JP2009124961A - New drug-resistant recombinant selective marker gene of fungus of genus aspergillus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酢酸を炭素源とする培地で、アスペルギルス属に属するカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質や、該タンパク質をコードするカルボキシン耐性マーカー遺伝子等に関する。 The present invention relates to a protein having a function of imparting carboxin resistance to a carboxin-sensitive microorganism belonging to the genus Aspergillus in a medium containing acetic acid as a carbon source, a carboxin resistance marker gene encoding the protein, and the like.
アスペルギルス属は、菌類真菌門に属し、形態的には、無色の分岐した長い菌糸を有することから子のう菌門の糸状菌の一種とされ、有性生殖を行わず無性生殖で無性胞子を作って繁殖する不完全菌類に属する。清酒、味噌、醤油などの発酵食品生産に古くから利用されているアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）といった有益な種がある一方、自然界で最も強力な発ガン性と急性毒性を持つアフラトキシンを産生するアスペルギルス・パラシチカス（Aspergillus parasiticus）などの有害な種も存在する。アスペルギルス・オリゼに関しては、食品生産のための発酵効率向上のための育種のみならず、高いタンパク質分泌生産能力を有することから、組換えタンパク質生産又は各種有用物質生産の宿主として利用され、そのための研究開発も盛んに行われている。他方、アスペルギルス・パラシチカスに関しては、特に熱帯・亜熱帯地域で収穫される穀物に対するアフラトキシンによる汚染が世界的な問題となっており、その制御のための研究が重要視されている。 Aspergillus genus belongs to the fungal fungus family, and is morphologically considered as a type of filamentous fungus of the Ascomycota fungus due to its long, colorless and branched mycelia. It belongs to imperfect fungi that make spores and propagate. While there are beneficial species such as Aspergillus oryzae that have long been used in the production of fermented foods such as sake, miso, and soy sauce, Aspergillus produces the most potent carcinogenic and acutely toxic aflatoxins. There are also harmful species such as Parasiticus (Aspergillus parasiticus). Aspergillus oryzae has high protein secretion production capacity as well as breeding for improving fermentation efficiency for food production, so it can be used as a host for recombinant protein production or various useful substance production. Development is also actively underway. On the other hand, regarding Aspergillus parasites, contamination by aflatoxins on cereals harvested particularly in tropical and subtropical regions has become a global problem, and research for their control is regarded as important.
遺伝子組換え法は、ある生物から取り出した有用な遺伝子を種の壁を越えて他の生物に導入することができるため、宿主生物の改良の範囲を画期的に拡大できるという利点がある。また生体内において遺伝子を操作できるため、遺伝子機能の研究に必須の技術でもある。上述のとおりアスペルギルス属の菌は有性生殖が見い出されておらず、多くの生物と異なり交雑による遺伝子交換ができないので古典的遺伝学が適用できず、変異遺伝子を別の変異株から移すことができない。そのため、アスペルギルス属の菌の遺伝子の改変による育種、又は遺伝子機能研究については特に遺伝子組換え法の適用が有効な手段である。 The gene recombination method has an advantage that the range of improvement of the host organism can be dramatically expanded because a useful gene extracted from one organism can be introduced into another organism across the species barrier. In addition, since the gene can be manipulated in vivo, it is an essential technique for the study of gene function. As mentioned above, Aspergillus bacteria have not found sexual reproduction, and unlike many organisms, genetic exchange by hybridization is not possible, so classical genetics cannot be applied, and mutant genes can be transferred from another mutant strain Can not. Therefore, the genetic recombination method is particularly effective for breeding by gene modification of Aspergillus bacteria or for gene function studies.
遺伝子組換え法による遺伝子導入の効率については、導入処理した細胞のうち数万分の１以下しか導入された遺伝子を保持する組換え細胞になっていないことが多い。大多数の組換えが起こっていない細胞の中から組換え細胞を選抜するためには、選択マーカー遺伝子を同時に導入し、目的の組換え細胞を選抜する方法が現在広く用いられている。すなわち、組換え処理後の細胞を培養する際、選択マーカー遺伝子が導入されていなければ生存できない条件下で培養することで、組換え体だけを選んでくるという方法である。 Regarding the efficiency of gene transfer by gene recombination methods, it is often the case that recombinant cells that retain a gene into which only 1 / 10,000 or less of the introduced cells have been introduced are retained. In order to select a recombinant cell from the majority of cells that have not undergone recombination, a method of simultaneously introducing a selectable marker gene and selecting a target recombinant cell is widely used. That is, when cells after recombination treatment are cultured, only recombinants are selected by culturing under conditions where they cannot survive unless a selection marker gene is introduced.
一般的に、組換え体選択マーカーとして利用される遺伝子は２つに分けられる。一つは栄養要求性相補遺伝子に代表される、変異によりある条件で生育できない変異細胞に対してその変異を相補する変異相補性遺伝子であり、もう一つは通常の細胞に対して生育阻害を示す薬剤に対する薬剤耐性遺伝子である。前者は遺伝子組換え試験を始める前の準備として、宿主となる細胞にあらかじめ選抜に必要な変異を導入しておく必要があるのに対し、後者は通常の細胞のいずれにも利用できるため、適用範囲が広く実用性が高い。アスペルギルス・オリゼで利用されている変異相補性遺伝子としては、アルギニン要求性相補遺伝子argB（非特許文献６参照）、ウラシル要求性相補遺伝子pyrG（非特許文献２参照）、アデニン要求性相補遺伝子adeA, adeB（非特許文献３参照）、硝酸塩資化遺伝子niaD（非特許文献４参照）、硫酸資化遺伝子sC（非特許文献５参照）等がある。しかしながら、アスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・パラシチカスで現在利用されている薬剤耐性遺伝子は薬剤ピリチアミンに対するptrA（特許文献１及び非特許文献１参照）のみである。 In general, the genes used as recombinant selection markers are divided into two. One is a complementary gene that complements the mutation of a mutant cell that cannot grow under certain conditions, such as an auxotrophic complementary gene, and the other inhibits the growth of a normal cell. It is a drug resistance gene for the indicated drug. While the former requires preparation of mutations necessary for selection in advance in the host cell as a preparation before starting the genetic recombination test, the latter can be applied to any normal cell. Wide range and high practicality. Mutation complementing genes used in Aspergillus oryzae include arginine-requiring complementary gene argB (see Non-patent document 6), uracil-requiring complementary gene pyrG (see Non-patent document 2), adenine-requiring complementary gene adeA, adeB (see Non-patent Document 3), nitrate assimilation gene niaD (see Non-Patent Document 4), sulfate assimilation gene sC (see Non-Patent Document 5), and the like. However, the only drug resistance gene currently used in Aspergillus oryzae and Aspergillus parasites is ptrA for the drug pyrithiamine (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
一方、担子菌においても、組換え体選択マーカーとして栄養要求性相補遺伝子が多く使われてきたが、最近、薬剤耐性遺伝子としてカルボキシアミド系の薬剤、特にカルボキシンに対する耐性遺伝子が単離され、選択マーカーとして利用されている。カルボキシン及びその類縁体は主として担子菌が原因となる作物病害に効果を示す農薬である。カルボキシン耐性はコハク酸脱水素酵素複合体（Ｓｄｈ）の中のＩｐサブユニット又は膜サブユニット（ＳｄｈＣ）のいずれかの遺伝子の変異により獲得されることが知られている（特許文献２及び非特許文献７〜１０参照）。また、カルボキシンに感受性が弱いアスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）を酢酸を炭素源とする培地で培養すると、カルボキシンに対する感受性が強くなったという報告がある（非特許文献１１参照）。 On the other hand, in basidiomycetes, auxotrophic complementary genes have been frequently used as recombinant selection markers, but recently, resistance genes for carboxamide drugs, particularly carboxin, have been isolated and selected as drug resistance genes. It is used as a marker. Carboxin and its analogs are pesticides that are effective against crop diseases mainly caused by basidiomycetes. Carboxin resistance is known to be acquired by mutation of either the Ip subunit or the membrane subunit (SdhC) in the succinate dehydrogenase complex (Sdh) (Patent Document 2 and Non-patent Document 2). (See Patent Documents 7 to 10). In addition, there is a report that when Aspergillus nidulans, which is weakly sensitive to carboxin, is cultured in a medium containing acetic acid as a carbon source, the sensitivity to carboxin is enhanced (see Non-Patent Document 11).
