JP2009153448A - Hydrolase complex of silica-based meso porous body-starch - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、シリカ系メソ多孔体と澱粉の加水分解酵酵素の複合体に関するものであり、更に詳しくは、表面を未処理あるいは適切な溶液で官能基を付与する処理等を施したシリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、該酵素の固定化法として利用して合成されたシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体、その製造方法、及びその用途に関するものである。 The present invention relates to a composite of a silica-based mesoporous material and a starch hydrolyzing enzyme, and more specifically, a silica-based meso having a surface untreated or treated with an appropriate solution to give a functional group. The present invention relates to a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex synthesized using the enzyme adsorption phenomenon on a porous material as a method for immobilizing the enzyme, a method for producing the same, and use thereof.
本発明は、表面を未処理あるいは適切な溶液で官能基を付与する処理等を施したシリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、該酵素の固定化法として利用し、シリカ系メソ多孔体の細孔内若しくは表面に酵素を安定に固定して、その酵素の機能を発揮させることを可能としたシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体、その製造方法、及びその用途に関する新技術を提供するものである。 The present invention utilizes the phenomenon of enzyme adsorption on a silica-based mesoporous material whose surface is untreated or treated with an appropriate solution to give a functional group as a method for immobilizing the enzyme, TECHNICAL FIELD The present invention relates to a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex capable of stably immobilizing an enzyme in the pores or on the surface of the body and exerting the function of the enzyme, its production method, and its use It provides new technology.
本発明は、例えば、酵素を利用した生化学品、食品製造等の技術分野において、酵素の安定性や耐久性、生産速度の向上等へ寄与するばかりか、連続的生産手法の確立を可能とすると共に、生産物からの酵素の分離工程を排除することが可能であり、その工程を、従来技術に比べ、大幅に効率化、簡略化することを可能にする固定化酵素複合体を提供するものとして有用である。 The present invention, for example, in the technical fields of biochemical products using foods, food production, etc., not only contributes to the stability and durability of the enzyme, improvement in production speed, etc., but also enables the establishment of a continuous production method. In addition, it is possible to eliminate the step of separating the enzyme from the product, and to provide an immobilized enzyme complex that makes it possible to make the process much more efficient and simplified as compared with the prior art. Useful as a thing.
一般に、酵素を用いた生化学品、食品製造等の技術分野においては、従来、酵素を水に溶解させて用いる操作をすることが多い。この操作法では、タンパク質である酵素の溶解度に限界があり、ある一定濃度以上の酵素が存在すると凝集を起こし、活性を失うことがしばしばである。一方、酵素反応を用いた反応系では、酵素の存在量が多いほど反応速度、ひいては生成物の生産速度を高められることが予想されている。 Generally, in technical fields such as biochemical products using enzymes and food production, conventionally, there are many operations in which an enzyme is dissolved in water. In this method of operation, the solubility of an enzyme, which is a protein, is limited, and when an enzyme of a certain concentration or more is present, aggregation occurs and the activity is often lost. On the other hand, in a reaction system using an enzyme reaction, it is expected that the reaction rate and thus the product production rate can be increased as the amount of the enzyme present increases.
その一方で、シリカ系メソ多孔体は、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有することを特徴としており、その細孔内部への酵素の導入、固定が可能である。したがって、シリカ系メソ多孔体は、数ｎｍから十数ｎｍの大きさを有する酵素、すなわちタンパク質の吸着、固定に対して有効な表面を多く有している有望な担体材料と見なすことができる。 On the other hand, the silica-based mesoporous material is characterized by having pores with a diameter of 2 to 50 nm, and an enzyme can be introduced and fixed inside the pores. Therefore, the silica-based mesoporous material can be regarded as a promising carrier material having many surfaces effective for adsorption and immobilization of enzymes having a size of several nm to several tens of nm, that is, proteins.
このシリカ系メソ多孔体を酵素の固定化のための担体として用いた場合、高密度に存在する酵素の凝集を防ぐことが可能となり、活性を有する酵素の高集積化が可能となると考えられる。このことは、酵素を用いた反応系において、溶液においては凝集を起こしてしまう量を越えて、酵素を存在させることが可能になることが期待される。 When this silica-based mesoporous material is used as a carrier for immobilizing an enzyme, it is possible to prevent aggregation of the enzyme present at a high density, and it is possible to highly integrate an active enzyme. This is expected to allow the enzyme to exist beyond the amount that causes aggregation in the solution in the reaction system using the enzyme.
担体に酵素を固定化して用いることは、従前より行われてきたことであるが、その目的は、酵素の分離、及び再利用に関するものがほとんどである。例えば、従来の酵素を用いた生化学品、食品製造等の技術分野においては、酵素を水に溶解させて用いる操作をすることが多く、この操作法では、生成物と酵素の分離操作が必要不可欠であり、また、分離された酵素は、廃棄されることが一般的である。この酵素の分離工程を省く目的で、酵素を担体に固定化して用いるための酵素の固定化技術が盛んに研究、開発されている。 Although the use of an enzyme immobilized on a carrier has been performed for a long time, its purpose is mostly related to the separation and reuse of the enzyme. For example, in technical fields such as biochemicals using conventional enzymes and food production, the enzyme is often used by dissolving it in water, and this method requires the separation of the product from the enzyme. It is essential, and the separated enzyme is generally discarded. For the purpose of omitting the step of separating the enzyme, enzyme immobilization technology for immobilizing the enzyme on a carrier has been actively researched and developed.
酵素の固定化法としては、例えば、樹脂ビーズ等に直接固定化する方法や、ポリマーの被覆によるマイクロカプセル化、酵素タンパク質表面を修飾して安定化させる表面修飾法等が提案されている。しかしながら、これらの方法は、酵素が固定化担体の表面上に固定されているだけで、酵素の高集積化や固定化による酵素機能の向上を目指したものではないのが実情である。 As an enzyme immobilization method, for example, a method of directly immobilizing on resin beads or the like, a microencapsulation by coating with a polymer, a surface modification method of modifying and stabilizing the enzyme protein surface, and the like have been proposed. However, in these methods, the enzyme is merely immobilized on the surface of the immobilization carrier, and the actual situation is that it does not aim to improve the enzyme function by increasing the enzyme concentration or immobilization.
酵素の再利用を目的とした酵素の固定化も検討されている。この場合も、分離工程の排除を目的とした方法と大きな差はなく、各種担体表面への単純な固定を行っているものが多い。高分子発泡体に固定化する方法も用いられており、この場合は、発泡体を圧縮することにより、生成物を含む溶液を分離すること等の操作が行われている。 Enzyme immobilization for the purpose of enzyme reuse has also been studied. In this case as well, there is no significant difference from the method aiming at elimination of the separation step, and many are simply fixed to the surface of various carriers. A method of fixing to a polymer foam is also used. In this case, operations such as separation of a solution containing a product are performed by compressing the foam.
酵素の固定化法の開発により、酵素を用いた生産プロセスにおいて、反応後の酵素の分離回収やその再利用が可能となり、生産プロセスの効率化に貢献していることは事実である。しかし、酵素の固定化により、酵素の高集積化や酵素機能そのものの向上を目的とした検討は、十分には行われていない。 The development of the enzyme immobilization method makes it possible to separate and recover the enzyme after the reaction in the production process using the enzyme and reuse it, thereby contributing to the efficiency of the production process. However, studies for the purpose of increasing the integration of the enzyme and improving the enzyme function itself by immobilizing the enzyme have not been sufficiently performed.
このような状況下で、本発明者らは、酵素の固定化により酵素の高集積化や酵素機能そのものの向上を目的として、酵素の担体として有望なシリカ系メソ多孔体への酵素、すなわちタンパク質の吸着、固定化現象を研究し（特許文献１参照）、この過程で、酵素、すなわちタンパク質のシリカ系メソ多孔体の細孔内への固定や、タンパク質の熱安定性や有機溶媒耐性の向上を見出し、シリカ系メソ多孔体を用いたタンパク質の機能賦活方法（特許文献１、及び非特許文献１）を発明するに至った。 Under these circumstances, the present inventors aim to increase the enzyme concentration and improve the enzyme function itself by immobilizing the enzyme, that is, the enzyme, i.e., protein, into a silica-based mesoporous material that is promising as an enzyme carrier. (See Patent Document 1), and in this process, the enzyme, ie, the protein, is immobilized in the pores of the silica-based mesoporous material, and the thermal stability of the protein and the organic solvent resistance are improved. The inventors have invented protein functional activation methods (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1) using silica-based mesoporous materials.
シリカ系メソ多孔体としては、一般に、ＭＣＭ、ＦＳＭ、ＳＢＡタイプ等の材料系が知られている。これらのシリカ系メソ多孔体は、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有することを特徴としている。酵素、すなわちタンパク質は、数ｎｍから十数ｎｍの大きさを有しており、シリカ系メソ多孔体の有する細孔径と同程度の大きさの分布を有している。このことから、シリカ系メソ多孔体を酵素の固定化担体として用いた場合、酵素を表面のみならず、細孔内にも固定化することができると考えられる。 As silica-based mesoporous materials, materials such as MCM, FSM, and SBA types are generally known. These silica-based mesoporous materials are characterized by having pores having a diameter of 2 to 50 nm. The enzyme, that is, the protein has a size of several nm to several tens of nm, and has a distribution having the same size as the pore diameter of the silica-based mesoporous material. From this, it is considered that when a silica-based mesoporous material is used as an enzyme immobilization carrier, the enzyme can be immobilized not only on the surface but also in the pores.
シリカ系メソ多孔体は、その酵素の固定化に対する有効な表面積が、従来の技術によるものより極めて大きく、大量の酵素を固定化することができる。シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体においては、その細孔内に酵素を固定化することも可能であり、また、集積化することも可能である。 The silica-based mesoporous material has an effective surface area for immobilizing the enzyme much larger than that of the conventional technique, and can immobilize a large amount of enzyme. In the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex, the enzyme can be immobilized in the pores, and can also be integrated.
シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化しようとする試みに関する、いくつかの報告がある（非特許文献２、３，４）が、工業的な利用を想定した場合、種々の問題が未解決であると思われる。また、これらの報告では、後記する事例を除いて、澱粉の加水分解を起こす酵素は扱われていない。 There are some reports regarding attempts to immobilize enzymes on silica-based mesoporous materials (Non-Patent Documents 2, 3, and 4), but various problems have not been solved when industrial use is assumed. It appears to be. Moreover, these reports do not deal with enzymes that cause starch hydrolysis, except in the cases described below.
澱粉の加水分解を起こす酵素については、シリカ系メソ多孔体と酵素との相互作用、すなわち吸着作用が弱く、容易に酵素の脱離を起こすことが示されている（非特許文献５）。この問題を解決するために、同文献では、シリカ系メソ多孔体の表面に処理を加え、酵素との結合を形成する官能基をシリカ系メソ多孔体の表面に形成される方法が報告されている。しかしながら、ここで用いられている表面処理の方法は、極めて煩雑で効率の悪いものであり、また、価格的にも利点が少ないものである。生化学品、食品製造等の技術分野においては、簡便な方法で酵素の固定化が行われることが望ましいのは、言うまでもない。そのため、当該技術分野においては、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体について、酵素の固定化による機能賦活方法の開発が強く望まれていた。 It has been shown that the enzyme that causes starch hydrolysis is weak in the interaction between the silica-based mesoporous material and the enzyme, that is, the adsorption action, and easily desorbs the enzyme (Non-patent Document 5). In order to solve this problem, the same literature reports a method in which the surface of a silica mesoporous material is treated to form a functional group that forms a bond with an enzyme on the surface of the silica mesoporous material. Yes. However, the surface treatment method used here is extremely complicated and inefficient, and has few advantages in terms of price. Needless to say, in technical fields such as biochemical products and food production, it is desirable that the enzyme be immobilized by a simple method. Therefore, in this technical field, it has been strongly desired to develop a function activation method by immobilizing an enzyme for a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex.
澱粉は、通常、アミロースとアミロペクチンの混合物として存在している。アミロースは、グルコースがα−１，４−グルコシド結合している長鎖構造を有するものであり、一方、アミロペクチンは、グルコースがα−１，４−グルコシド結合のみではなく、ところどころにα−１，６−グルコシド結合を含み、枝分かれを有する構造を持つ。このように、澱粉は、グルコースをその構成単位として構成されているが、それを加水分解するためには、直鎖部分や枝分かれ部分等、種々の部位に作用する多種多様な酵素を利用することが有効である。 Starch is usually present as a mixture of amylose and amylopectin. Amylose has a long chain structure in which glucose is α-1,4-glucoside-linked, while amylopectin is not only α-1,4-glucoside-linked but also α-1,4-glucoside-linked in some places. It has a 6-glucoside bond and a branched structure. In this way, starch is composed of glucose as its structural unit, but in order to hydrolyze it, a wide variety of enzymes that act on various sites such as straight-chain and branched parts must be used. Is effective.
すなわち、由来や性状の異なる澱粉原料に対して、効率的にその加水分解を進行させるには、多種多様な酵素の働きを利用することが重要である。このことは、工業的な澱粉の加水分解において、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を利用及び適用する上でも重要なことである。 That is, it is important to utilize the action of a wide variety of enzymes in order to efficiently promote hydrolysis of starch raw materials having different origins and properties. This is also important in utilizing and applying the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex in industrial starch hydrolysis.
澱粉の加水分解を行う酵素をシリカ系メソ多孔体に固定化した例としては、α−アミラーゼをＭＣＭもしくはＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体に固定化した事例がある（非特許文献５）。しかしながら、α−アミラーゼのみで多様な澱粉原料を効率的に加水分解することは困難であることは言うまでもなく、汎用性の高い、単一もしくは複数の澱粉の加水分解能力を有する酵素が固定化されている、多種多様なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体が強く望まれている。 As an example in which an enzyme that hydrolyzes starch is immobilized on a silica-based mesoporous material, α-amylase is immobilized on an MCM or SBA-type silica-based mesoporous material (Non-patent Document 5). However, it goes without saying that it is difficult to efficiently hydrolyze various starch raw materials with only α-amylase, and a highly versatile enzyme having the ability to hydrolyze single or multiple starches is immobilized. A wide variety of silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complexes are strongly desired.
このような状況下において、本発明者らは、上記問題を解決するために鋭意研究を行い、シリカ系メソ多孔体に澱粉の加水分解を行う酵素を吸着させ、その酵素が固定化されていること、すなわちシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の形成を確認し、更に、このシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を用いて、酵素反応の特性評価を行い、固定化された酵素が所定の活性を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。 Under such circumstances, the present inventors have intensively studied to solve the above problems, adsorbing an enzyme that hydrolyzes starch to a silica-based mesoporous material, and the enzyme is immobilized. That is, confirming the formation of a hydrolytic enzyme complex of silica-based mesoporous material-starch, and further, using this silica-based mesoporous material-hydrolyzing enzyme complex of starch, characterizing the enzymatic reaction, The inventors have found that the immobilized enzyme has a predetermined activity, and have completed the present invention.
本発明は、シリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、該酵素の固定化法として利用し、澱粉の加水分解を行う酵素とシリカ系メソ多孔体の複合体であって、固定化された酵素が澱粉の加水分解を触媒する活性を有していることを特徴とする、多種多様なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を提供すること、を目的とするものである。また、澱粉の加水分解を行う際に、酵素の分離・回収を容易にし、繰り返し使用も可能とすると共に、基質を連続的に供給することで、澱粉の加水分解を連続的に進行させることができ、一般性及び普遍性が高く、かつ簡便な操作による酵素反応を利用した加水分解物の生産を可能にするシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を提供することを目的とするものである。 The present invention is a complex of an enzyme that hydrolyzes starch and a silica-based mesoporous material, using the enzyme adsorption phenomenon on the silica-based mesoporous material as a method for immobilizing the enzyme. It is an object of the present invention to provide a variety of silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complexes, wherein the enzyme has an activity of catalyzing the hydrolysis of starch. . In addition, when starch is hydrolyzed, the enzyme can be easily separated and recovered, and can be used repeatedly. By continuously supplying the substrate, the hydrolysis of starch can be continuously advanced. An object of the present invention is to provide a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex that is capable of producing a hydrolyzate that is highly general and universal and that uses an enzymatic reaction by a simple operation. Is.
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）澱粉の加水分解を行う酵素と該澱粉の加水分解酵素を固定化させたシリカ系メソ多孔体との複合体であって、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が澱粉の加水分解を触媒する活性を有していることを特徴とするシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（２）シリカ系メソ多孔体が、ケイ素と酸素を必須成分として含む化合物の多孔体である、前記（１）に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（３）シリカ系メソ多孔体が、ＭＣＭ、ＦＳＭ、又はＳＢＡタイプである、前記（１）又は（２）に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（４）シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有する、前記（１）から（３）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（５）シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有する、前記（１）から（４）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（６）シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２／ｇの比表面積を有する、前記（１）から（５）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（７）澱粉の加水分解を行う酵素が、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、若しくはアミロ−１，６−グルコシダーゼ、又はこれらの１種以上の酵素とα−アミラーゼの併用である、前記（１）から（６）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（８）シリカ系メソ多孔体へ澱粉の加水分解酵素が高濃度に高集積化させた状態で固定化されている、前記（１）から（７）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体。
（９）シリカ系メソ多孔体と澱粉の加水分解酵素を溶解した溶液を混合することにより、該澱粉の加水分解酵素をシリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に安定に吸着、保持、固定させることを特徴とするシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１０）シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御又は増大させ、高集積化する、前記（９）に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１１）シリカ系メソ多孔体が、ＭＣＭ、ＦＳＭ、又はＳＢＡタイプである、前記（９）又は（１０）に記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１２）シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有する、前記（９）から（１１）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１３）シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有する、前記（９）から（１２）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１４）シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２／ｇの比表面積を有する、前記（９）から（１３）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１５）澱粉の加水分解を行う酵素が、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、若しくはアミロ−１，６−グルコシダーゼ、又はこれらの１種以上の酵素及びα−アミラーゼである、前記（９）から（１４）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１６）シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量及び活性を制御する、前記（９）から（１５）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の製造方法。
（１７）前記（１）から（８）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を用いて澱粉の加水分解反応を行うことを特徴とする澱粉加水分解物の製造方法。
The present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
(1) A complex of an enzyme that hydrolyzes starch and a silica-based mesoporous material on which the starch-hydrolyzing enzyme is immobilized, wherein the enzyme immobilized on the silica-based mesoporous material A silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex characterized by having an activity of catalyzing decomposition.
(2) The silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex according to (1) above, wherein the silica-based mesoporous material is a porous material of a compound containing silicon and oxygen as essential components.
(3) The silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex according to (1) or (2) above, wherein the silica-based mesoporous material is MCM, FSM, or SBA type.
(4) The silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex according to any one of (1) to (3) above, wherein the silica-based mesoporous material has pores having a diameter of 2 to 50 nm.
(5) The silica-based mesoporous material according to any one of (1) to (4), wherein the silica-based mesoporous material has a total pore volume of 0.1 to 3.5 ml / g. Degradative enzyme complex.
(6) The silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex according to any one of (1) to (5) above, wherein the silica-based mesoporous material has a specific surface area of 200 to 1500 m 2 / g.
(7) An enzyme that hydrolyzes starch is β-amylase, glucoamylase, pullulanase, isoamylase, oligo-1,6-glucosidase, amylo-1,6-glucosidase, or one or more of these enzymes The silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex according to any one of (1) to (6), which is a combined use of α-amylase.
(8) The silica-based mesoporous material according to any one of (1) to (7), wherein the starch hydrolyzing enzyme is immobilized on the silica-based mesoporous material in a highly concentrated state. -Starch hydrolase complex.
