JP2009250721A - Analyzing method of intermolecular interaction - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により迅速かつ精度よく判断する方法に関する。 The present invention relates to a method for quickly and accurately determining the presence or absence of an intermolecular interaction by a fluorescence intensity distribution analysis method (FIDA).
近年の光計測技術の発展は目覚ましく、蛍光一分子からの蛍光を測定・解析することができる一分子蛍光分析技術が多くの分野で応用されつつある。このような一分子蛍光分析技術には、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）や蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ）等がある。 The development of optical measurement technology in recent years is remarkable, and single molecule fluorescence analysis technology capable of measuring and analyzing fluorescence from a single fluorescent molecule is being applied in many fields. Such single-molecule fluorescence analysis techniques include fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence intensity distribution analysis (Fluorescence-Intensity Distribution Analysis: FIDA), and the like.
一分子蛍光分析技術は、レーザー共焦点顕微鏡の光学系と、フォトンカウンティング（１光子検出）可能な超高感度の光検出装置とを用いて、溶液中の微小空間内の蛍光一分子レベルの蛍光シグナルを測定し、その蛍光シグナルの揺らぎや強度を、種々の方法により解析することにより、該蛍光分子の大きさや密度等の情報を得ることができる。このため、生物科学、医学、薬学等の分野では、一分子蛍光分析技術が、生体分子等の状態や運動の検出・観測に応用されており、例えば、タンパク質と核酸の結合反応や抗原抗体反応を解明する試みがなされている（例えば、特許文献１及び２並びに非特許文献１参照。）
Single molecule fluorescence analysis technology uses a laser confocal microscope optical system and an ultrasensitive photodetection device capable of photon counting (single-photon detection), and the fluorescence at a single molecule level in a minute space in a solution. Information such as the size and density of the fluorescent molecule can be obtained by measuring the signal and analyzing the fluctuation and intensity of the fluorescent signal by various methods. For this reason, in the fields of biological science, medicine, pharmacy, etc., single-molecule fluorescence analysis technology has been applied to the detection and observation of the state and movement of biomolecules, such as protein-nucleic acid binding reactions and antigen-antibody reactions. (See, for example,
ＦＣＳは、検出された蛍光シグナルから、蛍光分子の標識拡散する時間（並進拡散時間）を求めることができる解析法である。並進拡散時間は分子の大きさによって異なるため、分子の相互作用や分解、凝集等の大きさの変化をモニターするために主に用いられる解析法である。また、観測領域中に存在する蛍光分子の数を算出することができるため、試料溶液における蛍光分子の濃度を概算することが可能である。さらに、試料溶液中に２種類以上の大きさを持つ蛍光分子が存在している場合、それぞれの並進拡散時間を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。例えば、分子間相互作用により複数の分子が結合している反応体は、相互作用していない分子よりも大きくなるため、該反応体の並進拡散時間はより長くなる。このため、並進拡散時間を求めることにより、分子間相互作用の有無を判別することができる。 FCS is an analysis method that can determine the label diffusion time (translational diffusion time) of fluorescent molecules from the detected fluorescent signal. Since the translational diffusion time varies depending on the size of the molecule, it is an analysis method mainly used to monitor changes in size such as molecular interaction, decomposition, and aggregation. In addition, since the number of fluorescent molecules present in the observation region can be calculated, the concentration of fluorescent molecules in the sample solution can be estimated. Furthermore, when there are two or more kinds of fluorescent molecules in the sample solution, the number and ratio of the molecules having the respective translational diffusion times can be calculated. For example, a reactant in which a plurality of molecules are bonded by intermolecular interaction becomes larger than a molecule that does not interact, and therefore the translational diffusion time of the reactant becomes longer. Therefore, the presence or absence of intermolecular interaction can be determined by obtaining the translational diffusion time.
ＦＩＤＡは、蛍光分子の一分子当たりの蛍光強度を求めることができる解析法であり、蛍光分子が他の分子と相互作用した結果、分子に結合している蛍光色素の発光効率等が変化したことに起因する蛍光強度の変化を検出することにより、分子間の相互作用を検出することができる。例えば、複数の蛍光標識分子が１の非蛍光標識分子と相互作用して形成された反応体の一分子当たりの蛍光強度は、相互作用していない蛍光標識分子よりも高くなる傾向がある。このため、蛍光強度を求めることにより、分子間相互作用の有無を判別することができる。
前述したように、並進拡散時間は蛍光分子の大きさに依存しているため、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無を判別することができる。しかしながら、一試料当たりの計測時間が数十秒と長く、また、計測値のばらつきが大きいという問題がある。 As described above, since the translational diffusion time depends on the size of the fluorescent molecule, even if the fluorescently labeled molecule and the non-fluorescently labeled molecule react 1: 1 to form a reactant, It is possible to determine the presence or absence of interaction. However, there are problems that the measurement time per sample is as long as several tens of seconds and that the measurement values vary greatly.
一方で、ＦＩＤＡは、一試料当たりの計測時間が数秒と短く、また、計測値のばらつきも非常に小さいという利点を有する。しかしながら、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合には、溶液中の蛍光分子の一分子当たりの蛍光強度に変化が起こりにくく、このため、分子間相互作用の有無を判別することができない、という問題がある。 On the other hand, FIDA has the advantage that the measurement time per sample is as short as a few seconds, and the variation in measured values is very small. However, when the fluorescently labeled molecule and the non-fluorescently labeled molecule react with each other to form a reactant, the fluorescence intensity per molecule of the fluorescent molecule in the solution hardly changes. There is a problem that it is impossible to determine the presence or absence of an inter-action.
本発明は、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無を、計測の精度及び迅速性に優れたＦＩＤＡにより判断するための方法を提供することを目的とする。 In the present invention, even when a fluorescently labeled molecule and a non-fluorescently labeled molecule are reacted in a 1: 1 ratio to form a reactant, the presence or absence of intermolecular interaction is determined with FIDA having excellent measurement accuracy and rapidity. It aims at providing the method for judging by.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、蛍光色素を用いて標識した分子（蛍光標識分子）と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により蛍光強度を求める場合に、標識に用いる蛍光色素として、該蛍光色素による蛍光強度が、レーザー光の照射により退色し易いものを用い、かつ、ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことにより、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無を判別し得ることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventor has determined whether or not there is an intermolecular interaction between a molecule labeled with a fluorescent dye (fluorescently labeled molecule) and a non-fluorescently labeled molecule. When the fluorescence intensity is determined by FIDA), the fluorescent dye used for the label is one whose fluorescence intensity is likely to fade when irradiated with laser light, and FIDA is performed in the presence of an anti-fading agent. Thus, even when the fluorescently labeled molecule and the non-fluorescently labeled molecule are reacted at 1: 1 to form a reactant, it has been found that the presence or absence of intermolecular interaction can be determined, and the present invention has been completed. It was.
