JP2009265053A - Evaluation method of antitumor effect and screening method of antitumor substance using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、被験物質について抗腫瘍作用を評価する方法に関する。また本発明は、当該方法を用いて抗腫瘍剤の有効成分となりえる物質を探索し取得する方法（スクリーニング方法）に関する。さらに本発明は、当該方法によって取得された物質を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。 The present invention relates to a method for evaluating an antitumor effect on a test substance. The present invention also relates to a method (screening method) for searching for and obtaining a substance that can be an active ingredient of an antitumor agent using the method. Furthermore, this invention relates to the antitumor agent which uses the substance acquired by the said method as an active ingredient.
がんは、罹患率および死亡率の高い疾患の一つである。最近では、医学の進歩によって、早期発見によるがんの死亡率は全体的に減少しているが、普遍的に有効ながんの防止策および治療方法は存在しない。また昨今の種々の理由（高齢者の増加、環境汚染など）により、がんの症例数は、これからますます増加すると予想される。 Cancer is one of the diseases with high morbidity and mortality. Recently, advances in medicine have resulted in an overall decrease in cancer mortality from early detection, but there are no universally effective cancer prevention and treatment methods. Also, due to various recent reasons (increased elderly, environmental pollution, etc.), the number of cancer cases is expected to increase further.
現在、がん治療は、一般に、早期発見に加えて、積極的な治療（手術、化学療法、放射線療法、またはホルモン療法を含む）が１乃至複数組み合わせて行われる。しかし、このような積極的な治療の多くは侵襲的であり、しかも全身的な毒性を免れないので、患者の肉体的および精神的な負担は大きく、また副作用によって患者の生活の質が大きく損なわれてしまう。また、がん細胞または腫瘍細胞は、本質的にがん治療で使用される細胞傷害薬に耐性を示すものもあれば、最初は応答するものの治療中に耐性を示すものもある。また、放射性療法は固形性腫瘍塊内のがん細胞の根絶には比較的効果がないことも認識されている。これは、放射性療法による細胞破壊には酸素由来のフリーラジカルが必要であるのに対して（非特許文献１）、腫瘍塊内の酸素レベルは、血液供給が欠如していることから低いのが一般的だからである。また多くの化学療法薬は、その有効性を発揮するのに酸素を必要とすることも知られている（非特許文献２）。 Currently, cancer treatment is generally performed in combination with one or more aggressive treatments (including surgery, chemotherapy, radiation therapy, or hormone therapy) in addition to early detection. However, many of these aggressive treatments are invasive and systemic toxicity is unavoidable, so the patient's physical and mental burden is significant, and side effects greatly impair the patient's quality of life. It will be. Some cancer cells or tumor cells are inherently resistant to cytotoxic drugs used in cancer treatment, while others respond initially but remain resistant during treatment. It is also recognized that radiotherapy is relatively ineffective at eradicating cancer cells within a solid tumor mass. This is because oxygen-derived free radicals are necessary for cell destruction by radiotherapy (Non-Patent Document 1), but the oxygen level in the tumor mass is low due to the lack of blood supply. Because it is general. It is also known that many chemotherapeutic drugs require oxygen to exert their effectiveness (Non-patent Document 2).
がんの原因は依然としてほとんど知られていない。しかし、一般に、がん形成または発がんには、複数の遺伝的および環境的要素を含む複雑なプロセスが関係していると考えられている。複数の発がん要因が複雑に相互作用してがんが発生することを考えると、特異的かつ普遍的に、がん細胞を死に誘導する方法、または腫瘍成長（がん細胞の増殖）を阻止する方法を開発することは極めて難しい課題であると考えられる。 Little is known about the cause of cancer. However, it is generally thought that carcinogenesis or carcinogenesis involves a complex process involving multiple genetic and environmental factors. Given the complex interaction of multiple carcinogenic factors, cancer can develop in a specific and universal way to induce cancer cell death or to block tumor growth (cancer cell proliferation). Developing a method is considered a very difficult task.
最近、がん治療や予防のため、特にナチュラルキラー細胞の活性化を介して生体の免疫機能を高める方法が提案されている（非特許文献３、４）。ナチュラルキラー細胞を活性化して生体の免疫機能そのものを高めることは、がんの種類に関係なく普遍的にがんに対抗できるものと考えられる。
本発明は、被験物質の抗腫瘍作用を評価する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、かかる評価方法を利用して、抗腫瘍剤の有効成分となり得る物質を探索し取得するための方法、すなわち新しい抗腫瘍剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for evaluating the antitumor action of a test substance. It is another object of the present invention to provide a method for searching for and obtaining a substance that can be an active ingredient of an antitumor agent by using such an evaluation method, that is, a method for screening a new antitumor agent.
さらに本発明は、当該スクリーニング方法を用いて取得された抗腫瘍作用を有する物質を有効成分とする抗腫瘍剤を提供することを目的とする。 Furthermore, an object of the present invention is to provide an antitumor agent comprising a substance having an antitumor action obtained by using the screening method as an active ingredient.
腎臓癌の患者では、血中単核球のアルギニン分解酵素の活性が高く、また血中のアルギニン濃度が低下している。このため、これらの条件が腫瘍免疫を低下させると考えられている（非特許文献５）。このことから、上記課題を解決するために、本発明者らは、アルギニンとその他のアミノ酸の混合物を腫瘍細胞を移植した被験動物に経口投与し、腫瘍の大きさ（腫瘍細胞の増殖率）を経時的に測定すると同時に、脾臓を支配する交感神経（脾臓交感神経）の遠心枝の電気活動の変化を経時的に測定してみたところ、アルギニンとリジンの混合物の経口投与が腫瘍細胞の増殖と脾臓交感神経の電気活動との間に良好な相関関係があること、具体的には脾臓交感神経の活動低下に対応して腫瘍細胞の増殖率が低下することを見出した。また、本発明者らは、芳香成分であるミルセンに、匂い刺激によって脾臓交感神経の活動を低下させる作用があることを確認し、さらに当該ミルセンを、腫瘍細胞を移植した被験動物に嗅がして経鼻摂取させることによって、上記アルギニンとリジンの混合物と同様に、腫瘍の大きさ（腫瘍細胞の増殖率）が小さくなることを確認した。 In patients with renal cancer, blood mononuclear cell arginine degrading enzyme activity is high, and blood arginine concentration is low. For this reason, it is thought that these conditions reduce tumor immunity (nonpatent literature 5). Therefore, in order to solve the above problems, the present inventors orally administer a mixture of arginine and other amino acids to a test animal transplanted with tumor cells, and determine the size of the tumor (proliferation rate of tumor cells). At the same time, we measured changes in the electrical activity of the centrifugal branch of the sympathetic nerve (splenic sympathetic nerve) that controls the spleen. As a result, oral administration of a mixture of arginine and lysine It has been found that there is a good correlation with the electrical activity of the splenic sympathetic nerve, specifically, the proliferation rate of tumor cells decreases in response to a decrease in the activity of the splenic sympathetic nerve. In addition, the present inventors confirmed that myrcene, which is an aromatic component, has an action of reducing splenic sympathetic nerve activity by odor stimulation, and further sniffed myrcene to a test animal transplanted with tumor cells. It was confirmed that the tumor size (tumor cell growth rate) was reduced by nasal ingestion, similar to the mixture of arginine and lysine.
これらの知見に基づいて、本発明者は、脾臓交感神経の活動の低下を指標とすることによって、被験物質の抗腫瘍作用を評価することができること、すなわち、かかる評価系を用いることで、抗腫瘍剤の有効成分として有用な物質、または抗腫瘍作用を有する食品やペット餌料の有効成分として有用な物質を簡便に探索し見出すことができることを確認し、本発明を完成するに至った。 Based on these findings, the present inventor can evaluate the antitumor action of a test substance by using a decrease in splenic sympathetic nerve activity as an index, that is, by using such an evaluation system, It was confirmed that a substance useful as an active ingredient of a tumor agent, or a substance useful as an active ingredient of food or pet food having antitumor activity can be easily searched and found, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、下記の態様を備えるものである。
（Ｉ）被験物質についてその抗腫瘍作用を評価する方法
（I-1）下記の工程を有することを特徴とする、被験物質の抗腫瘍作用を評価する方法：
(1)被験物質を非ヒト動物に投与し、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程。
（I-2）さらに下記の工程を有する、（I-1）に記載する抗腫瘍作用の評価方法：
(2)被験物質を投与した非ヒト動物の脾臓交感神経の活動が、被験物質を投与しない非ヒト動物の脾臓交感神経の活動よりも低下する場合に、当該被験物質について抗腫瘍作用があると判断する工程。
（I-3）脾臓交感神経活動の測定を、脾臓交感神経の遠心枝の電気活動を測定することによって行う（I-1）または（I-2）に記載する抗腫瘍作用の評価方法。
That is, the present invention includes the following aspects.
(I) Method for evaluating the antitumor action of a test substance (I-1) A method for evaluating the antitumor action of a test substance, comprising the following steps:
(1) A step of administering a test substance to a non-human animal and measuring splenic sympathetic nerve activity of the non-human animal.
(I-2) The method for evaluating antitumor activity according to (I-1), further comprising the following steps:
(2) When the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal administered with the test substance is lower than the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal not administered with the test substance, the test substance has an antitumor effect. The process of judging.
(I-3) The method for evaluating an antitumor effect according to (I-1) or (I-2), wherein the measurement of splenic sympathetic nerve activity is performed by measuring the electrical activity of the distal branch of the splenic sympathetic nerve.