上述のとおり、アスペルギルス属においては、遺伝子組換え法が効果的な育種又は研究手法であり、育種・研究の用途において、複数の外来遺伝子を導入するには複数のマーカー遺伝子が必要であるが、実際に利用されている薬剤耐性遺伝子は市販されているピリチアミン耐性遺伝子のみである。他の生物の生育を阻害する薬剤の多くについてアスペルギルス属の菌は耐性を示し、使用できる薬剤が限られていることが新たなマーカー遺伝子の開発の大きな障害となっている。しかし、アスペルギルス・オリゼでは全ゲノム解析が終了し、複雑な生命現象の解析が可能となった今、複数の遺伝子が関わる形質の改変、物質生産経路の導入等の研究開発が今後ますます増加する。また、例えばアスペルギルス・オリゼで自己の遺伝子の改変による組換え体を産業的に利用する場合を考えると、マーカー遺伝子もアスペルギルス・オリゼ由来のものを用いるとセルフクローニングとして法令上の遺伝子組換え生物等の使用には当たらず、産業的な価値が大きい。そのため、新たなマーカー遺伝子の開発が強く求められている。本発明の課題は、アスペルギルス属微生物において有用な新たな薬剤耐性マーカー遺伝子を提供することにある。 As described above, in the genus Aspergillus, genetic recombination is an effective breeding or research technique, and in the use of breeding and research, multiple marker genes are required to introduce multiple foreign genes. The only drug resistance gene actually used is the commercially available pyrithiamine resistance gene. Aspergillus bacteria are resistant to many drugs that inhibit the growth of other organisms, and the limited use of drugs is a major obstacle to the development of new marker genes. However, now that Aspergillus oryzae has completed genome-wide analysis and is able to analyze complex life phenomena, research and development such as modification of traits involving multiple genes and introduction of substance production pathways will continue to increase. . In addition, for example, considering the case of industrially using recombinants of Aspergillus oryzae by modifying their own genes, if the marker gene is also derived from Aspergillus oryzae, self-cloning, such as genetically modified organisms The industrial value is great. Therefore, there is a strong demand for the development of new marker genes. An object of the present invention is to provide a novel drug resistance marker gene useful in Aspergillus microorganisms.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討し、担子菌で利用可能となったカルボキシン耐性（特許文献２参照）について、アスペルギルス属について実験を試みたが、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・パラシチカスとも通常の培養条件ではカルボキシンに対して感受性が大変弱く、培地に加える薬剤の実用範囲内で菌糸生育を完全に抑えることは不可能であった。また、担子菌のカルボキシン耐性遺伝子はそれぞれの種でのみ機能するらしく、担子菌ヒラタケの変異遺伝子は属が異なるシイタケに耐性を付与することはない。従って担子菌亜門のヒラタケの耐性遺伝子を子嚢菌門（アスペルギルス属は不完全菌だがここに分類されると考えられている）のアスペルギルス属で利用することは不可能だと考えられた。 The present inventor has intensively studied to solve the above-mentioned problems, and has attempted to test for Aspergillus genus for carboxin resistance (see Patent Document 2) that can be used in basidiomycetes. Aspergillus oryzae, Aspergillus Both Parasites were very sensitive to carboxin under normal culture conditions, and it was impossible to completely suppress mycelial growth within the practical range of drugs added to the medium. In addition, the basidiomycete carboxin resistance gene seems to function only in each species, and the basidiomycete oyster mushroom mutant gene does not confer resistance to shiitake mushrooms of different genera. Therefore, it was considered impossible to use the Aspergillus spp. Gene of Aspergillus (Aspergillus genus is considered to be incomplete but classified here).
本発明者らは、アスペルギルス属に属する微生物であるアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・パラシチカスを、酢酸を炭素源とする培地で培養することにより、該微生物がカルボキシン感受性となり、さらにこれらアスペルギルス属に属する微生物に突然変異誘発処理を行うことにより、カルボキシン耐性微生物が出現し、カルボキシン耐性突然変異遺伝子が生じたことが予測された。そこで、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の全塩基配列から、担子菌のカルボキシン耐性遺伝子として知られているコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子に対応する遺伝子を検索することによって、該遺伝子に変異が生じていることを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。 As a result of culturing Aspergillus oryzae and Aspergillus parasites, which are microorganisms belonging to the genus Aspergillus, in a medium containing acetic acid as a carbon source, the microorganisms become susceptible to carboxin, and the microorganisms belonging to the genus Aspergillus It was predicted that by carrying out mutagenesis treatment, carboxin-resistant microorganisms appeared and carboxin-resistant mutant genes were generated. Thus, by searching for a gene corresponding to the succinate dehydrogenase Ip subunit gene known as the basidiomycete carboxin resistance gene from the entire base sequence of Aspergillus oryzae RIB40, the gene was mutated. I confirmed. The present invention has been completed based on these findings.
すなわち本発明は、［１］（１）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（２）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、さらに２４９番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードする単離されたＤＮＡや、［２］配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、ロイシン又はアスパラギンに置換されていることを特徴とする上記［１］記載のタンパク質をコードする単離されたＤＮＡに関する。 That is, the present invention provides [1] (1) a protein comprising an amino acid sequence in which the 249th histidine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is substituted with another amino acid, or (2) SEQ ID NO: in the sequence listing The 249th histidine of the amino acid sequence shown in 1 comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the 249th are substituted, deleted or added in the amino acid sequence in which the other amino acid is substituted; And an isolated DNA encoding a protein having a function of conferring carboxin resistance to a carboxin-sensitive microorganism in a medium containing acetic acid as a carbon source, and [2] 249 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing Wherein the second histidine is substituted with leucine or asparagine. Sul relates to an isolated DNA.
また本発明は、［３］配列表の配列番号２に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号２における塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ以外のコドンに置換された塩基配列からなる単離されたＤＮＡや、［４］塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＡＡＣ、ＡＡＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＡＴ又はＴＡＣであることを特徴とする上記［３］記載のＤＮＡや、［５］塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＣＴＣ又はＡＡＣであることを特徴とする上記［３］記載のＤＮＡや、［６］配列表の配列番号３に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号３における塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ以外のコドンに置換された塩基配列からなるＤＮＡや、［７］塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＡＡＣ、ＡＡＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＡＴ又はＴＡＣであることを特徴とする上記［６］記載のＤＮＡや、［８］塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＣＴＣ又はＡＡＣであることを特徴とする上記［６］記載のＤＮＡや、［９］上記［１］〜［８］のいずれか記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関する。 The present invention also provides a variant of DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing [3] or a base sequence containing the base sequence, wherein the bases of base numbers 940 to 942 in SEQ ID NO: 2 are , Isolated DNA consisting of a base sequence substituted with a codon other than CAT, TAA, TAG or TGA, or [4] bases 940 to 942 are AAC, AAT, TTA, TTG, CTT, CTC, The DNA described in [3] above, which is CTA, CTG, TAT or TAC, or the base of [5] base numbers 940 to 942 is CTC or AAC, described in [3] above Or a variant of DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing [6] or a base sequence containing the base sequence, the base number 745 to SEQ ID NO: 3 DNA consisting of a base sequence in which 47 bases are substituted with codons other than CAT, TAA, TAG or TGA, and [7] bases 745 to 747 are AAC, AAT, TTA, TTG, CTT, CTC, The DNA described in [6] above, which is CTA, CTG, TAT or TAC, or the base of [8] base numbers 745 to 747 is CTC or AAC, described in [6] above And [9] DNA that is hybridized under stringent conditions with any one of the above-mentioned [1] to [8] and that has a carbon source as a carbon source, the carboxin-sensitive microorganisms are resistant to carboxin. The present invention relates to a DNA encoding a protein having a function to be imparted.
