JP2009225733A - Method for evaluation of trpa1 activator - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化粧品などの外用剤の開発、生化学などの分野における基礎研究などに好適である、ＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法に関する。 The present invention relates to a method for evaluating an activator of TRPA1. More specifically, the present invention relates to a method for evaluating an activator of TRPA1, which is suitable for development of external preparations such as cosmetics and basic research in fields such as biochemistry.
肌荒れなどの皮膚トラブルは、年々増加する傾向にある。例えば、アトピー性皮膚炎に罹患している患者や敏感肌を有する人の場合、皮膚におけるバリアー能が低下しているため、刺激性物質などが皮膚から侵入しやすくなっている。そのため、アトピー性皮膚炎に罹患している患者の皮膚や敏感肌を有する人の皮膚は、前記皮膚トラブルが生じやすくなっている。したがって、日常的に皮膚に使用される化粧品は、無刺激又は低刺激の品質を有することが望ましい。 Skin troubles such as rough skin tend to increase year by year. For example, in the case of a patient suffering from atopic dermatitis or a person having sensitive skin, since the barrier ability in the skin is reduced, an irritating substance or the like easily enters from the skin. Therefore, the skin trouble of the patient suffering from atopic dermatitis or the skin of a person having sensitive skin is likely to occur. Therefore, it is desirable that cosmetics that are routinely used on the skin have a non-irritating or low irritation quality.
皮膚に対する物質の刺激性などの評価は、例えば、ヒトパッチ試験、ドレイズ皮膚一次刺激試験、眼粘膜刺激性試験、蛋白変性試験、溶血変性試験、細胞増殖阻害試験、分化阻害試験、透過性試験などにより行なわれている（例えば、非特許文献１を参照）。しかしながら、これらの試験は、皮膚における感覚刺激を定量的に測定することができないため、皮膚に対する物質の刺激性を、十分な感度で評価することが困難であるという欠点がある。皮膚における感覚刺激を定量的に測定する方法としては、ヒトによるスティンギングテスト法が知られている（例えば、非特許文献２を参照）。しかしながら、ヒトによるスティンギングテスト法は、被験者によるバラつき、季節の違いなどによって実験結果の誤差が大きいため、皮膚における感覚刺激を、十分な精度及び感度で評価することが困難であるという欠点がある。
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を活性化する物質を高い感度で評価することができるＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法を提供することを目的とする。また、本発明は、感覚刺激を引き起こす物質を高い精度で、かつ高い感度で評価することができる感覚刺激を引き起こす物質の評価方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the prior art, and an object of the present invention is to provide a method for evaluating a TRPA1 activator that can evaluate a substance that activates the physiological function of TRPA1 with high sensitivity. To do. It is another object of the present invention to provide a method for evaluating a substance that causes sensory stimulation that can evaluate a substance that causes sensory stimulation with high accuracy and high sensitivity.
すなわち、本発明の要旨は、
（１） 被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、該被験物質により、ＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法、
（２） 前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化を、細胞内カルシウムイオン濃度を指標として測定する前記（１）に記載の評価方法、
（３） 前記ＴＲＰＡ１発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を発現可能に宿主細胞に導入することにより得られる細胞である前記（１）又は（２）に記載の評価方法、
（４） 前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞である前記（３）に記載の評価方法、並びに
（５） 被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、該被験物質により、ＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることを特徴とする感覚刺激を引き起こす物質の評価方法
に関する。
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) A method for evaluating an activator of TRPA1, comprising contacting a test substance, an alkaline solution, and a TRPA1-expressing cell, and examining whether or not the physiological function of TRPA1 is activated by the test substance ,
(2) The evaluation method according to (1), wherein the activation of the physiological function of TRPA1 is measured using an intracellular calcium ion concentration as an index,
(3) The evaluation method according to (1) or (2), wherein the TRPA1-expressing cell is a cell obtained by introducing a nucleic acid encoding TRPA1 into a host cell so as to allow expression.
(4) The evaluation method according to (3) above, wherein the host cell is HEK293 cell, CHO cell, COS-7 cell or NIH3T3 cell, and (5) a test substance, an alkaline solution and a TRPA1-expressing cell are brought into contact with each other. The present invention relates to a method for evaluating a substance that causes sensory stimulation, characterized by examining whether or not a physiological function of TRPA1 is activated by the test substance.
本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を活性化する物質を高い感度で評価することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法は、感覚刺激を引き起こす物質を高い精度で、かつ高い感度で評価することができるという優れた効果を奏する。 The TRPA1 activation substance evaluation method of the present invention has an excellent effect that a substance that activates the physiological function of TRPA1 can be evaluated with high sensitivity. Moreover, the method for evaluating a substance that causes sensory stimulation of the present invention has an excellent effect that a substance that causes sensory stimulation can be evaluated with high accuracy and high sensitivity.
本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法は、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、該被験物質により、ＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることを特徴とする。 The method for evaluating an activator of TRPA1 according to the present invention comprises contacting a test substance, an alkaline solution, and a TRPA1-expressing cell, and examining whether the physiological function of TRPA1 is activated by the test substance. And
本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法は、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させているため、被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際してアルカリ性溶液を用いない場合に比べて、被験物質によるＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化をより高い感度で評価することができるという優れた効果を奏する。このように、本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法は、高い感度でＴＲＰＡ１の活性化物質を評価することができるため、被験物質が少量であっても、この被検物質がＴＲＰＡ１の活性化物質であるか否かを評価することができる。また、本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法では、被験物質の評価にＴＲＰＡ１発現細胞が用いられているため、ヒトや実験動物を用いなくても、ＴＲＰＡ１を介して皮膚などに感覚刺激を引き起こす物質を評価することができる。 Since the test substance, the alkaline solution, and the TRPA1-expressing cell are brought into contact with each other in the method for evaluating the TRPA1-activating substance of the present invention, compared with the case where the alkaline solution is not used when contacting the test substance with the TRPA1-expressing cell, It has an excellent effect that the activation of the physiological function of TRPA1 by the test substance can be evaluated with higher sensitivity. Thus, since the TRPA1 activator evaluation method of the present invention can evaluate the TRPA1 activator with high sensitivity, even if the test substance is a small amount, the test substance is active in TRPA1. It can be evaluated whether it is a chemical substance. Further, in the method for evaluating a TRPA1 activator of the present invention, TRPA1-expressing cells are used for the evaluation of a test substance, so that sensory stimulation can be applied to the skin or the like via TRPA1 without using humans or experimental animals. The substance that causes it can be evaluated.