(9) By mixing a silica-based mesoporous material and a solution in which starch hydrolyzing enzyme is dissolved, the starch-hydrolyzing enzyme is stably adsorbed, retained and fixed on the silica-based mesoporous material and in the pores. A method for producing a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex characterized in that:
(10) The silica-based mesoporous material-starch according to (9), wherein the enzyme is immobilized on the silica-based mesoporous material by repeating the operation of immobilizing the enzyme, thereby controlling or increasing the amount of the enzyme immobilized, thereby increasing the concentration. A method for producing a hydrolase complex.
(11) The method for producing a hydrolytic enzyme complex of silica-based mesoporous material-starch according to (9) or (10), wherein the silica-based mesoporous material is MCM, FSM, or SBA type.
(12) Production of a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex according to any one of (9) to (11), wherein the silica-based mesoporous material has pores having a diameter of 2 to 50 nm. Method.
(13) The silica-based mesoporous material-starch hydrate according to any one of (9) to (12), wherein the silica-based mesoporous material has a total pore volume of 0.1 to 3.5 ml / g. A method for producing a degrading enzyme complex.
(14) The silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex according to any one of (9) to (13), wherein the silica-based mesoporous material has a specific surface area of 200 to 1500 m 2 / g. Production method.
(15) The enzyme that hydrolyzes starch is β-amylase, glucoamylase, pullulanase, isoamylase, oligo-1,6-glucosidase, amylo-1,6-glucosidase, or one or more of these enzymes and The method for producing a hydrolytic enzyme complex of silica-based mesoporous material-starch according to any one of (9) to (14), which is α-amylase.
(16) The silica-based mesoporous material according to any one of (9) to (15), wherein the amount and activity of the immobilized enzyme are controlled by changing the central pore diameter of the silica-based mesoporous material. A method for producing a starch hydrolyzing enzyme complex.
(17) A starch hydrolyzate characterized by performing a hydrolysis reaction of starch using the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex according to any one of (1) to (8). Production method.
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、澱粉の加水分解を行う酵素と該澱粉の加水分解酵素を固定化させたシリカ系メソ多孔体との複合体であって、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が澱粉の加水分解を触媒する活性を有していることを特徴とするものである。また、本発明は、上記シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を製造する方法であって、シリカ系メソ多孔体と澱粉の加水分解酵素を溶解した溶液を混合することにより、該澱粉の加水分解酵素をシリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に安定に吸着、保持、固定させることを特徴とするものである。
Next, the present invention will be described in more detail.
The present invention is a composite of an enzyme that hydrolyzes starch and a silica-based mesoporous material on which the starch-hydrolyzing enzyme is immobilized, wherein the enzyme immobilized on the silica-based mesoporous material is a starch. It has an activity of catalyzing hydrolysis. Further, the present invention is a method for producing the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex, wherein the silica-based mesoporous material and the starch hydrolyzing enzyme solution are mixed, The starch hydrolyzing enzyme is stably adsorbed, held and fixed on the silica-based mesoporous material and in the pores.
本発明は、シリカ系メソ多孔体が、ＭＣＭ、ＦＳＭ、又はＳＢＡタイプであること、シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有すること、シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有すること、シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２／ｇの比表面積を有すること、シリカ系メソ多孔体へ澱粉の加水分解酵素が高濃度に高集積化させた状態で固定化されていること、シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御又は増大させ、高集積化すること、を好ましい実施の態様としている。 In the present invention, the silica-based mesoporous material is MCM, FSM, or SBA type, the silica-based mesoporous material has pores having a diameter of 2 to 50 nm, and the silica-based mesoporous material It has a total pore volume of 1 to 3.5 ml / g, a silica-based mesoporous material has a specific surface area of 200 to 1500 m 2 / g, and a high concentration of starch hydrolyzing enzyme in the silica-based mesoporous material It is immobilized in a highly integrated state, and by repeating the operation of immobilizing the enzyme on the silica-based mesoporous material, the amount of enzyme immobilized is controlled or increased, and the high integration is achieved. This is a preferred embodiment.
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体としては、一般に、ＭＣＭ、ＦＳＭ、ＳＢＡタイプ等の材料系が適用される。これらの材料系は、その作製法の違いにより分類されているが、基本的構造は、類似したものである。ＭＣＭやＦＳＭタイプの合成は、カチオン性界面活性剤を用いて形成されるミセルを鋳型として、メソ多孔体が合成されている。但し、ＦＳＭタイプは、層状化合物であるカネマイトを原料として用いることに特徴がある。 As the silica-based mesoporous material constituting the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention, material systems such as MCM, FSM, and SBA types are generally applied. These material systems are classified according to the difference in their production methods, but the basic structure is similar. In the synthesis of the MCM or FSM type, a mesoporous material is synthesized using micelles formed using a cationic surfactant as a template. However, the FSM type is characterized in that kanemite, which is a layered compound, is used as a raw material.
一方、ＳＢＡでは、中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマーを用いて形成されるミセルを鋳型としている。このような複数のタイプのシリカ系メソ多孔体が、澱粉の加水分解を行う酵素の固定用担体として挙げられる。しかし、シリカ系メソ多孔体の構造を持つものであれば、基本的には該機能及び能力を有している限り全て使用可能であって、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体として、その製造方法や性状が特段に限定されるものではない。 On the other hand, in SBA, a micelle formed using a block copolymer of a neutral nonionic surfactant is used as a template. Such a plurality of types of silica-based mesoporous materials can be cited as carriers for immobilizing enzymes that hydrolyze starch. However, as long as it has the structure of a silica-based mesoporous material, it can basically be used as long as it has the function and ability, and a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex. The production method and properties of the silica-based mesoporous material constituting the material are not particularly limited.
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の作製に際しては、合成されたシリカ系メソ多孔体に対し、特段の表面処理を施すことなく、洗浄の操作のみを行ったものを用いることができる。澱粉の加水分解酵素をシリカ系メソ多孔体に固定する操作は、澱粉の加水分解酵素を溶解した溶液中に当該シリカ系メソ多孔体を浸漬、混合する操作のみにより行うことが可能であり、極めて簡便で単純な方法である。シリカ系メソ多孔体に対する表面処理等は必ずしも必要ではない。 In the production of the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention, the synthesized silica-based mesoporous material was subjected only to the washing operation without any special surface treatment. Can be used. The operation of fixing the starch hydrolyzing enzyme to the silica mesoporous material can be performed only by the operation of immersing and mixing the silica mesoporous material in a solution in which the starch hydrolyzing enzyme is dissolved. It is a simple and simple method. Surface treatment or the like for the silica-based mesoporous material is not always necessary.
しかしながら、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体の酵素に対する固定化の機能及び能力は、シリカ系メソ多孔体と酵素の間の吸着で発揮され、この際には、シリカ系メソ多孔体表面と酵素との間の親和性が重要となる上に、また、酵素の吸着は、その分散溶媒、分散溶媒中の酵素安定化剤、更には、分散溶媒のｐＨ等で影響される場合も多いので、対象とする酵素及びそれを含む溶液の成分状況等に応じて、本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体は、それを構成するシリカ系メソ多孔体の表面状態で、多少変わることもあり得る。 However, the function and ability of immobilization of the silica-based mesoporous material constituting the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex to the enzyme is exhibited by adsorption between the silica-based mesoporous material and the enzyme. In this case, the affinity between the surface of the silica-based mesoporous material and the enzyme is important, and the adsorption of the enzyme is performed by the dispersion solvent, the enzyme stabilizer in the dispersion solvent, and further the dispersion solvent. In many cases, the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention constitutes the enzyme depending on the target enzyme and the component status of the solution containing the enzyme. Depending on the surface state of the silica-based mesoporous material, it may be slightly changed.
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の作製に際し、シリカ系メソ多孔体の表面処理を施すことは、適宜可能であり、その表面処理操作の有無、処理方法等が特に限定されるものではない。例えば、シリカ系メソ多孔体表面に形成されるべき官能基としては、固定化する酵素との親和性を確保できる官能基、例えば、アルコキシ基、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基、ニトリル基、アミノ基、メルカプトプロピル基、チオール基、シラノール基、ヒドロキシル基等を挙げることができ、基本的には、シリカ系メソ多孔体の表面に形成可能な官能基であれば、いずれでも良く、ここに例示した官能基類に限定されるものではない。 In the production of the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention, it is possible to appropriately perform the surface treatment of the silica-based mesoporous material, and the presence or absence of the surface treatment operation, the treatment method, etc. It is not limited. For example, functional groups to be formed on the surface of the silica-based mesoporous material include functional groups that can ensure affinity with the enzyme to be immobilized, such as alkoxy groups, octadecyl groups, octyl groups, phenyl groups, nitrile groups, amino groups. Groups, mercaptopropyl groups, thiol groups, silanol groups, hydroxyl groups, etc. Basically, any functional group can be used as long as it is a functional group that can be formed on the surface of a silica-based mesoporous material. The functional groups are not limited to those described above.
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成する元素は、一般には、ケイ素と酸素であるが、ケイ素の一部が他の元素に置換したシリカ系メソ多孔体も、酵素の固定化機能を有する。シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素と置換可能なものの典型としては、例えば、アルミニウム、ホウ素、燐、ガリウム、ニオブ、チタン、錫、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム、マンガン、ジルコニウム、タンタル、ハフニウム等を挙げることができる。しかし、これらに留まるものではなく、基本的にシリカ系メソ多孔体の構造を破壊しないものであればいずれでも良い。 The elements constituting the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention are generally silicon and oxygen, but silica-based mesoporous materials in which a part of silicon is substituted with other elements are also available. Has an enzyme immobilization function. Typical examples of those that can replace silicon constituting the silica-based mesoporous material include, for example, aluminum, boron, phosphorus, gallium, niobium, titanium, tin, iron, cobalt, copper, nickel, zinc, chromium, vanadium, manganese, Zirconium, tantalum, hafnium, etc. can be mentioned. However, it is not limited to these, and any may be used as long as it does not basically destroy the structure of the silica-based mesoporous material.