さらに本発明は、［１０］配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質や、［１１］配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、さらに２４９番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質や、［１２］配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、ロイシン又はアスパラギンに置換されていることを特徴とする上記［１０］又は［１１］記載のタンパク質や、［１３］上記［１］〜［９］のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクターや、［１４］上記［１３］記載の組換えベクターが導入されたアスペルギルス属に属する微生物からなる形質転換体や、［１５］アスペルギルス属に属する微生物が、アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・パラシチカスであることを特徴とする上記［１４］記載の形質転換体や、［１６］上記［１］〜［９］のいずれか記載のＤＮＡを、アスペルギルス属に属する微生物のマーカー遺伝子として使用する方法や、［１７］上記［１］〜［９］のいずれか記載のＤＮＡと目的遺伝子とが組み込まれた組換えベクターでアスペルギルス属に属する微生物を形質転換し、得られた形質転換体を酢酸を炭素源とするカルボキシン含有培地で培養し、カルボキシン耐性を指標として前記形質転換体を選抜する方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a protein comprising an amino acid sequence in which the 249th histidine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the [10] Sequence Listing is substituted with another amino acid, or shown in SEQ ID NO: 1 in the [11] Sequence Listing. In the amino acid sequence in which the 249th histidine of the amino acid sequence is substituted with another amino acid, and one or several amino acids other than the 249th are substituted, deleted, or added, and A protein having a function of imparting carboxylin resistance to a carboxin-sensitive microorganism in a medium serving as a carbon source, or the 249th histidine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the [12] Sequence Listing is substituted with leucine or asparagine. A protein according to [10] or [11] above, or [13] above [1] [9] a recombinant vector comprising the DNA of any one of [9], [14] a transformant comprising a microorganism belonging to the genus Aspergillus into which the recombinant vector of [13] has been introduced, [15] a genus of Aspergillus The transformant according to [14] above, wherein the microorganism to which the microorganism belongs is Aspergillus oryzae or Aspergillus parasite, or [16] the DNA according to any one of [1] to [9] above, Or a method of using as a marker gene of a microorganism belonging to the above, or [17] transforming a microorganism belonging to the genus Aspergillus with a recombinant vector in which the DNA of any one of [1] to [9] and a target gene are incorporated. The obtained transformant is cultured in a carboxin-containing medium containing acetic acid as a carbon source, and the above-mentioned form is used with carboxin resistance as an index. It relates to a method for selecting a transformant.
本発明によると、アスペルギルス属微生物において有用カルボキシン耐性マーカー遺伝子を提供することができ、その結果、カルボキシン感受性のアスペルギルス属に属する微生物を宿主微生物とした遺伝子組換え系において、酢酸を炭素源とする培地でアスペルギルス属微生物を培養することにより、目的とする形質転換体をカルボキシン耐性を指標として効率よく選別することができる。 According to the present invention, a useful carboxin resistance marker gene can be provided in an Aspergillus microorganism, and as a result, in a genetic recombination system using a microorganism belonging to the genus Aspergillus that is sensitive to carboxin as a host microorganism, acetic acid is used as a carbon source. By culturing Aspergillus microorganisms in the culture medium, the target transformant can be efficiently selected using carboxin resistance as an index.
本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、さらに２４９番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号２における塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ以外のコドンに置換された塩基配列からなるＤＮＡ（配列表の配列番号２における塩基番号９４０〜９４２の塩基が、ＣＡＣ、ＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ以外のコドンに置換された配列番号２の塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ）や、配列表の配列番号３に示される塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡの変異体であって、配列番号３における塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ以外のコドンに置換された塩基配列からなるＤＮＡ（配列表の配列番号３における塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＣＡＣ、ＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ以外のコドンに置換された配列番号３の塩基配列、又は該塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ）や、上記いずれか記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、上記カルボキシン感受性微生物としては、アスペルギルス属に属する微生物を好適に例示することができ、また、上記「カルボキシン」とは、以下の式(Ｉ)で表される化合物（Carboxin；5,6-dihydro-2-methyl-1,4-oxathiine-3-carboxanilide）を意味し、通常カルボキシンは、担子菌が原因の作物病害に使用される農薬として使用されている。 Examples of the DNA of the present invention include DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which the 249th histidine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is substituted with another amino acid, and shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. In the amino acid sequence in which the 249th histidine of the amino acid sequence is substituted with another amino acid, and one or several amino acids other than the 249th are substituted, deleted, or added, and DNA encoding a protein having a function of imparting carboxin resistance to a carboxin-sensitive microorganism in a medium serving as a carbon source, or a DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or a base sequence containing the base sequence Wherein the bases of base numbers 940 to 942 in SEQ ID NO: 2 are CAT, TAA, T DNA consisting of a base sequence substituted with a codon other than G or TGA (SEQ ID NO: the bases of base numbers 940 to 942 in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing are replaced with codons other than CAC, CAT, TAA, TAG or TGA) 2), a DNA sequence comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, or a base sequence comprising the base sequence, DNA consisting of a base sequence in which the bases of base numbers 745 to 747 in number 3 are substituted with codons other than CAT, TAA, TAG or TGA (bases of base numbers 745 to 747 in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing are CAC, DN comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 substituted with a codon other than CAT, TAA, TAG or TGA, or a nucleotide sequence containing the nucleotide sequence Or a DNA that encodes a protein that has a function of conferring carboxin resistance to a carboxin-sensitive microorganism in a medium containing acetic acid as a carbon source. The carboxin-sensitive microorganism is not particularly limited, and a microorganism belonging to the genus Aspergillus can be suitably exemplified, and the “carboxyn” is a compound represented by the following formula (I) ( Carboxin; 5,6-dihydro-2-methyl-1,4-oxathiine-3-carboxanilide), usually carboxin is used as an agrochemical used for crop diseases caused by basidiomycetes.
上記配列表の配列番号２に示される塩基配列は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）ＤＯＧＡＮのデータベースにその配列が明らかにされているアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の遺伝子の全塩基配列(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top)から、担子菌のコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子に対応する遺伝子であり、また、上記配列表の配列番号３は、配列表の配列番号２に示される塩基配列からイントロン部分を除いたｃＤＮＡの塩基配列であり、上記配列表の配列番号１は、上記配列番号３に記載の塩基配列より推測されるアミノ酸配列である。 The base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the above sequence listing is the entire base sequence of the Aspergillus oryzae RIB40 gene whose sequence has been clarified in the database of the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) DOGAN (http: //www.bio.nite.go.jp/dogan/Top), a gene corresponding to the succinate dehydrogenase Ip subunit gene of basidiomycete, and SEQ ID NO: 3 in the above sequence listing is the sequence listing The base sequence of cDNA obtained by removing the intron portion from the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is an amino acid sequence deduced from the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
また、上記「配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列」としては、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、例えばアスパラギン、ロイシン又はチロシンに置換されているアミノ酸配列を挙げることができ、中でもロイシン又はアスパラギンに置換されているアミノ酸配列を好適に例示することができる。また、本発明において「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列をいう。 In addition, as the “amino acid sequence in which the 249th histidine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing is substituted with other amino acids”, the 249th histidine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is For example, an amino acid sequence substituted with asparagine, leucine or tyrosine can be exemplified, and among them, an amino acid sequence substituted with leucine or asparagine can be preferably exemplified. In the present invention, the “amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added” is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, Preferably, it refers to an amino acid sequence in which any one to three amino acids are substituted, deleted, or added.
上記配列番号２における塩基番号９４０〜９４２や配列番号３における塩基番号７４５〜７４７の塩基が、ＣＡＣ（ヒスチジンコドン）、ＣＡＴ（ヒスチジンコドン）、ＴＡＡ（ストップコドン）、ＴＡＧ（ストップコドン）又はＴＧＡ（ストップコドン）以外のコドンとしては、ＡＡＣ、ＡＡＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＡＴ又はＴＡＣであることがカルボキシン耐性付与の強さの点で好ましく、中でもＣＴＣ又はＡＡＣであることが特に好ましい。 Bases 940 to 942 in SEQ ID NO: 2 and bases 745 to 747 in SEQ ID NO: 3 are CAC (histidine codon), CAT (histidine codon), TAA (stop codon), TAG (stop codon) or TGA ( The codons other than (stop codon) are preferably AAC, AAT, TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG, TAT, or TAC in terms of the strength of imparting carboxin resistance, and in particular, CTC or AAC. It is particularly preferred.
