JP2009153507A - Process for preparation of d-glyceric acid from glycerol - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｄ−グリセリン酸生産能を有する酢酸菌をアルカリ性のグリセロール含有培地中で培養する工程を含む、Ｄ−グリセリン酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing D-glyceric acid, comprising a step of culturing acetic acid bacteria having an ability to produce D-glyceric acid in an alkaline glycerol-containing medium.
近年高騰する石油資源だけに依存しない原料転換政策として、あるいは二酸化炭素削減といった地球温暖化問題に対応する技術的概念としてバイオリファイナリーが注目されている。バイオマスは再生可能なエネルギーの中でもカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールやバイオディーゼルといったバイオ燃料の導入が世界的規模で進行している。バイオディーゼルは油脂類の主成分であるトリグリセリドをエステル交換反応により脂肪酸メチルエステルにして燃料とするが、本反応に伴って副生するグリセロールの有効利用法の開発がプロセス開発の鍵となっている。近年のバイオディーゼル使用量の急速な増加を考えると、グリセロール問題の解決は急務といえる。またオレオケミカル産業においても、石油代替・再生産可能資源である植物油脂を原料としたプロセスが導入されていることから、同様にグリセロールの有効活用が大きな問題となっている。 In recent years, biorefinery has attracted attention as a raw material conversion policy that does not depend only on soaring petroleum resources, or as a technical concept that addresses global warming issues such as carbon dioxide reduction. Biomass is carbon neutral among renewable energy, and the introduction of biofuels such as bioethanol and biodiesel is progressing on a global scale. In biodiesel, triglycerides, the main component of fats and oils, are converted into fatty acid methyl esters by a transesterification reaction and used as fuel. . Given the rapid increase in biodiesel usage in recent years, the solution to the glycerol problem is urgent. Also, in the oleochemical industry, the effective use of glycerol is also a major problem since a process using vegetable oils and fats, which are alternative and reproducible resources for petroleum, has been introduced.
これまでに、生物的および化学的な触媒システムを用いてグリセロール（グリセリン）から有用物質を生産する試みが数多くなされており、グリセロールを原料とした化学触媒によるグリセリン酸の製造法に関しては、Ｄ，Ｌ−グリセリン酸またはその塩の製造方法（例えば特許文献１、２、３）が知られている。また、酸化能を有する微生物を用いて原料基質の酸化物を得る方法において、その原料としてグリセロールを用いることも知られていた（特許文献４）が、目的とする酸化物質は２-ケト-Ｌ-グロン酸、酢酸などであって、グリセリン酸を製造しようとするものではなかった。
Ｄ，Ｌ−グリセリン酸のうち、光学活性体のＤ−グリセリン酸は、L-セリン等のアミノ酸原料として（特許文献５）、または医薬品、農薬製造の中間体として（特許文献６）、さらには樹脂等への添加剤あるいはその原料（特許文献７）として用いられる産業上有用な化学物質である。
しかしながら、化学触媒による方法（特許文献１、２、３）ではＤ，Ｌ−グリセリン酸のラセミ体が生成し、Ｄ−グリセリン酸を得るためには、ラセミ体を化学的手段または微生物学的手段によってラセミ分割してＤ−グリセリン酸を得る（特許文献８）必要がある。従って、原料のグリセロール含有溶液から、Ｄ−グリセリン酸を直接的かつ選択的に製造する方法の開発は非常に重要である。
So far, many attempts have been made to produce useful substances from glycerol (glycerin) using biological and chemical catalyst systems. Regarding the production method of glyceric acid using glycerol as a raw material, D, A method for producing L-glyceric acid or a salt thereof (for example, Patent Documents 1, 2, and 3) is known. Further, it has been known that glycerol is used as a raw material in a method for obtaining an oxide of a raw material substrate using a microorganism having oxidizing ability (Patent Document 4), but the target oxidizing substance is 2-keto-L. -Guronic acid, acetic acid, etc., not glyceric acid.
Among D, L-glyceric acids, optically active D-glyceric acid is used as an amino acid raw material such as L-serine (Patent Document 5), or as an intermediate for producing pharmaceuticals and agricultural chemicals (Patent Document 6), and It is an industrially useful chemical substance used as an additive to a resin or the like or a raw material thereof (Patent Document 7).
