JP2009148222A - Method for producing l-glutamic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｌ−グルタミン酸の製造方法に関する。さらに詳しくは、高効率なＬ−グルタミン酸生産機能を付与するために特定の遺伝子操作が施されたコリネ型細菌形質転換体及び該形質転換体によるＬ−グルタミン酸の製造技術に関する。 The present invention relates to a method for producing L-glutamic acid. More specifically, the present invention relates to a coryneform bacterium transformant that has been subjected to a specific genetic manipulation for imparting a highly efficient L-glutamate production function, and a technique for producing L-glutamate using the transformant.
食品のうまみ成分として知られるＬ−グルタミン酸は、従来より、コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料以外にも多くの分野で利用されており、世界中で年間１８０万トン程度生産されている。 Conventionally, L-glutamic acid, which is known as an umami component of food, has been industrially produced by fermentation using coryneform bacteria belonging to the genus Corynebacterium and Brevibacterium. L-glutamic acid is used in many fields other than the seasoning raw material, and is produced about 1.8 million tons annually worldwide.
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）によるＬ−グルタミン酸発酵においては、培地に含まれるビオチンもしくはビオチン活性物質の濃度がＬ−グルタミン酸の生産性に大きく影響することが知られている（非特許文献１）。このため、コリネバクテリウム・グルタミカムによりＬ−グルタミン酸を製造する場合には、（１）ビオチンもしくはビオチン活性物質が適量以下の枯渇条件で培養を行う、（２）培養途中に、ペニシリン（非特許文献２）やＴｗｅｅｎ（登録商標）４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）等の界面活性剤（非特許文献３）をタイミングよく、ビオチン作用抑制物質として添加する、あるいは、（３）培養途中の培養温度を上昇させる等の誘導操作を行うことにより、Ｌ−グルタミン酸の生産が行われてきた。 In L-glutamic acid fermentation by Corynebacterium glutamicum, it is known that the concentration of biotin or a biotin active substance contained in the medium greatly affects the productivity of L-glutamic acid (Non-patent Document 1). ). For this reason, when producing L-glutamic acid with Corynebacterium glutamicum, (1) culturing under conditions where the biotin or biotin active substance is depleted below an appropriate amount, (2) penicillin during the culturing (non-patent document) 2) or a surfactant (Non-patent Document 3) such as Tween (registered trademark) 40 (polyoxyethylene sorbitan monopalmitate) is added in a timely manner as a biotin action inhibitory substance, or (3) culture in the middle of culture Production of L-glutamic acid has been performed by performing an induction operation such as raising the temperature.
しかしながら、コリネバクテリウム・グルタミカムの培養途中にこれらのＬ−グルタミン生産の誘導操作を行うことは、生産技術として煩雑であるという問題点があった。また、（１）のビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導操作を行う場合には、ビオチン枯渇のタイミングによりＬ−グルタミン酸の生産性が変動し、安定してＬ−グルタミン酸を生産できないという問題点があった。
このため、煩雑な誘導操作や高価な薬品試剤の使用を不要とする、Ｌ−グルタミン酸を安定的に高収率で生産することができる技術が求められている。
For this reason, the technique which can produce L-glutamic acid stably and with a high yield which does not require complicated induction | guidance | derivation operation and use of an expensive chemical reagent is calculated | required.
本発明の目的は、コリネ型細菌を用いたＬ−グルタミン酸の生産において、前記の煩雑な誘導操作を行うことなく、Ｌ−グルタミン酸の安定的な高生産が可能な新規技術を提供することである。 An object of the present invention is to provide a novel technique capable of stably producing high amounts of L-glutamic acid without performing the above-described complicated induction operation in the production of L-glutamic acid using coryneform bacteria. .
本発明者らは、従来の発酵法によるＬ−グルタミン酸の生産方法を改良すべく、鋭意研究した結果、コリネ型細菌においてＬ−グルタミン酸の生産に関与すると考えられる多くのタンパク質の中から、Ｌ−グルタミン酸の生産に強く関与すると考えられる特定のタンパク質（図１のＮｏ．５７２で示されるスポットのタンパク質）を見出し、該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）及び遺伝子配列（配列番号１）を同定した。また、このタンパク質をコードする遺伝子をコリネ型細菌に導入して該タンパク質を高発現するコリネ型細菌形質転換体を作製し、ビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地において該形質転換体のＬ−グルタミン酸生産能力を調べたところ、該形質転換体が優れたＬ−グルタミン酸生産能力を発揮することを見出した。さらに、該形質転換体を用いてＬ−グルタミン酸の生産を行うと、従来のグルタミン酸生産のための誘導操作（ビオチン枯渇状態にする、ペニシリンを添加する、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）４０を添加する等）を行うことなくＬ−グルタミン酸を高効率に生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to improve the conventional L-glutamic acid production method by fermentation, the present inventors have found that L-glutamic acid among many proteins considered to be involved in L-glutamic acid production in coryneform bacteria. A specific protein (spot protein indicated by No. 572 in FIG. 1) that is considered to be strongly involved in the production of glutamic acid was found, and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and gene sequence (SEQ ID NO: 1) of the protein were identified. . Further, a gene encoding this protein is introduced into a coryneform bacterium to produce a coryneform bacterium transformant that highly expresses the protein, and the trait is obtained in a medium that has not been subjected to induction of L-glutamate production by biotin depletion. When the L-glutamic acid-producing ability of the transformant was examined, it was found that the transformant exhibited an excellent L-glutamic acid-producing ability. Further, when L-glutamic acid is produced using the transformant, conventional induction operation for glutamic acid production (biotin-depleted state, penicillin is added, or Tween (registered trademark) 40 is added, etc.) It was found that L-glutamic acid can be produced with high efficiency without carrying out (1), and the present invention has been completed.
すなわち本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子により形質転換されたコリネ型細菌を培地中で培養する工程と、該コリネ型細菌により培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、該Ｌ−グルタミン酸を培地から採取する工程とを含むことを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造方法。
（ａ）（ａ−１）配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ｂ−１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は（ｂ−２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２）遺伝子が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831株由来のものであることを特徴とする前記（１）に記載のＬ−グルタミン酸の製造方法。
（３）形質転換されるコリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）であることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載のＬ−グルタミン酸の製造方法。
（４）コリネバクテリウム・グルタミカムが、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC31831株、ATCC13020株、ATCC13032株、ATCC13060株、ATCC14020株、又はR株(FERM P-18976)であることを特徴とする前記（３）に記載のＬ−グルタミン酸の製造方法。
That is, the present invention relates to the following (1) to (6).
(1) a step of culturing a coryneform bacterium transformed with the following gene (a) or (b) in a medium; and L-glutamic acid produced and accumulated in the medium by the coryneform bacterium, A method for producing L-glutamic acid, comprising a step of collecting glutamic acid from a medium.
(A) (a-1) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (a-2) DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence of (a-1) and stringent DNA encoding a protein that has a function of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium that does not undergo L-glutamic acid production induction treatment by biotin depletion, and that hybridizes under conditions
(B) (b-1) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b-2) one or more amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, Gene (2) gene encoding a protein consisting of a substituted or added amino acid sequence and having an action of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production by biotin depletion Is derived from Corynebacterium glutamicum ATCC31831 strain, the method for producing L-glutamic acid according to (1) above,
(3) The coryneform bacterium to be transformed is Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, or Brevibacterium lactofermentum (1) Or the method for producing L-glutamic acid according to (2).
(4) The above (3), wherein the Corynebacterium glutamicum is Corynebacterium glutamicum ATCC31831, ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060, ATCC14020, or R (FERM P-18976) A method for producing L-glutamic acid as described in 1. above.
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子をコリネ型細菌に導入したことを特徴とするコリネ型細菌形質転換体。
（ａ）（ａ−１）配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ｂ−１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は（ｂ−２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子
(5) A coryneform bacterium transformant obtained by introducing the following gene (a) or (b) into a coryneform bacterium.
(A) (a-1) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (a-2) DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence of (a-1) and stringent DNA encoding a protein that has a function of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium that does not undergo L-glutamic acid production induction treatment by biotin depletion, and that hybridizes under conditions
(B) (b-1) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b-2) one or more amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A gene encoding a protein consisting of a substituted or added amino acid sequence and having an action of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production by biotin depletion
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
（ａ）（ａ−１）配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ｂ−１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は（ｂ−２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子
(6) A recombinant vector comprising the following gene (a) or (b):
(A) (a-1) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (a-2) DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence of (a-1) and stringent DNA encoding a protein that has a function of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium that does not undergo L-glutamic acid production induction treatment by biotin depletion, and that hybridizes under conditions
(B) (b-1) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b-2) one or more amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A gene encoding a protein consisting of a substituted or added amino acid sequence and having an action of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production by biotin depletion
本発明によれば、Ｌ−グルタミン酸製造方法に関し、ビオチン枯渇、Ｔｗｅｅｎ４０等の脂肪酸エステル界面活性剤の使用、ペニシリンの使用及び培養温度の上昇操作等の制御を行うことなくコリネ型細菌形質転換体を培養し、このコリネ型細菌形質転換体をグルタミン酸生産用液体培地に供するだけで高効率にＬ−グルタミン酸を製造できる。すなわち、コリネ型細菌を用いるＬ−グルタミン酸発酵において、Ｌ−グルタミン酸を従来よりも簡便に、しかも安定的に高い生産性で製造することができる。 The present invention relates to a method for producing L-glutamic acid, wherein a coryneform bacterium transformant is obtained without controlling biotin depletion, use of fatty acid ester surfactants such as Tween 40, use of penicillin, and operation for raising the culture temperature. L-glutamic acid can be produced with high efficiency simply by culturing and using this coryneform bacterium transformant in a liquid medium for glutamic acid production. That is, in L-glutamic acid fermentation using coryneform bacteria, L-glutamic acid can be produced more easily and stably with higher productivity than before.
以下に、本発明を詳述する。
（コリネ型細菌形質転換体）
本発明においては、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子により形質転換されたコリネ型細菌（コリネ型細菌形質転換体）を用いてＬ−グルタミン酸を製造する。
（ａ）（ａ−１）配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｂ）（ｂ−１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は（ｂ−２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）又は（ｂ）の遺伝子としては、（ａ−１）配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ｂ−１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が好ましい。
The present invention is described in detail below.
(Coryne type bacterial transformant)
In the present invention, L-glutamic acid is produced using a coryneform bacterium (coryneform bacterium transformant) transformed with the following gene (a) or (b).
(A) (a-1) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (a-2) DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence of (a-1) and stringent DNA encoding a protein that hybridizes under conditions and has a function of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production by biotin depletion;
(B) (b-1) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b-2) one or more amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A gene encoding a protein consisting of a substituted or added amino acid sequence and having an action of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production by biotin depletion.
As the gene (a) or (b), (a-1) a gene encoding a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (b-1) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Is preferred.
上記(ａ）又は（ｂ）の遺伝子は、通常Ｌ−グルタミン酸生産菌、すなわち菌体内でＬ−グルタミン酸を生合成し、生合成したＬ−グルタミン酸を菌体内に蓄積するか、又は菌体外に排出する菌が保有するものである。このようなＬ−グルタミン酸生産菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）が挙げられる。 The gene of the above (a) or (b) is usually an L-glutamic acid producing bacterium, that is, L-glutamic acid is biosynthesized in the microbial cell, and the biosynthesized L-glutamic acid is accumulated in the microbial cell or outside the microbial cell. It is owned by the bacteria to be discharged. Examples of such L-glutamic acid-producing bacteria include Corynebacterium glutamicum.
