JP2009189267A - Vessel for distribution in minute well - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、水性液体試料を多数の独立した微小ウェル内に分配するための容器、及びこの容器を用い水性液体試料を多数の独立した微小ウェル内に分配する方法に関する。 The present invention relates to a container for dispensing an aqueous liquid sample into a number of independent microwells and a method for dispensing an aqueous liquid sample into a number of independent microwells using this container.
微生物の検出は産業分野、臨床分野において実施されている。産業分野においては、例えば食品分野、製薬分野、化粧品分野において加工、製造した製品中の微生物を直接定性または定量したり、製造環境中に汚染のおそれのある微生物の存在を定性または定量することで適切な品質管理が行われている。臨床分野においては血液等の体液中に存在する微生物を検出又は同定する試験が行われている。 The detection of microorganisms is carried out in the industrial field and clinical field. In the industrial field, for example, by directly qualifying or quantifying microorganisms in products processed and manufactured in the food field, pharmaceutical field, and cosmetic field, or by qualitatively or quantifying the presence of potentially contaminating microorganisms in the manufacturing environment. Appropriate quality control is performed. In the clinical field, a test for detecting or identifying a microorganism present in a body fluid such as blood is performed.
このような微生物検査は、試料を液体培地又は寒天培地に接種後、一定時間培養して微生物を増殖させて検出する方法が一般的である。微生物の検出指標として、酸化還元指示薬を用いて微生物の代謝活性を測定したり、二酸化炭素の産生量あるいは酸素の消費量を指標にする方法等が存在する。しかし、これらの方法は培養時間に多くの時間を要し、判定結果が得られるまでに数日から数週間かかるという問題がある。 Such a microorganism test is generally performed by inoculating a sample in a liquid medium or an agar medium and then culturing for a certain period of time to proliferate and detect the microorganism. As a microorganism detection index, there are a method of measuring a metabolic activity of a microorganism using a redox indicator, a method of using a carbon dioxide production amount or an oxygen consumption amount as an index. However, these methods have a problem that a lot of time is required for the culture time, and it takes several days to several weeks until a determination result is obtained.
培養時間を短縮する方法として、微生物のもつＤＮＡを増幅して検出する方法が知られている。微生物の検出は生菌の存在を検出することが重要であるが、この方法は微生物が死滅していても、ＤＮＡが存在すれば陽性と判定してしまうという問題がある。
また、微生物のエネルギー代謝をＡＴＰの分解を指標にして化学発光法により検出する技術も開発されている。しかしながらこの方法は試料中に含まれる微生物以外のＡＴＰの影響を受けやすく、微生物の識別が困難である。
As a method for shortening the culture time, a method for amplifying and detecting a DNA of a microorganism is known. For detection of microorganisms, it is important to detect the presence of viable bacteria, but this method has a problem that even if the microorganisms are killed, it is determined to be positive if DNA is present.
In addition, a technology for detecting the energy metabolism of microorganisms by chemiluminescence using the decomposition of ATP as an index has been developed. However, this method is susceptible to ATP other than the microorganisms contained in the sample, and it is difficult to identify the microorganisms.
試料中の生きた微生物を特異的に蛍光標識し、フローサイトメトリーを利用することで迅速な微生物検出を実現した方法も見出されている。しかしながらこの方法は、非常に小さな内径を持つセルの中に試料を送り込むために、試料が粘性を帯びている場合や、固形の不純物が一定量以上存在する場合には検査できず、検査対象が限られてしまう問題がある。また、検出装置が高価であり一般的に普及するに至っていない。 A method has also been found that realizes rapid microorganism detection by specifically fluorescently labeling live microorganisms in a sample and using flow cytometry. However, since this method feeds the sample into a cell having a very small inner diameter, it cannot be inspected when the sample is viscous or when a solid impurity is present in a certain amount or more. There is a limited problem. Moreover, the detection apparatus is expensive and has not been widely used.
培養時間を短縮することで判定までの時間を短縮する方法として、特許文献１〜３には液体試料を多数の独立した微小領域に分けて培養を行う方法が記載されている。培養空間を小さくすることで事実上の微生物濃度を上げ、検出可能なレベルまでの微生物の増殖時間を短縮させることができる。
また、特許文献４には、多数の微小空間で培養することで培養時間の短縮を図ると同時に、最確数分析の精度を向上させる方法が記載されている。
As a method for shortening the time until determination by shortening the culture time, Patent Documents 1 to 3 describe a method in which a liquid sample is cultured in a number of independent microregions. By reducing the culture space, the effective microorganism concentration can be increased, and the growth time of microorganisms to a detectable level can be shortened.
Patent Document 4 describes a method for improving the accuracy of the most probable number analysis while simultaneously reducing the culture time by culturing in a large number of minute spaces.
このように微生物を培養する空間を微小化することで、検出までの培養時間を短縮することが可能であるが、微小空間である微小なウェル内に微生物を含む液体試料を分注することは通常は困難である。これは、液体の表面張力が影響すること、さらにウェル内の空気がウェル内に停滞してしまうために容易には液体試料がウェル内に入っていかないからである。微小空間内に微生物を含む液体試料を分配する手段として、特許文献１〜３には液体試料に格子状の仕切り部材を圧着させる方法が記載されている。この方法は貫通型の格子状仕切り部材を液体試料に押し付けることで格子内に溶液を容易に満たすことができる点で優れている。しかしながら本法は試料を接種した後に格子状の部材を押し付けるという２段階の操作を要する。また、デバイスの製造面からみると、液体試料を入れる容器と格子状の部材の２種類の成型作業が必要になるため、金型費用、成型費用の点で課題が残る。
特許文献５には液体試料を多数のアリコットに分画する方法が記載されている。これは微小ウェル内に気泡が停滞しないようにウェル底部にも開放部を設けることで液体試料が分配しやすくなっている。しかしながら、分配のためにはデバイスを傾けながら全てのアリコットの上方開放部に液体試料を接触させる操作を要するため、液体試料の接種だけで全てのウェルに自然に分配されるのに比べると操作が煩雑である。さらにデバイス形態が煩雑であるためデバイスの製造工程が複雑にならざるを得ない。
Patent Document 5 describes a method of fractionating a liquid sample into a large number of aliquots. This facilitates the distribution of the liquid sample by providing an open part at the bottom of the well so that bubbles do not stagnate in the microwell. However, for dispensing, it is necessary to bring the liquid sample into contact with the upper open parts of all aliquots while tilting the device. It is complicated. Furthermore, since the device configuration is complicated, the device manufacturing process must be complicated.