However, in the method using a chemical catalyst (Patent Documents 1, 2, and 3), a racemic form of D, L-glyceric acid is generated, and in order to obtain D-glyceric acid, the racemic form is obtained by chemical means or microbiological means. To obtain D-glyceric acid by racemic resolution (Patent Document 8). Therefore, it is very important to develop a method for directly and selectively producing D-glyceric acid from a raw material glycerol-containing solution.
これまでに、グリセロールを原料としてＤ−グリセリン酸を直接製造する方法として、酢酸菌の１種であるグルコノバクター（Gluconobacter）属細菌を用いるＤ−グリセリン酸の製造方法（特許文献９）が知られているが、その培養条件は、酢酸菌一般の最適培養条件である微酸性条件（ｐＨ４〜７）である。
バイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）製造等におけるエステル交換反応は、ほとんどがアルカリ触媒法により行われるため、副生する廃グリセロール溶液（粗グリセロール）は、その製造プロセスにもよるが、一般的にｐＨ８〜１１程度のアルカリ性である。従って粗グリセロールを有効活用するという観点からみて、粗グリセロールから中和工程なしにＤ−グリセリン酸を直接生産できることが望まれる。すなわち、初発のグリセロール含有溶液のｐＨがアルカリ条件（ｐＨ８〜１１）のままでＤ−グリセリン酸が生産可能なシステムの構築が必要となる。しかしながら、これまで、アルカリ条件下で、グリセロールをＤ−グリセリン酸に変換できる微生物の報告はない。
また、エステル交換反応により副生した粗グリセロールなどの場合、一般に含まれるグリセロールの濃度が高いので、アルカリ性であることに加えて、できるだけ高濃度（例えば１５％(v/v)以上）のグリセロール濃度でも生育でき、かつＤ−グリセリン酸高生産性の微生物であることは、さらに望まれる特性である。しかし、特許文献９に記載される中性から微酸性下でのＤ−グリセリン酸製造例では、培地中のグリセロール濃度はたかだか１０％(v/v)でしかなく、満足できるものではなかった。
The transesterification reaction in the production of biodiesel fuel (BDF) and the like is mostly carried out by an alkali catalyst method. Therefore, the waste glycerol solution (crude glycerol) produced as a by-product generally has a pH of 8 to 11 depending on the production process. It is about alkaline. Therefore, from the viewpoint of effectively using crude glycerol, it is desired that D-glyceric acid can be directly produced from crude glycerol without a neutralization step. That is, it is necessary to construct a system capable of producing D-glyceric acid while keeping the pH of the first glycerol-containing solution in an alkaline condition (pH 8 to 11). However, there have been no reports of microorganisms that can convert glycerol to D-glyceric acid under alkaline conditions.
In addition, in the case of crude glycerol produced as a by-product by transesterification, since the concentration of glycerol generally contained is high, the concentration of glycerol is as high as possible (for example, 15% (v / v) or more) in addition to being alkaline. However, it is a further desired characteristic that it is a microorganism that can grow and has high productivity of D-glyceric acid. However, in the example of producing D-glyceric acid under neutral to slightly acidic conditions described in Patent Document 9, the glycerol concentration in the medium was only 10% (v / v), which was not satisfactory.
本発明は、アルカリ性条件下のグリセロール含有培地で微生物によりＤ−グリセリン酸を製造する方法を提供することを目的とする。また、そのことにより、植物油脂等のエステル交換反応において副生するアルカリ性の粗グリセロールを直接Ｄ−グリセリン酸に変換できる副生物の有効利用法を提供することも目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing D-glyceric acid by a microorganism in a glycerol-containing medium under alkaline conditions. It is another object of the present invention to provide an effective utilization method of a by-product that can directly convert alkaline crude glycerol by-produced in a transesterification reaction of vegetable oils and fats to D-glyceric acid.
上述した目的を達成するため、本発明者等は、グリセロールから光学活性なグリセリン酸を生産可能な微生物を探索すべく鋭意検討した結果、酢酸菌に属する微生物が、通常の至適生育条件は中性から微酸性条件であるにもかかわらず、アルカリ性条件下のグリセロール含有培地を用いてもＤ−グリセリン酸生産能を示すばかりか、むしろ微酸性条件下での生産性以上の生産性を示すという驚くべき結果を見出し、本願発明に至った。 In order to achieve the above-mentioned object, the present inventors have intensively studied to search for microorganisms capable of producing optically active glyceric acid from glycerol. As a result, microorganisms belonging to acetic acid bacteria have medium optimal growth conditions. Despite being acidic to slightly acidic conditions, using a glycerol-containing medium under alkaline conditions not only shows the ability to produce D-glyceric acid, but rather shows higher productivity than productivity under slightly acidic conditions. A surprising result was found and the present invention was reached.
