JP2009213391A - Dna probe set for identifying differentiated type or undifferentiated type of human stomach cancer cell, dna microarray loaded with the dna probe set, and molecular diagnostic system for human stomach cancer, using the dna microarray - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイに搭載するＤＮＡプローブ・セットに関し、より詳細には、ヒト胃がん細胞の分化型と未分化型とを識別するためのＤＮＡプローブ・セットに関する。 The present invention relates to a DNA probe set mounted on a DNA microarray, and more particularly to a DNA probe set for discriminating between differentiated and undifferentiated types of human gastric cancer cells.
一般に、胃がんは、病理形態学的診断基準から、分化型と未分化型の２つの型に分類される。従来、胃がんの型を特定する診断においては、手術で摘出した臓器や組織を固定液などで固定して包埋し、適宜の大きさに切り出して作製した顕微鏡標本を病理医が細胞病理組織診断することによって行われていた。 Generally, gastric cancer is classified into two types, differentiated type and undifferentiated type, based on pathomorphological diagnostic criteria. Conventionally, in diagnosis to identify the type of gastric cancer, a pathologist diagnoses a microscopic specimen prepared by fixing an organ or tissue extracted by surgery with a fixative solution, etc., and cutting it into an appropriate size. Was done by doing.
しかしながら、このような細胞病理組織診断には一般に時間がかかり、またそれを正確に行うには経験を要することに加え、その判断に診断を行う病理医の主観が入るという問題があった。そこで、診断者を選ばず、且つ、精度の高い客観的な診断を実現すべく、ヒト胃がんの型の特定診断においてゲノム研究の成果を取り入れた分子診断法の適用が求められていた。ここで、がんの分子診断法とは、がん細胞で特異的に変化する遺伝子発現をマーカーとして、その分子マーカーの変化を定量的に計測することでがん細胞の存在を特定する方法をいう。がんの分子診断法を実現するシステムとして、たとえば、Affymetrix社から１６００遺伝子を搭載したがん関連のカスタム・ＤＮＡマイクロアレイと自動測定システムが提供されているが、この製品は、大集積のＤＮＡマイクロアレイであって非常に高価であり、また、胃がんに特化されたものではなかった。 However, such cytopathological diagnosis generally takes time, and in addition to requiring experience in order to perform it accurately, there is a problem that the subjectivity of the pathologist performing the diagnosis is included in the judgment. Therefore, in order to realize a highly accurate objective diagnosis without selecting a diagnostic person, there has been a demand for the application of a molecular diagnostic method incorporating the results of genome research in the specific diagnosis of human gastric cancer types. Here, the molecular diagnostic method for cancer is a method for identifying the presence of cancer cells by quantitatively measuring changes in the molecular markers using gene expression that specifically changes in cancer cells as a marker. Say. For example, Affymetrix provides a cancer-related custom DNA microarray and an automatic measurement system equipped with a 1600 gene as a system for realizing a molecular diagnostic method for cancer. This product is a highly integrated DNA microarray. However, it was very expensive and was not specialized for stomach cancer.
加えて、従来の市販のＤＮＡマイクロアレイは、すくなくとも1000オーダーのプローブを搭載しており、これに伴ってそれらを測定する装置には、低蛍光強度から高蛍光強度に至る広範囲について定量性をもって測定すべく６桁以上の直線的測定レンジが要求されており、ＤＮＡマイクロアレイを用いる検査システムは、その低コスト化が困難であった。なお、非特許文献１〜７は、ヒト胃がん培養細胞における遺伝子発現解析に関する知見を開示する。
本発明は、上記従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、本発明は、ヒト胃がんの分化型と未分化型の２つの型に共通して用いることができ、当該分化型と未分化型を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セット、該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイ、及び該ＤＮＡマイクロアレイを用いたヒト胃がん用分子診断システムを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-described problems in the prior art, and the present invention can be used in common for two types of human gastric cancer differentiated and undifferentiated types. Disclosed is a DNA probe set that can identify a type by identifying the type, a DNA microarray on which the DNA probe set is mounted, and a molecular diagnostic system for human gastric cancer using the DNA microarray .