本明細書において、アルカリ性溶液とは、例えば、アルカリ性物質、アルカリ性緩衝液などを含み、アルカリ性である溶液をいう。 In this specification, an alkaline solution refers to a solution that is alkaline, including, for example, an alkaline substance, an alkaline buffer solution, and the like.
アルカリ性溶液のｐＨは、ＴＲＰＡ１の生理学的機能に対する被験物質の作用の発現を増強させるｐＨで、かつＴＲＰＡ１発現細胞が生育できるｐＨである。アルカリ性溶液のｐＨは、ＴＲＰＡ１発現細胞の種類によって、生育できるｐＨの範囲が異なるため、一概に決定することができない。通常、アルカリ性溶液のｐＨは、ｐＨ８〜１４である。 The pH of the alkaline solution is a pH that enhances the expression of the test substance's action on the physiological function of TRPA1, and is a pH at which TRPA1-expressing cells can grow. The pH of the alkaline solution cannot be generally determined because the range of pH that can be grown varies depending on the type of TRPA1-expressing cells. Usually, the pH of the alkaline solution is pH 8-14.
アルカリ性物質としては、特に限定されないが、例えば、アンモニア、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。アルカリ性物質を溶解させる溶媒としては、特に限定されないが、エタノール、生理的食塩水、水などが挙げられる。 Although it does not specifically limit as an alkaline substance, For example, ammonia, a monoethanolamine, a triethanolamine, ammonium carbonate, ammonium hydrogencarbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide etc. are mentioned. The solvent for dissolving the alkaline substance is not particularly limited, and examples thereof include ethanol, physiological saline, and water.
また、アルカリ性緩衝液としては、アルカリ性のトリス塩酸緩衝液、ヘペス緩衝液などが挙げられる。 Examples of the alkaline buffer include alkaline tris hydrochloric acid buffer and hepes buffer.
被験物質としては、特に限定されないが、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられる。被験物質は、必要に応じて、溶媒に溶解させてもよい。かかる溶媒は、ＴＲＰＡ１発現細胞の生育、ＴＲＰＡ１の生理学的機能の発現に影響を与えない溶媒であるのが望ましい。被験物質を溶解させる溶媒としては、例えば、エタノール、生理的食塩水、水などが挙げられる。 Although it does not specifically limit as a test substance, For example, an inorganic compound, an organic compound, a plant extract, a microorganism culture, a microorganism extract etc. are mentioned. The test substance may be dissolved in a solvent as necessary. Such a solvent is desirably a solvent that does not affect the growth of TRPA1-expressing cells and the expression of physiological functions of TRPA1. Examples of the solvent for dissolving the test substance include ethanol, physiological saline, and water.
ＴＲＰＡ１発現細胞は、一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰチャネル）の１つであるＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。 A TRPA1-expressing cell is a cell that expresses a physiological function of TRPA1, which is one of transient receptor potential channels (TRP channels).
ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、痛み刺激、温度刺激、機械刺激、化学刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。 Examples of physiological functions of TRPA1 include permeation of cations such as sodium ions and calcium ions from the outside to the inside of cells due to stimulation such as pain stimulation, temperature stimulation, mechanical stimulation, and chemical stimulation.
ＴＲＰＡ１発現細胞は、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞であってもよく、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞であってもよい。 The TRPA1-expressing cell may be a wild-type cell expressing endogenous TRPA1, or a cell into which a nucleic acid encoding TRPA1 has been introduced into a host cell so that it can be expressed.
ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を簡便な操作で、かつ高い感度で測定することができる観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。 Among the TRPA1-expressing cells, from the viewpoint that the physiological function of TRPA1 can be measured with a simple operation and high sensitivity, a cell in which a nucleic acid encoding TRPA1 has been introduced into a host cell so that it can be expressed (hereinafter, referred to as “TRPA1”). Also referred to as “exogenous TRPA1-expressing cells”).
内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経細胞などが挙げられる。 Although it does not specifically limit as a wild type cell which expresses endogenous TRPA1, For example, a sensory neuron etc. are mentioned.
外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、宿主細胞に導入された前記核酸が、染色体外要素として存在している細胞であってもよく、宿主細胞に導入された前記核酸が組み込みにより染色体に組み込まれている細胞であってもよい。 An exogenous TRPA1-expressing cell may be a cell in which the nucleic acid introduced into the host cell is present as an extrachromosomal element, or a cell in which the nucleic acid introduced into the host cell is integrated into the chromosome by integration. It may be.
外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、慣用の形質転換方法によって、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターなどにより宿主細胞を形質転換することにより得られる。 Exogenous TRPA1-expressing cells can be obtained by transforming host cells with a recombinant vector or the like that retains a nucleic acid encoding TRPA1 by a conventional transformation method.
ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。ヒトにおけるＴＲＰＡ１活性化物質を的確に評価する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、好ましくはヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸である。ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。なお、ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが陽イオンを透過させる生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１又は数個のヌクレオチド残基の置換、欠失又は挿入を有する変異型核酸であってもよい。 The nucleic acid encoding TRPA1 may be a nucleic acid encoding human TRPA1 or a nucleic acid encoding TRPA1 of another animal. From the viewpoint of accurately evaluating a TRPA1 activator in humans, the nucleic acid encoding TRPA1 is preferably a nucleic acid encoding human TRPA1. Examples of the nucleic acid encoding TRPA1 include a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a base sequence of a nucleic acid encoding human TRPA1 registered in GenBank as accession number NM_007332. It should be noted that one or several nucleic acids encoding TRPA1 are present at the inside or at the end of the base sequence of the structural gene of TRPA1 as long as the polypeptide encoded by the nucleic acid expresses a physiological function of permeating cations. It may be a mutant nucleic acid having substitution, deletion or insertion of the nucleotide residues.