すなわち本発明は、以上の知見を得て完成することができたものであり、具体的には以下の通りのものである。
〔１〕 グリセロールを基質とするＤ−グリセリン酸の製造方法であって、Ｄ−グリセリン酸生産能を有する酢酸菌を、アルカリ性のグリセロール含有培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、Ｄ−グリセリン酸の製造方法。
〔２〕 前記酢酸菌が、グルコノバクター（Gluconobacter）属、アセトバクター（Acetobacter）属、又はグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属の細菌から選ばれることを特徴とする、前記〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕 前記グリセロール含有培地の初発ｐＨがｐＨ８〜９であることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕 前記グリセロール含有培地が、トリグリセリドのエステル交換反応により副生した廃グリセロール溶液（粗グリセロール）であることを特徴とする、前記〔３〕に記載の製造方法。
That is, the present invention has been completed by obtaining the above knowledge, and specifically, is as follows.
[1] A method for producing D-glyceric acid using glycerol as a substrate, comprising the step of culturing an acetic acid bacterium having D-glyceric acid-producing ability in an alkaline glycerol-containing medium. -Manufacturing method of glyceric acid.
[2] The production according to [1], wherein the acetic acid bacterium is selected from bacteria belonging to the genus Gluconobacter, Acetobacter, or Gluconacetobacter. Method.
[3] The production method according to [1] or [2], wherein the initial pH of the glycerol-containing medium is pH 8-9.
[4] The production method according to [3], wherein the glycerol-containing medium is a waste glycerol solution (crude glycerol) by-produced by a transesterification reaction of triglyceride.
本発明により、トリグリセリドのエステル交換反応により副生した粗グリセロールなどのアルカリ性グリセロール含有溶液を用いて、効率よく高生産性で、工業的利用価値の高いＤ−グリセリン酸を製造することができる。 According to the present invention, using an alkaline glycerol-containing solution such as crude glycerol by-produced by transesterification of triglyceride, D-glyceric acid with high productivity and high industrial utility value can be produced.
本発明に用いる微生物としては、エタノールから酢酸を生産する酢酸菌に属する細菌であれば,どのような細菌であっても用いることができる。
典型的には、アセトバクター属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属に属し、グリセロールをＤ−グリセリン酸へと変換する能力を有している微生物を用いることができる。具体的な細菌の例としては、アセトバクターアセティ（Acetobacter aceti）NBRC14818株、アセトバクターシビノンジェンシス（Acetobacter cibinongensis）NBRC16605株、アセトバクターエスチュネンシス（Acetobacter estunensis）NBRC13751株、アセトバクターインドネシエンシス（Acetobacter indonesiensis）NBRC16471株、アセトバクターラバニエンシス（Acetobacter lovaniensis）NBRC13753株、アセトバクターオリエンタリス（Acetobacter orientalis）NBRC16606株、アセトバクターパスツリアヌス（Acetobacter pasteurianus）NBRC3188株、アセトバクターペルオキシダンス（Acetobacter peroxydans）NBRC13755株、アセトバクターシジギ（Acetobacter syzygii）NBRC16604株、アセトバクタートロピカリス（Acetobacter tropicalis）NBRC16470株、アセトバクター属細菌（Acetobacter sp.）NBRC3283株等が挙げられる。また、具体的なグルコンアセトバクター属細菌の例としては、グルコンアセトバクターユーロパス（Gluconacetobacter europaeus）NBRC3261株、グルコンアセトバクターハンセニ（Gluconacetobacter hansenii）NBRC14820株、グルコンアセトバクターリクファシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）NBRC12388株、グルコンアセトバクターオボディエンス（Gluconacetobacter oboediens）NBRC14822株、グルコンアセトバクターキシリナス（Gluconacetobacter xylinus）NBRC15273株、グルコンアセトバクター属細菌（Gluconacetobacter sp.）NBRC14815株等が挙げられる。一方、具体的なグルコノバクター属細菌の例としては、グルコノバクターセリナス（Gluconobacter cerinus）NBRC3262株、グルコノバクターサブオキシダンス（Gluconobacter suboxydans）NBRC3172株、グルコノバクターメラノジーナス（Gluconobacter melanogenus）NBRC3292株等が挙げられる。
さらに、本発明に用いる微生物には、グリセロールからＤ−グリセリン酸を生産することができる限り、上記微生物の同じ属に属する程度の変異株であれば包含される。これは、自然突然変異によるものであってもよいし、紫外線照射や化学的変異原処理等、何らかの物理的または化学的処理を施すことによって塩基の付加、欠失、置換等を人工的に誘発したものであってもよい。
As the microorganism used in the present invention, any bacteria can be used as long as it belongs to acetic acid bacteria that produce acetic acid from ethanol.