（II）抗腫瘍作用を有する物質（抗腫瘍物質）のスクリーニング方法
（II-1）工程(1)または(2)を有する上記（I-2）乃至（I-3）のいずれかに記載する方法を行うことを特徴とする、被験物質のなかから抗腫瘍作用を有する物質をスクリーニングする方法。
（II-2）工程(2)で、抗腫瘍作用があると判断された被験物質を、抗腫瘍剤の有効成分として取得する、（II-1）に記載するスクリーニング方法。
（II-3）工程(2)で、抗腫瘍作用があると判断された被験物質を、抗腫瘍作用を有する食品、動物の餌料、または芳香剤の有効成分として取得する、（II-1）に記載するスクリーニング方法。
(II) Screening method of substance having antitumor action (antitumor substance) (II-1) Described in any one of (I-2) to (I-3) above, which comprises step (1) or (2) A method for screening a substance having an antitumor action among test substances, which comprises performing the method.
(II-2) The screening method according to (II-1), wherein the test substance determined to have an antitumor action in step (2) is obtained as an active ingredient of an antitumor agent.
(II-3) Obtain the test substance determined to have antitumor activity in step (2) as an active ingredient of food, animal feed, or fragrance that has antitumor activity, (II-1) A screening method described in 1.
（III）抗腫瘍剤
（III-1）上記（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する評価方法によって抗腫瘍作用があると評価された、アルギニンおよびリジンの混合物、またはミルセンを有効成分とする抗腫瘍剤。
（III-2）ヒトまたは非ヒト動物の腫瘍、特に悪性腫瘍（がん）を治療するために使用される（III-1）に記載する抗腫瘍剤。
(III) Antitumor agent (III-1) A mixture of arginine and lysine, or myrcene, which was evaluated to have antitumor activity by the evaluation method described in any of (I-1) to (I-3) above An antitumor agent containing as an active ingredient.
(III-2) The antitumor agent according to (III-1), which is used for treating tumors of human or non-human animals, particularly malignant tumors (cancers).
本発明の評価方法によれば、被験物質を投与して、脾臓を支配する交感神経の電気活動の低下の有無を観察することによって、簡単に被験物質の抗腫瘍作用の有無を判断することができる。すなわち、本発明によれば、簡単に被験物質の抗腫瘍作用を評価することができる。 According to the evaluation method of the present invention, the presence or absence of the antitumor action of the test substance can be easily determined by administering the test substance and observing the presence or absence of a decrease in the electrical activity of the sympathetic nerve that governs the spleen. it can. That is, according to the present invention, the antitumor action of a test substance can be easily evaluated.
このため、本発明の評価方法は、従来公知の抗腫瘍剤の抗腫瘍作用、特に免疫増強作用に基づく抗腫瘍作用を評価する方法として有用であるほか、いままで抗腫瘍作用が知られていなかった物質（可食性物質や芳香成分を含む）について新たに抗腫瘍作用を見出すための方法として、さらに、多くの物質の中から抗腫瘍作用を有する物質を探索し取得するための方法として、また、複数の成分からなる組成物の中から抗腫瘍作用を有する有効成分を同定する方法として、有効に使用することができる。 Therefore, the evaluation method of the present invention is useful as a method for evaluating the antitumor action of a conventionally known antitumor agent, particularly an antitumor action based on an immunopotentiating action, and no antitumor action has been known so far. As a method for finding a new anti-tumor effect for a new substance (including edible substances and fragrance components), as a method for searching for and acquiring a substance having an anti-tumor action from many substances, and It can be effectively used as a method for identifying an active ingredient having an antitumor action from a composition comprising a plurality of ingredients.
そしてかかる方法によって新たに取得された抗腫瘍作用を有する物質は、抗腫瘍作用を効果・効能とする抗腫瘍剤（ヒト用医薬品および動物用医薬品を含む）、食品、動物餌料、またはアロマセラピーなどに使用される芳香剤や香料の有効成分として有効に使用することができる。 Newly obtained antitumor substances obtained by such methods include antitumor agents (including human drugs and veterinary drugs), foods, animal feeds, or aromatherapy that have antitumor effects. It can be used effectively as an active ingredient of fragrances and fragrances used in
（Ｉ）抗腫瘍作用の評価方法
本発明の抗腫瘍作用の評価方法は、評価対象とする被験物質を非ヒト動物に投与して、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定することによって実施することができる。
(I) Method for evaluating antitumor action The method for evaluating antitumor action of the present invention comprises administering a test substance to be evaluated to a non-human animal and measuring the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal. Can be implemented.
測定に使用する非ヒト動物は、ヒト以外の哺乳動物または鳥類などの恒温動物であれば特に制限されず、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、サル、イヌおよびネコなどを挙げることができる。 The non-human animal used for the measurement is not particularly limited as long as it is a non-human mammal or a constant temperature animal such as a bird, and examples thereof include rats, mice, guinea pigs, rabbits, monkeys, dogs and cats.
被験物質の投与方法としては、経皮投与、経口投与、経腸投与、静脈投与および経鼻投与を挙げることができる。かかる投与方法は、被験物質の使用目的や使用形態に応じて適宜選択することができる。例えば、被験物質が、外用組成物（外用医薬品を含む）やその成分である場合またはその用途で使用する場合は、当該被験物質を非ヒト動物に経皮投与することによって抗腫瘍作用を評価することが好ましい。また、被験物質が、経腸投与剤（経口投与や坐薬などその物質が腸を通過するものを含む）やその成分である場合またはその用途で使用する場合は、当該被験物質を非ヒト動物に経腸投与（直腸投与を含む）することによって、抗腫瘍作用を評価することが好ましい。さらに、被験物質が、静脈投与剤（注射剤や点滴剤を含む）やその成分である場合またはその用途で使用する場合は、当該被験物質を非ヒト動物に静脈投与することによって、抗腫瘍作用を評価することが好ましい。さらにまた、被験物質が、経鼻投与剤やその成分である場合または芳香剤などのように経鼻的に使用されるものである場合は、当該被験物質を非ヒト動物に経鼻投与または経鼻摂取させることによって、抗腫瘍作用を評価することが好ましい。 Examples of the administration method of the test substance include transdermal administration, oral administration, enteral administration, intravenous administration and nasal administration. Such an administration method can be appropriately selected depending on the purpose of use and the form of use of the test substance. For example, when the test substance is a composition for external use (including topical medicine) or its components or is used for the purpose, the antitumor action is evaluated by transdermally administering the test substance to a non-human animal. It is preferable. In addition, when the test substance is an enteral agent (including those that pass through the intestine, such as oral administration and suppositories) or its components, or when it is used for that purpose, the test substance should be administered to a non-human animal. It is preferable to evaluate the antitumor action by enteral administration (including rectal administration). Furthermore, when the test substance is an intravenously administered agent (including injections and infusions) or its components, or when it is used for that purpose, the test substance is administered intravenously to a non-human animal, resulting in antitumor activity. Is preferably evaluated. Furthermore, when the test substance is a nasal agent or a component thereof, or is used nasally, such as a fragrance, the test substance is administered to a non-human animal via nasal administration. It is preferable to evaluate the antitumor effect by ingesting the nose.
また、被験物質が、経口組成物（食品や経口医薬品、動物餌料を含む）やその成分である場合またはその用途で使用する場合は、当該被験物質を非ヒト動物に経口投与することによって、抗腫瘍作用を評価することが好ましい。なお、この場合、被験物質を経口投与してから、体内吸収されるか、或は、腸内にて効果を発揮して脾臓交感神経の活動に反映されるまでに、多少の時間を要する。このため、まず被験物質を非ヒト動物に経腸投与（経小腸投与）して、予め抗腫瘍作用を評価し（一次評価）、次いで、当該一次評価で抗腫瘍作用が確認された被験物質を非ヒト動物に経口投与して、経口投与による抗腫瘍作用を評価することもできる（二次評価）。 In addition, when the test substance is an oral composition (including food, oral medicine, animal feed) or its components, or when it is used for its use, the test substance is administered orally to a non-human animal, It is preferable to evaluate the tumor action. In this case, after the test substance is orally administered, it takes some time until it is absorbed in the body or exerts its effect in the intestine and reflected in the activity of the splenic sympathetic nerve. For this reason, first, the test substance is enterally administered to a non-human animal (enteral small intestine), the antitumor action is evaluated in advance (primary evaluation), and then the test substance whose antitumor action has been confirmed in the primary evaluation is obtained. It can also be administered orally to non-human animals to evaluate the antitumor effect by oral administration (secondary evaluation).
非ヒト動物に経皮投与する方法としては、被験物質を非ヒト動物の皮膚に塗布する方法、および被験物質を含浸または担持させたシートを貼付する方法などを挙げることができ、投与する被験物質の調製形態（例えば、ローション、エアゾール剤、フォーム剤、乳液、クリーム、軟膏、ゲル剤、貼付剤など）に応じて適宜設定することができる。経皮投与する非ヒト動物の部位は、制限はされないが、好ましくは体毛の影響が少ない領域、具体的には毛がないか若しくは毛の少ない皮膚領域（例えば腹部、太ももの内側、尻尾など）である。但し、試験領域を剃毛することによって体毛の影響を回避することができるため、上記部位に特に拘泥はされない。また、体毛の影響を回避するために、遺伝的に毛のない動物（例えばヘアレスマウス、ヘアレスラットなど）を使用することもできる。 Examples of the method of transdermal administration to non-human animals include a method of applying a test substance to the skin of a non-human animal, a method of attaching a sheet impregnated with or carrying a test substance, and the like. Can be appropriately set according to the preparation form (for example, lotion, aerosol, foam, emulsion, cream, ointment, gel, patch, etc.). The site of the non-human animal to be administered transdermally is not limited, but is preferably an area where there is little influence of body hair, specifically a skin area where there is no hair or little hair (eg, abdomen, inside of thigh, tail, etc.) It is. However, since the influence of body hair can be avoided by shaving the test area, the above-mentioned part is not particularly restricted. Moreover, in order to avoid the influence of body hair, an animal having no hair (for example, a hairless mouse, a hairless rat, etc.) can also be used.