変異型核酸としては、例えば、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件（デフォルト値）下、評価対象の配列をアライメントして算出される配列相同性の値が、ＴＲＰＡ１が有する生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
Examples of the mutant nucleic acid include (A) the conditions of Cost to open gap 11, Cost to extended gap 1, expect value 10, and wordsize 11 (default) for the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 by the BLAST algorithm. Value), the sequence homology value calculated by aligning the sequences to be evaluated is preferably 60% or more, more preferably 80% or more, from the viewpoint of sufficiently exerting the physiological function of TRPA1. A nucleic acid consisting of a base sequence that is preferably 90% or more, and the encoded polypeptide is a polypeptide that expresses at least a function of permeating cations,
(B) In SEQ ID NO: 2, encodes an amino acid sequence having a substitution, deletion or addition of one or several amino acid residues, and the encoded polypeptide at least expresses a function of permeating cations A nucleic acid which is a polypeptide,
(C) A polypeptide that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid complementary to the nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and expresses the function of allowing a cation to permeate. A nucleic acid etc. are mentioned.
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸によりコードされるポリペプチドの生理学的機能と同等又はそれ以上の生理学的機能を有するポリペプチドをコードする核酸を得る観点から、好ましくは配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸と、配列番号：１に対する配列相同性が少なくとも６０％である塩基配列からなる核酸とが特異的にハイブリダイゼーションする条件である。前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸とハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５重量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中、室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度条件で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度条件下での洗浄を行なう条件などが挙げられる。 In the present specification, “stringent conditions” means a polypeptide having a physiological function equivalent to or higher than the physiological function of a polypeptide encoded by a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. From the viewpoint of obtaining a nucleic acid that encodes, preferably a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid consisting of a base sequence having a sequence homology of at least 60% with respect to SEQ ID NO: 1 are specifically high. Conditions for hybridization. Examples of the stringent conditions include a hybridization solution [composition: 6 × SSC (composition: 0.9 M sodium chloride, composition), and a nucleic acid having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid to be hybridized. 0.09M sodium citrate, pH 7.0), 0.5 wt% sodium dodecyl sulfate, 5 × Denhardt's solution, 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA, 50 vol% formamide] at room temperature at 42 more stringent conditions Incubate for 10 hours at 60 ° C. or higher as a more stringent condition, then, for example, 2 × SSC, 0.1 × SSC as a more stringent condition, at room temperature More stringent conditions at 42 ° C or higher Examples of the conditions include cleaning conditions under a temperature condition of 60 ° C. or higher.
ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づき作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づき設計され、合成された２種のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などにより得られる。 The nucleic acid encoding TRPA1 is, for example, a hybridization method using a probe prepared on the basis of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and two kinds of synthesized and synthesized based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It can be obtained by a nucleic acid amplification method using a primer pair consisting of oligonucleotide primers.
形質転換方法は、用いられる宿主細胞の種類に応じた方法であればよい。形質転換方法としては、例えば、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などに記載されたエレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などが挙げられる。 The transformation method may be any method according to the type of host cell used. The transformation method is described in, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Press, 1989). Examples include a poration method, a lipofection method, a transfection method, and a particle gun method.
組換えベクターは、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を、慣用のベクターと連結させることにより得られるベクターである。ベクターは、調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。ベクターは、形質転換後の細胞のなかから外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を選択する観点から、好ましくは選択マーカー遺伝子を有するベクターである。また、ベクターは、必要により、ＴＲＰＡ１を連結させるための部位の上流に、発現プロモーターを有していてもよい。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。 A recombinant vector is a vector obtained by ligating a nucleic acid encoding TRPA1 with a conventional vector. Any vector can be used as long as it is easy to prepare, can be efficiently introduced into a host cell, and TRPA1 can be efficiently expressed in the host cell. The vector is preferably a vector having a selectable marker gene from the viewpoint of selecting exogenous TRPA1-expressing cells from the transformed cells. Moreover, the vector may have an expression promoter upstream of the site for linking TRPA1 as necessary. Examples of the vector include a plasmid vector and a virus vector.
プラスミドベクターとしては、特に限定されないが、例えば、大腸菌のプラスミドベクター、酵母のプラスミドベクターなどが挙げられる。また、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。 The plasmid vector is not particularly limited, and examples thereof include an Escherichia coli plasmid vector and a yeast plasmid vector. Examples of virus vectors include retrovirus vectors.
発現プロモーターは、宿主細胞内でＴＲＰＡ１を発現させるに適したプロモーターであればよい。発現プロモーターは、用いられる宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。 The expression promoter may be a promoter suitable for expressing TRPA1 in the host cell. The expression promoter can be appropriately selected depending on the type of host cell used.
前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＡ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、好ましくは動物細胞である。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。前記宿主細胞のなかでは、ヒトの組織において、ＴＲＰＡ１を活性化する物質を評価する観点及びヒトにおける感覚刺激をもたらす被験物質を評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、温度感受性ＴＲＰチャネルがほとんど発現していない観点から、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。 The host cell is not particularly limited as long as the nucleic acid encoding TRPA1 is efficiently expressed and can be easily cultured, and examples thereof include animal cells, bacterial cells, plant cells, and insect cells. It is done. Among these, animal cells are preferable from the viewpoint of sufficiently reproducing the physiological function of TRPA1 in humans. Examples of animal cells include human cells, monkey cells, mouse cells, and the like. Although it does not specifically limit as a monkey cell, For example, a COS-7 cell etc. are mentioned. Although it does not specifically limit as a mouse cell, For example, a CHO cell, a NIH3T3 cell, etc. are mentioned. Although it does not specifically limit as a human cell, For example, HEK293 cell, Hela cell, etc. are mentioned. Among the host cells, HEK293 cells, CHO cells, COS-7 cells, and NIH3T3 cells are used in human tissues from the viewpoint of evaluating substances that activate TRPA1 and from the viewpoint of evaluating test substances that cause sensory stimulation in humans. Is preferred. Among these, HEK293 cells are more preferable from the viewpoint that temperature-sensitive TRP channels are hardly expressed.