Typically, a microorganism belonging to the genus Acetobacter, Glucon acetobacter, or Gluconobacter and having the ability to convert glycerol into D-glyceric acid can be used. Specific examples of bacteria include Acetobacter aceti NBRC14818 strain, Acetobacter cibinongensis NBRC16605 strain, Acetobacter estunensis NBRC13751 strain, Acetobacter indonesiensis (Acetobacter indonesiensis) NBRC16471 strain Acetobacter Rabbani ene cis (Acetobacter lovaniensis) NBRC13753 strain, Acetobacter orientalis (Acetobacter orientalis) NBRC16606 strain Acetobacter path tree Ass (Acetobacter pasteurianus) NBRC3188 strain Acetobacter peroxy Dance (Acetobacter peroxydans) NBRC13755 strain Acetobacter syzygii NBRC16604 strain, Acetobacter tropicalis NBRC16470 strain, Acetobacter sp. NBRC3283 strain and the like. Further, examples of specific Gluconacetobacter bacteria, Gluconacetobacter EUR path (Gluconacetobacter europaeus) NBRC3261 strain, Gluconacetobacter Han Seni (Gluconacetobacter hansenii) NBRC14820 strain, Gluconacetobacter Riku tumefaciens (Gluconacetobacter liquefaciens) NBRC12388 strain , Gluconacetobacter oboediens NBRC14822 strain, Gluconacetobacter xylinus NBRC15273 strain, Gluconacetobacter sp. NBRC14815 strain and the like. On the other hand, specific examples of bacterium belonging to the genus Gluconobacter include Gluconobacter cerinus NBRC3262 strain, Gluconobacter suboxydans NBRC3172 strain, Gluconobacter melanogenus NBRC3292 And stocks.
Furthermore, the microorganisms used in the present invention include mutant strains of the same genus as long as they can produce D-glyceric acid from glycerol. This may be due to spontaneous mutation, or artificially induced addition, deletion, substitution, etc. of bases by applying some physical or chemical treatment such as ultraviolet irradiation or chemical mutagen treatment. It may be what you did.
一般に酢酸菌は、エタノールから酢酸を生産する能力を有しているため、耐酸性があり、至適培養ｐＨは、ｐＨ５．４からｐＨ６．３といわれている。（Singleton & Sainsbury, Dictionary of Microbiology, 1978）これまでに酢酸菌が、アルカリ性のグリセロール含有培地を用いてＤ−グリセリン酸を生産するということは知られていない。
本発明で、「アルカリ性のグリセロール含有培地中で培養する」というとき、初発ｐＨがアルカリ性（ｐＨ７＜）であることを指す。図１にも示されるように、酢酸菌は培地中のグリセロールを利用してＤ−グリセリン酸を産生するため、培養中にｐＨは徐々に下がる傾向にある。本発明においては、用いる培地のｐＨをアルカリ性に調整してから、本発明の酢酸菌を培養する。初発ｐＨはｐＨ７よりも高ければよく、好ましくはｐＨ８〜ｐＨ１１、より好ましくはｐＨ８〜ｐＨ９である。
In general, acetic acid bacteria have the ability to produce acetic acid from ethanol, and thus have acid resistance, and the optimum culture pH is said to be pH 5.4 to pH 6.3. (Singleton & Sainsbury, Dictionary of Microbiology, 1978) It has not been known so far that acetic acid bacteria produce D-glyceric acid using an alkaline glycerol-containing medium.