また、その置換量に関しても、シリカ系メソ多孔体の構造を破壊しない量であれば、置換量は、いかなる量でもかまわず、該置換シリカ系メソ多孔体は、酵素固定用の担体となり得る。本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体は、いずれも熱安定性、化学安定性に優れており、しかも環境に対する負荷が低い物質であるので、本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体は、例えば、生化学品製造、医薬品製造等にとって極めて有用であり、産業上の利用可能性とその経済効果は計り知れないものがある。 Further, regarding the amount of substitution, the substitution amount may be any amount as long as it does not destroy the structure of the silica-based mesoporous material, and the substituted silica-based mesoporous material can serve as a carrier for enzyme immobilization. The silica-based mesoporous material constituting the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention is excellent in thermal stability and chemical stability, and has a low environmental impact. The silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention is extremely useful for, for example, biochemical production and pharmaceutical production, and its industrial applicability and its economic effects are immeasurable. There is.
シリカ系メソ多孔体は、一般には、数ｎｍの細孔径を有するが、その細孔径は、シリカ系メソ多孔体の合成条件により制御可能である。例えば、固定化すべき酵素が５ｎｍの大きさを有していた場合、その酵素の大きさに相応した細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を酵素固定用担体として用いる選択肢があり、その場合には、酵素の固定量が増加したり、酵素の安定性が向上することがあり得る。かかる状況を踏まえ、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成する際には、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御することが不可欠である。本発明では、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御することで、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成する上で、好適なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を開発することが可能である。 The silica-based mesoporous material generally has a pore size of several nm, but the pore size can be controlled by the synthesis conditions of the silica-based mesoporous material. For example, when the enzyme to be immobilized has a size of 5 nm, there is an option to use a silica-based mesoporous material having a pore size corresponding to the size of the enzyme as a carrier for enzyme immobilization. The amount of enzyme immobilized may increase, or the stability of the enzyme may improve. In view of this situation, it is indispensable to control the pore size of the silica-based mesoporous material when forming the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex. In the present invention, a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme is suitable for constituting a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex by controlling the pore size of the silica-based mesoporous material. It is possible to develop a complex.
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の酵素には、澱粉の加水分解を行う酵素として、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、若しくはアミロ−１，６−グルコシダーゼ、又はこれらの１種以上の酵素とα−アミラーゼを用いることができるが、基本的には、澱粉の加水分解を行える酵素であれば、どのような種に由来するものであっても良く、ここに例示した酵素類に限定されるものではない。 The enzyme of the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention includes β-amylase, glucoamylase, pullulanase, isoamylase, oligo-1,6-glucosidase, as an enzyme that hydrolyzes starch. Alternatively, amylo-1,6-glucosidase, or one or more of these enzymes and α-amylase can be used. Basically, any enzyme can be used as long as it can hydrolyze starch. However, it is not limited to the enzymes exemplified here.
いずれの酵素を用いた場合であっても、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成する上で、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御すること、及びシリカ系メソ多孔体表面上の官能基を制御することが可能であり、それにより、選択された酵素に対して、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を構成する上での好適な処理を施すことが可能である。 Regardless of which enzyme is used, controlling the pore diameter of the silica-based mesoporous material in forming the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex, and the silica-based mesoporous material It is possible to control the functional groups on the surface, and thereby to give a suitable treatment for constituting the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex to the selected enzyme. Is possible.
本発明では、澱粉の加水分解に際し、原料澱粉の性状や特性に応じて好適な酵素を選択して、その酵素を用いたシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を、固定化酵素として選択することができる。本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を用いることで、多種多様な澱粉原料を対象として、酵素反応により糖類を生成させることができる。 In the present invention, upon hydrolysis of starch, a suitable enzyme is selected according to the properties and properties of the raw starch, and the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex using the enzyme is immobilized enzyme. Can be selected. By using the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention, saccharides can be produced by enzymatic reaction targeting a wide variety of starch raw materials.
本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体には、上述のように、澱粉の加水分解を行う酵素として、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、若しくはアミロ−１，６−グルコシダーゼ、又はこれらの１種以上の酵素とα−アミラーゼを用いることができるため、本発明では、これらの酵素を固定化した、酵素反応に好適なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を提供することができる。 As described above, in the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention, β-amylase, glucoamylase, pullulanase, isoamylase, oligo-1,6 are used as enzymes for hydrolyzing starch. -Glucosidase, amylo-1,6-glucosidase, or one or more of these enzymes and α-amylase can be used. In the present invention, these enzymes are immobilized on a silica system suitable for enzyme reaction. A mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex can be provided.
本発明では、シリカ系メソ多孔体へ澱粉の加水分解酵素を高濃度に高集積化させた状態で固定化させること、シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御又は増大させ、高集積化すること、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量及び活性を制御すること、が可能であることが分かった。本発明は、シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させることにより、活性を有する酵素の高集積化を行い、反応系中に高濃度に酵素を存在させることが容易であること、酵素を用いた反応系において、酵素溶液では凝集を起こしてしまう量を越えて、酵素を存在させることが可能であること、酵素濃度が高くても、高密度に存在する酵素の凝集を生じさせることなく酵素反応を進行させることが容易であること、酵素の回収が容易であること、酵素の繰り返し使用が可能であること、等の利点を有する。 In the present invention, the enzyme hydrolyzing starch is immobilized on the silica-based mesoporous material in a highly concentrated state, and the operation of immobilizing the enzyme on the silica-based mesoporous material is repeated, whereby It was found that it is possible to control or increase the amount of immobilization, to increase the integration, and to control the amount and activity of the immobilized enzyme by changing the central pore diameter of the silica-based mesoporous material. It was. In the present invention, the enzyme is immobilized on a silica-based mesoporous material, whereby the active enzyme is highly integrated, and it is easy to make the enzyme present in a high concentration in the reaction system. In an existing reaction system, the enzyme solution can be present in excess of the amount that causes aggregation, and even if the enzyme concentration is high, the enzyme does not cause aggregation of the enzyme present at high density. There are advantages such as easy progress of the reaction, easy recovery of the enzyme, and repeated use of the enzyme.
本発明により、以下のような効果が奏される。
（１）本発明のシリカ系メソ多孔体は、酵素の導入可能な細孔径を有する細孔を有していることから、酵素の吸着可能な表面が大きいため、大量の酵素を固定することができ、酵素の高集積化が可能であり、また、繰り返し酵素の固定化を施すことにより、より多量な酵素を固定化することもできるため、酵素の高集積化が可能である。
（２）本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を用いることで、高集積化された酵素を反応系中に存在させることができるため、酵素反応をより効率的に進めることができ、また、固定化により高集積化された酵素を利用することから、酵素の凝集を避けることができるため、酵素を溶液に溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることが可能となり、酵素反応をより効率的に進めることに寄与できる。
（３）本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体では、シリカ系メソ多孔体に酵素が固定化されていることにより、酵素の回収が容易であり、酵素の繰り返し使用が可能であり、基質を連続的にシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体と接触して流通させ、連続的な酵素反応の実施が可能である。
（４）本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体は、環境に負荷の少ない材料系で構成されており、原材料は、入手しやすく、作製方法も簡単で安価である。
（５）本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体は、未処理若しくは適切な溶液による処理で官能基を有していることから、固定化される酵素の量や固定化状態を制御することができ、酵素反応に好適なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を選択することができ、また、その作製条件の制御により、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることが可能であり、それにより固定化される酵素の量や活性を制御することができ、酵素反応に好適なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を選択することができる。
（６）本発明のシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体は、その作製条件の制御により、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることが可能であり、それにより、固定化される酵素の安定性や耐久性を向上させることができ、酵素反応をより効率的に進行させることができる。
（７）上記の構成及び効果を組み合わせて利用することにより、新規の澱粉の加水分解プロセスを構築し、提供することができる。
The following effects are exhibited by the present invention.
(1) Since the silica-based mesoporous material of the present invention has pores having pore diameters into which the enzyme can be introduced, since the surface on which the enzyme can be adsorbed is large, a large amount of enzyme can be immobilized. The enzyme can be highly integrated, and by repeatedly immobilizing the enzyme, a larger amount of enzyme can be immobilized, so that the enzyme can be highly integrated.
(2) By using the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention, a highly integrated enzyme can be present in the reaction system. In addition, since the enzyme is highly integrated by immobilization, the enzyme can be prevented from aggregating. Therefore, the enzyme should be present in the reaction system at a higher concentration than the solution dissolved in the solution. It is possible to contribute to a more efficient enzymatic reaction.
(3) In the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention, since the enzyme is immobilized on the silica-based mesoporous material, the enzyme can be easily recovered, and the enzyme can be used repeatedly. It is possible to continuously carry out the enzyme reaction by continuously circulating the substrate in contact with the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex.
(4) The silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention is composed of a material system having a low environmental load, and the raw materials are easily available and the production method is simple and inexpensive.
(5) Since the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention has a functional group by treatment with an untreated or appropriate solution, the amount of immobilized enzyme and immobilization It is possible to select a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex suitable for an enzymatic reaction, and to control the production conditions of the silica-based mesoporous material. It is possible to change the pore size, thereby controlling the amount and activity of the immobilized enzyme, and selecting a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex suitable for the enzymatic reaction. it can.
(6) The silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex of the present invention can change the central pore diameter of the silica-based mesoporous material by controlling the production conditions, thereby immobilizing The stability and durability of the enzyme to be produced can be improved, and the enzyme reaction can proceed more efficiently.
(7) A novel starch hydrolysis process can be constructed and provided by using a combination of the above-described configurations and effects.
以下に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例等によって何ら制約を受けるものではない。以下の実施例では、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の合成法について説明する。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below based on examples, but the present invention is not limited by the following examples. In the following examples, a method for synthesizing a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex will be described.
