JP2009171883A

JP2009171883A - ポリヒドロキシアルカノエートおよびポリヒドロキシアルカノエートの製造方法

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Publication number: JP2009171883A
Application number: JP2008012454A
Authority: JP
Inventors: Koji Sato; 康治佐藤; Kenji Tajima; 健次田島; Masanobu Munakata; 正信棟方; Tokuo Matsushima; 得雄松島
Original assignee: AGRI BIOINDUSTRY KK; Hokkaido University NUC
Current assignee: AGRI BIOINDUSTRY KK; Hokkaido University NUC
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2008-01-23
Publication date: 2009-08-06
Anticipated expiration: 2028-01-23
Also published as: JP5555975B2

Abstract

【課題】寒冷地においても流動性を失うことなく粘接着性を有し、接着剤やバインダー等に利用することができるポリヒドロキシアルカノエート、およびバイオディーゼル燃料の副産物を有効利用して該ポリヒドロキシアルカノエートを工業生産に適応して生産する製造方法を提供する。
【解決手段】３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエートからなる群から選択される少なくとも一つをモノマーユニットとしてなり、ガラス転移温度が−４８℃以下である。
【選択図】図６

Description

本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）およびＰＨＡの製造方法に関し、特に３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）をモノマーユニットとして含まず、ガラス転移温度（Ｔｇ）が−４８℃以下であるＰＨＡ、およびバイオディーゼル燃料の副産物を炭素源に利用してＰＨＡを製造する方法に関する。

生分解性ポリエステルは、現在までに数多くの微生物において、糖や植物油等の再生可能な生物有機資源（バイオマス）を原料として生成され、微生物の体内に蓄積されることが知られている。その中でも、ＰＨＡは化学合成プラスチックと同様に熱可塑性を示し、優れた生分解性と生体適合性を有することから注目を集めているポリエステルであり、ポリマー中において９０種類以上のモノマー構造が確認されている。

このように微生物によって生産される代表的なＰＨＡとして、３ＨＢをモノマーユニットとしたものが挙げられるが、３ＨＢをモノマーユニットとしたＰＨＡ｛Ｐ（３ＨＢ）｝は結晶性が高く、硬くてかつ脆い性質を持っており、実用性に乏しいとされている。このような問題を解決するため、ＰＨＡの性質を改善する様々な試みがなされている。

特に、３ＨＢ以外のモノマーユニットからなるＰＨＡは、ＰＨＡを生産する微生物の種類や培地組成、培養条件等を変えたり、微生物を新規に分離したり、または遺伝子組換え技術を用いて形質転換した微生物を用いる等によって製造が実現されている。

例えば、特表平４−５０４２０５号公報には、シュードモナス・フルオレッセンスｒＲＮＡ分枝の細菌を所定の栄養培地中で培養することにより、６〜１０の炭素原子を有する繰返し単位から構成されるＰＨＡを製造する方法が開示されている（特許文献１）。

特開平７−０３１４９０号公報には、新規に分離したシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）３１−１株により、モノマーユニットである３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨｘ）、３−ヒドロキシオクタノエート（３ＨＯ）、３−ヒドロキシデカノエート（３ＨＤ）、または３−ヒドロキシドデカノエート（３ＨＤＤ）からなる共重合体を産生することが開示されている。そして、その共重合体の数平均分子量は１１０，０００〜２９０，０００、ガラス転移温度は−４４℃〜−３４℃であることが開示されている（特許文献２）。

特開２００１−１７８４８４号公報には、新規に分離したシュードモナス・チコリアイＨ４５株を、酢酸ナトリウムを単一炭素源として含む培地中で培養することにより、炭素数６（以下、「Ｃ６」のように示す。）、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４のモノマーユニットを少なくとも一種類含むＰＨＡを製造する方法が開示されている（特許文献３）。

特開２００４−３２１１６７号公報には、所定の形質転換微生物を、Ｃ６からＣ１０を炭素源として含む培地で培養することにより、Ｃ６からＣ１０のモノマーユニットから構成されたＰＨＡを生産する方法が開示されている（特許文献４）。

一方、バイオ燃料についても、環境保全への推進の高まりから利用促進に向けた施策が急速に進展しており、菜種油や廃食用油等から生成されるバイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）は軽油代替として注目されている。ＢＤＦ製造時には副産物（ＢＤＦＢ）が約２０％排出されるが、そのほとんどが産業廃棄物として処分されているため、近年、ＢＤＦＢの有効利用方法が検討されている。

例えば、特開２００６−１８０７８２号公報には、微生物による発酵技術によってＢＤＦＢから水素およびエタノールを製造することが報告されている（特許文献５）。

他方、微生物によるＰＨＡの発酵合成は、炭素源以外の栄養源である窒素源や無機塩類等を欠乏させて微生物の増殖を制限した場合に促進されることから、従来は、微生物を増殖させる一段階目と、ＰＨＡを蓄積させる二段階目とからなる二段階培養法が採用されている。

二段階培養法の一段階目は、栄養豊富な培地で微生物を培養し増殖させることを目的としているため、資化可能な炭素源を自由に選択することができる。また、二段階目は、一段階目で得られた微生物を洗浄回収し、炭素源以外の栄養源の制限下において新たに炭素源を加えたミネラル培地により微生物を培養し、ＰＨＡの生産を誘導するものである。

これに対し一段階培養法は、窒素源と炭素源とを加えた栄養豊富な培地中において、微生物の増殖とＰＨＡの蓄積とを同時に行わせることによりＰＨＡを発酵合成する方法である。この一段階培養法においてもＰＨＡを生産することはできるが、従来、二段階培養法に比べて生産量が非常に少ないという問題がある。