非ヒト動物に静脈投与する方法としては、注射または点滴を用いて、非ヒト動物の静脈内に被験物質を投与する方法を用いることができる。 As a method for intravenous administration to a non-human animal, a method of administering a test substance into the vein of a non-human animal using injection or infusion can be used.
非ヒト動物に経鼻投与する方法（または経鼻摂取させる方法）としては、スプレーや吸入器などを用いて非ヒト動物の鼻から被験物質を強制的に投与する方法、飼育室の大気中に被験物質を散布して呼吸とともに鼻から被験物質を摂取させる方法などを用いることができる。 As a method of nasally administering to a non-human animal (or nasal ingestion method), a test substance is forcibly administered from the nose of the non-human animal using a spray or an inhaler, etc. For example, a method of spraying a test substance and ingesting the test substance from the nose with breathing can be used.
非ヒト動物に経腸投与する方法としては、非ヒト動物を麻酔下で開腹し、腸内にカニューレを設置して被験物質を投与する方法、または肛門を介して直腸内に被験物質を投与する方法を挙げることができる。また非ヒト動物に経口投与する方法としては、口腔内にカニューレを設置して被験物質を強制摂取させる方法、または被験動物を食餌または水に混ぜて、非ヒト動物に食餌や水と一緒に飲食させる方法を挙げることができる。 For enteral administration to non-human animals, non-human animals are laparotomized under anesthesia, a test substance is administered by placing a cannula in the intestine, or a test substance is administered into the rectum via the anus A method can be mentioned. As a method for oral administration to non-human animals, a method of forcibly ingesting the test substance by installing a cannula in the oral cavity, or mixing the test animal with food or water and feeding the non-human animal with food or water Can be mentioned.
斯くして被験物質を投与した非ヒト動物について、その脾臓を支配する交感神経（脾臓交感神経）の活動を測定する。当該神経活動の測定は、脾臓交感神経の遠心枝の電気活動を測定することによって行うことができる。 Thus, the activity of the sympathetic nerve (spleen sympathetic nerve) governing the spleen is measured for the non-human animal administered the test substance. The nerve activity can be measured by measuring the electrical activity of the distal branch of the splenic sympathetic nerve.
脾臓交感神経（遠心枝）の電気活動の測定は、具体的には、麻酔下で、非ヒト動物の脾臓交感神経の遠心枝を、実体顕微鏡下で剥離し、それを銀電極にのせて活動電位を記録することによって行うことができる。なお、銀電極は、乾燥を防ぐために、予め液体パラフィンとワセリンの混合物に十分浸しておくことが好ましい。得られた神経の電気活動は、差動増幅器にて増幅し、オシロスコープにてモニターする。ここでノイズ信号はウィンドウ・ディスクリミネーターにより分離する。信号をスパイク変換し、得られたスパイクをレイトメーターにより５秒間のスパイク数としてカウントする。これをＡ／Ｄ(アナログ／デジタル)変換した後、パソコンに記録する（図１参照）。 Measurement of electrical activity of splenic sympathetic nerves (centrifugal branches) is specifically performed under anesthesia by detaching a centrifugal branch of splenic sympathetic nerves of a non-human animal under a stereomicroscope and placing it on a silver electrode. This can be done by recording the potential. In order to prevent drying, the silver electrode is preferably sufficiently immersed in a mixture of liquid paraffin and petrolatum in advance. The obtained nerve electrical activity is amplified by a differential amplifier and monitored by an oscilloscope. Here, the noise signal is separated by a window discriminator. The signal is subjected to spike conversion, and the obtained spike is counted as the number of spikes for 5 seconds by a late meter. This is A / D (analog / digital) converted and then recorded on a personal computer (see FIG. 1).
かかる方法により脾臓交感神経の遠心枝の電気活動を、スパイク数として測定することができる。すなわち、被験物質投与前に測定したスパイク数が、被験物質投与によって減少した場合には、被験物質投与によって脾臓交感神経の電気活動が低下したと判断することができる。 With this method, the electrical activity of the distal branch of the splenic sympathetic nerve can be measured as the number of spikes. That is, when the number of spikes measured before administration of the test substance is decreased by administration of the test substance, it can be determined that the electrical activity of the splenic sympathetic nerve has been reduced by administration of the test substance.
かかる脾臓交感神経の電気活動の低下は、実験例に示すように腫瘍の増殖率の低下、すなわち抗腫瘍効果と精度良く相関する。このため、被験物質投与前に測定した上記スパイク数が、被験物質の投与によって減少した場合には、被験物質の投与によって脾臓交感神経の電気活動が低下したと判断することができ、この場合、当該被験物質に抗腫瘍作用があると評価することができる。一方、被験物質投与前に測定した上記スパイク数が、被験物質の投与によって変動しないか増加した場合には、被験物質の投与によって脾臓交感神経の電気活動が変動しないか上昇したと判断することができ、この場合、当該被験物質には抗腫瘍作用がないと評価することができる。 Such a decrease in the electrical activity of the splenic sympathetic nerve correlates accurately with a decrease in the growth rate of the tumor, that is, the antitumor effect, as shown in the experimental examples. For this reason, when the number of spikes measured before administration of the test substance is decreased by administration of the test substance, it can be determined that the electrical activity of the splenic sympathetic nerve has been reduced by administration of the test substance. It can be evaluated that the test substance has an antitumor effect. On the other hand, when the number of spikes measured before administration of the test substance does not vary or increases due to the administration of the test substance, it can be determined that the electrical activity of the splenic sympathetic nerve does not vary or has increased due to the administration of the test substance. In this case, the test substance can be evaluated as having no antitumor action.
以上のことを総合するに、本発明の抗腫瘍作用の評価方法は、下記の工程(1)を行うことによって実施することができる：
(1)被験物質を非ヒト動物に投与し、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程。
In summary, the antitumor activity evaluation method of the present invention can be carried out by performing the following step (1):
(1) A step of administering a test substance to a non-human animal and measuring splenic sympathetic nerve activity of the non-human animal.
好ましくは本発明の抗腫瘍作用の評価方法は、上記工程(1)に続いて、下記の工程(2)を行うことによって実施することができる：
(2)上記工程(1)において、被験物質を投与した非ヒト動物の脾臓交感神経の活動が、被験物質を投与しない非ヒト動物（対照非ヒト動物）の脾臓交感神経の活動（対照活動）よりも低下する場合に、当該被験物質について抗腫瘍作用があると判断する工程。
Preferably, the method for evaluating an antitumor action of the present invention can be carried out by performing the following step (2) following the above step (1):
(2) In the above step (1), the splenic sympathetic nerve activity of the non-human animal administered with the test substance is the splenic sympathetic nerve activity (control activity) of the non-human animal (control non-human animal) not administered with the test substance. A step of determining that the test substance has an antitumor action when the test substance is lower than
なお、工程(2)において対照とする非ヒト動物は、工程(1)で被験物質を投与した非ヒト動物と同一の動物であっても、また異なる動物であってもよい。前者の場合は、被験物質を投与する前に当該非ヒト動物について測定された脾臓交感神経の活動が比較の対象とされ、上記でいう対照活動となる。また、後者において、対照非ヒト動物として被験物質を投与した非ヒト動物と異なる動物を使用する場合、当該動物は、被験物質を投与した非ヒト動物と同種の動物を用いることが好ましい。 The non-human animal used as a control in step (2) may be the same animal as the non-human animal administered the test substance in step (1) or may be a different animal. In the former case, the activity of the splenic sympathetic nerve measured for the non-human animal before administration of the test substance is used as a comparison target, which is the control activity described above. In the latter case, when an animal different from the non-human animal administered with the test substance is used as the control non-human animal, the animal is preferably the same animal as the non-human animal administered with the test substance.
斯くして本発明によれば、被験物質について、経皮投与、静脈投与、経鼻投与、経口投与または経腸投与による抗腫瘍効果を評価することができる。なお、抗腫瘍効果を評価する対象の被験物質は、測定者が任意に選択することができ、例えば既に抗腫瘍作用が知られている抗腫瘍物質や組成物（医薬品、食品および芳香剤を含む）であってもよいし、また抗腫瘍作用が知られていない物質や組成物（医薬品、食品および芳香剤を含む）であってもよい。前者の場合は、本発明の評価方法により、抗腫瘍作用を再確認またはその作用がナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化に起因するものであることを評価することができ、またその抗腫瘍作用を、他の物質の抗腫瘍作用と比較評価をすることができる。なお、ＮＫ細胞には特異性がないので、ＮＫ活性が高まればどのような腫瘍にも対抗することできると考えられる。また、後者の場合は、本発明の評価方法により、今まで抗腫瘍作用が知られていない物質や組成物について新たに抗腫瘍作用を見出すことができる。 Thus, according to the present invention, the antitumor effect of transdermal administration, intravenous administration, nasal administration, oral administration or enteral administration can be evaluated for a test substance. The test substance to be evaluated for anti-tumor effect can be arbitrarily selected by the measurer. For example, anti-tumor substances and compositions already known for anti-tumor action (including pharmaceuticals, foods and fragrances) Or a substance or composition (including pharmaceuticals, foods and fragrances) whose antitumor action is not known. In the former case, the antitumor effect can be reconfirmed by the evaluation method of the present invention, or it can be evaluated that the effect is caused by the activation of natural killer cells (NK cells), and the antitumor effect thereof. The effect can be compared with the antitumor effect of other substances. In addition, since NK cells do not have specificity, it is considered that any tumor can be combated if NK activity is increased. In the latter case, a new antitumor effect can be found for substances and compositions that have not been known to have an antitumor effect until now by the evaluation method of the present invention.