例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）によるＬ−グルタミン酸の生産では、菌体内でクエン酸回路（ＴＣＡ回路）の中間生成物がＬ−グルタミン酸に変換され、該Ｌ−グルタミン酸が菌体内に蓄積するか、又は菌体外へ排出されて培地にグルタミン酸が生成蓄積する。 For example, in the production of L-glutamic acid by Corynebacterium glutamicum, an intermediate product of a citrate cycle (TCA cycle) is converted into L-glutamic acid in the microbial cells, and the L-glutamic acid accumulates in the microbial cells. Or it is discharged out of the cells and glutamic acid is produced and accumulated in the medium.
本発明では、ビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質（以下、単に「Ｌ−グルタミン酸生産促進作用を有するタンパク質」ともいう）をコードする遺伝子を使用する。「ビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地（以下、単に「誘導処理が施されていない培地」ともいう）」とは、培地中のビオチン濃度が通常コリネ型細菌を用いるＬ−グルタミン酸の生産において使用されるビオチン枯渇状態より高い濃度であればよいが、例えば、ビオチン濃度が約１０μｇ／Ｌ以上、さらには２０μｇ／Ｌ程度の培地が挙げられる。すなわち本発明の製造方法によれば、このような培地においてもＬ−グルタミン酸を高い生産性で製造できる。 In the present invention, a protein having an action of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production due to biotin depletion (hereinafter simply referred to as “protein having an action of promoting L-glutamic acid production”). The gene encoding (also called) is used. “A medium not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production by biotin depletion (hereinafter, also simply referred to as“ medium not subjected to induction treatment ”) means that the concentration of biotin in the medium usually uses coryneform bacteria. -The concentration may be higher than the biotin-depleted state used in the production of glutamic acid. For example, a medium having a biotin concentration of about 10 µg / L or more, further about 20 µg / L can be mentioned. That is, according to the production method of the present invention, L-glutamic acid can be produced with high productivity even in such a medium.
本発明におけるＬ−グルタミン酸生産促進作用を有するタンパク質は、該タンパク質を高発現するコリネ型細菌形質転換体を誘導処理が施されていない培地中で培養した場合に、該形質転換体によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するものである。従って、本発明の製造方法では、ビオチン枯渇（制限）による誘導操作を行わずにＬ−グルタミン酸を効率よく製造することができる。 The protein having L-glutamic acid production promoting action according to the present invention is obtained by cultivating a coryneform bacterial transformant that highly expresses the protein in a medium not subjected to induction treatment. It has the effect of promoting production. Therefore, in the production method of the present invention, L-glutamic acid can be produced efficiently without performing an induction operation due to biotin depletion (restriction).
本発明におけるＬ−グルタミン酸生産促進作用を有するタンパク質は、誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有する限り、他の培地において、コリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するものであってもよい。 As long as the protein having L-glutamic acid production promoting action in the present invention has an action of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium not subjected to induction treatment, L- It may have an action of promoting glutamic acid production.
コードされるタンパク質がＬ−グルタミン酸生産促進作用を有する限り、上記(a)又は（ｂ）の遺伝子の由来微生物の種類は限定されない。好ましくは、（ａ）又は（ｂ）の遺伝子が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831株由来のものであることである。 As long as the encoded protein has L-glutamic acid production promoting action, the type of microorganism derived from the gene (a) or (b) is not limited. Preferably, the gene of (a) or (b) is derived from Corynebacterium glutamicum ATCC31831 strain.
配列番号１で表わされる塩基配列は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831由来のＤＮＡ配列である。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列」とは、例えば、配列番号１に示すＤＮＡ配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法又はプラーク・ハブリダイゼーション法等により得られるＤＮＡを意味する。
「ストリンジェントな条件」とは、一般的な条件、例えば、Molecular Cloning, A laboratory Manual, Second Edition,1989,Vol.12,P11,45等に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。
The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a DNA sequence derived from Corynebacterium glutamicum ATCC31831.
Here, the “DNA sequence that hybridizes under stringent conditions” refers to, for example, a colony hybridization method or a plaque hazard using DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a probe. It means DNA obtained by a hybridization method or the like.
“Stringent conditions” refers to general conditions such as those described in Molecular Cloning, A laboratory Manual, Second Edition, 1989, Vol. 12, P11, 45, and the like. Specifically, it refers to the case where hybridization occurs at a temperature 5 to 10 ° C. lower than the melting temperature (Tm) of the complete hybrid.
また、（ｂ）の遺伝子としては、該遺伝子にコードされるタンパク質のＬ−グルタミン酸生産促進作用が保持されている限り、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１個若しくは複数個（約２〜１０個、好ましくは２〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている遺伝子であってもよい。 In addition, as the gene of (b), one or more (about 2 to 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as long as the L-glutamic acid production promoting action of the protein encoded by the gene is retained. Individual, preferably about 2 to 5 amino acids) may be a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence deleted, substituted or added.
本発明で形質転換されるコリネ型細菌の例として、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）等が挙げられる。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムとして、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC31831株、ATCC13020株、ATCC13032株、ATCC13060株、ATCC14020株、又はR株(FERM P-18976)等が挙げられ、コリネバクテリウム・フラバムとしては、ATCC13826、ATCC14067及びMJ-233(FERM BP-1497)株等が挙げられ、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムとしては、ATCC13869株を例示することができる。 Examples of coryneform bacteria transformed by the present invention include Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, and the like. Specific examples of Corynebacterium glutamicum include Corynebacterium glutamicum ATCC31831 strain, ATCC13020 strain, ATCC13032 strain, ATCC13060 strain, ATCC14020 strain, or R strain (FERM P-18976), and the like. Examples of flavums include ATCC13826, ATCC14067, and MJ-233 (FERM BP-1497) strain. Examples of Brevibacterium lactofermentum include ATCC13869 strain.
（コリネ型細菌形質転換体の作製方法）
本発明におけるコリネ型細菌形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子をコリネ型細菌に導入し、該コリネ型細菌を形質転換することによって作製することができる。（ａ）又は（ｂ）の遺伝子をコリネ型細菌に導入したコリネ型細菌形質転換体も、本発明の１つである。
(Method for producing coryneform bacterial transformant)
The coryneform bacterium transformant in the present invention can be produced by introducing the gene (a) or (b) into a coryneform bacterium and transforming the coryneform bacterium. A coryneform bacterium transformant in which the gene of (a) or (b) is introduced into a coryneform bacterium is also one aspect of the present invention.
（１）遺伝子の単離及び同定
（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を単離する方法及び同定する方法としては、まず、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を培養し、次いでペニシリンや、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０等の界面活性剤を培養液に添加し、ペニシリン又は界面活性剤の添加により、添加前よりもコリネ型細菌で高発現しているタンパク質（機能未知であるが多数存在する：後記参照）をプロテオーム解析する。次いで、プロテオーム解析により得られたタンパク質情報から、該タンパク質をコードする遺伝子の情報を得る。各遺伝子情報に基づく、それぞれのコリネ型細菌形質転換体を創製し、該形質転換体の誘導処理が施されていない培地中でのＬ−グルタミン酸生産性を逐一調べることにより、本発明の目的とする上記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を得ることができる。
(1) Isolation and identification of gene As a method for isolating and identifying the gene of (a) or (b), first, a coryneform bacterium having L-glutamic acid-producing ability is cultured, then penicillin, A surfactant such as Tween (registered trademark) 40 is added to the culture solution, and by adding penicillin or a surfactant, a protein that is highly expressed in coryneform bacteria than before the addition (the function is unknown, but there are many : See below) Proteome analysis. Next, information on a gene encoding the protein is obtained from the protein information obtained by proteome analysis. By creating each coryneform bacterial transformant based on each gene information and examining L-glutamic acid productivity in a medium not subjected to induction treatment of the transformant, Thus, the gene (a) or (b) can be obtained.
なお、後述するペニシリン、又はペニシリン及びクロラムフェニコールの添加により発現が上昇したタンパク質が全てＬ−グルタミン酸の高効率な生産に関連するものとは限らない。
図１は、ペニシリン添加後にコリネ型細菌において発現が上昇するタンパク質の二次元電気泳動ゲル上の位置を示したものである。ペニシリン添加後、その発現が添加前に比べて上昇するタンパク質は非常に多く存在する。
本発明者らは、これらの発現が上昇したタンパク質の中の、約２６種を同定し、その中よりさらに６種を選択して、後述する遺伝子工学的方法によりコリネ型細菌形質転換体を創製し、誘導処理が施されていない培地を使用して各々の形質転換体のＬ−グルタミン酸生産能力を調べた。その結果、図１中のＮｏ．５７２で示されるタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された株が優れたＬ−グルタミン酸生産能力を発揮することを見出した結果、本発明に到達したものである。図１のＮｏ．５７２で示されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
Note that not all penicillin, which will be described later, or a protein whose expression has been increased by the addition of penicillin and chloramphenicol is related to highly efficient production of L-glutamic acid.
FIG. 1 shows the positions on the two-dimensional electrophoresis gel of proteins whose expression increases in coryneform bacteria after the addition of penicillin. There are many proteins whose expression increases after the addition of penicillin compared to before the addition.
The present inventors identified about 26 types of these proteins with increased expression, selected 6 types among them, and created coryneform bacterial transformants by a genetic engineering method described later. Then, the L-glutamic acid-producing ability of each transformant was examined using a medium not subjected to induction treatment. As a result, No. 1 in FIG. As a result of finding that a strain transformed with a gene encoding the protein represented by 572 exhibits excellent L-glutamic acid-producing ability, the present invention has been achieved. No. 1 in FIG. The amino acid sequence of the protein represented by 572 is shown in SEQ ID NO: 2.
上記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を同定するためのプロテオーム解析に使用されることになる、ペニシリン等の添加前の菌体（コリネ型細菌）の培養は以下の方法で行うことができる。
タンパク質のプロテオーム解析に使用されたコリネ型細菌と、後述する本発明のＬ−グルタミン酸製造のために使用されるコリネ型細菌（形質転換されるコリネ型細菌）とは、同じ菌株であっても、異なる菌株であってもよい。プロテオーム解析に使用する好ましいコリネ型細菌は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC31831株である。
Cultivation of bacterial cells (coryneform bacteria) before addition of penicillin or the like to be used for proteome analysis for identifying the gene (a) or (b) can be performed by the following method.