例えば、前記特許文献２には、炭素源としてオクタン酸ナトリウムを与えた一段階の培養により、３ＨＨｘと３ＨＯとをモノマーユニットとする共重合体を生産することが開示されている。また、特開２００２−２５３２８５には、炭素化合物と天然培地成分とを加えた無機培地に所定のアルカン酸を添加したものを用いて培養することにより、一段階でＰＨＡを製造する方法が開示されている（特許文献６）。

特表平４−５０４２０５号公報特開平７−０３１４９０号公報特開２００１−１７８４８４号公報特開２００４−３２１１６７号公報特開２００６−１８０７８２号公報特開２００２−２５３２８５号公報

しかしながら、特許文献１から５に記載された発明においては、製造されたＰＨＡのＴｇは高温であり、数平均分子量や重量平均分子量も異なっている。ここで、ＰＨＡを構成するモノマーユニットの種類が同じであっても、モノマーユニットの構成比や分子量が相違することにより、ガラス転移温度や粘度、接着性等が異なるといった全く違う特性を有するＰＨＡとなる。例えば、バイオポールＤ４００Ｇ（モンサント社製）とバイオポールＤ６００Ｇ（モンサント社製）はポリヒドロキシブチレート／バリレート共重合体であって、構成するモノマーユニットは同じであっても、ガラス転移温度はそれぞれ５℃と−１０℃であり、１５℃もの差がある。さらに、特許文献２においては、製造されたＰＨＡのモノマーユニットの構成比およびガラス転移温度が数℃違うことにより、ゴム状や油状といった異質な性状を有することが示されている。

また、ＢＤＦＢの有効な利用方法は開発されはじめたところであり、現在は水素やエタノール、１，３−プロパンジオールを生産するために利用されているにとどまり、他の物質を製造するために有効利用された報告はない。

さらに、前記二段階培養法によるＰＨＡの製造は、前記一段階培養法に比べて多くの設備を設ける必要があり、それに伴って作業工程が煩雑となり、余分な手間と時間を要するため、工業的な生産には適さない。また、特許文献２に記載された発明のような従来の一段階培養法によるＰＨＡの製造法においては、二段階培養に比べて生産量が少なく、半分程度の生産量にまでなってしまうといった問題があった。さらに、特許文献６に記載された発明においては、一段階培養法によりＰＨＡ生産されているが、炭素源化合物と高価な酵母エキスの添加が必要となるといった問題点があった。

本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、３ＨＢを含むことなくＴｇが−４８℃以下のＰＨＡであって、高価な酵母エキス等を添加する必要もなくＢＤＦＢを炭素源として有効利用して微生物にＰＨＡを生産させることができ、かつ、生産させたＰＨＡの分離回収が簡便であり、通常二段階培養が必要な微生物を用いても、一の培養装置内での一段階の培養において効率的にＰＨＡ生産が可能であるＰＨＡおよびＰＨＡを製造する方法を提供することを目的としている。

本発明に係るポリヒドロキシアルカノエートの特徴は、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエートからなる群から選択される少なくとも一つをモノマーユニットとしてなるポリヒドロキシアルカノエートであって、かつガラス転移温度が−４８℃以下である点にある。

また、本発明において、前記３−ヒドロキシオクタノエートの組成率と前記３−ヒドロキシデカノエートの組成率との合計が７０％以上であることが好ましい。

そして、本発明において、−５℃以上４５℃以下における粘度が１．０×１０^４ｍＰａ／ｓ以上１．２×１０^５ｍＰａ／ｓ以下であって、温度の上昇に伴って前記粘度が低下することが好ましい。

さらに、本発明において、分子量分布が１から２であることが好ましい。

一方、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエートの製造方法の特徴は、油脂をエステル交換反応することにより得られたバイオディーゼル燃料の副産物を炭素源として微生物発酵法により製造する点にある。

また、本発明に係るポリヒドロキシアルカノエートの製造方法の別の特徴は、油脂をエステル交換反応することにより得られたバイオディーゼル燃料の副産物を中和した中和副産物を炭素源として微生物発酵法により製造する点にある。

また、本発明において、前記微生物発酵法における培養が前記バイオディーゼル燃料の副産物または前記中和副産物を培地に用いた一段階の培養であることが好ましい。

そして、本発明においては、第１組成のモノマーユニットが３ーヒドロキシオクタノエートであって第２組成のモノマーユニットが３−ヒドロキシデカノエートであるポリヒドロキシアルカノエート、または第１組成のモノマーユニットが３ーヒドロキシデカノエートであって第２組成のモノマーユニットが３−ヒドロキシオクタノエートであるポリヒドロキシアルカノエートを、培養時間を制御することにより選択的に製造することが可能である。

また、本発明において、前記微生物発酵法における微生物がラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）またはポリヒドロキシアルカノエート生成組換え大腸菌であることが好ましい。

さらに、本発明において、前記微生物発酵法における微生物としてシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）を用いることにより３−ヒドロキシブチレートをモノマーユニットとして含まないポリヒドロキシアルカノエートを製造することが好ましい。

また、本発明において、前記微生物発酵法における培養が流加培養法または連続培養法により行われることが好ましい。

本発明によれば、これまで産業廃棄物として処理されていたＢＤＦＢを有効利用して、工業生産に適応した生産方法によって簡便かつ効果的にＰＨＡを得ることができる。そして、得られたＰＨＡは３ＨＢを含むことなくＴｇが−４８℃以下であることから、寒冷地においても流動性を失うことなく粘接着性を有し、接着剤やバインダー樹脂等に利用することができる。また、培養時間を適宜選択することによって、ＰＨＡの組成比率を調節することができるため、利用目的に応じて所望の性質を有するＰＨＡを製造することができる。