In the present invention, when “cultivate in an alkaline glycerol-containing medium”, it means that the initial pH is alkaline (pH 7 <). As shown also in FIG. 1, since acetic acid bacteria produce D-glyceric acid using glycerol in the medium, the pH tends to gradually decrease during the culture. In the present invention, the acetic acid bacterium of the present invention is cultured after adjusting the pH of the medium to be used to be alkaline. The initial pH should be higher than pH 7, preferably pH 8 to pH 11, more preferably pH 8 to pH 9.
これらの微生物を培養する培地中のグリセロール含有量（初発グリセロール含有量）は０．１％〜３０％（v/v）の範囲で適宜設定することができる。例えば１〜２０％（v/v）、好ましくは５〜１５％（v/v）であり、通常は１０±２％（v/v）が最も好ましいが、アセトバクター属微生物の場合は、１０〜２０％（v/v）の高濃度である方がむしろ好ましく、１５±２％（v/v）が最も好ましい。本発明においては、アルカリ性グリセロール含有溶液として、トリグリセリドのエステル交換反応により副生した廃グリセロール溶液などを用いることができるが、これら廃グリセロール溶液は一般にグリセロール濃度が高いので、１０％（v/v）以上、さらには１５±２％（v/v）という高濃度グリセロール含有溶液でのＤ−グリセリン酸生産性が高い点はきわめて大きなメリットである。
培地のグリセロール以外の基本的組成は、当該技術分野に知られるものを任意に選択することができる。窒素源としては、酵母抽出液（例えばDIFCO社製BactoTM Yeast Extractなど）、ポリペプトン、ペプトン、コーンスティープリカー等が利用でき、特に、酵母抽出液、ポリペプトンが好ましい。その際の酵母抽出液濃度は10〜25g/l、特に20±5 g/lが最適である。その他、必要に応じて、例えば Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4・7H2O、CaCl2・2H2O、FeCl3・6H2O 等の無機塩類を添加する。また、使用菌株の増殖を促進し、グリセロールからＤ−グリセリン酸への変換を促進するような有機物および無機物を適宜添加することもできる。
培養条件は特に制限はないが、例えば２５〜３５℃、好ましくは３０℃の温度で、好気条件のもと、振とう培養することができる。
このような培養条件の下、使用菌株を１〜７日間培養すると、培地中にＤ−グリセリン酸が生成される。
The glycerol content (initial glycerol content) in the medium in which these microorganisms are cultured can be appropriately set within the range of 0.1% to 30% (v / v). For example, it is 1 to 20% (v / v), preferably 5 to 15% (v / v), and usually 10 ± 2% (v / v) is most preferable. Higher concentrations of ˜20% (v / v) are preferred, and 15 ± 2% (v / v) is most preferred. In the present invention, as the alkaline glycerol-containing solution, a waste glycerol solution by-produced by a transesterification reaction of triglyceride can be used. However, since these waste glycerol solutions generally have a high glycerol concentration, 10% (v / v) As described above, the high productivity of D-glyceric acid in a high-concentration glycerol-containing solution of 15 ± 2% (v / v) is a great merit.
The basic composition other than glycerol in the medium can be arbitrarily selected from those known in the art. As the nitrogen source, yeast extract (for example, Bacto ™ Yeast Extract manufactured by DIFCO), polypeptone, peptone, corn steep liquor and the like can be used, and yeast extract and polypeptone are particularly preferable. In this case, the optimum concentration of the yeast extract is 10 to 25 g / l, particularly 20 ± 5 g / l. In addition, inorganic salts such as Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 .7H 2 O, CaCl 2 .2H 2 O, FeCl 3 .6H 2 O and the like are added as necessary. Moreover, organic substances and inorganic substances that promote the growth of the strain used and promote the conversion of glycerol to D-glyceric acid can be added as appropriate.
The culture conditions are not particularly limited. For example, the culture can be performed with shaking at a temperature of 25 to 35 ° C., preferably 30 ° C. under aerobic conditions.
When the strain to be used is cultured for 1 to 7 days under such culture conditions, D-glyceric acid is produced in the medium.
