, and a test DNA subjected to a methylation sensitive restriction enzyme A process of measuring fluorescence intensity and a process of determining whether or not the test DNA is cleaved by a methylation-sensitive agent based on the fluorescence intensity, depending on whether or not the test DNA is cleaved. Wherein the determining whether the enzyme has an active demethylating DNA is provided. This method is characterized in that the test DNA is pre-methylated, the DNA methylase is replaced with a test enzyme, and a test substance for determining whether or not it has a DNA methylation inhibitory action is not mixed. It should be understood that this is only different from the method of detecting inhibitors that inhibit DNA methylation.

更に、上記の本発明のＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法に於ける特徴は、ＤＮＡの脱メチル化を阻害する阻害物質を検出する方法にも適用できる。従って、本発明の更に別の態様によれば、ＤＮＡの脱メチル化を阻害する阻害物質を検出する方法であって、メチル化されたメチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡと、ＤＮＡの脱メチル化を阻害する阻害物質であるか否かが判定されるべき被検物質と、ＤＮＡ脱メチル化酵素とを混合する過程と、その後、試験ＤＮＡに非メチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態のメチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれかを選択的に切断するメチル化感受性作用物質を作用させる過程と、メチル化感受性制限酵素を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程と、蛍光強度に基づいて試験ＤＮＡが前記メチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程とを含み、試験ＤＮＡが切断されたか否かによって被検物質がＤＮＡの脱メチル化を阻害する阻害物質であるか否かを判定することを特徴とする方法が提供される。この方法は、前記のＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法とは、試験ＤＮＡが予めメチル化され、ＤＮＡメチル化酵素をＤＮＡ脱メチル化酵素に置き換えた点が異なる。   Furthermore, the above-described characteristics of the method for detecting an inhibitor that inhibits DNA methylation of the present invention can also be applied to a method for detecting an inhibitor that inhibits DNA demethylation. Therefore, according to yet another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting an inhibitor that inhibits DNA demethylation, comprising a restriction enzyme recognition site containing a methylated methylation site, and a fluorescent label. A test DNA which is a double-stranded DNA to which is added, a test substance to be determined whether it is an inhibitor that inhibits demethylation of DNA, and a DNA demethylase Thereafter, a methylation-sensitive agent that selectively cleaves either the restriction enzyme recognition site containing the methylation site in the unmethylated state or the restriction enzyme recognition site containing the methylation site in the methylation state in the test DNA. A process of measuring, a process of measuring the fluorescence intensity of a test DNA to which a methylation sensitive restriction enzyme is allowed to act, and whether or not the test DNA is cleaved by the methylation sensitive agent based on the fluorescence intensity And a determining step, method characterized in that the test substance to determine whether the inhibitor inhibits DNA demethylation is provided by whether the test DNA has been cut. This method differs from the above-described method for detecting an inhibitor that inhibits DNA methylation in that the test DNA is previously methylated and the DNA methylase is replaced with a DNA demethylase.

本発明の方法は、上記の説明から理解されるように、従前のＤＮＡのメチル化パターンを詳細に特定するためＤＮＡのメチル化の検出方法とは異なり、被検物質に対するＤＮＡメチル化阻害作用（又は、酵素のＤＮＡメチル化活性、酵素のＤＮＡ脱メチル化活性若しくはＤＮＡ脱メチル化阻害作用）を有するか否かを判定することを目的とした方法なので、試験ＤＮＡのメチル化の有無の検出に当たり、従前のＤＮＡのメチル化検出方法で行われる如き、シトシンをウラシルに置換する亜硫酸水素ナトリウム処理、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅、ＤＮＡをその長さによって電気泳動法などを用いていない。従って、本発明の方法によれば、従前のＤＮＡのメチル化検出方法に比して、高濃度若しくは多量の試料を必要とせず、簡便に且迅速に、ＤＮＡのメチル化の有無の検出が行われる。また、特に、本発明の一連の過程に於いて、メチル化状態のＤＮＡと非メチル化状態のＤＮＡとの見分けるための測定が蛍光測定であるので、試料量を従前の方法に比して大幅に低減することができる点で非常に有利である。更に、蛍光測定の際、前記の如き蛍光相関分光分析等に用いられる共焦点光学顕微鏡の光学系を備えた装置を用いれば、試料量は、より一層低減することが可能となる。   As is understood from the above description, the method of the present invention differs from the conventional method for detecting methylation of DNA in order to specify the methylation pattern of DNA in detail. Alternatively, the method is intended to determine whether or not the enzyme has DNA methylation activity, enzyme DNA demethylation activity or DNA demethylation inhibitory activity). As in the conventional method for detecting methylation of DNA, sodium bisulfite treatment for replacing cytosine with uracil, amplification of DNA by PCR, and electrophoresis of DNA depending on its length are not used. Therefore, according to the method of the present invention, the presence or absence of DNA methylation can be detected easily and quickly without the need for a high concentration or a large amount of sample as compared with the conventional DNA methylation detection method. Is called. In particular, in the series of processes of the present invention, since the measurement for distinguishing between methylated DNA and unmethylated DNA is fluorescence measurement, the amount of sample is greatly increased compared to the conventional method. This is very advantageous in that it can be reduced. Furthermore, the sample amount can be further reduced by using a device equipped with an optical system of a confocal optical microscope used for fluorescence correlation spectroscopy as described above in the fluorescence measurement.

試料量を従前に比して低減できるということは、新薬の開発や遺伝子発現機構の研究の分野に於いて、非常に有利であることは理解されるべきである。新薬の開発や遺伝子発現機構の研究の現場に於いて使用される試薬又は物質は、しばしば、高価であったり、或いは稀少であるために、大量に入手することが困難である場合がある。また、或る被検物質がＤＮＡメチル化阻害作用を有しているか否かを判定する前に、即ち、その物質がＤＮＡメチル化阻害剤として利用可能であるか否かを決定する前に大量に入手又は調製することは、経済的でない。そのような少量しか手に入らない物質又は有用であるか不明な物質について、ＤＮＡメチル化阻害作用の有無を判定しようとする場合に、本発明の方法は、少量の試料でも検査ができるので、極めて有効である（もし大量の試料が必要だとすれば、試料が足りないことで、検査自体が実施不可能となる場合もある。）。また、本発明は、試料が少量でよく、試験ＤＮＡを準備しておけば、その後の一連の過程が比較的迅速に且簡便であることから、多種の被検物質について、ＤＮＡメチル化阻害作用のスクリーニングをする場合にも適用できる。   It should be understood that the ability to reduce the amount of sample compared to the prior art is very advantageous in the field of new drug development and gene expression mechanism research. Reagents or substances used in the field of new drug development or gene expression mechanism research are often expensive or scarce and may be difficult to obtain in large quantities. Further, before determining whether or not a test substance has a DNA methylation inhibitory effect, that is, before determining whether or not the substance can be used as a DNA methylation inhibitor, It is not economical to obtain or prepare. For a substance that can be obtained only in a small amount or a substance that is unclear as useful, the method of the present invention can test even a small amount of sample when trying to determine the presence or absence of DNA methylation inhibitory action. It is extremely effective (if a large amount of sample is needed, the lack of sample may make the test itself impossible). In addition, the present invention requires a small amount of sample, and if a test DNA is prepared, the subsequent series of processes is relatively quick and simple. It can also be applied to screening.

更に、特記すべきことは、本発明のＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法は、上記に述べた如く、若干の修正をするだけで、酵素のＤＮＡメチル化活性を検出する方法、酵素のＤＮＡ脱メチル化活性を検出する方法及びＤＮＡの脱メチル化を阻害する阻害物質を検出する方法に応用することができ、ＤＮＡメチル化阻害剤の場合と同様、多種の被検物質について、ＤＮＡメチル化活性の有無、ＤＮＡ脱メチル化活性の有無、ＤＮＡ脱メチル化阻害作用の有無のスクリーニングも簡便に且迅速に、又、多量の試料を要せずに、任意の酵素のＤＮＡメチル化活性や物質の脱メチル化阻害作用を検出することができる点である。これらの活性や阻害作用を検出することも、上記のＤＮＡのメチル化の制御による新薬の開発の過程やＤＮＡのメチル化又は脱メチル化が係る遺伝子発現機構の探求の過程に於いて非常に有用である。この点に関し、現在のところ、実際の細胞内で、メチル化されたＤＮＡの脱メチル化をするＤＮＡ脱メチル化酵素が存在は確認されていない（従って、脱メチル化阻害剤も確認されていない。）。本発明によれば、脱メチル化活性のスクリーニングは、簡便に且迅速に実施できるので、もしＤＮＡ脱メチル化酵素が存在するのであれば、本発明の方法により、容易に発見できるかもしれない。そして、もしＤＮＡ脱メチル化酵素が発見されれば、メチル化されたＤＮＡを脱メチル化する新規な薬剤として利用できるかもしれない。   Further, it should be noted that the method for detecting an inhibitor that inhibits DNA methylation according to the present invention is a method for detecting the DNA methylation activity of an enzyme with only minor modifications as described above. It can be applied to a method for detecting the DNA demethylation activity of an enzyme and a method for detecting an inhibitor that inhibits the demethylation of DNA. As in the case of a DNA methylation inhibitor, In addition, screening for the presence or absence of DNA methylation activity, presence or absence of DNA demethylation activity, and presence or absence of DNA demethylation inhibitory activity can be performed easily and quickly, and DNA methylation of any enzyme can be performed without requiring a large amount of sample. It is a point which can detect the demethylation inhibitory effect of a chemical activity and a substance. Detecting these activities and inhibitory effects is also very useful in the process of developing new drugs by controlling DNA methylation and in the process of exploring gene expression mechanisms involving DNA methylation or demethylation. It is. In this regard, the presence of a DNA demethylase that demethylates methylated DNA in actual cells has not been confirmed so far (and therefore no demethylation inhibitor has been confirmed). .) According to the present invention, the screening for demethylation activity can be carried out simply and rapidly, so if DNA demethylase is present, it may be easily discovered by the method of the present invention. And if a DNA demethylase is discovered, it may be used as a novel drug for demethylating methylated DNA.

