JP2009240232A - Method for examining risk of side effect of anticancer agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は抗癌剤の副作用の危険性を検査する方法およびそれに使用するプローブやプライマーに関する。 The present invention relates to a method for examining the risk of side effects of anticancer agents, and probes and primers used therefor.
ドセタキセル（商品名タキソテール）は難治性乳癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、頭頸部癌などの治療に使用されている。しかしながら、白血球や好中球の減少症などの副作用を呈することが知られており、好中球減少症の発症は患者の約３６％にも及ぶ。ドセタキセルなどの抗癌剤について、副作用が起こりやすい患者を予測できれば、抗癌剤の投与を控える、あるいは抗癌剤の投与量を減らすことができ、治療方針の決定に大変有用である。
ドセタキセルの副作用を予測する従来法としては、副作用の発現は薬剤の全身的曝露量に依存するという観点から、薬剤投与後の血中ドセタキセル濃度をモニタリングする方法
(therapeutic drug monitoring：TDM) が挙げられる。しかしながら、TDMは手技的に煩雑であり、また、薬剤投与開始前に副作用発症リスクを予測することができない。
これまで、抗癌剤の副作用と遺伝子多型との相関を調べた報告としては、ドセタキセルやドキソルビシンなどの抗癌剤による副作用とHNF4αやCARなどの転写因子の遺伝子型について調べた報告がある（非特許文献１）が、これらの遺伝子多型と抗癌剤の副作用との相関は十分なものではなかった。
Docetaxel (trade name Taxotere) is used to treat refractory breast cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, head and neck cancer, and the like. However, it is known to exhibit side effects such as leukocyte and neutropenia, and neutropenia affects about 36% of patients. If anticancer drugs such as docetaxel can be predicted for patients who are likely to have side effects, the administration of anticancer drugs can be reduced or the dosage of anticancer drugs can be reduced.
As a conventional method for predicting side effects of docetaxel, a method of monitoring blood docetaxel concentration after drug administration from the viewpoint that the occurrence of side effects depends on the systemic exposure of the drug
(therapeutic drug monitoring: TDM). However, TDM is technically cumbersome and the risk of developing side effects cannot be predicted before the start of drug administration.
To date, reports on the correlation between side effects of anticancer drugs and gene polymorphism include reports on the side effects of anticancer drugs such as docetaxel and doxorubicin and the genotypes of transcription factors such as HNF4α and CAR (Non-patent Document 1). ) However, the correlation between these gene polymorphisms and side effects of anticancer drugs was not sufficient.
SLCO1B3遺伝子はOATP1B3とも呼ばれ、血液中から肝臓に薬剤を取り込む肝臓の薬剤トランスポーターとして機能することが報告されている（非特許文献２）。
また、ABCC２遺伝子はMRP2とも呼ばれ、肝細胞から胆汁中に薬剤を排出する肝臓の薬剤トランスポーターとして機能することが報告されている（非特許文献３）。
しかしながら、これらの遺伝子における一塩基多型と抗癌剤の副作用との関連は示されていない。
ABCC2 gene is also called MRP2 and has been reported to function as a liver drug transporter that drains drugs from hepatocytes into bile (Non-patent Document 3).
However, no association between single nucleotide polymorphisms in these genes and side effects of anticancer agents has been shown.
本発明は、抗癌剤の副作用の危険性を正確に予測するための検査方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a test method for accurately predicting the risk of side effects of an anticancer drug.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、SLCO1B3遺伝子およびABCC2遺伝子上に存在する特定の塩基の一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型が抗癌剤の副作用に関連することを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have made extensive studies to solve the above problems. As a result, it was found that a single nucleotide polymorphism of a specific base present on the SLCO1B3 gene and ABCC2 gene or a single nucleotide polymorphism of a base in linkage disequilibrium with the base is related to the side effect of the anticancer drug, and completed the present invention. It came to do.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型、配列番号２の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型、または前記いずれかの塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて抗癌剤の副作用の危険性を検査する方法。
（２）配列番号１〜９のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、抗癌剤の副作用の危険性を検査するためのプローブ。
（３）配列番号１〜９のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、抗癌剤の副作用の危険性を検査するためのプライマー。
That is, the present invention is as follows.