以下、本発明に係るＰＨＡおよびＰＨＡの製造方法について、本実施形態におけるＰＨＡおよびＰＨＡの製造方法に基づき説明する。

まず、本発明に係るＰＨＡについて説明する。本発明に係るＰＨＡは、３ＨＨｘ、３ＨＯ、３ＨＤ、３ＨＤＤからなる群から選択される少なくとも一つをモノマーユニットとしてなる。すなわち、本発明におけるモノマーユニットは、３ＨＨｘ、３ＨＯ、３ＨＤ、３ＨＤＤの４種のモノマーユニット中から選ばれる１つないし４つであり、前記４種のモノマーユニット以外のモノマーユニットは含まれない。ただし、ＰＨＡ全体として「３ＨＨｘ、３ＨＯ、３ＨＤ、３ＨＤＤからなる群から選択される少なくとも一つをモノマーユニットとしてなる」場合の他、「３ＨＨｘ、３ＨＯ、３ＨＤ、３ＨＨＤからなる群から選択される少なくとも一つをモノマーユニットとしてなる」ＰＨＡを一部に有するＰＨＡも含まれる。なお、本実施形態におけるＰＨＡは、図３、図４、図５、または図６に示すとおり、３ＨＨｘと３ＨＯと３ＨＤと３ＨＤＤとからなっている。

ここで、本発明において、「モノマーユニットとしてなる」とは、選ばれたモノマーユニットすべてが前記ＰＨＡを構成する場合の他、前記ＰＨＡを構成しなくとも、例えば前記ＰＨＡの鎖に絡み付く等してモノマーとして残存するような場合も含む趣旨である。

また、本発明に係るＰＨＡは、ガラス転移温度（Ｔｇ）が−４８℃以下である。ここで、Ｔｇとは、高温では液体であるガラス等の物質が温度の降下により、ある温度範囲で急激にその粘度を増し、ほとんど流動性を失って非結質固体となる温度をいう。ガラス転移温度よりも高温では、網状構造をなす鎖状高分子の各部分の熱運動が激しく、ゴム状弾性を示すが、ガラス転移温度以下では熱運動が自由体積の減少によって抑制されて硬くなる。

なお、本実施形態におけるＰＨＡのＴｇは、ＰＨＡを生成する微生物の炭素源により異なっており、図７に示すとおり、精製グリセリンを炭素源とした場合は−４８．６℃ないし−５７．３℃、油脂をエステル交換反応することにより得られたバイオディーゼル燃料の副産物（ＢＤＦＢ）を炭素源とした場合は−５１．７℃ないし−６０．９℃、ＢＤＦＢを中和した中和副産物（中和ＢＤＦＢ）を炭素源とした場合は−４９．０℃ないし−５７．７℃である。

また、本発明に係るＰＨＡは、３ＨＨｘ、３ＨＯ、３ＨＤ、３ＨＤＤからなる群から選択される少なくとも一つをモノマーユニットとしていれば、その組成率は特に限定されないが、本実施形態におけるＰＨＡは、図３、図４、図５、または図６に示すとおり、モノマーユニットのうち３ＨＯの組成率と３ＨＤの組成比率との合計が７０％以上である。また、本実施形態におけるＰＨＡの分子量分布は、図３または図７の示すように、物性面の観点からも、好ましくは１から２であり、より好ましくは１．５から２であり、さらに好ましくは１．７から２である。

また、本発明に係るＰＨＡの粘度は、温度依存的に粘性が変化し、特に温度の上昇に伴って粘性が低下する性質を有することが好ましい。本実施形態におけるＰＨＡは、図９または図１０に示すとおり、−５℃以上４５℃以下における粘度が約１．０×１０^４ｍＰａ／ｓ以上約１．２×１０^５ｍＰａ／ｓ以下であって、温度の上昇に伴って粘度が低下するという性質を有している。すなわち、本発明に係るＰＨＡは温度依存的に粘性が変化するため、加工等が容易であり、例えば接着剤やバインダー樹脂等に利用することが可能である。

次に、本発明に係るＰＨＡの製造方法について説明する。本発明に係るＰＨＡの製造方法は、精製グリセリンの他、油脂をエステル交換反応することにより得られたバイオディーゼル燃料の副産物（ＢＤＦＢ）やＢＤＦＢを中和した中和副産物（中和ＢＤＦＢ）を炭素源とした、微生物発酵法による製造方法である。特に、環境保全やコスト、工業生産への適応性等の観点から、ＢＤＦＢや中和ＢＤＦＢを炭素源とした微生物発酵法による製造方法が好ましい。

ここで、ＢＤＦＢについて詳説する。ＢＤＦＢとは、バイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）を生成する際に副産物として生成するものであり、本実施形態において用いるＢＤＦＢは、図１に示すように主な組成としてグリセリンや脂肪酸を含んでいる。本発明に係るＰＨＡの製造方法において用いられるＢＤＦＢは油脂からＢＤＦを生成する際に副産物として生成するものであればこれに限られず、例えば、他の食品由来の有機性不純物や灰分、ミネラル等、他の組成を有していてもよい。

また、ＢＤＦは、菜種油や廃食用油等の油脂にメタノールと水酸化カリウム等のアルカリ触媒とを加え、アルコリシスさせてエステル交換反応を起こすことにより一般的に得られるものであるが、ＢＤＦＢはこれと同時に得られるものである。そのため、ＢＤＦＢはアルカリ性を有している。そこで、ＰＨＡの製造に際しては、前記ＢＤＦＢを炭素源として微生物発酵法により製造するほか、中和ＢＤＦＢを炭素源として製造することもできる。

なお、本実施形態においては、図７または図８に示すとおり、精製グリセリンを炭素源とした場合には、室温（約４０℃付近まで）で固形のＰＨＡを製造することができ、ＢＤＦＢまたは中和ＢＤＦＢを炭素源とした場合には、室温で流動性を有するＰＨＡを製造することができる。