本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。   Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following description of preferred embodiments of the present invention.

以下に添付の図を参照しつつ、本発明を幾つかの好ましい実施形態について詳細に説明する。   The present invention will now be described in detail with reference to a few preferred embodiments with reference to the accompanying drawings.

図１は、本発明のＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法の好ましい実施形態に於ける処理過程をフローチャートの形式で表したものであり、図２は、図１の処理に於いて想定される分子の状態の変化を模式的に示したものである。   FIG. 1 is a flowchart showing the processing steps in a preferred embodiment of the method for detecting an inhibitor that inhibits methylation of DNA of the present invention, and FIG. 2 shows the processing steps in FIG. The change of the state of the molecule | numerator assumed by this is typically shown.

図１及び図２を参照して、本発明の方法の実施を開始する当たり、予め、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有する二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡが準備される。試験ＤＮＡの長さは、合成のコスト及び検出の容易さから１０〜１００merが好ましく、２０から４０merが更に好ましい。メチル化部位は、５’−シトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）−３’の塩基配列のうちのＣであり、図２（Ａ）に例示されている如く、二本鎖ＤＮＡに於いて、Ｃは、Ｇに結合しているので、５’−Ｃ−Ｇ−３’の塩基配列に対向する塩基配列は、３’−Ｇ−Ｃ−５’である。メチル化酵素の存在下（阻害作用がなければ）では、双方のＤＮＡ鎖の５’−Ｃ−Ｇ−３’のＣ塩基がメチル化されることが知られている。   With reference to FIG. 1 and FIG. 2, when starting the implementation of the method of the present invention, a test DNA which is a double-stranded DNA having a restriction enzyme recognition site including a methylation site is prepared in advance. The length of the test DNA is preferably 10 to 100 mer, more preferably 20 to 40 mer, from the cost of synthesis and ease of detection. The methylation site is C in the base sequence of 5′-cytosine (C) -guanine (G) -3 ′. As illustrated in FIG. 2 (A), in the double-stranded DNA, Since C is bonded to G, the base sequence opposite to the base sequence of 5′-CG-3 ′ is 3′-GC-5 ′. It is known that the 5'-CG-3 'C bases of both DNA strands are methylated in the presence of methylase (if there is no inhibitory action).

また、試験ＤＮＡには、少なくとも一つの蛍光標識として蛍光色素が付加されている。蛍光色素としては、この分野で通常使われる任意の蛍光色素、例えば、TAMRA（carboxymethylrhodamine）、TMR(tetramethylrhodamine)、Alexa647、Rhodamine Green、Alexa488などであってよいが、これらに限定されない。なお、試験ＤＮＡに一つの蛍光色素を付加する場合には、試験ＤＮＡは、蛍光標識部位とメチル化部位との距離がＤＮＡ全長の半分よりも短くなるよう調製されていることが好ましい。後でより詳細に説明される如く、試験ＤＮＡが被検物質（メチル化阻害作用の有無が検査される物質）の存在下でメチル化酵素により処理され、更に、メチル化感受性作用物質により処理された後、試験ＤＮＡがメチル化部位で切断されているか否かを判断する際、試験ＤＮＡに一つの蛍光色素を付加する場合には、蛍光色素が付加しているＤＮＡ分子の運動状態の変化が（蛍光測定に基づいて）観察される。試験ＤＮＡが切断されると、一方のＤＮＡ断片にのみ蛍光色素が付加された状態となるところ、蛍光標識部位とメチル化部位との距離がＤＮＡ全長の半分よりも短ければ、試験ＤＮＡが切断された場合とそうでない場合との蛍光色素が付加しているＤＮＡ分子の長さの差が大きくなり、従って、蛍光強度測定により検出されるＤＮＡ分子の運動状態の変化が大きくなるので、ＤＮＡの切断の有無がより感度良く検出可能となる。また、試験ＤＮＡは、複数種類の蛍光色素により蛍光標識されていてもよい。メチル化切断部位を挟んで異なる種類の標識でＤＮＡ鎖を修飾すると、後述の如く、蛍光相互相関分光法での計測が可能となり、１種類の蛍光標識の場合よりも、試験ＤＮＡの切断の有無が感度良く検出することが出来る。   Further, a fluorescent dye is added to the test DNA as at least one fluorescent label. The fluorescent dye may be any fluorescent dye usually used in this field, such as TAMRA (carboxymethylrhodamine), TMR (tetramethylrhodamine), Alexa647, Rhodamine Green, Alexa488, but is not limited thereto. When a single fluorescent dye is added to the test DNA, the test DNA is preferably prepared so that the distance between the fluorescent labeling site and the methylation site is shorter than half of the total DNA length. As will be explained in more detail later, the test DNA is treated with a methylating enzyme in the presence of a test substance (a substance to be examined for the presence or absence of methylation inhibiting action), and further treated with a methylation sensitive substance. After that, when determining whether or not the test DNA is cleaved at the methylation site, if one fluorescent dye is added to the test DNA, the movement state of the DNA molecule to which the fluorescent dye is added changes. Observed (based on fluorescence measurements). When the test DNA is cleaved, a fluorescent dye is added to only one DNA fragment. If the distance between the fluorescent labeling site and the methylation site is shorter than half of the total DNA length, the test DNA is cleaved. The difference between the length of the DNA molecule to which the fluorescent dye is added and the case where the fluorescent dye is added is large, and therefore the change in the movement state of the DNA molecule detected by the fluorescence intensity measurement is large, so that the DNA is cleaved. The presence or absence of can be detected with higher sensitivity. The test DNA may be fluorescently labeled with a plurality of types of fluorescent dyes. If the DNA strand is modified with a different type of label across the methylation cleavage site, measurement by fluorescence cross-correlation spectroscopy becomes possible, as will be described later, and whether or not the test DNA is cleaved more than in the case of one type of fluorescent label. Can be detected with high sensitivity.

試験ＤＮＡは、上記条件を満たす生物由来のＤＮＡでもよいが、人工的に合成したＤＮＡは、生物由来のものより安定性が高く、安価で大量生産ができるので、継続的に、多種類の被検物質のスクリーニングに適している。試験ＤＮＡは、本実施形態の方法を実施する度に調製するのではなく、一度に量産した後、変性しない態様にて保存し、本実施形態の方法を実施する際に必要量ずつ使用するようにされてよい。   Although the test DNA may be DNA derived from organisms that satisfy the above conditions, artificially synthesized DNA is more stable than organism-derived DNA and can be mass-produced at low cost. Suitable for screening of test substances. Test DNA is not prepared each time the method of this embodiment is performed, but is mass-produced at a time and then stored in a non-denaturing manner so that it can be used in the required amount when the method of this embodiment is performed. It may be done.

かくして、本実施形態の方法の初めの過程に於いて、試験ＤＮＡと被検物質とがまず混合され（ステップ１）、しかる後にＤＮＡメチル化酵素（及び酵素反応のための基質）が添加される(ステップ２)。ＤＮＡメチル化酵素は、ＣｐＧメチラーゼ、Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b, Damメチラーゼ、Dcmメチラーゼなどが用いられてよい。なお、当業者にとって理解される如く、以降の物質の混合操作は、特に断らない限り、水溶液中に物質を溶解した状態で行う。その後、ＤＮＡのメチル化反応が進行するよう混合液は、例えば、３７℃、１時間程度、インキュベーションされる。また、ステップ２のＤＮＡメチル化酵素の添加に先立って、３７℃、３０分程度、水溶液をインキュベーションして、溶液の温度を酵素反応をさせるべき温度に合わせておくことが好ましい。水溶液の組成、反応過程の温度、反応時間等の条件は、目的の酵素反応等が適当に進行するよう通常使用される条件が選択されてよい。   Thus, in the first step of the method of this embodiment, the test DNA and the test substance are first mixed (step 1), and then DNA methylase (and the substrate for the enzyme reaction) is added. (Step 2). As the DNA methylase, CpG methylase, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b, Dam methylase, Dcm methylase and the like may be used. As will be understood by those skilled in the art, the subsequent mixing operation of the substance is performed in a state in which the substance is dissolved in an aqueous solution unless otherwise specified. Thereafter, the mixed solution is incubated at 37 ° C. for about 1 hour so that the DNA methylation reaction proceeds. Prior to the addition of the DNA methylating enzyme in Step 2, it is preferable to incubate the aqueous solution at 37 ° C. for about 30 minutes so that the temperature of the solution is adjusted to the temperature at which the enzyme reaction is to occur. Conditions such as the composition of the aqueous solution, the temperature of the reaction process, the reaction time, and the like that are normally used may be selected so that the target enzyme reaction proceeds appropriately.

ステップ３の反応過程に於いては、図２（Ｂ）に示されている如く、被検物質がメチル化阻害作用を有していなければ、塩基配列Ｃ−ＧのＣがメチル化され（同図右）、被検物質がメチル化阻害作用を有していれば、塩基配列Ｃ−ＧのＣがメチル化されないまま（非メチル化状態：同図左）となる。   In the reaction process of Step 3, as shown in FIG. 2 (B), if the test substance has no methylation inhibitory action, C of the base sequence CG is methylated (same as above). If the test substance has a methylation-inhibiting action, C in the base sequence CG remains unmethylated (unmethylated state: left in the figure).

メチル化酵素処理の後、次いで、水溶液にメチル化感受性作用物質が添加され（ステップ４）、試験ＤＮＡのメチル化部位、塩基配列Ｃ−Ｇ、を含む制限酵素認識部位に於ける切断が進行するよう水溶液が、例えば、３７℃、１時間にてインキュベーションされる（ステップ５）。ここで、メチル化感受性作用物質が、メチル化されていないメチル化部位を切断するものであれば、被検物質がメチル化阻害作用を有する場合、メチル化されていない試験ＤＮＡを切断し、ＤＮＡを断片化するが（図２（Ｃ）左）、被検物質がメチル化阻害作用を有していない場合、試験ＤＮＡを切断しないので、従って、試験ＤＮＡの長さは保存されることとなる。（同図右）。   After the methylase treatment, a methylation-sensitive agent is then added to the aqueous solution (step 4), and cleavage at the restriction enzyme recognition site including the methylation site of the test DNA and the base sequence CG proceeds. The aqueous solution is incubated at 37 ° C. for 1 hour, for example (step 5). Here, if the methylation-sensitive agent is a substance that cleaves a methylation site that is not methylated, if the test substance has a methylation inhibitory action, cleave the test DNA that is not methylated, However, when the test substance does not have a methylation inhibitory action, the test DNA is not cleaved, so that the length of the test DNA is preserved. . (Right figure).