本発明者らは、ヒト胃がんの型の特定診断に対し分子診断法の適用を試みるうえで、ＤＮＡマイクロアレイに搭載するＤＮＡプローブ・セットであって、ヒト胃がんを特定することができるＤＮＡプローブ・セットにつき鋭意検討した。その結果、精選された７７のマーカー遺伝子由来のＤＮＡプローブからなるセットであって、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド群を用いることによって、ヒト胃がんを特定することはもちろんのこと、その胃がん細胞の型（分化型あるいは未分化型）を識別してこれを特定することができることを発見し、本発明に至ったのである。 The present inventors have tried to apply a molecular diagnostic method to a specific diagnosis of human gastric cancer type, and are a DNA probe set mounted on a DNA microarray, which can identify human gastric cancer. I studied it earnestly. As a result, it is a set of 77 selected DNA genes derived from marker genes, and it is possible to identify human gastric cancer by using an oligonucleotide group having a specific base sequence. It was discovered that a type (differentiated type or undifferentiated type) can be identified and specified, and the present invention has been achieved.
すなわち、本発明によれば、配列番号１〜７７で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブ・セットが提供され、該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。本発明によれば、前記ＤＮＡプローブ・セットが２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのエリアに搭載された、ＤＮＡマイクロアレイが提供される。さらに、本発明によれば、前記ＤＮＡマイクロアレイを含み、蛍光強度の直線的測定レンジが３桁であることを特徴とする、ヒト胃がん用分子診断システムが提供される。 That is, according to the present invention, a DNA probe set including an oligonucleotide having the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 77 is provided, and a DNA microarray on which the DNA probe set is mounted is provided. According to the present invention, there is provided a DNA microarray in which the DNA probe set is mounted in an area of 2 × 2 mm to 4 × 4 mm. Furthermore, according to the present invention, there is provided a molecular diagnostic system for human gastric cancer comprising the DNA microarray, wherein the linear measurement range of fluorescence intensity is 3 digits.
さらに本発明の別の構成によれば、前記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト胃がんを特定する方法であって、配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞がヒト分化型胃がんであるか否かを判断する方法が提供される。また、本発明によれば、前記ＤＮＡマイクロアレイを用いてヒトから採取した細胞を分析しヒト胃がんを特定する方法であって、配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞がヒト未分化型胃がんであるか否かを判断する方法が提供される。 According to still another aspect of the present invention, there is provided a method for identifying human gastric cancer by analyzing cells collected from a human using the DNA microarray, comprising SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60. Analyzing the fluorescence value of a spot loaded with an oligonucleotide comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 46 Provides a method for determining whether the cell is a human differentiated gastric cancer. According to the present invention, there is also provided a method for identifying human gastric cancer by analyzing cells collected from humans using the DNA microarray, comprising SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 77, by analyzing the fluorescence value of the spot loaded with the oligonucleotide consisting of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 46, A method is provided for determining whether a cell is a human undifferentiated gastric cancer.
上述したように、本発明によれば、ヒト胃がんの分化型と未分化型について共通して用いることができ、この２つの型を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。 As described above, according to the present invention, a DNA probe set that can be used in common for differentiated and undifferentiated types of human gastric cancer, and can identify these two types and specify them, and A DNA microarray on which a DNA probe set is mounted is provided.
以下、本発明を実施の形態をもって説明するが、本発明は、以下に示す実施の形態に限定されるものではない。本発明者らは、本発明のヒト胃がんの分化型と未分化型を識別して特定するためのＤＮＡプローブ・セットの設計に際し、ヒト胃がん培養細胞における遺伝子発現解析に関する先に挙げた論文７報（非特許文献１〜７）に掲載されたマーカー遺伝子について、ヒト胃がんの分化型および未分化型に対する発現の特異性とその発現量などに鑑みて精査した結果、胃がん関連遺伝子として合計２６０のマーカー遺伝子を抽出した。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to embodiments, but the present invention is not limited to the following embodiments. In designing the DNA probe set for discriminating and identifying the differentiated and undifferentiated types of human gastric cancer of the present invention, the present inventors have reported 7 papers mentioned above concerning gene expression analysis in human gastric cancer cultured cells. The marker genes listed in (Non-Patent Documents 1 to 7) were examined in view of the specificity of expression and the expression level of human gastric cancer differentiated and undifferentiated types, and as a result, a total of 260 markers were identified as gastric cancer-related genes. Genes were extracted.