（１）シリカ系メソ多孔体の合成１
シリカ系メソ多孔体のうち、まず、ＦＳＭタイプに属するものの作製方法を示す。カチオン性界面活性剤である塩化ベヘニルトリメチルアンモニウムを主成分とし、エチルアルコールとの混合物である界面活性剤（アーカード）１０ｇを、超純水１２５ｇに混合し、７０℃で３０分間、撹拌混合した。この撹拌混合には、ホモミキサーを用いた。別途、カネマイト６．６７ｇを超純水１３０．８３ｇと混合し、７０℃で撹拌混合した。尚、細孔径を制御する目的で、膨張剤としてトリイソプロピルベンゼンを添加することができる。
(1) Synthesis of silica-based mesoporous material 1
First, a method for producing a silica-based mesoporous material belonging to the FSM type will be described. 10 g of a surfactant (Arcade), which is mainly composed of behenyltrimethylammonium chloride, which is a cationic surfactant, and a mixture with ethyl alcohol, was mixed with 125 g of ultrapure water and stirred at 70 ° C. for 30 minutes. A homomixer was used for this stirring and mixing. Separately, 6.67 g of kanemite was mixed with 130.83 g of ultrapure water and stirred and mixed at 70 ° C. For the purpose of controlling the pore diameter, triisopropylbenzene can be added as an expanding agent.
この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。それぞれの溶液の所定の撹拌時間を経た後、両者を混合し、更に、７０℃で２時間、ホモミキサーを用いて撹拌混合した。この撹拌混合の後、２規定の塩酸を約１時間かけて滴下し、溶液の状態をｐＨ８．５とした。ｐＨが８．５となった後、更に３時間、撹拌混合した。この溶液を吸引濾過した後、分離された固形物を７０℃の温水に再分散し、また、濾過を繰り返した。この操作を３回繰り返した後、固形物を６０℃で２４時間、乾燥した。更に、空気気流中にて５５０℃で６時間焼成することにより、各種細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。 A magnetic stirrer was used for the stirring and mixing. After a predetermined stirring time of each solution, both were mixed, and further stirred and mixed at 70 ° C. for 2 hours using a homomixer. After this stirring and mixing, 2N hydrochloric acid was added dropwise over about 1 hour to bring the solution to pH 8.5. After the pH reached 8.5, the mixture was further stirred for 3 hours. After this solution was suction filtered, the separated solid was redispersed in warm water at 70 ° C., and filtration was repeated. After repeating this operation three times, the solid was dried at 60 ° C. for 24 hours. Furthermore, by firing at 550 ° C. for 6 hours in an air stream, silica-based mesoporous materials having various pore diameters were obtained.
上記手法により合成されたシリカ系メソ多孔体について、粉末Ｘ線回折法、走査電子顕微鏡法、透過電子顕微鏡法及び窒素吸着等温線の測定を適用した。粉末Ｘ線回折法は、Ｂｒｕｋｅｒ製ＡＸＳ Ｄ８−ＡＤＶＡＮＣＥ Ｖａｒｉｏ−１を用いて実施した。得られたＸ線回折パターンより、上記手法により作製されたシリカ系メソ多孔体は、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していることが分かった。また、回折ピーク位置の解析から、合成時膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体に比較して、膨張剤を用いた場合の方が細孔径が大きくなっていることが確認できた。 For the silica-based mesoporous material synthesized by the above method, powder X-ray diffraction, scanning electron microscopy, transmission electron microscopy, and nitrogen adsorption isotherm measurements were applied. The powder X-ray diffraction method was performed using AXS D8-ADVANCE Vario-1 manufactured by Bruker. From the obtained X-ray diffraction pattern, it was found that the silica-based mesoporous material produced by the above method had a two-dimensional hexagonal pore arrangement structure. In addition, from the analysis of the diffraction peak position, it was confirmed that the pore diameter was larger when the expansion agent was used compared to the silica-based mesoporous material when the expansion agent was not used during synthesis. .
走査電子顕微鏡（日立製Ｓ−８００を使用）による観察から、合成されたシリカ系メソ多孔体は、不定形顆粒状の形態として観察された。透過電子顕微鏡（日本電子製Ｊ−２０１０Ｆを使用）による観察からは、合成時膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体では、４ｎｍ径の細孔が分布していることが確認された。膨張剤としてトリイソプロピルベンゼンを７．５ｇ添加した場合のシリカ系メソ多孔体では、７．５ｎｍの細孔が分布していることが確認され、また、膨張剤としてトリイソプロピルベンゼンを１４ｇ添加したシリカ系メソ多孔体では、９ｎｍの細孔が分布していることが確認された。 From the observation with a scanning electron microscope (using Hitachi S-800), the synthesized silica-based mesoporous material was observed as an amorphous granular form. Observation with a transmission electron microscope (using J-2010F manufactured by JEOL) confirmed that pores with a diameter of 4 nm were distributed in the silica-based mesoporous material when no expansion agent was used during synthesis. . In the silica-based mesoporous material when 7.5 g of triisopropylbenzene was added as an expanding agent, it was confirmed that 7.5 nm pores were distributed, and silica added with 14 g of triisopropylbenzene as an expanding agent In the system mesoporous material, it was confirmed that 9 nm pores were distributed.
窒素吸着等温線の測定は、Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製Ａｕｔｏｓｏｒｂにて行った。その結果を図１に示す。図１の左側が吸着等温線を示し、右側が細孔径分布を示している。膨張剤の添加量に依存して、異なる吸着等温線が得られた。合成時膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体では、４ｎｍ径の細孔による鋭いピークが確認された。膨張剤としてトリイソピルベンゼンを７．５ｇ及び１４ｇ添加した場合のシリカ系メソ多孔体では、それぞれ７．５ｎｍ，９ｎｍにピークを持つ、細孔の分布が確認された。 The measurement of the nitrogen adsorption isotherm was performed with an Autosorb manufactured by Quantachrome. The result is shown in FIG. The left side of FIG. 1 shows the adsorption isotherm, and the right side shows the pore size distribution. Depending on the amount of expansion agent added, different adsorption isotherms were obtained. In the silica-based mesoporous material when no expansion agent was used during synthesis, a sharp peak due to pores having a diameter of 4 nm was confirmed. In the silica-based mesoporous material when 7.5 g and 14 g of triisopyrbenzene were added as an expanding agent, pore distributions having peaks at 7.5 nm and 9 nm were confirmed.
以下、合成時膨張剤を用いなかった場合の４ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体をＦＳＭ−４、膨張剤としてトリイソピルベンゼンを７．５ｇ添加して合成した７．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体をＦＳＭ−７．５、同じく膨張剤としてトリイソピルベンゼンを１４ｇ添加して合成した９ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体をＦＳＭ−９、と記載する。 Hereinafter, FSM-4 was added as a silica-based mesoporous material having a peak of pore size distribution at 4 nm when no expansion agent was used during synthesis, and 7.5 g of triisopyrbenzene was added as an expansion agent. Silica mesoporous material having a pore size distribution peak at 9 nm synthesized by adding FSM-7.5, a silica mesoporous material having a pore size distribution peak at 5 nm diameter, and 14 g of triisopyrbenzene as a swelling agent. The porous body is described as FSM-9.
（２）シリカ系メソ多孔体の合成２
次に、シリカ系メソ多孔体のうち、ＳＢＡタイプに属するもの作製方法を示す。中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマー（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））（分子量：〜５８００、ＥＯ：ＰＯ：ＥＯ＝２０：７０：２０）１２ｇを、超純水４４９ｍｌに混合し、更に、３５％の塩酸２０ｍｌを加えて、３５℃で一晩、撹拌混合した。
(2) Synthesis of silica-based mesoporous material 2
Next, a method for producing a silica-based mesoporous material belonging to the SBA type will be described. Block copolymer of neutral nonionic surfactant (poly (ethylene glycol) -block-poly (propylene glycol) -block-poly (ethylene glycol)) (molecular weight: -5800, EO: PO: EO = 20: 70) 20) 12 g was mixed with 449 ml of ultrapure water, and further 20 ml of 35% hydrochloric acid was added, followed by stirring and mixing at 35 ° C. overnight.
その後、シリカ源としてのＴＥＯＳ（Ｔｅｔｒａｅｔｈｌｙ Ｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）を２７．４ｍｌ加え、３５℃で２０時間、撹拌混合した。この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。この反応液をオートクレーブ容器に装填し、３５、７５，１００，１３０℃の各温度で２４時間静置した。この溶液を吸引濾過した後、６０℃で２４時間、乾燥した。更に、空気気流中にて５５０℃で６時間焼成することにより、各種細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。この合成法によるＳＢＡは、Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡである。オートクレーブ容器の保持温度により細孔径が制御された。 Thereafter, 27.4 ml of TEOS (Tetrahethly Orthosilicate) as a silica source was added and stirred and mixed at 35 ° C. for 20 hours. A magnetic stirrer was used for the stirring and mixing. This reaction solution was charged into an autoclave container and allowed to stand at each temperature of 35, 75, 100, and 130 ° C. for 24 hours. The solution was suction filtered and dried at 60 ° C. for 24 hours. Furthermore, by firing at 550 ° C. for 6 hours in an air stream, silica-based mesoporous materials having various pore diameters were obtained. SBA by this synthesis method is SBA having a P6 mm structure. The pore diameter was controlled by the holding temperature of the autoclave container.
Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡの合成条件は、中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマー（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））（分子量：〜５８００、ＥＯ：ＰＯ：ＥＯ＝２０：７０：２０）１２ｇを、超純水４３４ｍｌに混合し、更に、３５％の塩酸２０ｍｌを加えた。しばらく撹拌混合した後、ブタノール１４．８ｍｌを加えて、３５℃で一晩、撹拌混合した。 The synthesis condition of SBA having an Ia3d structure is a neutral nonionic surfactant block copolymer (poly (ethylene glycol) -block-poly (propylene glycol) -block-poly (ethylene glycol)) (molecular weight: -5800, 12 g of EO: PO: EO = 20: 70: 20) was mixed with 434 ml of ultrapure water, and 20 ml of 35% hydrochloric acid was further added. After stirring and mixing for a while, 14.8 ml of butanol was added and stirred and mixed overnight at 35 ° C.