Even if the coryneform bacterium used for protein proteomic analysis and the coryneform bacterium (transformed coryneform bacterium) used for the production of L-glutamic acid of the present invention described later are the same strain, Different strains may be used. A preferred coryneform bacterium used for proteome analysis is Corynebacterium glutamicum ATCC31831.
i）培養方法
i)-1前々培養
前々培養では、−８０℃で凍結保存している菌体を融かして、融かした菌体を表１に示す組成の平板培地に約２００μＬ（マイクロリットル）滴下し、コーンラージ棒で全体に塗布する。そして、これを約３０℃で２４時間静置培養する。
i) Culture method
i) -1 Pre-culture In pre-culture, the cells stored frozen at −80 ° C. are thawed, and the thawed cells are about 200 μL (microliter) in a plate medium having the composition shown in Table 1. Drip and apply to the whole with a corn large stick. And this is statically cultured at about 30 degreeC for 24 hours.
i)-2 前培養
前培養は前々培養で得られた菌体の３分の２を平板培地からかきとり、表２に示す組成の液体培地（培養液）４０ｍＬ（ミリリットル）に植菌し、約３１℃、１２０ｒｐｍ、１７時間の条件で振とう培養する。
i) -2 Preculture In preculture, 2/3 of the cells obtained in the previous culture are scraped from the plate medium and inoculated into 40 mL (milliliter) of a liquid medium (culture solution) having the composition shown in Table 2. Culture with shaking at about 31 ° C., 120 rpm, 17 hours.
i)-3 本培養
本培養においては、前培養と同じ表２で示される液体培地４０ｍＬに前培養溶液１ｍＬを植菌し、約３１℃、１２０ｒｐｍで振とう培養する。なお、前培養、本培養及びＬ−グルタミン酸を生産させる培養における培地の経時的なｐＨ調整は、乾熱滅菌したＣａＣＯ３（炭酸カルシウム）を培養液に添加して行うことができる。
i) -3 Main Culture In the main culture, 1 mL of the preculture solution is inoculated into 40 mL of the liquid medium shown in Table 2 as in the preculture, and cultured with shaking at about 31 ° C. and 120 rpm. In addition, the time-dependent pH adjustment of the culture medium in the preculture, the main culture, and the culture for producing L-glutamic acid can be performed by adding CaCO 3 (calcium carbonate) sterilized by dry heat to the culture solution.
ii）高効率なＬ−グルタミン酸の生産に関与するタンパク質の単離と同定
本発明は、ペニシリンやＴｗｅｅｎ（登録商標）４０等の界面活性剤をコリネ型細菌の培養液に添加し、添加後に菌体内で発現が上昇する多くのタンパク質の中から、本発明で特定されたＬ−グルタミン酸生産促進作用を有するタンパク質を選定することにより、到達されるものである。
従って、このような特定のタンパク質を得るためには、例えば、培地へのペニシリン添加により菌体内で発現が上昇するタンパク質の単離及び同定を行う。以下に、ペニシリン添加により菌体内で発現が上昇するタンパク質の単離及び同定方法を説明する。
ii) Isolation and identification of proteins involved in high-efficiency L-glutamic acid production In the present invention, a surfactant such as penicillin or Tween (registered trademark) 40 is added to a culture solution of coryneform bacteria, and the bacteria are added after the addition. This is achieved by selecting a protein having an L-glutamic acid production promoting action specified in the present invention from many proteins whose expression is increased in the body.
Therefore, in order to obtain such a specific protein, for example, isolation and identification of a protein whose expression increases in the microbial cells due to the addition of penicillin to the medium is performed. Below, the isolation and identification method of the protein whose expression rises in a microbial cell by penicillin addition is demonstrated.
ペニシリンの添加は、本培養した培養菌体の光学濃度（ＯＤ６６０：測定は、測定範囲が０．０３〜０．４の範囲を超えないようにサンプルを希釈して行う）が１５程度に増大したときに培地にペニシリンを１０μＭ程度加えればよい。このとき、ペニシリン添加により発現が上昇し、Ｌ−グルタミン酸の生産に影響するタンパク質の単離及び同定を容易にするためには、ペニシリン添加直後にクロラムフェニコールを８０μＭ程度培地に加えればよい。 The addition of penicillin increased the optical density (OD660: measurement was performed by diluting the sample so that the measurement range did not exceed the range of 0.03 to 0.4) to about 15 when the cultured cells were cultured. Sometimes about 10 μM penicillin may be added to the medium. At this time, in order to facilitate the isolation and identification of the protein whose expression is increased by the addition of penicillin and affects the production of L-glutamic acid, about 80 μM of chloramphenicol may be added to the medium immediately after the addition of penicillin.
ペニシリン添加前後のタンパク質発現の上昇は、いわゆる、公知のプロテオーム解析で調べることができる。
プロテオーム解析においては、ペニシリンを添加して培養したコリネ型細菌からタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質（混合物）を二次元電気泳動により個々のタンパク質に分離する。次いで、分離した各タンパク質を同定する。
The increase in protein expression before and after the addition of penicillin can be examined by so-called known proteome analysis.
In proteome analysis, proteins are extracted from coryneform bacteria cultured with penicillin added, and the extracted proteins (mixtures) are separated into individual proteins by two-dimensional electrophoresis. Each separated protein is then identified.
タンパク質抽出方法については、以下の手順で行うことができる。
まず、−８０℃に保存しておいた菌体（コリネ型細菌）に、例えば、表３に示す組成のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を約１ｍＬ加えて菌体を懸濁させる。これを遠心分離し、上清を取り除く。この操作を２回程度繰り返すことが好ましい。
The protein extraction method can be performed by the following procedure.
First, for example, about 1 mL of a sodium phosphate buffer solution (pH 7.0) having the composition shown in Table 3 is added to the cells (coryneform bacteria) stored at −80 ° C. to suspend the cells. This is centrifuged and the supernatant is removed. This operation is preferably repeated about twice.
得られた菌体の沈殿に、リン酸ナトリウム緩衝液を２００μＬ程度、及びプロテアーゼ阻害物質カクテル（Protease inhibitor cocktail）を２５μＬ程度加える。次いでこれを、例えば、Ultra sonic homogenizer UH−５０（ＳＭＴ社製）を用いて超音波破砕することによってタンパク質を抽出する。 About 200 μL of sodium phosphate buffer and about 25 μL of protease inhibitor cocktail are added to the resulting bacterial cell precipitate. Subsequently, the protein is extracted by sonication using, for example, Ultrasonic homogenizer UH-50 (manufactured by SMT).
プロテオーム解析に使用するコリネ型細菌として、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)を使用する場合には、超音波破砕により細胞内タンパク質の機能を保持させたまま抽出すべく、１５秒間程度超音波を与え、次いで１５秒間程度冷却する操作を６回程度繰り返すことが好ましい。
この超音波破砕物を、例えば、４℃、１０，０００ｒｐｍ、１０分の条件で遠心分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに移し、これをタンパク質単離及び同定用のサンプルとする。
For example, when using Corynebacterium glutamicum as a coryneform bacterium used for proteome analysis, it is necessary to perform extraction for about 15 seconds while maintaining the function of intracellular proteins by ultrasonic disruption. It is preferable to repeat the operation of applying sound waves and then cooling for about 15 seconds about 6 times.
The sonicated product is centrifuged, for example, at 4 ° C., 10,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant is transferred to another Eppendorf tube, which is used as a sample for protein isolation and identification.
このようにして、（１）ペニシリン、又はペニシリン及びクロラムフェニコールの添加直前の菌体から抽出したタンパク質、及び（２）添加後の菌体から抽出したタンパク質を、それぞれ二次元電気泳動に供することにより、ペニシリン添加前後のタンパク質の発現量の変化を調べることができる。具体的には、電気泳動終了後に電気泳動ゲル上で展開（分離）されているタンパク質をＳＹＰＲＯ Ｒｅｄで染色し、ＳＹＰＲＯ Ｒｅｄで染色された各タンパク質スポットの蛍光強度を測定して比較することにより、タンパク質の発現変化を調べることができる。実施例に示すように、ペニシリン添加により発現量が上昇するタンパク質のスポットは多く存在する。ペニシリン添加により発現量が上昇するタンパク質選定の目安としては、その蛍光強度がペニシリン添加前のタンパク質の蛍光強度と比較して約３倍以上であれば、Ｌ−グルタミン酸の高効率な生産に関与する一次候補タンパク質と選定される。最終的には、各タンパク質をコードする遺伝子情報を得て、該遺伝子情報に基づき形質転換体を創製し、本発明技術が得られる。 In this way, (1) the protein extracted from the bacterial body immediately before the addition of penicillin, or penicillin and chloramphenicol, and (2) the protein extracted from the bacterial body after the addition are each subjected to two-dimensional electrophoresis. Thus, the change in the expression level of the protein before and after the addition of penicillin can be examined. Specifically, after the electrophoresis is completed, the protein developed (separated) on the electrophoresis gel is stained with SYPRO Red, and the fluorescence intensity of each protein spot stained with SYPRO Red is measured and compared. Changes in protein expression can be examined. As shown in the Examples, there are many protein spots whose expression levels are increased by the addition of penicillin. As a guideline for selecting a protein whose expression level is increased by the addition of penicillin, if the fluorescence intensity is about 3 times or more compared to the fluorescence intensity of the protein before the addition of penicillin, it is involved in highly efficient production of L-glutamic acid. Selected as the primary candidate protein. Finally, gene information encoding each protein is obtained, and a transformant is created based on the gene information, thereby obtaining the technique of the present invention.
二次元電気泳動ゲル上で確認できたタンパク質の中で、ペニシリン添加直前のものと比較して、発現上昇しているタンパク質がＬ−グルタミン酸の生産に関与していると考えることができる。発現量が上昇したタンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析装置を用いて分析することにより、ターゲットとなるタンパク質を同定することができる。 Among the proteins confirmed on the two-dimensional electrophoresis gel, it can be considered that the protein whose expression is increased is involved in the production of L-glutamic acid as compared with the protein immediately before the addition of penicillin. By analyzing a protein with an increased expression level using a MALDI-TOF MS or an LC-MS / MS analyzer, a target protein can be identified.
同定したタンパク質はアミノ酸配列として情報が得られるので、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)における既知のゲノム配列、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032株のゲノム配列のコドンからアミノ酸配列を決定し、同定したタンパク質とマッチングする箇所をコンピューターを用いて解析する。このとき、使用する解析ソフトとしては、例えば、ＭＡＳＣＯＴ（Matrix Science社、USA）を用いるとよい。
そして、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のゲノム配列から決定されたアミノ酸配列が、同定したタンパク質のアミノ酸配列と高精度にマッチングした場合、そのアミノ酸配列をコードしているコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の遺伝子は、形質転換のために使用される対象候補とすることができる。
上記のようにして、本発明で用いられる（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を同定することができる。
Since the identified protein can be obtained as an amino acid sequence, the amino acid sequence from the known genomic sequence in Corynebacterium glutamicum, for example, the codon of the genomic sequence of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Determine and match the identified protein with a computer. At this time, for example, MASCOT (Matrix Science, USA) may be used as analysis software to be used.
When the amino acid sequence determined from the genome sequence of Corynebacterium glutamicum matches with the amino acid sequence of the identified protein with high accuracy, Corynebacterium glutamicum encoding the amino acid sequence ( Corynebacterium glutamicum) gene can be a candidate for use for transformation.
As described above, the gene (a) or (b) used in the present invention can be identified.
本発明のコリネ型細菌形質転換体は、上記で同定した遺伝子、すなわち上記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子をコリネ型細菌導入して形質転換することによって作製することができる。具体的には、（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を含有する組換えベクターを作製し、該ベクターによりコリネ型細菌を形質転換する。（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を含有する組換えベクターも、本発明の１つである。 The coryneform bacterium transformant of the present invention can be prepared by introducing the above-identified gene, that is, the gene of (a) or (b) above into a coryneform bacterium for transformation. Specifically, a recombinant vector containing the gene (a) or (b) is prepared, and a coryneform bacterium is transformed with the vector. A recombinant vector containing the gene (a) or (b) is also one aspect of the present invention.
（２）ベクターの構築
i） プライマーの設計
まず、目的とするタンパク質をコードする遺伝子配列、すなわち（ａ）又は（ｂ）の遺伝子の配列をＰＣＲ法により増幅するための、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。例えば、これらの遺伝子の配列を増幅させるためのプライマーとして、配列番号４及び５で表わされる塩基配列のプライマー等が挙げられる。これらのプライマーを用い、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC31831株の染色体を鋳型として、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができる。
(2) Construction of vector
i) Primer Design First, an oligonucleotide primer for amplifying the gene sequence encoding the target protein, that is, the gene sequence (a) or (b) by the PCR method is designed. For example, primers for amplifying the sequences of these genes include primers having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 4 and 5. Using these primers, PCR amplification of a gene fragment can be performed using, for example, the chromosome of Corynebacterium glutamicum ATCC31831 as a template.
ii）ＰＣＲによる遺伝子断片の取得
ＰＣＲは、公知のＰＣＲ装置、例えば、サーマルサイクラー等を利用することができる。ＰＣＲのサイクルは公知の技術に従って行なわれてよく、例えば表４に示す組成の反応液中、表５に示す反応条件で実施することができる。
ＰＣＲ断片の精製及びゲルからのＤＮＡ抽出はWizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社）を用いて容易に行なうことができる。
ii) Acquisition of gene fragment by PCR For PCR, a known PCR device such as a thermal cycler can be used. The PCR cycle may be performed according to a known technique. For example, it can be performed in a reaction solution having the composition shown in Table 4 under the reaction conditions shown in Table 5.