次に、National Center for Biotechnology Information（NCBI）とEnsembl に登録されているＤＮＡデータベースを参照して、上述した２６０のマーカー遺伝子のそれぞれについて、45
±2 merのオリゴヌクレオチド・シーケンスを抽出した。オリゴヌクレオチド・シーケンスの抽出は、（１）5′末端および3′末端が、ＧまたはＣであること、（２）ＧＣ含有率が４５〜６０％であること、（３）融解温度（Ｔｍ）が６３〜７４°であること、（４）Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）の各塩基が偏在しないこと、（５）NCBIの検索ソフトウェアであるBLASTを用いた検索で、他の遺伝子において部分配列として含まれていないこと、の５つの条件を満たすものについてこれを選択して行った。
Next, with reference to the DNA database registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and Ensembl, each of the 260 marker genes described above is
A ± 2 mer oligonucleotide sequence was extracted. Extraction of the oligonucleotide sequence is as follows: (1) 5 'and 3' ends are G or C, (2) GC content is 45-60%, (3) Melting temperature (Tm) (4) A (adenine), T (thymine), C (cytosine), G (guanine) bases are not unevenly distributed, (5) NCBI search software BLAST In the search used, this was selected for those satisfying the five conditions of being not included as a partial sequence in other genes.
下記表１〜３に、上述した手順で抽出した、本発明のＤＮＡプローブ・セットとして用いられる、７７のオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。表１には、未分化型胃がんのマーカー遺伝子（配列番号１）、分化型胃がんのマーカー遺伝子由来の一群（配列番号２〜４）、および、胃がんのマーカー遺伝子由来の一群（配列番号５〜３０）を、表２には、胃がん前がんのマーカー遺伝子由来の一群（配列番号３１〜４１）、Helicobacter pylori関連のマーカー遺伝子由来の一群（配列番号４２〜４６）、および、chemotherapy関連のマーカー遺伝子（配列番号４７）を、表３には、肺がんマーカー遺伝子とも共通のがんのマーカー遺伝子由来の一群（配列番号４８〜７７）をそれぞれ示す。なお、表１〜３には、ＤＮＡプローブの塩基配列とともに、由来マーカー遺伝子のAccession
No.（GenBank）およびSymbol、ならびに、その塩基数、ＧＣ含有率（％）、および融解温度（Ｔｍ）を併せて示す。
Tables 1 to 3 below show the base sequences of 77 oligonucleotides used as the DNA probe set of the present invention extracted by the procedure described above. Table 1 shows an undifferentiated gastric cancer marker gene (SEQ ID NO: 1), a group derived from a differentiated gastric cancer marker gene (SEQ ID NO: 2 to 4), and a group derived from a gastric cancer marker gene (SEQ ID NO: 5 to 30). Table 2 shows a group (SEQ ID NO: 31 to 41) derived from a marker gene for gastric cancer precancer, a group derived from a marker gene related to Helicobacter pylori (SEQ ID NO: 42 to 46), and a marker gene related to chemotherapy Table 3 shows (SEQ ID NO: 47), and Table 3 shows a group (SEQ ID NOs: 48 to 77) derived from a cancer marker gene that is also common to lung cancer marker genes. Tables 1 to 3 show the accession of the origin marker gene together with the base sequence of the DNA probe.
No. (GenBank) and Symbol are shown together with the number of bases, GC content (%), and melting temperature (Tm).
本発明のＤＮＡプローブ・セットによれば、上記表１〜３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが搭載されたわずか７７のスポットによって、ヒト胃がんを特定することはもちろんのこと、その分化型または未分化型を識別してこれを正確に特定することができるＤＮＡマイクロアレイが実現される。すなわち、本発明のＤＮＡプローブ・セットは、わずか７７のプローブから構成されているにもかかわらず、ヒト胃がんの上記２つの型を絞り込むための解析に必要十分な情報を提供することができることを特徴とするものであり、このような機能を奏する特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド群の構成は、本発明者らによって初めて開示されるものである。さらに、本発明のＤＮＡプローブ・セットは、そのプローブ数が７７に精選されているため、その他コントロールを含めても、たとえば、２×２ｍｍ〜４×４ｍｍのスポットエリアに搭載可能であり、さらに、その解析時間も大幅に短縮される。 According to the DNA probe set of the present invention, human gastric cancer can be identified by only 77 spots on which oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in Tables 1 to 3 above are mounted. A DNA microarray capable of identifying an undifferentiated type and accurately specifying it is realized. That is, the DNA probe set of the present invention is capable of providing information necessary and sufficient for analysis for narrowing down the above two types of human gastric cancer, despite being composed of only 77 probes. The structure of an oligonucleotide group having a specific base sequence that exhibits such a function is disclosed for the first time by the present inventors. Furthermore, since the number of probes of the DNA probe set of the present invention is selected to 77, including other controls, for example, it can be mounted in a spot area of 2 × 2 mm to 4 × 4 mm, The analysis time is also greatly reduced.