そのようなメチル化感受性作用物質は、典型的には、メチル化感受性制限酵素であり、例としては、Aat II、Acc I、Acc II、Aci I、Afa I、Afl II、Alu I、Aor13H I、Aor51H I、Apa I、ApaL I、Ava I、Ava II、Bal I、BamH I、Ban II、Bbe I、Bcn I、Bgl I、Bgl II、Bln I、BmeT110 I、BmgT120 I、Bpu1102 I、BspT104 I、BspT107 I、Bsp1286 I、Bsp1407 I、BssH II、BspD I、BstP I、BstU I、BstX I、Bst1107 I、Cfr10 I、Cfr13 I、Cla I、Cpo I、Dra I、Eae I、Eag I、Eam1105 I、EcoO65 I、EcoO109 I、EcoR I、EcoR V、EcoT14 I、EcoT22 I、Eco52 I、Eco81 I、Fba I、Fok I、Fse I、Hae II、Hae III、Hap II、Hha I、Hinc II、Hind III、Hinf I、Hin1 I、Hpa II、HpyCH4 IV、Kas I、Kpn I、Mbo I、Mbo II、Mfl I、Mlu I、Msp I、Mun I、Mva I、Nae I、NegM IV、Nco I、Nde I、Nhe I、Not I、Nru I、Nsb I、PmaC I、PshA I、PshB I、Psp1406 I、Pst I、Pvu I、Pvu II、Sac I、Sac II、Sal I、Sca I、Sfi I、Sma I、Smi I、SnaB I、Spe I、Sph I、 Sse8387 I、Ssp I、Stu I、Taq I、Tth111 I、Van91 I、VpaK11B I、Xba I、Xho I、Xsp Iなどが挙げられる。また、メチル化感受性制限酵素としては、上記のうち、好ましくは、塩基配列ＣＣＧＧ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＣ、ＡＣＧＴ、ＣＧＧＣＣＧ、ＧＣＣＧＧＣ、ＧＧＣＧＣＣ、ＣＣＣＧＧＧ、ＣＧＣＧ、ＡＴＣＧＴＡ、ＴＴＣＧＡＡ、ＧＴＣＧＡＧ又はＣＴＣＧＡＧを選択的に切断するメチル化感受性制限酵素が用いられ、更に好ましくは、HpaII（Ｃ‘ＣＧＧ）、AciI（Ｃ‘ＣＧＣ）、HinPII（Ｇ‘ＣＧＣ）、HpyCH4IV(Ａ‘ＣＧＴ）、EagI（Ｃ‘ＧＧＣＣＧ）、NegMIV（Ｇ‘ＣＣＧＧＣ）、KasI（Ｇ‘ＧＣＧＣＣ）、SmaI（ＣＣＣ‘ＧＧＧ）、BstUI（ＣＧ‘ＣＧ）、BspDI（ＡＴ‘ＣＧＴＡ）、BstBI（ＴＴ‘ＣＧＡＡ）、SalI（Ｇ‘ＴＣＧＡＧ）及びXhoI（Ｃ‘ＴＣＧＡＧ）等のメチル化感受性制限酵素が用いられてよい。なお、括弧内の「‘」は、酵素の切断部位を示している。   Such methylation sensitive agents are typically methylation sensitive restriction enzymes such as Aat II, Acc I, Acc II, Aci I, Afa I, Afl II, Alu I, Aor13H I , Aor51H I, Apa I, ApaL I, Ava I, Ava II, Bal I, BamH I, Ban II, Bbe I, Bcn I, Bgl I, Bgl II, Bln I, BmeT110 I, BmgT120 I, Bpu1102 I, BspT104 I, BspT107 I, Bsp1286 I, Bsp1407 I, BssH II, BspD I, BstP I, BstU I, BstX I, Bst1107 I, Cfr10 I, Cfr13 I, Cla I, Cpo I, Dra I, Eae I, Eag I, Eam1105 I, EcoO65 I, EcoO109 I, EcoR I, EcoR V, EcoT14 I, EcoT22 I, Eco52 I, Eco81 I, Fba I, Fok I, Fse I, Hae II, Hae III, Hap II, Hha I, Hinc II , Hind III, Hinf I, Hin1 I, Hpa II, HpyCH4 IV, Kas I, Kpn I, Mbo I, Mbo II, Mfl I, Mlu I, Msp I, Mun I, Mva I, Nae I, NegM IV, Nco I, Nde I, Nhe I, Not I, Nru I, Nsb I, PmaC I, PshA I, PshB I, Psp1406 I, Pst I, Pvu I, Pvu II, Sac I, Sac II, Sal I, Sca I, Sfi I, Sma I, Smi I, SnaB I, Spe I, Sph I, Sse8387 I, Ssp I, Stu I, Taq I, Examples include Tth111 I, Van91 I, VpaK11B I, Xba I, Xho I, and Xsp I. As the methylation-sensitive restriction enzyme, among the above, preferably, the base sequence CCGG, CCGC, GCGC, ACGT, CGGCCG, GCCGGC, GGCGCC, CCCGGG, CGCG, ATCGTA, TTCGAA, GTCGAG or CTCGAG is selectively cleaved. A methylation sensitive restriction enzyme is used, and more preferably, HpaII (C′CGG), AciI (C′CGC), HinPII (G′CGC), HpyCH4IV (A′CGT), EagI (C′GGCGG), NegMIV ( G'CCGGC), KasI (G'GCGCC), SmaI (CCC'GGG), BstUI (CG'CG), BspDI (AT'CGTA), BstBI (TT'CGAA), SalI (G'TCGAG) and XhoI (C Methylation sensitive restriction enzymes such as' TCGAG) may be used. In addition, “′” in parentheses indicates an enzyme cleavage site.

なお、ステップ４−５のメチル化感受性作用物質又は制限酵素による処理は、酵素反応ではなく、化学的にメチル化された状態のメチル化部位を切断し、非メチル化状態のメチル化部位を切断しないメチル化感受性作用物質によって行ってもよい。この場合は、メチル化された試験ＤＮＡは切断され、断片化されるが、メチル化されていない試験ＤＮＡは切断されず、従って、試験ＤＮＡの長さは保存されることとなる。（図２（Ｃ）の場合の逆）   The treatment with a methylation-sensitive agent or restriction enzyme in Step 4-5 is not an enzymatic reaction, but cleaves a methylated site in a chemically methylated state and cleaves a methylated site in an unmethylated state. It may be done with a methylation sensitive agent that does not. In this case, the methylated test DNA is cleaved and fragmented, but the unmethylated test DNA is not cleaved, thus preserving the length of the test DNA. (The reverse of the case of FIG. 2 (C))

かくして、メチル化感受性作用物質又は制限酵素による処理が終了すると、次いで、水溶液の蛍光強度測定が行われる（ステップ６）。蛍光強度測定としては、上記の説明から理解される如く、蛍光標識された試験ＤＮＡ又はその断片の分子の構造の変化又は運動状態の変化を検出できる任意の測定・分光分析方法が選択されてよい。   Thus, when the treatment with the methylation sensitive agent or restriction enzyme is completed, the fluorescence intensity of the aqueous solution is then measured (step 6). As understood from the above description, any measurement / spectroscopic analysis method capable of detecting a change in the structure of the molecule of the fluorescently labeled test DNA or a fragment thereof or a change in the movement state may be selected as the fluorescence intensity measurement. .

試験ＤＮＡに一つの蛍光標識が付加されている場合、試験ＤＮＡが切断されると、蛍光標識の付加されているＤＮＡ分子の長さが短くなる。短くなった蛍光標識の付加されているＤＮＡ分子は、短くなる前のＤＮＡ分子よりも早いブラウン運動をする。そこで、この場合には、蛍光標識の付加されているＤＮＡ分子のブラウン運動の早さの変化を検出することのできる蛍光相関分光法、蛍光偏光解消法などを有利に用いることができる。   When one fluorescent label is added to the test DNA, when the test DNA is cleaved, the length of the DNA molecule to which the fluorescent label is added is shortened. A shortened DNA molecule with a fluorescent label has a faster Brownian motion than a DNA molecule before shortening. Therefore, in this case, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence depolarization, or the like that can detect a change in the speed of Brownian motion of a DNA molecule to which a fluorescent label is added can be advantageously used.

蛍光相関分光法では、微小の蛍光観察領域をブラウン運動により通過する分子の移動（並進運動）の速さが観測される。分子の並進運動の速さは、測定された蛍光強度の時間を変数とした自己相関関数の形状に反映される（以下の実施例に於ける測定結果を参照）。分子の並進運動の速さの指標としては、測定開始時から自己相関関数の値が半分になるまでの時間の長さ（並進拡散時間）が用いられる。分子の移動は、分子の大きさが小さいほど、速くなるので、並進拡散時間が短くなる。本発明の場合、試験ＤＮＡが切断されると、蛍光標識の付加されているＤＮＡ分子の長さが短くなり、従って、並進拡散時間が短くなるので、このことから、試験ＤＮＡの切断の有無が判定される。なお、試験ＤＮＡが切断されていない状態の並進拡散時間は、予め、ＤＮＡが切断されていないことが分かっている対照試料、或いは、メチル化感受性作用物質を添加する前の試験ＤＮＡにより測定されていてよい。   In fluorescence correlation spectroscopy, the speed of movement (translational movement) of molecules passing through a minute fluorescence observation region by Brownian motion is observed. The speed of the translational movement of the molecule is reflected in the shape of the autocorrelation function with the measured fluorescence intensity time as a variable (see the measurement results in the following examples). As an index of the translational speed of the molecule, the length of time (translational diffusion time) from the start of measurement until the autocorrelation function value is halved is used. Since the movement of the molecule is faster as the size of the molecule is smaller, the translational diffusion time is shortened. In the case of the present invention, when the test DNA is cleaved, the length of the DNA molecule to which the fluorescent label is added is shortened, and therefore the translational diffusion time is shortened. Determined. Note that the translational diffusion time when the test DNA is not cleaved is measured in advance with a control sample that is known not to cleave the DNA, or with the test DNA before the addition of a methylation-sensitive agent. It's okay.