Purification of PCR fragments and extraction of DNA from the gel can be easily performed using Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega).
iii）プラスミドＤＮＡの調製
ＰＣＲにより得られた遺伝子断片の塩基配列の決定は、以下のように行うことができる。まず、ＰＣＲによって増幅した遺伝子断片を、適当なクローニングベクター（プラスミドベクター）に導入する。次いで、このプラスミドベクターを、微生物、例えば大腸菌等に導入し、該菌株を形質転換する。大腸菌の形質転換は、公知の方法、例えば、エレクトロポレーション法、塩化カルシウム法等により行なうことができる。
iii) Preparation of plasmid DNA The base sequence of a gene fragment obtained by PCR can be determined as follows. First, a gene fragment amplified by PCR is introduced into an appropriate cloning vector (plasmid vector). Next, this plasmid vector is introduced into a microorganism such as Escherichia coli, and the strain is transformed. Transformation of E. coli can be performed by a known method such as electroporation method or calcium chloride method.
次いで、形質転換された大腸菌を培養し、培養物から菌体を回収する。回収された菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の技術によって行なうことができ、また市販のプラスミド抽出キットを用いて簡便に抽出することもできる。
具体的には、例えば、回収した菌体にＲＮａｓｅを加え、さらに０．１％ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳ、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を用いる方法にて簡易的にプラスミドの抽出を行なうことができる。例えば、大腸菌の場合には、以下の手順で行なうのが好ましい。栄養豊富な培地で培養した培養液１．５〜３．０ｍＬから集菌した大腸菌形質転換体の菌体に、表６に示す組成の溶液Ｉを２００μＬと１０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ溶液１μＬとを加え懸濁する。次に表７に示す組成の溶液ＩＩを４００μＬ加えて緩やかに混合して１０分間氷水中で静置し、さらに、表８に示す組成の溶液ＩＩＩを３００μＬ加えて緩やかに混合した後、１０分程度以上氷水中で静置する。溶液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した後、上清に６００μＬのイソプロピルアルコールを加えて混合し、室温で２０分以上静置することによりＤＮＡを沈殿させる。さらに、この溶液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）することによりＤＮＡを回収し、得られたプラスミドＤＮＡの沈殿を乾燥させた後、表９に示す組成のＴＥ緩衝液２００μＬに沈殿を溶解させる。
Next, the transformed E. coli is cultured, and the cells are recovered from the culture. Plasmid DNA is extracted from the collected cells. Plasmid DNA can be extracted by a known technique, or can be easily extracted using a commercially available plasmid extraction kit.
Specifically, for example, plasmids can be easily extracted by a method using 0.1% NaOH, 0.5% SDS, 3M sodium acetate solution (pH 5.2) by adding RNase to the collected cells. Can be done. For example, in the case of Escherichia coli, the following procedure is preferable. 200 μL of solution I having the composition shown in Table 6 and 1 μL of 10 mg / mL RNase solution are added to the cells of E. coli transformants collected from 1.5 to 3.0 mL of the culture solution cultured in a nutrient-rich medium. It becomes cloudy. Next, 400 μL of the solution II having the composition shown in Table 7 was added and gently mixed and allowed to stand in ice water for 10 minutes. Further, 300 μL of the solution III having the composition shown in Table 8 was added and gently mixed, and then 10 minutes. Leave in ice water for more than about After centrifuging the solution (15,000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.), 600 μL of isopropyl alcohol is added to the supernatant and mixed, and the mixture is allowed to stand at room temperature for 20 minutes or more to precipitate DNA. Furthermore, this solution was centrifuged (15,000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.) to recover DNA, and the resulting plasmid DNA precipitate was dried, and then diluted to 200 μL of TE buffer having the composition shown in Table 9. Dissolve the precipitate.
その後、２００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）溶液を加えて激しく混合した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃）して、水層に２０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）と４００μＬのエタノールとを添加して混合し、−２０℃で３０分以上放置することによりＤＮＡを沈殿させることができる。 Thereafter, 200 μL of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25/24/1) solution was added and mixed vigorously, followed by centrifugation (15,000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.), and 20 μL of 3M sodium acetate was added to the aqueous layer. DNA can be precipitated by adding and mixing a solution (pH 5.2) and 400 μL of ethanol, and allowing to stand at −20 ° C. for 30 minutes or more.
遠心分離して得られるＤＮＡに５００μＬの７０％エタノールを用いてプラスミドＤＮＡを洗浄することでその純度を上げることができる。減圧乾燥したプラスミドＤＮＡを２０〜５０μＬのＴＥ緩衝液又は純水（MilliQ）に溶解させプラスミド溶液として使用することができる。 The purity of the DNA obtained by centrifugation can be increased by washing the plasmid DNA with 500 μL of 70% ethanol. The plasmid DNA dried under reduced pressure can be dissolved in 20 to 50 μL of TE buffer or pure water (MilliQ) and used as a plasmid solution.
得られたプラスミドＤＮＡが目的の遺伝子サイズであるかどうかは、アガロースゲル電気泳動を３５分程度行なうことで確認することができる。
また、抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、遺伝子の配列を確認することができる。大腸菌形質転換体中のプラスミドＤＮＡの塩基配列の決定は、BigDye terminator cycle sequencing kit V. 1.1 (Applied Biosystems 社)を用いてdideoxy法により行うことができる。
Whether or not the obtained plasmid DNA has the target gene size can be confirmed by performing agarose gel electrophoresis for about 35 minutes.
Moreover, the sequence of a gene can be confirmed by determining the base sequence of the extracted plasmid DNA. Determination of the base sequence of plasmid DNA in the E. coli transformant can be performed by the dideoxy method using BigDye terminator cycle sequencing kit V. 1.1 (Applied Biosystems).
iv)プラスミドＤＮＡのベクターへの組換えベクターへの挿入
得られたプラスミドＤＮＡを特定のベクターに組み込むライゲーション反応を行い、コリネ型細菌に（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を導入するための組換えベクターを作製する。この組換えベクターをコリネ型細菌に導入して該細菌を形質転換することにより、コリネ型細菌形質転換体を得ることができる。
上記ライゲーション反応において、プラスミド同士でライゲーションしてしまうセルフライゲーションを防ぐには、Bacterial alkaline phosphatase(Ｅ.coli C75)(NipponGene Co.Ltd)によるＤＮＡ末端の脱リン酸化を行なった後にライゲーション反応を行なうとよい。
iv) Insertion of plasmid DNA into a recombinant vector Recombination for introducing the gene (a) or (b) into a coryneform bacterium by performing a ligation reaction in which the obtained plasmid DNA is incorporated into a specific vector Create a vector. By introducing this recombinant vector into a coryneform bacterium and transforming the bacterium, a coryneform bacterium transformant can be obtained.
In the above ligation reaction, in order to prevent self-ligation that causes ligation between plasmids, the ligation reaction is performed after dephosphorylation of DNA ends with Bacterial alkaline phosphatase (E. coli C75) (NipponGene Co. Ltd). Good.
（３）宿主による目的遺伝子の発現
大腸菌形質転換体中のプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定した後、宿主であるコリネ型細菌、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC31831株に組換えベクターを導入して形質転換する際には、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等公知の方法で上記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を含有する組換えベクターの導入を行なうことができる。これらの中では、エレクトロポレーション法が好ましい。
(3) Expression of target gene by host After determining the nucleotide sequence of plasmid DNA in the E. coli transformant, the recombinant vector is transferred to the host coryneform bacterium, for example, Corynebacterium glutamicum ATCC31831 strain. When introducing and transforming, a recombinant vector containing the gene (a) or (b) above should be introduced by a known method such as calcium chloride / rubidium chloride method, calcium phosphate method, electroporation method, etc. Can do. Among these, the electroporation method is preferable.
上記の方法は遺伝子工学実験の常法に基づいて行なうことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入及び発現法は多くの実験書に掲載されているので（例えば、Samrook,J. ,Russel.D.W.,Molecular Cloning A Laboratory Mannual,3rd Edition, CSHL Press, ,2001: Hopwood.D.A., Bibb,M.J., Chater, K.F., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M., Schrempf, H. Genetic manipulation of Streptmyces: Alaboratory manual, The John Lnnes institute, Norwich, UK, 1985等）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入及び発現を行なうことができる。 The above method can be performed based on a conventional method of genetic engineering experiment. Information on vectors of various microorganisms such as E. coli and actinomycetes and methods for introducing and expressing foreign genes are published in many experimental documents (for example, Samrook, J., Russel. DW, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3 rd Edition, CSHL Press,, 2001: Hopwood.DA, Bibb, MJ, Chater, KF, Bruton, CJ, Kieser, HM, Lydiate, DJ, Smith, CP, Ward, JM, Schrempf, H. Genetic manipulation of Streptmyces : Alaboratory manual, The John Lnnes Institute, Norwich, UK, 1985, etc.), vector selection, gene introduction and expression can be performed according to them.
（ａ）又は（ｂ）の遺伝子をコリネ型細菌に導入したコリネ型細菌形質転換体のＬ−グルタミン酸生成能は、誘導処理が施されていない培地、例えば、上記表２に示す組成（ビオチン濃度２０μｇ／Ｌ）の培地において確認することができる。なお、該コリネ型細菌形質転換体は、ビオチン枯渇状態の培地においてもＬ−グルタミン酸を効率よく生産することができる。従って、後述するように、Ｌ−グルタミン酸を生産する際の培地の組成は特に限定されない。 The ability to produce L-glutamic acid of a coryneform bacterium transformant in which the gene of (a) or (b) has been introduced into a coryneform bacterium is determined by the composition (biotin concentration shown in Table 2 above, for example, a medium not subjected to induction treatment). 20 μg / L) medium. The coryneform bacterium transformant can efficiently produce L-glutamic acid even in a biotin-depleted medium. Therefore, as will be described later, the composition of the medium for producing L-glutamic acid is not particularly limited.
（Ｌ−グルタミン酸の製造方法）
本発明のＬ−グルタミン酸の製造方法は、上記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子がコリネ型細菌に導入されたコリネ型細菌形質転換体を培地中で培養する工程と、該コリネ型細菌形質転換体により培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、該Ｌ−グルタミン酸を培地から採取する工程とを含む。
(Method for producing L-glutamic acid)
The method for producing L-glutamic acid of the present invention comprises a step of culturing in a medium a coryneform bacterium transformant in which the gene (a) or (b) is introduced into a coryneform bacterium, and the coryneform bacterium transformation. And a step of producing and accumulating L-glutamic acid in the medium by the body and collecting the L-glutamic acid from the medium.
（１）コリネ型細菌形質転換体の培養
本発明におけるタンパク質をコードする遺伝子、すなわち上記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子を含む組換えベクターにより形質転換されたコリネ型細菌（コリネ型細菌形質転換体）は下記する微生物培養培地等で、培養温度約１５〜３７℃、培養時間約１〜７日間、培地のｐＨ約５．０〜８．０で培養されることが好ましい。
(1) Cultivation of coryneform bacterium transformant Coryneform bacterium transformed with a recombinant vector containing the gene encoding the protein in the present invention, that is, the gene of (a) or (b) above (coryneform bacterium transformation) The body) is preferably cultured in the following microorganism culture medium, etc., at a culture temperature of about 15 to 37 ° C., a culture time of about 1 to 7 days, and a pH of the medium of about 5.0 to 8.0.