その後、シリカ源としてのＴＥＯＳ（Ｔｅｔｒａｅｔｈｌｙ Ｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）を２７．４ｍｌ加え、３５℃で２０時間、撹拌混合した。この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。この反応液をオートクレーブ容器に装填し、３５、７５，１００，１３０℃の各温度で２４時間静置した。この溶液を吸引濾過した後、６０℃で２４時間、乾燥した。更に、空気気流中にて５５０℃で６時間焼成することにより、各種細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。 Thereafter, 27.4 ml of TEOS (Tetrahethly Orthosilicate) as a silica source was added and stirred and mixed at 35 ° C. for 20 hours. A magnetic stirrer was used for the stirring and mixing. This reaction solution was charged into an autoclave container and allowed to stand at each temperature of 35, 75, 100, and 130 ° C. for 24 hours. The solution was suction filtered and dried at 60 ° C. for 24 hours. Furthermore, by firing at 550 ° C. for 6 hours in an air stream, silica-based mesoporous materials having various pore diameters were obtained.
上記手法により合成されたシリカ系メソ多孔体について、先のＦＳＭタイプの場合と同様に、粉末Ｘ線回折法、走査電子顕微鏡法、透過電子顕微鏡法及び窒素吸着等温線の測定を適用した。得られたＸ線回折パターンより、上記手法により作製されたシリカ系メソ多孔体は、Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡタイプの場合は、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していること、Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡタイプの場合は、３次元の細孔配列構造を有していることが分かった。また、回折ピーク位置の解析から、合成時の温度の違いにより、細孔径が異なっていることが確認できた。 For the silica-based mesoporous material synthesized by the above method, the powder X-ray diffraction method, the scanning electron microscope method, the transmission electron microscope method, and the measurement of the nitrogen adsorption isotherm were applied as in the case of the previous FSM type. From the obtained X-ray diffraction pattern, the silica-based mesoporous material produced by the above method has a two-dimensional hexagonal pore arrangement structure in the case of the SBA type having a P6 mm structure, and an SBA having an Ia3d structure. In the case of the type, it was found to have a three-dimensional pore arrangement structure. Further, from the analysis of the diffraction peak position, it was confirmed that the pore diameter was different depending on the temperature at the time of synthesis.
走査電子顕微鏡による観察から、Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡタイプの場合は、柱状の集合体として、また、Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡタイプの場合は、不定形顆粒状の形態として、観察された。透過電子顕微鏡による観察からは、合成時の温度の違いにより、異なった細孔径を有していることを確認した。 From observation with a scanning electron microscope, it was observed as a columnar aggregate in the case of the SBA type having a P6 mm structure, and as an amorphous granular form in the case of the SBA type having an Ia3d structure. From observation with a transmission electron microscope, it was confirmed that they had different pore diameters due to temperature differences during synthesis.
窒素吸着等温線の測定も同様に行った。Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡタイプの結果を図２に、Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡタイプの結果を図３に示す。図２，３共に、左側が吸着等温線を示し、右側が細孔径分布を示している。合成時の温度の違いに依存して、異なる吸着等温線が得られた。Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体では、３５℃で合成したものは６．２ｎｍ径の細孔による鋭いピークが確認された。以下、７５℃、１００℃、１３０℃のものには、それぞれ６．７ｎｍ、８．０ｎｍ、１１．１ｎｍ径の細孔による鋭いピークが確認された。Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体では、３５℃で合成したものは６．１ｎｍ径の細孔による鋭いピークが確認された。以下、７５℃、１００℃、１３０℃のものには、それぞれ６．７ｎｍ、９．９ｎｍ、１１．０ｎｍ径の細孔による鋭いピークが確認された。 The nitrogen adsorption isotherm was measured in the same manner. FIG. 2 shows the result of the SBA type having the P6 mm structure, and FIG. 3 shows the result of the SBA type having the Ia3d structure. 2 and 3, the left side shows the adsorption isotherm, and the right side shows the pore size distribution. Depending on the temperature difference during synthesis, different adsorption isotherms were obtained. In the SBA type silica-based mesoporous material having a P6 mm structure, those synthesized at 35 ° C. were confirmed to have sharp peaks due to 6.2 nm diameter pores. Hereinafter, sharp peaks due to pores having diameters of 6.7 nm, 8.0 nm, and 11.1 nm were confirmed at 75 ° C., 100 ° C., and 130 ° C., respectively. In the SBA type silica-based mesoporous material having an Ia3d structure, a sharp peak due to a 6.1 nm diameter pore was confirmed when synthesized at 35 ° C. Hereinafter, sharp peaks due to pores having diameters of 6.7 nm, 9.9 nm, and 11.0 nm were confirmed at 75 ° C., 100 ° C., and 130 ° C., respectively.
以下、Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体で、合成時３５℃としたものをＰ６ｍｍ−３５、以下同様に、７５℃、１００℃、１３０℃のものを、Ｐ６ｍｍ−７５、Ｐ６ｍｍ−１００、Ｐ６ｍｍ−１３０、と記載する。また、Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体で、合成時３５℃としたものをＩａ３ｄ−３５、以下、同様に、７５℃、１００℃、１３０℃のものを、Ｉａ３ｄ−７５、Ｉａ３ｄ−１００、Ｉａ３ｄ−１３０、と記載する。 Hereinafter, a P6 mm-structured SBA type silica-based mesoporous material having a synthesis temperature of 35 ° C. is P6 mm-35, and similarly, those at 75 ° C., 100 ° C., and 130 ° C. are P6 mm-75 and P6 mm-100. , P6mm-130. Further, an SBA type silica-based mesoporous material having an Ia3d structure, which was 35 ° C. at the time of synthesis, was Ia3d-35, and similarly, those at 75 ° C., 100 ° C. and 130 ° C. were Ia3d-75 and Ia3d 100, Ia3d-130.
（１）シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の作製
澱粉の加水分解酵素の固定化用担体として用いたシリカ系メソ多孔体を、以下の表に示す（表１参照）。Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡ４種（窒素吸着による細孔径、６．２ｎｍ、６．７ｎｍ、８．０ｎｍ、１１．１ｎｍのもの）、Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡ４種（窒素吸着による細孔径、６．１ｎｍ、６．７ｎｍ、９．９ｎｍ、１１．０ｎｍのもの）、ＦＳＭタイプのもの３種（窒素吸着による細孔径、４．０ｎｍ、７．５ｎｍと９．０ｎｍのもの）を用いた。
(1) Production of Silica Mesoporous Material-Starch Hydrolyzing Enzyme Complex The silica mesoporous material used as a carrier for immobilizing starch hydrolyzing enzyme is shown in the following table (see Table 1). SBA4 species with P6 mm structure (pore diameter by nitrogen adsorption, 6.2 nm, 6.7 nm, 8.0 nm, 11.1 nm), SBA4 species with Ia3d structure (pore diameter by nitrogen adsorption, 6.1 nm, 6.7 nm) , 9.9 nm, 11.0 nm) and three types of FSM type (pore diameters by nitrogen adsorption, 4.0 nm, 7.5 nm, and 9.0 nm).
まず、グルコアミラーゼの吸着等温線を作成した。酵素として、グルコアミラーゼ（Ｗａｋｏ ０７７−０４０７１）を用いた。購入したグルコアミラーゼの瓶に、８ｍｌ程度の超純水を入れて溶かすと、およそ３０ｍｇ／ｍｌ程度の溶液になる。正確な濃度をγグロブリンをコントロールとしたＢＣＡ法で測定した。それを０．１Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で希釈することで、目的濃度のグルコアミラーゼ溶液を得た。吸着等温線の作成は、以下の手順によった。 First, an adsorption isotherm of glucoamylase was prepared. As an enzyme, glucoamylase (Wako 077-04071) was used. When ultrapure water of about 8 ml is poured into a purchased glucoamylase bottle and dissolved, the solution becomes about 30 mg / ml. The exact concentration was measured by the BCA method using γ globulin as a control. By diluting it with 0.1 M acetate buffer (pH 5.5), a glucoamylase solution having a target concentration was obtained. The adsorption isotherm was created according to the following procedure.
１．チューブに各メソポーラスシリカを１０ｍｇずつ量り取った。
２．グルコアミラーゼ溶液の希釈系列（０〜１６ｍｇ／ｍｌ）を作成した。
３．メソポーラスシリカを量り取ったチューブに、タンパク質溶液を１ｍｌずつ入れ、良く攪拌混合した。
４．４℃で一晩（８時間以上）転倒混和した。
５．チューブを遠心し、その上清に残ったタンパク質濃度を、ＢＣＡキットで測定した。
６．測った濃度から、メソポーラスシリカに吸着されたグルコアミラーゼ量を算出し、吸着等温線を作成した。
1. 10 mg of each mesoporous silica was weighed into a tube.
2. A dilution series (0 to 16 mg / ml) of glucoamylase solution was prepared.
3. 1 ml of the protein solution was put into a tube in which mesoporous silica was weighed and mixed well with stirring.
Inverted at 4.4 ° C overnight (over 8 hours).
5. The tube was centrifuged, and the protein concentration remaining in the supernatant was measured with a BCA kit.
6). From the measured concentration, the amount of glucoamylase adsorbed on mesoporous silica was calculated, and an adsorption isotherm was created.
これらの手法を用いることで、グルコアミラーゼの最大吸着量を算出した。これらの結果を図４〜６に示す。図４に示すように、Ｐ６ｍｍ−３５、Ｐ６ｍｍ−７５、Ｐ６ｍｍ−１００、Ｐ６ｍｍ−１３０のグルコアミラーゼ最大吸着量は、それぞれ１０，２０，５０，８０ｍｇであることが分かった。同様に、図５に示すように、Ｉａ３ｄ−３５、Ｉａ３ｄ−７５、Ｉａ３ｄ−１００、Ｉａ３ｄ−１３０のグルコアミラーゼ最大吸着量は、それぞれ５，１５，７５，３００ｍｇであり、図６に示すように、ＦＳＭ−４、ＦＳＭ−７．５、ＦＳＭ−９のグルコアミラーゼ最大吸着量は、それぞれ７５，２００，４２０ｍｇであることが分かった（表１参照）。 By using these methods, the maximum adsorption amount of glucoamylase was calculated. These results are shown in FIGS. As shown in FIG. 4, it was found that the maximum glucoamylase adsorption amounts of P6mm-35, P6mm-75, P6mm-100, and P6mm-130 were 10, 20, 50, and 80 mg, respectively. Similarly, as shown in FIG. 5, the maximum glucoamylase adsorption amounts of Ia3d-35, Ia3d-75, Ia3d-100, and Ia3d-130 are 5, 15, 75, and 300 mg, respectively, as shown in FIG. , FSM-4, FSM-7.5, and FSM-9 were found to have a maximum adsorption amount of 75, 200, and 420 mg, respectively (see Table 1).