また、本発明に係るＰＨＡの製造方法においては、精製グリセリンやＢＤＦＢ、中和ＢＤＦＢをそのまま唯一の炭素源として用いてもよく、また精製グリセリンやＢＤＦＢ、中和ＢＤＦＢに脂肪酸、糖等を炭素源を添加して用いてもよい。

また、本発明に係るＰＨＡの製造方法においては、精製グリセリンやＢＤＦＢ、中和ＢＤＦＢを炭素源として培地に用いることにより、微生物を培養してＰＨＡを生産することができる方法であれば、一段階培養や二段階培養のみならず、より多くの段階（ステップ）を経る培養を採用してもよい。なお、前記二段階培養は、培地中の制限したい窒素源や無機塩類等が微生物の増殖により消費され欠乏するように調製した培地を用いることにより、一の培養装置内にて行うことも可能である。よって、本発明に係る一段階培養とは、一の培養段階でＰＨＡを発酵合成する培養であり、窒素源と炭素源とを加えた栄養豊富な培地中において微生物の増殖とＰＨＡの蓄積とを同時に行わせることによりＰＨＡを発酵合成する方法のみならず、前述のように培地中の制限したい窒素源や無機塩類等が微生物の増殖により消費され欠乏するように調製した培地を用いることにより、一の培養装置内にて行う培養も含まれる。

例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）は、通常ＰＨＡを生産するのに二段階培養が必要な微生物であるが、ＢＤＦＢまたは中和ＢＤＦＢを炭素源とすることで、生産量の低下を示すことなく、一段階培養により３ＨＢをモノマーユニットとして含まないＰＨＡを生産することができる。このように、一段階培養が可能になることにより、作業工程や必要な装置を軽減することができることから、本発明に係るＰＨＡの製造方法は工業生産に適用しているといえる。

また、本発明に係るＰＨＡの製造方法においては、培養時間を制御することにより２種類の組成比率を有するＰＨＡを選択して製造することができる。つまり、培養時間を一定時間より短く設定することにより、３ＨＯが第１組成のモノマーユニットであって、３ＨＤが第２組成のモノマーユニットであるＰＨＡを製造することができ、培養時間を一定時間より長く設定すれば、３ＨＤが第１組成のモノマーユニットであって、３ＨＯが第２組成のモノマーユニットであるＰＨＡを製造することができる。前記２種類のＰＨＡは、組成比率が相違することから、粘度や接着性、剪断特性等の異なる性質を有するＰＨＡとなり、利用方法に応じて目的の性質のＰＨＡを選択して製造することが可能である。

さらに、本発明に係るＰＨＡの製造方法においては、精製グリセリンやＢＤＦＢ、中和ＢＤＦＢを炭素源としてＰＨＡを生産できる微生物であれば特に限定されないが、本実施形態においては、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）やシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）、アロクロマチウム・ヴィノッサム（Allochromatium vinosum）、ズーグレア・ラミゼア（Zoogloea ramigera）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）、Rhisobium meliloti、アシネトバクター属（Acinetobacter sp.）、アルカリゲネスレータス（Alcaligenes latus）、Thiocystis violacea、Thiocapsa phennigii、Synechocystis sp. PCC6803、シュードモナスエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）等のＰＨＡ天然生産微生物の他、遺伝子組換え技術によりＰＨＡの生産能を人工的に付与した組換え微生物等が用いられている。

例えば、ＰＨＡの生産量を向上をさせたい場合は、窒素制限条件下で培養することによってＰＨＡ生成が誘導される微生物が好ましく、本実施形態において用いられているラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）やシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）の他、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）等が用いられることが好ましい。一方、３ＨＢをモノマーユニットとして含まないＰＨＡを製造させたい場合は、シュードモナス属に属する微生物が好ましく、例えば本実施形態において用いられているシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）や所望の形質転換されたＰＨＡ生成組み換え微生物が用いられることが好ましい。本実施形態においては、ＰＨＡ含有量および生成量の点から、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）が好ましい態様として用いられている。

また、本発明に係るＰＨＡの製造方法においては、ＰＨＡの生成能を有する組換え微生物であれば導入する酵素遺伝子や遺伝子の由来、宿主は特に限定されない。例えば、導入することができる酵素遺伝子としては、ＰＨＡ生成細菌由来ＰＨＡ生成酵素遺伝子や人工的に作成されたヒドロキシアルカノイルＣｏＡ重合能を有するたんぱく質をコードするＤＮＡ等とモノマー供給関連酵素遺伝子（アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子、β−ケトチオラーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドラターゼ等）を挙げることができ、宿主としては大腸菌（E.coli)、枯草菌（Bacillus subtilis）、巨大菌（Bacillus megateriumu）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）等を挙げることができる。

なお、本実施形態のＰＨＡ製造方法においては、一般的に汎用されているラルストニア・ユートロファ由来のＰＨＡを生成する酵素をコードする遺伝子である、ＮＡＤＰＨ−アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子とβ−ケトチオラーゼとＰＨＡ重合酵素とを大腸菌（E.coli）に導入したＰＨＡ生成組換え大腸菌を使用している。

また、本発明に係るＰＨＡの製造方法における微生物発酵法の培養方法として、培地添加のタイミングは特に限定されない。つまり、回分培養のみならず、工業生産に有利な流加培養法や連続培養法においてもＰＨＡを製造することが可能である。なお、本実施形態においては、流加培養法または連続培養法が用いられている。

なお、微生物の培養温度は、微生物の属種、培養方法、基質特異性や基質の溶解性、生産性に応じて適宜選択されればよいが、用いる微生物が成育・増殖し、ＰＨＡを生成可能な範囲の培養温度であればよく、好ましくは３０〜４５℃である。