蛍光偏光解消法では、この分野に於いて知られている如く、分子の回転ブラウン運動（自転）の速さが観測される。分子の回転運動の速さは、測定された蛍光の縦偏光と横偏光の強度の割合又は偏光度に反映される。分子の回転は、分子の大きさが小さいほど、速くなるので、偏光度が小さくなる。本発明の場合、試験ＤＮＡが切断されると、蛍光標識の付加されているＤＮＡ分子の長さが短くなり、従って、回転運動が速くなり、偏光度が下がるので、このことから、試験ＤＮＡの切断の有無が判定される。なお、試験ＤＮＡが切断されていない状態の偏光度は、予め、ＤＮＡが切断されていないことが分かっている対照試料、或いは、メチル化感受性作用物質を添加する前の試験ＤＮＡにより測定されていてよい。   In fluorescence depolarization, as is known in the art, the speed of rotational Brownian motion (rotation) of molecules is observed. The speed of the rotational movement of the molecule is reflected in the measured ratio between the intensity of longitudinally polarized light and transversely polarized light, or the degree of polarization. Since the rotation of the molecule becomes faster as the size of the molecule is smaller, the degree of polarization becomes smaller. In the case of the present invention, when the test DNA is cleaved, the length of the DNA molecule to which the fluorescent label is added is shortened, and thus the rotational movement is accelerated and the degree of polarization is reduced. The presence or absence of cutting is determined. Note that the degree of polarization when the test DNA is not cleaved is measured in advance using a control sample that is known not to cleave the DNA, or the test DNA before the addition of a methylation-sensitive agent. Good.

なお、既に述べた如く、試験ＤＮＡは、好ましくは、蛍光標識部位とメチル化部位との距離がＤＮＡ全長の半分よりも短くなるよう構成されているので、試験ＤＮＡが切断されている場合とそうでない場合の蛍光標識されたＤＮＡ分子の長さの差が大きくなっている。かかる長さの差により、上記の蛍光強度測定に於いて、分子の運動状態の差が感度よく検出できるようになることは理解されるべきである。   As already mentioned, the test DNA is preferably constructed so that the distance between the fluorescent labeling site and the methylation site is shorter than half of the total DNA length. If not, the difference in length of the fluorescently labeled DNA molecules is large. It should be understood that such a difference in length makes it possible to detect a difference in the movement state of molecules with high sensitivity in the above-described fluorescence intensity measurement.

試験ＤＮＡに二種類の蛍光標識がメチル化部位を挟んで付加されている場合、試験ＤＮＡが切断されると、二つの蛍光標識の付加されているＤＮＡ分子が分離することとなる。従って、試験ＤＮＡの切断の有無は、二つの蛍光標識の挙動が独立であるか相関があるかを検出することにより判定することができる。そこで、この場合には、蛍光相互相関分光法を有利に用いることができる。   When two types of fluorescent labels are added to the test DNA across the methylation site, when the test DNA is cleaved, the DNA molecules to which the two fluorescent labels are added are separated. Therefore, the presence or absence of cleavage of the test DNA can be determined by detecting whether the behaviors of the two fluorescent labels are independent or correlated. Therefore, in this case, fluorescence cross-correlation spectroscopy can be advantageously used.

蛍光相互相関分光法では、この分野に於いて知られている如く、二つの発光波長の異なる蛍光標識が微小の蛍光観察領域をブラウン運動により通過する際に、各々の標識の蛍光強度の変化から二つの蛍光標識の運動に相関があるか否かを判定することができる。もし蛍光標識が一つの担体（分子）に存在する場合には、二つの蛍光強度の変化が一体的に変化するが、蛍光標識が別々の担体に存在する場合には、二つの蛍光強度の変化は、独立に変化することとなる。蛍光標識が一つの担体に乗っているか否かは、二つの蛍光強度の相互相関関数から判定することができる。本発明の場合、試験ＤＮＡが切断されれば、二つの標識は別々に運動することとなり、試験ＤＮＡが切断されずに二つの標識が一体的に運動する場合に比して相互相関関数の値が顕著な低くなるので、かかる相互相関関数の顕著な差により、試験ＤＮＡの切断の有無が判定される   In fluorescence cross-correlation spectroscopy, as is known in the art, when two fluorescent labels having different emission wavelengths pass through a minute fluorescence observation region by Brownian motion, the change in fluorescence intensity of each label is detected. It can be determined whether there is a correlation between the movements of the two fluorescent labels. If the fluorescent label is present on one carrier (molecule), the change in the two fluorescent intensities changes together, but if the fluorescent label is present on a separate carrier, the two fluorescent intensity changes Will change independently. Whether or not the fluorescent label is on one carrier can be determined from the cross-correlation function of the two fluorescent intensities. In the case of the present invention, if the test DNA is cleaved, the two labels move separately, and the value of the cross-correlation function is compared to the case where the two labels move together without cleaving the test DNA. Is markedly lower, and the significant difference in the cross-correlation function determines the presence or absence of cleavage of the test DNA.

かくして、上記の如き、蛍光測定に基づいて試験ＤＮＡの切断の有無が判定されると、被検物質のメチル化阻害作用の有無が判定される（ステップ７−９）。メチル化感受性作用物質が非メチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、試験ＤＮＡの切断が検出された場合、被検物質のメチル化阻害作用が有りと判定され、試験ＤＮＡの切断が検出されない場合、被検物質のメチル化阻害作用が無しと判定される。また、メチル化感受性作用物質がメチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、試験ＤＮＡの切断が検出された場合、被検物質のメチル化阻害作用が無しと判定され、試験ＤＮＡの切断が検出されない場合、被検物質のメチル化阻害作用が有りと判定される。   Thus, when the presence or absence of cleavage of the test DNA is determined based on the fluorescence measurement as described above, the presence or absence of the methylation inhibitory action of the test substance is determined (step 7-9). If the methylation-sensitive agent is capable of cleaving a methylated site in an unmethylated state, it is determined that the test substance has a methylation-inhibiting action when cleavage of the test DNA is detected, and the test DNA is cleaved. If is not detected, it is determined that the test substance has no methylation-inhibiting action. In addition, if the methylation-sensitive agent cleaves a methylated site in the methylation state, if cleavage of the test DNA is detected, it is determined that there is no methylation-inhibiting action of the test substance, and the test DNA When cleavage is not detected, it is determined that the test substance has a methylation-inhibiting action.

ところで、上記の実施形態の一連の過程は、或る酵素について、ＤＮＡのメチル化活性があるか否かを判定するためにも用いることができる。その場合、ステップ１のメチル化阻害作用の有無が判定される被検物質と試験ＤＮＡの混合は行われず、ステップ２のメチル化酵素を添加する際、ＤＮＡのメチル化活性があるか否かを判定されるべき被検酵素が添加される。一連の処理の後、試験ＤＮＡの切断の有無が判定されると、ＤＮＡのメチル化活性の有無が判定される。メチル化感受性作用物質が非メチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、試験ＤＮＡの切断が検出された場合、被検酵素のメチル化活性が無しと判定され、試験ＤＮＡの切断が検出されない場合、被検酵素のメチル化活性が有りと判定される（メチル化感受性作用物質がメチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、上記の逆の判定が為される。）。   By the way, the series of processes of the above embodiment can be used to determine whether or not a certain enzyme has DNA methylation activity. In that case, the test substance for which the presence or absence of the methylation inhibitory effect of Step 1 is determined is not mixed with the test DNA, and whether or not there is DNA methylation activity when adding the methylating enzyme of Step 2 The test enzyme to be determined is added. When the presence or absence of cleavage of the test DNA is determined after a series of treatments, the presence or absence of DNA methylation activity is determined. If the methylation-sensitive agent is capable of cleaving a methylation site in an unmethylated state, if cleavage of the test DNA is detected, it is determined that the test enzyme has no methylation activity, and the test DNA is cleaved. If not detected, it is determined that the test enzyme has methylation activity (if the methylation-sensitive agent cleaves a methylated site in the methylated state, the above determination is reversed). .

また、予めメチル化された試験ＤＮＡを用いれば、上記の実施形態の一連の過程は、任意のタンパク質等の物質の脱メチル化酵素活性の検査にも用いることができる。その場合、まず、試験ＤＮＡとしては、メチル化部位がメチル化されているＤＮＡが使用される。そして、ステップ１のメチル化阻害作用の有無が判定される被検物質と試験ＤＮＡの混合は行われず、ステップ２のメチル化酵素を添加するのに代えて、ＤＮＡの脱メチル化活性があるか否かを判定されるべき被検酵素が添加される。一連の処理の後、試験ＤＮＡの切断の有無が判定されると、ＤＮＡの脱メチル化活性の有無が判定される。メチル化感受性作用物質が非メチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、試験ＤＮＡの切断が検出された場合、被検酵素の脱メチル化活性が有りと判定され、試験ＤＮＡの切断が検出されない場合、被検酵素の脱メチル化活性が無しと判定される（メチル化感受性作用物質がメチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、上記の逆の判定が為される。）。   In addition, if a test DNA that has been methylated in advance is used, the series of processes of the above-described embodiment can also be used for testing demethylase activity of a substance such as an arbitrary protein. In that case, first, as the test DNA, DNA in which the methylation site is methylated is used. Then, the test substance to be tested for the presence or absence of methylation inhibitory activity in step 1 is not mixed with the test DNA, and instead of adding the methylating enzyme in step 2, there is DNA demethylation activity. A test enzyme to be determined is added. When it is determined whether or not the test DNA is cleaved after a series of treatments, the presence or absence of DNA demethylation activity is determined. If the methylation-sensitive agent cleaves a methylated site in an unmethylated state, if cleavage of the test DNA is detected, it is determined that the test enzyme has demethylation activity and the test DNA is cleaved. Is not detected, it is determined that the test enzyme has no demethylation activity (if the methylation-sensitive agent cleaves a methylated site in the methylated state, the above determination is reversed) .)