（II）抗腫瘍物質のスクリーニング方法
本発明はまた、抗腫瘍作用を有する物質（抗腫瘍物質）をスクリーニングする方法を提供する。当該方法は、多くの被験物質のなかから、非ヒト動物に投与した場合に、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を低下させる作用を有する物質を選別することによって実施することができる。
(II) Screening Method for Antitumor Substance The present invention also provides a method for screening a substance having an antitumor action (antitumor substance). The method can be performed by selecting a substance having an action of reducing the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal when administered to the non-human animal from many test substances.
具体的には、抗腫瘍物質のスクリーニングは、前述する被験物質の抗腫瘍作用の評価方法に従って、下記の工程(1) を行うことによって実施することができる。
(1)被験物質を非ヒト動物に投与して、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程。
Specifically, screening for an antitumor substance can be performed by performing the following step (1) according to the above-described method for evaluating the antitumor action of a test substance.
(1) A step of administering a test substance to a non-human animal and measuring splenic sympathetic nerve activity of the non-human animal.
好ましくは本発明のスクリーニング方法は、上記工程(1)に続いて、下記の工程(2)を行うことによって実施することができる：
(2)上記工程(1)において、被験物質を投与した非ヒト動物の脾臓交感神経の活動が、被験物質を投与しない非ヒト動物の脾臓交感神経の活動よりも低下する場合に、当該被験物質について抗腫瘍作用があると判断する工程。
Preferably, the screening method of the present invention can be carried out by performing the following step (2) following the above step (1):
(2) In the above step (1), when the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal administered with the test substance is lower than the activity of the spleen sympathetic nerve of the non-human animal not administered with the test substance, the test substance The step of determining that antitumor activity is present.
ここで使用する非ヒト動物の種類や脾臓交感神経の活動の測定方法は、いずれも前述する本発明の評価方法で採用するものを同様に用いることができる。 As the method for measuring the type of non-human animal and the activity of splenic sympathetic nerve used here, those employed in the evaluation method of the present invention described above can be used in the same manner.
斯くして、非ヒト動物に投与した場合に当該動物の脾臓交感神経の活動が低下することが確認された被験物質は、抗腫瘍作用を有する物質（抗腫瘍物質）として判断取得することができる。 Thus, a test substance that is confirmed to have decreased splenic sympathetic nerve activity when administered to a non-human animal can be determined and acquired as a substance having antitumor activity (antitumor substance). .
なお、非ヒト動物への投与方法としては、前述する本発明の評価方法と同様に、経皮投与、静脈投与、経鼻投与、経口投与および経腸投与を挙げることができる。皮膚投与（塗布および貼付を含む）によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質をスクリーニングするためには、被験物質を経皮投与することが好ましい。経腸投与（小腸投与および直腸投与を含む）によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質をスクリーニングするためには、被験物質を経腸投与することが好ましく、また経鼻投与または匂い刺激によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質をスクリーニングするためには、被験物質を経鼻投与または経鼻摂取させることが好ましい。 Examples of the administration method to non-human animals include transdermal administration, intravenous administration, nasal administration, oral administration and enteral administration, as in the evaluation method of the present invention described above. In order to screen for a test substance that exhibits an antitumor action by skin administration (including application and patching), it is preferable to administer the test substance transdermally. In order to screen for test substances that exert an antitumor effect by enteral administration (including small intestine administration and rectal administration), it is preferable to enter the test substance enterally, and antitumor action by nasal administration or odor stimulation In order to screen for test substances that exhibit the above, it is preferable to administer the test substance nasally or nasally.
また経口的に摂取させることによって抗腫瘍作用を発揮する被験物質をスクリーニングするためには、被験物質を経口投与することが好ましい。なお、経口によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質を選別する場合は、まず経腸投与を用いて第一次スクリーニングすることで、予め経腸投与によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質を選別し、次いで、ここで選別された被験物質について経口投与を用いた第二次スクリーニングを行って、経口投与によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質を選別する方法を採用してもよい。 In addition, in order to screen for a test substance that exerts an antitumor action when taken orally, it is preferable to administer the test substance orally. In addition, when selecting a test substance that exerts an antitumor effect by oral, first, a test substance that exhibits an antitumor effect by enteral administration is selected in advance by first screening using enteral administration, Subsequently, a secondary screening using oral administration may be performed on the test substance selected here, and a test substance that exhibits an antitumor action by oral administration may be selected.
斯くして本発明のスクリーニング方法によって選別された抗腫瘍物質は、さらに腫瘍細胞を移植した病態モデル動物などを用いた有効性試験、安全性試験、さらにヒトを対象とした試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な抗腫瘍物質を選別取得することができる。 Thus, the antitumor substance selected by the screening method of the present invention may be further used for efficacy tests, safety tests, and tests for humans using pathological model animals transplanted with tumor cells. By carrying out these tests, more practical antitumor substances can be selected and obtained.
またこのようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の種類に応じて、化学的合成、生物学的合成（発酵を含む）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができ、抗腫瘍剤、抗腫瘍効果を有する外用組成物、経口組成物（食品、動物餌料を含む）または芳香剤や香料の有効成分として使用することができる。 The substances selected in this way are subjected to structural analysis as necessary, and then, depending on the type of the substance, chemical synthesis, biological synthesis (including fermentation), or genetic manipulation, It can be manufactured industrially and can be used as an active ingredient of an antitumor agent, an external composition having an antitumor effect, an oral composition (including food and animal feed), or a fragrance or a fragrance.
（III）抗腫瘍剤
本発明はまた、上記本発明の評価方法で抗腫瘍作用があると判断される抗腫瘍物質を有効成分とする抗腫瘍剤を提供する。なお当該抗腫瘍剤には、ヒト医薬品としての抗腫瘍剤のみならず、動物（例えば、イヌやネコなどのペット）用医薬品としての抗腫瘍剤が含まれる。
(III) Antitumor Agent The present invention also provides an antitumor agent comprising, as an active ingredient, an antitumor substance that is judged to have an antitumor action by the evaluation method of the present invention. The anti-tumor agent includes not only an anti-tumor agent as a human drug but also an anti-tumor agent as a drug for animals (for example, pets such as dogs and cats).
かかる抗腫瘍物質として、実験例１〜２で示すように、アルギニンとリジンの混合物を挙げることができる。当該混合物は、非ヒト動物に50mMの割合で投与（好ましくは経口投与）したときに、脾臓交感神経活動の低下を示すとともに、腫瘍の増殖率の低下（抗腫瘍作用）を示すことが確認されている。 Examples of such an antitumor substance include a mixture of arginine and lysine as shown in Experimental Examples 1 and 2. It has been confirmed that the mixture exhibits a decrease in splenic sympathetic nerve activity and a decrease in tumor growth rate (antitumor effect) when administered to a non-human animal at a ratio of 50 mM (preferably orally). ing.
このため当該アルギニンとリジンの混合物は、抗腫瘍のための有効成分、特に経口投与または経腸投与することで抗腫瘍作用を発揮する抗腫瘍有効成分として、有効に用いることができる。このためアルギニンとリジンの混合物は、抗腫瘍を効果・効能とする抗腫瘍剤、食品または動物餌料、特に経口または経腸投与用の抗腫瘍剤の有効成分として使用することができる。すなわち、本発明によれば、アルギニンとリジンの混合物を有効成分とし、抗腫瘍を効能・効果とする経口または経腸投与形態を有する抗腫瘍剤を提供することができる。 Therefore, the mixture of arginine and lysine can be effectively used as an active ingredient for antitumor, particularly as an antitumor active ingredient that exhibits an antitumor action by oral administration or enteral administration. For this reason, a mixture of arginine and lysine can be used as an active ingredient of an antitumor agent having an antitumor effect / efficacy, a food or animal feed, particularly an antitumor agent for oral or enteral administration. That is, according to the present invention, an antitumor agent having an oral or enteral administration form having a mixture of arginine and lysine as an active ingredient and having antitumor efficacy / effect can be provided.
当該抗腫瘍剤に含まれるアルギニンとリジンの配合量は、抗腫瘍剤が抗腫瘍効果を備える限り、特に制限されず、通常１〜１００重量％の範囲から適宜選択して用いることができる。好ましくは５０〜１００重量％を挙げることができる。当該抗腫瘍剤の形態は、経口または経腸投与形態であれば特に制限されず、例えば飲料形態（ドリンク形態）、ゲルまたはシロップ形態、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、粉末または顆粒状形態などの経口投与形態、ならびにクリーム、固形、またはカプセルなどの汎用の坐剤形態を有する経腸投与形態を挙げることができる。 The blending amount of arginine and lysine contained in the antitumor agent is not particularly limited as long as the antitumor agent has an antitumor effect, and can be appropriately selected and used usually in the range of 1 to 100% by weight. Preferably 50-100 weight% can be mentioned. The form of the antitumor agent is not particularly limited as long as it is an oral or enteral administration form. For example, a drink form (drink form), a gel or syrup form, a tablet form, a pill form, a capsule form, a powder or a granular form. As well as enteral dosage forms having general suppository forms such as creams, solids, or capsules.
アルギニンとリジンの混合物の投与量としては、制限はされないが、後述する実験例の結果から、１回投与あたりそれぞれ25mmole以上であることが好ましい。 The dose of the mixture of arginine and lysine is not limited, but is preferably 25 mmole or more per administration from the results of experimental examples described below.
また抗腫瘍物質として、実験例３〜４で示すように、ミルセンを挙げることができる。当該ミルセンを、非ヒト動物に経鼻的に摂取させると、脾臓交感神経活動の低下を示すとともに、腫瘍の増殖率の低下（抗腫瘍作用）を示すことが確認されている。なお、ミルセン、特にβ−ミルセン（7-メチル-3-メチレンオクタ-1,6-ジエン）は、ローリエ、バーベナ、キャラウェイ、フェンネル、タラゴン、イノンド、オウシュウヨモギ、セイヨウトウキなどの植物に含まれている天然のモノテルペン炭化水素である。 As an antitumor substance, myrcene can be mentioned as shown in Experimental Examples 3 to 4. It has been confirmed that when the myrcene is ingested nasally by a non-human animal, the splenic sympathetic nerve activity is reduced and the growth rate of the tumor is reduced (antitumor effect). In addition, myrcene, especially β-myrcene (7-methyl-3-methyleneocta-1,6-diene) is contained in plants such as Laurier, Verbena, Caraway, Fennel, Tarragon, Inond, Sugomogi, and Japanese cherry. Natural monoterpene hydrocarbon.
