JP2009125008A - Method for producing hybrid polynucleotide - Google Patents

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Daisuke Miki
大輔 三木
Kenji Masui
健治 増井
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Tosoh Corp
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for efficiently producing various hybrid genes with decreased number of steps in contrast with conventional gene mutagenesis method necessitating complicated procedures. <P>SOLUTION: In a method for producing a hybrid polynucleotide by an in vivo homologous recombination in a microbial cell, a linear gene is formed by connecting only one terminal of the original polynucleotide to both ends of a linear vector in the same direction, and the gene is cyclized by homologous recombination to obtain a hybrid polynucleotide. In the second recombination or thereafter, only a hybrid polynucleotide having one terminal derived from the same polynucleotide is used to perform the recombination. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、相同組換えを用いた遺伝子組換え方法において、既存の蛋白質をコードする遺伝子に少ない工程で効率的により多くの遺伝子変異を導入する、ハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法に関するものである。   The present invention relates to a method for producing a hybrid polynucleotide, wherein a gene recombination method using homologous recombination efficiently introduces more gene mutations into a gene encoding an existing protein with fewer steps.

既存のタンパク質をコードする遺伝子に遺伝子変異を導入し、新たな機能を持たせることは、古くから行われている。その方法には、PCRを行う際にDNAポリメラーゼがある一定の割合で遺伝子を読み間違う性質を利用したエラープローンPCR(Plymerase Chain Reaction)と呼ばれるものや、変異原性物質や紫外線により細胞を処理し、遺伝子に突然変異を起こす方法がある。   Introducing a gene mutation into a gene encoding an existing protein to give it a new function has long been performed. In this method, DNA polymerase is called error-prone PCR (Plymerase Chain Reaction), which utilizes the property of reading a gene at a certain rate and mistakenly, and cells are treated with mutagenic substances or ultraviolet rays. There are ways to mutate genes.

また、既存のタンパク質のアミノ酸配列の一部を他の配列と置換し、タンパク質を改良する試みも行われている。その中で共通の祖先分子に由来した、同じタンパク質ファミリーに属する2種類以上のタンパク質の間でハイブリッドを作製する方法が近年開発されている。その方法には、目的のタンパク質をコードする複数の遺伝子(親遺伝子)を断片化し、PCRによりin vitroで遺伝子断片を再結合することで、複数の親遺伝子がランダムに結合した多数のハイブリッド遺伝子を作製することができるSexal PCRやファミリーシャフリングと呼ばれる方法や(例えば、特許文献1参照)、遺伝子の断片化を制限酵素で行うことにより、より効率良くハイブリッド遺伝子を形成させる方法がある(例えば、特許文献2参照)。   Attempts have also been made to improve proteins by replacing part of the amino acid sequence of existing proteins with other sequences. Among them, a method for producing a hybrid between two or more proteins belonging to the same protein family derived from a common ancestor molecule has been recently developed. The method involves fragmenting multiple genes (parent genes) that encode the protein of interest, and recombining the gene fragments in vitro by PCR to generate a large number of hybrid genes in which multiple parent genes are randomly linked. There is a method called Sexal PCR or family shuffling that can be prepared (for example, see Patent Document 1), and a method of forming a hybrid gene more efficiently by performing fragmentation of a gene with a restriction enzyme (for example, Patent Document 2).

一方、大腸菌などの微生物内における相同組換えを利用し、in vivoで既存のタンパク質の遺伝子配列の一部を他の配列と置換したハイブリッド遺伝子を作製し、既存のタンパク質に新たな機能を持たせることが試みられている。その方法には、大腸菌におけるRecAタンパク質による相同組換えを利用しハイブリッド遺伝子を作製する方法があり、数多く報告されている。この方法は、ベクター上に相同な2種類の遺伝子を同じ向きにクローン化したプラスミドを作製し、2つの遺伝子間を制限酵素で切断することにより直鎖状遺伝子にし、続いて該直鎖状遺伝子を大腸菌に導入し、RecAタンパク質による相同遺伝子間での相同組換えによって遺伝子を環状化することにより、ハイブリッド遺伝子を得る方法である。この方法では比較的相同性の低い遺伝子間からもハイブリッド遺伝子を作製することができる。また、遺伝子断片を含む環状ベクターを制限酵素で切断するのではなく、予め直鎖状のベクターを作製し、これに遺伝子断片の一方の末端だけを連結することによって直鎖状DNAを作製する方法がある(例えば、特許文献3参照)。この方法では相同組換えする度に遺伝子のクローン化をする必要がなく、また、一度の反応で複数の組み合わせのハイブリッド遺伝子を作製することが可能である。   On the other hand, using homologous recombination in microorganisms such as Escherichia coli, a hybrid gene is created by replacing part of the gene sequence of an existing protein with another sequence in vivo, and the existing protein has a new function. It has been tried. There are many methods for producing a hybrid gene using homologous recombination by RecA protein in Escherichia coli. In this method, a plasmid in which two types of homologous genes are cloned in the same direction on a vector is prepared, a linear gene is obtained by cleaving the two genes with a restriction enzyme, and then the linear gene Is introduced into Escherichia coli, and the gene is circularized by homologous recombination between homologous genes using RecA protein to obtain a hybrid gene. In this method, a hybrid gene can be prepared from genes having relatively low homology. Also, a method for preparing a linear DNA by preparing a linear vector in advance and ligating only one end of the gene fragment to the circular vector containing the gene fragment instead of cleaving with a restriction enzyme. (For example, refer to Patent Document 3). In this method, it is not necessary to clone a gene every time homologous recombination occurs, and it is possible to produce a hybrid gene of a plurality of combinations in one reaction.

特表平10−50561号公報Japanese National Patent Publication No. 10-50561 特開2000−245473号公報JP 2000-245473 A 特開2006−42737号公報JP 2006-42737 A

これら各種の遺伝子変異導入方及びハイブリッド遺伝子作製法は、いずれも有効な方法であるが、いくつかの改善すべき課題がある。   These various gene mutation introduction methods and hybrid gene production methods are all effective methods, but there are some problems to be improved.

すなわち、エラープローンPCRや、変異原性物質や紫外線による細胞処理は、遺伝子の突然変異か無作為に起こるため、目的タンパク質の機能的な構造が破壊されてしまったり、細胞が死滅してしまう場合がある。既存のin vitroでのファミリーシャフリングでは、何らかの方法で遺伝子の不特定の部位あるいは特定の部位を切断し遺伝子を断片化しなければならないという煩雑な工程が存在する。また、試験管内で、PCRを利用した遺伝子断片の再結合を行うため、制限酵素による断片化であっても、80%以上という比較的高い相同性が要求される。そのため、相同性が高い遺伝子配列のハイブリッドを作製するには有効であるが、相同性が低い遺伝子間でのハイブリッド遺伝子作製には適さない場合がある。一方in vivoでの相同組換えを用いる方法では、一度の反応で一回の相同組換えしか起こらず、得られるハイブリッド遺伝子の種類がファミリーシャフリング法に比べて少ないことや、得られるハイブリッド遺伝子の種類を増やすために二回目、三回目の相同組換えを行う場合、その都度遺伝子のクローン化を行わなければならないという課題がある。   In other words, error-prone PCR, cell processing with mutagenic substances and ultraviolet rays occur due to gene mutation or randomization, so that the functional structure of the target protein is destroyed or cells are killed. There is. In existing family shuffling in vitro, there is a complicated process in which an unspecified site or a specific site of a gene must be cleaved by some method to fragment the gene. Further, since gene fragments are recombined using PCR in a test tube, a relatively high homology of 80% or more is required even in the case of fragmentation with a restriction enzyme. Therefore, although it is effective for producing a hybrid of gene sequences having high homology, it may not be suitable for producing a hybrid gene between genes having low homology. On the other hand, in the method using homologous recombination in vivo, only one homologous recombination occurs in one reaction, and there are fewer types of hybrid genes obtained compared to the family shuffling method, When performing the second and third homologous recombination in order to increase the number of types, there is a problem that the gene must be cloned each time.