更に、上記の実施形態の図１の一連の過程は、或る物質について、ＤＮＡの脱メチル化酵素の脱メチル化作用を阻害する作用があるか否かを判定するためにも用いることができる。その場合、試験ＤＮＡとしては、メチル化部位がメチル化されているＤＮＡが使用される。そして、脱メチル化阻害作用の有無が判定される被検物質と試験ＤＮＡの混合の後、ステップ２に於いて、脱メチル化酵素が添加される。一連の処理の後、試験ＤＮＡの切断の有無が判定されると、被検物質の脱メチル化阻害作用の有無が判定される。メチル化感受性作用物質が非メチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、試験ＤＮＡの切断が検出された場合、被検物質の脱メチル化阻害作用が無しと判定され、試験ＤＮＡの切断が検出されない場合、被検物質の脱メチル化阻害作用が有りと判定される（メチル化感受性作用物質がメチル化状態のメチル化部位を切断するものであれば、上記の逆の判定が為される。）。   Furthermore, the series of processes in FIG. 1 of the above embodiment can also be used to determine whether a substance has an action of inhibiting the demethylation action of DNA demethylase. . In that case, as test DNA, DNA in which the methylation site is methylated is used. Then, after mixing the test substance for which the presence or absence of the demethylation inhibitory action is determined and the test DNA, in step 2, demethylase is added. When the presence or absence of cleavage of the test DNA is determined after a series of treatments, the presence or absence of the demethylation inhibitory action of the test substance is determined. If the methylation-sensitive agent cleaves a methylation site in an unmethylated state, if cleavage of the test DNA is detected, it is determined that the test substance has no demethylation inhibitory activity, and the test DNA If cleavage is not detected, it is determined that the test substance has demethylation inhibitory action (if the methylation sensitive substance cleaves a methylated site in the methylated state, the above determination is reversed. .)

上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。   In order to verify the effectiveness of the present invention described above, the following experiment was conducted. It should be understood that the following examples illustrate the effectiveness of the present invention and do not limit the scope of the present invention.

１つの蛍光標識が付加された試験ＤＮＡを用いたＤＮＡメチル化阻害物質のメチル化阻害作用の判定
１つの蛍光標識が付加された試験ＤＮＡを用いて、上記の処理過程に従って、被検物質のＤＮＡメチル化阻害作用の有無の判定を行った。 Determination of the methylation inhibitory action of a DNA methylation inhibitor using a test DNA to which one fluorescent label has been added Using the test DNA to which one fluorescent label has been added, the test substance DNA The presence or absence of methylation inhibitory effect was determined.

試験ＤＮＡの調製
以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとTAMRA（カルボキシテトラメチルローダミン）にて一端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（いずれもシグマジェノシスより入手）を会合させ二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡを調製した。
オリゴヌクレオチド 5’GCCATGTACCCTCGACACAA3’
蛍光標識オリゴヌクレオチド 5’(TAMRA)TTGTGTCGAGGGTACATGGC3’
なお、下線を付したＣＧがメチル化部位である。
会合の手順は、以下の通りである。オリゴヌクレオチド、蛍光標識オリゴヌクレオチドをそれぞれＴＥバッファ(１ mM EDTA, １０ mM Tris-HCl)で希釈し５０ mMとした。次いで、オリゴヌクレオチド１０μｌ、蛍光標識オリゴヌクレオチド１０μｌ、TEバッファ８０μｌを混ぜ、９５℃で１０分間反応させた後、ゆっくり冷却してオリゴヌクレオチドを会合させ二本鎖ＤＮＡを生成した。この反応液にエキソヌクレアーゼ(タカラバイオより入手)を添加して、３７℃で反応させることにより未反応のオリゴヌクレオチドを分解した後、MERmaid SPIN kit (QBioGene, USAより入手)で精製することにより試験ＤＮＡの純度を高め、高感度の解析が出来るようにした。会合させた状態の試験ＤＮＡの塩基配列は、以下の通りである。
(TAMRA)TTGTGTCGAGGGTACATGGC
AACACAGCTCCCATGTACCG
（下線部がメチル化部位） Preparation of test DNA Test DNA which is a double-stranded DNA by associating an oligonucleotide having the following base sequence with an oligonucleotide fluorescently labeled at one end with TAMRA (carboxytetramethylrhodamine) (both obtained from Sigma Genosis) Was prepared.
Oligonucleotide 5'GCCATGTACCCT CG ACACAA3 '
Fluorescently labeled oligonucleotide 5 '(TAMRA) TTGTGT CG AGGGTACATGGC3'
The underlined CG is a methylation site.
The meeting procedure is as follows. Oligonucleotide and fluorescently labeled oligonucleotide were each diluted with TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl) to 50 mM. Subsequently, 10 μl of oligonucleotide, 10 μl of fluorescently labeled oligonucleotide, and 80 μl of TE buffer were mixed and reacted at 95 ° C. for 10 minutes, and then slowly cooled to associate the oligonucleotides to produce double-stranded DNA. To this reaction solution, exonuclease (obtained from Takara Bio Inc.) was added and reacted at 37 ° C to decompose the unreacted oligonucleotide, followed by purification with MERmaid SPIN kit (obtained from QBioGene, USA). The purity of DNA was increased to enable highly sensitive analysis. The base sequence of the test DNA in the associated state is as follows.
(TAMRA) TTGTGT CG AGGGTACATGGC
AACACA GC TCCCATGTACCG
(Underlined part is methylation site)

試験ＤＮＡのメチル化（ステップ１−３）
試験ＤＮＡに、被検物質として（ＤＮＡメチル化阻害作用があることが知られている）5-アザデオキシシチジン（Sigma Aldrich）を混合した。また対照試料として、ＤＮＡメチル化阻害作用のないMicrocin SF608を試験ＤＮＡに混合したものを調製した。手順は、以下の通りである。試験ＤＮＡを反応バッファ（５０mM NaCl,１０mMTris-HCl,１０mM MgCl2,１mM dithiothreitol）に溶解し、ＤＮＡ濃度が５ｎＭとなるようにした。被検試料には、5-アザデオキシシを、対照試料には、Microcin SF608を、それぞれ１μＭとなるよう加えて、それぞれ３７℃にて３０分、インキュベーションを行った。 Methylation of test DNA (Step 1-3)
Test DNA was mixed with 5-azadeoxycytidine (Sigma Aldrich) as a test substance (known to have a DNA methylation inhibitory effect). As a control sample, a mixture of Microcin SF608 having no DNA methylation inhibitory effect and test DNA was prepared. The procedure is as follows. The test DNA was dissolved in a reaction buffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol) so that the DNA concentration was 5 nM. 5-azadeoxy was added to the test sample, and Microcin SF608 was added to the control sample to 1 μM, respectively, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.

しかる後に、これらの試料にＤＮＡメチル化酵素であるCpGメチラーゼ(New England Biolabsより入手)を２０Ｕ加え、その基質となるS-アデノシルメチオニン（Sigma Aldrichより入手）を濃度が１６０μＭとなるよう加えた。かかる試料は、次いで、３７℃で１時間インキュベーションを行い、酵素のＤＮＡのメチル化反応を促進させた。   Thereafter, 20 U of CpG methylase (obtained from New England Biolabs), a DNA methylating enzyme, was added to these samples, and S-adenosylmethionine (obtained from Sigma Aldrich) as its substrate was added to a concentration of 160 μM. . Such samples were then incubated for 1 hour at 37 ° C. to promote the enzymatic DNA methylation reaction.

メチル化感受性制限酵素による非メチル化部位の切断（ステップ４−５）
かくして、ＤＮＡメチル化酵素処理を施した被検試料と対照試料を、メチル化されていないＤＮＡを切断し、メチル化されたＤＮＡを切断しないメチル化感受性制限酵素にて処理した。手順は、以下の通りである。被検試料と対照試料を、１０ｎＭとなるように、反応バッファ（５０mM NaCl,１０mM Tris-HCl,１０mM MgCl2,１mM dithiothreitol）に溶解し、これに、メチル化感受性制限酵素AccI（タカラバイオ） ５Ｕを加え、３７℃にて１時間、インキュベーションした。 Cleavage of unmethylated site by methylation sensitive restriction enzyme (step 4-5)
Thus, the test sample and the control sample subjected to the DNA methylase treatment were treated with a methylation sensitive restriction enzyme that cleaves unmethylated DNA and does not cleave methylated DNA. The procedure is as follows. The test sample and the control sample were dissolved in a reaction buffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol) so as to have a concentration of 10 nM, and this was added to methylation sensitive restriction enzyme AccI (Takara Bio) 5U. And incubated at 37 ° C. for 1 hour.

上記のメチル化感受性制限酵素処理により、被検試料（メチル化阻害作用有り）に於いては、試験ＤＮＡは、非メチル化状態にあると考えられるので、メチル化部位で切断されることとなる。   As a result of the above-mentioned methylation-sensitive restriction enzyme treatment, the test DNA is considered to be in an unmethylated state in the test sample (with methylation inhibitory action), so that it is cleaved at the methylation site. .

蛍光相関分光法による計測（ステップ６）
メチル化感受性制限酵素処理された被検試料と対照試料及びメチル化感受性制限酵素処理していない被検試料について、共焦点顕微鏡の光学系を備えた１分子蛍光分析システム ＭＦ２０（オリンパス）を用いて、蛍光相関分光法により、蛍光強度測定を行った。測定に於いては、被検試料と対照試料は、それぞれ、試験ＤＮＡ濃度が１ｎＭになるよう希釈し、計測時間を１試料につき、１５秒（５秒×３回）とした。 Measurement by fluorescence correlation spectroscopy (step 6)
For a test sample treated with methylation-sensitive restriction enzyme, a control sample, and a test sample not treated with methylation-sensitive restriction enzyme, a single-molecule fluorescence analysis system MF20 (Olympus) equipped with an optical system of a confocal microscope was used. The fluorescence intensity was measured by fluorescence correlation spectroscopy. In the measurement, each of the test sample and the control sample was diluted so that the test DNA concentration was 1 nM, and the measurement time was 15 seconds (5 seconds × 3 times) per sample.