このため当該ミルセンは、抗腫瘍のための有効成分、特に経鼻投与するか、または経鼻的に摂取させることで抗腫瘍作用を発揮する抗腫瘍有効成分として、有効に用いることができる。このためミルセンは、抗腫瘍を効果・効能とする抗腫瘍剤、特に経鼻投与用の抗腫瘍剤、または抗腫瘍を効果・効能とする芳香剤（アロマセラピーに使用するアロマ剤を含む）の有効成分として使用することができる。すなわち、本発明によれば、ミルセンを有効成分とし、抗腫瘍を効能・効果とする経鼻投与形態を有する抗腫瘍剤、香料や芳香剤を提供することができる。 For this reason, the myrcene can be effectively used as an active ingredient for antitumor, particularly as an antitumor active ingredient that exerts an antitumor action when administered nasally or taken nasally. Therefore, myrcene is an antitumor agent that has antitumor effects / efficacy, especially anti-tumor agents for nasal administration, or fragrances that have antitumor effects / efficacy (including aromatherapy agents used for aromatherapy). It can be used as an active ingredient. That is, according to the present invention, it is possible to provide an antitumor agent, a fragrance, and a fragrance that have a nasal administration form that uses myrcene as an active ingredient and has an antitumor effect.
当該抗腫瘍剤などに含まれるミルセンの配合量は、抗腫瘍剤が抗腫瘍効果を備える限り、特に制限されず、通常１〜１００重量％の範囲から適宜選択して用いることができる。当該抗腫瘍剤の形態は、経鼻投与形態であれば特に制限されず、例えば、滴剤、噴霧剤（噴霧器を用いて噴霧する液剤、エアゾル剤など）、洗浄剤、注入剤などとすることができる。取り扱いの簡便性の点では、プッシュ式容器で一回のプッシュで定量の有効成分が放出する機能を有するものが好ましい。 The amount of myrcene contained in the antitumor agent or the like is not particularly limited as long as the antitumor agent has an antitumor effect, and can be appropriately selected from the range of 1 to 100% by weight. The form of the antitumor agent is not particularly limited as long as it is a nasal administration form. For example, a drop, a spray (a liquid sprayed using a sprayer, an aerosol, etc.), a cleaning agent, an injection, etc. Can do. From the viewpoint of ease of handling, it is preferable to use a push-type container that has a function of releasing a fixed amount of an active ingredient with a single push.
ミルセンの投与量としては、制限はされないが、後述する実験例の結果から、室温25℃、湿度60％の条件下で100倍から10,000倍のミルセン水稀釈懸濁液から蒸発する量であることが好ましい。 The dose of myrcene is not limited, but from the results of experimental examples described later, it should be an amount that evaporates from a 100-fold to 10,000-fold myrcene water dilution suspension at room temperature of 25 ° C and humidity of 60%. Is preferred.
以下、本発明を実験例によって更に詳細に説明する。但し、これらの実験例は本発明を何ら限定するものではない。なお、下記の実験例において、特に言及しない限り、％は重量％を意味するものとする。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to experimental examples. However, these experimental examples do not limit the present invention. In the following experimental examples, “%” means “% by weight” unless otherwise specified.
実験例１
（１）実験方法
（1-1）被験試料の調製
アルギニン（Arg）とリジン（Lys）の混合物を、それぞれの濃度が2mM、10mM、および50mMとなるように水に溶解し、これを被験試料とした。また、対照試料として、水を用いた。
Experimental example 1
(1) Experimental method (1-1) Preparation of test sample Dissolve a mixture of arginine (Arg) and lysine (Lys) in water so that their concentrations are 2 mM, 10 mM, and 50 mM, respectively. It was. Moreover, water was used as a control sample.
（1-2）被験動物
実験には、4週令の雌BALB/c slc nu/nuヌードマウスを、12時間毎の明暗周期（8時〜20時まで点灯）下に24℃の恒温動物室にて１週間以上飼育したマウスを使用した。飼育には餌（オリエンタル酵母、MF）及び水を自由摂取させた。斯くして飼育した体重約20gの雌ヌードマウスに、無麻酔下に皮下注射によりヒト大腸癌細胞（HCT116、2.5x106cells/mouse）を移植して、癌細胞移植マウスを作製し、これを被験動物とした。
(1-2) Test animals For the experiment, 4 weeks old female BALB / c slc nu / nu nude mice were kept in a constant temperature animal room at 24 ° C under a 12-hour light-dark cycle (lighted from 8 o'clock to 20 o'clock). Mice were used for 1 week or longer. For the breeding, food (oriental yeast, MF) and water were ingested freely. In this way, human colon cancer cells (HCT116, 2.5x10 6 cells / mouse) were transplanted by subcutaneous injection under anesthesia to female nude mice with a body weight of about 20 g to produce cancer cell transplanted mice. This was a test animal.
（1-3）実験方法
被験動物（各群４匹ずつ）に、唯一の飲料水として被験試料（アルギニンとリジンをそれぞれ2mMずつ、10mMずつおよび50mMずつを含む水）自由摂取させながら28日間飼育し、経時的に腫瘍細胞の大きさおよび重量を測定した（被験試料投与群：2mM投与群、10mM投与群、50mM投与群）。具体的には、大腸癌細胞移植後、週３回腫瘍の大きさを最大径（腫瘍の最も長い部位の長さ、L）とそれに直角に交わる線上の腫瘍の幅（W）のそれぞれをmm単位で測定し、腫瘍体積を下式に従って求めた(Gonzalez et al. J. Biol. Chem. 281: 20851-20864 (2006))。
(1-3) Experimental method Breeding for 28 days while allowing test animals (4 animals in each group) to freely ingest test samples (water containing arginine and
全ての群（2mM被験試料投与群、10mM被験試料投与群、50mM被験試料投与群、水投与対照群：各群４匹ずつ）のマウスについて、実験終了後に腫瘍の外観を写真撮影し、次いで腫瘍を取り出してその重量（g）を測定した。データは全て平均値±標準誤差で示す。また統計検定は分散分析法（analysis of variance, NOVA, with repeated measures）および Mann-Whitney U-testにて行った。 For the mice of all groups (2 mM test sample administration group, 10 mM test sample administration group, 50 mM test sample administration group, water administration control group: 4 mice each), the appearance of the tumor was photographed after the experiment was completed, and then the tumor Was taken out and its weight (g) was measured. All data are shown as mean ± standard error. Statistical tests were performed using analysis of variance (NOVA, with repeated measures) and Mann-Whitney U-test.
（２）実験結果
図２に各群（2mM被験試料投与群、10mM被験試料投与群、50mM被験試料投与群、水投与対照群）の腫瘍体積（mm3）の経時的変化を示す。水投与対照群のマウスではヒト大腸癌細胞移植28日後に、腫瘍体積が400mm３を越える腫瘍塊の形成が認められた（---●---）。これと比較して2mM被験試料投与群のマウスでは、腫瘍体積が500mm３を越えるまでに大きく腫瘍塊が形成された（P<0.01、F=7.85 by ANOVA；ANOVA法により５分から40分までの値を群として比較した）（−●−）。ところが、10mM被験試料投与群のマウスの腫瘍体積は、水投与対照群のマウスの腫瘍体積と比較して、移植18日後までは小さかったが、28日目までにはむしろ水投与対照群のマウスの腫瘍体積を追い越す程で、両群間の腫瘍体積には有意差が認められなかった（---▲---）。これに対して50mM被験試料投与群のマウスの腫瘍体積は、水投与対照群のマウスの腫瘍体積よりも著しくかつ有意に小さかった（P<0.05、F=4.31 by ANOVA）（―▲―）。
(2) Experimental results FIG. 2 shows changes over time in the tumor volume (mm 3 ) of each group (2 mM test sample administration group, 10 mM test sample administration group, 50 mM test sample administration group, water administration control group). In the water-administered control group, formation of a tumor mass exceeding the tumor volume of 400 mm 3 was observed 28 days after human colon cancer cell transplantation (--- ● ---). Compared with this, in the 2 mM test sample administration group, a large tumor mass was formed by the tumor volume exceeding 500 mm 3 (P <0.01, F = 7.85 by ANOVA; 5 to 40 minutes by ANOVA method). The values were compared as a group) (− ● −). However, the tumor volume of the mice in the 10 mM test sample administration group was small until the 18th day after transplantation compared to the tumor volume of the mice in the water administration control group, but rather the mice in the water administration control group by the 28th day. There was no significant difference in the tumor volume between the two groups (--- ▲ ---). In contrast, the tumor volume of the mice in the 50 mM test sample administration group was significantly and significantly smaller than the tumor volume of the mice in the water administration control group (P <0.05, F = 4.31 by ANOVA) (-▲-).
各群のマウスは、腫瘍移植28日後にすべて大量ウレタン麻酔薬投与によって屠殺した。屠殺時の腫瘍の外観写真を図３に、摘出した腫瘍塊の写真を図４に、それぞれ示す。図３と図４からも、水投与対照群のマウスの腫瘍塊の大きさと比較して、2mM被験試料投与群のマウスの腫瘍塊は大きくなり、一方、50mM被験試料投与群のマウスの腫瘍塊は小さくなっていることが確認された。 All mice in each group were sacrificed 28 days after tumor implantation by administration of a large amount of urethane anesthetic. A photograph of the appearance of the tumor at the time of sacrifice is shown in FIG. 3, and a photograph of the excised tumor mass is shown in FIG. 3 and 4 also show that the tumor mass of the mouse in the 2 mM test sample administration group is larger than the tumor mass of the mouse in the water administration control group, while the tumor mass of the mouse in the 50 mM test sample administration group is large. Was confirmed to be smaller.