さらに、ＰＨＡの抽出・精製工程は、常法によって行うことができる。例えば、培養液を遠心分離器によって回収し、蒸留水およびメタノールで洗浄して、減圧または凍結乾燥して乾燥菌体を得、乾燥菌体をクロロホルムに懸濁してＰＨＡを加温抽出し、菌体を除去した後、メタノールによりＰＨＡを沈殿回収する方法等がある。

以下、本発明に係るＰＨＡおよびＰＨＡの製造方法の実施例について説明する。なお、本発明の範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

油脂をエステル交換反応することにより得られたバイオディーゼル燃料の副産物（ＢＤＦＢ）の組成を調べるため、財団法人日本食品分析センターに当該組成の分析を依頼した。その結果を図１に示す。なお、当該組成のうち、グリセリンについてはガスクロマト法により、脂肪酸を含むエーテル可溶化分についてはソックスレー抽出法により、強熱残分については直接灰化法（測定条件として、温度：５５０℃、恒量）により、エーテル可溶化分のうち脂肪酸組成についてはガスクロマト法により、メタノールについてはガスクロマト法により分析されている。なお、重金属については硫化ナトリウム比色法により分析されているが、５ｐｐｍを検出限界として検出されなかった。また、ＢＤＦＢ１０％水溶液についてガラス電極法によりｐＨが測定されており、結果はｐＨ１０．３であった。

次に、既知のＰＨＡ生成細菌を用いて、ＢＤＦＢとグリセリンとを炭素源とした培地におけるＰＨＡの生産性を比較した。

まずはフラスコにてＰＨＡ生成試験を行った。具体的には、まず、フリーズストックされているＪＭ１０９／ｐＴＩ３０５、ラルストニア・ユートロファＡＴＣＣ１７６９９（Ralstonia eutropha ATCC17699）、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０（Pseudomonas putida KT2440）の既知のＰＨＡ生成微生物３種をＮＲ培地６ｍＬに植菌し、３０℃で一晩浸振とう培養した。

ＪＭ１０９／ｐＴＩ３０５は、大腸菌ＪＭ１０９（E.coli.JM109）に、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来のｐｈａＣＡＢを組み込んだプラスミドｐＴＩ３０５を導入したＰＨＡ生成組換え大腸菌である（Polyhydroxyalkanoate synthase from Bacillus sp. INT005 is composed of PhaC and PhaR. Journal of Bioscience and Bioengineering v94, p. 343-350 (2002)）。

次に、５００ｍＬ羽根付き三角フラスコ（イワキ製）で調製したＭＳ培地１００ｍＬに中和ＢＤＦＢまたはグリセロールを１％（ｗｔ／ｖｏｌ）加えた培地に、上記にて得られた培養液５ｍＬを加えて、３０℃，１６０ｒｐｍで培養した。２４時間後にさらにＢＤＦＢまたはグリセロールを１％（ｗｔ／ｖｏｌ）加えて４８時間培養した。培養後、菌体を遠心分離によって回収し、蒸留水および５％メタノールで洗浄した後、減圧または凍結乾燥して乾燥菌体を得た。

なお、本実施例で用いているＮＲ培地およびＭＳ培地の組成は、以下の通りである（J. Bacteriol. V179, p4821-4830 (1997)、Appl. Microbiol. Biotechnol. V45 , p363-370 (1996)）。

（ＮＲ培地の組成）培地１Ｌ中
バクトイーストエクストラクト３ｇ
バクトペプトン１０ｇ
エルリッヒカツオエキス１０ｇ

（ＭＳ培地）培地１Ｌ中
リン酸水素二ナトリウム３．６ｇ
リン酸二水素カリウム１．５ｇ
塩化アンモニウム０．５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物０．０１０４ｇ
トレースエレメント水溶液０．０５ｍＬ

＜ＰＨＡの生成量＞
このようにして得られた乾燥菌体を、１５重量％濃度の硫酸メタノール溶液２ｍＬとクロロホルム２ｍＬとの混合液に懸濁し、１００℃で１４０分間処理しアルコリシスした。冷却後、超純水を１ｍＬ加えよく混合し静置し２層に分離させ、この下層を回収しフィルター濾過により不溶物を除去した。このうち０．５ｍＬと、０．１ｖｏｌ％カプリル酸メチルを含むクロロホルム溶液０．５ｍＬとを混合し、ＦＩＤを備えたキャピラリーガスクロマトグラフＧＣ−２０１０（島津製作所製）にて昇温分析し、モノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。カラムには、ヒューズド・シリカ・キャピラリーカラムＤＢ−５（カラム内径０．２５ｍｍ、液層膜厚０．２５μｍ、カラム長３０ｍ；島津製作所社製）を使用した。なお、分析条件は、初発温度９０℃、５分、昇温速度５℃／分、最終温度２５０℃、２分にて行った。得られた各ＰＨＡの生成量を図２に示す。

図２に示される通り、炭素源としてグリセリンと中和ＢＤＦＢとを用いた場合で比較すると、ＪＭ１０９／ｐＴＩ３０５ではＰＨＡ含有量とＰＨＡ生成量とに大きな差は見られなかった。一方、ラルストニア・ユートロファＡＴＣＣ１７６９９とシュードモナス・プチダＫＴ２４４０を用いた場合、中和ＢＤＦＢを炭素源とするとＰＨＡ含有率とＰＨＡ生成量とが大幅に上昇した。

ＪＭ１０９／ｐＴＩ３０５等のＰＨＡ生成組み換え微生物は、増殖と同時にＰＨＡ生成が可能であり、ラルストニア・ユートロファＡＴＣＣ１７６９９やシュードモナス・プチダＫＴ２４４０は、窒素等の栄養素を制限した条件下で培養することによってＰＨＡ生成が誘導されるＰＨＡ生産天然菌であることから、中和ＢＤＦＢはＰＨＡ生産天然菌にとって非常に有用な炭素源であることが示された。