すなわち、本発明は、蛍光色素を用いて標識した分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により蛍光強度を求めることにより判別する方法において、前記蛍光色素が、ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素であり、
前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記蛍光色素が、フルオレセイン、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン誘導体、フルオレセインイソチオシアナート、カルボキシフルオレセイン、テキサスレッド、オレゴングリーンからなる群より選択される色素であることを特徴とする前記記載の分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記退色防止剤が、ヒドロキシラジカル又はスーパーオキシドラジカル除去能を有する化合物であることを特徴とする前記記載の分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
また、本発明は、前記退色防止剤が、システアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、プロピルガレート、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノル−１−オキシル、５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドからなる群より選択される１以上であることを特徴とする前記記載の分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
また、本発明は、蛍光色素を用いて標識した分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により蛍光強度を求めることにより判別する方法において、前記蛍光色素が退色しやすい蛍光色素であり、前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
That is, the present invention relates to a method for determining the presence or absence of intermolecular interaction between a molecule labeled with a fluorescent dye and a non-fluorescent labeled molecule by determining the fluorescence intensity by fluorescence intensity distribution analysis (FIDA), The fluorescent dye is a fluorescent dye that reacts with radicals and easily fades.
The present invention provides a method for analyzing an intermolecular interaction, wherein the FIDA is performed in the presence of an anti-fading agent.
Further, in the present invention, the fluorescent dye is a group consisting of fluorescein, 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene derivative, fluorescein isothiocyanate, carboxyfluorescein, Texas red, and Oregon green. The present invention provides a method for analyzing an intermolecular interaction as described above, wherein the dye is a more selected dye.
The present invention also provides the method for analyzing an intermolecular interaction as described above, wherein the anti-fading agent is a compound having hydroxy radical or superoxide radical removing ability.
Further, in the present invention, the anti-fading agent is cysteamine, 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane, propyl gallate, 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl, 2,2 , 6,6-tetramethyl-4-piperidinol-1-oxyl, or 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide. It provides an analysis method of interaction.
Further, the present invention relates to a method for determining the presence or absence of intermolecular interaction between a molecule labeled with a fluorescent dye and a non-fluorescent labeled molecule by determining the fluorescence intensity by a fluorescence intensity distribution analysis method (FIDA), The present invention provides a method for analyzing an intermolecular interaction, wherein the fluorescent dye is a fluorescent dye that easily fades, and the FIDA is performed in the presence of an anti-fading agent.
本発明の分子間相互作用の解析方法を用いることにより、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無を迅速かつ高精度に判別することができる。 By using the method for analyzing intermolecular interactions according to the present invention, even when a fluorescently labeled molecule and a non-fluorescently labeled molecule react 1: 1 to form a reactant, the presence or absence of intermolecular interaction is determined. The determination can be made quickly and with high accuracy.
通常、ＦＩＤＡを始めとする蛍光分析を行う場合には、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）等のように、連続して光照射を行っても退色せず安定して蛍光を発する色素が用いられる。このような光照射の時間や回数の影響を受けにくい高安定性の蛍光色素を用いることにより、計測値ごとのばらつきを防止し、より安定した解析結果を得ることができると考えられているためである。 Usually, when performing fluorescence analysis including FIDA, a dye that stably emits fluorescence without fading even when continuously irradiated with light, such as TMR (tetramethylrhodamine), is used. It is thought that by using a highly stable fluorescent dye that is not easily affected by the time and number of times of light irradiation, it is possible to prevent variations in measurement values and obtain more stable analysis results. It is.
蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で分子間相互作用をする場合には、理論的には、蛍光標識分子単量体と、蛍光標識分子と非蛍光標識分子の結合反応体（以下、単に結合反応体ということがある。）の蛍光強度は同等である。実際に、常法に従い高安定性の蛍光色素を用いた場合には、蛍光標識分子単量体と、蛍光標識分子と非蛍光標識分子の反応体の判別は非常に困難である。 When a fluorescently labeled molecule and a non-fluorescently labeled molecule interact with each other at a ratio of 1: 1, theoretically, a fluorescently labeled molecule monomer and a binding reactant of the fluorescently labeled molecule and the nonfluorescently labeled molecule (hereinafter referred to as “the fluorescently labeled molecule”) , Sometimes referred to simply as binding reactants). Actually, when a highly stable fluorescent dye is used according to a conventional method, it is very difficult to distinguish between a fluorescently labeled molecule monomer and a reactant of a fluorescently labeled molecule and a non-fluorescently labeled molecule.
ＦＩＤＡにより蛍光標識分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を判別するためには、蛍光標識分子単量体の蛍光強度と、蛍光標識分子と非蛍光標識分子との反応体の蛍光強度とにおいて、判別可能な程度の相違が観測される必要がある。ここで、蛍光標識分子単量体と結合反応体とは、レーザー光が照射される観測領域の通過時間が異なることから、観測領域の通過時間に応じて蛍光強度が変化する場合には、蛍光標識分子単量体と結合反応体の蛍光強度に、判別可能な程度の相違が生じるため、ＦＩＤＡによっても分子間相互作用の有無を迅速かつ高精度に判別することができる。 In order to determine the presence or absence of intermolecular interaction between a fluorescently labeled molecule and a nonfluorescently labeled molecule by FIDA, the fluorescence intensity of the fluorescently labeled molecule monomer and the fluorescence of the reactant of the fluorescently labeled molecule and the nonfluorescently labeled molecule are determined. A discernable difference in intensity needs to be observed. Here, since the fluorescence labeled molecular monomer and the binding reactant are different in the transit time of the observation region irradiated with the laser light, the fluorescence intensity changes depending on the transit time of the observation region. Since there is a discriminable difference between the fluorescence intensity of the labeled molecule monomer and the binding reactant, the presence or absence of intermolecular interaction can be quickly and accurately discriminated by FIDA.
本発明の分子間相互作用の解析方法は、蛍光色素を用いて標識した分子と非蛍光標識分子との分子間相互作用の有無を、ＦＩＤＡにより蛍光強度を求めることにより判別する方法において、前記蛍光色素が退色しやすい蛍光色素であり、前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする。蛍光標識分子として退色し易い蛍光色素を用いて標識した分子を用いることにより、測定試料溶液中の蛍光標識分子と非蛍光標識分子が、１：１で分子間相互作用をする場合であっても、該分子間相互作用の結果形成された結合反応体の蛍光強度と、該蛍光標識分子単量体の蛍光強度とを、識別可能な程度に異ならせることができるため、該分子間相互作用の有無を判別することができる。 The method for analyzing an intermolecular interaction according to the present invention is a method for determining the presence or absence of intermolecular interaction between a molecule labeled with a fluorescent dye and a non-fluorescent labeled molecule by determining the fluorescence intensity by FIDA. The dye is a fluorescent dye that easily fades, and the FIDA is performed in the presence of an anti-fading agent. Even when the fluorescently labeled molecule and the non-fluorescently labeled molecule in the measurement sample solution have a 1: 1 molecular interaction by using a molecule labeled with a fluorescent dye that easily fades as the fluorescently labeled molecule. Since the fluorescence intensity of the binding reactant formed as a result of the intermolecular interaction and the fluorescence intensity of the fluorescently labeled molecular monomer can be differentiated to an identifiable level, The presence or absence can be determined.
