JP2009124982A - Method for concentrating fat-derived cell, and transplanting material - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、脂肪由来細胞の濃縮方法および移植材に関するものである。 The present invention relates to a method for concentrating fat-derived cells and a transplant material.
従来、脂肪由来細胞は、細胞治療の細胞ソースとして注目されている。脂肪由来細胞には複数の細胞集団が存在することが知られている（例えば、特許文献１参照。）。 Conventionally, adipose-derived cells have attracted attention as a cell source for cell therapy. It is known that a plurality of cell populations exist in fat-derived cells (see, for example, Patent Document 1).
しかしながら、脂肪由来細胞に含まれるどの細胞集団に治療効果が備わっているのかについては、はっきりしたメカニズムが解明されていない。このため、脂肪組織から分離した脂肪由来細胞によって所望の効果を得られない場合も発生する。 However, no clear mechanism has been elucidated as to which cell population contained in adipose-derived cells has a therapeutic effect. For this reason, the case where a desired effect is not acquired by the fat origin cell isolate | separated from the fat tissue also generate | occur | produces.
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、脂肪組織から分離した脂肪由来細胞のうち接着能および増殖能の高い細胞を分取して移植することによって、治療効果の高い移植を行うことができる脂肪由来細胞の濃縮方法および移植材を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of such circumstances, and has a high therapeutic effect by sorting and transplanting cells with high adhesion ability and proliferation ability among adipose-derived cells separated from adipose tissue. It is an object of the present invention to provide a method for concentrating adipose-derived cells that can be transplanted and a transplant material.
上記課題を解決するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、脂肪組織から単離された脂肪由来細胞に対して、表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１の発現を測定し、測定された前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１が、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現しているか否かを判定し、前記ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している脂肪由来細胞を分取する脂肪由来細胞の濃縮方法を提供する。
In order to solve the above problems, the present invention provides the following means.
The present invention measures the expression of surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271 on adipose-derived cells isolated from adipose tissue, and the measured surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271 are: CD31 -, CD34 +, CD45 - and CD271 + expression in combination with that it is judged whether or not the to of the CD31 -, CD34 +, CD45 - and to retrieve the adipose-derived cells expressing a combination of CD271 + min A method for concentrating adipose-derived cells is provided.
発明者らは表面抗原マーカーＣＤ３１（抗原：Plate Endothelial Cell Adhesion Molecule-1）、ＣＤ３４（抗原：分子量約１１０ｋDａの単鎖膜貫通型リン酸化糖タンパク）、ＣＤ４５（抗原：白血球共通抗原）およびＣＤ２７１（抗原：Nerve growth factor receptor）を用いて、脂肪由来細胞について各表面抗原マーカーの発現を測定し、表面抗原マーカーＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−およびＣＤ２７１＋で分画される細胞群は接着能が高く、増殖能も高いことを見出した。
本発明によれば、接着能および増殖能が高い細胞群を分取して濃縮することにより、脂肪組織から分離した脂肪由来細胞のうち接着能および増殖能の高い細胞を分取して移植するという治療効果の高い移植を行うことができる。つまり、脂肪組織に含まれている様々な細胞の中から、目的とする治療効果の高い細胞を選択して移植するので、その治療効果を高めることができる。
The inventors have surface antigen markers CD31 (antigen: Plate Endothelial Cell Adhesion Molecule-1), CD34 (antigen: a single-chain transmembrane phosphorylated glycoprotein having a molecular weight of about 110 kDa), CD45 (antigen: leukocyte common antigen) and CD271 ( Using an antigen: Nerve growth factor receptor, the expression of each surface antigen marker is measured for adipose-derived cells, and the cell group fractionated by the surface antigen markers CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + has an adhesive ability. It was found to be high and proliferate.
According to the present invention, by collecting and concentrating a group of cells having high adhesive ability and proliferating ability, cells having high adhesive ability and proliferating ability among the adipose-derived cells separated from adipose tissue are fractionated and transplanted. It is possible to perform transplantation with a high therapeutic effect. That is, since a target cell having a high therapeutic effect is selected from various cells contained in the adipose tissue and transplanted, the therapeutic effect can be enhanced.