図３は、蛍光相関分光法により、制限酵素処理していない被検試料（曲線Ａ）と、Microcin SF608を添加した対照試料（曲線Ｂ）と、5-アザデオキシシチジン添加の被検試料（曲線Ｃ）から得られた自己相関曲線をそれぞれ示している。同図を参照して、理解される如く、制限酵素処理していない被検試料とMicrocin SF608を添加した対照試料の自己相関曲線の形状は、概ね一致するが、5-アザデオキシシチジン添加の被検試料の自己相関曲線の形状は、他の試料の自己相関曲線に比べ左にシフトしていることがわかる。各試料の並進拡散時間は、以下の通りであった。
制限酵素処理していない被検試料 ８５３μ秒
Microcin SF608を添加した対照試料 ８４０μ秒
5-アザデオキシシチジン添加の被検試料 ４７６μ秒
既に述べた如く、蛍光標識の付加されたＤＮＡ分子が小さくなると、分子の移動速度が速くなることから、自己相関曲線は速く低減し、並進拡散時間は短くなる。従って、上記の結果は、5-アザデオキシシチジン添加の被検試料に於いて、ＤＮＡが切断されていることを示している。即ち、5-アザデオキシシチジンの存在下では、メチル化酵素のＤＮＡのメチル化が阻害されたことを示す。かくして、本発明の蛍光相関分光法を採用した方法により、被検物質がＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質であることが示された。 FIG. 3 shows a test sample not subjected to restriction enzyme treatment (curve A), a control sample added with Microcin SF608 (curve B), and a test sample added with 5-azadeoxycytidine (curve) by fluorescence correlation spectroscopy. The autocorrelation curves obtained from C) are shown respectively. As can be seen from the figure, the shape of the autocorrelation curve of the test sample not treated with restriction enzyme and the control sample to which Microcin SF608 was added generally coincided, but the sample to which 5-azadeoxycytidine was added were identical. It can be seen that the shape of the autocorrelation curve of the test sample is shifted to the left as compared with the autocorrelation curves of the other samples. The translation diffusion time of each sample was as follows.
Test sample not treated with restriction enzyme 853 μs
Control sample with Microcin SF608 added 840 μs
Test sample added with 5-azadeoxycytidine 476 μs As already mentioned, as the fluorescently labeled DNA molecule becomes smaller, the movement speed of the molecule increases, so the autocorrelation curve decreases rapidly and the translational diffusion time Becomes shorter. Therefore, the above results indicate that the DNA is cleaved in the test sample added with 5-azadeoxycytidine. That is, in the presence of 5-azadeoxycytidine, it indicates that methylation of methylation enzyme DNA was inhibited. Thus, it was shown that the test substance is an inhibitor that inhibits DNA methylation by the method employing the fluorescence correlation spectroscopy of the present invention.

蛍光偏光解消法による計測（ステップ６）
メチル化感受性制限酵素処理された被検試料と対照試料及びメチル化感受性制限酵素処理していない被検試料について、１分子蛍光分析システム ＭＦ２０（オリンパス）を用いて、蛍光偏光解消法により、蛍光強度測定を行った。測定に於いては、被検試料と対照試料は、それぞれ、試験ＤＮＡ濃度が１ｎＭになるよう希釈し、計測時間を１試料につき、３秒（１秒×３回）とした。測定値は、ｍＰ値（縦偏光と横偏光の強度の差分を縦偏光と横偏光の和で割った値の１０００倍に相当する）である。 Measurement by fluorescence depolarization method (Step 6)
Fluorescence intensity of a test sample treated with methylation-sensitive restriction enzyme, a control sample, and a test sample not treated with methylation-sensitive restriction enzyme by fluorescence depolarization using a single molecule fluorescence analysis system MF20 (Olympus) Measurements were made. In the measurement, the test sample and the control sample were each diluted so that the test DNA concentration was 1 nM, and the measurement time was 3 seconds (1 second × 3 times) per sample. The measured value is an mP value (corresponding to 1000 times the value obtained by dividing the difference in intensity between the longitudinally polarized light and the horizontally polarized light by the sum of the vertically polarized light and the horizontally polarized light).

各試料のｍＰ値は、以下の通りであった。
制限酵素処理していない被検試料 ２８３
Microcin SF608を添加した対照試料 ２７９
5-アザデオキシシチジン添加の被検試料 １２４
既に述べた如く、蛍光標識の付加されたＤＮＡ分子が小さくなると、分子の回転ブラウン運動が速くなることから、ｍＰ値は低減する。従って、上記の結果は、5-アザデオキシシチジン添加の被検試料に於いて、ＤＮＡが切断されていることを示している。即ち、5-アザデオキシシチジンの存在下では、ＤＮＡが非メチル化状態にあり、メチル化酵素のＤＮＡのメチル化が阻害されたことを示す。かくして、本発明の蛍光偏光解消法を採用した方法によっても、被検物質がＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質であることが示された。 The mP value of each sample was as follows.
Test sample not treated with restriction enzyme 283
Control sample with Microcin SF608 added 279
Test sample with 5-azadeoxycytidine added 124
As already mentioned, when the fluorescently labeled DNA molecule becomes smaller, the rotational Brownian motion of the molecule becomes faster and the mP value decreases. Therefore, the above results indicate that the DNA is cleaved in the test sample added with 5-azadeoxycytidine. That is, in the presence of 5-azadeoxycytidine, the DNA was in an unmethylated state, indicating that methylation of the methylase enzyme DNA was inhibited. Thus, it was shown that the test substance was an inhibitor that inhibits DNA methylation even by the method employing the fluorescence depolarization method of the present invention.

２つの発光波長の異なる蛍光標識が付加された試験ＤＮＡを用いたＤＮＡメチル化阻害物質のメチル化阻害作用の判定
２つの発光波長の異なる蛍光標識が付加された試験ＤＮＡを用いて、上記の処理過程に従って、被検物質のＤＮＡメチル化阻害作用の有無の判定を行った。 Determination of methylation inhibitory action of a DNA methylation inhibitor using a test DNA to which two fluorescent labels having different emission wavelengths are added The above treatment using a test DNA to which two fluorescent labels having different emission wavelengths are added According to the process, the presence or absence of a DNA methylation inhibitory effect of the test substance was determined.

試験ＤＮＡの調製
以下の塩基配列を有するTAMRA（カルボキシテトラメチルローダミン）にて一端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（シグマジェノシスより入手）とAlexa647にて一端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（日本バイオサービスより入手）を会合させ二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡを調製した。
蛍光標識オリゴヌクレオチド 5’(alexa647)GCCATGTACCCTCGACACAA3’
蛍光標識オリゴヌクレオチド 5’(TAMRA)TTGTGTCGAGGGTACATGGC3’
なお、下線を付したＣＧがメチル化部位である。
会合の手順は、実施例１と同様である。会合させた状態の試験ＤＮＡの塩基配列は、以下の通りである。
(TAMRA)TTGTGTCGAGGGTACATGGC
AACACAGCTCCCATGTACCG(alexa647)
（下線部がメチル化部位） Preparation of test DNA Oligonucleotide fluorescently labeled at one end with TAMRA (carboxytetramethylrhodamine) having the following base sequence (obtained from Sigma Genosys) and oligonucleotide fluorescently labeled at one end with Alexa647 (Nippon Bioservices) To obtain a test DNA which is a double-stranded DNA.
Fluorescently labeled oligonucleotide 5 '(alexa647) GCCATGTACCCT CG ACACAA3'
Fluorescently labeled oligonucleotide 5 '(TAMRA) TTGTGT CG AGGGTACATGGC3'
The underlined CG is a methylation site.
The meeting procedure is the same as in Example 1. The base sequence of the test DNA in the associated state is as follows.
(TAMRA) TTGTGTCGAGGGTACATGGC
AACACAGCTCCCATGTACCG (alexa647)
(Underlined part is methylation site)

以後の試験ＤＮＡのメチル化（ステップ１−３）とメチル化感受性制限酵素による非メチル化部位の切断（ステップ４−５）は、実施例１と同様とした。   Subsequent methylation of the test DNA (step 1-3) and cleavage of the unmethylated site with a methylation sensitive restriction enzyme (step 4-5) were the same as in Example 1.

蛍光相互相関分光法による計測（ステップ６）
メチル化感受性制限酵素処理された被検試料と対照試料について、１分子蛍光分析システム ＭＦ２０（オリンパス）を用いて、蛍光相互相関分光法により、蛍光強度測定を行った。測定に於いては、被検試料と対照試料は、それぞれ、試験ＤＮＡ濃度が０．１ｎＭになるよう希釈し、計測時間を１試料につき、１５秒（５秒×３回）とした。 Measurement by fluorescence cross-correlation spectroscopy (Step 6)
For the test sample and the control sample treated with the methylation-sensitive restriction enzyme, the fluorescence intensity was measured by fluorescence cross-correlation spectroscopy using a single molecule fluorescence analysis system MF20 (Olympus). In the measurement, each of the test sample and the control sample was diluted so that the test DNA concentration was 0.1 nM, and the measurement time was 15 seconds (5 seconds × 3 times) per sample.