形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどにより行なうことができる。また、得られた細胞が外因性ＴＲＰＡ１発現細胞であることの確認は、例えば、細胞を、１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することにより行なうことができる。細胞が外因性ＴＲＰＡ１発現細胞である場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも大きくなる。 Selection of exogenous TRPA1-expressing cells from the transformed cells can be performed, for example, by culturing in a selective medium corresponding to the selection marker gene when the recombinant vector used has a selection marker gene. . In addition, confirmation that the obtained cell is an exogenous TRPA1-expressing cell can be confirmed by, for example, contacting the cell with 1 to 10 mM paraoxybenzoic acid methyl ester, and measuring the intracellular calcium ion concentration described below after the contact. This can be done by measuring the intracellular calcium ion concentration of the cells. When the cell is an exogenous TRPA1-expressing cell, the intracellular calcium ion concentration of the cell after contact is larger than the intracellular calcium ion concentration of the cell not contacted with paraoxybenzoic acid methyl ester.
被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触は、例えば、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを、ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に適した培地に添加し、得られた混合物をインキュベーションすること、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを混合し、得られた混合物をインキュベーションすることなどにより行なわれる。 The contact between the test substance, the alkaline solution, and the TRPA1-expressing cell is, for example, adding the test substance, the alkaline solution, and the TRPA1-expressing cell to a medium suitable for culturing the TRPA1-expressing cell, and incubating the obtained mixture. The test substance, alkaline solution, and TRPA1-expressing cells are mixed, and the resulting mixture is incubated.
ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に用いられる培地としては、当該ＴＲＰＡ１発現細胞が生育するのに適した成分、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどを成分とする培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に、前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地などが挙げられる。ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に用いられる培地は、ＴＲＰＡ１発現細胞の種類により培養条件が異なるため、一概に決定することができない。例えば、用いられるＴＲＰＡ１発現細胞が、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に用いられる培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。 Examples of the medium used for culturing TRPA1-expressing cells include components suitable for growth of the TRPA1-expressing cells, such as glucose, amino acids, peptone, vitamins, cell growth promoting factors (for example, cell growth factors, hormones, binding proteins). , Cell adhesion factors, lipids, etc.), serum (eg, fetal bovine serum, etc.), calcium chloride, magnesium chloride, etc. The medium may be a conventional basic medium supplemented with the above components, or a commercially available medium. The basic medium is not particularly limited, and examples thereof include MEM medium, DMEM medium, and RPMI 1640 medium. The culture medium used for culturing TRPA1-expressing cells cannot be generally determined because the culture conditions differ depending on the type of TRPA1-expressing cells. For example, when the TRPA1-expressing cells used are cells obtained from HEK293 cells, a 10% by mass fetal bovine serum-containing DMEM medium or the like is used as a medium used for culturing the TRPA1-expressing cells.
被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、被験物質の量は、被験物質の種類に応じて適宜設定することができる。 When contacting the test substance, the alkaline solution, and the TRPA1-expressing cells, the amount of the test substance can be appropriately set according to the type of the test substance.
また、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、ＴＲＰＡ１発現細胞の数は、試験データの信頼性の観点から、１視野（データ解析範囲）あたり、好ましくは１×１０1細胞以上、より好ましくは１×１０2細胞以上であり、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎない観点から、好ましくは３×１０２細胞以下、より好ましくは２×１０２細胞以下となるようにすることができる。 In addition, when contacting the test substance, the alkaline solution and the TRPA1-expressing cells, the number of TRPA1-expressing cells is preferably 1 × 10 1 cells or more per visual field (data analysis range) from the viewpoint of the reliability of the test data. More preferably, it is 1 × 10 2 cells or more, and from the viewpoint of securing the cell spacing and preventing the cells from becoming too dense, it is preferably 3 × 10 2 cells or less, more preferably 2 × 10 2 cells or less. Can be.
さらに、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、アルカリ性溶液の量は、用いられるアルカリ性溶液の種類により異なるので、一概に決定することができない。通常、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との混合物中におけるアルカリ性溶液の濃度は、有効な緩衝効果を発揮する観点から、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、浸透圧に影響させない観点から、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは３０ｍＭ以下である。 Furthermore, when the test substance, the alkaline solution, and the TRPA1-expressing cells are brought into contact with each other, the amount of the alkaline solution varies depending on the type of the alkaline solution used, and thus cannot be determined in general. Usually, the concentration of the alkaline solution in the mixture of the test substance, the alkaline solution and the TRPA1-expressing cells is preferably 1 mM or more, more preferably 10 mM or more from the viewpoint of exerting an effective buffering effect, and does not affect the osmotic pressure. From the viewpoint, it is preferably 50 mM or less, more preferably 30 mM or less.
被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物のｐＨは、ＴＲＰＡ１の生理学的機能に対する被験物質の作用の発現が増強されるｐＨで、かつＴＲＰＡ１発現細胞が生育できるｐＨであればよい。通常、前記混合物のｐＨは、８〜１０である。 The pH of the mixture containing the test substance, the alkaline solution, and the TRPA1-expressing cells may be a pH that enhances the expression of the action of the test substance on the physiological function of TRPA1 and that allows the TRPA1-expressing cells to grow. Usually, the pH of the mixture is 8-10.
なお、ＴＲＰＡ１発現細胞とアルカリ性溶液と被験物質とを接触させるに先立って、生理学的機能を発現させるに適した状態にＴＲＰＡ１発現細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＡ１発現細胞を、任意の時間培養してもよい。 Prior to contacting the TRPA1-expressing cells, the alkaline solution and the test substance, in order to maintain the TRPA1-expressing cells in a state suitable for expressing a physiological function, the TRPA1-expressing cells are optionally added as necessary. You may culture | cultivate for this time.