以上のように本実施例１によれば、既知のＰＨＡ生成細菌は炭素源としてＢＤＦＢを利用可能であるとともに、高いＰＨＡ生成量が得られることから、環境面のみならず工業生産面において非常に有用であることが示された。

炭素源としてグリセリンを添加した培地においてシュードモナス・プチダＫＴ２４４０（Pseudomonas putida KT2440）を用いてＰＨＡを生成し、得られたＰＨＡの組成を分析した。また、フラスコとファーメンタでの製造を行ってＰＨＡの生産性を比較した。フラスコでの製造は実施例１の乾燥菌体を常法により分析した結果である。なお、ファーメンタでの製造は、Biotechnology and Bioengineering v68、pp. 446-470 (2002)を参考にして行った。

ファーメンタでの製造について、具体的には、まず、フリーズストックされているシュードモナス・プチダＫＴ２４４０（Pseudomonas putida KT2440）をＮＲ培地に植菌し、３０℃で一晩浸振とう培養した。その培養液１ｍＬをＮＲ培地５０ｍＬを含む２５０ｍＬ三角フラスコ（イワキ製）に移し、３０℃にて１０時間培養した。

次に、得られた培養液２０ｍＬを、ＭＲ培地９８０ｍＬを含む３Ｌ三角フラスコに移し、３０℃で一晩培養した。その後培養液を、リン酸二水素カリウムを除いたＭＲ培地に移植した。移植時、２．７ＬのＭＲ培地を含むジャーファーメンタに３００ｍＬの培養液を添加したものをＪａｒ−１、２．５ＬのＭＲ培地を含むジャーファーメンタに５００ｍＬの培養液を添加したものをＪａｒ−２とした。攪拌速度を２００ｒｐｍ、培養温度を３０℃とし、流加培養（フェドバッチ培養）した。流加液は培地のｐＨが７．０を超えた際に添加し、２４時間までは１２０ｍＬを、２４時間から培養終了までは１８０ｍＬを、各々添加した。通気量は、２４時間までは１ｖｖｍ、２４時間から培養終了までは２ｖｖｍとした。また、菌体の増殖に伴い低下する溶存酸素濃度（ＤＯ）を、攪拌速度をコントロールすることで３０％に制御した。

なお、本実施例で用いているＮＲ培地、ＭＳ培地および流加液の組成は、以下の通りである。
（ＮＲ培地の組成）培地１Ｌ中
バクトイーストエクストラクト３ｇ
バクトペプトン１０ｇ
エルリッヒカツオエキス１０ｇ
（ＭＲ培地の組成）培地１Ｌ中、約ｐＨ７．０
リン酸水素二アンモニウム３ｇ
クエン酸０．８ｇ
グリセロール２０ｇ
硫酸マグネシウム１．４ｇ
トレースメタル溶液１０ｍＬ
（流加液の組成）１Ｌ中
グリセリン５００ｇ
硫酸マグネシウム・７水和物１ｇ

４８時間培養後、各培養液から菌体を遠心分離器によって回収し、蒸留水および５％メタノール水溶液で２回洗浄した後、減圧または凍結乾燥して乾燥菌体を得た。

＜組成分析＞
このようにして得られた各乾燥菌体をクロロホルムに懸濁し、１００℃で３時間抽出した。その後、フィルター濾過により菌体を除去後、クロロホルム抽出液にメタノールを１０倍量加えてＰＨＡを沈殿回収した。得られた各ＰＨＡを実施例１と同様の方法で、１００℃にて１４０分間メタノリシスを行った後、抽出液をＦＩＤを備えたキャピラリーガスクロマトグラフＧＣ−２０１０（島津製作所製）で昇温分析し、モノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。カラムは、ヒューズド・シリカ・キャピラリーカラムＤＢ−５（カラム内径０．２５ｍｍ、液層膜厚０．２５μｍ、カラム長３０ｍ）（島津製作所社製）を使用した。分析条件は、初発温度９０℃、５分、昇温速度５℃／分、最終温度２５０℃、２分にて行った。その結果を図２に示す。

＜分子量測定＞
また、得られた化合物の分子量をゲルパミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ測定方法は、ＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺＭ−Ｈカラム（６．０ｎｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ，東ソー製）を２本直列に接続し、移動相はクロロホルムを用いて４０℃、流速０．３ｍＬ／分にて測定した。純正のポリスチレンを用いて検量線を作成し、数平均分子量（Ｍｎ）と重量平均分子量（Ｍｗ）を算出した。その結果を図３に示す。

図３に示される通り、フラスコとファーメンタのどちらの製造方法においても３ＨＢをモノマーユニットとして含まず、３ＨＤと３ＨＯとを主成分とするＰＨＡが生成された。

以上のような本実施例２によれば、フラスコのみならずファーメンタを用いても同等のＰＨＡを製造することが可能であることが示され、工業生産に有用であることが示された。

次に、炭素源としてＢＤＦＢまたは中和ＢＤＦＢを添加した培地で製造されたＰＨＡと、グリセリンを添加した培地で製造されたＰＨＡとの組成、分子量および物性を比較した。

具体的には、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０（Pseudomonas putida KT2440）を用いてファーメンタで製造を行った。ファーメンタでの製造は、実施例２と同様に流加培養（フェドバッチ培養）によって行った。