(1) A single nucleotide polymorphism in the base corresponding to the 61st base of SEQ ID NO: 1, a single nucleotide polymorphism in the base corresponding to the 61st base of SEQ ID NO: 2, or any one of the above bases A method of analyzing a single nucleotide polymorphism of a base in linkage disequilibrium and examining the risk of side effects of an anticancer drug based on the analysis result.
(2) A probe for examining the risk of side effects of an anticancer drug, which has a sequence of 10 bases or more including the 61st base in the base sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 9 or a complementary sequence thereof.
(3) A primer for examining the risk of side effects of an anticancer drug, which can amplify a region containing the base at position 61 in any one of SEQ ID NOs: 1 to 9.
本発明の検査方法により、抗癌剤の副作用の危険性を簡便かつ正確に予測することができ、抗癌剤の投与の可否、投与量の決定など癌の治療方針を決定するための優れた指標となりうる。
By the test method of the present invention, the risk of side effects of an anticancer drug can be predicted easily and accurately, and it can be an excellent index for determining a cancer treatment policy, such as whether or not an anticancer drug can be administered and the dose.
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、染色体上の、配列番号１の６１番目の塩基または配列番号２の６１番目の塩基に相当する塩基の一塩基多型（SNP；single nucleotide polymorphism）または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析に基づいて抗癌剤の副作用の危険性を検査する方法である。
<1> Test Method of the Present Invention The test method of the present invention is a single nucleotide polymorphism (SNP) of a nucleotide corresponding to the 61st base of SEQ ID NO: 1 or the 61st base of SEQ ID NO: 2 on a chromosome. polymorphism) or a single nucleotide polymorphism of a base in linkage disequilibrium with the base, and a method for examining the risk of side effects of the anticancer drug based on the analysis.
本発明の方法によって副作用の危険性を調べることのできる抗癌剤の種類としては、その輸送にABCC2やSLCO1B3が関与するものが挙げられ、具体的には、ドセタキセル、および、パクリタキセル、アクチノマイシンD、ミトキサントロン、イリノテカン（Cancer Lett
2007 Dec 13）、エトポシド、シスプラチン、ドキソルビシン、エピルビシン（Mol Pharmacol 1999; 55:929-37.）、イリノテカン（Clin Pharmacol Ther 2007; 81:42-9.）、メトトレキセート（Pharmacogenet Genomics 2005; 15:277-85.）などが挙げられる。
The types of anticancer agents whose risk of side effects can be examined by the method of the present invention include those in which ABCC2 and SLCO1B3 are involved in the transport thereof, specifically, docetaxel, paclitaxel, actinomycin D, mitoxine Santron, Irinotecan (Cancer Lett
2007 Dec 13), etoposide, cisplatin, doxorubicin, epirubicin (Mol Pharmacol 1999; 55: 929-37.), Irinotecan (Clin Pharmacol Ther 2007; 81: 42-9.), Methotrexate (Pharmacogenet Genomics 2005; 15: 277- 85.).
本発明の方法によって危険性を予測する抗癌剤の副作用としては、これまでに報告されている副作用を含め特に制限されないが、特に白血球減少または好中球減少が挙げられる。
白血球減少または好中球減少の程度は、NCI-CTC (National Cancer Institute - Common Toxicity Criteria) ver.2 (癌と化学療法、第28巻 第13号：1993-2027、2001) に定められており、本発明の方法によれば、遺伝子多型の種類によって、ドセタキセル投与期間内にグレード3または4の白血球減少または好中球減少が起こる可能性が高いなどと予測することができる。
なお、「検査」とは将来、副作用が生じるかどうかを予測するための検査、及び副作用の程度が悪化するかどうかを予測するための検査を含む。
The side effect of the anticancer agent for predicting the risk by the method of the present invention is not particularly limited, including the side effects reported so far, and particularly includes leukopenia or neutropenia.