さらに好都合なことに、本発明のＤＮＡプローブ・セットによれば、ＤＮＡマイクロアレイ解析において、有意な測定値として採用するスポットの蛍光強度を100〜100,000(３桁）の範囲に収めることができる。これはすなわち、本発明のＤＮＡプローブ・セットを用いたヒト胃がんの分子診断においては、ＤＮＡマイクロアレイ解析装置におけるスキャナーの直線的測定レンジが３桁あれば必要十分であることを意味する。従来の市販のＤＮＡマイクロアレイは、すくなくとも1000オーダーのプローブを搭載しており、これに伴ってそれらを測定する装置には、低蛍光強度から高蛍光強度に至る広範囲について定量性をもって測定すべく６桁以上の直線的測定レンジが要求されており、その結果、システム全体が高額なものとなっていたのに対し、本発明のＤＮＡプローブ・セットによれば、上述したように測定装置に要求される直線的測定レンジは３桁の範囲である。したがって、本発明によれば、蛍光強度100〜100,000の範囲が直線的測定レンジであるヒト胃がん用分子診断システムが提供され、これに対応してシステムに関するコストの低減が期待される。 Further advantageously, according to the DNA probe set of the present invention, the fluorescence intensity of the spot used as a significant measurement value in the DNA microarray analysis can fall within the range of 100 to 100,000 (three digits). This means that in the molecular diagnosis of human gastric cancer using the DNA probe set of the present invention, it is necessary and sufficient if the linear measurement range of the scanner in the DNA microarray analyzer is three digits. Conventional commercially available DNA microarrays are equipped with at least 1000-order probes, and in connection with this, the apparatus for measuring them has six digits to measure a wide range from low fluorescence intensity to high fluorescence intensity. The above linear measurement range is required, and as a result, the entire system is expensive. On the other hand, according to the DNA probe set of the present invention, the measurement apparatus is required as described above. The linear measurement range is a three-digit range. Therefore, according to the present invention, a molecular diagnostic system for human gastric cancer in which the range of fluorescence intensity of 100 to 100,000 is a linear measurement range is provided, and correspondingly, cost reduction for the system is expected.
以下、本発明のＤＮＡプローブ・セットについて、実施例を用いてより具体的に説明を行なうが、本発明は、後述する実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the DNA probe set of the present invention will be described more specifically using examples, but the present invention is not limited to the examples described later.
（ＤＮＡマイクロアレイの作製）
上述した手順に従って決定した塩基配列を有する45 ±2 mer のオリゴヌクレオチドを、Invitrogen社（Invitrogen Japan KK.,Tokyo,Japan)から入手した。上記表１〜３に示す末端未修飾の７７のオリゴヌクレオチドを、３×３ｍｍ基板に対してスポッティングすることによって独自のＤＮＡマイクロアレイを作製した。なお、本実施例におけるＤＮＡマイクロアレイには、上記表１〜３に示す７７のオリゴヌクレオチドの他に、正常細胞のマーカーとして標準化遺伝子由来のＤＮＡプローブである２３種のオリゴヌクレオチドと、陰性対照として植物遺伝子由来のＤＮＡプローブである３種のオリゴヌクレオチドを加え、合計１０３のスポットを搭載した。下記表４に、標準化遺伝子由来の２３種のオリゴヌクレオチドの塩基配列を、下記表５に、植物遺伝子由来の３種のオリゴヌクレオチドの塩基配列をそれぞれ示す。
(Production of DNA microarray)
A 45 ± 2 mer oligonucleotide having a base sequence determined according to the above procedure was obtained from Invitrogen (Invitrogen Japan KK., Tokyo, Japan). A unique DNA microarray was prepared by spotting 77 unmodified oligonucleotides shown in Tables 1 to 3 on a 3 × 3 mm substrate. In addition to the 77 oligonucleotides shown in Tables 1 to 3 above, the DNA microarray in this example includes 23 oligonucleotides that are DNA probes derived from standardized genes as normal cell markers, and a plant as a negative control. Three kinds of oligonucleotides, which are DNA probes derived from genes, were added, and a total of 103 spots were mounted. Table 4 below shows the base sequences of 23 kinds of oligonucleotides derived from standardized genes, and Table 5 below shows the base sequences of 3 kinds of oligonucleotides derived from plant genes.