また、予め直鎖状のベクターを作製し、これに相同な2種類の遺伝子断片(それぞれ第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドとすると)のそれぞれ一方の末端だけを連結することによって直鎖状DNAを作製する方法においても、二度の組換えで得られるポリヌクレオチドは5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来し、中央部分が第二のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドのみであり、これ以上の変異を導入しようとする場合、さらに組換えを行わなければならない。また、二回目以降の組換えを行う場合、直鎖状遺伝子の5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来するキメラ遺伝子と、3’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来するキメラ遺伝子の両方を調製しなければならず、煩雑である。   In addition, a linear vector is prepared in advance, and only one end of each of two types of gene fragments (assuming the first polynucleotide and the second polynucleotide, respectively) are linked to form a linear vector. In the method for preparing the DNA, the polynucleotide obtained by the two recombination is derived from the first polynucleotide at the 5 ′ end portion, from the second polynucleotide at the central portion, and from the 3 ′ end portion. If only the hybrid derived from the first polynucleotide is to be introduced and further mutations are to be introduced, further recombination must be performed. In addition, when performing the second and subsequent recombination, a chimeric gene in which the 5 ′ end portion of the linear gene is derived from the first polynucleotide and a chimeric gene in which the 3 ′ end portion is derived from the first polynucleotide Both must be prepared and are cumbersome.

本発明の目的は、微生物細胞内でのin vivo相同組換えを用いた方法を元にした、少ない工程でより多様なハイブリッド遺伝子を簡便に作製するための手段として、ハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法を提供することにある。   An object of the present invention is to provide a method for producing a hybrid polynucleotide as a means for easily producing more diverse hybrid genes with fewer steps based on a method using in vivo homologous recombination in a microbial cell. It is to provide.

従来の微生物内での相同組換え法は、2種類の相同な遺伝子をダンデムにクローン化した後、これを制限酵素で切断して直鎖状DNAとし、次いで、該直鎖状DNAを大腸菌内での相同組換えによって環状化した後、それぞれ別に組換えを行った5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来するキメラ遺伝子と、3’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来するキメラ遺伝子を用いて、2回目以降の組換えを行っていた。   In the conventional homologous recombination method in microorganisms, two types of homologous genes are cloned into dandem, and then cleaved with a restriction enzyme to obtain linear DNA. A chimeric gene in which the 5′-end portion is derived from the first polynucleotide after being circularized by homologous recombination, and the 3′-end portion is derived from the first polynucleotide. Was used for the second and subsequent recombination.

本発明者らは、2回目以降の組換えを行う場合に、5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来するキメラ遺伝子のみを用いることによって、多様なハイブリッド遺伝子を簡便に作製する方法を見出した。   The present inventors have found a method for easily preparing various hybrid genes by using only a chimeric gene whose 5 ′ terminal portion is derived from the first polynucleotide in the second and subsequent recombination. It was.

すなわち本発明は、従来の相同組換え法のように2回目以降の組換えに5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来するキメラ遺伝子と、3’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来するキメラ遺伝子の両方を調製する必要がなく、多様なハイブリッド遺伝子を作製することが可能である。   That is, the present invention provides a chimeric gene in which the 5 ′ end portion is derived from the first polynucleotide and the 3 ′ end portion is derived from the first polynucleotide in the second and subsequent recombination as in the conventional homologous recombination method. It is not necessary to prepare both of the chimeric genes to be prepared, and a variety of hybrid genes can be produced.

従って本発明は、微生物細胞内でのin vivo相同組換えを用いたポリヌクレオチドハイブリッド作製方法を元にした、少ない工程でより多様なハイブリッド遺伝子を簡便に作製するためのポリヌクレオチドハイブリッドの作製方法である。以下、本発明を詳細に説明する。   Therefore, the present invention is a polynucleotide hybrid production method for easily producing more diverse hybrid genes with fewer steps, based on a polynucleotide hybrid production method using in vivo homologous recombination in microbial cells. is there. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明における第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドは、それぞれ1種類だけであってもよく、また、2種類以上であってもよい。   Each of the first polynucleotide and the second polynucleotide in the present invention may be one kind or two kinds or more.

本発明における任意のベクターは特に限定されないが、通常、抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を含むものを使用する。   Although the arbitrary vector in this invention is not specifically limited, Usually, what contains marker genes, such as an antibiotic resistance gene, is used.

本発明における相同組換え能を持つ微生物は特に限定されないが、通常、recA遺伝子を持つ大腸菌株を使用し、特に好ましくはrecBCsbcA変異株の大腸菌を使用する。   The microorganism having homologous recombination ability in the present invention is not particularly limited, but usually an Escherichia coli strain having a recA gene is used, particularly preferably a recBCsbcA mutant E. coli.

本発明の請求項1に記載された方法に使用する第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドの両端を切断する制限酵素は、それぞれ異なる制限酵素であることが好ましいが、それぞれのポリヌクレオチドの5’末端を切断する制限酵素、あるいは3’末端を切断する制限酵素は同じ制限酵素であってもよい。また、本発明の請求項2に記載された方法に使用する制限酵素は、それぞれ異なる制限酵素である。なお、本発明の方法における各工程を2回以上繰り返す場合、使用する制限酵素は通常1回目に使用したものと同一のものを使うが、異なる制限酵素を使ってもよい。   The restriction enzymes that cleave both ends of the first polynucleotide and the second polynucleotide used in the method described in claim 1 of the present invention are preferably different restriction enzymes. The restriction enzyme that cuts the 5 ′ end or the restriction enzyme that cuts the 3 ′ end may be the same restriction enzyme. Moreover, the restriction enzymes used in the method described in claim 2 of the present invention are different restriction enzymes. When each step in the method of the present invention is repeated twice or more, the restriction enzyme used is usually the same as that used for the first time, but different restriction enzymes may be used.

本発明の請求項1に記載の方法の概要を、図1及び図2を用いて説明する。第一のポリヌクレオチドと、それに相同な部分配列を持つ第二のポリヌクレオチドをベクターのmultiple cloning site(多クローニング部位)にクローン化したものを例に本発明を説明するが、本発明は相同性のある遺伝子断片すべてに適用できる。また、異なる制限酵素を、制限酵素A、B、C、Dとして説明する。制限酵素Aは、第一のポリヌクレオチドの5’末端あるいはそれより上流の遺伝子を切断する制限酵素、制限酵素Bは、第一のポリヌクレオチドの3’末端あるいはそれより下流の遺伝子を切断する制限酵素、制限酵素Cは、第二のポリヌクレオチドの5’末端側あるいはそれより上流の遺伝子を切断する制限酵素、制限酵素Dは、第二のポリヌクレオチドの3’末端側あるいはそれより下流の遺伝子を切断する制限酵素とする。   The outline of the method according to claim 1 of the present invention will be described with reference to FIGS. The present invention will be described with reference to an example in which a first polynucleotide and a second polynucleotide having a partial sequence homologous thereto are cloned into a multiple cloning site of the vector. Applicable to all gene fragments with Different restriction enzymes are described as restriction enzymes A, B, C, and D. Restriction enzyme A is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 5 ′ end of the first polynucleotide or upstream thereof. Restriction enzyme B is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 3 ′ end of the first polynucleotide or downstream thereof. Enzyme, restriction enzyme C is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 5 ′ end side or upstream of the second polynucleotide, and restriction enzyme D is a gene at the 3 ′ end side or downstream of the second polynucleotide Is a restriction enzyme that cleaves.