The degree of leukopenia or neutropenia is defined in NCI-CTC (National Cancer Institute-Common Toxicity Criteria) ver.2 (Cancer and Chemotherapy, Vol. 28, No. 13, 1993-2027, 2001) According to the method of the present invention, it can be predicted that grade 3 or 4 leukopenia or neutropenia is likely to occur within the docetaxel administration period depending on the type of genetic polymorphism.
The “test” includes a test for predicting whether or not a side effect will occur in the future and a test for predicting whether or not the degree of the side effect will deteriorate.
配列番号１はABCC2（MRP2）遺伝子のゲノム配列（10q24）の一部であり、配列番号１の61番目の塩基はABCC2遺伝子の3'flanking+9190に相当し、G（グアニン：メジャーアレル）>C（シトシン：マイナーアレル）の多型（SNP）が存在する。このSNP（SNP-1）は、National Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）にrs12762549として登録されている。
配列番号１において、６１番目の塩基がCである場合は抗癌剤の副作用の危険性が高い
。また、アレルを考慮して解析した場合は、配列番号１の６１番目がCC＞CG＞GGの順で抗癌剤の副作用の危険性が高い。
SEQ ID NO: 1 is a part of the genomic sequence (10q24) of ABCC2 (MRP2) gene. The 61st base of SEQ ID NO: 1 corresponds to 3'flanking + 9190 of ABCC2 gene, and G (guanine: major allele)> C (cytosine: minor allele) polymorphism (SNP) exists. This SNP (SNP-1) is registered as rs12762549 in the dbSNP database (//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) of the National Center for Biotechnology Information.
In SEQ ID NO: 1, when the 61st base is C, the risk of side effects of the anticancer drug is high. Moreover, when analyzing in consideration of alleles, the 61st position of SEQ ID NO: 1 is in the order CC>CG> GG, and the risk of side effects of anticancer agents is high.
配列番号２はSLCO1B3（OATP1B3）遺伝子のゲノム配列（12p12）の一部であり、配列番号２の61番目の塩基はSLCO1B3遺伝子のintron 11-5676に相当し、A（アデニン：メジャーアレル）>G（グアニン：マイナーアレル）の多型（SNP）が存在する。このSNP（SNP-2）は、dSNPデータベースにrs11045585として登録されている。
配列番号２において、６１番目の塩基がGである場合は抗癌剤の副作用の危険性が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、配列番号２の６１番目がGG＞GA＞AAの順で抗癌剤の副作用の危険性が高い。
SEQ ID NO: 2 is a part of the genomic sequence (12p12) of the SLCO1B3 (OATP1B3) gene. The 61st base of SEQ ID NO: 2 corresponds to intron 11-5676 of the SLCO1B3 gene, and A (adenine: major allele)> G There is a polymorphism (SNP) of (guanine: minor allele). This SNP (SNP-2) is registered as rs11045585 in the dSNP database.
In SEQ ID NO: 2, when the 61st base is G, the risk of side effects of the anticancer drug is high. Moreover, when analyzing in consideration of the allele, the 61st position of SEQ ID NO: 2 is in the order of GG>GA> AA, and the risk of side effects of the anticancer drug is high.
これらの塩基に相当する塩基を本発明においては解析する。ここで、「相当する」とは、ヒトABCC2またはSLCO1B3遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。 Bases corresponding to these bases are analyzed in the present invention. Here, “corresponding” means a corresponding base in the region having the above sequence on the human ABCC2 or SLCO1B3 gene, and it is assumed that the sequence is slightly changed at a position other than the SNP due to a difference in race or the like. Also includes analyzing the corresponding bases therein.
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べることによって、抗癌剤の副作用の危険性を検査することができる。検査するＳＮＰの数は、一種類でもよいし、上記２種類のＳＮＰｓを合わせて解析してもよい。なお、上記遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。 By examining the type of the SNP base, the risk of side effects of the anticancer drug can be examined. The number of SNPs to be inspected may be one type, or may be analyzed by combining the two types of SNPs. The gene sequence may be analyzed for the sense strand or the antisense strand.