上記「酢酸を炭素源とする培地におけるカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質」とは、炭素源として酢酸のみを含む培地においてカルボキシン感受性微生物に、その発現によりカルボキシン耐性を付与することができ、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンがロイシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質のカルボキシン耐性付与活性に比べて同程度のカルボキシン耐性付与活性を２倍以下の濃度で奏するタンパク質をいう。例えば、炭素源がグルコースであるＧＹ培地（１％グルコース、０．５％イーストエキストラクト、２％寒天）では、カルボキシンに対して強い感受性を示さず完全な生育阻害が観察されないが、培地の炭素源をグルコースから酢酸に代えたＡＹ培地（１４４ｍＭ酢酸バッファーｐＨ６．５、０．５％イーストエキストラクト、２％寒天）で２８℃にて２日間培養することにより、カルボキシンに対する強い感受性を示し、５０μｇ／ｍＬのカルボキシンの濃度で生育を完全に阻害されるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０に、カルボキシン耐性付与機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した形質転換アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０を、５０μｇ／ｍＬ以上カルボキシンを含有する１４４ｍＭ酢酸バッファーｐＨ６．５、０．５％イーストエキストラクト、２％寒天を含むＡＹ培地にて２８℃で４〜５日間培養後、形質転換株が生存しうる機能を有するタンパク質を挙げることができる。 The above-mentioned “protein having a function of imparting carboxin resistance to carboxin-sensitive microorganisms in a medium containing acetic acid as a carbon source” means that the expression of carboxin-sensitive microorganisms in a medium containing only acetic acid as a carbon source is resistant to carboxin. That is equivalent to the carboxylin resistance-imparting activity of a protein consisting of an amino acid sequence in which the 249th histidine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is substituted with leucine. It refers to a protein that exhibits activity at a concentration of 2 times or less. For example, in a GY medium (1% glucose, 0.5% yeast extract, 2% agar) in which the carbon source is glucose, no strong growth inhibition is observed and no strong growth inhibition is observed. High sensitivity to carboxin is demonstrated by culturing at 28 ° C for 2 days in AY medium (144 mM acetate buffer pH 6.5, 0.5% yeast extract, 2% agar) in which the carbon source is changed from glucose to acetic acid. Aspergillus oryzae RIB40, whose growth is completely inhibited at a concentration of 50 μg / mL, was transformed into 50 μg / mL of transformed Aspergillus oryzae RIB40 transformed with a DNA encoding a protein having a function of imparting carboxylin resistance. 144 mM acetate buffer pH 6.5 containing carboxin A protein having a function capable of surviving a transformed strain after culturing at 28 ° C. for 4 to 5 days in an AY medium containing 0.5% yeast extract and 2% agar.
上記「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。 The above “stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Specifically, DNAs having 50 to 70% homology or more are located between each other. 65 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, or 0.1 × SSC, 0 which is a condition in which DNAs that hybridize and DNAs having lower homology do not hybridize each other or washing conditions of normal Southern hybridization The conditions for hybridization at a salt concentration corresponding to 1% SDS can be mentioned. For example, DNA that can hybridize under stringent conditions can include DNA having a certain degree of homology with the base sequence of the DNA used as a probe, for example, 60% or more, preferably 70%. Preferred examples thereof include DNA having homology of 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more.
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号２又は３に示される塩基配列情報、あるいは配列番号１に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて、当該遺伝子が存在することが予測されるゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。例えば上記プローブやプライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイト法）によって調製することができる。また、酢酸を炭素源とする培地でのカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を置換、欠失、又は付加して塩基配列を改変することによっても取得することができる。さらに、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体間、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、アスペルギルス属に属する微生物の種、株、変異体、変種から得ることも可能である。 The method for obtaining and preparing the DNA of the present invention is not particularly limited, and is based on the nucleotide sequence information shown in SEQ ID NO: 2 or 3 disclosed in the present specification or the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1. Prepare appropriate probes and primers and use them to isolate the target DNA by screening genomic DNA libraries and cDNA libraries that are predicted to contain the gene. It can be prepared by synthesis. For example, the probe and primer can be prepared by a known DNA synthesis method (for example, phosphoramidite method) using an ordinary automatic DNA synthesizer (for example, Applied Biosystem). In addition, DNA encoding a protein that is substantially the same as a protein having a function of imparting carboxin resistance to a carboxin-sensitive microorganism in a medium containing acetic acid as a carbon source can be obtained by, for example, site-specific mutagenesis. It can also be obtained by altering the base sequence by substituting, deleting, or adding the amino acid. Furthermore, it is generally known that the amino acid sequence of a protein and the base sequence that encodes it are slightly different between species, strains, variants, and variants, and therefore encodes substantially the same protein. DNA can also be obtained from species, strains, mutants, and variants of microorganisms belonging to the genus Aspergillus.
前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡの一例として、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）を好適に挙げることができ、これらの変異ＤＮＡは、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号２又は３に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual,3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 2001.（以後"モレキュラークローニング第３版"と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。 A preferred example of DNA that can hybridize under stringent conditions is DNA (mutant DNA) having a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, or added. These mutant DNAs can also be prepared by any method known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, and mutagenesis. Specifically, these DNAs can be obtained by using a method of bringing the mutagen agent into contact with DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3, a method of irradiating ultraviolet rays, a genetic engineering method, etc. Mutant DNA can be obtained by introducing a mutation into. Site-directed mutagenesis, which is one of genetic engineering techniques, is useful because it can introduce specific mutations at specific positions. Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, NY., 2001. (hereinafter abbreviated as "Molecular Cloning 3rd Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), etc. Can be done. By expressing this mutant DNA using an appropriate expression system, a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added can be obtained.
本発明のタンパク質としては、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、さらに２４９番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質であれば特に制限されず、上記「配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列」としては、ヒスチジンが、例えばアスパラギン、ロイシン、チロシン等に置換されているアミノ酸配列を挙げることができ、中でもロイシン又はアスパラギンに置換されているアミノ酸配列を好適に例示することができる。 Examples of the protein of the present invention include a protein comprising an amino acid sequence in which the 249th histidine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is substituted with another amino acid, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. In the amino acid sequence in which the 249th histidine is substituted with another amino acid, one or several amino acids other than the 249th are further substituted, deleted, or added, and acetic acid is used as a carbon source. The protein is not particularly limited as long as it is a protein having a function of imparting carboxin resistance to a carboxin-sensitive microorganism in the medium, and the above-mentioned “249th histidine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is substituted with another amino acid. As the `` amino acid sequence '', histidine is placed in, for example, asparagine, leucine, tyrosine, etc. Has been that there may be mentioned amino acid sequence, can be preferably exemplified amino acid sequence is substituted with inter alia leucine or asparagine.
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来の変異タンパク質として、化学合成したタンパク質として、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質として調製することができる。天然由来の変異タンパク質として取得する場合には、かかるタンパク質を発現している微生物細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなる本発明のＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。 The method for obtaining and preparing the protein of the present invention is not particularly limited, and can be prepared as a naturally occurring mutant protein, a chemically synthesized protein, or a recombinant protein produced by a gene recombination technique. In the case of obtaining a naturally occurring mutant protein, the protein of the present invention can be obtained by appropriately combining protein isolation / purification methods from microbial cells expressing such protein. When preparing a protein by chemical synthesis, the protein of the present invention can be synthesized according to a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), etc. . In addition, the protein of the present invention can be synthesized using various commercially available peptide synthesizers. When a protein is prepared by a gene recombination technique, the protein of the present invention can be prepared by introducing the DNA of the present invention comprising a base sequence encoding the protein into a suitable expression system. Among these, preparation by a gene recombination technique that can be prepared in a large amount by a relatively easy operation is preferable.