第一のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素Bで処理した後切断部位を脱リン酸化し、次いで、制限酵素Aで処理し、ポリヌクレオチドをベクターから切り離すことにより、第一のポリヌクレオチド断片を調製する(図1、1−1の第一ポリヌクレオチドとして示される)。同様に、第二のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素Cで処理した後切断部位をアルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化し、次いで、制限酵素Dで処理し、ポリヌクレオチドをベクターから切り離すことにより、第二のポリヌクレオチド断片を調製する(図1、1−1の第二ポリヌクレオチドとして示される)。それぞれのポリヌクレオチドの末端のアルファベットは、切断した制限酵素部位を示している。星印(*)は脱リン酸化部位を示している。ベクターは酵素A、Dで切断し、アルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化したものを調製する(図1、1−2のベクターとして示される)。第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドとベクターを混ぜ合わせ、ライゲーションするとB*、C*の部分は連結できないため、直鎖状分子ができる(図1、1−3として示される)。ライゲーション反応後、アガロースゲル電気泳動などで目的の直鎖状に連結した分子だけを回収し、相同組換え能を持つ微生物に導入、ベクターに応じた抗生物質を含んだ培地に塗布する。2種類のポリヌクレオチドの相同な部分での相同組換えが起こり、環状になった分子を持つ大腸菌のみが増殖する。抗生物質を含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組換えハイブリッドポリヌクレオチドライブラリー1−1とする(図1、1−4として示される)。プラスミドの抽出は、一般的な大腸菌からの抽出方法により行えばよく、市販されているプラスミド抽出キット(QIAprep、キアゲン社製)などを用いて行えばよい。ポリヌクレオチドライブラリー1−1は、5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなる(図1、1−4として示される)。   A vector cloned from the first polynucleotide is treated with restriction enzyme B, followed by dephosphorylation of the cleavage site, followed by treatment with restriction enzyme A to cleave the polynucleotide from the vector. Fragments are prepared (shown as the first polynucleotide in FIGS. 1, 1-1). Similarly, a vector obtained by cloning the second polynucleotide is treated with restriction enzyme C and then dephosphorylated by treating the cleavage site with alkaline phosphatase, and then treated with restriction enzyme D, and the polynucleotide is vectorized. A second polynucleotide fragment is prepared by detaching from (shown as the second polynucleotide in FIGS. 1, 1-1). The alphabet at the end of each polynucleotide indicates a cleaved restriction enzyme site. An asterisk (*) indicates a dephosphorylation site. A vector is prepared by cleaving with enzymes A and D and dephosphorylated by treating with alkaline phosphatase (shown as vectors in FIGS. 1 and 1-2). When the first polynucleotide and the second polynucleotide are mixed with the vector and ligated, the B * and C * portions cannot be linked, so that a linear molecule is formed (shown as FIGS. 1 and 1-3). After the ligation reaction, only the target linearly linked molecules are collected by agarose gel electrophoresis or the like, introduced into a microorganism having homologous recombination ability, and applied to a medium containing an antibiotic corresponding to the vector. Homologous recombination occurs at the homologous part of the two polynucleotides, and only E. coli having a circular molecule grows. Plasmids are collectively collected from colonies grown in a medium containing antibiotics and purified in bulk to form a single recombinant hybrid polynucleotide library 1-1 (shown as FIGS. 1, 1-4). Plasmid extraction may be performed by a general extraction method from E. coli, and may be performed using a commercially available plasmid extraction kit (QIAprep, manufactured by Qiagen). The polynucleotide library 1-1 is composed of a hybrid in which the 5 ′ end portion is derived from the first polynucleotide and the 3 ′ end portion is derived from the second polynucleotide (shown as FIGS. 1 and 1-4). .

続いて一回目の組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、二回目の組換えを行う。方法は一回目の方法と同じである。   Subsequently, a second recombination is performed on the hybrid polynucleotide library prepared by the first recombination. The method is the same as the first method.

ポリヌクレオチドライブラリー1−1を、制限酵素Bで処理した後切断部位をアルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化し、次いで、制限酵素Aで処理し、ポリヌクレオチドをベクターから切り離し、第一のポリヌクレオチド断片を調製する(図2、2−1の第一ポリヌクレオチドとして示される)。同様に、ポリヌクレオチドライブラリー1−1を、制限酵素Cで処理した後切断部位をアルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化し、次いで、制限酵素Dで処理し、ポリヌクレオチドをベクターから切り離し、第二のポリヌクレオチド断片を調製する(図2、2−1の第二ポリヌクレオチドとして示される)。ベクターは酵素A、Dで切断し、アルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化したものを用意する(図2、2−2のベクターとして示される)。第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドとベクターを混ぜ合わせ、ライゲーションするとB*、C*の部分は連結できないため、直鎖状分子ができる(図2、2−3として示される)。ライゲーション反応後、アガロースゲル電気泳動などで目的の直鎖状に連結した分子だけを回収し、相同組換え能を持つ微生物に導入、ベクターに応じた抗生物質を含んだ培地に塗布する。2種類のポリヌクレオチドの相同な部分での相同組換えが起こり、環状になった分子を持つ大腸菌のみが増殖する。抗生物質を含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、二回組換えハイブリッドポリヌクレオチドライブラリー1−2とする(図2、2−4として示される)。ポリヌクレオチドライブラリー1−2のポリヌクレオチドの部分は、5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来し、続いて第二のポリヌクレオチドに由来した部分、続いて第一のポリヌクレオチド由来した部分からなり、3’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなるクローン、及び5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来し3’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなるクローンからなる。(図2、2−4として示される)。   The polynucleotide library 1-1 is treated with restriction enzyme B and then dephosphorylated by treating the cleavage site with alkaline phosphatase, and then treated with restriction enzyme A to cleave the polynucleotide from the vector, A polynucleotide fragment is prepared (shown as the first polynucleotide in FIGS. 2, 2-1). Similarly, the polynucleotide library 1-1 is treated with restriction enzyme C and then dephosphorylated by treating the cleavage site with alkaline phosphatase, then treated with restriction enzyme D to cleave the polynucleotide from the vector, A second polynucleotide fragment is prepared (shown as the second polynucleotide in FIGS. 2, 2-1). Prepare a vector that has been dephosphorylated by digestion with enzymes A and D and treatment with alkaline phosphatase (shown as vectors in FIGS. 2 and 2-2). When the first polynucleotide and the second polynucleotide are mixed with the vector and ligated, the B * and C * portions cannot be linked, so that a linear molecule is formed (shown as FIGS. 2 and 2-3). After the ligation reaction, only the target linearly linked molecules are collected by agarose gel electrophoresis or the like, introduced into a microorganism having homologous recombination ability, and applied to a medium containing an antibiotic corresponding to the vector. Homologous recombination occurs at the homologous part of the two polynucleotides, and only E. coli having a circular molecule grows. Plasmids are collectively collected from colonies grown on antibiotic-containing media and purified in bulk to yield a twice-recombinant hybrid polynucleotide library 1-2 (shown as FIGS. 2, 2-4). The polynucleotide portion of the polynucleotide library 1-2 has a 5 ′ terminal portion derived from the first polynucleotide, followed by a portion derived from the second polynucleotide, followed by a portion derived from the first polynucleotide. A clone consisting of a hybrid whose 3 ′ end portion is derived from a second polynucleotide, and a hybrid whose 5 ′ end portion is derived from a first polynucleotide and whose 3 ′ end portion is derived from a second polynucleotide It consists of a clone. (Shown as FIGS. 2, 2-4).

二回目の組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、三回目の組換え、三回組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、四回目の組換え、と順次組換えを行うことができる。方法は一回目の組換えと同じである。これにより、少ない工程でより多様なハイブリッド遺伝子を簡便に作製することが可能である。   For the hybrid polynucleotide library prepared by the second recombination, perform the third recombination, the fourth recombination for the hybrid polynucleotide library prepared by the third recombination, and then the recombination sequentially. It can be carried out. The method is the same as the first recombination. This makes it possible to easily produce more diverse hybrid genes with fewer steps.

また、第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドとを入れ換えて同様の操作により組換えを行っても、同様の効果が期待できる。   Moreover, the same effect can be expected even if the first polynucleotide and the second polynucleotide are replaced and recombination is performed by the same operation.