本発明の目的は、分配手段の操作が煩雑であったり、デバイス形態が複雑であったという従来の課題を解決することにあり、簡単な操作で、該液体試料を容易に微小ウェルへ分配させることができ、形態が単純であり製造工程が簡単な容器、及び該容器を用いた、微生物を含む試料に適した分配方法を提供することにある。 An object of the present invention is to solve the conventional problem that the operation of the distributing means is complicated and the device form is complicated, and the liquid sample can be easily distributed to the microwells by a simple operation. An object of the present invention is to provide a container that is simple in form and simple in manufacturing process, and a distribution method that uses the container and that is suitable for a sample containing microorganisms.
斯かる実情に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った結果、内表面と水との接触角が６０°以下である内表面を有する微小ウェルを有する容器を用いれば、該ウェル上に、水性液体試料を供給するという簡単な操作だけで、該液体試料を容易に微小空間へ分配することができることを見出し本発明を完成した。 In view of such a situation, the present inventor has conducted intensive research. As a result, if a container having a microwell having an inner surface whose contact angle between the inner surface and water is 60 ° or less is used, an aqueous solution is formed on the well. The present invention has been completed by finding that the liquid sample can be easily distributed to a minute space by a simple operation of supplying the liquid sample.
すなわち本発明は、断面積１０mm2以下の微小ウェルを複数個有し、当該微小ウェルの内表面の水との接触角が６０°以下であることを特徴とする、水性液体試料を微小ウェル内に分配するための容器を提供するものである。 That is, the present invention has an aqueous liquid sample in a microwell, characterized in that it has a plurality of microwells having a cross-sectional area of 10 mm 2 or less, and the contact angle with water on the inner surface of the microwell is 60 ° or less. A container for dispensing is provided.
また、本発明は、該容器に、水性液体試料を供することを特徴とする、水性液体試料を微小ウェル内に分配する方法を提供するものである。
更に、本発明は、該容器に、被検水性液体試料を供給して該試料を微小ウェル内に分配し、次いで培養することを特徴とする、被検水性液体試料中の微生物の検出方法を提供するものである。
The present invention also provides a method for distributing an aqueous liquid sample into microwells, wherein the container is provided with an aqueous liquid sample.
Furthermore, the present invention provides a method for detecting microorganisms in a test aqueous liquid sample, characterized in that the test aqueous liquid sample is supplied to the container, the sample is distributed into microwells, and then cultured. It is to provide.
本発明によれば、水性液体試料を容器に入れるだけで、該液体試料の微小ウェルへの分配ができる（自然分配）ため、従来技術に比べて分配操作が大幅に簡便化される。すなわち、本発明によれば、該液体試料が微小ウェルの上部開放部の上に広がり、その後、微小ウェル内に該液体試料が流入するので分配操作が大幅に簡便化される。
また、本発明容器は形態が単純であり製造が容易である。
例えば、一定量の試料の中に微生物がいるかどうかを検査する場合、分配容器を用いて少量ずつに分配して検査することは知られているが、本発明の容器を用いれば、ただ一定量の試料を容器上部に供給するだけという極めてシンプルな操作で速やかに分配することができ、微生物検査に適している。このように本発明の容器は、微生物検査に用いることによりその特徴が大きく生かされる。この本発明の容器の特徴は、微小ウェルの内面の親水性を高めることにより初めて可能となったものである。
According to the present invention, since the liquid sample can be distributed to the microwells (natural distribution) simply by putting the aqueous liquid sample into the container, the distribution operation is greatly simplified as compared with the prior art. That is, according to the present invention, the liquid sample spreads over the upper open portion of the microwell, and then the liquid sample flows into the microwell, so that the dispensing operation is greatly simplified.
The container of the present invention has a simple form and is easy to manufacture.
For example, when inspecting whether or not microorganisms are present in a certain amount of sample, it is known that a dispensing container is used to distribute and inspect small quantities, but if the container of the present invention is used, only a certain amount is observed. This sample can be quickly distributed by an extremely simple operation of simply supplying the sample to the upper part of the container, and is suitable for microbial testing. As described above, the characteristics of the container of the present invention can be greatly utilized by using it for microbial testing. This characteristic of the container of the present invention is made possible only by increasing the hydrophilicity of the inner surface of the microwell.
本発明は、内表面に親水処理が施された微小ウェルを有する容器の該ウェル上に、水性液体試料を供給するだけで、該液体試料が微小ウェルの上部開放部の上に自然に広がり、上部開放部の上に広がった該液体試料が微小ウェル内に自然に流入することを特徴とする水性液体試料を微小ウェル内に分配するための容器である。 In the present invention, simply by supplying an aqueous liquid sample onto the well of a container having a microwell having an inner surface subjected to hydrophilic treatment, the liquid sample naturally spreads over the upper open portion of the microwell, A container for distributing an aqueous liquid sample into a microwell, wherein the liquid sample spread over the upper opening naturally flows into the microwell.
以下図面を挙げて、本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれらに限定されない。
図１は、本発明に係る容器の一形態を示している。
本発明の容器は特に限定されないが、光学的な検出にも用いることができる透明な容器が好ましい。また、容器の材質は、製造面で大量生産が容易な樹脂素材を用いることが好ましいが、ガラス、陶器等を用いることもできる。樹脂素材としては、アクリル系樹脂、ポリメチルメタクリレート、シクロオレフィン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられる。図１では容器の上面図は正方形となっているが、この形に限定されるわけではなく、三角形、長方形、台形、平行四辺形、その他の四角形、5個以上の頂点をもつ多角形であってもよく、また、円形、楕円形、半月形などの辺の一部または全部が曲線である形状であってもよい。容器はその内部に複数の微小ウェルを有している。上面図において微小ウェルの形状が正方形となっているが、この形に限定されるわけではなく、三角形、長方形、台形、平行四辺形、その他の四角形、5個以上の頂点をもつ多角形であってもよく、また、円形、楕円形、半月形などの辺の一部または全部が曲線である形状でもよい。特に水性液体試料を自然分配する場合は、ウェルとウェルの間隔が狭く、ウェルが密接して並んでいるものが好ましく、さらに微小ウェルの形状が四角形であるものが望ましい。すなわち、ウェルとウェルの間隔が広くなると、ウェル上面に供給した液体試料がウェルに分配された後に、ウェルとウェル隔壁の上部にわずかでも試料が残る可能性が高くなるので、隔壁は製造可能な範囲で狭くなるように設計するのが好ましい。また、微小ウェル壁面は容器底面に対して垂直である必要もない。さらに微小ウェル底面は平坦であっても丸みを帯びていてもよいし段差が存在してもよく、ウェル上部は水性液体試料が流入できるように開放されている（微小ウェル上部開放部）。特に水性液体試料を自然分配する場合は、容器に配置された微小ウェルの上部開放部に、水性液体試料が微小ウェルに分配される前に該試料を一次的に保持するための壁を設けたものが好ましい。ここで、微小ウェル上部開放部とは、水性液体試料を流入させるために開放されている部分であって、微小ウェルを区切っている微小ウェル壁面の最頂部から、容器底面と平行に水平方向に広がる平面部分をいう。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings, but the present invention is not limited thereto.