ＴＲＰＡ１発現細胞の培養方法は、用いられる細胞の種類に応じた方法であればよく、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などの方法が挙げられる。また、培養温度、培養時間、培養液のｐＨ、二酸化炭素濃度などの培養条件は、用いられる宿主細胞に応じて適宜設定される。ＴＲＰＡ１発現細胞に用いられる宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である場合、ＴＲＰＡ１発現細胞は、細胞を良好に生育させる観点から、通常、５体積％二酸化炭素中、３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で培養される。 The method for culturing TRPA1-expressing cells may be any method according to the type of cells used, and examples include methods such as single-layer stationary culture, suspension culture, rotational culture, and three-dimensional carrier culture. . In addition, culture conditions such as culture temperature, culture time, culture medium pH, and carbon dioxide concentration are appropriately set according to the host cells used. When the host cell used for the TRPA1-expressing cell is HEK293 cell, the TRPA1-expressing cell is usually 36 ° C to 38 ° C, preferably 36.5 ° C in 5% by volume carbon dioxide from the viewpoint of causing the cells to grow well. Incubate at ~ 37.5 ° C.
被験物質によるＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化は、例えば、細胞内カルシウムイオン濃度、ＴＲＰＡ１を介する電位、これらの組み合わせなどを指標として測定される。 Activation of the physiological function of TRPA1 by the test substance is measured using, for example, intracellular calcium ion concentration, potential via TRPA1, combinations thereof, and the like.
被験物質によるＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化は、例えば、アルカリ性溶液と接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度と、被験物質とアルカリ性溶液と接触させたＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度との差、アルカリ性溶液に接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１を介する電位と、被験物質とアルカリ性溶液とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１を介する電位の差、これらの組み合わせなどを調べることにより測定される。 Activation of the physiological function of TRPA1 by the test substance is, for example, the intracellular calcium ion concentration of the TRPA1-expressing cell when contacted with the alkaline solution, and the intracellular calcium ion of the TRPA1-expressing cell contacted with the test substance and the alkaline solution. Differences between ion concentration, potential via TRPA1 in TRPA1-expressing cells when contacted with alkaline solution, and potential via TRPA1 in TRPA1-expressing cells contacted with test substance and alkaline solution, combinations thereof, etc. Measured by examining.
アルカリ性溶液に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内では、アルカリ性溶液に接触させていないＴＲＰＡ１発現細胞に比べて、ＴＲＰＡ１を介するＴＲＰＡ１発現細胞外からＴＲＰＡ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量が増大する。したがって、被験物質とアルカリ性溶液とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞では、被験物質に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞に比べて、被験物質によるＴＲＰＡ１を介するＴＲＰＡ１発現細胞外からＴＲＰＡ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量が相対的に増大し、細胞内カルシウムイオン濃度の増加の幅が大きくなる。よって、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触により、細胞内カルシウムイオン濃度をより高感度で測定することができるため、前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化は、細胞内カルシウムイオン濃度を指標として測定することが好ましい。 In a TRPA1-expressing cell that has been contacted with an alkaline solution, the amount of inflow of calcium ions from outside the TRPA1-expressing cell via TRPA1 into the TRPA1-expressing cell is increased compared to a TRPA1-expressing cell that has not been contacted with an alkaline solution. Therefore, in the TRPA1-expressing cells brought into contact with the test substance and the alkaline solution, calcium ions from outside the TRPA1-expressing cells via the TRPA1 by the test substance into the TRPA1-expressing cells are compared with the TRPA1-expressing cells brought into contact with the test substance. The amount of inflow increases relatively, and the range of increase in intracellular calcium ion concentration increases. Therefore, since the intracellular calcium ion concentration can be measured with higher sensitivity by contacting the test substance, the alkaline solution and the TRPA1-expressing cell, the activation of the physiological function of the TRPA1 It is preferable to measure as an index.
細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法としては、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンに結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を介して、間接的に調べる方法などが挙げられる。前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンに対する結合量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ ２、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。 As a method for measuring intracellular calcium ion concentration, for example, a fluorescent reagent based on a calcium chelating agent (hereinafter also referred to as “fluorescent calcium indicator”) is introduced into a TRPA1-expressing cell, and the fluorescent calcium indicator is added to intracellular calcium ions. And a method of indirectly examining through the fluorescence intensity of the fluorescent calcium indicator bound to calcium ions. The fluorescent calcium indicator is not particularly limited as long as it is a reagent whose fluorescence characteristics change depending on the binding amount to calcium ions, and examples thereof include FURA 2, FURA 2-AM, and Fluo-3.
この場合、被験物質がＴＲＰＡ１活性化物質であることの判断基準としては、例えば、〔Ｉ〕アルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞に比べて、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度が、増加していること、〔ＩＩ〕被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度と、被験物質と中性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度との差が、ＴＲＰＡ１の既知のアゴニストとアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度と、ＴＲＰＡ１の既知のアゴニストと中性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度との差と同じであるかそれよりも大きいことなどが挙げられる。 In this case, the criteria for determining that the test substance is a TRPA1 activator include, for example, [I] a test substance and an alkaline solution compared to a TRPA1 expressing cell when the alkaline solution is contacted with a TRPA1 expressing cell. The intracellular calcium ion concentration of the TRPA1-expressing cell when contacted with the TRPA1-expressing cell is increased. [II] The TRPA1-expressing cell when the test substance, the alkaline solution and the TRPA1-expressing cell are contacted The difference between the intracellular calcium ion concentration and the intracellular calcium ion concentration of the TRPA1-expressing cell when the test substance, the neutral solution, and the TRPA1-expressing cell are brought into contact with each other is a known agonist of TRPA1, an alkaline solution, and a TRPA1-expressing cell. Intracellular calcium ion concentration of TRPA1-expressing cells when contacted with Either the same as the difference between the intracellular calcium ion concentration of TRPA1 expressing cells when TRPA1 is brought into contact with a known agonist and the neutral solution and TRPA1 cells expressing it and the like larger than.
なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出するのが望ましい。具体的には、例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍである。この場合、細胞内カルシウムイオン濃度は、励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度との蛍光強度比（励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度）により調べることができる。 In addition, when a fluorescent calcium indicator has two types of excitation wavelengths, it is desirable to calculate a fluorescence intensity ratio from the fluorescence intensity in each excitation wavelength from a viewpoint of improving accuracy. Specifically, for example, the excitation wavelengths of FURA 2-AM, which is a fluorescent calcium indicator, are 340 nm and 380 nm. In this case, the intracellular calcium ion concentration is examined by the fluorescence intensity ratio between the fluorescence intensity at the excitation wavelength of 340 nm and the fluorescence intensity at the excitation wavelength of 380 nm (fluorescence intensity at the excitation wavelength of 340 nm / fluorescence intensity at the excitation wavelength of 380 nm). Can do.
ＴＲＰＡ１を介する電位の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。 Examples of the method for measuring the potential via TRPA1 include a patch clamp method.
この場合、被験物質がＴＲＰＡ１活性化物質であることの判断基準としては、例えば、アルカリ性溶液に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における一定の電位下での電流に比べて、被験物質とアルカリ性溶液とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が、大きいことなどが挙げられる。 In this case, the criterion for determining that the test substance is a TRPA1 activator is, for example, that the test substance is in contact with the alkaline solution compared to the current at a constant potential in the TRPA1-expressing cell contacted with the alkaline solution. For example, the current at the same potential as that of the above-mentioned TRPA1-expressing cells is large.
本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法に供することによって、ＴＲＰＡ１の活性化物質であることが判明した被験物質は、ＴＲＰＡ１を介して皮膚などに感覚刺激を引き起こす。本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法によれば、例えば、化粧品、皮膚外用剤などの成分として用いる化合物などを被験物質として用いることにより、前記化合物などが感覚刺激を引き起こさないかどうかを調べることができる。これにより、感覚刺激を引き起こす物質を予め除外することも可能となるため、本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法によれば、皮膚トラブルを生じやすい人に適した化粧品、皮膚外用剤などの製造が可能になる。また、本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法により、感覚刺激を引き起こす物質のスクリーニング、薬理学的評価などを行なうことができる。 A test substance that has been found to be an activator of TRPA1 by using the method for evaluating an activator of TRPA1 of the present invention causes sensory stimulation on the skin or the like via TRPA1. According to the method for evaluating an active substance of TRPA1 of the present invention, for example, by using a compound used as a component of cosmetics, a topical skin preparation, or the like as a test substance, whether or not the compound causes a sensory stimulus is examined. be able to. This makes it possible to exclude substances that cause sensory irritation in advance. Therefore, according to the evaluation method of the activated substance of TRPA1 of the present invention, cosmetics suitable for people who are likely to cause skin troubles, skin external preparations, etc. Manufacturing becomes possible. In addition, according to the method for evaluating a TRPA1 activation substance of the present invention, screening for substances that cause sensory stimulation, pharmacological evaluation, and the like can be performed.
本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法は、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、該被験物質により、ＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることを特徴とする。 The method for evaluating a substance that causes sensory stimulation according to the present invention comprises contacting a test substance, an alkaline solution, and a TRPA1-expressing cell, and examining whether or not the physiological function of TRPA1 is activated by the test substance. And
本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法は、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させているため、被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際してアルカリ性溶液を用いない場合に比べて、被験物質によるＴＲＰＡ１を介する感覚刺激をより高い感度で評価することができるという優れた効果を奏する。このように、本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法は、高い感度で感覚刺激を引き起こす物質を評価することができるため、被験物質が少量であっても、この被検物質が感覚刺激を引き起こす物質であるか否かを評価することができる。また、本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法は、感覚刺激を引き起こす物質を評価するに際して、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べているため、感覚刺激を引き起こす物質を高い精度で評価することができるという優れた効果を奏する。 In the method for evaluating a substance that causes sensory stimulation of the present invention, since a test substance, an alkaline solution, and a TRPA1-expressing cell are brought into contact with each other, compared to a case where an alkaline solution is not used when contacting the test substance with a TRPA1-expressing cell, There is an excellent effect that sensory stimulation via TRPA1 by a test substance can be evaluated with higher sensitivity. Thus, since the method for evaluating a substance that causes sensory stimulation according to the present invention can evaluate a substance that causes sensory stimulation with high sensitivity, even if the test substance is a small amount, the test substance does not cause sensory stimulation. It is possible to evaluate whether or not it is a substance to cause. In addition, the method for evaluating a substance that causes sensory stimulation according to the present invention examines whether or not the physiological function of TRPA1 in a TRPA1-expressing cell is activated when evaluating the substance that causes sensory stimulation. It has an excellent effect of being able to evaluate substances that cause odor with high accuracy.
被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触は、前記ＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法における操作と同様の操作を行なうことにより実施することができる。 The contact between the test substance, the alkaline solution, and the TRPA1-expressing cells can be carried out by performing the same operation as in the method for evaluating the TRPA1 activation substance.
ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化は、前記ＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法と同様の指標により測定することができる。 Activation of a physiological function of TRPA1 in a TRPA1-expressing cell can be measured by the same index as in the method for evaluating an activator of TRPA1.
被験物質がＴＲＰＡ１活性化物質であることの判断基準は、前記ＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法における被験物質がＴＲＰＡ１活性化物質であることの判断基準と同様である。 The criterion for determining that the test substance is a TRPA1 activator is the same as the criterion for determining that the test substance in the TRPA1 activator evaluation method is a TRPA1 activator.