（ヒト胃がん培養細胞系への適用）
上述した手順で作製したＤＮＡマイクロアレイをヒト胃がん培養細胞系へ適用し遺伝子発現量の測定を行った。本実施例においては、ヒト分化型胃がんについて２種類のヒト胃がん由来培養細胞、ヒト未分化型胃がんについて３種類のヒト胃がん由来培養細胞をそれぞれ用いた。下記表６に、各病態と用いた培養細胞株の対応関係をまとめて示す。
(Application to human gastric cancer cell lines)
The DNA microarray prepared by the procedure described above was applied to a human gastric cancer cultured cell line, and the gene expression level was measured. In this example, two types of human gastric cancer-derived cultured cells were used for human differentiated gastric cancer, and three types of human gastric cancer-derived cultured cells were used for human undifferentiated gastric cancer. Table 6 below summarizes the correspondence between each disease state and the cultured cell line used.
表６に示した細胞株を培養してtotal RNAを抽出し、当該total RNAから逆転写酵素によってcDNAを調製した。本実験においては、ヒト正常胃由来培養細胞は入手困難であったため、ブランクとして、ヒト正常胃由来培養細胞の代りにMKN7（ヒト分化型胃がん由来培養細胞）を用いた。なお、MKN7については、事前に、ヒト正常胃粘膜由来のtotal
RNA を入手し、MKN7の遺伝子発現がヒト正常胃粘膜細胞に近いことを確認した。
The cell lines shown in Table 6 were cultured, total RNA was extracted, and cDNA was prepared from the total RNA using reverse transcriptase. In this experiment, since human normal stomach-derived cultured cells were difficult to obtain, MKN7 (human differentiated gastric cancer-derived cultured cells) was used as a blank instead of human normal stomach-derived cultured cells. For MKN7, the total amount derived from human normal gastric mucosa in advance
RNA was obtained and it was confirmed that the gene expression of MKN7 is close to that of human normal gastric mucosa cells.
表６に示した細胞株由来のcDNAのうち、MKN7由来のcDNAはAlexa647で、その他の株由来のcDNAはAlexa555でそれぞれ蛍光標識した。ほぼ等量の蛍光標識DNAを本実施例のＤＮＡマイクロアレイへ競合ハイブリダイズさせて、スキャナーで測定して蛍光強度を解析した。なお、測定した蛍光強度は、GAPD(配列番号８７)の蛍光強度で補正して蛍光値データを得た。本実施例においては、上述した測定を各々の培養細胞について最低２回以上行い、その平均値を蛍光値データとした。 Among the cDNAs derived from the cell lines shown in Table 6, the MKN7-derived cDNA was fluorescently labeled with Alexa647, and the cDNAs derived from other lines were fluorescently labeled with Alexa555. An approximately equal amount of fluorescently labeled DNA was competitively hybridized to the DNA microarray of this example, and measured with a scanner to analyze the fluorescence intensity. The measured fluorescence intensity was corrected with the fluorescence intensity of GAPD (SEQ ID NO: 87) to obtain fluorescence value data. In this example, the above measurement was performed at least twice for each cultured cell, and the average value was used as fluorescence value data.