図５には摘出した腫瘍塊の重量を示す。Mann-Whitney U-testによる統計計算では５％の危険率では有意な差違が認められなかったが、水投与対照群の腫瘍塊の重量と比較して、2mM被験試料投与群のマウスの腫瘍塊の重量は増加し、一方、50mM被験試料投与群のマウスの腫瘍塊の重量は低下する傾向が認められた（図５）。 FIG. 5 shows the weight of the excised tumor mass. The statistical calculation by Mann-Whitney U-test showed no significant difference at a 5% risk rate, but compared to the weight of the tumor mass in the water-treated control group, the tumor mass of the mouse in the 2 mM test sample-administered group On the other hand, the tumor mass weight of mice in the 50 mM test sample administration group tended to decrease (FIG. 5).
これらの結果からわかるように、被験試料（アルギニンとリジンの混合物）の経口投与によって、濃度依存的にヌードマウスに移植したヒト大腸癌細胞によって形成される腫瘍は、その増殖が制御され、2mM濃度で腫瘍は有意に増加し、10mM濃度では殆ど水投与対照群と変化なく、50mM濃度では腫瘍の大きさは有意に低下した。また、実験終了後に摘出した腫瘍塊の重量にも同じ傾向が認められた。 As can be seen from these results, tumors formed by human colon cancer cells transplanted into nude mice in a dose-dependent manner by the oral administration of the test sample (mixture of arginine and lysine), the growth of which is controlled, the concentration of 2 mM The tumor increased significantly, and at 10 mM concentration, there was almost no change from the water-treated control group, and at 50 mM concentration, the tumor size decreased significantly. Moreover, the same tendency was recognized also in the weight of the tumor mass extracted after completion | finish of experiment.
実験例２
（Ｉ）脾臓交感神経（遠心枝）の電気活動の測定
（１）実験方法
（1-1）被験試料の調製
アルギニンとリジンの混合物を、それぞれの濃度が2mM、10mM、および50mMとなるように水に溶解し、これを被験試料とした。また、対照試料として、水を用いた。
Experimental example 2
(I) Measurement of electrical activity of splenic sympathetic nerves (centrifugal branches) (1) Experimental method (1-1) Preparation of test sample Mixtures of arginine and lysine so that their concentrations are 2 mM, 10 mM, and 50 mM, respectively. This was dissolved in water and used as a test sample. Moreover, water was used as a control sample.
（1-2）被験動物
予め１週間、24±1℃、12時間周期の明期（照明80lx、7:00-19:00）及び暗期（19:00-7:00）の環境下で飼育したラット（雄、Wistar rat、250〜300g）を被験動物（非ヒト動物）として用いた。なお、実験前、ラットには飼料（MF type; Oriental Yeast）と水を自由に摂取させた。
(1-2) Test animals Preliminarily for 1 week at 24 ± 1 ° C, 12 hours light period (
上記ラットを3時間絶食させた後、ウレタン麻酔下（1g/kgのウレタン水溶液を腹腔内投与内）で、上記で調製した被験試料（2mM、10mM、50mM Arg＋Lys）、またはコントロールとして水のみを、それぞれ1mlずつ経口投与して、投与直後から40分間、脾臓交感神経の遠心枝の神経活動（電気活動）の変化を測定した。具体的には、3時間絶食後、明期の中間期にウレタン麻酔下に開腹し、脾臓交感神経を銀電極で吊り上げ、既述の方法(Tanida et al. Am. J. Physiol. 288: R447-R455 (2005))にて、脾臓交感神経の変化を測定した。この測定値が落ち着いた時期(13時頃)に、各種の被験試料（アルギニンとリジンを、それぞれ、2mMずつ、10mMずつおよび50mMずつを含む水溶液) １mlを経口投与して脾臓交感神経活動の変化を電気生理学的に測定した。脾臓交感神経（遠心枝）の電気活動の測定は、具体的には、ラットの脾臓交感神経の遠心枝を、実体顕微鏡下で、銀電極に釣り上げて行った。乾燥を防ぐ為に電極は予め液体パラフィンとワセリンの混合物に十分浸しておいた。得られた神経の電気活動は、差動増幅器にて増幅し、オシロスコープにてモニターした。脾臓交感神経の神経活動を検出するために、ノイズ信号をウィンドウ・ディスクリミネーターにより分離し、スパイク信号に変換した。得られたスパイク信号はレイトメーターにより５秒間のスパイク数としてカウントし、A／D(アナログ／デジタル)変換後、パソコンに記録した（図１参照）。電気活動の記録は40分間行った（図６Ｂ参照）。なお、被験試料の経口投与は、口腔内に挿入したポリエチレンチューブを使用し、投与速度を1 ml/minに設定して行った。手術開始から測定終了までチューブを気管に挿入して気道を確保し、保温装置にて体温(ラット直腸温)を36.0±0.5℃に保つようにした。対照実験としては、対照試料（水）を1ml、同様の条件で十二指腸内投与することで行った。 After fasting the rat for 3 hours, under urethane anesthesia (1 g / kg aqueous urethane solution intraperitoneally administered), the test sample prepared above (2 mM, 10 mM, 50 mM Arg + Lys), or only water as a control, 1 ml each was orally administered, and the change in the nerve activity (electric activity) of the distal branch of the splenic sympathetic nerve was measured for 40 minutes immediately after administration. Specifically, after fasting for 3 hours, the abdomen was opened under urethane anesthesia in the middle of the light period, and the splenic sympathetic nerve was lifted with a silver electrode, and the method described above (Tanida et al. Am. J. Physiol. 288: R447 -R455 (2005)), changes in splenic sympathetic nerves were measured. Changes in splenic sympathetic nerve activity by oral administration of 1 ml of various test samples (aqueous solutions containing 2 mM, 10 mM, and 50 mM, respectively) at the time when this measurement value settled (around 13:00) Was measured electrophysiologically. Specifically, the electrical activity of the splenic sympathetic nerve (centrifugal branch) was measured by lifting the splenic sympathetic nerve branch of the rat onto a silver electrode under a stereomicroscope. In order to prevent drying, the electrode was previously sufficiently immersed in a mixture of liquid paraffin and petrolatum. The obtained nerve electrical activity was amplified with a differential amplifier and monitored with an oscilloscope. In order to detect splenic sympathetic nerve activity, the noise signal was separated by a window discriminator and converted into a spike signal. The obtained spike signal was counted as the number of spikes for 5 seconds by a late meter, and was recorded on a personal computer after A / D (analog / digital) conversion (see FIG. 1). Electrical activity was recorded for 40 minutes (see FIG. 6B). The oral administration of the test sample was performed using a polyethylene tube inserted into the oral cavity and setting the administration rate to 1 ml / min. A tube was inserted into the trachea from the start of the operation to the end of the measurement to secure the airway, and the body temperature (rat rectal temperature) was maintained at 36.0 ± 0.5 ° C. with a heat retaining device. As a control experiment, 1 ml of a control sample (water) was administered into the duodenum under the same conditions.
脾臓交感神経の活動のデータは5分間毎の5秒あたりの発火頻度(pulse/5 s)の平均値にて解析し投与前の値を100％として百分率で表した。 Data on splenic sympathetic nerve activity was analyzed by the average value of the firing frequency (pulse / 5 s) per 5 seconds every 5 minutes and expressed as a percentage with the value before administration as 100%.
（２）実験結果
結果を図６に示す。なお、図６の（Ａ）は実測データであり、（Ｂ）はこの実測データを、投与前の実測データ（スパイク数）を100％として、5分毎の平均値でグラフ化したものである（0−40分間）。なお、図６（Ａ）の一番上は対照として水を投与したラット（水投与対照ラット）の実測データ〔図６（Ｂ）：―●―〕、２番目は2mMの被験試料を投与したラット（2mM被験試料投与ラット）の実測データ〔図６（Ｂ）：---●--〕、３番目は10mMの被験試料を投与したラット（10mM被験試料投与ラット）の実測データ（図６（Ｂ）：---▲---）、一番下は50mMの被験試料を投与したラット（50mM被験試料投与ラット）の実測データ〔図６（Ｂ）：---◆---〕を示す。
(2) Experimental results The results are shown in FIG. 6A shows actual measurement data, and FIG. 6B is a graph of this actual measurement data, with the actual measurement data before administration (number of spikes) taken as 100%, with an average value every 5 minutes. (0-40 minutes). The top of FIG. 6 (A) is measured data of a rat administered with water as a control (water-treated control rat) [FIG. 6 (B):-●-], and the second is a 2 mM test sample administered. Measured data of rat (2 mM test sample-administered rat) [FIG. 6B: --- ●-] Third, measured data of rat (10 mM test sample-administered rat) administered with 10 mM test sample (FIG. 6) (B): --- ▲ ---), the bottom is measured data of a rat administered with a 50 mM test sample (50 mM test sample-administered rat) [FIG. 6B: --- ◆ ---] Indicates.
図６（Ａ）および（Ｂ）からわかるように、水投与対照ラットおよび10mM被験試料投与ラットの脾臓交感神経の活動（電気活動）は、それらの投与前と殆ど変わらなかったのに対して、2mM被験試料投与ラットの脾臓交感神経の活動は増加し、また50mM被験試料投与ラットの脾臓交感神経の活動は著明に低下した。 As can be seen from FIGS. 6 (A) and (B), the splenic sympathetic nerve activity (electrical activity) of water-treated control rats and 10 mM test sample-treated rats was almost the same as that before the administration, The splenic sympathetic nerve activity of the rats treated with 2 mM test sample increased, and the splenic sympathetic nerve activity of the rats treated with 50 mM test sample decreased markedly.