また、酢酸菌菌体またはその処理物をアルカリ条件下でグリセロールに作用させることによりＤ−グリセリン酸を生成させる場合にも、酢酸菌の培養には前述の培地組成および培養条件を用いることができるが、その場合には酢酸菌の至適培養ｐＨであるｐＨ５．４からｐＨ６．３で培養することが好ましい。酢酸菌菌体としては、例えば菌体そのもの、または菌体を含有した培養液等が挙げられる。一方、菌体処理物としては、例えば超音波処理、凍結乾燥処理、乾燥処理、機械的破砕処理、界面活性剤処理、酵素処理した菌体等が挙げられる。これらを用いてアルカリ条件下で反応させることで、水溶液中にＤ−グリセリン酸を生成させることができる。 In addition, in the case where D-glyceric acid is produced by allowing acetic acid bacterial cells or treated products thereof to act on glycerol under alkaline conditions, the above-mentioned medium composition and culture conditions can be used for cultivation of acetic acid bacteria. However, in that case, it is preferable to culture at pH 5.4 to pH 6.3, which is the optimum culture pH of acetic acid bacteria. Examples of the acetic acid bacterial cells include the bacterial cells themselves or a culture solution containing the bacterial cells. On the other hand, examples of the microbial cell processed product include ultrasonic cells, freeze-drying processing, drying processing, mechanical crushing processing, surfactant processing, enzyme-treated microbial cells, and the like. D-glyceric acid can be produced | generated in aqueous solution by making it react under alkaline conditions using these.
培養液中に生成蓄積されたＤ−グリセリン酸の単離、精製は当業者が任意の方法により行うことができるが、遠心分離等の方法により菌体を除去した後の反応液を、例えば、イオン交換樹脂による分離方法、カルシウム・マグネシウムイオン等との金属塩とする分離方法、エステル体にしたのち蒸留する分離方法等により単離、精製することができる。 Isolation and purification of D-glyceric acid produced and accumulated in the culture solution can be carried out by those skilled in the art by any method. For example, the reaction solution after removing the cells by a method such as centrifugation is used, for example, It can be isolated and purified by a separation method using an ion exchange resin, a separation method using a metal salt with calcium, magnesium ions, or the like, a separation method in which an ester is formed and then distilled.
以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
なお下記実施例におけるグリセロールおよびＤ−グリセリン酸の定量は糖と有機酸を同時に分析するカラム（Shodex社製 SH1011）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）にて行った。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
In the following Examples, glycerol and D-glyceric acid were quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) using a column (SH1011 manufactured by Shodex) that simultaneously analyzes sugar and organic acid.
（実施例１）
各種微生物保存機関より入手した酢酸菌、アセトバクタートロピカリス NBRC16470株、グルコンアセトバクターハンセニ NBRC14820株、およびグルコノバクターセリナス NBRC3262株をグルコース0.5%、酵母抽出液0.5%、ポリペプトン0.5%、MgSO4・7H2O 0.5%の組成を有する前培養培地（５ ml／試験管）に植菌し、３０℃で４８時間往復振とう培養を行った。次いで、表１に示す組成で初発グリセロール濃度が１０％（v/v）の培地３０ mLが入った３００ mL容三角フラスコに上記培養液を１.５ mLずつ植菌した。培養は、温度３０℃、振とう２００ rpmで行った。
Acetic acid bacteria, Acetobacter tropicalis NBRC16470 strain, Gluconacetobacter Hanseni NBRC14820 strain, and Gluconobacter serinas NBRC3262 strain obtained from various microorganism preservation institutions with 0.5% glucose, 0.5% yeast extract, 0.5% polypeptone, MgSO 4 -A preculture medium (5 ml / test tube) having a composition of 7H 2 O 0.5% was inoculated, and reciprocal shaking culture was performed at 30 ° C for 48 hours. Next, 1.5 mL of the above culture solution was inoculated in a 300 mL Erlenmeyer flask containing 30 mL of a medium having the composition shown in Table 1 and an initial glycerol concentration of 10% (v / v). The culture was performed at a temperature of 30 ° C. and shaking at 200 rpm.