上記手順で得られた各スポットの蛍光値データについて、ブランク（本実施例においてはMKN7で代替）の蛍光値に対する比（以下、Ratioとして参照する）を求め、（１）Ratioが２以上、（２）Ratioが１／２以下、（３）Ratioが１／２以上２以下、（４）蛍光値が低い（胃がん細胞およびブランクの蛍光値のいずれもが１００以下）、という４段階で評価した。なお、評価（１）〜（３）においては、胃がん細胞およびブランク（MKN7）のいずれにおいても有意な蛍光値が得られたことを前提とした。本実施例においては、蛍光光度計で出力１０００Ｖのフォトマルを９８％出力で使用した時の蛍光値１００を閾値とし、これを超える値を有意な蛍光値とした。 With respect to the fluorescence value data of each spot obtained by the above procedure, a ratio (hereinafter referred to as Ratio) of the blank (substitute with MKN7 in this example) to the fluorescence value is obtained, and (1) Ratio is 2 or more ( 2) Ratio was 1/2 or less, (3) Ratio was 1/2 or more and 2 or less, and (4) Fluorescence value was low (both stomach cancer cells and blank fluorescence values were 100 or less). . In the evaluations (1) to (3), it was assumed that a significant fluorescence value was obtained in both the gastric cancer cell and the blank (MKN7). In this example, a fluorescence value of 100 when a photomultiplier with an output of 1000 V was used at 98% output was used as a threshold value, and a value exceeding this was set as a significant fluorescence value.
次に、上記評価結果に基づいて、ヒト分化型胃がん培養細胞２株（MKN7、AZ521）に対して共通した評価を得たスポット群を抽出するとともに、ヒト未分化型胃がん培養細胞３株（KATO
III、NUGC3、NUGC4）に対して共通した評価を得たスポット群を抽出したうえで、上記両スポット群の共通項を抽出した。さらに、この共通項のスポット群について、ヒト分化型胃がん培養細胞２株における評価と、ヒト未分化型胃がん培養細胞３株のおける評価とが異なるスポット群を抽出した。
Next, based on the above evaluation results, a spot group that has been evaluated in common for two human differentiated gastric cancer cell lines (MKN7, AZ521) is extracted, and three human undifferentiated gastric cancer cell lines (KATO).
III, NUGC3, and NUGC4) were extracted from the spot groups that had a common evaluation, and the common terms of both spot groups were extracted. Further, with respect to the spot group of this common item, spot groups having different evaluations in two human differentiated gastric cancer cultured cell strains and evaluations in three human undifferentiated gastric cancer cultured cell strains were extracted.
図1は、ヒト分化型胃がん培養細胞２株において同じ評価を得、且つ、ヒト未分化型胃がん培養細胞３株においても同じ評価を得たスポットの由来遺伝子のうち、ヒト分化型胃がん培養細胞２株における評価とヒト未分化型胃がん培養細胞３株における評価とが異なるものであった１１マーカー遺伝子のオリゴヌクレオチドの配列番号を、その評価および由来遺伝子（Symbol）とともにまとめて示す。
FIG. 1 shows the human differentiated gastric
図１に示されるように、本実施例のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイにおいて、配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された１１のスポットのそれぞれが、ヒト分化型胃がんの培養細胞２株（MKN7,
AZ521）について同じ評価を示した。具体的には、ヒト分化型胃がんの培養細胞２株（MKN7,
AZ521）は、配列番号２、配列番号５３、配列番号６６、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、および配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された７のスポットにおいては、いずれも、「Ratioが１／２以上２以下」という評価を示し、配列番号４８、配列番号６０、配列番号３７、および配列番号６８で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された４のスポットにおいては、「蛍光値が低い」という評価を示した。
As shown in FIG. 1, in the DNA microarray on which the DNA probe set of this example is mounted, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 77, and 11 spots loaded with the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 46 are respectively two cultured cell lines of human differentiated gastric cancer (MKN7,
AZ521) showed the same evaluation. Specifically, two human differentiated gastric cancer cell lines (MKN7,
AZ521) is a sequence of 7 spots on which oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 77, and SEQ ID NO: 46 are mounted. In the four spots on which the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 37, and SEQ ID NO: 68 are mounted, The value was “low”.