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。 For example, when the protein of the present invention is prepared by gene recombination technology, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography can be used to recover and purify the protein from the cell culture. , Known methods including hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography, preferably high performance liquid chromatography. In particular, the column used for affinity chromatography is, for example, a column in which an antibody such as a monoclonal antibody against the protein of the present invention is bound, or when a normal peptide tag is added to the protein of the present invention, By using a column to which an affinity substance is bound, purified products of these proteins can be obtained.
本発明の組換えベクターとしては、上記本発明のＤＮＡを１種以上含み、かつ宿主細胞においてカルボキシン耐性遺伝子を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、ベクターの種類としては、例えばプラスミド、コスミド等を挙げることができる。本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡが発現するベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡが発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。上記選択マーカー遺伝子としてのカルボキシン耐性遺伝子と、目的遺伝子を組み込むことができるクローニングサイトとを備えた形質転換用発現ベクターとしては、カルボキシン耐性を選択マーカーとして形質転換体のスクリーニングに用いられるものであって、前記クローニングサイトに目的遺伝子を挿入することにより、上記形質転換用組換えベクターとしうるものであればどのようなものでもよく、上記クローニングサイトは、ポリリンカークローニングサイトを有することが好ましい。また、本発明の組換えベクターは、宿主細胞内で自律的に増殖しうる多コピー型ベクターであってもよいし、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの間で組換え可能なゲノム挿入型ベクターであってもよい。具体的には、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐBluescriptII、ｐＳＰ７２、ｐＢＩ１２１(いずれも大腸菌で自律複製)等の一般的なクローニングベクターに、アスペルギルス属菌の遺伝子プロモーター、ターミネーター等の制御配列を含むＤＮＡを組み込むことによりゲノム挿入型ベクターとすることができ、また、ｐＡＵＲ３１６、ｐＰＴＲII等を用いることにより宿主細胞内で自律的に増殖しうる多コピー型ベクターとすることができ、これらのベクターに本発明のＤＮＡを作動可能なように組み込むことにより、アスペルギルス属菌の系に適した本発明の組換えベクターを構築することができる。 The recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it is a recombinant vector containing one or more of the DNAs of the present invention and capable of expressing a carboxin resistance gene in a host cell. Examples thereof include plasmids and cosmids. The recombinant vector of the present invention can be constructed by appropriately integrating with a vector that expresses the DNA of the present invention. Such an expression vector is preferably one that can autonomously replicate in the host cell, or one that can be integrated into the chromosome of the host cell. Further, a promoter, an enhancer, a terminator, etc. can be used at a position where the DNA of the present invention can be expressed. Those containing a control sequence can be preferably used. An expression vector for transformation comprising a carboxin resistance gene as a selection marker gene and a cloning site into which a target gene can be incorporated is used for screening transformants using carboxin resistance as a selection marker. Any one can be used as long as it can be used as the recombinant vector for transformation by inserting a target gene into the cloning site, and the cloning site preferably has a polylinker cloning site. The recombinant vector of the present invention may be a multicopy vector that can autonomously propagate in a host cell, or a genome insertion vector that can be recombined with the genomic DNA of the host cell. May be. Specifically, control sequences such as gene promoters and terminators of Aspergillus spp. Are added to general cloning vectors such as pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pBR322, pBluescriptII, pSP72, and pBI121 (all of which are autonomously replicated in E. coli). By incorporating the contained DNA, it can be made into a genome insertion type vector, and by using pAUR316, pPTRII, etc., it can be made into a multi-copy type vector that can be propagated autonomously in a host cell. By incorporating the DNA of the present invention operably, the recombinant vector of the present invention suitable for the Aspergillus system can be constructed.
上記本発明のアスペルギルス属に属する微生物の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質を発現するアスペルギルス属に属する微生物の形質転換体であれば特に制限されず、該形質転換体は、所定の濃度のカルボキシンを含有する酢酸を炭素源とする培地で、カルボキシン耐性株として生存することができる。 As a transformant of the microorganism belonging to the genus Aspergillus of the present invention, the recombinant vector of the present invention is introduced, and belongs to the genus Aspergillus that expresses a protein having a function of imparting carboxin resistance to the carboxin-sensitive microorganism. The transformant is not particularly limited as long as it is a microorganism transformant, and the transformant can survive as a carboxin-resistant strain in a medium containing acetic acid containing a predetermined concentration of carboxin as a carbon source.
上記本発明のアスペルギルス属に属する微生物の形質転換体を作製するための組換えベクターの宿主への導入方法としては、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びモレキュラークローニング第３版等に記載されている方法に準じて行うことができるなどの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、プロトプラスト−ＰＥＧ法、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム法等により行うことができるが、プロトプラスト−ＰＥＧ法、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム法が好ましい。 As a method for introducing a recombinant vector for producing a transformant of a microorganism belonging to the genus Aspergillus of the present invention into a host, it is described in Davis et al. (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) and Molecular Cloning 3rd Edition. Many standard laboratory manual methods such as protoplast-PEG method, calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid mediated transfection, etc. The protoplast-PEG method, the electroporation, and the Agrobacterium method are preferable.
本発明のアスペルギルス属に属する微生物としては、真菌の子嚢菌門の不完全菌類アスペルギルス属に属するものであれば特に制限されず、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus lutiensismut.kawachi）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamari）、アスペルギルス・グラウカス（Aspergillus glaucus）、アスペルギルス・パラシチカス、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavas）、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ベルシコロル（Aspergillus versicolor）、アスペルギルス・カンジタス（Aspergillus candidus）、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus usutus）等を挙げることができ、さらに、該アスペルギルス属に属する微生物を親株として人為的改変した株、又は天然に存在する変異株なども包含されるが、中でもアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・パラシチカス、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・フラバス等が好ましく、アスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・パラシチカスがより好ましい。 The microorganism belonging to the genus Aspergillus of the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the genus Aspergillus, an incomplete fungus of the Ascomycota fungus. For example, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus kawachi (Aspergillus lutiensismut.kawachi), Aspergillus awamori, Aspergillus saitoi, Aspergillus usamii, Aspergillus sojae, Aspergillus sogie, Aspergillus talus (Aspergillus glaucus), Aspergillus palracicus, Aspergillus flavas, Aspergillus ochraceus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus fumigatus Examples include Aspergillus versicolor, Aspergillus candidus, Aspergillus usutus, and the like, or a strain obtained by artificially modifying a microorganism belonging to the genus Aspergillus as a parent strain, or naturally Although existing mutants are also included, Aspergillus oryzae, Aspergillus parasite, Aspergillus soja, Aspergillus flavus and the like are preferable, and Aspergillus oryzae and Aspergillus parasite are more preferable.
具体的には、本発明のアスペルギルス属に属する微生物としては、本発明のＤＮＡで形質転換されたアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株やアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９株を挙げることができる。アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株、及びアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９株はいずれもAmerican Type Culture Collectionより入手可能である。なお、本発明のＤＮＡで形質転換されたアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株及びアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９株は、実施例の記載等により再現性をもって作製可能であるが、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構食品総合研究所にて保管されており、一定条件下で分譲可能である。 Specifically, examples of the microorganism belonging to the genus Aspergillus of the present invention include Aspergillus oryzae RIB40 strain and Aspergillus parasites NRRL2999 strain transformed with the DNA of the present invention. Both Aspergillus oryzae RIB40 strain and Aspergillus parasiticus NRRL 2999 strain are available from the American Type Culture Collection. Note that the Aspergillus oryzae RIB40 strain and Aspergillus paralyticus NRRL2999 strain transformed with the DNA of the present invention can be produced with reproducibility according to the description of the examples, etc., but the National Agriculture and Food Research Organization It is stored at the National Food Research Institute and can be sold under certain conditions.