上記発明においては、前記細胞の分取がフローサイトメトリによって行われることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記細胞の分取が抗体で標識した磁気ビーズを用いて行われることとしてもよい。
本発明は、前記濃縮方法によって濃縮された脂肪由来細胞を含む移植材を提供する。
In the above invention, the cell sorting may be performed by flow cytometry.
In the above invention, the sorting of the cells may be performed using magnetic beads labeled with an antibody.
The present invention provides a transplant containing fat-derived cells concentrated by the concentration method.
本発明によれば、脂肪組織から分離した脂肪由来細胞のうち接着能および増殖能の高い細胞を分取して移植することによって、治療効果の高い移植を行うことができるという効果を奏する。 According to the present invention, it is possible to perform transplantation with a high therapeutic effect by sorting and transplanting cells having high adhesion ability and proliferation ability among adipose-derived cells separated from adipose tissue.
以下に、本発明の実施形態に係る脂肪由来細胞の濃縮方法および移植材について説明する。
本発明の第１の実施形態に係る脂肪由来細胞の濃縮方法は、例えば、脂肪組織から単離された前記脂肪由来細胞について、接着能および増殖能の高い細胞をフローサイトメトリにより分取する脂肪由来細胞の濃縮方法である。この濃縮方法は、脂肪組織から単離された脂肪由来細胞に対して、表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１の発現を測定し、測定された前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１が、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現しているか否かを判定し、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している脂肪由来細胞を分取することによって行われる。
Below, the concentration method and transplant material of the fat origin cell which concern on embodiment of this invention are demonstrated.
The method for concentrating adipose-derived cells according to the first embodiment of the present invention includes, for example, a method of sorting cells having high adhesion ability and proliferation ability by flow cytometry with respect to the adipose-derived cells isolated from adipose tissue. This is a method for concentrating derived cells. This concentration method measures the expression of surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271 on adipose-derived cells isolated from adipose tissue, and the measured surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271 are , CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + are determined to determine whether they are expressed, and adipose-derived cells expressed by the combination of CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + are fractionated Is done by.
つまり、細胞の膜表面で発現している前記表面抗原ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１に対する抗体（細胞表面マーカー）であって、予め蛍光色素等で標識されているＣＤ３１抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ４５抗体およびＣＤ２７１抗体が、前記表面抗原を発現している細胞の膜表面にそれぞれ結合される。これらの抗体が結合されている細胞に、フローサイトメータ等から発せられた励起光が照射されると、前記抗体が結合している細胞から蛍光が発せられる。この蛍光を測定することにより前記表面抗原マーカーの発現を確認することができる。 That is, antibodies (cell surface markers) against the surface antigens CD31, CD34, CD45 and CD271 expressed on the cell membrane surface, which are previously labeled with a fluorescent dye or the like, CD31 antibody, CD34 antibody, CD45 antibody and CD271 antibodies are each bound to the membrane surface of cells expressing the surface antigen. When cells to which these antibodies are bound are irradiated with excitation light emitted from a flow cytometer or the like, fluorescence is emitted from the cells to which the antibodies are bound. By measuring this fluorescence, the expression of the surface antigen marker can be confirmed.
前記蛍光色素は、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＰＥ−Ｃｙ７（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙａｎｉｎ７）またはＡＰＣ−Ｃｙ７（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ−Ｃｙａｎｉｎ７）等を使用する。前記ＣＤ３１抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ４５抗体およびＣＤ２７１抗体がそれぞれ異なる前記蛍光色素で標識されている場合は、前記蛍光色素の種類によって放出される波長が異なるため、同時に複数の前記表面抗原マーカーの発現を測定することができる。 As the fluorescent dye, APC (Allophycocyanin), PE (Phycoerythrin), PE-Cy7 (Phycoerythrin-Cyanin7), APC-Cy7 (Allophycocyanin-Cyanin7), or the like is used. When the CD31 antibody, the CD34 antibody, the CD45 antibody and the CD271 antibody are labeled with different fluorescent dyes, the emitted wavelength differs depending on the type of the fluorescent dye. Can be measured.