本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法によれば、例えば、種々の化合物などのなかから、感覚刺激を引き起こす物質をスクリーニングすることができる。また、本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法によれば、化粧品、皮膚外用剤などに含まれる成分の薬理学的評価を行なうことができる。 According to the method for evaluating a substance that causes sensory stimulation of the present invention, for example, a substance that causes sensory stimulation can be screened from various compounds. Further, according to the method for evaluating a substance that causes sensory stimulation of the present invention, pharmacological evaluation of components contained in cosmetics, external preparations for skin, and the like can be performed.
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to the examples.
（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、である商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μｌとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μｌと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μｌとを混合し、混合物ＩＩを得た。
(Production Example 1)
A cDNA encoding human TRPA1 [Polynucleotide at positions 63 to 3888 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (GenBank accession number: NM_007332)] is a vector for mammalian cells (trade name, manufactured by Invitrogen). : PcDNA3.1 (+)] to obtain a human TRPA1 expression vector. 1 μg of the obtained human TRPA1 expression vector was mixed with 6 μl of a gene introduction reagent [manufactured by Invitrogen, trade name: PLUS Reagent, catalog number: 11514-015] to obtain a mixture I. In addition, 4 μl of cationic lipid for gene introduction [manufactured by Invitrogen, trade name: Lipofectamine (registered trademark), catalog number: 18324-012] and serum use reduction medium [trade name: OPTI-MEM (manufactured by Invitrogen), registered (Trademark) I Reduced-Serum Medium (Cat. No. 11058021) 200 μl was mixed to obtain a mixture II.
また、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を、直径３５ｍｍのシャーレ上、１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中、５体積％二酸化炭素、３７℃で、７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。 In addition, 5 × 10 5 HEK293 cells were cultured on a petri dish having a diameter of 35 mm in 10% by mass FBS-containing DMEM medium at 5% by volume carbon dioxide at 37 ° C. until reaching 70% confluency.
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。 By adding the mixture I and the mixture II to the obtained cell culture, the human TRPA1 expression vector was introduced into HEK293 cells to obtain TRPA1-expressing cells.
（実験例１）
溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製した。得られた溶媒Ａを実験例１の試験液とした。
(Experimental example 1)
Solvent A [composition: 140 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM glucose, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)] was prepared. The obtained solvent A was used as the test solution of Experimental Example 1.
（実験例２）
溶媒Ｂ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）〕を調製した。得られた溶媒Ｂを実験例２の試験液とした。
(Experimental example 2)
Solvent B [Composition: 140 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM glucose, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0)] was prepared. The obtained solvent B was used as the test solution of Experimental Example 2.
（実験例３）
被験物質として、ＴＲＰＡ１の既知のアゴニストであるイシリン〔和光純薬工業（株）製、カタログ番号：４２０−０３７−Ｍ００１〕を、最終濃度が１０μＭとなるように、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕に添加し、実験例３の試験液を調製した。
(Experimental example 3)
As a test substance, icilin [manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., catalog number: 420-037-M001], which is a known agonist of TRPA1, was used in a solvent A [composition: 140 mM sodium chloride] so that the final concentration was 10 μM. 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM glucose, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)] to prepare a test solution of Experimental Example 3.
（実験例４）
実験例３における溶媒Ａに代えて、アルカリ性溶液である溶媒Ｂ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）〕を用いたことを除き、実験例１と同様の操作を行なうことにより、実験例４の試験液を調製した。
(Experimental example 4)
Instead of solvent A in Experimental Example 3, solvent B (composition: 140 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 10 mM glucose, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0)), which is an alkaline solution, was used. A test solution of Experimental Example 4 was prepared by performing the same operation as in Experimental Example 1 except that it was used.
（実験例５）
被験物質として、ＴＲＰＡ１の既知のアゴニストであるシンナムアルデヒド〔和光純薬工業（株）製、カタログ番号：０３１−０３４５３〕を、最終濃度が１００μＭとなるように、前記溶媒Ａに添加し、実験例５の試験液を調製した。
(Experimental example 5)
As a test substance, cinnamaldehyde (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., catalog number: 031-03453), which is a known agonist of TRPA1, was added to the solvent A so as to have a final concentration of 100 μM. 5 test solutions were prepared.
（実験例６）
実験例５における溶媒Ａに代えて、アルカリ性溶液である溶媒Ｂを用いたことを除き、実験例５と同様の操作を行なうことにより、実験例６の試験液を調製した。
(Experimental example 6)
A test solution of Experimental Example 6 was prepared by performing the same operation as in Experimental Example 5 except that Solvent B, which was an alkaline solution, was used instead of Solvent A in Experimental Example 5.
（実験例７）
被験物質として、ＴＲＰＡ１の既知のアゴニストであるイソチオシアン酸アリル〔和光純薬工業（株）製、カタログ番号：０１６−０１４６３〕を、最終濃度が５μＭとなるように、前記溶媒Ａに添加し、実験例７の試験液を調製した。
(Experimental example 7)
As a test substance, allyl isothiocyanate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., catalog number: 016-01463), a known agonist of TRPA1, was added to the solvent A so as to have a final concentration of 5 μM. The test solution of Example 7 was prepared.
（実験例８）
実験例７における溶媒Ａに代えて、アルカリ性溶液である溶媒Ｂを用いたことを除き、実験例７と同様の操作を行なうことにより、実験例８の試験液を調製した。
(Experimental example 8)
A test solution of Experimental Example 8 was prepared by performing the same operation as in Experimental Example 7 except that Solvent B, which was an alkaline solution, was used instead of Solvent A in Experimental Example 7.
（実施例１）
前記製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションして、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入した。
Example 1
The TRPA1-expressing cells obtained in Production Example 1 were mixed at room temperature in a 10% by weight fetal calf serum-containing DMEM medium containing FURA 2-AM (manufactured by Invitrogen), a reagent for measuring intracellular calcium ions, at a final concentration of 5 μM. After incubation for 60 minutes, FURA 2-AM was introduced into the TRPA1-expressing cells.