また、コリネ型細菌形質転換体は、紫外線、エックス線又は薬品等を用いる人工的な変異導入方法により変異しうるが、このように得られるどのような変異株であっても本発明の目的とするＬ−グルタミン酸生産能を有するかぎり、本発明のコリネ型細菌形質転換体として使用することができる。 In addition, the coryneform bacterium transformant can be mutated by an artificial mutagenesis method using ultraviolet rays, X-rays, drugs, or the like, and any mutant strain obtained in this way is an object of the present invention. As long as it has the ability to produce L-glutamic acid, it can be used as the coryneform bacterium transformant of the present invention.
微生物培養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば好ましく用いることができるが、液体培地が好ましく、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等が用いられる。 The microorganism culture medium can be preferably used as long as it is a medium used for normal microorganism culture, but a liquid medium is preferable, for example, a natural source containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other nutrient substances. A medium or a synthetic medium is used.
炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、デンプン加水分解物、ソルビトール又はグリセリン（グリセロール）等の糖質及び糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸；エタノール又はプロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれらの炭素源の濃度は通常約０．１〜１０％（ｗｔ）である。 Examples of the carbon source include glucose, sugar alcohol such as glucose, fructose, sucrose, mannose, maltose, mannitol, xylose, galactose, starch, molasses, starch hydrolysate, sorbitol or glycerol (glycerol); acetic acid, citrate fermentation Organic acids such as lactic acid, fumaric acid, maleic acid or gluconic acid; alcohols such as ethanol or propanol. Moreover, hydrocarbons, such as normal paraffin, etc. can be used if desired. A carbon source may be used individually by 1 type, and may mix and use 2 or more types. The concentration of these carbon sources in the medium is usually about 0.1 to 10% (wt).
窒素源としては、窒素化合物、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム又は酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物；尿素；アンモニア（水）；硝酸ナトリウム又は硝酸カリウム等の硝酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、ＮＺ−アミン、タンパク質加水分解物又はアミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用可能である。窒素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）である。 Nitrogen sources include nitrogen compounds such as inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium carbonate, ammonium phosphate or ammonium acetate; urea; ammonia (water); nitrates such as sodium nitrate or potassium nitrate. However, it is not limited to these. Further, corn steep liquor, meat extract, bepton, NZ-amine, protein hydrolyzate, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, and the like can also be used. A nitrogen source may be used individually by 1 type, and may mix and use 2 or more types. The concentration of the nitrogen source in the medium is usually about 0.1 to 10% (wt), although it varies depending on the nitrogen compound used.
無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、硫酸塩等が使用される。例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０％（ｗｔ）である。 As the inorganic salts, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, sulfates and the like are used. Examples thereof include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate. These inorganic salts may be used alone or in a combination of two or more. The concentration of inorganic salts in the medium is usually about 0.01 to 1.0% (wt), although it varies depending on the inorganic salt used.
栄養物質としては、例えば、アミノ酸、脂肪酸、核酸を使用することができ、さらにこれらのものを含有する肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物又は動植物若しくは微生物菌体のエキス、又はこれらの分解物等が挙げられる。培地中の栄養物質の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）である。
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄養素を補給することが好ましい。
For example, amino acids, fatty acids and nucleic acids can be used as nutritional substances, and meat extracts, peptones, polypeptones, casamino acids, yeast extracts, dry yeast, corn steep liquor, nonfat dry milk, and nonfat containing these substances. Examples include soy hydrochloride hydrolyzate, extracts of animals and plants or microbial cells, or degradation products thereof. The concentration of the nutrient substance in the medium is usually about 0.1 to 10% (wt), although it varies depending on the nutrient substance used.
When using an auxotrophic mutant that requires an amino acid or the like for growth, it is preferable to supplement the required nutrients.
さらに必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。 Furthermore, vitamins can also be added as needed. Examples of vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
好ましい微生物培養培地としては、ＬＢ（Luria−Bertani）培地、ＮＺＹＭ培地、ＴＢ（Terrific Broth）培地、ＳＯＢ培地、２×ＹＴ培地、ＡＨＣ培地、χ１７７６培地、Ｍ９培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地、ＹＰＡＤ培地又はＳｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地等が挙げられる。 Preferred microorganism culture media include LB (Luria-Bertani) medium, NZYM medium, TB (Terrific Broth) medium, SOB medium, 2 × YT medium, AHC medium, χ1776 medium, M9 medium, YPD medium, SD medium, YPAD medium. Or a super broth culture medium etc. are mentioned.
（２）コリネ型細菌形質転換体によるＬ−グルタミン酸の生産
上記のようにして培養されたコリネ型細菌形質転換体をＬ−グルタミン酸を生産させるための培地（グルタミン酸生産用培地）中で培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、生成したＬ−グルタミン酸を培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を効率よく製造することができる。
(2) Production of L-glutamic acid by coryneform bacterial transformant The coryneform bacterial transformant cultured as described above is cultured in a medium for producing L-glutamic acid (a medium for producing glutamic acid). L-glutamic acid can be produced efficiently by producing and accumulating L-glutamic acid in the medium and collecting the produced L-glutamic acid from the medium.
コリネ型細菌形質転換体によりＬ−グルタミン酸を生産させるための培地としては、前記のコリネ型細菌形質転換体の培養に使用される培地と同様の培地を用いることができる。グルタミン酸生産用培地に使用される炭素源及び窒素源は、Ｌ−グルタミン酸の生産に使用する菌株が利用可能なものならば、いずれの種類を用いてもよい。
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補給することが好ましい。
As the medium for producing L-glutamic acid by the coryneform bacterium transformant, the same medium as that used for culturing the coryneform bacterium transformant can be used. Any kind of carbon source and nitrogen source may be used as long as the strain used for the production of L-glutamic acid is available for the medium for producing glutamic acid.
When using an auxotrophic mutant that requires an amino acid or the like for growth, it is preferable to supplement the required nutrients.
Ｌ−グルタミン酸生産のための培養は、培養温度を約２０〜４５℃とし、培地のｐＨを約５〜９に制御し、通気培養（好気培養）を行なう。
Ｌ−グルタミン酸生産のための培養中に培地のｐＨが低下する場合には、炭酸カルシウムやアンモニアガス等のアルカリで中和する。
このようにして、１０時間〜１００時間程度培養することにより、培地中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
The culture for producing L-glutamic acid is carried out by aeration culture (aerobic culture) with a culture temperature of about 20 to 45 ° C. and a pH of the medium of about 5 to 9.
When the pH of the medium is lowered during the culture for producing L-glutamic acid, the medium is neutralized with an alkali such as calcium carbonate or ammonia gas.
In this way, by culturing for about 10 to 100 hours, a significant amount of L-glutamic acid is accumulated in the medium.
Ｌ−グルタミン酸生産のための培養終了後の培地からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行うことができる。例えば、培地から菌体を除去した後に、培地を濃縮晶析することにより生成したＬ−グルタミン酸を採取できる。 The method for collecting L-glutamic acid from the medium after completion of the culture for producing L-glutamic acid can be performed according to a known recovery method. For example, L-glutamic acid produced by removing the cells from the medium and then concentrating and crystallizing the medium can be collected.
本発明はまた、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質を含有するＬ−グルタミン酸生産促進剤を提供する。
（ｃ）（ｃ−１）配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるタンパク質、又は（ｃ−２）配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質
（ｄ）（ｄ−１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｄ−２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質
The present invention also provides an L-glutamic acid production promoter containing the following protein (c) or (d).
(C) (c-1) a protein encoded by the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (c-2) consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. A protein having an action of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium that is encoded by DNA that hybridizes with DNA under stringent conditions and is not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production by biotin depletion (d (D-1) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (d-2) an amino acid wherein one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. L-glutamic acid production inducing process by sequencing and biotin depletion Protein having an action of promoting the L- glutamic acid production by coryneform bacterium in a medium have
上記（ｃ）又は（ｄ）タンパク質を高発現するように形質転換されたコリネ型細菌形質転換体は、誘導処理が施されていない培地において高いＬ−グルタミン酸生産能を有する。従って、このようなタンパク質を高発現するコリネ型細菌形質転換体を用いると、煩雑な誘導操作を行うことなく、Ｌ−グルタミン酸を安定的に効率よく生産することができる。（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質を高発現するコリネ型細菌形質転換体は、上述した（ａ）又は（ｂ）の遺伝子をコリネ型細菌に導入する方法により作製することができる。 The coryneform bacterium transformant transformed so as to highly express the protein (c) or (d) has a high L-glutamic acid producing ability in a medium not subjected to induction treatment. Therefore, when a coryneform bacterium transformant that highly expresses such a protein is used, L-glutamic acid can be stably and efficiently produced without performing a complicated induction procedure. The coryneform bacterium transformant that highly expresses the protein (c) or (d) can be produced by a method of introducing the above-described gene (a) or (b) into a coryneform bacterium.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to these.
（実施例１） タンパク質抽出用微生物の培養
−８０℃で凍結保存しておいたCorynebacterium glutamicum（C.glutamicum)ATCC31831株を融かして、ＣＭ２Ｂ平板培地（表１）に２００μＬ滴下し、コーンラージ棒で全体に塗布した。これを３０℃で２４時間静置培養することにより前々培養を行なった。
前培養は前々培養で得られた菌体の３分の２を平板培地からかきとり、この菌体を４０ｍＬの液体培地（表２）に植菌し、３１．５℃、１２０ｒｐｍで１７時間振とう培養することにより行なった。
本培養は４０ｍＬの液体培地（表２）に前培養溶液１ｍＬを植菌し、３１．５℃、１２０ｒｐｍで振とう培養することにより行った。なお、培養時の培地ｐＨの調整は、培地に乾熱滅菌した炭酸カルシウムを添加して行なった。
(Example 1) Culture of microorganism for protein extraction Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) ATCC31831 strain frozen at -80 ° C was melted and 200 µL was added dropwise to CM2B plate medium (Table 1), and corn large The whole was applied with a stick. This was cultivated in advance by standing culture at 30 ° C. for 24 hours.
In pre-culture, two thirds of the cells obtained in the previous culture are scraped from the plate medium, and the cells are inoculated into a 40 mL liquid medium (Table 2) and shaken at 31.5 ° C. and 120 rpm for 17 hours. This was performed by culturing.
The main culture was performed by inoculating 1 mL of the preculture solution in 40 mL of a liquid medium (Table 2) and culturing with shaking at 31.5 ° C. and 120 rpm. The medium pH during the culture was adjusted by adding dry heat sterilized calcium carbonate to the medium.
（実施例２）高効率なＬ−グルタミン酸の生産に関与するタンパク質の単離と同定
ペニシリン添加により、菌体内で発現が上昇する多くのタンパク質の中の何れかが高効率なＬ−グルタミン酸の生産に関与するタンパク質と推測される。
そこで、ペニシリン添加前後の発現タンパク量の比較解析を、プロテオーム解析により行なった。
(Example 2) Isolation and identification of a protein involved in the production of highly efficient L-glutamic acid Any of many proteins whose expression is increased in bacterial cells by the addition of penicillin is a highly efficient production of L-glutamic acid Presumed to be a protein involved in
Therefore, comparative analysis of the amount of expressed protein before and after penicillin addition was performed by proteome analysis.