FIG. 1 shows one embodiment of a container according to the present invention.
Although the container of this invention is not specifically limited, The transparent container which can be used also for optical detection is preferable. Further, as the material of the container, it is preferable to use a resin material that is easily mass-produced in terms of manufacturing, but glass, ceramics, and the like can also be used. Examples of the resin material include acrylic resin, polymethyl methacrylate, cycloolefin, polystyrene, polyethylene, polycarbonate, and polypropylene. In FIG. 1, the top view of the container is a square, but is not limited to this shape, and is a triangle, rectangle, trapezoid, parallelogram, other quadrilateral, or a polygon having five or more vertices. Alternatively, a part of or all of the sides such as a circle, an ellipse, and a half moon may be curved. The container has a plurality of microwells therein. In the top view, the shape of the microwell is a square, but it is not limited to this shape. It is a triangle, rectangle, trapezoid, parallelogram, other quadrilateral, or a polygon with five or more vertices. Alternatively, a part of or all of the sides such as a circle, an ellipse, and a half moon may be curved. In particular, when an aqueous liquid sample is naturally distributed, it is preferable that the distance between the wells is narrow and the wells are closely arranged, and that the shape of the microwell is a quadrangle. That is, when the distance between the wells is increased, the liquid sample supplied to the upper surface of the well is distributed to the wells, and therefore, the possibility that a sample may remain even slightly above the wells and the well partition walls is increased. It is preferable to design to be narrow in the range. Further, the wall surface of the microwell does not need to be perpendicular to the bottom surface of the container. Further, the bottom surface of the microwell may be flat or rounded, or may have a step, and the upper portion of the well is opened so that an aqueous liquid sample can flow (microwell upper open portion). In particular, when an aqueous liquid sample is naturally distributed, a wall for temporarily holding the aqueous liquid sample before being distributed to the microwell is provided in the upper open portion of the microwell arranged in the container. Those are preferred. Here, the microwell upper open portion is a portion that is opened to allow the aqueous liquid sample to flow in. From the top of the microwell wall that divides the microwell, the microwell upper open portion is parallel to the container bottom surface in the horizontal direction. The flat part that spreads out.
微小ウェルの横断面積は、微生物の濃縮効果を考慮するとできるだけ小さいことが望ましい。一方、機器、または目視で判定可能な程度な大きさを保つ必要もある。また、検査する水性液体試料の量は一般に１ｍＬ以上であるため、各微小ウェルの合計として一定の容積を確保する必要もある。これらの観点から、微小ウェルの横断面積は１０ｍｍ2以下で、０．０００１ｍｍ2〜１０ｍｍ2が好ましく、さらに、１〜６ｍｍ2が好ましく、特に微生物培養用容器として１〜３ｍｍ2が好ましい。 It is desirable that the cross-sectional area of the microwell be as small as possible in consideration of the microorganism concentration effect. On the other hand, it is also necessary to maintain a size that can be determined visually by equipment or by visual inspection. In addition, since the amount of the aqueous liquid sample to be inspected is generally 1 mL or more, it is necessary to ensure a certain volume as the sum of each microwell. From these viewpoints, the cross-sectional area of the micro-well is 10 mm 2 or less, preferably 0.0001 mm 2 to 10 mm 2, further preferably from 1 to 6 mm 2, 1 to 3 mm 2 are preferred especially as a container for culturing microorganisms.
微小ウェルの容積を確保するためのもう一つの手段は微小ウェルを深くすることである。微生物は増殖してくると凝集して沈殿するものが多く、実際には微小ウェル全体に均一に微生物が分散しているわけではなく、微小ウェル底部に微生物が凝集してくるものが多い。従って、微小ウェルを深くしても、微小ウェル底面の横断面積が十分小さければ微小空間培養による微生物の濃縮効果はほとんど薄れない。微小ウェルのアスペクト比（穴径と深さの比）は２以上が好ましく、さらに５以上が好ましい。また深さは、容器を作製する上で１０ｍｍ以下が好ましい。微小ウェルのアスペクト比が大きいもの、すなわち、ウェルの深さがウェルの径に対して大きいと、細菌は試料中で沈んでいることが多いので、細菌が発生する微量の成分を感知する検出方法を採用する場合は、ウェル内の底部にその微量成分が局在することにより、検出速度の短縮に貢献する。
また、容器内に存在する微小ウェルの数に制限はない。容器の大きさが一定の場合には、微小ウェルの断面積が小さくなれば、その分微小ウェルの数を増やすことができる。微小ウェルの数を多くすることで、より広範囲の定量が可能になる。容器内に存在する微小ウェルの数は複数であるが、微生物培養用容器として１０個以上が好ましく、特に１００〜１０００個が広範囲の定量が可能となり望ましい。
Another means for securing the microwell volume is to deepen the microwell. Many microorganisms aggregate and precipitate as they grow, and in reality, the microorganisms are not uniformly dispersed throughout the microwell, and many microorganisms aggregate at the bottom of the microwell. Therefore, even if the microwell is deepened, if the cross-sectional area of the bottom surface of the microwell is sufficiently small, the effect of concentrating microorganisms by microspace culture is hardly diminished. The aspect ratio (ratio of hole diameter and depth) of the microwell is preferably 2 or more, and more preferably 5 or more. Further, the depth is preferably 10 mm or less in producing the container. When the aspect ratio of a microwell is large, that is, when the depth of the well is large relative to the diameter of the well, the bacteria often sink in the sample. Is used, the trace component is localized at the bottom of the well, thereby contributing to a reduction in detection speed.
Moreover, there is no restriction | limiting in the number of the microwells which exist in a container. When the size of the container is constant, if the cross-sectional area of the microwell is reduced, the number of microwells can be increased accordingly. A wider range of quantification is possible by increasing the number of microwells. The number of microwells present in the container is plural, but 10 or more are preferable as the microorganism culturing container, and 100 to 1000 are particularly preferable because a wide range of quantification is possible.