本発明の請求項2に記載の方法の概要を、図3及び図4を用いて説明する。第一のポリヌクレオチドと、それに相同な部分配列を持つ第二のポリヌクレオチドをベクターのmultiple cloning siteにクローン化したものを例に本発明を説明するが、本発明は相同性のある遺伝子断片すべてに適用できる。また、異なる制限酵素を、制限酵素E、H、P、Fとして説明する。制限酵素Eは、第一のポリヌクレオチドの5’末端側あるいはそれより上流の遺伝子を切断する制限酵素、制限酵素H、は第一のポリヌクレオチドの3’末端側あるいはそれより下流の遺伝子を切断する制限酵素、制限酵素Pは、第二のポリヌクレオチドの3’末端側あるいはそれより下流の遺伝子を切断し且つ制限酵素Hよりも第二のポリヌクレオチドに近い部分を切断する制限酵素、制限酵素Fは、第二のポリヌクレオチドの5’末端側あるいはそれより上流の遺伝子を切断し且つ制限酵素Eよりも第二のポリヌクレオチドに近い部分を切断する制限酵素とする。第一のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素EとHで切断し、ポリヌクレオチドをベクターから切り離し、さらに両末端のリン酸基を脱リン酸化することにより第一のポリヌクレオチド断片を調製する(図3、3−1の第一ポリヌクレオチドとして示される)。第一のポリヌクレオチドと相同な配列をもつ第二のポリヌクレオチドがクローン化されたベクターを、制限酵素Pで切断した後切断部位のリン酸基をアルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化し、次いで、制限酵素Hで処理することにより第二のポリヌクレオチド断片を含むベクター遺伝子を調製する(図3、3−1の第二ポリヌクレオチドとして示される)。それぞれのポリヌクレオチドの末端のアルファベットは、切断した制限酵素部位を示している。星印(*)は脱リン酸化部位を示している。第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドを含むベクターを混ぜ合わせライゲーションすると制限酵素Hによる切断部位でのみ結合がおこり、直鎖状分子ができる(図3、3−2として示される)。ライゲーション反応後、アガロースゲル電気泳動などで目的の直鎖状に連結した分子だけを回収し、相同組換え能を持つ微生物に導入、ベクターに応じた抗生物質を含んだ培地に塗布する。2種類のポリヌクレオチドの相同な部分での相同組換えが起こり、環状になった分子を持つ大腸菌のみが増殖する。抗生物質を含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組み換えハイブリッドポリヌクレオチドライブラリー3−1とする(図3、3−3として示される)。ポリヌクレオチドライブラリー3−1は5’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなる(図3、3−3として示される)。   The outline of the method according to claim 2 of the present invention will be described with reference to FIGS. The present invention will be described by taking as an example the cloning of a first polynucleotide and a second polynucleotide having a partial sequence homologous thereto into a vector multiple cloning site. However, the present invention covers all homologous gene fragments. Applicable to. Different restriction enzymes will be described as restriction enzymes E, H, P, and F. Restriction enzyme E is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 5 ′ end of the first polynucleotide or upstream thereof, restriction enzyme H is a gene that cleaves the gene at the 3 ′ end of the first polynucleotide or downstream thereof. Restriction enzyme P, restriction enzyme P is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 3 ′ end of the second polynucleotide or downstream thereof and cleaves a portion closer to the second polynucleotide than restriction enzyme H F is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 5 ′ end of the second polynucleotide or upstream thereof and cleaves the portion closer to the second polynucleotide than the restriction enzyme E. The first polynucleotide fragment is prepared by cleaving the vector cloned from the first polynucleotide with restriction enzymes E and H, cleaving the polynucleotide from the vector, and dephosphorylating the phosphate groups at both ends. (Shown as the first polynucleotide in FIGS. 3, 3-1). A vector in which a second polynucleotide having a sequence homologous to the first polynucleotide is cloned, is dephosphorylated by cleaving with a restriction enzyme P and then treating the phosphate group at the cleavage site with alkaline phosphatase; Next, a vector gene containing the second polynucleotide fragment is prepared by treating with restriction enzyme H (shown as the second polynucleotide in FIGS. 3 and 3-1). The alphabet at the end of each polynucleotide indicates a cleaved restriction enzyme site. An asterisk (*) indicates a dephosphorylation site. When a vector containing the first polynucleotide and the second polynucleotide is mixed and ligated, binding occurs only at the restriction enzyme H cleavage site to form a linear molecule (shown as FIGS. 3 and 3-2). After the ligation reaction, only the target linearly linked molecules are collected by agarose gel electrophoresis or the like, introduced into a microorganism having homologous recombination ability, and applied to a medium containing an antibiotic corresponding to the vector. Homologous recombination occurs at the homologous part of the two polynucleotides, and only E. coli having a circular molecule grows. Plasmids are collectively collected from colonies grown in a medium containing antibiotics and purified in bulk to give a single recombinant hybrid polynucleotide library 3-1 (shown as FIGS. 3 and 3-3). Polynucleotide library 3-1 consists of hybrids whose 5 'end portion is derived from the second polynucleotide and whose 3' end portion is derived from the first polynucleotide (shown as FIGS. 3, 3-3).

続いて一回目の組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、二回目の組換えを行う。方法は一回目の方法と同じである。   Subsequently, a second recombination is performed on the hybrid polynucleotide library prepared by the first recombination. The method is the same as the first method.

ポリヌクレオチドライブラリー3−1を制限酵素EとHで切断しポリヌクレオチドをベクターから切り離し、さらに両末端のリン酸基を脱リン酸化することにより第一のポリヌクレオチド断片を調製する(図4、4−1の第一ポリヌクレオチドとして示される)。一方、ポリヌクレオチドライブラリー3−1を、制限酵素Pで切断した後切断部位のリン酸基をアルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化し、次いで、制限酵素Hで処理することにより第二のポリヌクレオチド断片を含むベクター遺伝子を調製する(図4、4−1の第二ポリヌクレオチドとして示される)。第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドを含むベクターを混ぜ合わせライゲーションすると制限酵素Hによる切断部位でのみ結合がおこり、直鎖状分子ができる(図4、4−2として示される)。ライゲーション反応後、アガロースゲル電気泳動などで目的の直鎖状に連結した分子だけを回収し、相同組換え能を持つ微生物に導入、ベクターに応じた抗生物質を含んだ培地に塗布する。2種類のポリヌクレオチドの相同な部分での相同組換えが起こり、環状になった分子を持つ大腸菌のみが増殖する。抗生物質を含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組み換えハイブリッドポリヌクレオチドライブラリー3−2とする(図4、4−3として示される)。   A first polynucleotide fragment is prepared by cleaving the polynucleotide library 3-1 with restriction enzymes E and H, cleaving the polynucleotide from the vector, and dephosphorylating the phosphate groups at both ends (FIG. 4, 4-1 shown as the first polynucleotide). On the other hand, after cleaving the polynucleotide library 3-1 with the restriction enzyme P, the phosphate group at the cleavage site is treated with alkaline phosphatase, and then dephosphorylated, and then treated with the restriction enzyme H to produce a second enzyme. A vector gene containing the polynucleotide fragment is prepared (shown as the second polynucleotide in FIGS. 4 and 4-1). When a vector containing the first polynucleotide and the second polynucleotide is mixed and ligated, binding occurs only at the cleavage site by the restriction enzyme H to form a linear molecule (shown as FIGS. 4 and 4-2). After the ligation reaction, only the target linearly linked molecules are collected by agarose gel electrophoresis or the like, introduced into a microorganism having homologous recombination ability, and applied to a medium containing an antibiotic corresponding to the vector. Homologous recombination occurs at the homologous part of the two polynucleotides, and only E. coli having a circular molecule grows. Plasmids are collectively collected from colonies grown in a medium containing antibiotics and purified in bulk to produce a single recombinant hybrid polynucleotide library 3-2 (shown as FIGS. 4 and 4-3).

ポリヌクレオチドライブラリー3−2のポリヌクレオチドの部分は、5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来し、続いて第二のポリヌクレオチドに由来した部分、続いて第一のポリヌクレオチド由来した部分からなり、3’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなるクローン、及び5’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来し3’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなるクローンからなる。(図4、4−3として示される)。   The polynucleotide portion of the polynucleotide library 3-2 has a 5 ′ terminal portion derived from the first polynucleotide, followed by a portion derived from the second polynucleotide, followed by a portion derived from the first polynucleotide. A clone consisting of a hybrid whose 3 ′ end portion is derived from a second polynucleotide, and a hybrid whose 5 ′ end portion is derived from a first polynucleotide and whose 3 ′ end portion is derived from a second polynucleotide It consists of a clone. (Shown as FIGS. 4, 4-3).