ただし、ＢＤＦＢまたは中和ＢＤＦＢを炭素源とする場合、流加液は、ｐＨ１２のＢＤＦＢを１２１℃で１５分間オートクレーブした液体（ＢＤＦＢ）、またはＢＤＦＢをｐＨ８．０に調製後、１２１℃で１５分間オートクレーブした液体（中和ＢＤＦＢ）を用いた。このＢＤＦＢまたは中和ＢＤＦＢを基質とした時には、菌体の基質要求性が高く、流加液の添加量がファーメンタ仕込み量を超えるため、培養途中で培養液を５．７Ｌまたは６．７Ｌを各々抜き取ってから流加液の添加を継続した。培養液の抜き取りは、ｐＨがアルカリに移行して酸性になった際に行い、流加液を再度添加して同じ培養液を得るために菌体の１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以上を残した。

炭素源としてグリセリン、ＢＤＦＢ、中和ＢＤＦＢを各々用いた各培養液から、実施例２と同様に常法に従って各乾燥菌体を得た。また、組成分析および分子量測定も実施例２と同様の方法により行った。

＜ＰＨＡ組成の経時変化＞
培養時間４８時間まで経時的に各培養液からＰＨＡを分離回収して、各培養時間におけるＰＨＡの組成分析を行い、含有率を算出した。その結果を図４および図５に示す。

図４および図５に示される通り、ＢＤＦＢと中和ＢＤＦＢのいずれを炭素源とした場合でも、３ＨＢをモノマーユニットとして含まず、かつ３ＨＤと３ＨＯとを主成分とするＰＨＡが生成された。また、培養時間が十数時間において、第１組成が３ＨＯであって第２組成が３ＨＤであるＰＨＡから、第１組成が３ＨＤであって第２組成が３ＨＯであるＰＨＡに変化し、培養時間により組成の異なるＰＨＡが生産された。

また、第１組成が３ＨＯであって第２組成が３ＨＤであるＰＨＡと、第１組成が３ＨＤであって第２組成が３ＨＯであるＰＨＡでは、粘性が肉眼上明らかに異なり、第１組成が３ＨＯであって第２組成が３ＨＤであるＰＨＡは粘性が低くて流動性を有し、第１組成が３ＨＤであって第２組成が３ＨＯであるＰＨＡは粘性が高い性質を有していた。

＜組成分析＞
前述と同様に、培養時間２４時間および４８時間後に各培養液からＰＨＡを各々分離回収し、キャピラリーガスクロマトグラフＧＣ−２０１０にて各ＰＨＡの組成分析を行ったところ、培養時間２４時間と４８時間において、各ＰＨＡの組成は同様であった。４８時間培養後の結果を図６に示す。

図６に示される通り、ＢＤＦＢおよび中和ＢＤＦＢを炭素源としても、３ＨＢをモノマーユニットとして含まず、３ＨＤと３ＨＯとを主成分とするＰＨＡが生成された。そして、グリセリンを炭素源とするＰＨＡは、３ＨＯと３ＨＤの含有率に差がみられ、３ＨＯに比べて３ＨＤの含有率が高く示された。一方、ＢＤＦＢおよび中和ＢＤＦＢを炭素源とするＰＨＡは３ＨＯと３ＨＤの含有率に大きな差は示されなかった。

また、２４時間と４８時間の培養によるＰＨＡの組成変化がないことから、ＢＤＦＢおよび中和ＢＤＦＢを炭素源とする場合、流加培養（フェドバッチ培養）による連続培養が可能であることが示唆された。

＜分子量およびＴｇ測定＞
また、前述と同様に、４８時間培養後に各培養液からＰＨＡを分離回収し、ＧＰＣにて分子量を測定し、熱量分析装置（ＴＧＡ）と示差走査熱量測定装置（ＤＳＣ）にてＴｇを決定した。ＴＧＡの測定は、BRUKER AXS TG-DTA 2010（BRUKER社）を使用し、窒素中にて１０℃／分の昇温速度で室温から５００℃まで測定を行った。ＤＳＣ測定は、BRUKER AXS DSC 3100を使用し、窒素中にて１０℃／分の昇温速度で−５℃から２１０℃まで測定を行った。その結果を図７に示す。

図７に示される通り、いずれを炭素源として用いた場合においても分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．５から２．０であり、Ｔｇは−４８℃以下を示した。一方、グリンセリンを炭素源とするＰＨＡは室温（約４０℃付近まで）において固形であるのに対し、ＢＤＦＢまたは中和ＢＤＦＢを炭素源とするＰＨＡは室温において流動性を有していた。

＜熱特性および粘度測定＞
次に、前述と同様に、４８時間培養後に各培養液からＰＨＡを分離回収し、得られたＰＨＡの熱特性および粘性を調べた。

まず、グリセリンを炭素源とするＰＨＡの粘度測定の予備実験として熱特性について調べた。具体的には、グリセリンを炭素源とするＰＨＡを６０度で１０分間放置し、状態を肉眼およびスパチュラによる触診にて観察を行った。その実験過程および結果を図８（ａ）〜（ｃ）に示す。

図８（ａ）および前述の通り、室温においてグリセリンを炭素源とするＰＨＡは室温で固形であり、６０℃では流動性を有する液状に変化した（図８（ｂ））。これをスパチュラですくって状態を観察したところ、粘性を有していた（図８（ｃ））。

つづいて、グリセリン、ＢＤＦＢおよび中和ＢＤＦＢを炭素源とするＰＨＡについて、レオメーターにて粘性を測定した。粘性の測定は、温度依存型測定によって行った。その結果を図９および図１０に示す。

図９および図１０に示される通り、ＢＤＦＢおよび中和ＢＤＦＢを炭素源とするＰＨＡは、グリセリンを炭素源とするＰＨＡに比べて粘性が低く、温度の上昇に伴った粘性の低下が観察された。グリセリンを炭素源とするＰＨＡでは、約４０℃で融け出し、４５℃以上で完全に融け、融けたＰＨＡは温度の低下とともに再び固化し、融解前に比べて粘度の上昇が観察された。