微小ウェルを有する容器の製造方法としては、切削加工、真空注型、光造型、真空成型、ブロー成型、圧縮成型、押出成型、吹込成型、発砲成型、スタンピング成型、注型成型、射出成型等が挙げられるが、一般的に用いられる射出成型が好ましい。 Manufacturing methods for containers having microwells include cutting, vacuum casting, photo molding, vacuum molding, blow molding, compression molding, extrusion molding, blow molding, firing molding, stamping molding, casting molding, injection molding, etc. Although generally mentioned, generally used injection molding is preferred.
本発明の容器は、水との接触角が６０°以下である微小ウェルの内表面を有する。ここで内表面は、微小ウェルのみならず容器内の他の内表面をも接触角を６０°以下にしてもよい。内表面をこのような接触角を持つものとするには、親水処理をすればよい。親水処理の方法は水性液体試料の接触角が６０°以下になる条件であれば、いかなる方法でも良い。好ましい親水処理方法としては、酸素プラズマ処理が挙げられる。酸素プラズマ処理は材料表面を酸化し、カルボニル基、水酸基など極性の原子団を形成することで、親水性を高める処理であり、これにより微小ウェル内表面を伝って水性液体試料が微小ウェル内に入りやすくなる。酸素プラズマ処理は既存の酸素プラズマ照射機により容易に行うことができ、微小なウェルの内部でも均一に親水性を付与することができる。また、微生物培養用容器の場合、さまざまな水性液体試料を用いる必要があるため、内表面と水との接触角は４０°以下、さらに１０〜４０°が望ましい。なお、接触角の測定は、平面である基板表面に液滴を滴下し静止させ、基板表面と液滴の接線とのなす角度を測定する。測定方法は、θ/2法、接線法、カーブフィッティング法が用いられるが、単にプラスチック表面の水に対する接触角を測定する際には、θ／２法が使用される。 The container of the present invention has an inner surface of a microwell having a contact angle with water of 60 ° or less. Here, the inner surface may have a contact angle of 60 ° or less not only for the microwells but also for other inner surfaces in the container. In order to make the inner surface have such a contact angle, a hydrophilic treatment may be performed. The hydrophilic treatment method may be any method as long as the contact angle of the aqueous liquid sample is 60 ° or less. A preferable hydrophilic treatment method includes oxygen plasma treatment. Oxygen plasma treatment is a treatment that improves the hydrophilicity by oxidizing the material surface to form polar atomic groups such as carbonyl groups and hydroxyl groups. Easy to enter. Oxygen plasma treatment can be easily performed with an existing oxygen plasma irradiator, and hydrophilicity can be imparted uniformly even inside a minute well. In the case of a microorganism culture container, since various aqueous liquid samples need to be used, the contact angle between the inner surface and water is preferably 40 ° or less, and more preferably 10 to 40 °. The contact angle is measured by dropping a droplet on a flat substrate surface and allowing it to stand still, and measuring the angle formed between the substrate surface and the tangent of the droplet. As a measuring method, a θ / 2 method, a tangent method, or a curve fitting method is used. However, when simply measuring the contact angle of water on the plastic surface, the θ / 2 method is used.
なお、酸素プラズマ処理は照射される素材により親水性が十分に付与できない場合があり、また、親水性を付与できてもすぐに親水性が低下してしまう素材もある。酸素プラズマ処理による親水性が安定的に持続する素材としては、ポリスチレンとポリシクロオレフィンを挙げることができる。
また、親水処理は、微小ウェル内表面のみに限らず、容器内表面全体、または容器全体について行ってもよい。
Note that the oxygen plasma treatment may not provide sufficient hydrophilicity depending on the material to be irradiated, and there are also materials whose hydrophilicity immediately decreases even if hydrophilicity can be provided. Polystyrene and polycycloolefin can be mentioned as a material in which the hydrophilicity by oxygen plasma treatment is stably maintained.
The hydrophilic treatment is not limited to the inner surface of the microwell, but may be performed on the entire inner surface of the container or the entire container.
本発明方法において、水性液体試料は界面活性剤を含有するものが好ましい。界面活性剤により水性液体試料の表面張力が抑えられ、微小ウェル内に水性液体試料が入りやすくなる。
界面活性剤は本発明の目的を達成するのに必要な種類、濃度を適宜選択することができる。一般に、界面活性剤の濃度が高い方が微小ウェル内に水性液体試料が入りやすくなる。
界面活性剤としては非イオン性の界面活性剤、イオン性の界面活性剤が挙げられるが、一般に非イオン性の界面活性剤の方が微生物に対する毒性が少ないので好ましい。非イオン性界面活性剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。市販品としては、Tween20、Tween80、TritonX-100等が挙げられる。イオン性の界面活性剤としてはデオキシコール酸等が挙げられるが、微生物の増殖に影響を与えないものであれば用いることができる。
In the method of the present invention, the aqueous liquid sample preferably contains a surfactant. The surface tension of the aqueous liquid sample is suppressed by the surfactant, and the aqueous liquid sample can easily enter the microwell.
As the surfactant, the type and concentration necessary for achieving the object of the present invention can be appropriately selected. In general, the higher the concentration of the surfactant, the easier it is for the aqueous liquid sample to enter the microwell.
Examples of the surfactant include nonionic surfactants and ionic surfactants. Generally, nonionic surfactants are preferred because they are less toxic to microorganisms. Nonionic surfactants include glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene fatty acid ester, pentaerythritol fatty acid ester, polyoxyethylene pentaerythritol fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, polyoxyethylene sucrose fatty acid Examples include esters, sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene propylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl phenyl ethers, and the like. Commercially available products include Tween 20, Tween 80, Triton X-100 and the like. Examples of the ionic surfactant include deoxycholic acid and the like, but any surfactant that does not affect the growth of microorganisms can be used.
微小ウェル内への水性液体試料の入りやすさは水性液体試料に存在する種々の成分からも影響を受ける。例えば水性液体試料が水であれば、微小ウェルの親水性をある程度上げれば微小ウェル内に容易に水性液体試料が入っていく。しかし、水性液体試料が果汁飲料や乳製品等ように糖質や脂質等の成分が多量に含まれるものの場合には、微小ウェルの親水性を上げても微小ウェル内に液体試料が入っていかない場合がある。しかしながら、微小ウェル内表面を酸素プラズマ処理すると同時に、水性液体試料中に界面活性剤を添加すると、果汁飲料や乳製品のような水性液体試料も微小ウェル内に容易に入れ込むことができる。
さらに、微小ウェルの親水性と水性液体試料中の界面活性剤の濃度を調節しすることで各微小ウェルに容易に水性液体試料を分配することが可能になる。
界面活性剤の濃度は、水性液体試料や、微小ウェルの親水性によって適宜調整すればよいが、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０の場合、０．００１〜１％が好ましい。
The ease with which an aqueous liquid sample can enter the microwell is also affected by various components present in the aqueous liquid sample. For example, if the aqueous liquid sample is water, the aqueous liquid sample can easily enter the microwell if the hydrophilicity of the microwell is increased to some extent. However, when the aqueous liquid sample contains a large amount of carbohydrates and lipids such as fruit juice and dairy products, the liquid sample does not enter the microwell even if the hydrophilicity of the microwell is increased. There is a case. However, when a surface active agent is added to the aqueous liquid sample simultaneously with the oxygen plasma treatment on the inner surface of the microwell, an aqueous liquid sample such as a fruit juice drink or a dairy product can be easily put into the microwell.