二回目の組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、三回目の組換え、三回組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、四回目の組換え、と順次組換えを行うことができる。方法は二回目の組換えと同様組換えを起こしたいポリヌクレオチドの5’末端が、第一のポリヌクレオチドあるいは第二のポリヌクレオチドのどちらか一方に由来するポリヌクレオチドライブラリーを使用して行えばよい。これにより、少ない工程でより多様なハイブリッド遺伝子を簡便に作製することが可能である。   For the hybrid polynucleotide library prepared by the second recombination, perform the third recombination, the fourth recombination for the hybrid polynucleotide library prepared by the third recombination, and then the recombination sequentially. It can be carried out. The method is carried out by using a polynucleotide library in which the 5 ′ end of the polynucleotide to be recombined is derived from either the first polynucleotide or the second polynucleotide as in the second recombination. Good. This makes it possible to easily produce more diverse hybrid genes with fewer steps.

また、第二のポリヌクレオチドがクローン化されたベクターを、第二のポリヌクレオチドの5’末端で切断する制限酵素Fで切断し、切断部位をアルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化した後、該ベクターの3’末端を制限酵素Eで切断した第二のポリヌクレオチド断片を含むベクター遺伝子を用いて、図3の3−1に示す第一のポリヌクレオチドとライゲーション及び相同組換えを行っても同様の効果が期待できる。   In addition, the vector in which the second polynucleotide is cloned is cleaved with a restriction enzyme F that cleaves at the 5 ′ end of the second polynucleotide, and the cleavage site is treated with alkaline phosphatase to dephosphorylate, Using the vector gene containing the second polynucleotide fragment obtained by cleaving the 3 ′ end of the vector with restriction enzyme E, ligation and homologous recombination with the first polynucleotide shown in FIG. Similar effects can be expected.

以上述べた本発明の請求項2の方法の一部を変更した方法によっても本発明の請求項2の方法と同様のハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーを作製できる。以下、本発明の請求項2の方法の一部を変更した方法について、図5を用いて説明する。第一のポリヌクレオチドと、それに相同な部分配列を持つ第二のポリヌクレオチドをベクターのmultiple cloning siteにクローン化したものを例に本発明を説明するが、本発明は相同性のある遺伝子断片すべてに適用できる。また、異なる制限酵素を、制限酵素E、H、P、Fとして説明する。制限酵素Eは、第一のポリヌクレオチドの5’末端側あるいはそれより上流の遺伝子を切断する制限酵素、制限酵素H、は第一のポリヌクレオチドの3’末端側あるいはそれより下流の遺伝子を切断する制限酵素、制限酵素Pは、第二のポリヌクレオチドの3’末端側あるいはそれより下流の遺伝子を切断し且つ制限酵素Hよりも第二のポリヌクレオチドに近い部分を切断する制限酵素、制限酵素Fは、第二のポリヌクレオチドの5’末端側あるいはそれより上流の遺伝子を切断し且つ制限酵素Eよりも第二のポリヌクレオチドに近い部分を切断する制限酵素とする。   A hybrid polynucleotide library similar to the method of claim 2 of the present invention can also be prepared by a method obtained by changing a part of the method of claim 2 of the present invention described above. Hereinafter, a method obtained by changing a part of the method according to claim 2 of the present invention will be described with reference to FIG. The present invention will be described by taking as an example the cloning of a first polynucleotide and a second polynucleotide having a partial sequence homologous thereto into a vector multiple cloning site. However, the present invention covers all homologous gene fragments. Applicable to. Different restriction enzymes will be described as restriction enzymes E, H, P, and F. Restriction enzyme E is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 5 ′ end of the first polynucleotide or upstream thereof, restriction enzyme H is a gene that cleaves the gene at the 3 ′ end of the first polynucleotide or downstream thereof. Restriction enzyme P, restriction enzyme P is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 3 ′ end of the second polynucleotide or downstream thereof and cleaves a portion closer to the second polynucleotide than restriction enzyme H F is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 5 ′ end of the second polynucleotide or upstream thereof and cleaves the portion closer to the second polynucleotide than the restriction enzyme E.

第一のポリヌクレオチドをクローン化したベクターを、制限酵素Eで切断し切断部位のリン酸基をアルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化した後、制限酵素Hでさらに切断し第一のポリヌクレオチドをベクターから切り離す(図5、5−1の第一ポリヌクレオチドとして示される)。第一のポリヌクレオチドと相同な配列をもつ第二のポリヌクレオチドがクローン化されたベクターを制限酵素PとHで切断した後切断部位のリン酸基を脱リン酸化することにより第二のポリヌクレオチド断片を含むベクター遺伝子を調製する(図5、5−1の第二ポリヌクレオチドとして示される)。それぞれのポリヌクレオチドの末端のアルファベットは、切断した制限酵素部位を示している。星印(*)は脱リン酸化部位を示している。第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドを含むベクターを混ぜ合わせライゲーションすると制限酵素Hによる切断部位でのみ結合がおこり、直鎖状分子ができる(図5、5−2として示される)。ライゲーション反応後、アガロースゲル電気泳動などで目的の直鎖状に連結した分子だけを回収し、相同組換え能を持つ微生物に導入、ベクターに応じた抗生物質を含んだ培地に塗布する。2種類のポリヌクレオチドの相同な部分での相同組換えが起こり、環状になった分子を持つ大腸菌のみが増殖する。抗生物質を含む培地で増殖したコロニーからプラスミドをまとめてバルクで精製し、一回組み換えハイブリッドポリヌクレオチドライブラリー4−1とする(図5、5−3として示される)。ポリヌクレオチドライブラリー4−1は5’末端部分が第二のポリヌクレオチドに由来し、3’末端部分が第一のポリヌクレオチドに由来したハイブリッドからなる(図5、5−3として示される)。   The vector obtained by cloning the first polynucleotide is cleaved with the restriction enzyme E, and the phosphate group at the cleavage site is treated with alkaline phosphatase to be dephosphorylated, and then further cleaved with the restriction enzyme H. From the vector (shown as the first polynucleotide in FIGS. 5 and 5-1). The second polynucleotide is obtained by cleaving the vector cloned from the second polynucleotide having a sequence homologous to the first polynucleotide with restriction enzymes P and H and then dephosphorylating the phosphate group at the cleavage site. A vector gene containing the fragment is prepared (shown as the second polynucleotide in FIGS. 5 and 5-1). The alphabet at the end of each polynucleotide indicates a cleaved restriction enzyme site. An asterisk (*) indicates a dephosphorylation site. When a vector containing the first polynucleotide and the second polynucleotide is mixed and ligated, binding occurs only at the site cleaved by the restriction enzyme H to form a linear molecule (shown as FIGS. 5 and 5-2). After the ligation reaction, only the target linearly linked molecules are collected by agarose gel electrophoresis or the like, introduced into a microorganism having homologous recombination ability, and applied to a medium containing an antibiotic corresponding to the vector. Homologous recombination occurs at the homologous part of the two polynucleotides, and only E. coli having a circular molecule grows. Plasmids are collectively collected from colonies grown in a medium containing antibiotics and purified in bulk to yield a single recombinant hybrid polynucleotide library 4-1 (shown as FIGS. 5 and 5-3). Polynucleotide library 4-1 consists of a hybrid whose 5 'end portion is derived from the second polynucleotide and whose 3' end portion is derived from the first polynucleotide (shown as FIGS. 5, 5-3).