図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、5-アザデオキシシチジン添加の被検試料、Microcin SF608を添加した対照試料から得られた蛍光相互相関分光法によるalexa647とTAMRAの蛍光強度の相互相関関数を示している。相互相関関数は、二つの蛍光強度の時間変化に相関がない場合には１となる。被検試料と対照試料との相互相関曲線の形状を比較して、対照試料は、相関値が１より大きいのに対し、被検試料は、相関値が略１に推移した。従って、被検試料では、alexa647とTAMRAの運動には相関が独立したものであり、対照試料では、alexa647とTAMRAの運動に或る程度の相関が在り、alexa647とTAMRAが同一の担体に乗っていることが示唆される。即ち、前者では、試験ＤＮＡが切断され、alexa647とTAMRAとが互いに独立に運動し、後者では、試験ＤＮＡが切断されずに保存されていることとなる。今回の実験系ではメチル化されていないＤＮＡが切断されるので、被検試料では、5-アザデオキシシチジンにより、メチル化酵素のＤＮＡのメチル化が阻害されたことを示す。かくして、本発明の蛍光相互相関分光法を採用した方法により、被検物質がＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質であることが示された。   4 (A) and 4 (B) show the cross-correlation between the fluorescence intensities of alexa647 and TAMRA by fluorescence cross-correlation spectroscopy obtained from the test sample added with 5-azadeoxycytidine and the control sample added with Microcin SF608, respectively. Indicates a function. The cross-correlation function is 1 when there is no correlation between the two fluorescence intensity changes over time. Comparing the shape of the cross-correlation curve between the test sample and the control sample, the control sample had a correlation value greater than 1, whereas the test sample had a correlation value of approximately 1. Therefore, in the test sample, the correlation between the movements of alexa647 and TAMRA is independent, and in the control sample, there is some correlation between the movements of alexa647 and TAMRA, and alexa647 and TAMRA are on the same carrier. It is suggested that That is, in the former, the test DNA is cleaved and alexa647 and TAMRA move independently from each other, and in the latter, the test DNA is stored without being cleaved. Since the unmethylated DNA is cleaved in this experimental system, the test sample shows that methylation of the methylating enzyme DNA was inhibited by 5-azadeoxycytidine. Thus, by the method employing the fluorescence cross-correlation spectroscopy of the present invention, it was shown that the test substance is an inhibitor that inhibits DNA methylation.

上記の実施例の結果は、メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡを用いて、一連の反応を施した後、メチル化感受性作用物質による試験ＤＮＡの切断の有無を試験ＤＮＡの蛍光測定に基づいて決定することができ、これにより、或る酵素がメチル化活性若しくは脱メチル化活性を有しているか否か、又は或る物質が酵素のメチル化若しくは脱メチル化の阻害作用を有しているか否かを判定することができることを示している。また、上記実施例に於いて特記されるべきことは、被検試料のＤＮＡ濃度が０．１乃至１ｎＭというごく微量でよく、検出に要する時間も３−１５秒と非常に短時間で計測が可能である点である。上記の方法によれば、多数の被検物質について、各被検物質がＤＮＡメチル化阻害剤であるか否かのスクリーニングを容易に行うことができる。同様に、ＤＮＡメチル化酵素若しくはＤＮＡ脱メチル化酵素のスクリーニング又はＤＮＡ脱メチル化阻害剤のスクリーニングも容易に行うことができる。   The results of the above examples show that, after performing a series of reactions using a test DNA that is a double-stranded DNA having a restriction enzyme recognition site including a methylation site and having a fluorescent label added thereto, methylation sensitivity is obtained. The presence or absence of cleavage of the test DNA by the agent can be determined based on fluorescence measurements of the test DNA, thereby determining whether an enzyme has methylation activity or demethylation activity, or It shows that it can be determined whether or not a substance has an inhibitory action on methylation or demethylation of an enzyme. Also, what should be noted in the above examples is that the DNA concentration of the test sample may be a very small amount of 0.1 to 1 nM, and the time required for detection is 3-15 seconds, which can be measured in a very short time. That is possible. According to the above method, it is possible to easily perform screening for a large number of test substances to determine whether or not each test substance is a DNA methylation inhibitor. Similarly, screening for DNA methylase or DNA demethylase or screening for DNA demethylation inhibitors can be easily performed.

図１は、本発明の方法の好ましい実施形態に於ける処理過程をフローチャートの形式にて示したものである。FIG. 1 is a flowchart showing the processing steps in a preferred embodiment of the method of the present invention. 図２は、図１の実施形態の処理過程中に於けるＤＮＡ分子の構造の変化を模式的に表したものである。FIG. 2 schematically shows changes in the structure of the DNA molecules during the process of the embodiment of FIG. 図３は、実施例１に於ける試料の蛍光相関分光法により得られた蛍光強度の自己相関関数値を表すグラフ図である。FIG. 3 is a graph showing the autocorrelation function value of the fluorescence intensity obtained by fluorescence correlation spectroscopy of the sample in Example 1. 図４は、実施例２に於ける試料の蛍光相互相関分光法により得られた蛍光標識alexa647とTAMRAの蛍光強度の相互相関関数値を表すグラフ図である。（Ａ）は、被検試料についての結果であり、（Ｂ）は、対照試料についての結果である。FIG. 4 is a graph showing the cross-correlation function values of the fluorescence intensities of the fluorescent labels alexa647 and TAMRA obtained by the fluorescence cross-correlation spectroscopy of the sample in Example 2. (A) is the result for the test sample, and (B) is the result for the control sample.

Claims (14)

ＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質を検出する方法であって、
メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡと、ＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質であるか否かが判定されるべき被検物質と、ＤＮＡメチル化酵素とを混合する過程と、
その後、非メチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれかを選択的に切断するメチル化感受性作用物質を前記試験ＤＮＡに作用させる過程と、
前記メチル化感受性制限酵素を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程と、
前記蛍光強度に基づいて前記試験ＤＮＡが前記メチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程とを含み、
前記試験ＤＮＡが切断されたか否かにより前記被検物質がＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質であるか否かを判定することを特徴とする方法。 A method for detecting an inhibitor that inhibits DNA methylation,
A test DNA that is a double-stranded DNA having a restriction enzyme recognition site including a methylation site and to which a fluorescent label is added, and a test to determine whether the substance is an inhibitor that inhibits DNA methylation Mixing a substance with a DNA methylase;
Thereafter, a methylation-sensitive agent that selectively cleaves either a restriction enzyme recognition site containing the methylation site in an unmethylated state or a restriction enzyme recognition site containing the methylation site in a methylation state is used as the test DNA. The process of acting on
Measuring the fluorescence intensity of the test DNA to which the methylation sensitive restriction enzyme is allowed to act;
Determining whether the test DNA has been cleaved by the methylation sensitive agent based on the fluorescence intensity,
A method for determining whether or not the test substance is an inhibitor that inhibits DNA methylation based on whether or not the test DNA is cleaved. 請求項１の方法であって、前記メチル化感受性作用物質が、非メチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位を切断するメチル化感受性作用物質であり、前記蛍光強度に基づいて前記試験ＤＮＡが前記メチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程に於いて、前記試験ＤＮＡが切断されたと判定された場合に、前記被検物質がＤＮＡのメチル化を阻害する阻害物質であると判定することを特徴とする方法。   The method according to claim 1, wherein the methylation-sensitive agent is a methylation-sensitive agent that cleaves a restriction enzyme recognition site including the methylation site in an unmethylated state, and the methylation-sensitive agent is based on the fluorescence intensity. In the process of determining whether or not the test DNA is cleaved by the methylation-sensitive agent, the test substance inhibits DNA methylation when the test DNA is determined to be cleaved It is determined that it is. 請求項１の方法であって、前記試験ＤＮＡに、少なくとも二種類の蛍光標識が付加されていることを特徴とする方法。   2. The method according to claim 1, wherein at least two kinds of fluorescent labels are added to the test DNA. 請求項１の方法であって、前記試験ＤＮＡに於いて前記メチル化部位と前記蛍光標識の付加された部位との距離が前記試験ＤＮＡの長さの半分以下であることを特徴とする方法。   2. The method according to claim 1, wherein a distance between the methylation site and the fluorescent-labeled site in the test DNA is not more than half of the length of the test DNA. 請求項１の方法であって、前記メチル化感受性作用物質が、Aat II、Acc I、Acc II、Aci I、Afa I、Afl II、Alu I、Aor13H I、Aor51H I、Apa I、ApaL I、Ava I、Ava II、Bal I、BamH I、Ban II、Bbe I、Bcn I、Bgl I、Bgl II、Bln I、BmeT110 I、BmgT120 I、Bpu1102 I、BspT104 I、BspT107 I、Bsp1286 I、Bsp1407 I、BssH II、BspD I、BstP I、BstU I、BstX I、Bst1107 I、Cfr10 I、Cfr13 I、Cla I、Cpo I、Dra I、Eae I、Eag I、Eam1105 I、EcoO65 I、EcoO109 I、EcoR I、EcoR V、EcoT14 I、EcoT22 I、Eco52 I、Eco81 I、Fba I、Fok I、Fse I、Hae II、Hae III、Hap II、Hha I、Hinc II、Hind III、Hinf I、Hin1 I、Hpa II、HpyCH4 IV、Kas I、Kpn I、Mbo I、Mbo II、Mfl I、Mlu I、Msp I、Mun I、Mva I、Nae I、NegM IV、Nco I、Nde I、Nhe I、Not I、Nru I、Nsb I、PmaC I、PshA I、PshB I、Psp1406 I、Pst I、Pvu I、Pvu II、Sac I、Sac II、Sal I、Sca I、Sfi I、Sma I、Smi I、SnaB I、Spe I、Sph I、Sse8387 I、Ssp I、Stu I、Taq I、Tth111 I、Van91 I、VpaK11B I、Xba I、Xho I、Xsp Iから成る群から選択されたメチル化感受性作用物質であることを特徴とする方法。   2. The method of claim 1 wherein the methylation sensitive agent is Aat II, Acc I, Acc II, Aci I, Afa I, Afl II, Alu I, Aor13H I, Aor51H I, Apa I, ApaL I, Ava I, Ava II, Bal I, BamH I, Ban II, Bbe I, Bcn I, Bgl I, Bgl II, Bln I, BmeT110 I, BmgT120 I, Bpu1102 I, BspT104 I, BspT107 I, Bsp1286 I, Bsp1407 I , BssH II, BspD I, BstP I, BstU I, BstX I, Bst1107 I, Cfr10 I, Cfr13 I, Cla I, Cpo I, Dra I, Eae I, Eag I, Eam1105 I, EcoO65 I, EcoO109 I, EcoR I, EcoR V, EcoT14 I, EcoT22 I, Eco52 I, Eco81 I, Fba I, Fok I, Fse I, Hae II, Hae III, Hap II, Hha I, Hinc II, Hind III, Hinf I, Hin1 I, Hpa II, HpyCH4 IV, Kas I, Kpn I, Mbo I, Mbo II, Mfl I, Mlu I, Msp I, Mun I, Mva I, Nae I, NegM IV, Nco I, Nde I, Nhe I, Not I , Nru I, Nsb I, PmaC I, PshA I, PshB I, Psp1406 I, Pst I, Pvu I, Pvu II, Sac I, Sac II, Sal I, Sc a I, Sfi I, Sma I, Smi I, SnaB I, Spe I, Sph I, Sse8387 I, Ssp I, Stu I, Taq I, Tth111 I, Van91 I, VpaK11B I, Xba I, Xho I, Xsp I A method characterized in that it is a methylation sensitive agent selected from the group consisting of: 請求項１の方法であって、メチル化感受性作用物質がメチル化感受性制限酵素であることを特徴とする方法。   2. The method of claim 1, wherein the methylation sensitive agent is a methylation sensitive restriction enzyme. 請求項１の方法であって、前記メチル化感受性作用物質が、ＣＣＧＧ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＣ、ＡＣＧＴ、ＣＧＧＣＣＧ、ＧＣＣＧＧＣ、ＧＧＣＧＣＣ、ＣＣＣＧＧＧ、ＣＧＣＧ、ＡＴＣＧＴＡ、ＴＴＣＧＡＡ、ＧＴＣＧＡＧ、及びＣＴＣＧＡＧからなる群から選択された認識配列を切断する制限酵素であることを特徴とする方法。   2. The method of claim 1, wherein the methylation sensitive agent is selected from the group consisting of CCGG, CCGC, GCGC, ACGT, CGGCCG, GCCGGC, GGCGCC, CCCGGG, CGCG, ATCGTA, TTCGAA, GTCGAG, and CTCGAG. A method comprising a restriction enzyme that cleaves a recognition sequence. 請求項１の方法であって、前記蛍光強度に基づいて前記試験ＤＮＡが前記メチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程に於いて、前記メチル化感受性作用物質を作用させる過程の前後の蛍光標識が付加された部位を有するＤＮＡの大きさの変化が決定されることを特徴とする方法。   The method according to claim 1, wherein in the step of determining whether the test DNA has been cleaved by the methylation-sensitive agent based on the fluorescence intensity, the step of causing the methylation-sensitive agent to act A method characterized in that a change in the size of a DNA having a site to which front and rear fluorescent labels are added is determined. 請求項１の方法であって、前記メチル化感受性作用物質を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程に於いて、前記蛍光強度の測定が蛍光相関分光法により行われることを特徴とする方法。   2. The method according to claim 1, wherein the fluorescence intensity is measured by fluorescence correlation spectroscopy in the process of measuring the fluorescence intensity of the test DNA to which the methylation sensitive agent is allowed to act. Method. 請求項１の方法であって、前記メチル化感受性作用物質を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程に於いて、前記蛍光強度の測定が蛍光相互相関分光法により行われることを特徴とする方法。   2. The method according to claim 1, wherein the fluorescence intensity is measured by fluorescence cross-correlation spectroscopy in the process of measuring the fluorescence intensity of the test DNA to which the methylation sensitive agent is allowed to act. how to. 請求項１の方法であって、前記メチル化感受性作用物質を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程に於いて、前記蛍光強度の測定が蛍光偏光解消法により行われることを特徴とする方法。   2. The method according to claim 1, wherein the fluorescence intensity is measured by fluorescence depolarization in the process of measuring the fluorescence intensity of the test DNA to which the methylation sensitive agent is allowed to act. Method. 酵素のＤＮＡメチル化活性を検出する方法であって、
メチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡと、ＤＮＡメチル化活性を有するか否かが判定されるべき被検酵素とを混合する過程と、
その後、非メチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれかを選択的に切断するメチル化感受性作用物質を前記試験ＤＮＡに作用させる過程と、
前記メチル化感受性制限酵素を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程と、
前記蛍光強度に基づいて前記試験ＤＮＡが前記メチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程とを含み、
前記試験ＤＮＡが切断された否かによって前記被検酵素がＤＮＡをメチル化する活性と有しているか否かを判定することを特徴とする方法。 A method for detecting DNA methylation activity of an enzyme, comprising:
A test DNA which is a double-stranded DNA having a restriction enzyme recognition site including a methylation site and to which a fluorescent label is added is mixed with a test enzyme to be determined whether or not it has DNA methylation activity. Process,
Thereafter, a methylation-sensitive agent that selectively cleaves either a restriction enzyme recognition site containing the methylation site in an unmethylated state or a restriction enzyme recognition site containing the methylation site in a methylation state is used as the test DNA. The process of acting on
Measuring the fluorescence intensity of the test DNA to which the methylation sensitive restriction enzyme is allowed to act;
Determining whether the test DNA has been cleaved by the methylation sensitive agent based on the fluorescence intensity,
A method for determining whether or not the test enzyme has an activity of methylating DNA based on whether or not the test DNA is cleaved. 酵素のＤＮＡ脱メチル化活性を検出する方法であって、
メチル化されたメチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡと、ＤＮＡ脱メチル化活性を有するか否かが判定されるべき被検酵素とを混合する過程と、
その後、非メチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれかを選択的に切断するメチル化感受性作用物質を前記試験ＤＮＡに作用させる過程と、
前記メチル化感受性制限酵素を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程と、
前記蛍光強度に基づいて前記試験ＤＮＡが前記メチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程とを含み、
前記試験ＤＮＡが切断された否かによって前記被検酵素がＤＮＡを脱メチル化する活性と有しているか否かを判定することを特徴とする方法。 A method for detecting the DNA demethylation activity of an enzyme comprising:
A test DNA which is a double-stranded DNA having a restriction enzyme recognition site containing a methylated methylation site and to which a fluorescent label is added, and a test to be judged whether or not it has DNA demethylation activity Mixing the enzyme,
Thereafter, a methylation-sensitive agent that selectively cleaves either a restriction enzyme recognition site containing the methylation site in an unmethylated state or a restriction enzyme recognition site containing the methylation site in a methylation state is used as the test DNA. The process of acting on
Measuring the fluorescence intensity of the test DNA to which the methylation sensitive restriction enzyme is allowed to act;
Determining whether the test DNA has been cleaved by the methylation sensitive agent based on the fluorescence intensity,
A method for determining whether or not the test enzyme has an activity of demethylating DNA based on whether or not the test DNA is cleaved. ＤＮＡの脱メチル化を阻害する阻害物質を検出する方法であって、
メチル化されたメチル化部位を含む制限酵素認識部位を有し、蛍光標識が付加された二本鎖ＤＮＡである試験ＤＮＡと、ＤＮＡの脱メチル化を阻害する阻害物質であるか否かが判定されるべき被検物質と、ＤＮＡ脱メチル化酵素とを混合する過程と、
その後、非メチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位又はメチル化状態の前記メチル化部位を含む制限酵素認識部位のいずれかを選択的に切断するメチル化感受性作用物質を前記試験ＤＮＡに作用させる過程と、
前記メチル化感受性制限酵素を作用させた試験ＤＮＡの蛍光強度を測定する過程と、
前記蛍光強度に基づいて前記試験ＤＮＡが前記メチル化感受性作用物質により切断された否かを判定する過程とを含み、
前記試験ＤＮＡが切断されたか否かによって前記被検物質がＤＮＡの脱メチル化を阻害する阻害物質であるか否かを判定することを特徴とする方法。
A method for detecting an inhibitor that inhibits demethylation of DNA, comprising:
Test DNA, which is a double-stranded DNA with a restriction enzyme recognition site containing a methylated methylation site, and whether it is an inhibitor that inhibits demethylation of DNA A process of mixing a test substance to be performed with a DNA demethylase;
Thereafter, a methylation-sensitive agent that selectively cleaves either a restriction enzyme recognition site containing the methylation site in an unmethylated state or a restriction enzyme recognition site containing the methylation site in a methylation state is used as the test DNA. The process of acting on
Measuring the fluorescence intensity of the test DNA to which the methylation sensitive restriction enzyme is allowed to act;
Determining whether the test DNA has been cleaved by the methylation sensitive agent based on the fluorescence intensity,
A method for determining whether or not the test substance is an inhibitor that inhibits DNA demethylation based on whether or not the test DNA is cleaved.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012026929A (en) * 2010-07-26 2012-02-09 Ooyashiki Kazuma Method for determining dna methylation degree by single-molecule fluorescence analysis method
JP2013540452A (en) * 2010-10-29 2013-11-07 アスラジェン， インコーポレイテッド MPCR method for analyzing repeat sequences
CN109811037A (en) * 2018-11-15 2019-05-28 华南师范大学 A kind of continuous on-line detection method of DNA methylation process

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109207618B (en) * 2017-06-30 2020-05-29 中国农业科学院植物保护研究所 Method and kit for determining methylation rate of target sequence in biological material
CN114381497B (en) * 2021-12-31 2024-01-26 湖南中医药大学 Method for detecting methylation modification of DNA

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7700324B1 (en) * 1998-11-03 2010-04-20 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methylated CpG island amplification (MCA)
EP1402071A4 (en) * 2001-06-08 2005-12-14 Us Genomics Inc Methods and products for analyzing nucleic acids based on methylation status
CA2454147C (en) * 2001-07-31 2013-05-21 The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon Inhibitor of dna methylation
US20060183115A1 (en) * 2001-09-26 2006-08-17 Epigenx Pharmaceuticals Assays for dna methylation changes

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012026929A (en) * 2010-07-26 2012-02-09 Ooyashiki Kazuma Method for determining dna methylation degree by single-molecule fluorescence analysis method
JP2013540452A (en) * 2010-10-29 2013-11-07 アスラジェン， インコーポレイテッド MPCR method for analyzing repeat sequences
CN109811037A (en) * 2018-11-15 2019-05-28 华南师范大学 A kind of continuous on-line detection method of DNA methylation process
CN109811037B (en) * 2018-11-15 2022-02-11 华南师范大学 Continuous online detection method for DNA methylation process

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