これらの結果から、グルコアミラーゼは、ＦＳＭ−９に最も多く吸着することが分かった。そこで、グルコアミラーゼが吸着するとき、ＦＳＭ−９の細孔の中にも入っているのか否かを確認した。ＦＳＭ−９をバッファーのみとグルコアミラーゼを溶解したバッファーでそれぞれ処理し、窒素吸着等温線を測定した。測定手順は以下によった。 From these results, it was found that glucoamylase adsorbs most to FSM-9. Then, when glucoamylase adsorb | sucked, it confirmed whether it was also contained in the pore of FSM-9. FSM-9 was treated with a buffer alone and a buffer in which glucoamylase was dissolved, and a nitrogen adsorption isotherm was measured. The measurement procedure was as follows.
１．１０ｍｌチューブにＦＳＭ−９を４０ｍｇずつ測り取った。
２．６ｍｇ／ｍｌ グルコアミラーゼ溶液又はバッファーを、それぞれ４ｍｌずつ加えて混合した。固まりが見られる場合は、超音波又はポンプで引いて空気を抜いた。
３．４℃で９時間ローテーターで回転させて、グルコアミラーゼを吸着させた。
４．チューブを３０００ｒｐｍで５分遠心した後、上清を除去して、上清の未吸着タンパク濃度をＢＣＡ法で測定した。
1. Weighed 40 mg of FSM-9 in a 10 ml tube.
Each 2.6 ml of 2.6 mg / ml glucoamylase solution or buffer was added and mixed. When lumps were observed, the air was drawn by sonication or pumping.
The glucoamylase was adsorbed by rotating with a rotator at 3.4 ° C. for 9 hours.
4). After centrifuging the tube at 3000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and the unadsorbed protein concentration of the supernatant was measured by the BCA method.
５．チューブに酢酸バッファー４ｍｌを加えて洗浄した（１回）。
６．チューブにエタノール４ｍｌを加えて、洗浄した（１回）。
７．上清を除去したＦＳＭ−９（＋グルコアミラーゼ）を少量のエタノールでシャーレに移し、６０℃のオーブンで３日乾燥させた。
８．乾燥させたＦＳＭ−９（＋グルコアミラーゼ）を約２０ｍｇセルに測り取り、６０℃で２４時間、脱ガスの前処理した後、窒素吸着等温線の測定を行った。
5. The tube was washed by adding 4 ml of acetate buffer (once).
6). The tube was washed by adding 4 ml of ethanol (once).
7). FSM-9 (+ glucoamylase) from which the supernatant was removed was transferred to a petri dish with a small amount of ethanol and dried in an oven at 60 ° C. for 3 days.
8). The dried FSM-9 (+ glucoamylase) was weighed into an about 20 mg cell, pretreated for degassing at 60 ° C. for 24 hours, and then the nitrogen adsorption isotherm was measured.
結果を図７に示す。図７の左側が吸着等温線を示し、右側が細孔径分布を示している。比較のため、グルコアミラーゼを吸着させたものと、させていないものの結果を示している。右側の図より、グルコアミラーゼの吸着により全細孔体積が減少していることが分かり、グルコアミラーゼは、ＦＳＭ−９の細孔内にも入っていることが確認できた。 The results are shown in FIG. The left side of FIG. 7 shows the adsorption isotherm, and the right side shows the pore size distribution. For comparison, the results of the adsorbed glucoamylase and the non-adsorbed glucoamylase are shown. From the figure on the right side, it was found that the total pore volume decreased due to the adsorption of glucoamylase, and it was confirmed that glucoamylase was also contained in the pores of FSM-9.
（２）シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体の酵素活性測定
グルコアミラーゼの活性測定には、キッコーマン製 商品コード６０２１２「糖化力分別定量キット」を用いた。あらかじめ、本実験に使用するグルコアミラーゼ標品は、検出可能なα−グルコシダーゼ活性を持たないことを確認した。本キットは、糖化力とα−グルコシダーゼ活性を測るためのキットであるが、α−グルコシダーゼを無視できるため、糖化力の値がそのままグルコアミラーゼ活性の値となる。また、基本的には、キットに添付されるインストラクションにしたがって活性測定を行うが、そのスケールを１０分の１にし、かつ吸光度の検出をプレートリーダーで行うため、活性単位の算出に関しては計算方法が若干異なる。
(2) Enzyme Activity Measurement of Silica Mesoporous Material-Starch Hydrolyzing Enzyme Complex A product code 60212 “Saccharification power fraction determination kit” manufactured by Kikkoman Corporation was used for the activity measurement of glucoamylase. In advance, it was confirmed that the glucoamylase preparation used in this experiment did not have detectable α-glucosidase activity. Although this kit is a kit for measuring saccharification power and α-glucosidase activity, since α-glucosidase can be ignored, the value of saccharification power becomes the value of glucoamylase activity as it is. Basically, the activity is measured according to the instructions attached to the kit, but the scale is reduced to 1/10 and the absorbance is detected with a plate reader. Slightly different.
グルコアミラーゼのシリカ系メソ多孔体への固定化は、以下の手順によった。酵素としては、グルコアミラーゼ（Ｗａｋｏ ０７７−０４０７１）を用いた。シリカ系メソ多孔体としては、ＳＢＡタイプとＦＳＭタイプのものを複数用いた。
１．０．１Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）に溶かした１ｍｌのグルコアミラーゼ（４ｍｇ／ｍｌ）と１０ｍｇのメソポーラスシリカを混合し、４℃で一晩転倒混和した。
２．遠心して上清を除いた。（吸着したタンパク質量を測定した。）
３．１ｍｌの酢酸バッファーでメソポーラスシリカを再懸濁した後、遠心する操作を5回繰り返し、吸着されなかったグルコアミラーゼを完全に除いた。
４．１ｍｌの酢酸バッファーに懸濁したものをサンプルとし、酢酸バッファーで更に５倍希釈した懸濁液を１ｍｌ用意した。
Immobilization of glucoamylase to the silica-based mesoporous material was performed according to the following procedure. As the enzyme, glucoamylase (Wako 077-04071) was used. As the silica-based mesoporous material, a plurality of SBA type and FSM type materials were used.
1. 1 ml of glucoamylase (4 mg / ml) dissolved in 0.1 M acetate buffer (pH 5.5) and 10 mg of mesoporous silica were mixed and mixed by inversion at 4 ° C. overnight.
2. The supernatant was removed by centrifugation. (The amount of adsorbed protein was measured.)
3. After resuspending mesoporous silica with 1 ml of acetate buffer, the centrifugation was repeated 5 times to completely remove the unadsorbed glucoamylase.
A sample suspended in 4.1 ml of acetate buffer was used as a sample, and 1 ml of a suspension further diluted 5-fold with acetate buffer was prepared.
まず、固定化したグルコアミラーゼの耐熱性向上を確認するために、シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体に対する熱処理を行った。処理は、以下のような手順を用いた。
１．先に準備された懸濁液１ｍｌを十分に攪拌し、先端をカットオフしてメソポーラスシリカの粒子が詰らないようにしたイエローチップを用いて、１００μｌずつ６本のエッペンドルフチューブに分注した。
２．３７，４５，５５，６５，７５，８５℃のヒートブロックを準備した。
３．１０分加熱した。
４．加温後、すぐに氷水中につけて急冷した。
First, in order to confirm the heat resistance improvement of the immobilized glucoamylase, the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex was subjected to heat treatment. The following procedure was used for processing.
1. 1 ml of the previously prepared suspension was sufficiently agitated, and 100 μl each was dispensed into 6 Eppendorf tubes using a yellow tip whose tip was cut off to prevent clogging of mesoporous silica particles.
2. 37, 45, 55, 65, 75, and 85 ° C. heat blocks were prepared.
3. Heated for 10 minutes.
4). Immediately after heating, it was immediately cooled in ice water.
グルコアミラーゼの活性測定は、以下の手順により測定した。
１．「糖化力分別定量キット」に含まれる、糖化力測定用基質溶液と酵素溶液を３７℃で予備加温した。
２．基質溶液と酵素溶液を等量ずつ混ぜ、反応溶液とした。
３．先を３ミリほどカットオフしたイエローチップを用いて、良く懸濁した固定化グルコアミラーゼサンプルから１０μｌを吸い上げ、９６穴ウェル中入れた。
４．反応溶液を１００μｌずつ入れ、３７℃で１０分間インキュベートした。
５．反応停止液２００μｌを入れ、反応を停止させた。
６．３０分ほど静置し、メソポーラスシリカを沈殿させた。
７．沈殿したメソポーラスシリカを吸い込まないように注意しながら、２００μｌの反応後の溶液を吸い上げ、プレートリーダー用のプレートに移した。
８．波長４００ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度が１．６程度までは、リニアに活性を反映するので、吸光度が１．６を超えたサンプルについては、希釈して測定した。
The activity of glucoamylase was measured by the following procedure.
1. The substrate solution for saccharification power measurement and the enzyme solution contained in the “saccharification power fraction determination kit” were pre-warmed at 37 ° C.
2. The substrate solution and the enzyme solution were mixed in equal amounts to obtain a reaction solution.
3. Using a yellow tip whose tip was cut off by about 3 mm, 10 μl of the well-suspended immobilized glucoamylase sample was sucked up and placed in a 96-well.
4). 100 μl of the reaction solution was added and incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
5. 200 μl of a reaction stop solution was added to stop the reaction.
6. Allowed to stand for about 30 minutes to precipitate mesoporous silica.
7). Taking care not to inhale the precipitated mesoporous silica, 200 μl of the solution after the reaction was sucked up and transferred to a plate for a plate reader.