ある分子の観測領域の通過時間は、該分子の大きさに依存する。例えば、大きな分子は観測領域の通過時間が長く、小さな分子は観測領域の通過時間が短い。つまり、大きな分子ほどレーザー光が照射される時間が長くなる。したがって、標識に用いる蛍光色素を、退色しやすい蛍光色素（以下、易退色性蛍光色素ということがある。）とすることにより、測定試料中の蛍光分子の蛍光強度を、レーザー光が照射される観測領域の通過時間に応じて変化させることが可能となる。例えば、分子量が比較的大きい結合反応体のほうが、観測領域の通過時間が長く、長時間レーザー光が照射される結果、蛍光標識分子単量体よりも早く退色する。この結果、蛍光標識分子単量体と結合反応体の蛍光強度を相違させることが可能となる。 The transit time of an observation region of a molecule depends on the size of the molecule. For example, a large molecule has a long transit time in the observation region, and a small molecule has a short transit time in the observation region. That is, the larger the molecule, the longer the time for which the laser beam is irradiated. Therefore, the fluorescent dye used for labeling is a fluorescent dye that is easily faded (hereinafter, also referred to as an easily faded fluorescent dye), so that the fluorescence intensity of the fluorescent molecules in the measurement sample is irradiated with laser light. It can be changed according to the transit time of the observation area. For example, a binding reactant having a relatively large molecular weight has a longer passage time in the observation region, and as a result of being irradiated with laser light for a long time, it fades faster than a fluorescently labeled molecular monomer. As a result, the fluorescence intensity of the fluorescently labeled molecular monomer and the binding reactant can be made different.
なお、本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる易退色性蛍光色素とは、一般的にレーザー光の照射により退色し易いとされている蛍光色素であれば、特に限定されるものではない。例えば、適した励起波長のレーザー光を５００μＷの強度で５秒間の照射を５回繰り返した場合に、５回目の照射時の蛍光強度が、１回目の照射時の蛍光強度の２０％以上減衰する蛍光色素であることが好ましい。 The fading fluorescent dye used in the method for analyzing intermolecular interaction of the present invention is not particularly limited as long as it is generally considered to be fading easily by laser light irradiation. Absent. For example, when a laser beam with a suitable excitation wavelength is irradiated 5 times at 500 μW intensity for 5 seconds, the fluorescence intensity at the time of the fifth irradiation attenuates by 20% or more of the fluorescence intensity at the time of the first irradiation. A fluorescent dye is preferred.
ここで、測定試料中に退色防止剤を添加することにより、観測される蛍光強度において、蛍光標識分子単量体と結合反応体とをより明確に相違させることができる。これは、退色防止剤により、蛍光標識分子単量体の退色が抑制されるためと推察される。 Here, by adding an anti-fading agent to the measurement sample, the fluorescence labeled molecular monomer and the binding reactant can be more clearly differentiated in the observed fluorescence intensity. This is presumably because the fading preventing agent suppresses fading of the fluorescently labeled molecular monomer.
本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる易退色性蛍光色素は、分子間相互作用の結果形成された結合反応体中の蛍光色素と、蛍光標識分子の単量体中の蛍光色素が、蛍光強度において識別可能な程度に異ならせることができる程度に退色し易い蛍光色素であれば特に限定されるものではないが、ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素であることが好ましい。ここで、ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素とは、退色反応においてラジカルが関与している蛍光色素を意味する。例えば、ラジカルと直接反応することにより退色する蛍光色素であってもよく、退色反応においてラジカルが触媒として機能する蛍光色素であってもよい。 The easily fading fluorescent dye used in the method for analyzing intermolecular interaction of the present invention is composed of a fluorescent dye in a binding reactant formed as a result of intermolecular interaction and a fluorescent dye in a monomer of a fluorescently labeled molecule. The fluorescent dye is not particularly limited as long as it is easily discolored to such an extent that it can be discriminated in terms of fluorescence intensity. However, it is preferably a fluorescent dye that easily reacts with a radical to cause discoloration. Here, the fluorescent dye that easily reacts with radicals and fades means a fluorescent dye that involves radicals in the fading reaction. For example, it may be a fluorescent dye that fades by directly reacting with a radical, or a fluorescent dye in which a radical functions as a catalyst in the fading reaction.
ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素として、例えば、フルオレセイン、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン誘導体（ＢＯＤＩＰＹ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テキサスレッド、オレゴングリーン等がある。これらの蛍光色素は、フルオレセインのように、退色反応にラジカルが関与していることが明らかになっているものであってもよく、ラジカル存在下で退色が促進されることが経験的に分かっているものであってもよい（例えば、ジョンソン（Johnson）、外５名、１９８２年、ジャーナル・オブ・イミュノロジカルメソッヅ（Journal of immunological methods）、第５５巻第２号、２３１〜２４２ページ参照。）。 Examples of fluorescent dyes that easily react with radicals and fade, such as fluorescein, 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene derivative (BODIPY), fluorescein isothiocyanate (FITC), carboxyfluorescein (FAM), Texas Red, Oregon Green, etc. These fluorescent dyes, such as fluorescein, may be those that have been shown to be involved in the fading reaction, and experience has shown that fading is promoted in the presence of radicals. (See, for example, Johnson, 5 others, 1982, Journal of immunological methods, Vol. 55, No. 2, pages 231-242). .)
本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる退色防止剤は、分子の標識に用いられる蛍光色素に対する光照射の影響を低減することができる化合物であれば特に限定されるものではなく、蛍光色素の種類等を考慮して適宜選択して用いることができる。ヒドロキシラジカル又はスーパーオキシドラジカル除去能を有する化合物であることがより好ましい。ヒドロキシラジカル等除去能を有する化合物であれば、フルオレセイン等のラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素を用いた場合に、効果的に該蛍光色素の退色を防止することができる。 The anti-fading agent used in the intermolecular interaction analysis method of the present invention is not particularly limited as long as it is a compound that can reduce the effect of light irradiation on the fluorescent dye used for labeling the molecule. It can be appropriately selected and used in consideration of the type of the dye. A compound having a hydroxyl radical or superoxide radical removing ability is more preferable. If it is a compound having removal ability such as a hydroxy radical, fading of the fluorescent dye can be effectively prevented when a fluorescent dye which reacts with a radical such as fluorescein and easily fades.