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．８の関係を満たす塩基をいう。
SNP-1と連鎖不平衡にあるSNPsとしては、rs7090705（配列番号３の61番目の塩基（C/T））, およびrs11190298（配列番号４の61番目の塩基（A/G））が挙げられる。
SNP-2と連鎖不平衡にあるSNPsとしては、rs4149160（配列番号５の61番目の塩基（A/G））、rs16923270（配列番号６の61番目の塩基（G/T））、rs12579674（配列番号７の61番目の塩基（A/T））、rs12582527（配列番号８の61番目の塩基（G/T））、rs4149155（配列番号９の61番目の塩基（A/C））が挙げられる。rs 番号はdbSNPデータベースの登録番号である。
In addition, the base to be analyzed in the present invention is not limited to the above, and a polymorphism of a base in linkage disequilibrium with the above base may be analyzed. Here, the “base in linkage disequilibrium with the above-mentioned base” refers to a base that satisfies the relationship of r 2 > 0.8 with the above-mentioned base.
Examples of SNPs in linkage disequilibrium with SNP-1 include rs7090705 (61st base (C / T) of SEQ ID NO: 3) and rs11190298 (61st base (A / G) of SEQ ID NO: 4). .
SNPs in linkage disequilibrium with SNP-2 include rs4149160 (61st base (A / G) of SEQ ID NO: 5), rs16923270 (61st base (G / T) of SEQ ID NO: 6), rs12579674 (sequence) No. 7 61st base (A / T)), rs12582527 (61st base of SEQ ID No. 8 (G / T)), rs4149155 (61st base of SEQ ID No. 9 (A / C)) . The rs number is the registration number of the dbSNP database.
上記遺伝子の一塩基多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、細胞、毛髪等の体毛、爪などが挙げられる。一塩基多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。 The sample used for the analysis of the single nucleotide polymorphism of the gene is not particularly limited as long as it is a sample containing chromosomal DNA. Examples thereof include body fluid samples such as blood and urine, cells, body hair such as hair, and nails. . Although these samples can be used directly for analysis of single nucleotide polymorphisms, it is preferable that chromosomal DNA is isolated from these samples by a conventional method and analyzed.
上記遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の一塩基多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。 Analysis of the single nucleotide polymorphism of the gene can be performed by a usual single nucleotide polymorphism analysis method. Examples include, but are not limited to, sequence analysis, PCR, hybridization, and the like.
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。 The sequence can be performed by a usual method. Specifically, a sequence reaction is performed using a primer set at a position of several tens of bases on the 5 ′ side of a base showing polymorphism, and the type of base at the corresponding position is determined from the analysis result. can do. When sequencing is performed, it is preferable to amplify a fragment containing a polymorphism in advance by PCR or the like.
また、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによっても解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマー
をそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
It can also be analyzed by examining the presence or absence of amplification by PCR. For example, a primer having a sequence corresponding to a region containing a base showing a polymorphism and corresponding to each polymorphism is prepared. PCR can be performed using each primer, and the type of polymorphism can be determined depending on the presence or absence of the amplification product.
また、多型を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９２ Ｊａｎ １； １２（１）： １３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、上記遺伝子の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。 It is also possible to amplify a DNA fragment containing a polymorphism and determine which type of polymorphism is based on the difference in mobility in electrophoresis of the amplified product. Examples of such a method include a PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method (Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146.). Specifically, first, DNA containing the polymorphic site of the gene is amplified, and the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA. Next, the dissociated single-stranded DNA is separated on a non-denaturing gel, and the type of polymorphism can be determined by the difference in mobility of the separated single-stranded DNA on the gel.
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料をＰＣＲで増幅し、それを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。 Furthermore, when a base showing polymorphism is included in the restriction enzyme recognition sequence, it can be analyzed by the presence or absence of cleavage by a restriction enzyme (RFLP method). In this case, first, a DNA sample is amplified by PCR and cut with a restriction enzyme. The DNA fragments can then be separated and the type of polymorphism determined by the size of the detected DNA fragment.
ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。 It is also possible to analyze the type of polymorphism by examining the presence or absence of hybridization. That is, it is possible to determine which base an SNP is by preparing probes corresponding to each base and examining which probe hybridizes.
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、抗癌剤の危険性を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、ABCC2またはSLCO1B3遺伝子における上記多型部位を含み、ハイブリダイズの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜９のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さはより好ましくは、１５〜３５塩基であり、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
また、プライマーとしては、ABCC2またはSLCO1B3遺伝子における上記多型部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜９のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１５〜５０塩基が好ましく、２０〜３５塩基がより好ましい。
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
<2> Reagent for test | inspection of this invention This invention also provides test reagents, such as a primer and a probe for test | inspecting the risk of an anticancer agent. Examples of such a probe include a probe that includes the polymorphic site in the ABCC2 or SLCO1B3 gene and can determine the type of base at the polymorphic site depending on the presence or absence of hybridization. Specifically, a probe having a length of 10 bases or more having a sequence containing the 61st base of any one of SEQ ID NOS: 1 to 9 or a complementary sequence thereof can be mentioned. The length of the probe is more preferably 15 to 35 bases, and further preferably 20 to 35 bases.
Examples of the primer include a primer that can be used for PCR for amplifying the polymorphic site in the ABCC2 or SLCO1B3 gene, or a primer that can be used for sequence analysis (sequencing) of the polymorphic site. It is done. Specifically, a primer capable of amplifying or sequencing a region containing the 61st base of any one of SEQ ID NOS: 1 to 9 is included. The length of such a primer is preferably 15 to 50 bases, more preferably 20 to 35 bases.
As a primer for sequencing the polymorphic site, a primer having a sequence 5′-side of the base, preferably 30 to 100 bases upstream, or a 3′-side region of the base, preferably 30 to 100 bases. A primer having a sequence complementary to the downstream region is exemplified. As a primer used for judging polymorphism by the presence or absence of amplification by PCR, it has a sequence containing the above base, has a primer containing the above base on the 3 ′ side, and a complementary sequence of the sequence containing the above base, Examples include a primer containing a base complementary to the above base on the 3 ′ side.
The test reagent of the present invention may contain PCR polymerases, buffers, hybridization reagents, etc. in addition to these primers and probes.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
BioBank Japan（//biobankjp.org/）に登録されたサンプルから、2003年6月から2006年3月までの間に登録された、ドセタキセルを投与されてグレード３または４の白血球減少症／好中球減少症を呈した28人の患者群（ADR group：副作用群）と、ドセタキセルを投
与されて白血球減少症／好中球減少症を呈することのなかった56人の患者群（non-ADR group：正常群）を選択し、1st studyを行った。
また、2nd studyでは、BioBank Japanに登録されたサンプルから、2006年4月から2006年12月までの間に登録された、ドセタキセルを投与されてグレード３または４の白血球減少症／好中球減少症を呈した11人の患者群（ADR group）と、ドセタキセルを投与されて白血球減少症／好中球減少症を呈することのなかった18人の患者群（non-ADR group）を選択して評価した。
なお、グレード３または４はNCI-CTC (National Cancer Institute - Common Toxicity
Criteria) ver.2 (癌と化学療法、第28巻 第13号：1993-2027、2001)の分類による。
Grade 3 or 4 leukopenia / neutralized by administration of docetaxel from samples registered at BioBank Japan (//biobankjp.org/) from June 2003 to March 2006 A group of 28 patients with thrombocytopenia (ADR group: side effect group) and a group of 56 patients who had been treated with docetaxel and did not present leukopenia / neutropenia (non-ADR group) : Normal group) and 1 st study was conducted.
Further, in the 2 nd study, the samples registered in the Biobank Japan, registered until December 2006 April 2006, docetaxel is administered Grade 3 or 4 leukopenia / neutropenia Select 11 patients with ADR group (ADR group) and 18 patients with non-ADR group who did not receive leukopenia / neutropenia after administration of docetaxel And evaluated.