二次元電気泳動は下記の操作方法イ及びロで行なった。
イ）等電点電気泳動
表１０に示す組成の膨潤液を作製した。３０μｇ／５０μＬとなるように調整した抽出タンパク質含有サンプルに膨潤液を２００μＬ加えて３０分間ボルテックスした。Immobiline DryStrip 膨潤トレイ（Amersham Bioscience社）を水平になるように置き、サンプル２５０μＬを供した。Immobiline Drystrip pH 4-7（13 cm）のゲル面を下向きにし、サンプルが全体に浸るように置き、その上から３ｍＬのDryStrip cover fluid（Amersham Bioscience社）を重層し、サンプル液の蒸発を防いだ。１５時間室温で膨潤させた。
クーリングポンプを予め２０℃に設定し、クーリングプレート内の循環水が２０℃となるようにした。クーリングプレートに少量のシリコンオイルを滴下し、その上にImmobiline DryStripトレイを置いた。Immobiline Drystripのゲル面を上向きに置き、その両端に湿らせたろ紙を載せた。さらに電極バーをろ紙の上に置き、シリコンオイルをゲルが浸るくらいまで注いだ。
表１１に示すプログラムに従って電気泳動を行なった。電気泳動終了後Immobiline Drystripをスクリュー管に入れ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うまで−８０℃で保存した。
Two-dimensional electrophoresis was performed by the following operating methods a and b.
B) Isoelectric focusing A swelling liquid having the composition shown in Table 10 was prepared. 200 μL of the swelling solution was added to the extracted protein-containing sample adjusted to 30 μg / 50 μL, and vortexed for 30 minutes. Immobiline DryStrip Swelling tray (Amersham Bioscience) was placed horizontally and 250 μL of sample was provided. Immobiline Drystrip pH 4-7 (13 cm) gel surface facing down, placed so that the sample was fully immersed, and 3 mL of DryStrip cover fluid (Amersham Bioscience) was layered on top to prevent evaporation of the sample liquid . Swelled at room temperature for 15 hours.
The cooling pump was set to 20 ° C. in advance so that the circulating water in the cooling plate was 20 ° C. A small amount of silicone oil was dropped on the cooling plate, and an Immobiline DryStrip tray was placed on it. The gel surface of Immobiline Drystrip was placed face up and moistened filter paper was placed on both ends. Furthermore, the electrode bar was placed on the filter paper, and silicon oil was poured until the gel soaked.
Electrophoresis was performed according to the program shown in Table 11. After completion of electrophoresis, Immobiline Drystrip was placed in a screw tube and stored at −80 ° C. until SDS-PAGE was performed.
ロ）二次元目の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
２本のファルコンチューブにＤＴＴ（ジチオスレイトール）を１００μｇ、又はヨードアセトアミドを２５０μｇ取り、それぞれにＳＤＳ平衡化buffer（表１２）を１０ｍＬ加えて、完全に溶かした。−８０℃に保存しておいたImmobiline Drystripの入ったスクリュー管にＤＴＴを含むＳＤＳ平衡化bufferを加えて１５分間振とうした。次にヨードアセトアミドを含むＳＤＳ平衡化bufferと入れ替えて１５分間振とうした。
B) Second-dimensional electrophoresis (SDS-PAGE)
100 µg of DTT (dithiothreitol) or 250 µg of iodoacetamide was taken in two falcon tubes, and 10 mL of SDS equilibration buffer (Table 12) was added to each tube to completely dissolve them. An SDS equilibration buffer containing DTT was added to a screw tube containing Immobiline Drystrip stored at −80 ° C. and shaken for 15 minutes. Next, it was replaced with SDS equilibration buffer containing iodoacetamide and shaken for 15 minutes.
１２．５％のランニングゲル（Running gel）（表１３）に１０μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を入れて軽く混合した後、組み立てたガラス板に注ぎ、純水（MilliQ）を１ｍＬ重層して３０分間放置し重合させた。なお、ガラス板を組み立てる前にガラス板の一方にBind-silane溶液（表１４）を２ｍＬ滴下してキムワイプで全体に広げて乾燥させた。この操作を３回行った。 10 μL of N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine (TEMED) was added to a 12.5% running gel (Table 13) and mixed gently, and then poured onto an assembled glass plate. 1 mL of water (MilliQ) was overlaid and allowed to stand for 30 minutes for polymerization. Before assembling the glass plate, 2 mL of a Bind-silane solution (Table 14) was dropped on one side of the glass plate, spread over the whole with Kimwipe, and dried. This operation was performed three times.
重層したMilliQを捨て、余分なBufferを洗い流したImmobiline Drystripをランニングゲルの上に載せた。さらにその上にアガロース（表１５）を重層し、その後組み立てたガラス板を泳動槽に設置した。泳動buffer（表１６）を泳動槽に注ぎ、電極を差し込んで電気泳動を開始した。泳動装置は縦型電気泳動装置（１６０×１６０ｍｍ、TAITEC社）を、パワーサプライはReal Power BP（Biocraft社）を用いた。始めの１５分は１５ｍＡで泳動を行い、その後３０ｍＡに変えてＢＰＢの先端がランニングゲルの下端に来るまで泳動を行った。 The layered MilliQ was discarded, and Immobiline Drystrip in which excess Buffer was washed was placed on the running gel. Furthermore, agarose (Table 15) was overlaid thereon, and then the assembled glass plate was placed in the electrophoresis tank. The electrophoresis buffer (Table 16) was poured into the electrophoresis tank, the electrode was inserted, and electrophoresis was started. The electrophoresis apparatus was a vertical electrophoresis apparatus (160 × 160 mm, TAITEC), and the power supply was Real Power BP (Biocraft). The first 15 minutes were run at 15 mA, then changed to 30 mA and run until the BPB tip was at the lower end of the running gel.
タンパク質発現量は、ＳＹＰＲＯ Ｒｅｄで染色された各タンパク質の蛍光強度を測定することにより定量的な解析を行なった。
ＳＹＰＲＯ Ｒｅｄ染色：抽出タンパク質の電気泳動終了後ゲルをタッパに入れ、固定液（表１７）を注ぎ３０分振とうした。固定液を捨て、洗浄液（表１８）２００ｍＬをゲルに注ぎ２０分振とうする操作を３回繰り返した。次いで、洗浄液を捨て染色液（表１９）を加え、アルミホイルで遮光して１時間振とうした。染色液を捨て、洗浄液２００ｍＬを加えて１分振とうした。画像はTyphoon9210（Amersham Bioscience）で取り込んだ。レーザー強度を変化させ全てのスポットが飽和しないように調節した。画像解析にはImage Master 2-D Elite（Amersham Bioscience）を用いた。
The protein expression level was quantitatively analyzed by measuring the fluorescence intensity of each protein stained with SYPRO Red.
SYPRO Red staining: After electrophoresis of the extracted protein, the gel was put into a tapper, and a fixative (Table 17) was poured and shaken for 30 minutes. The fixing solution was discarded, and the operation of pouring 200 mL of the cleaning solution (Table 18) onto the gel and shaking for 20 minutes was repeated three times. Next, the washing solution was discarded and a staining solution (Table 19) was added, and the mixture was shaken for 1 hour while being shielded from light with aluminum foil. The staining solution was discarded, and 200 mL of washing solution was added and shaken for 1 minute. Images were captured with Typhoon9210 (Amersham Bioscience). The laser intensity was changed so that all spots were not saturated. Image Master 2-D Elite (Amersham Bioscience) was used for image analysis.
これらのタンパク質の二次元電気泳動ゲル上の位置を図１に示した。
各タンパク質の発現量は、ペニシリンを添加後の時間により変化する。ペニシリン添加直後（０時間）、添加後１時間、２時間、３時間及び４時間に発現解析を行い、ペニシリン添加後に発現が上昇するタンパク質を表２０に示した。表２０は発現が３倍以上になったタンパク質スポットを選び出しているが、図１中の番号Ｎｏ．９０、１０２、１９０、２０６、２１４、２５２、３２２、３２９、３３９、３６５、３７８、３８０、３８１、及び４６２は５回の発現解析実験を行った中で、１回の実験でしか３倍以上になっていない。一方、Ｎｏ．５４、１５７、２５８、２９８、３０４、３１６、３２４、３６１、３７５、３８７、４５８、及び５７２は５回の発現解析実験の中で２回以上発現比が３倍を超えたタンパク質であり、特に、Ｎｏ．５７２に関しては全ての発現解析において発現量が３倍以上となっており、最終的には１０倍以上変化しているので、グルタミン酸生産に最も強く関与する可能性が高いと予測された。以下の説明においては、Ｎｏ．５７２のタンパク質を、「Ｓｐｏｔ５７２タンパク質」ともいう。表２０中の数値は、ペニシリン添加前のタンパク質の発現量を１とした場合のペニシリン添加後のタンパク質発現量（５回の実験の平均値）である。
The positions of these proteins on the two-dimensional electrophoresis gel are shown in FIG.
The expression level of each protein varies depending on the time after adding penicillin. Expression analysis was performed immediately after the addition of penicillin (0 hour), 1 hour, 2 hours, 3 hours and 4 hours after the addition, and Table 20 shows the proteins whose expression increases after the addition of penicillin. Table 20 shows a selection of protein spots whose expression was tripled or more. 90, 102, 190, 206, 214, 252, 322, 329, 339, 365, 378, 380, 381, and 462 were three times more than three times in one expression analysis experiment. It is not. On the other hand, no. 54, 157, 258, 298, 304, 316, 324, 361, 375, 387, 458, and 572 are proteins having an expression ratio of more than 3 times in 5 expression analysis experiments, , No. Regarding 572, the expression level was 3 times or more in all expression analyses, and finally changed 10 times or more. Therefore, it was predicted that the possibility of being most strongly involved in glutamate production was high. In the following description, no. The protein of 572 is also referred to as “Spot572 protein”. The numerical values in Table 20 are protein expression levels after addition of penicillin (average value of five experiments) when the expression level of protein before addition of penicillin is 1.
（実施例３） グルタミン酸生産に最も強く関与するタンパク質のアミノ酸分析
図１のＮｏ．５７２スポットの位置に対応するＣＢＢ染色タンパク質をカッターナイフで切り出し（染色液組成は表２１に示す）、Treff tubeに入れ、表２２に示す組成の脱色液１００μＬを加え３０分ボルテックスする操作をＣＢＢの色素が消失するまで繰り返した。
(Example 3) Amino acid analysis of the protein most strongly involved in glutamic acid production CBB-stained protein corresponding to the position of 572 spots was cut out with a cutter knife (stain composition is shown in Table 21), put into a Treff tube, and 100 μL of decolorizing solution having the composition shown in Table 22 was added and vortexed for 30 minutes. Repeated until the dye disappeared.
次に、この脱色した処理物を用いてペプチド抽出、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行なうべく、酵素（トリプシン）分解処理をおこなった。酵素分解は、表２３に示す組成の溶液２０μＬを脱色した処理物に加え、これを氷中４５分静置後、余分な液を除去し、次いでこれに表２４に示す組成の溶液を４０μＬずつ加えて３７℃で１４〜１６時間静置して行なった。 Next, an enzymatic (trypsin) decomposition treatment was performed in order to perform peptide extraction and LC-MS / MS analysis using the decolorized processed product. In the enzymatic decomposition, 20 μL of the solution having the composition shown in Table 23 was added to the decolored processed product, and this was allowed to stand in ice for 45 minutes. Then, excess liquid was removed, and then 40 μL of the solution having the composition shown in Table 24 was added thereto. In addition, it was allowed to stand at 37 ° C. for 14 to 16 hours.