測定された前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１が、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現しているか否かの判定を行う際、前記表面抗原マーカーが発現していない状態を測定しておく。つまり、ＩｇＧ等のアイソタイプコントロール（ネガティブコントロール）を用いて自家蛍光等の非特異的な反応による影響を測定し、ネガティブ（−）の状態を確認する。次に、前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１を用いた測定を行い、ネガティブ（−）の状態をもとにポジティブ（＋）であるか否かを判断する。ネガティブ（−）の状態から変動が生じて蛍光強度が高くなった場合はポジティブ（＋）であるといえる。例えば、ＣＤ３１についてポジティブである細胞はＣＤ３１＋、ネガティブである細胞はＣＤ３１−と表記する。このようにして各前記表面抗原マーカーの発現について判断を行い、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している細胞群を特定する。 When determining whether or not the measured surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271 are expressed by a combination of CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + , the surface antigen marker is expressed. Measure the state that is not. That is, the influence of nonspecific reactions such as autofluorescence is measured using an isotype control (negative control) such as IgG, and the negative (-) state is confirmed. Next, measurement using the surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271 is performed, and it is determined whether or not it is positive (+) based on the negative (−) state. It can be said that it is positive (+) when fluctuation occurs from the negative (-) state and the fluorescence intensity becomes high. For example, a cell positive for CD31 is expressed as CD31 + , and a cell negative is expressed as CD31 − . In this way, the expression of each surface antigen marker is determined, and a cell group expressed by a combination of CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + is specified.
特定されたＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している細胞群の分取については、例えば、まず上から下に前記脂肪由来細胞を含む分取用サンプルを流し、一定の振動を加えることによってサンプル液が細胞１個を含む程度の小さな液滴となるようにする。次に上記判断によって特定されたＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している細胞を含む液滴のみをプラスまたはマイナスに荷電し、プラスに荷電した場合は液滴がマイナス極板側に、マイナスに荷電した場合は液滴がプラス極板側に引かれることによって分取が行われる。荷電されていない液滴は極板に引かれることなく垂直に落下するため、荷電された液滴に含まれた目的とする細胞のみを収集することができる。このようにして治療効果の高い細胞を濃縮することができる。 Regarding the sorting of the cell group expressed by the identified combination of CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + , for example, first, a sample for sorting containing the adipose-derived cells is flowed from the top to the bottom. In this way, the sample liquid is made to be a small droplet containing one cell. Next, only droplets containing cells expressed by the combination of CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + specified by the above judgment are charged positively or negatively, and when charged positively, the droplets are negatively charged. When negatively charged on the electrode plate side, the liquid droplets are drawn to the positive electrode plate side, so that sorting is performed. Since the uncharged droplets fall vertically without being pulled by the electrode plate, only target cells contained in the charged droplets can be collected. In this way, cells having a high therapeutic effect can be concentrated.
本発明の第２の実施形態に係る脂肪由来細胞の濃縮方法は、例えば、脂肪組織から単離された前記脂肪由来細胞について、接着能および増殖能の高い細胞を抗体で標識した磁気ビーズを用いて分取する脂肪由来細胞の濃縮方法である。
この濃縮方法は、例えば、ＣＤ３１抗体で標識された磁気ビーズと前記脂肪由来細胞とを混合し、前記ＣＤ３１抗体で標識された磁気ビーズと結合したＣＤ３１抗原を発現している細胞のみを磁力で引き寄せておき、残りの細胞を回収することによりＣＤ３１−の細胞を分取する。次に回収されたＣＤ３１−の細胞群について、ＣＤ４５抗体で標識された磁気ビーズと結合したＣＤ４５抗原を発現している細胞のみを磁力で引き寄せておき、残りの細胞を回収することによりＣＤ３１−かつＣＤ４５−の細胞が分取されたこととなる。
The method for concentrating adipose-derived cells according to the second embodiment of the present invention uses, for example, magnetic beads obtained by labeling cells with high adhesion ability and proliferation ability with antibodies for the adipose-derived cells isolated from adipose tissue. This is a method for concentrating fat-derived cells to be collected.