この結果からわかるように、被験試料の経口投与によって、濃度依存的に脾臓を支配する交感神経の活動が制御され、2mM濃度で脾臓交感神経の活動は有意に増加し、50mM濃度で脾臓交感神経の活動は有意に低下した。 As can be seen from this result, the activity of the sympathetic nerve that controls the spleen is controlled in a concentration-dependent manner by the oral administration of the test sample. Activity decreased significantly.
（II）脾臓交感神経の活動と腫瘍の増殖率との相関関係
実験例１および２で得られた結果から、下記の方法に従って腫瘍の増殖率（％）および脾臓交感神経活動の抑制率（％）を求めた。
(1) 腫瘍の増殖率（％）の求め方
腫瘍の増殖率（％）は、各被験試料投与群（2mM被験試料投与群、10mM被験試料投与群、50mM被験試料投与群）の移植28日後のマウスの腫瘍体積を、水投与対照群の移植28日後のマウスの腫瘍体積を100％として、百分率に換算することによって算出した。
(2)脾臓交感神経活動の抑制率（％）の求め方
脾臓交感神経活動の抑制率（％）は、図６（Ｂ）に示すグラフを元に、各被験試料投与ラット（2mM被験試料投与ラット、10mM被験試料投与ラット、50mM被験試料投与ラット）の0〜40分までの脾臓交感神経活動値（Splenic-SNA）−時間曲線下面積を、水投与対照ラットの0〜40分までの脾臓交感神経活動値（Splenic-SNA）−時間曲線下面積を100％として、百分率に換算することによって算出した。
(II) Correlation between splenic sympathetic nerve activity and tumor growth rate From the results obtained in Experimental Examples 1 and 2, tumor growth rate (%) and splenic sympathetic nerve activity inhibition rate (%) according to the following methods )
(1) Determination of tumor growth rate (%) Tumor growth rate (%) is 28 days after transplantation in each test sample administration group (2 mM test sample administration group, 10 mM test sample administration group, 50 mM test sample administration group). The tumor volume of the mice was calculated by converting the tumor volume of the mice 28 days after transplantation in the water-administered control group to 100% as a percentage.
(2) Determination of spleen sympathetic nerve activity inhibition rate (%) The spleen sympathetic nerve activity inhibition rate (%) was determined based on the graph shown in FIG. Splenic sympathetic nerve activity value (Splenic-SNA) -time curve area from 0 to 40 minutes (rat, 10 mM test sample-administered rat, 50 mM test sample-administered rat) The area under the sympathetic nerve activity value (Splenic-SNA) -time curve was taken as 100%, and the percentage was calculated by converting to percentage.
但し、実際には、均質な紙に図６（Ｂ）を印刷し、各被験試料投与ラットおよび水投与対照ラットの、0分から40分までの脾臓交感神経活動値（Splenic-SNA）−時間曲線下面積を切りとり、それぞれ重量を測定し、水投与対照ラットについて切り取った重量を100％した時の、各被験試料投与ラットに関する重量を百分率に換算して面積の低下を抑制率として算出した。 However, in actuality, FIG. 6B is printed on homogeneous paper, and the splenic sympathetic nerve activity value (Splenic-SNA) -time curve from 0 to 40 minutes for each test sample-administered rat and water-administered control rat. The lower area was cut out, the respective weights were measured, and when the weight cut out for the water-administered control rats was taken as 100%, the weight for each test sample-administered rat was converted to a percentage, and the decrease in area was calculated as the inhibition rate.
上記で得られた結果を、脾臓交感神経活動の抑制率（％）を横軸、腫瘍の増殖率（％）を縦軸にしてグラフにした結果を図７に示す。図７の図中の数式は直線の近似式と相関係数を示す。 FIG. 7 shows a graph of the results obtained above, with the suppression rate (%) of splenic sympathetic nerve activity on the horizontal axis and the tumor growth rate (%) on the vertical axis. The numerical formula in the figure of FIG. 7 shows a linear approximation formula and a correlation coefficient.
図７から、脾臓交感神経活動の抑制率と腫瘍の増殖率とは良好な相関関係にあり、脾臓交感神経活動の低下は、腫瘍の増殖低下を反映することが判明した。このことから、脾臓交感神経の活動（電気活動）を測定しその低下を指標とすることによって、被験物質の抗腫瘍湿作用を評価することができると考えられる。また、脾臓交感神経の活動を抑制する物質は、ＮＫ細胞を高めることにより腫瘍の増殖を抑制し、抗がん作用を発揮すると考えられる。 From FIG. 7, it was found that the suppression rate of splenic sympathetic nerve activity and the growth rate of tumor are in a good correlation, and the decrease in splenic sympathetic nerve activity reflects the decrease in tumor growth. From this, it is considered that the antitumor wet action of the test substance can be evaluated by measuring the activity (electric activity) of the spleen sympathetic nerve and using the decrease as an index. Moreover, it is thought that the substance which suppresses the activity of a spleen sympathetic nerve suppresses the growth of a tumor by raising NK cells and exhibits an anticancer effect.
実験例３
（１）実験方法
（1-1）被験試料の調製
β−ミルセン（和光純薬工業（株）製）を10,000倍の水に懸濁して噴霧液として調製し、これを被験試料とした。また、対照試料として、水を用いた。
Experimental example 3
(1) Experimental method (1-1) Preparation of test sample β-Myrcene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was suspended in 10,000 times water to prepare a spray solution, and this was used as a test sample. Moreover, water was used as a control sample.
（1-2）被験動物
実験には、4週令の雌BALB/c slc nu/nuヌードマウスを、12時間毎の明暗周期（8時〜20時まで点灯）下に24℃の恒温動物室にて１週間以上飼育したマウスを使用した。飼育には餌（オリエンタル酵母、MF）及び水を自由摂取させた。斯くして飼育した体重約20gの雌ヌードマウスに、無麻酔下に皮下注射によりヒト大腸癌細胞（HCT116、2.5x106cells/mouse）を移植して、癌細胞移植マウスを作製し、これを被験動物とした。
(1-2) Test animals For the experiment, 4 weeks old female BALB / c slc nu / nu nude mice were kept in a constant temperature animal room at 24 ° C under a 12-hour light-dark cycle (lighted from 8 o'clock to 20 o'clock). Mice were used for 1 week or longer. For the breeding, food (oriental yeast, MF) and water were ingested freely. In this way, human colon cancer cells (HCT116, 2.5x10 6 cells / mouse) were transplanted by subcutaneous injection under anesthesia to female nude mice with a body weight of about 20 g to produce cancer cell transplanted mice. This was a test animal.
（1-3）実験方法
被験動物（各群５匹ずつ）に、ヒト大腸癌細胞移植後、毎日13時から13時半までの30分間、β−ミルセンを10,000倍の水に懸濁した被験試料を噴霧した。実際には、ヌードマウスを入れた飼育箱に、被験試料（ミルセン希釈懸濁液）または対照試料（水）を散布する装置をセットした。毎日、定時に被験試料または対照試料を散布するように、散布装置に24時間繰り返しタイマーをとりつけた。
(1-3) Experimental method A test in which β-myrcene was suspended in 10,000 times water for 30 minutes from 13:00 to 13:30 daily after transplantation of human colon cancer cells to test animals (five animals in each group) The sample was sprayed. Actually, a device for spraying a test sample (Myrsen diluted suspension) or a control sample (water) was set in a breeding box containing nude mice. The spraying device was fitted with a timer for 24 hours so that the test sample or the control sample was sprayed on a regular basis every day.
このように毎日30分間、被験試料（ミルセン希釈懸濁液）または対照試料（水）を散布する条件下で、被験動物を、大腸癌細胞移植後21日間飼育して、経時的に腫瘍細胞の大きさおよび重量を、実験例１に記載する方法に準じて測定した（Myrcene投与群、Water投与群：各群５匹ずつ）。 全ての群（Myrcene投与群、Water投与群）のマウスについて、実験終了後に腫瘍の外観を写真撮影し、次いで腫瘍を取り出してその重量（g）を測定した。データは全て平均値±標準誤差で示す。また統計検定は分散分析法（analysis of variance, NOVA, with repeated measures）および two-samples t-testにて行った。 In this way, the test animals were bred for 21 days after colon cancer cell transplantation under conditions where the test sample (myrcene diluted suspension) or the control sample (water) was sprayed every day for 30 minutes. The size and weight were measured according to the method described in Experimental Example 1 (Myrcene administration group, Water administration group: 5 mice in each group). With respect to mice of all groups (Myrcene administration group, Water administration group), the appearance of the tumor was photographed after the experiment was completed, and then the tumor was taken out and its weight (g) was measured. All data are shown as mean ± standard error. Statistical tests were performed by analysis of variance (NOVA, with repeated measures) and two-samples t-test.
（２）実験結果
図８に各群（Myrcene投与群、Water投与群）の腫瘍体積（mm3）の経時的変化を示す。ヒト大腸癌細胞移植11日後から、Myrcene投与群（―■―）は、Water投与群（―●―）と比較して、腫瘍体積の増加が抑制され、移植後4日目から21日目までの値を群として分散分析法（ANOVA）にて比較するとMyrcene投与群のヒト大腸癌細胞の形成する腫瘍の体積はWater投与群のそれよりも有意に小さかった（P<0.05, F=5.05 by ANOVA）。
(2) Experimental results FIG. 8 shows changes over time in the tumor volume (mm 3 ) of each group (Myrcene administration group, Water administration group). From 11 days after human colon cancer cell transplantation, the Myrcene administration group (-■-) suppressed tumor volume increase compared to the Water administration group (-●-), from the 4th day to the 21st day after transplantation. As a group, the volume of tumor formed by human colon cancer cells in the Myrcene group was significantly smaller than that in the Water group (P <0.05, F = 5.05 by) ANOVA).