Furthermore, the aqueous liquid sample can be easily distributed to each microwell by adjusting the hydrophilicity of the microwell and the concentration of the surfactant in the aqueous liquid sample.
The concentration of the surfactant may be appropriately adjusted depending on the aqueous liquid sample and the hydrophilicity of the microwell. For example, in the case of Tween 20, 0.001 to 1% is preferable.
水性液体試料と微小ウェルの接触角は、各微小ウェルに容易に水性液体試料を分配するための一つの目安となる。この接触角は、微小ウェルの親水性、水性液体試料及びその界面活性剤の濃度により変化するため、これらを調整して、水との接触角を６０°以下、特に０〜５０°、更に２０〜４０°とすることが水性液体試料の分配性の点で好ましい。 The contact angle between the aqueous liquid sample and the microwell is one measure for easily distributing the aqueous liquid sample to each microwell. Since this contact angle varies depending on the hydrophilicity of the microwell, the concentration of the aqueous liquid sample and its surfactant, these are adjusted so that the contact angle with water is 60 ° or less, particularly 0 to 50 °, more preferably 20 It is preferable that the angle is ˜40 ° from the viewpoint of the dispersibility of the aqueous liquid sample.
図２は本発明にかかる培養容器に水性液体試料を導入したときの模式図を示す。
図２容器には、容器に配置された微小ウェルの上部開放部に、水性液体試料が微小ウェルに分配される前に該試料を一次的に保持するための壁が設けられている。
図２−Ａは微小ウェル内を酸素プラズマ処理しておらず、水性液体試料に界面活性剤を添加していない場合を示している。水性液体試料は微小ウェル上部開放部の上に広がった状態で維持され、微小ウェル内に水性液体試料が流入してくることはない。
図２−Ｂは微小ウェル内を酸素プラズマ処理した場合で、水性液体試料を導入したときを示している。図２−Ｂは全ての微小ウェルの上部開放部の上全体に水性液体試料が広がるのに必要な量の水性液体試料を導入した場合を示しており、この場合、微小ウェル上部開放部の上に広がってから微小ウェル内に流入し始めるので、微小ウェル間で均一な分配が可能になる。
ここで、全ての微小ウェルの上部開放部の上全体に水性液体試料が広がるために必要な水性液体試料の量が、全ての微小ウェルの容積を合計した量よりも多い場合には、全ての微小ウェルに水性液体試料を分配しても、過剰な水性液体試料が微小ウェル上に残存してしまうために、微小ウェル内の溶液を他の微小ウェルの溶液から独立させることができない（図３）。従って、容器横断面全体に水性液体試料が広がるために必要な水性液体試料の量は、全ての微小ウェルの容積を合計した容積と同じか、少なくなるようにすることが望ましい。
FIG. 2 shows a schematic diagram when an aqueous liquid sample is introduced into the culture container according to the present invention.
The container shown in FIG. 2 is provided with a wall in the upper open portion of the microwell arranged in the container for temporarily holding the aqueous liquid sample before being distributed to the microwell.
FIG. 2A shows a case where the inside of the microwell is not subjected to oxygen plasma treatment and a surfactant is not added to the aqueous liquid sample. The aqueous liquid sample is maintained in a state of being spread over the upper opening of the microwell, and the aqueous liquid sample does not flow into the microwell.
FIG. 2-B shows a case where an aqueous liquid sample is introduced in the case where the inside of the microwell is subjected to oxygen plasma treatment. FIG. 2-B shows a case where an amount of the aqueous liquid sample necessary for spreading the aqueous liquid sample is introduced over the entire upper opening of all the microwells. Since it starts to flow into the microwells after spreading to the uniform well, uniform distribution between the microwells becomes possible.
Here, if the amount of the aqueous liquid sample required for the aqueous liquid sample to spread over the entire upper opening of all the microwells is larger than the total volume of all the microwells, Even if the aqueous liquid sample is distributed to the microwell, the excess aqueous liquid sample remains on the microwell, so that the solution in the microwell cannot be made independent from the solutions of the other microwells (FIG. 3). ). Therefore, it is desirable that the amount of the aqueous liquid sample required for the aqueous liquid sample to spread over the entire cross section of the container is the same as or less than the total volume of all the microwells.
本発明の容器を微生物試験に用いる場合、水性液体試料には、微生物を含む全ての水性液体試料が含まれる。水性液体試料は必ずしも微生物を含む必要はなく、微生物を含む可能性があれば足りる。微生物を含む液体であれば後述する測定結果は陽性となり、微生物を含んでいなければ後述する測定結果は陰性となる。水性液体試料は食品分野を例にとると、水、ミネラルウォーター、清涼飲料、果汁飲料、牛乳等の液体食材などに限らず、種々の固形、半固形食材を液体中でホモジナイズしたものや、製造環境中に設置された、空気中の汚染物質を回収、検査するためのエアーサンプラーに捕獲された微生物を液体で抽出したサンプル等も含まれる。また、液体食材をメンブレンでろ過して、メンブレン上にトラップされた微生物を液体を用いて抽出したものも水性液体試料となり得る。 When the container of the present invention is used for a microbial test, the aqueous liquid sample includes all aqueous liquid samples containing microorganisms. The aqueous liquid sample does not necessarily contain microorganisms, and only needs to contain microorganisms. If the liquid contains microorganisms, the measurement result described later is positive, and if it does not contain microorganisms, the measurement result described later is negative. Taking the food field as an example, aqueous liquid samples are not limited to liquid foods such as water, mineral water, soft drinks, fruit juice drinks, milk, etc. Examples include a sample of microorganisms captured in an air sampler installed in the environment for collecting and testing airborne contaminants. Moreover, what filtered the liquid foodstuff with the membrane and extracted the microorganisms trapped on the membrane using the liquid can also be an aqueous liquid sample.