In this concentration method, for example, magnetic beads labeled with a CD31 antibody and the fat-derived cells are mixed, and only cells expressing CD31 antigen bound to the magnetic beads labeled with the CD31 antibody are attracted by a magnetic force. Then, by collecting the remaining cells, the CD31 − cells are collected. Next, with respect to the collected CD31 − cell group, only the cells expressing the CD45 antigen bound to the magnetic beads labeled with the CD45 antibody are attracted by a magnetic force, and the remaining cells are recovered to recover the CD31 − and CD45 − cells were sorted.
次に回収されたＣＤ３１−かつＣＤ４５−の細胞群についてＣＤ３４抗体で標識された磁気ビーズと結合したＣＤ３４抗原を発現している細胞のみを磁力で引き寄せておき、引き寄せられなかった細胞を取り除くことによってＣＤ３１−、ＣＤ４５−かつＣＤ３４＋の細胞が分取されたこととなる。続いて回収されたＣＤ３１−、ＣＤ４５−かつＣＤ３４＋の細胞群についてＣＤ２７１抗体で標識された磁気ビーズと結合したＣＤ２７１抗原を発現している細胞のみを磁力で引き寄せておき、引き寄せられなかった細胞を取り除くことによってＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の細胞が分取されたこととなる。
このようにして、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している細胞群を特定して分取し、治療効果の高い細胞を濃縮することができる。
Next, only the cells expressing the CD34 antigen bound to the magnetic beads labeled with the CD34 antibody in the collected CD31 − and CD45 − cell groups are attracted by magnetic force, and the cells that have not been attracted are removed. CD31 − , CD45 − and CD34 + cells were sorted. Subsequently, with respect to the collected CD31 − , CD45 − and CD34 + cell groups, only cells expressing the CD271 antigen bound to the magnetic beads labeled with the CD271 antibody were attracted by magnetic force, and the cells that were not attracted were collected. By removing the cells, CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + cells were sorted.
In this manner, a cell group expressed by a combination of CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + can be identified and sorted, and cells having a high therapeutic effect can be concentrated.
本発明の第３の実施形態に係る脂肪由来細胞の移植材は、例えば、脂肪組織から単離された前記脂肪由来細胞のうち、前記表面抗原マーカーの発現によって特定された接着能および増殖能の高い細胞を分取して濃縮した脂肪由来細胞を含む移植材である。前記移植材は、濃縮した細胞以外にサイトカイン等の治療効果を高める成分を含んでいてもよい。
目的とする細胞の分取方法については、第１の実施形態と同様に前記フローサイトメトリによる分取方法であってもよく、また、第２の実施形態と同様に前記抗体で標識した磁気ビーズを用いた分取方法であってもよい。
The transplant material for adipose-derived cells according to the third embodiment of the present invention has, for example, the adhesion ability and the proliferation ability specified by the expression of the surface antigen marker among the adipose-derived cells isolated from adipose tissue. It is a transplant containing fat-derived cells obtained by sorting and concentrating high cells. The transplant material may contain components that enhance the therapeutic effect such as cytokines in addition to the concentrated cells.
The target cell sorting method may be the flow cytometry sorting method as in the first embodiment, or the magnetic beads labeled with the antibody as in the second embodiment. It may be a sorting method using.
発明者らは表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１を用いて、脂肪由来細胞についてこれらの表面抗原マーカーの発現を測定し、表面抗原マーカーＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋で分画される細胞群は、他の分画と比較して生着能が高い細胞群であることを見出した。したがって、接着能および増殖能が高い細胞を分取して濃縮することができ、採取された前記脂肪由来細胞中の目的とする細胞の構成比に影響されることなく、治療効果の高い移植を行うことができる。 The inventors measured the expression of these surface antigen markers on adipose-derived cells using surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271, and fractionated with surface antigen markers CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 +. It was found that the cell group to be treated is a cell group having higher engraftment ability than other fractions. Therefore, it is possible to sort and concentrate cells having high adhesive ability and proliferative ability, and to perform transplantation with high therapeutic effect without being affected by the composition ratio of the target cells in the collected fat-derived cells. It can be carried out.