Grade 3 or 4 is NCI-CTC (National Cancer Institute-Common Toxicity
Criteria) ver.2 (Cancer and chemotherapy, Vol. 28, No. 13, 1993-2027, 2001).
1st studyと2nd studyの合計113人の被検者において、癌の種類は、肺癌（３２人)、乳癌（３８人)、食道癌（１１人)、その他の癌（３２人)であった。
性別は、ADR groupで男性17人女性21人、non-ADR groupで男性29人女性45人であった。ADR groupとnon-ADR groupにおいて、年齢、他の抗癌剤の使用の有無は有意差が無かった。
なお、BioBank Japanでは全ての被検者から書面によるインフォームド・コンセントを得ており、本研究は、東京大学医科学研究所および理化学研究所の倫理審査委員会の承認を得たものである。
In 1 st study and sum of 2nd study 113 subjects, the type of cancer, lung cancer (32 people), breast cancer (38 patients), esophageal cancer (11 people) was other cancers (32 patients) .
There were 17 males and 21 females in the ADR group and 29 males and 45 females in the non-ADR group. There was no significant difference between age and use of other anticancer drugs in ADR group and non-ADR group.
BioBank Japan has obtained written informed consent from all subjects, and this study was approved by the Ethics Review Committee of the Institute of Medical Science and the Institute of Physical and Chemical Research, the University of Tokyo. .
1st studyでは、まず、CYP3A4、CYP3A5、ABCB1、ABCC2、SLCO1B3、NR1l2、NR1l3の7種類の遺伝子に着目し、haplotype-tagging SNPs （htSNPs）により、ｒ2＝０．８、マイナーアレル頻度（MAF）＞１０%という基準で一塩基多型（SNPｓ）を選んだ。また、文献（J
Pharmacol Exp Ther 2001; 297: 1137-43；Clin Pharmacol Ther 2001; 70: 189-99；Drug Metab Dispos 2002; 30: 363-4；Pharmacogenetics 2004; 14: 441-52）で報告されたＳＮＰｓも評価に加えた。
すなわち、合計で、LDがｒ2≧０．８である６９種類のhtSNPsと、上記遺伝子の機能を変化させる可能性のある10種類の機能的SNPsを選択した。
上記79種類のＳＮＰｓに対してインベーダープローブ（Third Wave Technologies, Madison, WI）を合成し、multiplex-PCRとインベーダーアッセイの組合せによる方法（Ohnishi Y, Tanaka T, Ozaki K, Yamada R, Suzuki H, Nakamura Y. A high-throughput SNP typing system for genome-wide association studies. J Hum Genet 2001;46:471-477）、または直接シークエンスによって、合計８４人分の患者におけるＳＮＰｓをジェノタイピングした。
In the 1 st study, we first focused on the seven genes CYP3A4, CYP3A5, ABCB1, ABCC2, SLCO1B3, NR1l2, and NR1l3. By haplotype-tagging SNPs (htSNPs), r 2 = 0.8, minor allele frequency (MAF ) Single nucleotide polymorphisms (SNPs) were selected on the basis of> 10%. The literature (J
Pharmacol Exp Ther 2001; 297: 1137-43; Clin Pharmacol Ther 2001; 70: 189-99; Drug Metab Dispos 2002; 30: 363-4; Pharmagenetics 2004; 14: 441-52) added.
That is, in total, 69 types of htSNPs with LD of r 2 ≧ 0.8 and 10 types of functional SNPs that may change the function of the gene were selected.
Invader probes (Third Wave Technologies, Madison, WI) were synthesized for the above 79 types of SNPs, and a method using a combination of multiplex-PCR and invader assay (Ohnishi Y, Tanaka T, Ozaki K, Yamada R, Suzuki H, Nakamura Y. A high-throughput SNP typing system for genome-wide association studies. J Hum Genet 2001; 46: 471-477), or by direct sequencing, SNPs in a total of 84 patients were genotyped.