また、水性液体試料はそのまま分配しても良いし、微生物の発育に必要な培地成分を加えてから分配しても良い。さらに、微小ウェル内に予め培地成分を設置しておき、水性液体試料が微小ウェル内に流入すると同時に培地成分と水性液体試料が混合されるような形態でもよい。
更に、微生物がトラップされた固形物にも本発明の方法は適用できる。本発明の容器において、液体培地を分配した微小ウェルの上部開放部に接するように微生物がトラップされたメンブレンを入れることで適用することもできる。
Further, the aqueous liquid sample may be distributed as it is, or may be distributed after adding medium components necessary for the growth of microorganisms. Further, a medium component may be previously set in the microwell, and the medium component and the aqueous liquid sample may be mixed at the same time as the aqueous liquid sample flows into the microwell.
Furthermore, the method of the present invention can also be applied to a solid material in which microorganisms are trapped. In the container of the present invention, it can also be applied by putting a membrane in which microorganisms are trapped so as to be in contact with the upper open part of the microwell to which the liquid medium is distributed.
微小ウェルに分配された水性液体試料は、微生物の培養のために、一定時間インキュベートしてもよい。この場合、本発明の容器は微生物培養用容器となる。インキュベートの温度は検査対象となる微生物により異なるため目的により適宜調節される。
微小ウェル内溶液は、微生物の存在で種々の指示薬により検出され得る。指示薬として酸化還元指示薬や、ガスセンサー等が挙げられる。酸化還元指示薬としては、例えば微生物の代謝活性により還元されて蛍光を発するレサズリンや、同様に還元されて発色するＷＳＴ等が挙げられる。これらの指示薬は水性液体試料に予め添加しておいてもよいし、微小ウェル内に予め設置しておくこともできる。
The aqueous liquid sample dispensed into the microwells may be incubated for a period of time for microbial culture. In this case, the container of the present invention is a microorganism culture container. Since the incubation temperature varies depending on the microorganism to be examined, it is appropriately adjusted depending on the purpose.
The microwell solution can be detected by various indicators in the presence of microorganisms. Examples of the indicator include a redox indicator and a gas sensor. Examples of the redox indicator include resazurin that is reduced by the metabolic activity of microorganisms to emit fluorescence, and WST that is similarly reduced to develop color. These indicators may be added in advance to the aqueous liquid sample, or may be installed in advance in the microwell.
ガスセンサーとしては微生物の呼吸により減少する酸素濃度を検知する酸素センサーや、微生物の呼吸により増加する二酸化炭素濃度を検知する二酸化炭素センサーが挙げられる。
指示薬の検出は既存の吸光検出器や蛍光検出器等の光学検出器で検出することも可能であるし、指示薬および微小ウェルの形状に適した専用の検出器を適用することでも検出し得る。
Examples of the gas sensor include an oxygen sensor that detects an oxygen concentration that decreases due to respiration of microorganisms, and a carbon dioxide sensor that detects a carbon dioxide concentration that increases due to respiration of microorganisms.
The indicator can be detected by an existing optical detector such as an absorption detector or a fluorescence detector, or can be detected by applying a dedicated detector suitable for the shape of the indicator and the microwell.
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these.
実施例１：微小ウェルを有するポリスチレン製の容器の作製
（１）微小ウェルを有するポリスチレン製の容器を射出成型で作製した（図４）。この容器は内に1.2mm四方の断面と10mmの高さを有する正四角柱構造の微小ウェルを49個有している。
Example 1 Production of Polystyrene Container Having Microwells (1) A polystyrene container having microwells was produced by injection molding (FIG. 4). This container has 49 micro wells of a regular quadrangular prism structure having a 1.2 mm square cross section and a height of 10 mm.
（２）表面処理による親水性（接触角）の比較
ポリスチレン製の384穴プレート、1536穴プレート、（１）の容器のそれぞれに、親水性ポリマーコート、酸素プラズマ処理の表面処理を施した。酸素プラズマ処理方法は、酸素プラズマ処理装置（ヤマト科学株式会社、PR301）のチャンバーに、処理を施す容器を入れ、チャンバー内を真空にして、酸素を18〜24cc導入した。高周波出力を60〜80Wとして、1分間酸素プラズマ処理を施した。親水性ポリマーコートは、住友ベークライト社 Ｓ−ＢＩＯ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）を用いた。
それぞれの表面処理による、ポリスチレン表面の水との接触角を測定した結果を表１に示す。
(2) Comparison of hydrophilicity (contact angle) by surface treatment Each of the 384-well plate, 1536-well plate made of polystyrene, and the container of (1) was subjected to a surface treatment of hydrophilic polymer coating and oxygen plasma treatment. In the oxygen plasma processing method, a container for processing was placed in a chamber of an oxygen plasma processing apparatus (Yamato Scientific Co., Ltd., PR301), the inside of the chamber was evacuated, and 18 to 24 cc of oxygen was introduced. Oxygen plasma treatment was performed at a high frequency output of 60 to 80 W for 1 minute. As the hydrophilic polymer coat, S-BIO (registered trademark) Prime Surface (registered trademark) manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. was used.
Table 1 shows the results of measuring the contact angle of each polystyrene with water on the polystyrene surface.
実施例２：断面積の異なるウェルへの表面処理による分配性
分配する培地は、酵母エキス2.5g/L、ペプトン5.0g/L、ブドウ糖1.0g/L、TES0.1M、リン酸緩衝液0.01M、レサズリン0.01mg/mLとして調製をした。また、界面活性剤を含有させた培地は、Tween20を最終濃度が0.05%となるように添加した。
実施例１に記載した容器を用い、界面活性剤を含有しない培地と含有している培地を、ウェルの上部開放部に滴下して、ウェル内部に分配することが可能であるかを確認した結果を表２に示す。
Example 2: Dispensability by surface treatment to wells having different cross-sectional areas The medium to be distributed was yeast extract 2.5 g / L, peptone 5.0 g / L, glucose 1.0 g / L, TES 0.1 M, phosphate buffer 0.01 M , Resazurin was prepared as 0.01 mg / mL. The medium containing the surfactant was added with Tween 20 so that the final concentration was 0.05%.
Using the container described in Example 1, the result of confirming whether or not a medium containing no surfactant and a medium containing the same can be dropped into the upper open portion of the well and distributed inside the well Is shown in Table 2.