このようなヒドロキシラジカル等除去能を有する化合物は、システアミンのように、特定の蛍光色素の退色防止剤として機能し得ることが明らかになっているものであってもよく、退色防止効果を有することが経験的に分かっているものであってもよい（例えば、サージェイ（Sergey）、外２名、１９９９年、アナリティカルバイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、第３０７巻第１号、８４〜９１ページ参照。）。また、光触媒においてスピントラップ剤として公知のものを用いることもできる。本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる退色防止剤としては、システアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、プロピルガレート、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノル−１−オキシル（ＴＥＭＰＯＬ）、５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）等であることが特に好ましい。 Such a compound having removal ability such as hydroxy radicals may have been shown to be capable of functioning as an anti-fading agent for a specific fluorescent dye, such as cysteamine, and has an anti-fading effect. (See, for example, Sergey, et al., 1999, Analytical Biochemistry, Vol. 307, No. 1, pages 84-91). ). Moreover, a well-known thing as a spin trap agent can also be used in a photocatalyst. Examples of the anti-fading agent used in the method for analyzing an intermolecular interaction of the present invention include cysteamine, 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO), propyl gallate, 2,2,6,6-tetra. With methylpiperidine-1-oxyl (TEMPO), 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinol-1-oxyl (TEMPOL), 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO), etc. It is particularly preferred.
本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる蛍光標識分子は、易退色性の蛍光色素を用いて標識した分子であって、ＦＩＤＡによる解析に通常供される種類の分子であれば特に限定されるものではない。例えば、タンパク質であってもよく、ペプチドであってもよく、核酸であってもよく、糖であってもよく、ビオチン等の低分子化合物であってもよい。また、これらの分子は、生体分子であってもよく、合成された化合物であってもよいが、解析の精度をより向上させることができるため、精製された分子であることが好ましい。 The fluorescently labeled molecule used in the method for analyzing intermolecular interaction of the present invention is a molecule labeled with an easily fading fluorescent dye and is particularly limited as long as it is a type of molecule that is usually used for analysis by FIDA. Is not to be done. For example, it may be a protein, a peptide, a nucleic acid, a sugar, or a low molecular compound such as biotin. These molecules may be biomolecules or synthesized compounds, but are preferably purified molecules because the accuracy of analysis can be further improved.
蛍光標識分子としては、タンパク質やペプチドは、アミノ酸のみから構成されるものであってもよく、糖タンパク質やリポタンパク質であってもよい。また、生物試料から精製されたタンパク質等であってもよく、公知の発現系を用いて得られたリコンビナントタンパク質であってもよい。また、核酸は、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよく、１本鎖核酸であってもよく、２本鎖核酸であってもよい。また、核酸類似体であってもよい。該核酸として、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ＰＣＲ増幅等による合成ＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等がある。 As a fluorescent labeling molecule, a protein or peptide may be composed only of amino acids, or may be a glycoprotein or a lipoprotein. Moreover, the protein etc. which were refine | purified from the biological sample may be sufficient, and the recombinant protein obtained using the well-known expression system may be sufficient. The nucleic acid may be either DNA or RNA, may be a single-stranded nucleic acid, or may be a double-stranded nucleic acid. It may also be a nucleic acid analog. Examples of the nucleic acid include genomic DNA, mRNA, hnRNA, synthetic DNA obtained by PCR amplification, cDNA synthesized from RNA using reverse transcriptase, and the like.
蛍光物質による標識の態様は、ＦＩＤＡに適するように、一分子当たりに標識される蛍光色素量が同等である限り、特に限定されるものではない。また、これらの分子の蛍光標識方法は、特に限定されるものではなく、各種類の分子を蛍光標識する場合に通常用いられる方法により蛍光標識することができる。例えば、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル) −カルボジイミド塩酸塩）法等により、分子に蛍光色素を化学的に結合させてもよく、蛍光標識された核酸やアミノ酸等を用いて合成と同時に標識してもよい。 The mode of labeling with a fluorescent substance is not particularly limited as long as the amount of fluorescent dye labeled per molecule is the same so as to be suitable for FIDA. Moreover, the fluorescent labeling method of these molecules is not particularly limited, and can be fluorescently labeled by a method usually used when fluorescently labeling each type of molecule. For example, a fluorescent dye may be chemically bonded to the molecule by the EDAC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride) method or the like, and a fluorescently labeled nucleic acid or amino acid is used. Labeling at the same time as synthesis.
本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられる非蛍光標識分子は、ＦＩＤＡによる解析に通常供される種類の分子であれば特に限定されるものではなく、蛍光標識分子において挙げられた分子を用いることができる。また、蛍光標識分子と非蛍光標識分子は、同一種類の分子であってもよく、異種類の分子であってもよい。例えば、蛍光標識分子と非蛍光標識分子の双方をタンパク質とし、タンパク質間の相互作用を、蛍光標識分子を核酸とし、非蛍光標識分子をタンパク質とすることにより、核酸とタンパク質の相互作用を、それぞれ解析することができる。また、蛍光標識分子を抗原とし、非蛍光標識分子を抗体とすることにより、抗原抗体反応を解析することもできる。さらに、蛍光標識分子を薬効が期待される合成された低分子化合物とし、非蛍光標識分子を生体分子とすることにより、新規医薬品のスクリーニング等を行うこともできる。 The non-fluorescent labeled molecule used in the method for analyzing intermolecular interaction of the present invention is not particularly limited as long as it is a kind of molecule usually used for analysis by FIDA. Can be used. The fluorescently labeled molecule and the non-fluorescently labeled molecule may be the same type of molecule or different types of molecules. For example, by using both fluorescently labeled molecules and non-fluorescently labeled molecules as proteins, interaction between proteins, fluorescently labeled molecules as nucleic acids, and nonfluorescently labeled molecules as proteins, respectively, Can be analyzed. In addition, antigen-antibody reaction can be analyzed by using a fluorescently labeled molecule as an antigen and a non-fluorescently labeled molecule as an antibody. Furthermore, by using a fluorescently labeled molecule as a synthesized low-molecular compound expected to have a medicinal effect and a non-fluorescently labeled molecule as a biomolecule, screening for a new drug can be performed.
本発明の分子間相互作用の解析方法を用いてある２種類の分子間の相互作用の有無を判断する場合に、いずれの種類の分子を蛍光標識分子とするかは、各分子の性質や大きさ、蛍光色素の標識方法等を考慮して、適宜決定することができるが、より小さい分子を蛍光標識分子とすることが好ましい。相互作用による蛍光強度の変化をより大きくすることができ、相互作用の有無の判別感度を向上し得るためである。 When determining the presence or absence of an interaction between two types of molecules using the method for analyzing an interaction between molecules of the present invention, which type of molecule is a fluorescently labeled molecule depends on the nature and size of each molecule. Although it can be appropriately determined in consideration of the labeling method of the fluorescent dye, etc., it is preferable to use a smaller molecule as the fluorescent labeling molecule. This is because the change in fluorescence intensity due to the interaction can be further increased, and the discrimination sensitivity for the presence or absence of the interaction can be improved.