続いて一回目の組換えで作製したハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーに対して、二回目の組換えを行う。方法は一回目の方法と同じである。2回目以降の組換えは、組換えを起こしたいポリヌクレオチドの5’末端が、第一のポリヌクレオチドあるいは第二のポリヌクレオチドのどちらか一方に由来するポリヌクレオチドライブラリーを使用し、上記と同様に行うことにより、本発明の請求項2の方法と同様のハイブリッドポリヌクレオチドライブラリーが得られる。これにより、少ない工程でより多様なハイブリッド遺伝子を簡便に作製することが可能である。また、第二のポリヌクレオチドがクローン化されたベクターを、第二のポリヌクレオチドの5’末端あるいはそれより上流の遺伝子で切断する制限酵素Fで切断し、切断部位をアルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化した後、該ベクターの3’末端を制限酵素Eで切断した第二のポリヌクレオチド断片を含むベクター遺伝子を用いて、第一のポリヌクレオチドとライゲーション及び相同組換えを行っても同様の効果が期待できる。   Subsequently, a second recombination is performed on the hybrid polynucleotide library prepared by the first recombination. The method is the same as the first method. In the second and subsequent recombination, a polynucleotide library in which the 5 ′ end of the polynucleotide to be recombined is derived from either the first polynucleotide or the second polynucleotide is used as described above. By performing the above, a hybrid polynucleotide library similar to the method of claim 2 of the present invention can be obtained. This makes it possible to easily produce more diverse hybrid genes with fewer steps. In addition, the vector in which the second polynucleotide is cloned is cut with a restriction enzyme F that cuts at the 5 ′ end of the second polynucleotide or a gene upstream thereof, and the cleavage site is treated with alkaline phosphatase. After dephosphorylation, ligation and homologous recombination with the first polynucleotide using a vector gene containing the second polynucleotide fragment obtained by cleaving the 3 ′ end of the vector with restriction enzyme E is the same. The effect can be expected.

本発明に従えば、遺伝子の断片化を行うことなく、大腸菌内での相同組換えを利用して、少ない工程でより多様なハイブリッド遺伝子を簡便に作製することができる。本発明は、親和性や特異性に優れた抗体の創出、耐熱性に優れた酵素や基質特異性の変化した酵素の創出など、既存のタンパク質の機能の高機能化や、全く新しい機能を持ったタンパク質の創出に有効である。   According to the present invention, more diverse hybrid genes can be easily produced with fewer steps by utilizing homologous recombination in E. coli without fragmenting the genes. The present invention has functions of existing proteins, such as the creation of antibodies with excellent affinity and specificity, the creation of enzymes with excellent heat resistance and enzymes with altered substrate specificity, and completely new functions. It is effective in creating new proteins.

以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。   Examples are shown below to describe the invention in more detail, but the invention is not limited to these Examples.

実施例1 一回目の組換えのための直鎖状抗体遺伝子の調製
相同な2種類の、同じ抗原に対する抗体遺伝子E06及びE30をベクターpFCAH10のmultiple cloning siteにそれぞれクローン化し、pE06、pE30とした。遺伝子をクローン化したプラスミドpE06を制限酵素XhoIと制限酵素NheIで切断し、精製後shrimp alkaline phosphatase (SAP)で脱リン酸化し、pE06(X*/N*)を得た。
Example 1 Preparation of Linear Antibody Gene for First Recombination Two homologous antibody genes E06 and E30 against the same antigen were cloned into a multiple cloning site of vector pFCAH10 to obtain pE06 and pE30, respectively. Plasmid pE06 from which the gene was cloned was cleaved with restriction enzyme XhoI and restriction enzyme NheI, purified and then dephosphorylated with shrim alkalin phosphatase (SAP) to obtain pE06 (X * / N *).

プラスミドpE30を制限酵素SfiIで切断、精製後SAPによって脱リン酸化した。さらに制限酵素NheIで切断し、pE30(S*/N)を得た。これと上記のpE06(X*/N*)を混ぜ合わせ、T4 ligaseによって連結反応を行った。反応後、全量をアガロースゲル電気泳動に供し、5.7kbの大きさの断片をゲルから回収し、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製を行った。   The plasmid pE30 was cleaved with the restriction enzyme SfiI, purified and then dephosphorylated with SAP. Further, it was cleaved with the restriction enzyme NheI to obtain pE30 (S * / N). This was mixed with the above-mentioned pE06 (X * / N *), and a ligation reaction was performed using T4 ligase. After the reaction, the entire amount was subjected to agarose gel electrophoresis, and a 5.7 kb fragment was recovered from the gel and purified by phenol extraction and ethanol precipitation.

実施例2 一回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーの作製
実施例1で調製した直鎖状遺伝子を、大腸菌のrecBCsbcA変異株JC8679株にエレクトロポレーションによって導入した。カルベニシリンを含んだ培地上でコロニーを増殖させ、コロニーをランダムに選び各コロニーからプラスミドを精製し、プラスミド上の遺伝子断片の塩基配列を決定した。その結果、5’末端部分がpE06由来、3’末端部分がpE30由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた(図6の6−1)。
Example 2 Preparation of Single Recombinant Hybrid Gene Library The linear gene prepared in Example 1 was introduced into the recBCsbcA mutant JC8679 of E. coli by electroporation. Colonies were grown on a medium containing carbenicillin, colonies were randomly selected, plasmids were purified from each colony, and the base sequences of gene fragments on the plasmids were determined. As a result, a hybrid gene in which the 5 ′ end portion was derived from pE06 and the 3 ′ end portion was derived from pE30 was formed (6-1 in FIG. 6).

そこで、カルベニシリンを含む培地で増殖したこれら形質転換された菌からプラスミドを調製し、一回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーpE06/30−1とし、クローンNoとしてE06/30−1−14などとした枝番号を付与した。   Therefore, a plasmid was prepared from these transformed bacteria grown on a medium containing carbenicillin, and it was designated as a single recombinant hybrid gene library pE06 / 30-1 and a clone No. such as E06 / 30-1-14. Was granted.

実施例3 二回目の組換えのための直鎖状抗体遺伝子の調製
ハイブリッド遺伝子ライブラリーpE06/30−1をXhoIとNheIで切断し、精製後shrimp alkaline phosphatase (SAP)で脱リン酸化し、pE06/30−1(X*/N*)を得た。又ハイブリッド遺伝子ライブラリーpE06/30−1をSfiIで切断、精製後SAPによって脱リン酸化した。さらにNheIで切断し、pE06/30−1(S*/N)を得た。これと上記のpE06/30−1(X*/N*)を混ぜ合わせ、T4 ligaseによって連結反応を行った。反応後、全量をアガロースゲル電気泳動に供し、5.7kbの大きさの断片をゲルから回収し、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製を行った。
Example 3 Preparation of Linear Antibody Gene for Second Recombination Hybrid gene library pE06 / 30-1 was cleaved with XhoI and NheI, purified and dephosphorylated with shrim alkalin phosphatase (SAP), pE06 / 30-1 (X * / N *) was obtained. The hybrid gene library pE06 / 30-1 was cleaved with SfiI, purified and then dephosphorylated with SAP. Cleavage with NheI gave pE06 / 30-1 (S * / N). This was mixed with the above pE06 / 30-1 (X * / N *), and a ligation reaction was performed using T4 ligase. After the reaction, the entire amount was subjected to agarose gel electrophoresis, and a 5.7 kb fragment was recovered from the gel and purified by phenol extraction and ethanol precipitation.

実施例4 二回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーの作製
実施例3で調製した直鎖状遺伝子を、大腸菌のrecBCsbcA変異株JC8679株にエレクトロポレーションによって導入した。カルベニシリンを含んだ培地上でコロニーを増殖させ、コロニーをランダムに選び各コロニーからプラスミドを精製し、プラスミド上の遺伝子断片の塩基配列を決定した。
Example 4 Preparation of Double Recombinant Hybrid Gene Library The linear gene prepared in Example 3 was introduced into the recBCsbcA mutant JC8679 of E. coli by electroporation. Colonies were grown on a medium containing carbenicillin, colonies were randomly selected, plasmids were purified from each colony, and the base sequences of gene fragments on the plasmids were determined.