その結果、ABCB1遺伝子上のrs2188524、ABCC2遺伝子上のrs11190291、rs3740065、rs12762549 およびrs11190303、SLCO1B3遺伝子上のrs7311358、rs11045585、rs2174012およびrs4149117ならびに、NR1I2遺伝子上のrs12633127の合計10種類のSNPｓが、P<0.05でグレード３または４の白血球減少症／好中球減少症の発症と相関を示した。
なお、統計解析はFisherの正確確率検定で行い、P値はBonferroniの補正を行った。
As a result, a total of 10 types of SNPs, rs2188524 on the ABCB1 gene, rs11190291, rs3740065, rs12762549 and rs11762303 on the ABCC2 gene, rs7311358 on the SLCO1B3 gene, rs11045585, rs2174012 and rs4149117, and rs12633127 on the NR1I2 gene, P <0.05 Correlated with the onset of grade 3 or 4 leukopenia / neutropenia.
Statistical analysis was performed by Fisher's exact test, and P values were corrected by Bonferroni.
1st studyで選択した１０種類のうち、rs4149117はrs7311358と強い連鎖不平衡の関係にあったため、rs4149117以外の９種類について、さらに2nd studyを行った。
その結果、2nd studyでは、rs12762549のみがP<0.05でグレード３または４の白血球減少症／好中球減少症の発症と相関を示した。
2nd studyではサンプルの数が少なかったため、1st studyに用いた84人分のサンプルと、2nd studyに用いた29人分のサンプルとをあわせて、上記9種類のＳＮＰｓについて評価した。
その結果、表１に示されるように、rs12762549（SNP-1：P=0.00022）とともに、rs11045585もグレード３または４の白血球減少症／好中球減少症の発症と相関を示した。(SNP-２：P =0.00017)
Of the 10 types selected in 1 st study, rs4149117 because there was a relationship between the strong linkage disequilibrium with rs7311358, for nine non Rs4149117, it was further 2 nd study.
As a result, in nd study, only rs12762549 was correlated with the onset of grade 3 or 4 leukopenia / neutropenia at P <0.05.
For 2 nd number of samples in the study was small, together with 84 persons of the sample used in the 1 st study, and 29 servings of samples used for 2 nd study, it was evaluated for the nine SNPs.
As a result, as shown in Table 1, along with rs12762549 (SNP-1: P = 0.00022), rs11045585 also correlated with the onset of grade 3 or 4 leukopenia / neutropenia. (SNP-2: P = 0.00017)
さらに、SNP1とSNP2の遺伝子型のcombination studyにおける関連解析を実施した。
すなわち、SNP1について、allele 2のホモ接合型（CC）を有する場合を１、それ以外を有する場合（CGまたはGG）を０、SNP２について、allele2のヘテロ接合型（AG）を有する場合を１、allele１のホモ接合型（AA）を有する場合を０として、副作用群と、正常群（非副作用群）について、各患者のスコア付けを行った。
その結果、表２に示されるように、副作用群ではスコアが1以上である患者が27人（６９．２％）に対し、正常群ではスコアが1以上である患者が１８人（２４．４％）であり、合計スコアが1点以上の患者をリスク型と判定した場合、白血球または好中球減少症の発症と強い関連が見られた（P = 0.0000057）。
この結果から、多型を組み合わせて解析することにより、より正確に副作用の危険性を調べることができることが示唆された。
Furthermore, association analysis was performed in a combination study of genotypes of SNP1 and SNP2.
That is, 1 for SNP1 having the allele 2 homozygous type (CC), 0 for the other (CG or GG), 1 for the SNP2 having the heterozygous allele 2 (AG), Each patient was scored for a side effect group and a normal group (non-side effect group), where 0 was the allele1 homozygous type (AA).
As a result, as shown in Table 2, 27 patients (69.2%) had a score of 1 or more in the side effect group, whereas 18 patients (24.4) had a score of 1 or more in the normal group. When a patient with a total score of 1 or more was judged as a risk type, there was a strong association with the onset of leukocytes or neutropenia (P = 0.0000057).
From these results, it was suggested that the risk of side effects can be examined more accurately by analyzing polymorphisms in combination.
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