本発明のアスペルギルス属に属する微生物のマーカー遺伝子として使用する方法としては、炭素源が酢酸である培地で確認されるカルボキシン感受性に対する選択マーカー遺伝子としての使用であれば特に制限されず、例えば、カルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と目的遺伝子とを組み込んだ組換えベクターが宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞中において選択マーカー遺伝子としてのカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と目的遺伝子とを発現させることで宿主を形質転換し、カルボキシン耐性を選択マーカーとして形質転換体をスクリーニングすることができる。この場合、組換えベクターは、宿主細胞内で自律的に増殖しうる多コピー型ベクターであっても、染色体組込型ベクターでもよい。 The method used as a marker gene of the microorganism belonging to the genus Aspergillus of the present invention is not particularly limited as long as it is used as a selection marker gene for carboxin sensitivity confirmed in a medium in which the carbon source is acetic acid. When a recombinant vector incorporating a gene encoding a protein having a function of conferring carboxylin resistance on a host-sensitive microorganism and the target gene is introduced into the host cell, the carboxin-sensitive microorganism as a selectable marker gene in the host cell A host is transformed by expressing a gene encoding a protein having a function of conferring carboxin resistance and a target gene, and transformants can be screened using carboxin resistance as a selection marker. In this case, the recombinant vector may be a multicopy vector that can autonomously grow in the host cell or a chromosomally integrated vector.
目的遺伝子としては、アスペルギルス属に属する微生物において発現するものであれば特に制限されず、例えば、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼ等のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、又はカルボキシペプチダーゼ遺伝子などを挙げることができるが、セルフクローニングをする場合には、宿主と同種の微生物に由来することが必要である。また、目的遺伝子には、上記タンパク質をコードするものに限らず、アンチセンス又はＲＮＡｉのようなジーンサイレンシング機能を有し、産業上不要な酵素や低分子の生産を抑制するポリヌクレオチドを含んでもよい。 The target gene is not particularly limited as long as it is expressed in a microorganism belonging to the genus Aspergillus. For example, pectin-degrading enzymes such as phytase, lyase and pectinase, amylase, glucoamylase, α-galactosidase, β-galactosidase, α- Glucosidase, β-glucosidase, mannosidase, isomerase, invertase, transferase, ribonuclease, chitinase, deoxyribonuclease, catalase, laccase, phenol oxidase, oxidase, oxidoreductase, cellulase, xylanase, peroxidase, lipase, hydrolase, esterase, protease, aminopeptidase, Or a carboxypeptidase gene. When the grayed, it is necessary from a microbial host the same type. The target gene is not limited to those encoding the above proteins, and may include genes that have gene silencing functions such as antisense or RNAi and suppress industrially unnecessary enzymes and production of small molecules. Good.
さらに、本発明のアスペルギルス属に属する微生物のマーカー遺伝子として使用する方法としては、上記組換えベクターにカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と目的遺伝子とを組み込んだ本発明のマーカー遺伝子にさらに既知の他の選択マーカーを組込み、多重選択マーカーとして使用することも可能である。多重選択マーカーの作製方法としては、例えば薬剤耐性マーカーであるピリチアミン耐性遺伝子ptrA、アルギニン要求性相補遺伝子argB、ウラシル要求性相補遺伝子pyrG、アデニン要求性相補遺伝子adeA, adeB、硝酸塩資化遺伝子niaD、硫酸資化遺伝子sC等の栄養要求性マーカー等から選択される１種以上の選択マーカーを作動可能なように組み込み、該組換えベクターが宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞中において多重選択マーカーとして使用する方法であれば特に制限されないが、ピリチアミン耐性遺伝子との二重マーカーが、事前に栄養要求変異体の作製が不要である点で好ましい。これら多重マーカーを含むベクターも、本発明の組換えベクターであり、例えば二次代謝産物の遺伝子組換え代謝物の生産において有用であるなどの利点がある。 Furthermore, as a method of using as a marker gene for a microorganism belonging to the genus Aspergillus of the present invention, a gene encoding a protein having a function of imparting carboxin resistance to a carboxin-sensitive microorganism and a target gene are incorporated into the above recombinant vector. However, it is also possible to incorporate another selectable marker into the marker gene of the present invention and use it as a multiple selectable marker. As a method for producing a multiple selection marker, for example, a drug resistance marker, pyrithiamine resistance gene ptrA, arginine requirement complementary gene argB, uracil requirement complementation gene pyrG, adenine requirement complementation genes adeA and adeB, nitrate utilization gene niaD, sulfate When one or more selection markers selected from auxotrophic markers such as the assimilation gene sC are operably incorporated and the recombinant vector is introduced into the host cell, it is used as a multiple selection marker in the host cell. Although it will not restrict | limit especially if it is a method to be used, A double marker with a pyrithiamine resistance gene is preferable at the point which preparation of an auxotrophic mutant is unnecessary beforehand. A vector containing these multiple markers is also a recombinant vector of the present invention, and has an advantage that it is useful, for example, in the production of a recombinant metabolite of a secondary metabolite.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
（アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・パラシチカスにおけるカルボキシン感受性試験）
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０及びアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９を通常培養するＧＹ培地（１％グルコース、０．５％イーストエキストラクト、２％寒天）に０、５０、１５０、２５０μｇ／ｍＬのカルボキシン（和光純薬工業株式会社製）を添加し、２８℃にて２日間培養してカルボキシンに対する感受性を確認したが、完全な生育阻害は起こらなかった（表１参照）。
(Carboxin sensitivity test in Aspergillus oryzae or Aspergillus parasites)
0, 50, 150, 250 μg / mL carboxin (Wako Pure Chemical Industries) in GY medium (1% glucose, 0.5% yeast extract, 2% agar) for normal cultivation of Aspergillus oryzae RIB40 and Aspergillus parasite NRRL2999 Manufactured by Co., Ltd.) and cultured at 28 ° C. for 2 days to confirm the sensitivity to carboxin, but no complete growth inhibition occurred (see Table 1).
培地の炭素源をグルコースから酢酸に代えたＡＹ培地（１４４ｍＭ酢酸バッファーｐＨ６．５、０．５％イーストエキストラクト、２％寒天）で２８℃にて２日間培養すると５０μｇ／ｍＬのカルボキシンの濃度で生育を完全に阻害することができた（表１参照）。炭素源をグルコースから酢酸に変更することでカルボキシンに対する感受性が向上することが明らかになったため、以後カルボキシン耐性試験や形質転換実験にはＡＹ培地を使用した。 When cultured at 28 ° C. for 2 days in AY medium (144 mM acetate buffer pH 6.5, 0.5% yeast extract, 2% agar) in which the carbon source of the medium was changed from glucose to acetic acid, the concentration of carboxin was 50 μg / mL. Was able to completely inhibit the growth (see Table 1). Since it became clear that the sensitivity to carboxin was improved by changing the carbon source from glucose to acetic acid, AY medium was used for the carboxin tolerance test and the transformation experiment.
（アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０からのカルボキシン耐性突然変異株の取得）
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０からカルボキシン耐性突然変異株の取得を試みた。変異原導入法として紫外線照射法を採用した。
(Acquisition of carboxin-resistant mutant strain from Aspergillus oryzae RIB40)
An attempt was made to obtain a carboxin resistant mutant from Aspergillus oryzae RIB40. An ultraviolet irradiation method was adopted as a mutagen introduction method.
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０を胞子形成斜面培地（ポテトデキストロースアガー：ＤＩＦＣＯ社製）で２８℃にて７日間培養後、胞子を０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０に懸濁し、目開き１６０μｍのナイロンメッシュでろ過した。ろ液を５，０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０に再懸濁した。この作業を３回繰り返し、胞子液を洗浄するとともに濃縮を行った。最終的に胞子濃度１×１０９／ｍＬとなるように再懸濁した。 After culturing Aspergillus oryzae RIB40 in a spore-forming slant medium (potato dextrose agar: DIFCO) at 28 ° C. for 7 days, the spore was suspended in 0.05% Tween 80 and filtered through a nylon mesh having an opening of 160 μm. The filtrate was centrifuged at 5,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded and resuspended in 0.05% Tween80. This operation was repeated three times to wash and concentrate the spore solution. Finally, the suspension was resuspended so that the spore concentration was 1 × 10 9 / mL.