その結果、5’末端部分がpE06に由来し、続いてpE30に由来した部分、続いてpE06に由来した部分からなり、3’末端部分がpE30に由来したハイブリッドからなる遺伝子、及び5‘末端部分がpE06由来、3’末端部分がpE30由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた(図6の6−2)。   As a result, a gene having a 5 ′ end portion derived from pE06, followed by a portion derived from pE30, followed by a portion derived from pE06, a 3 ′ end portion comprising a hybrid derived from pE30, and a 5 ′ end portion A hybrid gene derived from pE06 and having a 3'-terminal portion derived from pE30 was formed (6-2 in FIG. 6).

そこで、カルベニシリンを含む培地で増殖したこれら形質転換された菌からプラスミドを調製し、二回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーpE06/30−2とし、クローンNoとしてE06/30−2−4などとした枝番号を付与した。   Therefore, a plasmid was prepared from these transformed bacteria grown in a medium containing carbenicillin, and it was designated as a twice-recombinant hybrid gene library pE06 / 30-2, with a clone number such as E06 / 30-2-4. Was granted.

実施例5 三回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーの作製
同様に、三回目の相同組換えを二回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーpEpE06/30−2を用いて一回目及び二回目の相同組換えと同様に行った。その結果、二回目とは異なった5’末端部分がpE06に由来し、続いてpE30に由来した部分、続いてpE06に由来した部分からなり、3’末端部分がpE30に由来したハイブリッドからなる遺伝子、及び5‘末端部分がpE06由来、3’末端部分がpE30由来のハイブリッド遺伝子が形成されていた(図6の6−3)。
Example 5 Production of Third Recombination Hybrid Gene Library Similarly, the third homologous recombination was performed in the same manner as the first and second homologous recombination using the second recombination hybrid gene library pEpE06 / 30-2. It was. As a result, the 5 ′ end portion different from the second one is derived from pE06, followed by a portion derived from pE30, followed by a portion derived from pE06, and a 3 ′ end portion comprising a hybrid derived from pE30. And a hybrid gene in which the 5 ′ end portion was derived from pE06 and the 3 ′ end portion was derived from pE30 (6-3 in FIG. 6).

そこで、カルベニシリンを含む培地で増殖したこれら形質転換された菌からプラスミドを調製し、三回組み換えハイブリッド遺伝子ライブラリーpE06/30−3とし、クローンNoとしてE06/30−3−33などとした枝番号を付与した。   Therefore, a plasmid was prepared from these transformed bacteria grown in a medium containing carbenicillin, and the three-fold recombinant hybrid gene library pE06 / 30-3 was used, and the branch number such as E06 / 30-3-33 was used as the clone No. Was granted.

請求項1に記載の方法の概要を示し、1回目の組換えに関する方法を示す図であり、図1中、Aは、第一のポリヌクレオチドの5’末端あるいはそれより上流の遺伝子を切断する制限酵素、Bは、第一のポリヌクレオチドの3’末端あるいはそれより下流の遺伝子を切断する制限酵素、Cは、第二のポリヌクレオチドの5’末端側あるいはそれより上流の遺伝子を切断する制限酵素、Dは、第二のポリヌクレオチドの3’末端側あるいはそれより下流の遺伝子を切断する制限酵素を示し、星印(*)は脱リン酸化部位を、白抜きの四角は第一のポリヌクレオチドを、黒抜きの四角は第二のポリヌクレオチドを示す。It is a figure which shows the outline | summary of the method of Claim 1, and is a figure which shows the method regarding the recombination of the 1st time. In FIG. Restriction enzyme, B is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 3 ′ end of the first polynucleotide or downstream thereof, and C is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 5 ′ end of the second polynucleotide or upstream thereof. Enzyme D is a restriction enzyme that cleaves the gene at the 3 ′ end of the second polynucleotide or downstream thereof, an asterisk (*) indicates a dephosphorylation site, and a white square indicates the first poly-nucleotide. Nucleotides, black squares indicate the second polynucleotide. 請求項1に記載の方法の概要を示し、2回目の組換えに関する方法を示す図であり、図2中、A、B、C、D、星印(*)、白抜きの四角、黒抜きの四角は図1と同様である。It is a figure which shows the outline | summary of the method of Claim 1, and is a figure which shows the method regarding the 2nd recombination, A, B, C, D, a star (*), a white square, a black square in FIG. These squares are the same as those in FIG. 請求項2に記載の方法の概要を示し、1回目の組換えに関する方法を示す図であり、図3中、Eは、第一のポリヌクレオチドの5’末端側あるいはそれより上流の遺伝子を切断する制限酵素、H、は第一のポリヌクレオチドの3’末端側あるいはそれより下流の遺伝子を切断する制限酵素、Pは、第二のポリヌクレオチドの3’末端側あるいはそれより下流の遺伝子を切断し且つ制限酵素Hよりも第二のポリヌクレオチドに近い部分を切断する制限酵素を示し、星印(*)は脱リン酸化部位を、白抜きの四角は第一のポリヌクレオチドを、黒抜きの四角は第二のポリヌクレオチドを示す。It is a figure which shows the outline | summary of the method of Claim 2, and is a figure which shows the method regarding 1st recombination, and E cuts the gene of the 5 'terminal side of a 1st polynucleotide, or its upstream from FIG. Restriction enzyme, H, which cleaves the gene at the 3 ′ end of the first polynucleotide or downstream thereof, P, cleaves the gene at the 3 ′ end of the second polynucleotide, or downstream thereof And a restriction enzyme that cleaves the portion closer to the second polynucleotide than the restriction enzyme H, the asterisk (*) indicates the dephosphorylation site, the open square indicates the first polynucleotide, Squares indicate the second polynucleotide. 請求項2に記載の方法の概要を示し、2回目の組換えに関する方法を示す図であり、図4中、E、H、P、星印(*)、白抜きの四角、黒抜きの四角は図3と同様である。It is a figure which shows the outline | summary of the method of Claim 2, and is a figure which shows the method regarding the 2nd recombination, and is E, H, P, an asterisk (*), a white square, a black square in FIG. Is the same as FIG. 本発明の請求項2の方法の一部を変更した方法の概要を示し、1回目の組換えに関する方法を示す図であり、E、H、P、星印(*)、白抜きの四角、黒抜きの四角は図3と同様である。The outline of the method which changed a part of method of Claim 2 of this invention is shown, It is a figure which shows the method regarding recombination of the 1st time, E, H, P, an asterisk (*), an open square, The black squares are the same as in FIG. 実施例1から5で得られたpE06とpE30のハイブリッド遺伝子の構造であり、各四角いは組換え前あるいは組換え後の遺伝子を示し、白抜きの四角は抗体遺伝子E06由来のポリヌクレオチドを、黒抜きの四角は抗体遺伝子E30由来のポリヌクレオチドを示し、横軸は、遺伝子の長さを示す。FIG. 4 shows the structure of the hybrid gene of pE06 and pE30 obtained in Examples 1 to 5, each square indicates a gene before or after recombination, and the open square indicates a polynucleotide derived from the antibody gene E06, which is black. Open squares indicate the polynucleotide derived from the antibody gene E30, and the horizontal axis indicates the length of the gene.