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、循環定温チャンバー付蛍光測定装置（浜松ホトニクス株式会社製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０）の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、被験対象となる試験液の溶媒と同じ溶媒で洗浄した。 The obtained FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells were placed in each chamber of a fluorescence measuring apparatus with a circulating constant temperature chamber (manufactured by Hamamatsu Photonics, Inc., trade name: ARGUS-50). Thereafter, the FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells in the chamber were washed with the same solvent as the solvent of the test liquid to be tested.
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、試験液を入れ、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞と試験液とを混合した。チャンバー中の混合物のｐＨは、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞と試験液との混合直後において、チャンバーに入れた試験液が、実験例１、３、５及び７それぞれの試験液である場合、ｐＨ７．４であり、チャンバーに入れた試験液が、実験例２、４、６及び８それぞれの試験液である場合、ｐＨ９．０であった。 Next, the test solution was placed in the chamber containing the FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells after washing, and the washed FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells and the test solution were mixed. When the pH of the mixture in the chamber is just after mixing the FURA 2-AM-introduced TRPA1-expressing cells and the test solution, the test solution placed in the chamber is the test solution of each of Experimental Examples 1, 3, 5, and 7, When the pH of the test solution was 7.4 and the test solution placed in the chamber was the test solution of each of Experimental Examples 2, 4, 6, and 8, the pH was 9.0.
その後、チャンバーにおいて、試験液を循環させながら、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）及び励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。測定された蛍光強度340nm及び蛍光強度380nmから、蛍光強度比（蛍光強度340nm／蛍光強度380nm）を算出した。 Thereafter, the fluorescence intensity based on FURA 2-AM introduced into TRPA1-expressing cells at an excitation wavelength of 340 nm and bound to intracellular calcium ions (hereinafter referred to as “fluorescence intensity 340 nm ”) while circulating the test solution in the chamber. The fluorescence intensity based on FURA 2-AM introduced into the TRPA1-expressing cells at an excitation wavelength of 380 nm (hereinafter referred to as “fluorescence intensity 380 nm ”) was measured. A fluorescence intensity ratio (fluorescence intensity 340 nm / fluorescence intensity 380 nm ) was calculated from the measured fluorescence intensity 340 nm and fluorescence intensity 380 nm .
実験例１〜８で得られた試験液に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光強度比を図１に示す。図１中、バー１は、実験例１の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー２は、実験例２の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー３は、実験例３の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー４は、実験例４の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー５は、実験例５の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー６は、実験例６の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー７は、実験例７の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー８は、実験例８の試験液を用いた場合の蛍光強度比を示す。 The fluorescence intensity ratio based on FURA 2-AM bound to calcium ions in TRPA1-expressing cells brought into contact with the test solutions obtained in Experimental Examples 1 to 8 is shown in FIG. In FIG. 1, bar 1 is the fluorescence intensity ratio when the test solution of Experimental Example 1 is used, bar 2 is the fluorescence intensity ratio when the test solution of Experimental Example 2 is used, and bar 3 is that of Experimental Example 3. Fluorescence intensity ratio when using the test solution, bar 4 is the fluorescence intensity ratio when using the test solution of Experimental Example 4, and bar 5 is the fluorescence intensity ratio when using the test solution of Experimental Example 5, bar 6 is the fluorescence intensity ratio when using the test solution of Experimental Example 6, bar 7 is the fluorescence intensity ratio when using the test solution of Experimental Example 7, and bar 8 is the test solution of Experimental Example 8. The fluorescence intensity ratio in the case is shown.
図１に示される結果から、バー１、３、５及び７の蛍光強度比に比べて、バー２、４、６及び８の蛍光強度比が大きいため、被験物質と中性の溶液とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞を用いる場合に比べて、被験物質とアルカリ性溶液とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞を用いることによって、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を、より高感度で測定することができることがわかる。したがって、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、被験物質によりＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることにより、高感度でＴＲＰＡ１の活性化物質を評価することができることが示唆される。 From the results shown in FIG. 1, since the fluorescence intensity ratio of bars 2, 4, 6 and 8 is larger than the fluorescence intensity ratio of bars 1, 3, 5 and 7, the test substance is in contact with a neutral solution. It can be seen that the physiological function of TRPA1 can be measured with higher sensitivity by using the TRPA1-expressing cells brought into contact with the test substance and the alkaline solution, compared to the case of using the TRPA1-expressing cells that have been allowed to enter. Therefore, it is possible to evaluate a TRPA1 activator with high sensitivity by contacting a test substance, an alkaline solution, and a TRPA1-expressing cell, and examining whether the physiological function of TRPA1 is activated by the test substance. It is suggested that it can be done.
また、バー２の蛍光強度比に比べて、バー４、６及び８それぞれの蛍光強度比が大きいため、イシリン、シンナムアルデヒド及びイソチオシアン酸アリルは、いずれも、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を活性化させることが知られているパラオキシ安息香酸メチルエステルのように、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を活性化させることが示唆される。なお、パラオキシ安息香酸メチルエステルは、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を活性化させることにより、細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの流入量を増加させ、感覚刺激を引き起こすことが知られている。したがって、かかる結果から、イシリン、シンナムアルデヒド及びイソチオシアン酸アリルは、いずれも、パラオキシ安息香酸メチルエステルに比べて、より強い感覚刺激を引き起こす物質であることが示唆される。 Also, since the fluorescence intensity ratios of bars 4, 6 and 8 are larger than those of bar 2, icilin, cinnamaldehyde and allyl isothiocyanate all activate the physiological function of TRPA1. It is suggested to activate the physiological function of TRPA1, such as p-hydroxybenzoic acid methyl ester, which is known. In addition, paraoxybenzoic acid methyl ester is known to increase the inflow of calcium ions from the outside of the cell into the cell and activate sensory stimulation by activating the physiological function of TRPA1. Therefore, from these results, it is suggested that icilin, cinnamaldehyde, and allyl isothiocyanate are substances that cause stronger sensory stimulation than methyl paraoxybenzoate.
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