各群のマウスは、腫瘍移植21日後にすべて大量ウレタン麻酔薬投与によって屠殺した。屠殺時の腫瘍の外観写真を図９に、摘出した腫瘍塊の写真を図１０に、それぞれ示す。図９と図１０からも、Water投与群の腫瘍塊の大きさと比較して、Myrcene投与群の腫瘍塊は小さくなっていることが確認された。 All mice in each group were sacrificed 21 days after tumor implantation by administration of a large amount of urethane anesthetic. A photograph of the appearance of the tumor at the time of sacrifice is shown in FIG. 9, and a photograph of the excised tumor mass is shown in FIG. 9 and 10 also confirmed that the tumor mass in the Myrcene administration group was smaller than the size of the tumor mass in the Water administration group.
図１１に摘出した腫瘍塊の重量を示す。Water投与群の腫瘍塊の重量と比較して、Myrcene投与群の腫瘍塊の重量は有意に低下することが確認された（P<0.05 by two-samples t-test）。 FIG. 11 shows the weight of the excised tumor mass. It was confirmed that the weight of the tumor mass in the Myrcene administration group was significantly reduced as compared with the weight of the tumor mass in the Water administration group (P <0.05 by two-samples t-test).
これらの結果から、被験試料（ミルセン希釈懸濁液）を経鼻的に摂取させることによって、ヌードマウスに移植したヒト大腸癌細胞から形成される腫瘍は、その増殖が有意に抑制されることが確認できた。 From these results, it is found that the growth of tumors formed from human colon cancer cells transplanted into nude mice can be significantly suppressed by nasally ingesting the test sample (myrcene diluted suspension). It could be confirmed.
実験例４
（Ｉ）脾臓交感神経（遠心枝）の電気活動の測定
（１）実験方法
（1-1）被験試料の調製
β−ミルセン（和光純薬工業（株）製）を100倍の水に懸濁して、これを被験試料とした。また、対照試料として水を用いた。
Experimental Example 4
(I) Measurement of electrical activity of splenic sympathetic nerve (centrifuge branch) (1) Experimental method (1-1) Preparation of test sample β-Myrcene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is suspended in 100 times water. This was used as a test sample. Water was used as a control sample.
（1-2）被験動物
予め１週間、24±1℃、12時間周期の明期（照明80lx、7:00-19:00）及び暗期（19:00-7:00）の環境下で飼育したラット（雄、Wistar rat、250〜300g）を被験動物（非ヒト動物）として用いた。なお、実験前、ラットには飼料（MF type; Oriental Yeast）と水を自由に摂取させた。
(1-2) Test animals Preliminarily for 1 week at 24 ± 1 ° C, 12 hours light period (
上記ラットを3時間絶食させた後、ウレタン麻酔下（1g/kgのウレタン水溶液を腹腔内投与内）で、上記で調製した被験試料（ミルセン希釈懸濁液）、またはコントロールとして対照試料（水）を経鼻的に摂取させて、脾臓交感神経の遠心枝の神経活動（電気活動）の変化を測定した（各群３匹ずつ）。具体的には、3時間絶食後、明期の中間期にウレタン麻酔下に開腹し、脾臓交感神経を銀電極で吊り上げ、既述の方法(Tanida et al. Am. J. Physiol. 288: R447-R455 (2005))にて、脾臓交感神経の変化を測定した。この測定値が落ち着いた時期(13時頃)に、ウレタン麻酔ラットの鼻先に被験試料または対照試料を染みこませた綿花をいれたビーカーを配置し、既述の方法(Shen et al. Neurosci. Lett. 380:289-294 (2005))にて10分間、匂い刺激して、脾臓交感神経活動（splenic sympathetic nerve activity、Splenic-SNA）の変化を、実験例２の方法と同様にして電気生理学的に測定した。 After fasting the rat for 3 hours, under urethane anesthesia (1 g / kg aqueous urethane solution intraperitoneally), the test sample prepared above (Myrcene diluted suspension) or the control sample (water) as a control Was measured intranasally and the change in the nerve activity (electric activity) of the distal branch of the splenic sympathetic nerve was measured (three mice in each group). Specifically, after fasting for 3 hours, the abdomen was opened under urethane anesthesia in the middle of the light period, and the splenic sympathetic nerve was lifted with a silver electrode, and the method described above (Tanida et al. Am. J. Physiol. 288: R447 -R455 (2005)), changes in splenic sympathetic nerves were measured. At the time when this measured value settled (around 13:00), a beaker containing a cotton sample soaked with a test sample or a control sample was placed at the nose of a urethane anesthetized rat, and the method described previously (Shen et al. Neurosci. Lett. 380: 289-294 (2005)) for 10 minutes, splenic sympathetic nerve activity (Splenic-SNA) changes in electrophysiology in the same manner as in Experimental Example 2 Measured.
脾臓交感神経の活動のデータは5分間毎の5秒あたりの発火頻度(pulse/5 s)の平均値にて解析し投与前の値を100％として百分率で表した。 Data on splenic sympathetic nerve activity was analyzed by the average value of the firing frequency (pulse / 5 s) per 5 seconds every 5 minutes and expressed as a percentage with the value before administration as 100%.
（２）実験結果
結果を図１２に示す。なお、図１２の（Ａ）は実測データであり、（Ｂ）はこの実測データを、投与前の実測データ（スパイク数）を100％として、5分毎の平均値でグラフ化したものである（0−60分間）。なお、図１２（Ａ）の左欄は対照として水を投与したラット（Water投与群）の実測データ〔図１２（Ｂ）：---●---〕、右欄は被験試料を投与したラット（Myrcene投与群）の実測データ〔図１２（Ｂ）：―●―〕を示す。
(2) Experimental results The results are shown in FIG. In FIG. 12, (A) is actual measurement data, and (B) is a graph of the actual measurement data, with the actual measurement data (number of spikes) before administration taken as 100%, as an average value every 5 minutes. (0-60 minutes). In addition, the left column of FIG. 12 (A) is actually measured data [FIG. 12 (B): -------] of the rat (Water administration group) which administered water as a control, and the right column administered the test sample. Measured data [FIG. 12 (B):-●-] of rats (Myrcene administration group) is shown.
図１２（Ａ）および（Ｂ）からわかるように、Water投与群の脾臓交感神経の活動は、水投与前と殆ど変わらず、水刺激によっては脾臓交感神経の活動を殆ど変化しなかったが、Myrcene投与群の脾臓交感神経の活動は著明に低下した（P<0.005, F=127 by ANOVA）。 As can be seen from FIGS. 12 (A) and (B), the activity of the splenic sympathetic nerve of the Water administration group was almost the same as that before the administration of water, and the activity of the spleen sympathetic nerve was hardly changed by water stimulation. The activity of the splenic sympathetic nerve in the Myrcene group was significantly reduced (P <0.005, F = 127 by ANOVA).
これらの結果からわかるように、被験試料（ミルセン希釈混濁液）の経鼻投与によって、脾臓交感神経の活動は有意に低下し、またヌードマウスに移植した腫瘍は、その増殖が有意に抑制されることが確認できた。すなわち、実験例３と４の結果からも、実験例１と２で示すように、脾臓交感神経活動の抑制と腫瘍の増殖率とは良好な相関関係にあり、脾臓交感神経活動の低下は、腫瘍の増殖低下を反映することが確認された。 As can be seen from these results, splenic sympathetic nerve activity is significantly reduced by nasal administration of the test sample (Myrcene diluted turbid solution), and the growth of tumors transplanted into nude mice is significantly suppressed. I was able to confirm. That is, from the results of Experimental Examples 3 and 4, as shown in Experimental Examples 1 and 2, there is a good correlation between the suppression of splenic sympathetic nerve activity and the growth rate of the tumor, and the decrease in splenic sympathetic nerve activity is It was confirmed to reflect a decrease in tumor growth.
Claims (6)
(1)被験物質を非ヒト動物に投与し、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程。 A method for evaluating the antitumor action of a test substance, which comprises the following steps:
(1) A step of administering a test substance to a non-human animal and measuring splenic sympathetic nerve activity of the non-human animal.
(2)被験物質を投与した非ヒト動物の脾臓交感神経の活動が、被験物質を投与しない非ヒト動物の脾臓交感神経の活動よりも低下する場合に、当該被験物質について抗腫瘍作用があると判断する工程。 The method for evaluating antitumor activity according to claim 1, further comprising the following steps:
(2) When the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal administered with the test substance is lower than the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal not administered with the test substance, the test substance has an antitumor effect. The process of judging.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007538062A (en) * | 2004-05-20 | 2007-12-27 | エーデン リサーチ ピーエルシー | Compositions containing terpene component encapsulated hollow glucan particles or cell wall particles, methods of making and using them |
-
2008
- 2008-04-30 JP JP2008118198A patent/JP2009265053A/en active Pending
- 2008-11-07 WO PCT/JP2008/070315 patent/WO2009133642A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007538062A (en) * | 2004-05-20 | 2007-12-27 | エーデン リサーチ ピーエルシー | Compositions containing terpene component encapsulated hollow glucan particles or cell wall particles, methods of making and using them |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN7013002012; 新島: 'ラット胸腺および脾臓を支配する自律神経の働きに及ぼすアルギニン-リジン静脈内投与の効果について' 日本肥満学会記録 １６, 1996, ２８７-２８８ * |
| JPN7013002013; 永井: '自律神経活動測定によるアロマ製品，健康食品及び薬剤の開発技術［１］ Ｉ 原理編 身体の恒常性維持に重要な' 食品と容器 ４７（７）, 2006, ４１８-４２６ * |
| JPN7013002014; 沢村: '芳香分析とその機能特性' 第６４回分析科学討論会講演要旨集 , 2003, ２３４ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009133642A1 (en) | 2009-11-05 |
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