具体的には、まず、蛍光標識分子と非蛍光標識分子と退色防止剤とを、測定試料用バッファーに添加することにより測定試料を調製する。測定試料用バッファーは、蛍光標識分子や非蛍光標識分子、退色防止剤、蛍光シグナル等に対する影響が少ないバッファーであれば、特に限定されるものではなく、通常一分子蛍光分析において用いられるバッファーを用いることができる。該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。測定試料用バッファーに添加する蛍光標識分子や非蛍光標識分子の濃度は、特に限定されるものではないが、１ｎＭ〜１０μＭであることが好ましい。また、蛍光標識分子よりも非蛍光標識分子の濃度が高いことがより好ましい。その他、退色防止剤の濃度は、蛍光標識分子の種類や濃度、退色防止剤の種類等を考慮して、適宜決定することができる。 Specifically, first, a measurement sample is prepared by adding a fluorescently labeled molecule, a non-fluorescently labeled molecule, and an anti-fading agent to a measurement sample buffer. The buffer for the measurement sample is not particularly limited as long as it is a buffer that has little influence on fluorescently labeled molecules, non-fluorescently labeled molecules, anti-fading agents, fluorescent signals, etc., and buffers that are usually used in single-molecule fluorescence analysis are used. be able to. Examples of the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a Tris buffer, and the like. The concentration of the fluorescently labeled molecule or the non-fluorescently labeled molecule added to the measurement sample buffer is not particularly limited, but is preferably 1 nM to 10 μM. Further, it is more preferable that the concentration of the non-fluorescent label molecule is higher than that of the fluorescent label molecule. In addition, the concentration of the anti-fading agent can be appropriately determined in consideration of the type and concentration of the fluorescent labeling molecule, the type of the anti-fading agent, and the like.
次に、該測定試料に、該蛍光標識分子の標識に用いた蛍光色素の分光特性に最適な波長の光を照射し、該蛍光標識分子からの蛍光シグナルを、高感度な検出装置を用いて経時的に検出し、該蛍光シグナルの揺らぎと強度を計測する。蛍光シグナルの検出は、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて行うことができる。計測された蛍光シグナルをＦＩＤＡにより解析し、各蛍光標識分子の蛍光強度を求める。 Next, the measurement sample is irradiated with light having a wavelength optimal for the spectral characteristics of the fluorescent dye used for labeling the fluorescently labeled molecule, and the fluorescence signal from the fluorescently labeled molecule is detected using a highly sensitive detection device. Detection is performed over time, and fluctuation and intensity of the fluorescent signal are measured. The detection of the fluorescence signal can be performed using, for example, a known single molecule fluorescence analysis system such as MF20 (manufactured by Olympus). The measured fluorescence signal is analyzed by FIDA to determine the fluorescence intensity of each fluorescently labeled molecule.
例えば、蛍光標識分子と退色防止剤の濃度を一定とし、非蛍光標識分子濃度を増減させた場合に、各測定試料から求められる蛍光強度が変動するか否かにより、蛍光標識分子と非蛍光標識分子の分子間相互作用の有無を判別することができる。例えば、非蛍光標識分子濃度を増大させた場合に、蛍光強度が減少する場合等、非蛍光標識分子濃度依存的に蛍光強度が変化する場合には、蛍光標識分子と非蛍光標識分子は相互作用していると判断することができる。逆に、非蛍光標識分子濃度を増減させた場合に、蛍光強度が特に変化しない場合には、蛍光標識分子と非蛍光標識分子は相互作用しないと判断することができる。
その他、ＦＩＤＡ解析では、測定試料中の蛍光分子の密度や数量も求めることができるため、相互作用をしている分子数を定量することも可能である。つまり、測定試料中の相互作用をしている分子数と、相互作用をしていない分子数の比率が求められるため、結合定数（Ｋｄ値）等の分子間相互作用の程度を示す指標等も求めることができる。
For example, when the concentration of the fluorescent labeling molecule and the anti-fading agent is kept constant and the concentration of the non-fluorescent labeling molecule is increased or decreased, the fluorescent labeling molecule and the non-fluorescent labeling depend on whether or not the fluorescence intensity required from each measurement sample varies. The presence or absence of intermolecular interactions of molecules can be determined. For example, when the fluorescence intensity changes depending on the concentration of the non-fluorescent label molecule, such as when the fluorescence intensity decreases when the non-fluorescent label molecule concentration is increased, the interaction between the fluorescent label molecule and the non-fluorescent label molecule It can be determined that Conversely, if the fluorescence intensity does not change particularly when the concentration of the non-fluorescent labeled molecule is increased or decreased, it can be determined that the fluorescent labeled molecule and the non-fluorescent labeled molecule do not interact.
In addition, in FIDA analysis, since the density and quantity of fluorescent molecules in a measurement sample can be obtained, the number of interacting molecules can be quantified. In other words, since the ratio of the number of interacting molecules in the measurement sample to the number of non-interacting molecules is obtained, an index indicating the degree of intermolecular interaction such as a binding constant (Kd value) is also provided. Can be sought.
本発明の分子間相互作用の解析方法は、検出用の蛍光色素として易退色性の蛍光色素を用いること、及び測定試料中に該蛍光色素の退色防止剤を添加すること以外は公知の一分子蛍光分析を行うことにより、簡便に分子間相互作用の有無を判別することができる。また、解析方法としてＦＩＤＡを用いることにより、迅速かつ高精度に蛍光シグナルを解析することが可能である。特に従来ＦＩＤＡでは非常に困難であった蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応する場合でも、分子間相互作用の有無を判別することができる。 The method for analyzing the interaction between molecules of the present invention is a known single molecule except that an easily fading fluorescent dye is used as a fluorescent dye for detection and an anti-fading agent for the fluorescent dye is added to a measurement sample. By performing fluorescence analysis, the presence or absence of intermolecular interaction can be easily determined. Further, by using FIDA as an analysis method, it is possible to analyze the fluorescence signal quickly and with high accuracy. In particular, even when a fluorescently labeled molecule and a non-fluorescently labeled molecule react with each other at 1: 1, which has been very difficult with conventional FIDA, it is possible to determine whether there is an intermolecular interaction.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
[実施例１]
フルオレセイン標識ビオチンと抗ビオチン抗体との反応を退色防止剤としてシステアミンを添加し計測を行った。
まず、フルオレセイン標識ビオチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を、ＰＢＳバッファー（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて希釈し、８ｎＭのフルオレセイン標識ビオチン溶液を調製した。また、抗ビオチン抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を、同様に希釈して、０、４、４０、２００、４００、２０００、４０００、１２０００ｎＭの抗ビオチン抗体溶液をそれぞれ調製した。さらに、粉末のシステアミン（ＳＩＧＭＡ社製）を、ＰＢＳバッファー（ＳＩＧＭＡ社製）に溶解させ、８０ｍＭのシステアミン溶液を調製した。
次に、フルオレセイン標識ビオチン溶液と、各濃度の抗ビオチン抗体溶液又はＰＢＳバッファーをそれぞれ２５μＬずつ混合し、室温で１５分間反応させた後、システアミン溶液を５０μＬずつそれぞれ添加して混合し、測定試料を調製した。該測定試料を測定用プレートに分注し、ＭＦ２０（オリンパス社製）にセットした後、波長：４８８ｎｍ、レーザーパワー：２００μＷ、測定時間：３秒間で蛍光シグナルを検出し、ＦＩＤＡ解析を行い、各測定試料中の蛍光標識分子（フルオレセイン標識ビオチン）の蛍光強度を求めた。なお、システアミン溶液に代えてＰＢＳバッファーを５０μＬずつそれぞれ添加して混合したものを、対照試料とし、同様にＦＩＤＡ解析を行い、各対照試料中の蛍光標識分子の蛍光強度を求めた。
[Example 1]
The reaction between fluorescein-labeled biotin and anti-biotin antibody was measured by adding cysteamine as an anti-fading agent.