次に、第１の実施形態の脂肪由来細胞の濃縮方法に係る、細胞を判定する方法の一実施例について、図１から図４を参照して説明する。
脂肪由来細胞は、コラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素を用いて脂肪組織から単離される。このようにして単離された脂肪由来細胞とＣＤ３１抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ４５抗体およびＣＤ２７１抗体を混合し、反応させた測定用試料ＳＡを用意する。この測定用試料ＳＡとは別に、単離された脂肪由来細胞とＩｇＧ等のアイソタイプコントロールを混合したコントロール試料ＳＢを、抗体に標識されている蛍光色素の種類に応じて用意する。
Next, an example of a method for determining cells according to the method for concentrating fat-derived cells of the first embodiment will be described with reference to FIGS.
Adipose-derived cells are isolated from adipose tissue using proteolytic enzymes such as collagenase. A sample SA for measurement is prepared by mixing the fat-derived cells thus isolated with the CD31 antibody, CD34 antibody, CD45 antibody and CD271 antibody and reacting them. Apart from this measurement sample SA, a control sample SB in which isolated fat-derived cells and an isotype control such as IgG are mixed is prepared according to the type of fluorescent dye labeled with the antibody.
図１は、表面抗原マーカーＣＤ３１およびＣＤ４５の発現および細胞群の分画を示すドットプロット（２パラメータヒストグラム）である。縦軸は表面抗原マーカーＣＤ３１の蛍光強度、横軸は表面抗原マーカーＣＤ４５の蛍光強度をそれぞれ表している。 FIG. 1 is a dot plot (two parameter histogram) showing expression of surface antigen markers CD31 and CD45 and fractionation of cell populations. The vertical axis represents the fluorescence intensity of the surface antigen marker CD31, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity of the surface antigen marker CD45.
まず、表面抗原マーカーＣＤ３１用のコントロール試料ＳＢ３１および表面抗原マーカーＣＤ４５用のコントロール試料ＳＢ４５を測定し、自家蛍光等の非特異的反応による影響を確認する。このコントロール試料ＳＢ３１の測定結果をＣＤ３１−（ネガティブ）の状態とし、図１のヒストグラムについてＣＤ３１−（ネガティブ）とＣＤ３１＋（ポジティブ）との境界線Ｋ１を決定する。同様にしてコントロール試料ＳＢ４５を測定し、ＣＤ４５−とＣＤ４５＋との境界線Ｋ２を決定する。これらの前記境界線Ｋ１およびＫ２をもとにＣＤ３１−かつＣＤ４５−である細胞分画をＰ１、ＣＤ３１＋かつＣＤ４５−である細胞分画をＰ２、ＣＤ３１−かつＣＤ４５＋である細胞分画をＰ３、ＣＤ３１＋かつＣＤ４５＋である細胞分画をＰ４とした。 First, the control sample SB31 for the surface antigen marker CD31 and the control sample SB45 for the surface antigen marker CD45 are measured, and the influence of nonspecific reaction such as autofluorescence is confirmed. The measurement result of the control sample SB31 is set to a CD31 − (negative) state, and a boundary line K1 between CD31 − (negative) and CD31 + (positive) is determined for the histogram of FIG. Measuring a control sample SB45 similarly, CD45 - determining the boundary line K2 of the CD45 +. Based on these boundary lines K1 and K2, the cell fraction that is CD31 − and CD45 − is P1, the cell fraction that is CD31 + and CD45 − is P2, and the cell fraction that is CD31 − and CD45 + is P3. The cell fraction that is CD31 + and CD45 + was designated P4.
測定用試料ＳＡを測定し、前記細胞分画Ｐ１からＰ４をもとに細胞群Ｆの発現を特定した。現れた細胞群Ｆは、ＣＤ３１−かつＣＤ４５−である細胞群Ｆ１、ＣＤ３１＋かつＣＤ４５−である細胞群Ｆ２、ＣＤ３１＋＋かつＣＤ４５−である細胞群Ｆ３、ＣＤ３１＋またはＣＤ３１−かつＣＤ４５＋である細胞群Ｆ４の４群であった。 The measurement sample SA was measured, and the expression of the cell group F was specified based on the cell fractions P1 to P4. Appeared cell unit F, CD31 - and CD45 - F3, CD31 + or CD31 group cells is - - and a CD45 + is cell group F2, CD31 ++ and CD45 is a - group of cells F1, CD31 + and CD45 is There were 4 groups of cell group F4.