この胞子液４ｍＬを直径５ｃｍのプラスチックシャーレに入れ、約１５ｃｍ離れた距離から紫外線を１０５秒又は６０秒間照射し、その後３０分間遮光した。紫外線照射した胞子を１５０μｇ／ｍＬのカルボキシン入りのＡＹ培地で２８℃にて４〜５日間培養した。この時の生存率は約８０％だった。各プレート培地に生成したコロニーから胞子を採取し、さらに１００μｇ／ｍＬのカルボキシン入りのＡＹ培地で４日間培養して精製したところ、最終的に１３株のカルボキシン耐性変異株を単離することができた。 4 mL of this spore solution was placed in a plastic petri dish having a diameter of 5 cm, irradiated with ultraviolet rays from a distance of about 15 cm for 105 seconds or 60 seconds, and then shielded from light for 30 minutes. The UV-irradiated spores were cultured at 28 ° C. for 4-5 days in an AY medium containing 150 μg / mL carboxin. The survival rate at this time was about 80%. Spores are collected from colonies generated on each plate medium, and further purified by culturing for 4 days in an AY medium containing 100 μg / mL carboxin. Finally, 13 strains of carboxin resistant mutants are isolated. I was able to.
（アスペルギルス・オリゼゲノムデータベースからのコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニットをコードする遺伝子の探索）
担子菌ではコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子における変異により、カルボキシン耐性が獲得されることが知られている（Keon et. al., Curr. Genet. 19, 475-481 (1991)、 Honda et. al., Curr. Genet. 37, 209-212 (2000)、及びIrie et. al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 2006-2009(2003)）ので、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムデータベース(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top)より当該遺伝子と思われる遺伝子を検索した（配列番号２参照）。また、この遺伝子から推測されるアミノ酸配列は配列番号１に示した。
(Search for gene encoding succinate dehydrogenase Ip subunit from Aspergillus oryzae genome database)
In basidiomycete, it is known that carboxin resistance is acquired by mutation in the succinate dehydrogenase Ip subunit gene (Keon et. Al., Curr. Genet. 19, 475-481 (1991), Honda et. al., Curr. Genet. 37, 209-212 (2000), and Irie et. al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 2006-2009 (2003)), the genome database of Aspergillus oryzae RIB40. (http://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top) was searched for a gene that seems to be the gene concerned (see SEQ ID NO: 2). The amino acid sequence deduced from this gene is shown in SEQ ID NO: 1.
上記カルボキシン耐性変異株１３株について、ゲノムＤＮＡよりＰＣＲ法を用いてコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲ反応は、プライマー１（フォワード）（5’-CTCCCTTCGACTTCATCTCG-3’；配列番号４）及びプライマー２（リバース）（5’-GACGGCCTCAAGAACCGA-3’；配列番号５）を使用し、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡株式会社製）を用いた。ＰＣＲサイクルの条件は、９４℃にて２分の後、９４℃にて１５秒、５８℃にて３０秒、６８℃にて１分２０秒を３２サイクルした後、６８℃にて７分処理し、１５℃で保存した。その結果、約１．３Ｋｂのゲノム遺伝子産物を確認した。得られたＰＣＲ産物をプロメガのＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍで精製し、ＤＮＡ塩基配列決定を行った。 For the 13 carboxin-resistant mutant strains, succinate dehydrogenase Ip subunit gene was amplified from genomic DNA using PCR. The PCR reaction uses primer 1 (forward) (5′-CTCCCTTCGACTTCATCTCG-3 ′; SEQ ID NO: 4) and primer 2 (reverse) (5′-GACGGCCTCAAGAACCGA-3 ′; SEQ ID NO: 5), and uses KOD- as the DNA polymerase. Plus- (Toyobo Co., Ltd.) was used. PCR cycle conditions were 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 15 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 1 minute 20 seconds, 32 cycles, then 68 ° C for 7 minutes. And stored at 15 ° C. As a result, a genomic gene product of about 1.3 Kb was confirmed. The obtained PCR product was purified by Promega Wizard (registered trademark) SV Gel and PCR Clean-Up System and subjected to DNA sequencing.
プライマー１及び２に加えて、プライマー３（フォワード）（5’- GAACTGCACAGGATCCCAAC -3’; 配列番号６）とプライマー４（リバース）（5’- CCTCACTGTTCCACCAGTAC -3’; 配列番号７）を塩基配列決定に使用した。 In addition to primers 1 and 2, primer 3 (forward) (5'-GAACTGCACAGGATCCCAAC-3 '; SEQ ID NO: 6) and primer 4 (reverse) (5'-CCTCACTGTTCCACCAGTAC -3'; SEQ ID NO: 7) were used for nucleotide sequencing. used.
上記耐性変異株１３株のうち９株において、コハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子にアミノ酸の置換を伴う変異が見つかった（図１参照）。すなわち、５株において、開始コドンから９４０番目のシトシンがチミンに置換され、別の１株で９４０番目と９４２番目のシトシンがそれぞれチミンに置換されたことにより、２４９番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンに置換された（以後、チロシン置換株とする）。さらに別の２株で９４１番目のアデニンがチミンに置換されたことにより、２４９番目のアミノ酸がヒスチジンからロイシンに置換された（以後、ロイシン置換株とする）。さらにまた別の１株で９４０番目のシトシンがアデニンに置換されたことにより、２４９番目のアミノ酸がヒスチジンからアスパラギンに置換された（以後、アスパラギン置換株とする）。上記耐性変異株１３株のうち４株ではコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子には変異が見られなかった（以後、ヒスチジン耐性株とする）。 In 9 of the 13 resistant mutants, a mutation involving amino acid substitution was found in the succinate dehydrogenase Ip subunit gene (see FIG. 1). That is, in 5 strains, the 940th cytosine from the start codon was replaced with thymine, and in another strain, the 940th and 942nd cytosines were replaced with thymine, so that the 249th amino acid was changed from histidine to tyrosine. It was substituted (hereinafter referred to as a tyrosine-substituted strain). Furthermore, the 942nd adenine was replaced with thymine in two other strains, whereby the 249th amino acid was replaced with leucine from histidine (hereinafter referred to as leucine-substituted strain). Furthermore, in another strain, the 940th cytosine was replaced with adenine, whereby the 249th amino acid was replaced with histidine to asparagine (hereinafter referred to as an asparagine-substituted strain). Among the 13 resistant mutant strains, 4 strains showed no mutation in the succinate dehydrogenase Ip subunit gene (hereinafter referred to as histidine resistant strain).
（カルボキシン耐性変異株間のカルボキシン耐性度の比較）
置換されたアミノ酸の相違によりカルボキシン耐性に違いが見られるかを確認するために、カルボキシン耐性試験を行った。カルボキシンの濃度を０、２５、５０、１００、１５０μｇ／ｍＬとしたＡＹ培地に１４×１０６／ｍＬの各上記耐性変異株の胞子を０．５μＬずつ接種し、２８℃にて２日間培養し、カルボキシン耐性度を試験した。
(Comparison of carboxin resistance between carboxin resistant mutants)
In order to confirm whether the difference in carboxin resistance was observed due to the difference in the substituted amino acids, a carboxin resistance test was performed. Inoculate 0.5 μL each of 14 × 10 6 / mL spores of each of the above-mentioned resistant mutants into AY medium with carboxin concentrations of 0, 25, 50, 100, and 150 μg / mL, and culture at 28 ° C. for 2 days And carboxin resistance was tested.