上記のトリプシン処理分解物にギ酸１μＬ及び純水（MilliQ）１ｍＬからなる組成液１００μＬを加え、１０分間超音波処理後、さらに、ギ酸１μＬ及びアセトニトリル１ｍＬからなる組成液８０μＬを加えて超音波処理を行なった。この溶液を常温で１時間、４０℃で２０分減圧乾燥を行なってから、６０℃で液量が３０μＬになるまでさらに減圧乾燥を行った。 100 μL of a composition solution consisting of 1 μL of formic acid and 1 mL of pure water (MilliQ) is added to the above-mentioned trypsin-treated decomposition product, followed by sonication for 10 minutes, and further, 80 μL of a composition solution consisting of 1 μL of formic acid and 1 mL of acetonitrile is added for sonication. I did it. This solution was dried under reduced pressure at room temperature for 1 hour and at 40 ° C. for 20 minutes, and further dried under reduced pressure at 60 ° C. until the liquid volume became 30 μL.
上記で得られた処理物３０μＬをMillex-GV４フイルター（Millipore社製）で精製し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。得られたマススペクトルをData analysis(Brukker Daltonics社)を用いて、MASCOT（Matrix Science社）genetic fileに加工し、全ゲノム既知のCorynebacterium glutamicumATCC13032株の情報をベースとしてMASCOTサーチを行った結果、配列番号２で示されるアミノ酸配列を得た。 30 μL of the treated product obtained above was purified with a Millex-GV4 filter (Millipore) and subjected to LC-MS / MS analysis. The resulting mass spectrum was processed into a MASCOT (Matrix Science) genetic file using Data analysis (Brukker Daltonics), and MASCOT search was performed based on the information of the whole genome known Corynebacterium glutamicum ATCC13032. The amino acid sequence shown in 2 was obtained.
（実施例４） ＰＣＲによる遺伝子断片の取得
ｉ）コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC31831株染色体ＤＮＡの調製
５ｍＬのＬ培地にて３０℃で一晩振とう培養したC.glutamicumATCC31831株の培養液を全量遠心（１５０００ｒｐｍ、２分）し、菌体を回収した。この菌体を５００μＬの５０ｍＭ Tris-HCl、50 mM EDTA （pH 8.0）に懸濁した後、再び遠心（１５０００ｒｐｍ、２分、４℃）することにより菌体を洗浄した。沈殿を再び８００μＬの５０ｍＭ Tris-HCl、50 mM EDTA （pH 8.0）に懸濁し、これにリゾチーム（５０ｍｇ／ｍＬ）を４０μＬ及びＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）を２０μＬ添加して３７℃で１時間静置した。さらに、リゾチーム（５０ｍｇ／ｍＬ）を２０μＬ添加して混合し、３７℃で１時間静置した。その後、１０％ＳＤＳを２０μＬ添加して７０℃で１時間放置した。放冷後、Proteinase K（２０ｍｇ／ｍＬ）を２４μＬ混合し、５０℃で１時間反応させた後、さらにProteinase K（２０ｍｇ／ｍＬ）を２４μＬ混合し５０℃で１時間反応させた。その後、フェノール／クロロホルム抽出を行った。遠心により水層を回収した後、水層の１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）と２倍量のエタノールとを加えて静かに混合した。−２０℃で３０分以上放置し、遠心（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）して上清を捨てた。５００μＬの７０％エタノールで沈殿を軽くリンスし乾燥させた。沈殿物を５０μＬの純水（MilliQ）に溶解させ染色体ＤＮＡ溶液とした。
(Example 4) Acquisition of gene fragment by PCR i) Preparation of chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC31831 Strain of C. glutamicum ATCC31831 strain cultured overnight at 30 ° C in 5 mL of L medium The whole cell was centrifuged (15000 rpm, 2 minutes), and the cells were collected. The cells were suspended in 500 μL of 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA (pH 8.0), and then centrifuged again (15000 rpm, 2 minutes, 4 ° C.) to wash the cells. The precipitate was again suspended in 800 μL of 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA (pH 8.0), 40 μL of lysozyme (50 mg / mL) and 20 μL of RNase A (10 mg / mL) were added thereto, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. did. Furthermore, 20 μL of lysozyme (50 mg / mL) was added and mixed, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, 20 μL of 10% SDS was added and left at 70 ° C. for 1 hour. After standing to cool, 24 μL of proteinase K (20 mg / mL) was mixed and reacted at 50 ° C. for 1 hour, and then 24 μL of proteinase K (20 mg / mL) was further mixed and reacted at 50 ° C. for 1 hour. Thereafter, phenol / chloroform extraction was performed. After collecting the aqueous layer by centrifugation, 1/10 volume of 3M sodium acetate solution (pH 5.2) and 2 volumes of ethanol were added and gently mixed. The mixture was allowed to stand at −20 ° C. for 30 minutes or more, centrifuged (15000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was discarded. The precipitate was lightly rinsed with 500 μL of 70% ethanol and dried. The precipitate was dissolved in 50 μL of pure water (MilliQ) to obtain a chromosomal DNA solution.
ii)ＰＣＲによる遺伝子断片の増幅
目的とするＳｐｏｔ５７２タンパク質をコードする遺伝子について、プロモーター領域を含んだ領域を得るために、該タンパク質をコードする遺伝子、並びにその上流の遺伝子２００ｂｐ及び下流の遺伝子１００ｂｐを含むように以下のプライマー（配列番号４及び５）を設計した。プライマー設計には全ゲノム配列が明らかとなっているC.glutamicum ATCC13032株のデータを参照した。
配列番号４
Spot No572F primer 5’-gaattcaacccacttgcgggtagtgg-3’
配列番号５
Spot No572R primer 5’-gaattcttaggcattctatacacaaaacg-3’
ii) Amplification of gene fragment by PCR In order to obtain a region including a promoter region for a gene encoding the target Spot572 protein, the gene encoding the protein, and 200 bp upstream gene and 100 bp downstream gene are included. Thus, the following primers (SEQ ID NOs: 4 and 5) were designed. For the primer design, the data of C. glutamicum ATCC13032 strain for which the entire genome sequence was clarified was referred.
SEQ ID NO: 4
Spot No572F primer 5'-gaattcaacccacttgcgggtagtgg-3 '
SEQ ID NO: 5
Spot No572R primer 5'-gaattcttaggcattctatacacaaaacg-3 '
上記ｉ）のC.glutamicum ATCC31831株染色体を鋳型とする遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、表４記載の反応液を用いて、表５記載の操作条件で行なった。
ＰＣＲ増幅遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動に懸け、７５０ｂｐ近傍で単一バンドを示すことを確認した（図２）。
PCR amplification of the gene fragment using the C. glutamicum ATCC31831 strain chromosome of i) above as a template was performed using the reaction solution described in Table 4 under the operating conditions described in Table 5.
The PCR amplified gene fragment was subjected to agarose gel electrophoresis and confirmed to show a single band near 750 bp (FIG. 2).
iii）ＰＣＲ断片の精製
増幅させたＰＣＲ断片は、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega）を使用して精製した。方法は添付のプロトコールに従った。
iii) Purification of PCR fragment The amplified PCR fragment was purified using Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega). The method followed the attached protocol.
iv)ＰＣＲ断片の抽出
Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega）を使用してゲルからＤＮＡ断片を抽出及び精製した。方法は添付のプロトコールに従った。
iv) PCR fragment extraction
DNA fragments were extracted and purified from the gel using Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega). The method followed the attached protocol.
（実施例５） プラスミドＤＮＡの調製
ＰＣＲで増幅し精製した上記の遺伝子断片量を電気泳動により確認し、pGEM-T Easy Vector(Promega社)とインサートＤＮＡ（遺伝子断片量）との量比が１：１−１：２程度となるように混合してライゲーション反応を行った。ＤＮＡ溶液に、２μＬのT4 DNA ligase（Takara Bio Inc.）と２μＬの10×T4 DNA ligase bufferとを添加して滅菌水で２０μＬにメスアップした。１６℃で一晩反応させ、反応後はTE bufferを加えて計２００μＬとしてから、フェノール／クロロホルム処理し、エタノール沈殿後、沈殿したＤＮＡを適当量の滅菌水に溶解させ大腸菌の形質転換に用いた。
(Example 5) Preparation of plasmid DNA The amount of the above-mentioned gene fragment amplified and purified by PCR was confirmed by electrophoresis, and the quantitative ratio of pGEM-T Easy Vector (Promega) to insert DNA (gene fragment amount) was 1. The mixture was mixed so that the ratio was about 1: 1: 2, and the ligation reaction was performed. 2 μL of T4 DNA ligase (Takara Bio Inc.) and 2 μL of 10 × T4 DNA ligase buffer were added to the DNA solution, and the volume was made up to 20 μL with sterile water. The reaction was allowed to proceed overnight at 16 ° C., and after the reaction, TE buffer was added to make a total of 200 μL, followed by phenol / chloroform treatment. After ethanol precipitation, the precipitated DNA was dissolved in an appropriate amount of sterile water and used for transformation of Escherichia coli. .
クローニングした遺伝子断片の塩基配列の決定は、BigDye terminator cycle sequencing kit V1.1（Applied Biosystems）を用いて、dideoxy法 で行った。ＰＣＲチューブにプラスミドＤＮＡ ２００−５００ｎｇ、表２５に示す組成の希釈バッファーにより２．５倍希釈したPremixを５μＬ、及びプライマー３．２ｐｍｏｌを加え、最終量２０μＬとなるように純水（MilliQ）を添加した。表２６に示すプログラムに従ってＰＣＲ反応を行った。反応後、ＰＣＲ産物に２μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）と５０μＬのエタノールとを加えボルテックスし、これを−２０℃で１５分以上保存した後遠心した（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分）。上清を捨て、７０％エタノールを２５０μＬを添加して遠心し（１５０００ｒｐｍ、４℃、５分）、上清を捨てて減圧乾燥を行った。沈殿物に２０μＬのHi−Di formamide（Applied Biosystems）を加え溶解させた。その後、溶解液を２分間煮沸させた後、氷水で急冷し、シークエンサーABI PRISM 310（Applied Biosystems）に供して、塩基配列を決定した。決定した塩基配列を、配列番号１（「Ｓｐｏｔ５７２遺伝子」ともいう）に示す。配列番号１において、２０６〜２０８番目のＡＴＧが開始コドンであり、６３５〜６３７番目のＴＡＡが終始コドンである。 The nucleotide sequence of the cloned gene fragment was determined by the dideoxy method using BigDye terminator cycle sequencing kit V1.1 (Applied Biosystems). To the PCR tube, add 200 μg of plasmid DNA, 5 μL of Premix diluted 2.5 times with a dilution buffer having the composition shown in Table 25, and 3.2 pmol of primer, and add pure water (MilliQ) to a final volume of 20 μL. did. PCR reaction was performed according to the program shown in Table 26. After the reaction, 2 μL of 3M sodium acetate solution (pH 5.2) and 50 μL of ethanol were added to the PCR product, vortexed, and stored at −20 ° C. for 15 minutes or more, followed by centrifugation (15000 rpm, 4 ° C., 20 minutes). ). The supernatant was discarded, 250 μL of 70% ethanol was added and centrifuged (15000 rpm, 4 ° C., 5 minutes), and the supernatant was discarded and dried under reduced pressure. 20 μL of Hi-Diformamide (Applied Biosystems) was added to the precipitate and dissolved. Thereafter, the lysate was boiled for 2 minutes, then rapidly cooled with ice water, and subjected to a sequencer ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) to determine the base sequence. The determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1 (also referred to as “Spot572 gene”). In SEQ ID NO: 1, the 206th to 208th ATGs are start codons, and the 635th to 637th TAAs are stop codons.
pGEM-T Easy Vectorに挿入されたＰＣＲ断片はゲノムデータが明らかでないC.glutamicum ATCC31831株の染色体を鋳型としているため、ＰＣＲにより変異が入ったかどうかをゲノム既知C.glutamicum ATCC13032株のデータベースと比較して確認することができない。そこで、遺伝子ごとに３〜５個のクローンを取り、それぞれのシーケンス結果を比較することで変異の有無を調べた。このようにして、C.glutamicum ATCC31831株の目的遺伝子配列を決定するとともに、変異を持たない遺伝子断片であることを確認した。 Since the PCR fragment inserted into pGEM-T Easy Vector uses the chromosome of C. glutamicum ATCC31831 strain whose genomic data is not clear as a template, whether the mutation was introduced by PCR is compared with the database of C. glutamicum ATCC13032 strain with known genome. Cannot be confirmed. Therefore, 3 to 5 clones were taken for each gene, and the presence or absence of mutation was examined by comparing the sequence results. In this way, the target gene sequence of C. glutamicum ATCC31831 strain was determined, and it was confirmed that the gene fragment had no mutation.