＜接着性測定＞
次に、前述の通り、４８時間培養後にグリセリンを炭素源とする培養液からＰＨＡを分離回収し、得られたＰＨＡの接着性を調べた。

具体的には、加重撓み量の測定を行った。つまり、図１１に示すように、まず、２枚のプラスチック製容器の一側面に４５℃で溶解したＰＨＡを各々０．１ｍｍ添付した（図１１（ａ））。ＰＨＡを添付した側面同士を接合して接着性を確認した（図１１（ｂ））。その後、−８０℃に３０分間放置して、容器接着部位に加重をかけて、撓み量を測定した（図１１（ｃ））。加重量は、５００ｇ、８００ｇ、１０００ｇで行った。また、加重量５８７．５ｇ、６７８．５ｇにける加重中および加重後の接着状態についての各観察図を図１２、図１３に各々示す。

図１２および図１３に示されるように、５８７．５ｇまたは６７８．５ｇの加重を容器接着部位にかけても容器同士は接着状態を保ち、加重方向に撓みが生じた（図１２（ａ）、図１３（ａ））。その後、加重を解くと撓みがなくなり、接着面は加重前の状態に戻ることが観察された（図１２（ｂ）、図１３（ｂ））。そして、加重量５００ｇ、８００ｇ、１０００ｇにおいても、図１２および図１３と同様の状態が観察され、各撓み量は、各々２．０ｍｍ、５．０ｍｍ、６．０ｍｍを示した。

以上のような本実施例３によれば、グリセリンのみならずＢＤＦＢおよび中和ＢＤＦＢを炭素源として用いても、ファーメンタにおいてＰＨＡを生産することができ、工業生産に有用であることが示された。また、グリセリンを炭素源とするＰＨＡと、ＢＤＦＢまたは中和ＢＤＦＢを炭素源とするＰＨＡとは、３ＨＯと３ＨＤの組成含有率、室温性状、ポリマー可溶性および粘度に明らかな違いがみられ、ＢＤＦＢまたは中和ＢＤＦＢを炭素源とするＰＨＡは粘着性を必要とする製品の利用に有用な特性を有することが明らかとなった。

なお、本発明に係るＰＨＡおよびＰＨＡの製造方法は、前述した実施例に限定されるものではなく、適宜変更することができる。

本発明に係るＰＨＡの製造に用いたＢＤＦＢの、財団法人日本食品分析センターによる組成分析試験の結果を表す図である。本実施例１におけるＰＨＡの生成量を示す図である。本実施例２におけるＰＨＡの組成、生成量および分子量を示す図である。本実施例３において、ＢＤＦＢを炭素源とした培地で培養した場合のＰＨＡの経時的組成変化を示す図である。本実施例３において、中和ＢＤＦＢを炭素源とした培地で培養した場合のＰＨＡの経時的組成変化を示す図である。本実施例３におけるＰＨＡの組成および生成量を示す図である。本実施例３におけるＰＨＡの分子量、Ｔｇ、室温性状および可溶性を示す図である。本実施例３におけるＰＨＡの熱特性を示す図である。本実施例３におけるＰＨＡの粘度を示す図である。本実施例３におけるＰＨＡの粘度と温度との相関とを示す図である。本実施例３におけるＰＨＡの接着性の測定過程を示す参考図である。本実施例３において、５８７．５ｇの加重をかけた場合のＰＨＡの接着性を示す観察図である。本実施例３において、６８７．５ｇの加重をかけた場合のＰＨＡの接着性を示す観察図である。

Claims

３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエートからなる群から選択される少なくとも一つをモノマーユニットとしてなるポリヒドロキシアルカノエートであって、かつガラス転移温度が−４８℃以下であることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート。
請求項１において、前記３−ヒドロキシオクタノエートの組成率と前記３−ヒドロキシデカノエートの組成率との合計が７０％以上であることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート。
請求項１または請求項２において、−５℃以上４５℃以下における粘度が１．０×１０^４ｍＰａ／ｓ以上１．２×１０^５ｍＰａ／ｓ以下であって、温度の上昇に伴って前記粘度が低下することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート。
請求項１から請求項３のいずれかにおいて、分子量分布が１から２であることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート。
油脂をエステル交換反応することにより得られたバイオディーゼル燃料の副産物を炭素源として微生物発酵法により製造することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
油脂をエステル交換反応することにより得られたバイオディーゼル燃料の副産物を中和した中和副産物を炭素源として微生物発酵法により製造することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
請求項５または請求項６において、前記微生物発酵法における培養が前記バイオディーゼル燃料の副産物または前記中和副産物を培地に用いた一段階の培養であることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
請求項５から請求項７のいずれかにおいて、第１組成のモノマーユニットが３ーヒドロキシオクタノエートであって第２組成のモノマーユニットが３−ヒドロキシデカノエートであるポリヒドロキシアルカノエート、または第１組成のモノマーユニットが３ーヒドロキシデカノエートであって第２組成のモノマーユニットが３−ヒドロキシオクタノエートであるポリヒドロキシアルカノエートを、培養時間を制御することにより選択的に製造することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
請求項５から請求項８のいずれかにおいて、前記微生物発酵法における微生物がラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）またはポリヒドロキシアルカノエート生成組換え大腸菌であることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
請求項５から請求項８のいずれかにおいて、前記微生物発酵法における微生物としてシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）を用いることにより３−ヒドロキシブチレートをモノマーユニットとして含まないポリヒドロキシアルカノエートを製造することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
請求項５から請求項１０のいずれかにおいて、前記微生物発酵法における培養が流加培養法または連続培養法により行うことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。