前述した方法による本培養開始後、４日後の培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清中のＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表２の通りであった。
（実施例２）
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例１と同じ前培養を行い、次いで、表１に示す組成で初発グリセロール濃度が１０、１５、２０％（v/v）の培地３０ mLの入った３００ mL容三角フラスコに上記培養液を１．５ mLずつ植菌し、実施例１と同様に本培養を行った。本培養開始４日後に生成したＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表３の通りであった。
Acetobacter tropicalis NBRC16470 strain was subjected to the same pre-culture as in Example 1, and then 300 mL containing 30 mL of medium having an initial glycerol concentration of 10, 15, and 20% (v / v) with the composition shown in Table 1. 1.5 mL each of the above culture solution was inoculated into an Erlenmeyer flask, and main culture was performed in the same manner as in Example 1. When the amount of D-glyceric acid produced 4 days after the start of the main culture was quantified, it was as shown in Table 3 below.
（実施例３）
上記検討した初発グリセロール濃度のうち、Ｄ−グリセリン酸生産量が最も高かった１５%（v/v）を実施例３以降の実験に用いた。アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例１と同じ前培養を行い、次いで表４に示す組成のうち、窒素源（0.5 g/l）としてポリペプトン（日本製薬製）、ぺプトン（DIFCO社製BactoTM Pepton）、酵母エキス（DIFCO社製BactoTM Yeast Extract）、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムをそれぞれ0.5 g/l入れた培地を用いて、実施例１と同様に本培養を行った。本培養開始４日後に生成したＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表５の通りであった。
Of the initial glycerol concentrations examined above, 15% (v / v), which produced the highest amount of D-glyceric acid, was used in the experiments in and after Example 3. Acetobacter tropicalis NBRC16470 strain was precultured in the same manner as in Example 1, and among the compositions shown in Table 4, as a nitrogen source (0.5 g / l), polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical), peptone (DIFCO Bacto TM) Pepton), yeast extract (DIFCO Co. Bacto TM yeast extract), ammonium sulfate, using a medium of sodium nitrate were each placed in 0.5 g / l, were subjected to the same main culture as in example 1. When the amount of D-glyceric acid produced 4 days after the start of the main culture was quantified, it was as shown in Table 5 below.
（実施例４）
上記検討した窒素源のうち、Ｄ−グリセリン酸生産量が最も高かった酵母エキス（DIFCO社製BactoTM Yeast Extract）を実施例４以降の実験に用いた。アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例１と同じ前培養を行い、次いで表６に示す組成のうち、酵母エキス濃度を5〜40 g/lとした培地を用いて、実施例１と同様に本培養を行った。本培養開始４日後に生成したＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表７の通りであった。
Among the nitrogen sources examined above, the yeast extract (Bacto ™ Yeast Extract manufactured by DIFCO) that produced the highest amount of D-glyceric acid was used in the experiments of Example 4 and later. Acetobacter tropicalis NBRC16470 strain was precultured in the same manner as in Example 1, and then the same composition as in Example 1 was used using a medium having a yeast extract concentration of 5 to 40 g / l among the compositions shown in Table 6. Culture was performed. When the amount of D-glyceric acid produced 4 days after the start of the main culture was quantified, it was as shown in Table 7 below.
（実施例５）
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株、グルコンアセトバクターハンセニ NBRC14820株、およびグルコノバクターセリナス NBRC3262株について実施例１と同じ前培養を行い、次いで表８に示す組成の培地をｐＨ７〜９に調整した培地を用いて、実施例１と同様に本培養を行った。本培養開始４日後に生成したＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の表９の通りであった。このようにいずれの菌株も、培地の初発ｐＨをｐＨ８,９といったアルカリ側に調整しても、１５％(v/v)という高濃度グリセロール含有培地であるにもかかわらず、Ｄ−グリセリン酸能を有しており、特にアセトバクタートロピカリス
NBRC16470株およびグルコノバクターセリナス NBRC3262株では、中性よりもアルカリ性側でＤ−グリセリン酸の生産量は増加している。また反応液を遠心分離後、強陰イオン交換樹脂、ダウエックス1-X8 (Cl型)（ダウケミカル社製）を用いてＤ−グリセリン酸を溶出後、光学分割用カラム、キラルパックMA(+)（ダイセル化学工業製）を用いてHPLC分析した。その結果、Ｄ−グリセリン酸標品（シグマ社）とピークの保持時間が完全に一致した。
Acetobacter tropicalis NBRC16470 strain, Gluconacetobacter Hanseni NBRC14820 strain, and Gluconobacter serinas NBRC3262 strain were precultured in the same manner as in Example 1, and then a medium having the composition shown in Table 8 was adjusted to pH 7-9. Was used in the same manner as in Example 1. When the amount of D-glyceric acid produced 4 days after the start of the main culture was quantified, it was as shown in Table 9 below. As described above, even when the initial pH of the medium is adjusted to an alkaline side such as pH 8.9, all the strains have D-glyceric acid ability despite being a medium containing glycerol having a high concentration of 15% (v / v). Especially Acetobacter tropicalis
In NBRC16470 strain and Gluconobacter serinas NBRC3262 strain, the production amount of D-glyceric acid is increased on the alkaline side rather than neutral. After the reaction solution was centrifuged, D-glyceric acid was eluted using a strong anion exchange resin, Dowex 1-X8 (Cl type) (manufactured by Dow Chemical Co.), and then an optical resolution column, Chiral Pack MA (+ ) (Manufactured by Daicel Chemical Industries). As a result, the D-glyceric acid preparation (Sigma) and the peak retention time were completely matched.