First, fluorescein-labeled biotin (manufactured by Molecular Probes) was diluted with a PBS buffer (manufactured by SIGMA) to prepare an 8 nM fluorescein-labeled biotin solution. Further, anti-biotin antibodies (manufactured by SIGMA) were similarly diluted to prepare 0, 4, 40, 200, 400, 2000, 4000, 12000 nM anti-biotin antibody solutions, respectively. Furthermore, powdered cysteamine (manufactured by SIGMA) was dissolved in PBS buffer (manufactured by SIGMA) to prepare an 80 mM cysteamine solution.
Next, 25 μL each of the fluorescein-labeled biotin solution and each concentration of anti-biotin antibody solution or PBS buffer were mixed and reacted at room temperature for 15 minutes. Prepared. After dispensing the measurement sample to a measurement plate and setting it on MF20 (manufactured by Olympus), the fluorescence signal was detected at wavelength: 488 nm, laser power: 200 μW, measurement time: 3 seconds, and FIDA analysis was performed. The fluorescence intensity of the fluorescently labeled molecule (fluorescein-labeled biotin) in the measurement sample was determined. In addition, instead of the cysteamine solution, 50 μL each of PBS buffer added and mixed was used as a control sample, and FIDA analysis was performed in the same manner to determine the fluorescence intensity of the fluorescently labeled molecules in each control sample.
ＦＩＤＡ計測では、計測領域内の分子１つあたりの蛍光量（蛍光強度）を計測することが可能であり、その値はＱ（ｋＨｚ）で表される。図１（ａ）は、各測定試料から求められたＱ値を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図であり、図１（ｂ）は、各対照試料から求められたＱ値を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図である。各測定試料から求められたＱ値は、抗ビオチン抗体濃度依存的に低下する傾向が観察され、フルオレセイン標識ビオチンと抗ビオチン抗体が相互作用することが確認できた。一方、対照試料から求められたＱ値は、各試料とも２０ｋＨｚ弱とほぼ一定であり、抗ビオチン抗体未添加の測定試料のＱ値（約７０ｋＨｚ）よりもはるかに低く、抗ビオチン抗体濃度を増大させても変化しなかった。これは、対照試料では、退色防止剤であるシステアミンがないために、測定前からフルオレセインが退色してしまっているためと推察される。
以上の結果から、本発明の分子間相互作用の解析方法を用いることにより、ＦＩＤＡ計測により分子間相互作用の有無を判別し得ることが明らかである。
In FIDA measurement, it is possible to measure the amount of fluorescence (fluorescence intensity) per molecule in the measurement region, and the value is represented by Q (kHz). FIG. 1 (a) is a diagram in which the Q value obtained from each measurement sample is plotted for each anti-biotin antibody concentration, and FIG. 1 (b) shows the Q value obtained from each control sample as the anti-biotin antibody concentration. It is the figure plotted for every. The Q value obtained from each measurement sample tended to decrease depending on the anti-biotin antibody concentration, and it was confirmed that the fluorescein-labeled biotin and the anti-biotin antibody interacted with each other. On the other hand, the Q value obtained from the control sample is almost constant at a little less than 20 kHz for each sample, which is much lower than the Q value (about 70 kHz) of the measurement sample not added with the anti-biotin antibody, and increases the anti-biotin antibody concentration. It did not change even if I let it. This is presumably because fluorescein fades before measurement because the control sample does not have cysteamine, which is an anti-fading agent.
From the above results, it is clear that the presence or absence of intermolecular interactions can be determined by FIDA measurement by using the method for analyzing intermolecular interactions of the present invention.
[参考例１]
実施例１で使用したフルオレセイン標識ビオチンと抗ビオチン抗体とが相互作用をすることを、従来法であるＦＣＳ計測により確認した。
具体的には、実施例１と同様に調製した各測定試料を、測定用プレートに分注し、ＭＦ２０（オリンパス社製）にセットした後、波長：４８８ｎｍ、レーザーパワー：１００μＷ、測定時間：１５秒間で蛍光シグナルを検出し、ＦＣＳ解析を行い、各測定試料中の蛍光標識分子（フルオレセイン標識ビオチン）の並進拡散時間を求めた。
図２は、各測定試料から求められた並進拡散時間（μｓ）を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図である。抗ビオチン抗体濃度依存的な並進拡散時間の増大が観察された。これは、フルオレセイン標識ビオチンと抗ビオチン抗体の結合により、一分子あたりの分子サイズが増大していることを表しており、この結果から、両者の間に相互作用があることが明らかである。したがって、実施例１において観測されたＱ値の変化も、両者の相互作用によって引き起こされたものであるということができる。
[Reference Example 1]
The interaction between the fluorescein-labeled biotin used in Example 1 and the anti-biotin antibody was confirmed by conventional FCS measurement.
Specifically, each measurement sample prepared in the same manner as in Example 1 was dispensed onto a measurement plate and set on MF20 (manufactured by Olympus), then wavelength: 488 nm, laser power: 100 μW, measurement time: 15 The fluorescence signal was detected for 2 seconds, FCS analysis was performed, and the translational diffusion time of the fluorescence labeled molecule (fluorescein labeled biotin) in each measurement sample was determined.
FIG. 2 is a diagram in which the translational diffusion time (μs) obtained from each measurement sample is plotted for each anti-biotin antibody concentration. An increase in translational diffusion time dependent on anti-biotin antibody concentration was observed. This indicates that the molecular size per molecule is increased due to the binding of fluorescein-labeled biotin and anti-biotin antibody, and it is clear from these results that there is an interaction between the two. Therefore, it can be said that the change in the Q value observed in Example 1 is also caused by the interaction between the two.