同じく、配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された１１のスポットのそれぞれが、ヒト未分化型胃がんの培養細胞３株（KATO
III, NUGC3, NUGC4）について同じ評価を示した。具体的には、ヒト未分化型胃がんの培養細胞３株（KATO
III, NUGC3, NUGC4 ）は、配列番号４８、配列番号６０、配列番号３７、配列番号６８、配列番号４６で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された５のスポットにおいては、「Ratioが２以上」という評価を示し、配列番号２、配列番号５３、および配列番号７７で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された３のスポットにおいては、「蛍光値が低い」という評価を示し、配列番号６６、配列番号７３、および配列番号４７で表されるオリゴヌクレオチドが搭載された３のスポットにおいては、「Ratioが１／２以下」という評価を示した。
Similarly, the oligos represented by SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 46 Each of the 11 spots loaded with nucleotides represents 3 human undifferentiated gastric cancer cell lines (KATO)
III, NUGC3, NUGC4) showed the same evaluation. Specifically, three cultured cells of human undifferentiated gastric cancer (KATO
III, NUGC3, NUGC4) are “Ratio is 2 or more” in 5 spots loaded with oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 46 In the three spots on which the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 53, and SEQ ID NO: 77 are mounted, the evaluation “low fluorescence value” is shown, and SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 73 And 3 spots loaded with the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 47 showed an evaluation that “Ratio was ½ or less”.
上述した本実施例のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイに対して、蛍光標識したサンプルを競合ハイブリダイズさせ、その蛍光データを解析する際、図１に示した配列番号で表されるＤＮＡプローブ群についての評価に着目することによってヒト胃がんの２つの型を識別しうることは容易に理解されよう。 When a fluorescently labeled sample is competitively hybridized with the DNA microarray on which the above-described DNA probe set of this embodiment is mounted, and the fluorescence data is analyzed, the DNA represented by the sequence number shown in FIG. It will be readily appreciated that the two types of human gastric cancer can be distinguished by focusing on the evaluation of the probe group.
すなわち、図１に示した配列番号で表されるＤＮＡプローブが搭載されたスポットについて得られた評価結果（「Ratioが２以上」、「Ratioが１／２以下」、「Ratioが１／２以上２以下」、「蛍光値が低い」）と、図１に表示した評価を内容とするテーブルとを照合し、その合致率を割り出すことによってヒト胃がんの２つの型（分化型・未分化型）を絞り込むことが可能となる。 That is, the evaluation results ("Ratio is 2 or more", "Ratio is 1/2 or less", "Ratio is 1/2 or more" obtained for the spot on which the DNA probe represented by the sequence number shown in FIG. 1 is mounted. 2 or less "," low fluorescence value ") and a table containing the evaluations shown in FIG. 1 as content, and by determining the match rate, two types of human gastric cancer (differentiated type and undifferentiated type) Can be narrowed down.
例えば、図１に示した配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６の１１のオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの結果に着目し、その内の７つ以上のスポットで、図１に表示されたヒト分化型胃がん培養細胞についての評価と同じ評価結果を得た場合に（７／１１の合致率）に、当該サンプルを「ヒト分化型胃がん」と判定すること、あるいは、図１に表示されたヒト未分化型胃がん培養細胞についての評価と同じ評価結果を得た場合に（７／１１の合致率）、当該サンプルを「ヒト未分化型胃がん」と判定することは、いずれも十分な妥当性をもつ。 For example, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 46 shown in FIG. Focusing on the result of the spot loaded with the 11 oligonucleotides, when the same evaluation result as the evaluation of the human differentiated gastric cancer cultured cells displayed in FIG. When the sample is determined to be “human differentiated gastric cancer” or the evaluation result is the same as the evaluation for cultured human undifferentiated gastric cancer cells displayed in FIG. In addition (7/11 match rate), it is sufficient to determine that the sample is “human undifferentiated gastric cancer”.
なお、判定基準となる上述した合致率は、その診断に求められる精度に鑑みて適宜設定しうることはいうまでもない。以上、説明してきた本実施例によって、本発明のＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイによって、ヒト胃がん培養細胞の２つの型を正確に識別してこれを特定することができることが示された。 Needless to say, the above-described match rate, which is a criterion, can be set as appropriate in view of the accuracy required for the diagnosis. As described above, it has been shown by the present embodiment that the two types of human gastric cancer cultured cells can be accurately identified and specified by the DNA microarray equipped with the DNA probe set of the present invention. .