これら４つの細胞群Ｆ１からＦ４を個別に培養すると、図３に示すように、細胞群Ｆ３およびＦ４は接着細胞がみられず、細胞群Ｆ１およびＦ２は接着細胞がみられた。細胞群Ｆ１の細胞のうち１％の細胞が接着、増殖し、細胞群Ｆ２の細胞のうち０．１％以下の細胞が接着し、増殖した。よって、細胞群Ｆ１は他の細胞群Ｆ２からＦ４と比較して最も接着能が高い細胞群であるといえる。 When these four cell groups F1 to F4 were individually cultured, adherent cells were not observed in cell groups F3 and F4, and adherent cells were observed in cell groups F1 and F2. 1% of the cells in the cell group F1 adhered and proliferated, and 0.1% or less of the cells in the cell group F2 adhered and proliferated. Therefore, it can be said that the cell group F1 is a cell group having the highest adhesion ability as compared with the other cell groups F2 to F4.
図２は、ＣＤ３１−かつＣＤ４５−である細胞群Ｆ１について測定された、表面抗原マーカーＣＤ２７１およびＣＤ３４の発現および細胞群の分画を示すドットプロットである。縦軸は表面抗原マーカーＣＤ２７１の蛍光強度、横軸は表面抗原マーカーＣＤ３４の蛍光強度をそれぞれ表している。 FIG. 2 is a dot plot showing the expression of the surface antigen markers CD271 and CD34 and the fractionation of the cell groups measured for the cell group F1 which is CD31 − and CD45 − . The vertical axis represents the fluorescence intensity of the surface antigen marker CD271, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity of the surface antigen marker CD34.
上記の方法と同様にして、表面抗原マーカーＣＤ２７１用のコントロール試料ＳＢ２７１および表面抗原マーカーＣＤ３４用のコントロール試料ＳＢ３４を測定し、自家蛍光等の非特異的反応による影響を確認する。コントロール試料ＳＢ２７１の測定結果をＣＤ２７１−の状態とし、図２のヒストグラムについてＣＤ２７１−とＣＤ２７１＋との境界線Ｋ３を決定する。同様にして表面抗原マーカーＣＤ３４用のコントロール試料ＳＢ３４を測定し、ＣＤ３４−とＣＤ３４＋との境界線Ｋ４を決定する。これらの前記境界線Ｋ３およびＫ４をもとに、ＣＤ２７１−かつＣＤ３４−である細胞分画をＰ５、ＣＤ２７１＋かつＣＤ３４−である細胞分画をＰ６、ＣＤ２７１−かつＣＤ３４＋である細胞分画をＰ７、ＣＤ２７１＋かつＣＤ３４＋である細胞分画をＰ８とした。 In the same manner as described above, the control sample SB271 for the surface antigen marker CD271 and the control sample SB34 for the surface antigen marker CD34 are measured, and the influence of nonspecific reaction such as autofluorescence is confirmed. The state, CD271 on histograms of Figure 2 - - the measurement results of the control samples SB271 CD271 determining boundary K3 of the CD271 + and. Similarly, the control sample SB34 for the surface antigen marker CD34 is measured, and the boundary line K4 between CD34 − and CD34 + is determined. Based on these boundary lines K3 and K4, the cell fraction that is CD271 − and CD34 − is the P5, the cell fraction that is CD271 + and CD34 − is the cell fraction that is P6, CD271 − and CD34 +. The cell fraction that is P7, CD271 + and CD34 + was designated P8.
前記測定用試料ＳＡに含まれる細胞群Ｆ１をさらに解析し、前記細胞分画Ｐ５からＰ８をもとに表面抗原マーカーＣＤ２７１およびＣＤ３４の発現について特定した。前記細胞群Ｆ１は、ＣＤ２７１−かつＣＤ３４−である細胞群Ｆ１−１、ＣＤ２７１＋かつＣＤ３４−である細胞群Ｆ１−２、ＣＤ２７１−かつＣＤ３４＋である細胞群Ｆ１−３、ＣＤ２７１＋かつＣＤ３４＋である細胞群Ｆ１−４の４群であった。 The cell group F1 contained in the measurement sample SA was further analyzed, and the expression of the surface antigen markers CD271 and CD34 was identified based on the cell fractions P5 to P8. The cell group F1 is, CD271 - and CD34 - a is cell group F1-1, CD271 + and CD34 - a is cell group F1-2, CD271 - and CD34 + in which cell group F1-3, CD271 + and CD34 + There were four groups of cell groups F1-4.