（実施例６）C.glutamicum ATCC31831株への配列番号１で表わされる遺伝子による形質転換
pGEM-T Easy Vector(Promega社)に挿入された遺伝子断片（Ｓｐｏｔ５７２遺伝子）を、常法に従い、制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出し、ＥｃｏＲＩで処理したｐＨＴ１ベクター（配列番号３）に連結させた。このとき、ｌａｃプロモーターの下流に挿入遺伝子が順方向に入っているものを選択した。なお、ｐＨＴ１プラスミドは、ｌａｃプロモーターの下流にマルチクローニングサイト、及びカナマイシン耐性遺伝子を含むものである。図９に、構築したプラスミドの模式図を示す。
(Example 6) Transformation of C. glutamicum ATCC31831 strain with the gene represented by SEQ ID NO: 1
The gene fragment (Spot572 gene) inserted into pGEM-T Easy Vector (Promega) was excised with restriction enzyme EcoRI and ligated to pHT1 vector (SEQ ID NO: 3) treated with EcoRI according to a conventional method. At this time, the one in which the inserted gene was in the forward direction downstream of the lac promoter was selected. The pHT1 plasmid contains a multicloning site and a kanamycin resistance gene downstream of the lac promoter. FIG. 9 shows a schematic diagram of the constructed plasmid.
C.glutamicumATCC31831株の形質転換は、コリネ型細菌の制限修飾系を回避するために、dam dem二重変異株である大腸菌ＳＣＳ１１０にコントロールプラスミドであるｐＨＴ１又はｐＨＴ１のＥｃｏＲＩサイトにＳｐｏｔ５７２遺伝子を挿入したプラスミドを導入し、得られたＳＣＳ１１０形質転換体から調製したそれぞれのプラスミドを用いて、常法に従い、C.glutamicumATCC31831株を形質転換することで、コントロール株及びＳｐｏｔ５７２タンパク質をコードする遺伝子の発現増強株を創製した。
（非特許文献：Vertes AA, Inui M, Kobayashi M, Kurusu Y, Yukawa H. 1993
Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in coryneform bacteria. Res Microbiol. 144, 181-5を参照）
In order to avoid the restriction modification system of coryneform bacteria, transformation of C. glutamicum ATCC 31831 is a plasmid in which the Spot572 gene is inserted into the control plasmid pHT1 or pHT1 EcoRI site into the dam dem double mutant Escherichia coli SCS110. Using the respective plasmids prepared from the obtained SCS110 transformants, the C. glutamicum ATCC31831 strain was transformed according to a conventional method, whereby a control strain and an expression-enhanced strain encoding a gene encoding Spot 572 protein were obtained. Created.
(Non-patent literature: Vertes AA, Inui M, Kobayashi M, Kurusu Y, Yukawa H. 1993
(See Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in coryneform bacteria. Res Microbiol. 144, 181-5)
（実施例７） 発現強化株によるＬ−グルタミン酸の生産
実施例６で得られた形質転換株を用いてＬ−グルタミン酸の生産を行った。
Ｌ−グルタミン酸の生産は、４０ｍＬの上記表２記載の組成のグルタミン酸生産用液体培地に形質転換株の前培養溶液１ｍＬを植菌し、３１．５℃、１２０ｒｐｍで振とう培養（溶存酸素が５％以上になるようにエアレーションを行なう）して行なった。
(Example 7) Production of L-glutamic acid by expression-enhanced strain L-glutamic acid was produced using the transformant obtained in Example 6.
In the production of L-glutamic acid, 1 mL of the preculture solution of the transformed strain was inoculated into 40 mL of a liquid medium for glutamic acid production having the composition described in Table 2 above, and cultured with shaking at 31.5 ° C. and 120 rpm (dissolved oxygen of 5 % Aeration).
図３は、そのときの培地中のグルタミン酸濃度（ｇ／Ｌ）及びグルコース濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を示したものであり、図４は、培地中の菌体の光学濃度（ＯＤ）の経時変化を示したものである。
なお、グルコース濃度はGlucose analyzer(YSI社製、YSI2700SELECT)を用いて測定した。グルタミン酸濃度はL-glutamic acid F-kit（R-Biopherm社製）を用いて測定し、菌体の光学濃度はダブルビーム分光光度計（日立製作所製、Ｕ−２０００）により測定した。
FIG. 3 shows the changes over time in glutamic acid concentration (g / L) and glucose concentration (g / L) in the medium at that time, and FIG. 4 shows the optical density (OD) of the cells in the medium. This shows the change over time.
The glucose concentration was measured using a Glucose analyzer (YSI 2700 SELECT, manufactured by YSI). The glutamic acid concentration was measured using L-glutamic acid F-kit (manufactured by R-Biopherm), and the optical density of the bacterial cells was measured with a double beam spectrophotometer (manufactured by Hitachi, U-2000).
（比較例１）
実施例６で得られたコントロールプラスミドｐＨＴ１（本発明のタンパク質をコードする遺伝子を有していない）が導入されたC.glutamicum ATCC31831株を用いて、実施例７と同様の条件、方法によりＬ−グルタミン酸生成量及び培地のグルコース量の経時変化を調べた。
そのときの培地中のグルタミン酸濃度（ｇ／Ｌ）及びグルコース濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を図５に、菌体の光学濃度（ＯＤ）の経時変化を図６に示す。
(Comparative Example 1)
Using the C. glutamicum ATCC31831 strain into which the control plasmid pHT1 (which does not have the gene encoding the protein of the present invention) obtained in Example 6 was introduced, L- Changes over time in the amount of glutamic acid produced and the amount of glucose in the medium were examined.
The time-dependent changes in glutamic acid concentration (g / L) and glucose concentration (g / L) in the medium at that time are shown in FIG. 5, and the time-dependent changes in the optical density (OD) of the cells are shown in FIG.
図３〜図６で示されている結果より、本発明で得られた形質転換株は、グルコース消費量当たりのＬ−グルタミン酸生成量がコントロール株に比して顕著に高い生産能力を有すること、また、菌体量当たりのＬ−グルタミン酸生成量も著しく高いことが明らかである。 From the results shown in FIG. 3 to FIG. 6, the transformed strain obtained in the present invention has a significantly higher production capacity of L-glutamic acid production per glucose consumption than the control strain, It is also clear that the amount of L-glutamic acid produced per bacterial cell is remarkably high.
（実施例７）
本発明の形質転換株は、図３に示されているように、Ｌ−グルタミン酸生産のための培養の後期（グルコース濃度が低下した後）にＬ−グルタミン酸の生産を開始する。
そこで、グルコース濃度が低下した時点でグルコースを添加し、Ｌ−グルタミン酸の生産持続性を調べた。その結果を図７に、また、そのときの培地中の菌体の光学濃度変化を図８に示す。
図７中の矢印の時点でグルコース溶液（４００ｇ／Ｌ）を４ｍＬ添加した。
(Example 7)
As shown in FIG. 3, the transformed strain of the present invention starts production of L-glutamic acid at the later stage of the culture for L-glutamic acid production (after the glucose concentration is lowered).
Therefore, glucose was added when the glucose concentration decreased, and the production sustainability of L-glutamic acid was examined. The result is shown in FIG. 7, and the change in the optical density of the cells in the medium at that time is shown in FIG.
At the time indicated by the arrow in FIG. 7, 4 mL of a glucose solution (400 g / L) was added.
グルコース濃度が低下した時点でグルコースを添加すると、その後もＬ−グルタミン酸は生産され続けていることから、本発明の形質転換株が一旦Ｌ−グルタミン酸を生産する状態に入ると、その機能を維持し続けることが示されている。
このことは、本発明のコリネ型細菌形質転換体を用いる製造方法では、グルコースを培地に添加し続ければ、Ｌ−グルタミン酸の連続的な生産が可能であることを示すものであり、従来公知のビオチン枯渇や培養温度の上昇等による誘導操作が不要となり、C.glutamicum株を用いてＬ−グルタミン酸の効率的な生産ができることを示すものである。
When glucose is added at the time when the glucose concentration is lowered, L-glutamic acid continues to be produced. Therefore, once the transformant of the present invention enters a state of producing L-glutamic acid, its function is maintained. Shown to continue.
This indicates that the production method using the coryneform bacterium transformant of the present invention can continuously produce L-glutamic acid if glucose is continuously added to the medium. This shows that induction by biotin depletion, an increase in culture temperature, etc. is no longer necessary, and L-glutamic acid can be efficiently produced using the C. glutamicum strain.
本発明のＬ−グルタミン酸の製造方法は、コリネ型細菌形質転換体を用いてＬ−グルタミン酸を従来よりも簡便に、しかも安定的に高い生産性で製造することができる。 In the method for producing L-glutamic acid of the present invention, L-glutamic acid can be produced more easily and stably with higher productivity than before by using a coryneform bacterium transformant.
Claims (6)
（ａ）（ａ−１）配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ｂ−１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は（ｂ−２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子 A step of culturing a coryneform bacterium transformed with the following gene (a) or (b) in a medium; and L-glutamic acid is produced and accumulated in the medium by the coryneform bacterium, and the L-glutamic acid is cultured in the medium. A method for producing L-glutamic acid, comprising the step of:
(A) (a-1) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (a-2) DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence of (a-1) and stringent DNA encoding a protein that has a function of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium that does not undergo L-glutamic acid production induction treatment by biotin depletion, and that hybridizes under conditions
(B) (b-1) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b-2) one or more amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A gene encoding a protein consisting of a substituted or added amino acid sequence and having an action of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production by biotin depletion
（ａ）（ａ−１）配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ｂ−１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は（ｂ−２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子 A coryneform bacterium transformant, wherein the following gene (a) or (b) is introduced into a coryneform bacterium.
(A) (a-1) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (a-2) DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence of (a-1) and stringent DNA encoding a protein that has a function of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium that does not undergo L-glutamic acid production induction treatment by biotin depletion, and that hybridizes under conditions
(B) (b-1) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b-2) one or more amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A gene encoding a protein consisting of a substituted or added amino acid sequence and having an action of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production by biotin depletion
（ａ）（ａ−１）配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ｂ−１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は（ｂ−２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつビオチン枯渇によるＬ−グルタミン酸生産誘導処理が施されていない培地においてコリネ型細菌によるＬ−グルタミン酸生産を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子 A recombinant vector comprising the following gene (a) or (b):
(A) (a-1) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (a-2) DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence of (a-1) and stringent DNA encoding a protein that has a function of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium that does not undergo L-glutamic acid production induction treatment by biotin depletion, and that hybridizes under conditions
(B) (b-1) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b-2) one or more amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A gene encoding a protein consisting of a substituted or added amino acid sequence and having an action of promoting L-glutamic acid production by coryneform bacteria in a medium not subjected to treatment for inducing L-glutamic acid production by biotin depletion
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