（ＤＮＡマイクロアレイの妥当性の検証）
図２は、本実施例のＤＮＡプローブ・セットを搭載して独自に作製したＤＮＡマイクロアレイの、ヒト分化型胃がん培養細胞（MKN7)とヒト未分化型胃がん培養細胞（NUGC4）によるscattering pattern を示す。図２において「×」はプローブが搭載された各スポットを示し、線分ａはRatio（分化型胃がん細胞/未分化型胃がん細胞)が「１」を示している。また、線分ｂと線分ｃの２本の線によって画定される範囲は、Ratio（分化型胃がん細胞/未分化型胃がん細胞)が「0.5< <2.0」であり、両細胞において有意な差異が認められない範囲を示している。一方、線分ｂの上側にある「×」はヒト分化型胃がん細胞で2.0倍以上に発現が増加している遺伝子を示しており、線分ｃの下側にある「×」はヒト分化型胃がん細胞で0.5倍以下に発現が減少している遺伝子を示している。
(Verification of validity of DNA microarray)
FIG. 2 shows the scattering pattern of the human microscopically differentiated gastric cancer cultured cells (MKN7) and the human undifferentiated gastric cancer cultured cells (NUGC4) of the DNA microarray that was uniquely prepared by mounting the DNA probe set of this example. In FIG. 2, “x” indicates each spot on which the probe is mounted, and a line segment a indicates “1” for Ratio (differentiated gastric cancer cells / undifferentiated gastric cancer cells). The range defined by the two lines b and c is “0.5 << 2.0” for Ratio (differentiated gastric cancer cells / undifferentiated gastric cancer cells). Indicates a range where is not allowed. On the other hand, “x” above the line segment b indicates a gene whose expression is increased 2.0 times or more in human differentiated gastric cancer cells, and “x” below the line segment c is a human differentiated type. It shows a gene whose expression decreases to 0.5 times or less in gastric cancer cells.
図２に示されるように、「×」で示される各スポットは、蛍光強度101〜105の範囲にほぼ納まっている。一方、蛍光強度101〜102の範囲は、すでに説明したように、本発明の解析方法においては「蛍光値が低い」と評価される範囲であって、その定量化を必要としない。すなわち、本発明の解析方法においては、蛍光強度101〜102の範囲に定量性は要求されず、蛍光強度102〜105の範囲についてのみ定量性をもって測定できれば必要十分なのであり、図２は、蛍光強度102〜105の３桁の範囲についてのみ直線的測定レンジを備える測定装置であっても妥当性をもった診断結果が得られることを示している。
As shown in FIG. 2, each spot indicated by “x” is substantially within the range of
以上、説明したように、本発明によれば、ヒト胃がんの分化型と未分化型について共通して用いることができ、この２つの型を識別してこれを特定することができるＤＮＡプローブ・セットおよび当該ＤＮＡプローブ・セットが搭載されたＤＮＡマイクロアレイが提供される。本発明のＤＮＡプローブ・セットは、従来以上に小型化されたＤＮＡマイクロアレイの作製を可能にすることによって、安価で高性能なヒト胃がんの分子診断システムの構築に資することが期待される。 As described above, according to the present invention, a DNA probe set that can be used in common for differentiated and undifferentiated types of human gastric cancer, and that can identify and identify these two types. And a DNA microarray on which the DNA probe set is mounted. The DNA probe set of the present invention is expected to contribute to the construction of a low-cost and high-performance molecular diagnostic system for human gastric cancer by enabling the production of a DNA microarray that is smaller than before.
Claims (6)
配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞がヒト分化型胃がんであるか否かを判断する方法。 A method for identifying human gastric cancer by analyzing cells collected from a human using the DNA microarray according to claim 2,
From the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 46 A method for determining whether or not the cell is a human differentiated gastric cancer by analyzing a fluorescence value of a spot on which the oligonucleotide is mounted.
配列番号４８、配列番号２、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号４７、配列番号７７、配列番号４６で表されるＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドが搭載されたスポットの蛍光値を解析することによって、前記細胞がヒト未分化型胃がんであるか否かを判断する方法。 A method for identifying human gastric cancer by analyzing cells collected from a human using the DNA microarray according to claim 2,
From the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 46 A method for determining whether or not the cell is a human undifferentiated gastric cancer by analyzing a fluorescence value of a spot on which the oligonucleotide is mounted.
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