Claims (2)

以下の(1)〜(8)の工程を含むことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法、
(1)異なる制限酵素で両末端が切断され、且つ3’末端が脱リン酸化されている第一のポリヌクレオチドを作製する工程、
(2)異なる制限酵素で両末端が切断され、且つ5’末端が脱リン酸化されている、第一のポリヌクレオチドと相同な配列を持つ第二のポリヌクレオチドを作製する工程、
(3)任意のベクターを、第一のポリヌクレオチドの5’末端を切断した制限酵素及び第二のポリヌクレオチドの3’末端を切断した制限酵素と接触させ切断する工程、
(4)工程(3)で作製した直鎖状ベクターの両末端を脱リン酸化する工程
(5)工程(4)で作製した両末端が脱リン酸化された直鎖状ベクターと、工程(1)で作製した第一のポリヌクレオチド及び工程(2)で作製した第二のポリヌクレオチドを接触させ、それぞれ同じ制限酵素での切断末端を介して、前記直鎖状ベクターの3’末端に第一のポリヌクレオチドを、前記直鎖状ベクターの5’末端に第二のポリヌクレオチドを連結させ、直鎖状分子を作製する工程、
(6)工程(5)で作製した直鎖状分子を、相同組換え能を持つ微生物に導入し、前記直鎖状分子内の第一及び第二のポリヌクレオチド上に存在する相同な配列を持つ部分で相同組換えを起こすことにより、前記直鎖状分子が環状化した微生物を選抜する工程、
(7)工程(6)で選抜した微生物からハイブリッドポリヌクレオチドを含むベクターを採取する工程、
(8)工程(7)で採取したポリヌクレオチドを、第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドとし、(1)〜(7)の工程を2回以上繰り返し、その繰り返し工程において、2回目以降の第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチド共にその5’末端が、前回組換えに用いた第一のポリヌクレオチドあるいは第二のポリヌクレオチドのどちらか一方に由来するポリヌクレオチドのみを組換えに用いる工程。
A method for producing a hybrid polynucleotide, comprising the following steps (1) to (8):
(1) producing a first polynucleotide in which both ends are cleaved with different restriction enzymes and the 3 ′ end is dephosphorylated;
(2) producing a second polynucleotide having a sequence homologous to the first polynucleotide, wherein both ends are cleaved with different restriction enzymes and the 5 ′ end is dephosphorylated;
(3) contacting any vector with a restriction enzyme cleaved at the 5 ′ end of the first polynucleotide and a restriction enzyme cleaved at the 3 ′ end of the second polynucleotide to cleave the vector;
(4) Step of dephosphorylating both ends of the linear vector prepared in step (3) (5) Linear vector dephosphorylated at both ends prepared in step (4) and step (1 ) And the second polynucleotide prepared in the step (2) are brought into contact with each other, and the first polynucleotide is put on the 3 ′ end of the linear vector through the same restriction enzyme. Linking a second polynucleotide to the 5 ′ end of the linear vector to produce a linear molecule,
(6) The linear molecule produced in step (5) is introduced into a microorganism having homologous recombination ability, and homologous sequences existing on the first and second polynucleotides in the linear molecule are introduced. A step of selecting a microorganism in which the linear molecule has been circulated by causing homologous recombination at a portion thereof,
(7) A step of collecting a vector containing a hybrid polynucleotide from the microorganism selected in step (6),
(8) The polynucleotides collected in step (7) are used as the first polynucleotide and the second polynucleotide, and steps (1) to (7) are repeated twice or more. In both the first polynucleotide and the second polynucleotide of the present invention, the 5 ′ end is used to recombine only the polynucleotide derived from either the first polynucleotide or the second polynucleotide used in the previous recombination. Step to use.
以下の(1)〜(6)の工程を含むことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法、
(1)異なる制限酵素で両末端が切断された(a)5’末端及び3’末端の両方が脱リン酸化されているか、又は(b)5’末端のみが脱リン酸化されているか、又は(c)3’末端のみが脱リン酸化されている第一のポリヌクレオチドを作製する工程、
(2)(a)第一のポリヌクレオチドの5’末端及び3’末端の両方が脱リン酸化されている場合には、第一のポリヌクレオチドと相同な配列を持つ第二のポリヌクレオチドを3’末端側に含み、5’末端が第一のポリヌクレオチドの3’末端を切断した制限酵素による切断末端で、3’末端が他の制限酵素による切断末端であり、且つ3’末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクター、又は第一のポリヌクレオチドと相同な配列を持つ第二のポリヌクレオチドを5’末端側に含み、5’末端がある制限酵素による切断末端で、3’末端が第一のポリヌクレオチドの5’末端を切断した制限酵素による切断末端であり、且つ5’末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクターを作製し、(b)第一のポリヌクレオチドの5’末端のみが脱リン酸化されている場合には、第二のポリヌクレオチドを3’末端側に含み、その5’末端が第一のポリヌクレオチドの3’末端を切断した制限酵素による切断末端で3’末端が他の制限酵素による切断末端であり、両末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクターを作製し、(c)第一のポリヌクレオチドの3’末端のみが脱リン酸化されている場合には、第二のポリヌクレオチドを5’末端側に含み、5’末端が他の制限酵素による切断末端で3’末端が第一のポリヌクレオチドの5’末端を切断した制限酵素による切断末端であり、両末端が脱リン酸化されている直鎖状ベクターを作製する工程、
(3)工程(2)で作製した直鎖状ベクターと、第一のポリヌクレオチドを混合し、それぞれ同じ制限酵素での切断末端を介して連結させ、直鎖状分子を作製する工程、
(4)工程(3)で作製した直鎖状分子を、相同組換え能を持つ微生物に導入し、前記直鎖状分子内の第一及び第二のポリヌクレオチド上に存在する相同な配列を持つ部分で相同組換えを起こすことにより、前記直鎖状分子が環状化した微生物を選抜する工程
(5)工程(4)で選抜した微生物からハイブリッドポリヌクレオチドを含むベクターを採取する工程。
(6)工程(5)で採取したポリヌクレオチドを、第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドとし、(1)〜(5)の工程を2回以上繰り返し、その繰り返し工程において、2回目以降の第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチド共にその5’末端が、前回組換えに用いた第一のポリヌクレオチドあるいは第二のポリヌクレオチドのどちらか一方に由来するポリヌクレオチドのみを組換えに用いる工程。
A method for producing a hybrid polynucleotide, comprising the following steps (1) to (6):
(1) both ends cleaved with different restriction enzymes (a) both the 5 ′ end and 3 ′ end are dephosphorylated, or (b) only the 5 ′ end is dephosphorylated, or (C) producing a first polynucleotide in which only the 3 ′ end is dephosphorylated,
(2) (a) When both the 5 ′ end and 3 ′ end of the first polynucleotide are dephosphorylated, the second polynucleotide having a sequence homologous to the first polynucleotide is changed to 3 Included on the end side, 5 ′ end is a cleavage end by a restriction enzyme cleaved from the 3 ′ end of the first polynucleotide, 3 ′ end is a cleavage end by another restriction enzyme, and 3 ′ end is dephosphorylated A linear vector that has been oxidized, or a second polynucleotide having a sequence homologous to the first polynucleotide at the 5 ′ end, and a cleavage end by a restriction enzyme having a 5 ′ end, and the 3 ′ end A linear vector having a restriction endonuclease cleaved at the 5 ′ end of the first polynucleotide and dephosphorylated at the 5 ′ end is prepared; (b) 5 ′ of the first polynucleotide When only the end is dephosphorylated Contains the second polynucleotide at the 3 ′ end, the 5 ′ end is the restriction end cut by the restriction enzyme that cuts the 3 ′ end of the first polynucleotide, and the 3 ′ end is the end cut by the other restriction enzyme. A linear vector in which both ends are dephosphorylated, and (c) when only the 3 ′ end of the first polynucleotide is dephosphorylated, The 'end side contains 5' end, the 3 'end is a restriction endonuclease cleaved by the restriction endonuclease that cleaves the 5' end of the first polynucleotide, and both ends are dephosphorylated. Producing a linear vector,
(3) a step of preparing a linear molecule by mixing the linear vector prepared in step (2) and the first polynucleotide and ligating each through a cleavage end with the same restriction enzyme,
(4) The linear molecule produced in step (3) is introduced into a microorganism having homologous recombination ability, and the homologous sequences present on the first and second polynucleotides in the linear molecule are A step of selecting a microorganism in which the linear molecule has been circulated by causing homologous recombination at a portion possessed, and a step of collecting a vector containing a hybrid polynucleotide from the microorganism selected in step (4).
(6) The polynucleotide collected in step (5) is used as the first polynucleotide and the second polynucleotide, and the steps (1) to (5) are repeated twice or more. In both the first polynucleotide and the second polynucleotide of the present invention, the 5 ′ end is used to recombine only the polynucleotide derived from either the first polynucleotide or the second polynucleotide used in the previous recombination. Step to use.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588101A (en) * 2018-04-27 2018-09-28 四川大学 Build the molecular cloning method of same gene difference expression vector

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