前記細胞群Ｆ１から分画されたこれら４つの細胞群Ｆ１−１からＦ１−４を個別に培養すると、図４に示すように、細胞群Ｆ１−１およびＦ１−２は接着細胞がみられず、細胞群Ｆ１−３およびＦ１−４は接着細胞がみられた。細胞群Ｆ１−３の細胞のうち０．５％の細胞が接着、増殖し、細胞群Ｆ１−４の細胞のうち２．５％の細胞が接着し、増殖した。よって細胞群Ｆ１−４は他の細胞群Ｆ１−１からＦ１−３と比較して最も接着能および増殖能が高い細胞群であるといえる。 When these four cell groups F1-1 to F1-4 fractionated from the cell group F1 are individually cultured, as shown in FIG. 4, no adherent cells are observed in the cell groups F1-1 and F1-2. In the cell groups F1-3 and F1-4, adherent cells were observed. 0.5% of the cells in the cell group F1-3 adhered and proliferated, and 2.5% of the cells in the cell group F1-4 adhered and proliferated. Therefore, it can be said that the cell group F1-4 is a cell group having the highest adhesion ability and proliferation ability as compared with the other cell groups F1-1 to F1-3.
接着能および増殖能が高い細胞群Ｆ１−４は、ＣＤ３１−かつＣＤ４５−である細胞群Ｆ１をさらにＣＤ２７１およびＣＤ３４によって分画された、ＣＤ２７１＋かつＣＤ３４＋の発現を示す細胞群である。したがって、このＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋を発現している細胞群を分取することにより、脂肪組織に含まれている様々な細胞の中から目的とする治療効果の高い細胞を濃縮することができるという効果を奏する。
なお、これらの表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１の測定順序は上記実施例に限られず、また、前記表面抗原マーカーを１つずつ４回測定してもよいし、４つを同時に測定することとしてもよい。また、上記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１に加えて、他の表面抗原マーカーを組み合わせて測定してもよいこととする。
Adhesion ability and proliferative capacity is high cell group F1-4 is, CD31 - and CD45 - cells group F1 was further fractionated by CD271 and CD34 is a cell group showing a CD271 + and CD34 + expression. Therefore, by sorting out the cell group expressing CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + , cells having high targeted therapeutic effects can be obtained from various cells contained in adipose tissue. There is an effect that it can be concentrated.
In addition, the measurement order of these surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271 is not limited to the above embodiment, and the surface antigen markers may be measured four times one by one, or four are measured simultaneously. It is good as well. In addition to the surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271, measurement may be performed in combination with other surface antigen markers.
ＳＡ 測定用試料
ＳＢ コントロール試料
Ｋ 境界線
Ｐ 細胞分画
Ｆ 細胞群
SA measurement sample SB control sample K boundary line P cell fraction F cell group
Claims (4)
測定された前記表面抗原マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ２７１が、ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現しているか否かを判定し、
前記ＣＤ３１−、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−かつＣＤ２７１＋の組み合わせで発現している脂肪由来細胞を分取する脂肪由来細胞の濃縮方法。 Measuring the expression of surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271 on adipose-derived cells isolated from adipose tissue;
Determining whether the measured surface antigen markers CD31, CD34, CD45 and CD271 are expressed in a combination of CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + ,
A method for concentrating adipose-derived cells, wherein the adipose-derived cells expressed by a combination of the CD31 − , CD34 + , CD45 − and CD271 + are separated.
A transplant containing fat-derived cells concentrated by the concentration method according to claim 1.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10751246B2 (en) | 2017-12-26 | 2020-08-25 | Sanjeev Kaila | Acoustic shock wave therapeutic methods |
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- 2007-11-22 JP JP2007302609A patent/JP2009124982A/en not_active Withdrawn
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