[比較例１]
ＴＭＲ標識ビオチンと抗ビオチン抗体との反応を退色防止剤としてシステアミンを添加し計測を行った。ＴＭＲは通常ＦＩＤＡ計測において用いられる色素であり、高安定性の蛍光色素である。なお、この実験で用いるＴＭＲ標識ビオチンと抗ビオチン抗体が相互作用をすることは、参考例１と同様のＦＣＳ計測により、確認されている。
具体的には、フルオレセイン標識ビオチンに代えてＴＭＲ標識ビオチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、測定試料及び対照試料をそれぞれ調製した後、各試料中のＱ値を測定した。
図３（ａ）は、各測定試料から求められたＱ値を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図であり、図３（ｂ）は、各対照試料から求められたＱ値を抗ビオチン抗体濃度ごとにプロットした図である。ＴＭＲ標識ビオチンでは、実施例１とは異なり、システアミンの添加、不添加に関わらず、抗ビオチン抗体濃度依存的なＱ値の変化は観察されなかった。つまり、抗ビオチン抗体の添加の有無によってＱ値が変化しないため、ＴＭＲ標識ビオチンと抗ビオチン抗体の相互作用の有無は判別することができなかった。これは、ＴＭＲは高安定性の蛍光色素であるため、抗ビオチン抗体との反応による蛍光退色が生じていないためと推察される。
[Comparative Example 1]
The reaction between TMR-labeled biotin and anti-biotin antibody was measured by adding cysteamine as an anti-fading agent. TMR is a dye usually used in FIDA measurement, and is a highly stable fluorescent dye. The interaction between the TMR-labeled biotin and the anti-biotin antibody used in this experiment has been confirmed by the same FCS measurement as in Reference Example 1.
Specifically, after preparing a measurement sample and a control sample in the same manner as in Example 1 except that TMR-labeled biotin (manufactured by Molecular Probes) was used instead of fluorescein-labeled biotin, the Q in each sample was prepared. The value was measured.
FIG. 3 (a) is a diagram in which the Q value obtained from each measurement sample is plotted for each anti-biotin antibody concentration, and FIG. 3 (b) shows the Q value obtained from each control sample as the anti-biotin antibody concentration. It is the figure plotted for every. With TMR-labeled biotin, unlike Example 1, no change in the Q value depending on the anti-biotin antibody concentration was observed regardless of the addition or non-addition of cysteamine. That is, since the Q value does not change depending on whether or not an anti-biotin antibody is added, the presence or absence of the interaction between the TMR-labeled biotin and the anti-biotin antibody cannot be determined. This is presumably because TMR is a highly stable fluorescent dye, and therefore, no fluorescence fading occurs due to the reaction with the anti-biotin antibody.
以上の結果から、通常のＦＩＤＡ計測では非常に検出が困難であった分子間相互作用であっても、本発明の分子間相互作用の解析方法を用いることにより、該分子間相互作用の有無を判別し得ることが明らかである。 From the above results, even if it is an intermolecular interaction that was very difficult to detect by ordinary FIDA measurement, the presence or absence of the intermolecular interaction can be determined by using the method for analyzing intermolecular interaction of the present invention. It is clear that it can be distinguished.
[実施例２]
本発明の分子間相互作用の解析方法を用いて、ビオチンと抗ビオチン抗体のＫｄ値を算出した。具体的には、ＦＩＴＣ標識ビオチンと抗ビオチン抗体との反応を、退色防止剤としてシステアミンを添加し計測を行い、得られた測定値からＫｄ値を算出した。
まず、フルオレセイン標識ビオチンに代えてＦＩＴＣ標識ビオチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いた以外は実施例１と同様にして、８ｎＭのＦＩＴＣ標識ビオチン溶液を調製した。また、実施例１と同様にして、０、４、４０、２００、４００、２０００、４０００、１２０００ｎＭの抗ビオチン抗体溶液、８０ｍＭのシステアミン溶液を、それぞれ調製した。
次に、ＦＩＴＣ標識ビオチン溶液と、各濃度の抗ビオチン抗体溶液又はＰＢＳバッファーをそれぞれ２５μＬずつ混合し、室温で１５分間反応させた後、システアミン溶液を５０μＬずつそれぞれ添加して混合し、測定試料を調製した。該測定試料を測定用プレートに分注し、ＭＦ２０（オリンパス社製）にセットした後、波長：４８８ｎｍ、レーザーパワー：２００μＷ、測定時間：５秒間、１０回で蛍光シグナルを検出し、ＦＩＤＡ解析を行い、各測定試料中の蛍光標識分子（ＦＩＴＣ標識ビオチン）の蛍光強度Ｑ（ｋＨｚ）を求めた。なお、システアミン溶液に代えてＰＢＳバッファーを５０μＬずつそれぞれ添加して混合したものを、対照試料とし、同様にＦＩＤＡ解析を行い、各対照試料中の蛍光標識分子の蛍光強度Ｑ（ｋＨｚ）を求めた。
図４は、得られたＱ値を添加した抗ビオチン抗体の濃度ごとにプロットした図である。このプロット図から、以下の式（１）を用いてフィッティングを行うことにより、Ｋｄ値を算出した。なお、フィッティングは、Ｏｒｉｇｉｎ８．０(Ｏｒｉｇｉｎ Ｌａｂ社製)を用いて行った。
この結果、ビオチンと抗ビオチン抗体の結合におけるＫｄ値は５．８３×１０−８Ｍと算出された。すなわち、実施例２の結果から、本発明の分子間相互作用の解析方法を用いて、Ｋｄ値を算出し得ることが明らかである。
The Kd values of biotin and anti-biotin antibody were calculated using the method for analyzing intermolecular interactions of the present invention. Specifically, the reaction between FITC-labeled biotin and anti-biotin antibody was measured by adding cysteamine as an anti-fading agent, and the Kd value was calculated from the obtained measured value.
First, an 8 nM FITC-labeled biotin solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that FITC-labeled biotin (manufactured by Molecular Probes) was used instead of fluorescein-labeled biotin. Further, in the same manner as in Example 1, 0, 4, 40, 200, 400, 2000, 4000, 12000 nM anti-biotin antibody solution and 80 mM cysteamine solution were prepared.
Next, 25 μL each of the FITC-labeled biotin solution and each concentration of anti-biotin antibody solution or PBS buffer were mixed and reacted at room temperature for 15 minutes, and then 50 μL each of cysteamine solution was added and mixed to prepare a measurement sample. Prepared. After dispensing the measurement sample on a measurement plate and setting it on MF20 (manufactured by Olympus), the fluorescence signal was detected 10 times with wavelength: 488 nm, laser power: 200 μW, measurement time: 5 seconds, and FIDA analysis was performed. The fluorescence intensity Q (kHz) of the fluorescence labeled molecule (FITC labeled biotin) in each measurement sample was determined. In addition, instead of the cysteamine solution, 50 μL each of PBS buffer added and mixed was used as a control sample, and FIDA analysis was performed in the same manner to determine the fluorescence intensity Q (kHz) of the fluorescently labeled molecule in each control sample. .
FIG. 4 is a diagram plotted for each concentration of anti-biotin antibody to which the obtained Q value was added. From this plot, Kd value was calculated by fitting using the following formula (1). The fitting was performed using Origin 8.0 (manufactured by Origin Lab).
As a result, the Kd value for binding of biotin and anti-biotin antibody was calculated to be 5.83 × 10 −8 M. That is, it is clear from the results of Example 2 that the Kd value can be calculated using the method for analyzing intermolecular interactions of the present invention.