ウェル断面積が大きな384穴ウェルでは、すべての条件で分配することができたが、それより断面積の小さな1536穴プレートでは、親水度の高い酸素プラズマ処理を施したプレートのみに分配することができ、さらに断面積の小さい容器では、界面活性剤が含有された培地を酸素プラズマ処理した容器に滴下した条件でのみ、分配することができた。 A 384-well well with a large well cross-sectional area could be dispensed under all conditions, but a 1536-well plate with a smaller cross-sectional area could be dispensed only to a highly hydrophilic oxygen plasma treated plate. In addition, in a container having a smaller cross-sectional area, distribution was possible only under the condition that a medium containing a surfactant was dropped into a container subjected to oxygen plasma treatment.
実施例３：樹脂表面の水に対する接触角と分配性
実施例１（１）の容器に、酸素プラズマ処理装置（ヤマト科学株式会社、PR301）を用いて、高周波出力20wとして30秒間酸素プラズマ処理を施した（弱めの処理）。樹脂の水に対する接触角が経時的に変化することを利用して、水に対して異なる接触角を有する容器を作製した。接触角の測定は、接触角計（Model G-1-1000、エルマ販売株式会社）を使用して、θ／２法により3重測定を実施して、その平均値を算出した。
次に、得られた異なる接触角を有する容器への分配性について評価した。分配する培地として酵母エキス2.5g/L、ペプトン5.0g/L、ブドウ糖1.0g/L、TES0.1M、リン酸緩衝液0.01M、レサズリン0.01mg/mL、Tween20を最終濃度0.05%となるように調製したものを用いた。
接触角と分配性の結果を表３に示す。接触角が53.0°以下の表面状態では、溶液の各ウェルへの分配が行うことができることを確認した。
Example 3: Water contact angle and distribution on the resin surface Using the oxygen plasma processing apparatus (Yamato Scientific Co., PR301) in the container of Example 1 (1), oxygen plasma treatment was performed for 30 seconds with a high frequency output of 20w (Weak treatment). Utilizing the fact that the contact angle of the resin with water changes over time, containers having different contact angles with respect to water were produced. For the measurement of the contact angle, a contact angle meter (Model G-1-1000, Elma Sales Co., Ltd.) was used, triple measurement was performed by the θ / 2 method, and the average value was calculated.
Next, the distribution property to the containers having different contact angles obtained was evaluated. Yeast extract 2.5g / L, peptone 5.0g / L, glucose 1.0g / L, TES0.1M, phosphate buffer 0.01M, resazurin 0.01mg / mL, and Tween20 as final media to be 0.05% The prepared one was used.
Table 3 shows the results of contact angle and distribution. It was confirmed that the solution could be distributed to each well in a surface state with a contact angle of 53.0 ° or less.
実施例４：水性液体試料の微小ウェルへの分配性
実施例１（１）の容器を用いて、水性液体試料の分配性を評価した。
容器は未処理と酸素プラズマ処理のものを用意した。
界面活性剤の添加はTween20を最終濃度0.05%になるようにして水性液体試料に添加した。
水性液体試料の分配性に対する容器の酸素プラズマ処理、および試料への界面活性剤の添加の効果を調べた結果を表４に示す。
Example 4: Dispensability of aqueous liquid sample to microwells Using the container of Example 1 (1), the dispersibility of the aqueous liquid sample was evaluated.
The containers were prepared untreated and oxygen plasma treated.
Surfactant was added to the aqueous liquid sample at a final concentration of 0.05% Tween20.
Table 4 shows the results of examining the effect of oxygen plasma treatment of the container and the addition of a surfactant to the sample on the dispersibility of the aqueous liquid sample.
酸素プラズマ処理と界面活性剤の添加を組み合わせることで、今回試験した全ての水性液体試料で微小ウェルへの分配が可能であることが確認できた。
また、各微小ウェルへの水性液体試料の分配の均一性については、分配が可能であった全ての条件で均一な分配が可能であった。これは水性液体試料を容器に導入しても、水性液体試料がすぐに微小ウェル内に入り込むのではなく、全ての水性液体試料が微小ウェルの上方開放部上の容器横断面全体に広がった後、微小ウェル内への水性液体試料の移動が始まるためである。
酸素プラズマ処理を行った直後の容器を用いると、容器内に導入された水性液体試料は即座に微小ウェル内に入り込んでしまうために、全ての水性液体試料が微小ウェルの上方開放部上の容器横断面全体に広がるための猶予時間がなく、微小ウェル間で均一な分配を行うのは困難であった。しかし、本実施例で示すように、酸素プラズマ処理後一定期間放置すると親水性がある程度低下した状態で安定し、均一な分配を実現するのに適した条件となることが確認できた。
By combining oxygen plasma treatment with the addition of a surfactant, it was confirmed that all the aqueous liquid samples tested this time can be distributed to microwells.
In addition, regarding the uniformity of the distribution of the aqueous liquid sample to each microwell, uniform distribution was possible under all conditions where distribution was possible. This is because when an aqueous liquid sample is introduced into a container, the aqueous liquid sample does not immediately enter the microwell, but after all the aqueous liquid sample has spread across the entire container cross-section above the open top of the microwell. This is because the movement of the aqueous liquid sample into the microwell begins.
When the container immediately after the oxygen plasma treatment is used, the aqueous liquid sample introduced into the container immediately enters the microwell, so that all the aqueous liquid samples are placed on the upper open portion of the microwell. There was no grace time to spread across the entire cross section and it was difficult to achieve uniform distribution among the microwells. However, as shown in the present example, it was confirmed that if it was allowed to stand for a certain period after the oxygen plasma treatment, the hydrophilicity was stabilized in a state where it was lowered to some extent, and the conditions were suitable for realizing uniform distribution.
実施例５：実施例１（１）の容器を用いた、カビを含む水性液体試料の培養結果
分配する培地は、4.0g/Lポテトエキス、20.0g/Lブドウ糖、0.1M TES(pH6.2)、0.05%Tween20、レサズリン0.01mg/mLとして調製をした。
培地と胞子液(A.nigerATCC16404)を混合して、その溶液を実施例1（１）の容器の上部開放部へ導入し、各ウェルへ分配させた後、蛍光プレートリーダーを使用して蛍光強度を経時的に測定した。また、96穴プレートを用いて300μＬの上記培地中で同様に試験を行い比較例とした。測定結果を図５に示す。図５の結果から１００００RFUに達する時間を検出時間とし、その結果を表５に示す。
Example 5: Cultivation result of aqueous liquid sample containing mold using the container of Example 1 (1) The medium to be distributed was 4.0 g / L potato extract, 20.0 g / L glucose, 0.1 M TES (pH 6.2) ), 0.05% Tween 20 and resazurin 0.01 mg / mL.