（実施例６）
アセトバクタートロピカリス NBRC16470株について実施例１と同じ前培養を行った。次いで、表６に示す組成の培地（ただし、酵母抽出液濃度は２０ g/l、ｐＨ8.2）５００ mlが入った1 L容ミニジャーに上記培養液を２５mlずつ植菌した。培養は、温度30℃、通気量0.8 vvm、攪拌５００ rpmで行った。生成したＤ−グリセリン酸量を定量したところ、下記の図１の通りであり、４日間の反応で25.1 g/lであった。このように、初発ｐＨをアルカリ性に調整しても、２４時間以上培養を続けると通常培地のｐＨは徐々に中性から微酸性に変化する傾向があることがわかった。
(Example 6)
Acetobacter tropicalis NBRC16470 strain was subjected to the same preculture as in Example 1. Next, 25 ml of the above culture solution was inoculated in a 1 L miniger containing 500 ml of a medium having the composition shown in Table 6 (where the yeast extract concentration was 20 g / l, pH 8.2). The culture was performed at a temperature of 30 ° C., an aeration rate of 0.8 vvm, and stirring at 500 rpm. When the amount of produced D-glyceric acid was quantified, it was as shown in FIG. 1 and was 25.1 g / l after 4 days of reaction. Thus, even when the initial pH was adjusted to be alkaline, it was found that the pH of the normal medium tends to gradually change from neutral to slightly acidic when the culture is continued for 24 hours or more.
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| JP2011254778A (en) * | 2010-06-11 | 2011-12-22 | Kao Corp | Method of producing l-glyceric acid by microorganism |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01168292A (en) * | 1987-12-25 | 1989-07-03 | Daicel Chem Ind Ltd | Production of d-glyceric acid |
| JP2006180782A (en) * | 2004-12-27 | 2006-07-13 | Hiroshima Univ | Method for producing hydrogen and ethanol from biodiesel waste liquid and kit for performing the method |
| JP2009050250A (en) * | 2007-05-11 | 2009-03-12 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Method for producing glyceric acid |
| JP2009159826A (en) * | 2007-12-28 | 2009-07-23 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Method for producing d-glyceric acid from glycerol |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01168292A (en) * | 1987-12-25 | 1989-07-03 | Daicel Chem Ind Ltd | Production of d-glyceric acid |
| JP2006180782A (en) * | 2004-12-27 | 2006-07-13 | Hiroshima Univ | Method for producing hydrogen and ethanol from biodiesel waste liquid and kit for performing the method |
| JP2009050250A (en) * | 2007-05-11 | 2009-03-12 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Method for producing glyceric acid |
| JP2009159826A (en) * | 2007-12-28 | 2009-07-23 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Method for producing d-glyceric acid from glycerol |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6012031722; Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｖｏｌ．８１, 2009, ｐｐ．１０３３-１０３９ * |
| JPN6012031723; Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｖｏｌ．６０, 2002, ｐｐ．２３３-２４２ * |
| JPN6012031724; Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．７５， Ｎｏ．２４, 2009, ｐｐ．７７６０-７７６６ * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009159826A (en) * | 2007-12-28 | 2009-07-23 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Method for producing d-glyceric acid from glycerol |
| JP2011254778A (en) * | 2010-06-11 | 2011-12-22 | Kao Corp | Method of producing l-glyceric acid by microorganism |
Also Published As
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