Ｙ：計測値Ｑ（ｋＨｚ）、Ｂｏｔｔｏｍ：Ｙの最小値、Ｔｏｐ：Ｙの最大値、
[Ａ]０：ＦＩＴＣ標識ビオチンの濃度(ｎＭ)、[Ｂ]０：添加した抗体濃度(ｎＭ)。
Y: measured value Q (kHz), Bottom: minimum value of Y, Top: maximum value of Y,
[A] 0 : FITC-labeled biotin concentration (nM), [B] 0 : Concentration of added antibody (nM).
［参考例２］
本発明の分子間相互作用の解析方法において用いられ得る蛍光色素であるオレゴングリーンと、高安定性蛍光色素であるＴＡＭＲＡとを用いて、蛍光色素の安定性評価法の一例を示した。
まず、オレゴングリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）と、ＴＡＭＲＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）とを、それぞれＰＢＳバッファー（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて希釈し、２ｎＭ溶液を調製した。
次に、各３０μＬを測定用プレートに分注し、ＭＦ２０（オリンパス社製）にセットした後、レーザーパワー：５００μＷ、測定時間：５秒間、５回で蛍光シグナルを検出し、ＦＩＤＡ解析を行い、各測定試料の全体の蛍光強度Ｃｏｕｎｔｒａｔｅ（ｋＨｚ）を求めた。なお、測定波長は、ＴＡＭＲＡ溶液を測定する場合には５４３ｎｍとし、オレゴングリーン溶液を測定する場合には４８８ｎｍとした。
図５は、各測定時のＣｏｕｎｔｒａｔｅ（ｋＨｚ）を、測定時間ごとにプロットした図である。図中、「０ｓｅｃ」が１回目の照射時を意味しており、「２０ｓｅｃ」が５回目の照射時のＣｏｕｎｔｒａｔｅ（ｋＨｚ）を意味している。（ａ）はオレゴングリーン溶液の測定結果であり、（ｂ）はＴＡＭＲＡ溶液の測定結果である。この結果、ＴＡＭＲＡ溶液では各測定時においてＣｏｕｎｔｒａｔｅはほぼ一定であるのに対して、オレゴングリーン溶液では、測定回数が多くなるほど、すなわち、レーザー光の照射時間が長くなるほどＣｏｕｎｔｒａｔｅが低下する傾向が観察された。具体的には、０秒と２０秒のＣｏｕｎｔｒａｔｅ（ｋＨｚ）を比較すると、ＴＡＭＲＡ溶液では４４１．３ｋＨｚ（０秒）から４３５．８ｋＨｚ（２０秒）と約１．２％しか蛍光強度の減衰が観察されなかったのに対して、オレゴングリーン溶液では７９ｋＨｚ（０秒）から５７ｋＨｚ（２０秒）と約２６．６％もの蛍光強度の減衰が観察された。つまり、オレゴングリーンは、適した励起波長のレーザー光を５００μＷの強度で５秒間の照射を５回繰り返した場合に、５回目の照射時の蛍光強度が、１回目の照射時の蛍光強度の２０％以上減衰する蛍光色素であり、易退色性であることが明らかである。
[Reference Example 2]
An example of a method for evaluating the stability of a fluorescent dye was shown using Oregon Green, which is a fluorescent dye that can be used in the method for analyzing an intermolecular interaction of the present invention, and TAMRA, which is a highly stable fluorescent dye.
First, Oregon Green (manufactured by Molecular Probes) and TAMRA (manufactured by Molecular Probes) were each diluted with a PBS buffer (manufactured by SIGMA) to prepare a 2 nM solution.
Next, 30 μL of each was dispensed on a measurement plate and set on MF20 (manufactured by Olympus), then the laser signal was detected at 500 μW, the measurement time was 5 seconds, and the FIDA analysis was performed. The total fluorescence intensity count (kHz) of each measurement sample was determined. The measurement wavelength was 543 nm when measuring the TAMRA solution, and 488 nm when measuring the Oregon green solution.
FIG. 5 is a diagram in which the Count rate (kHz) at each measurement is plotted for each measurement time. In the figure, “0 sec” means the first irradiation, and “20 sec” means the count (kHz) at the fifth irradiation. (A) is a measurement result of an Oregon green solution, (b) is a measurement result of a TAMRA solution. As a result, in the TAMRA solution, the count rate is almost constant at each measurement, whereas in the Oregon green solution, the tendency that the count rate decreases as the number of times of measurement increases, that is, as the irradiation time of the laser beam becomes longer is observed. It was. Specifically, when comparing the count rate (kHz) between 0 seconds and 20 seconds, the TAMRA solution observed only about 1.2% attenuation of fluorescence intensity from 441.3 kHz (0 seconds) to 435.8 kHz (20 seconds). In contrast, in the Oregon Green solution, a fluorescence intensity decay of about 26.6% was observed from 79 kHz (0 seconds) to 57 kHz (20 seconds). That is, in Oregon Green, when the laser beam with a suitable excitation wavelength is repeatedly irradiated for 5 seconds at an intensity of 500 μW for 5 times, the fluorescence intensity at the fifth irradiation is 20 times the fluorescence intensity at the first irradiation. It is clear that it is a fluorescent dye that attenuates by more than% and is easily faded.
本発明の分子間相互作用の解析方法を用いることにより、蛍光標識分子と非蛍光標識分子が１：１で反応し反応体を形成している場合であっても、分子間相互作用の有無をＦＩＤＡ計測により判別することができるため、主に、生物科学、医学、薬学等の分野において利用が可能である。 By using the method for analyzing intermolecular interactions according to the present invention, even when a fluorescently labeled molecule and a non-fluorescently labeled molecule react 1: 1 to form a reactant, the presence or absence of intermolecular interaction is determined. Since it can be discriminated by FIDA measurement, it can be used mainly in the fields of biological science, medicine, pharmacy and the like.
Claims (5)
前記蛍光色素が、ラジカルと反応して退色しやすい蛍光色素であり、
前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする分子間相互作用の解析方法。 In a method for determining the presence or absence of intermolecular interaction between a molecule labeled with a fluorescent dye and a non-fluorescent labeled molecule by determining the fluorescence intensity by fluorescence intensity distribution analysis (FIDA),
The fluorescent dye is a fluorescent dye that easily reacts with radicals and fades;
A method for analyzing an intermolecular interaction, wherein the FIDA is performed in the presence of an anti-fading agent.
前記蛍光色素が、退色しやすい蛍光色素であり、
前記ＦＩＤＡを、退色防止剤の存在下において行うことを特徴とする分子間相互作用の解析方法。 In a method for determining the presence or absence of intermolecular interaction between a molecule labeled with a fluorescent dye and a non-fluorescent labeled molecule by determining the fluorescence intensity by fluorescence intensity distribution analysis (FIDA),
The fluorescent dye is a fluorescent dye that easily fades,
A method for analyzing an intermolecular interaction, wherein the FIDA is performed in the presence of an anti-fading agent.
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