8). Absorbance at a wavelength of 400 nm was measured. Since the activity is linearly reflected up to an absorbance of about 1.6, samples with absorbance exceeding 1.6 were diluted and measured.
本キットでは、４−ニトロフェニルβ−マルトシドが、グルコアミラーゼによって分解され、４−ニトロフェニルβ−グルコシドを生じ、更に、共役酵素として添加したβ−グルコシダーゼによって生ずる４−ニトロフェノールの吸光度を測ることによって糖化力活性を測定する。糖化力の１Ｕ（ユニット）は、インストラクションに従う条件下で、１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生ずる力価として定義されている。 In this kit, 4-nitrophenyl β-maltoside is decomposed by glucoamylase to produce 4-nitrophenyl β-glucoside, and the absorbance of 4-nitrophenol produced by β-glucosidase added as a conjugate enzyme is measured. To measure saccharifying activity. 1 U (unit) of saccharification power is defined as the titer that produces 1 μmol of 4-nitrophenol per minute under conditions according to the instructions.
その計算式は、糖化力（Ｕ／ｍｌ）＝サンプルの吸光度×０．１７１×希釈倍率である。本実験の場合、糖化力がグルコアミラーゼの活性と等しいとして扱い、希釈倍率が１０であり、プレートリーダーを用いることで、吸光度が０．５倍（ポジティブコントロールを用いて検討済み）になっていることを考慮すると、下記の式により、
グルコアミラーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）＝サンプルの吸光度×０．１７１×１０×（１／０．５）
酵素活性は、サンプルの吸光度×３．４２と換算される。
The calculation formula is saccharification power (U / ml) = absorbance of sample × 0.171 × dilution ratio. In the case of this experiment, the saccharification power is treated as being equal to the activity of glucoamylase, the dilution factor is 10, and the absorbance is 0.5 times (examined using a positive control) by using a plate reader. Considering that, the following formula:
Glucoamylase activity (U / ml) = absorbance of sample × 0.171 × 10 × (1 / 0.5)
The enzyme activity is converted to the absorbance of the sample × 3.42.
これらのシリカ系メソ多孔体に固定化したグルコアミラーゼの活性を測定した。活性の測定に際し、反応温度を変化させ温度による依存性も合わせて確認した。その結果を図８〜１０に示す。これらの図には、それぞれのシリカ系メソ多孔体についてグループ毎に示している。耐熱性に関しては、いずれの固定化グルコアミラーゼも６５℃付近で９０％以上の活性を失うという意味では違いが見られなかった。ただし、メソ穴の大きさと、酵素活性には相関があることを示している。例えば、Ｐ６ｍｍ及びＦＳＭタイプでは、メソ穴が大きいほど良好で、Ｉａ３ｄタイプでは、９．９ｎｍ程度の細孔径の方が比活性が高い。 The activity of glucoamylase immobilized on these silica-based mesoporous materials was measured. In measuring the activity, the reaction temperature was changed and the dependence on temperature was also confirmed. The results are shown in FIGS. In these figures, each silica-based mesoporous material is shown for each group. Regarding heat resistance, no difference was observed in the sense that any of the immobilized glucoamylases lost 90% or more of activity at around 65 ° C. However, there is a correlation between the size of the mesopores and the enzyme activity. For example, the larger mesopores are better for P6 mm and FSM types, and the specific activity is higher for pore diameters of about 9.9 nm for Ia3d type.
また、特に重要なことは、溶液中に溶解させたグルコアミラーゼの酵素比活性（図中、Ｎａｔｉｖｅで標記）に比較した場合、ＦＳＭ−９、Ｐ６ｍｍ−１３０及びＩａ３ｄ−１００に吸着、固定されたα−アミラーゼの比活性は、同程度の比活性を示している。このことは、細孔径を適合させたシリカ系メソ多孔体に固定化されたグルコアミラーゼが、溶液中に分散した状態のグルコアミラーゼと同等の比活性を示していることを示している。 In addition, it is particularly important that the glucoamylase dissolved in the solution was adsorbed and fixed to FSM-9, P6mm-130, and Ia3d-100 when compared with the specific enzyme activity (labeled as Native in the figure). The specific activity of α-amylase shows the same specific activity. This indicates that the glucoamylase immobilized on the silica-based mesoporous material having a fine pore size exhibits a specific activity equivalent to that of the glucoamylase dispersed in the solution.
このことから、澱粉の加水分解のための反応系において、シリカ系メソ多孔体に固定化されたグルコアミラーゼを共存させることにより、その溶解度を超えた量のグルコアミラーゼを反応系内に存在させることが可能であることが分かる。このことは、言うまでもなく、反応速度、すなわち澱粉の加水分解速度の向上に寄与するものであり、また、反応生成物からも容易に酵素を回収することが可能である。グルコアミラーゼが固定化されたシリカ系メソ多孔体を更に固定し、そこに、澱粉を含む溶液を流すような装置を構成すれば、連続的な酵素反応の実施が可能である。 Therefore, in the reaction system for starch hydrolysis, coexistence of glucoamylase immobilized on the silica-based mesoporous material allows the amount of glucoamylase exceeding its solubility to be present in the reaction system. It is understood that is possible. Needless to say, this contributes to an improvement in the reaction rate, that is, the hydrolysis rate of starch, and the enzyme can be easily recovered from the reaction product. A continuous enzyme reaction can be carried out by constructing a device in which a silica-based mesoporous material on which glucoamylase is immobilized is further immobilized, and a solution containing starch is passed therethrough.
一般に、酵素、すなわちタンパク質の溶解度には限界があり、それを越えると凝集という現象を起こす。グルコアミラーゼの場合も例外ではなく、１０ｍｇ／ｍｌを越えるような高濃度にすると凝集が起こり、凝集を起こした酵素は活性に寄与しない。一方で、シリカ系メソ多孔体に固定化されたグルコアミラーゼの場合、先に示したＦＳＭ−９ １０ｍｇに対して、グルコアミラーゼが４．２ｍｇ程度、吸着、固定されたシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を、１ｍｌの反応基質、すなわち澱粉の溶解した溶液中に５０ｍｇ分散させることは容易である。この反応系においては、溶液１ｍｌにα−アミラーゼ４．２×５０／１０＝２１ｍｇを活性を有した状態で存在させられることが理解できる。すなわち、１０ｍｇ／ｍｌを超えた酵素量を反応系内に容易に存在させることが可能である。 In general, the solubility of an enzyme, that is, a protein is limited, and if it exceeds that, the phenomenon of aggregation occurs. In the case of glucoamylase, there is no exception, and aggregation occurs at a high concentration exceeding 10 mg / ml, and the enzyme that has caused aggregation does not contribute to the activity. On the other hand, in the case of glucoamylase immobilized on a silica-based mesoporous material, silica-based mesoporous material-starch in which about 4.2 mg of glucoamylase is adsorbed and immobilized with respect to 10 mg of FSM-9 shown above. It is easy to disperse 50 mg of this hydrolase complex in 1 ml of the reaction substrate, ie, a solution in which starch is dissolved. In this reaction system, it can be understood that α-amylase 4.2 × 50/10 = 21 mg can be present in an active state in 1 ml of the solution. That is, an enzyme amount exceeding 10 mg / ml can be easily present in the reaction system.
以上詳述したように、本発明は、シリカ系メソ多孔体と澱粉の加水分解酵素の複合体に関するものであり、本発明により、表面を未処理あるいは適切な溶液で官能基を付与する処理等を施したシリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、該酵素の固定化法として利用して合成したシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体、その製造方法、及びその用途を提供することができる。本発明によれば、シリカ系メソ多孔体の表面に未処理若しくは適切な溶液による処理で官能基を付与することができ、また、その合成条件を制御することで細孔径を制御できることから、固定化酵素として好適なシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を提供することができる。 As described above in detail, the present invention relates to a composite of a silica-based mesoporous material and a starch hydrolyzing enzyme. According to the present invention, the surface is untreated or a functional group is imparted with an appropriate solution. The silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex synthesized by utilizing the enzyme adsorption phenomenon on the silica-based mesoporous material subjected to the above-mentioned method as an immobilization method of the enzyme, its production method, and its use Can be provided. According to the present invention, a functional group can be imparted to the surface of the silica-based mesoporous material by treatment with an untreated or appropriate solution, and the pore diameter can be controlled by controlling the synthesis conditions. It is possible to provide a silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex that is suitable as an enzyme.
本発明では、澱粉の加水分解に際し、原料澱粉の性状や特性に応じて好適な酵素を選択して、その酵素を用いたシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体を、固定化酵素として選択することができる。そのため、酵素の回収が容易であり、繰り返し使用も可能となる他、基質を連続的にシリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体と接触して流通させる連続的な酵素反応の実施も可能となる。 In the present invention, upon hydrolysis of starch, a suitable enzyme is selected according to the properties and properties of the raw starch, and the silica-based mesoporous material-starch hydrolyzing enzyme complex using the enzyme is immobilized enzyme. Can be selected. Therefore, the enzyme can be easily recovered and can be used repeatedly. In addition, the continuous enzyme reaction can be performed by continuously contacting the substrate with the hydrolytic enzyme complex of silica-based mesoporous material and starch. It becomes possible.
また、本発明によれば、固定化により高集積化された酵素を利用することから、酵素の凝集を避けることができるため、酵素を溶液に溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることが可能となり、酵素反応をより効率的に進めることに寄与できる。本発明は、例えば、多種多様な澱粉原料から、複数の酵素を作用させた状態で良質な加水分解物を効率的に製造する新規の澱粉加水分解プロセスのシステムを構築し、提供することを可能とするものとして有用である。 In addition, according to the present invention, since the enzyme highly integrated by immobilization is used, the aggregation of the enzyme can be avoided, so that the enzyme exists in the reaction system at a higher concentration than the state in which the enzyme is dissolved in the solution. This can contribute to the efficient progress of the enzyme reaction. For example, the present invention can construct and provide a novel starch hydrolysis process system that efficiently produces a high-quality hydrolyzate in a state where a plurality of enzymes are allowed to act from a wide variety of starch raw materials. It is useful as
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