The medium and spore solution (A.nigerATCC16404) are mixed, the solution is introduced into the upper open part of the container of Example 1 (1), distributed to each well, and then the fluorescence intensity using a fluorescence plate reader Was measured over time. In addition, the same test was performed in a 300 μL medium using a 96-well plate as a comparative example. The measurement results are shown in FIG. From the results shown in FIG. 5, the time required to reach 10,000 RFU was taken as the detection time, and the results are shown in Table 5.
表５の結果から、実施例１（１）の容器を用いることで、容易に微小ウェルに溶液を分配することが可能であり、A.nigerの検出時間も１２時間の短縮が可能であった。 From the results in Table 5, it was possible to easily distribute the solution to the microwells by using the container of Example 1 (1), and the detection time of A. niger could be shortened by 12 hours. .
実施例６：実施例１（１）の容器を用いた、大腸菌を含む水性液体試料の培養結果
分配する培地は、2.5g/L酵母エキス、5.0g/Lペプトン、1.0g/Lブドウ糖、0.05%Tween20、レサズリン0.01mg/mLとして調製をした。
培地と大腸菌（Eshcherichia coli ATCC8739）を混合して、その溶液を実施例1（１）の容器の上部開放部へ導入し、各ウェルへ分配させた後、蛍光プレートリーダーを使用して蛍光強度を経時的に測定した。また、96穴プレートを用いて300μＬの上記培地中で同様に試験を行い比較例とした。測定結果を図６に示す。図6の結果から１００００RFUに達する時間を検出時間とし、その結果を表６に示す。
Example 6: Culture results of aqueous liquid sample containing Escherichia coli using the container of Example 1 (1) The medium to be distributed was 2.5 g / L yeast extract, 5.0 g / L peptone, 1.0 g / L glucose, 0.05 % Tween20 and resazurin 0.01 mg / mL were prepared.
The culture medium and E. coli (Eshcherichia coli ATCC8739) are mixed, the solution is introduced into the upper open part of the container of Example 1 (1), distributed to each well, and then the fluorescence intensity is measured using a fluorescence plate reader. Measured over time. In addition, the same test was performed in a 300 μL medium using a 96-well plate as a comparative example. The measurement results are shown in FIG. From the results shown in FIG. 6, the time required to reach 10,000 RFU was defined as the detection time, and the results are shown in Table 6.
表６の結果から、実施例１（１）の容器を用いることで、容易に微小ウェルに溶液を分配することが可能であり、大腸菌の検出時間も２．７時間の短縮が可能であった。 From the results of Table 6, it was possible to easily distribute the solution to the microwells by using the container of Example 1 (1), and the detection time of E. coli could be shortened by 2.7 hours. .
実施例７：実施例１（１）の容器を用いた、微生物（カビ）を含むメンブレンの培養結果
実施例２と同様の培地をウェルの上部開放部に滴下して、各ウェルに分配させた。胞子液(A.nigerATCC16404)をろ過して、メンブレンフィルター上に胞子を回収した。そのメンブレンフィルターを培地で満たされたウェル上に乗せて、蛍光プレートリーダーを使用して蛍光強度を経時的に測定した（MF使用）。また、実施例４と同様に胞子液を同培地に混合したものの試験を行い比較例（MF未使用）とした。測定結果を図７に示す。図７の結果から１５０００RFUに達する時間を検出時間とし、その結果を表７に示す。
Example 7: Culture result of membrane containing microorganisms (mold) using the container of Example 1 (1) The same medium as in Example 2 was dropped on the upper open part of the well and distributed to each well . The spore solution (A.nigerATCC16404) was filtered and the spores were collected on a membrane filter. The membrane filter was placed on a well filled with a medium, and fluorescence intensity was measured over time using a fluorescence plate reader (using MF). Moreover, the test of what mixed the spore liquid with the same culture medium was carried out similarly to Example 4, and it was set as the comparative example (MF unused). The measurement results are shown in FIG. From the results shown in FIG. 7, the time to reach 15000 RFU was defined as the detection time, and the results are shown in Table 7.
表７の結果から、実施例１（１）の容器を用いることで、水性液体試料中の微生物だけではなく、メンブレンフィルター上の微生物も同等の検出時間で検出することができた。 From the results of Table 7, by using the container of Example 1 (1), not only the microorganisms in the aqueous liquid sample but also the microorganisms on the membrane filter could be detected in the same detection time.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015115635A1 (en) * | 2014-01-31 | 2015-08-06 | 凸版印刷株式会社 | Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63198976A (en) * | 1987-02-13 | 1988-08-17 | Sumitomo Electric Ind Ltd | Base material for cultivating cell |
| JPH06327462A (en) * | 1993-05-21 | 1994-11-29 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Formation of cell aggregate |
| JP2002204690A (en) * | 2001-01-09 | 2002-07-23 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Cell-adhered cell incubator, method for producing the same and method for using the same |
| JP2007192712A (en) * | 2006-01-20 | 2007-08-02 | Toppan Printing Co Ltd | Method of storing substrate, and substrate |
| WO2009038104A1 (en) * | 2007-09-18 | 2009-03-26 | Nanobiotech Co., Ltd. | Method for production of solid phase surface having low binding property |
-
2008
- 2008-02-13 JP JP2008031709A patent/JP4975658B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63198976A (en) * | 1987-02-13 | 1988-08-17 | Sumitomo Electric Ind Ltd | Base material for cultivating cell |
| JPH06327462A (en) * | 1993-05-21 | 1994-11-29 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Formation of cell aggregate |
| JP2002204690A (en) * | 2001-01-09 | 2002-07-23 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Cell-adhered cell incubator, method for producing the same and method for using the same |
| JP2007192712A (en) * | 2006-01-20 | 2007-08-02 | Toppan Printing Co Ltd | Method of storing substrate, and substrate |
| WO2009038104A1 (en) * | 2007-09-18 | 2009-03-26 | Nanobiotech Co., Ltd. | Method for production of solid phase surface having low binding property |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015115635A1 (en) * | 2014-01-31 | 2015-08-06 | 凸版印刷株式会社 | Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method |
| CN105940096A (en) * | 2014-01-31 | 2016-09-14 | 凸版印刷株式会社 | Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method |
| JPWO2015115635A1 (en) * | 2014-01-31 | 2017-03-23 | 凸版印刷株式会社 | Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method |
| EP3101115A4 (en) * | 2014-01-31 | 2017-12-13 | Toppan Printing Co., Ltd. | Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method |
| US11261484B2 (en) | 2014-01-31 | 2022-03-01 | Toppan Printing Co., Ltd. | Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method |
| US11371089B2 (en) | 2014-01-31 | 2022-06-28 | Toppan Printing Co., Ltd. | Biomolecule analysis method |
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