各上記耐性変異株につきカルボキシンの濃度ごとにコロニー直径を測定し、カルボキシンを添加していない場合の各耐性変異株のコロニー直径を１００％とした場合の割合を計算して、耐性度の評価基準とした（図２−ａ参照）。なお、カルボキシンを添加していない場合のコロニー直径は野生株及び耐性変異株間で大きな差はなかった。同一のアミノ酸が変異した株間ではカルボキシン耐性に差が見られなかったため、各アミノ酸変異株の代表株（アスパラギン置換株＃１４、ロイシン置換株＃９、チロシン置換株＃４）及びヒスチジン耐性株＃３、並びに野生株（ＷＴ）のコロニー形成の様子を図２−ｂに示す。４種の耐性変異株のうちロイシン置換株とアスパラギン置換株のカルボキシン耐性がもっとも強いレベルであった。次にチロシン置換株が強い耐性度を示したが、ヒスチジン耐性株は、野生株に比べ明確な耐性を示すものの、そのレベルは他の耐性変異株の中ではもっとも低かった。この結果、野生株が強く生育阻害を示す５０μｇ／ｍＬカルボキシンが添加された培地を用いれば、変異型コハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子をカルボキシン耐性選択マーカーとして利用でき、その際、耐性度がもっとも強かったロイシン又はアスパラギンに置換したタイプの遺伝子の使用がもっとも適切であることが判明した。 The colony diameter is measured for each of the above-mentioned resistant mutants for each concentration of carboxin, and the ratio when the colony diameter of each resistant mutant is 100% when no carboxin is added is calculated. Evaluation criteria were used (see FIG. 2-a). The colony diameter when no carboxin was added was not significantly different between the wild strain and the resistant mutant. Since there was no difference in carboxin resistance between strains in which the same amino acid was mutated, representative strains of each amino acid mutant (asparagine substitution strain # 14, leucine substitution strain # 9, tyrosine substitution strain # 4) and histidine resistance strain # 3 and the colony formation of the wild strain (WT) are shown in FIG. Of the four resistant mutants, the leucine-substituted and asparagine-substituted strains had the strongest levels of carboxin resistance. Next, tyrosine-substituted strains showed strong resistance, but histidine-resistant strains showed clear resistance compared to wild-type strains, but the level was the lowest among other resistant mutants. As a result, using a medium supplemented with 50 μg / mL carboxin that strongly inhibits the growth of wild strains, the mutant succinate dehydrogenase Ip subunit gene can be used as a carboxin resistance selection marker. It has been found that the use of the gene of the type with the strongest leucine or asparagine substitution is most appropriate.
（カルボキシン耐性選択マーカーを組み込んだベクターの構築）
上記のロイシン又はアスパラギンに置換したタイプの遺伝子のベクターへの組込みを試みた。まず、２４９番目のヒスチジンがロイシンに置換されたコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子につき、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーとして、プライマー５（フォワード）（5’-CAGTGGGCTGGCTTATAGTGGA-3’; 配列番号８）とプライマー６（リバース）（5’- CTTGGAGACCACCTTGAGACAACTTA -3’ ; 配列番号９）を使用した。ＰＣＲサイクルの条件は、９４℃にて２分の後、９４℃にて１５秒、６０℃にて３０秒、６８℃にて３分を３５サイクルした後、６８℃にて７分処理し、１５℃で保存した。その結果、約３Ｋｂのゲノム遺伝子産物を得た。
(Construction of vector incorporating carboxin resistance selection marker)
An attempt was made to incorporate into the vector a gene of the type replaced with the above leucine or asparagine. First, succinate dehydrogenase Ip subunit gene in which the 249th histidine was replaced with leucine was subjected to PCR using KOD-Plus- as a DNA polymerase. As PCR primers, primer 5 (forward) (5′-CAGTGGGCTGGCTTATAGTGGA-3 ′; SEQ ID NO: 8) and primer 6 (reverse) (5′-CTTGGAGACCACCTTGAGACAACTTA -3 ′; SEQ ID NO: 9) were used. The PCR cycle conditions were 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 3 minutes, 35 cycles, then 68 ° C for 7 minutes, Stored at 15 ° C. As a result, a genomic gene product of about 3 Kb was obtained.
得られたＰＣＲ産物をプロメガのＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍで精製し、それを制限酵素EcoRIとBglIIとを用いて３７℃にて１５時間処理した。かかる処理によって得られたＤＮＡ断片に対し、EcoRIとBamHIで処理したｐＳＰ７２ベクター（プロメガ社製）を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社製）を用いて１６℃にて７時間反応した反応液を大腸菌に形質転換した。この組換えプラスミドを持つ大腸菌からプラスミドを精製し、正確にカルボキシン耐性遺伝子を有することを、精製したプラスミドベクターの塩基配列を決定することにより確認した。このプラスミドをｐＣＢＲ−Ｌ（ロイシン置換型プラスミド）とした。 The resulting PCR product was purified with Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System and treated with restriction enzymes EcoRI and BglII at 37 ° C. for 15 hours. The DNA fragment obtained by this treatment was mixed with pSP72 vector (Promega) treated with EcoRI and BamHI, and the reaction solution was reacted at 16 ° C. for 7 hours using T4 DNA ligase (Promega). Was transformed. The plasmid was purified from Escherichia coli having this recombinant plasmid, and it was confirmed by accurately determining the nucleotide sequence of the purified plasmid vector that it had a carboxin resistance gene. This plasmid was designated as pCBR-L (leucine-substituted plasmid).
上記と同様の方法で、２４９番目のヒスチジンがアスパラギン置換されたコハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子を、ｐＳＰ７２ベクターに組み込み、かかるプラスミドをｐＣＢＲ−Ｎ（アスパラギン置換型プラスミド）とした。 In the same manner as described above, the succinate dehydrogenase Ip subunit gene in which the 249th histidine was substituted with asparagine was incorporated into the pSP72 vector, and this plasmid was designated as pCBR-N (asparagine-substituted plasmid).
（プロトプラスト−ＰＥＧ法によるアスペルギルス属に属する微生物の形質転換）
上記で得られた２種類のプラスミドをベクターとして、プロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０及びアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９の形質転換を試みた。まず、アスペルギルス・オリゼをＣＤ液体培地（ツアペックドックス液体培地；１％グルコース、０．６％硝酸ナトリウム、０．０５２％塩化カリウム、０．１５２％リン酸二水素カリウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％硫酸鉄、０．８８％硫酸亜鉛、０．０４％硫酸銅、０．０１％ホウ酸ナトリウム、０．００５％モリブデン酸アンモニウム、水酸化カリウムにてｐＨ６．５に調整）で２８℃にて、１８〜２０時間静置培養後、ガラスビーズ（５ｍｍ〜６ｍｍ；三商社製）を加え、３０℃にて２４時間振とう培養した。続いて菌糸をガラスフィルター（１Ｇ）でろ過して回収し、滅菌水と０．８Ｍ食塩水で洗浄した。十分に脱水後、菌体を１０ｍＬプロトプラスト化溶液〔０．８Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５ｍｇ／ｍＬヤタラーゼ（宝酒造株式会社製）、１０ｍｇ／ｍＬセルラーゼ（ヤクルト社製）、１ｍＭ ＤＴＴ〕に懸濁した。３０℃にて振とうさせながら２時間反応させた後、ミラクロス（２２〜２５μｍ；CALBIOCHEM社製）でろ過し、ろ液を２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、ソリューション１（０．８Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）を１ｍＬ添加し、再度遠心した。プロトプラストが２×１０8／ｍＬとなるようにソリューション１を加え、０．２容量のソリューション２（４０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）、５０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）と１ｍＭとなるようにＤＴＴを加え、よく混合した。０．１ｍＬプロトプラスト溶液につき５μｇ又は１０μｇのｐＣＢＲ−Ｌ又はｐＣＢＲ−Ｎを加えた。氷上で３０分放置後、０．５ｍＬのソリューション２を加え、室温で２０分放置した。その後、５ｍＬのソリューション１を加えてよく混合後、２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除いた後、沈殿した細胞を０．１５ｍＬのソリューション１に懸濁した。カルボキシンを濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように添加したＡＹプレート培地（６５６ｍＭ塩化ナトリウムを含む）の中央に５０μＬの細胞懸濁液を置いた。これに、カルボキシンの濃度を５０μｇ／ｍＬとしたＡＹ軟寒天培地（１４４ｍＭ酢酸ｐＨ６．５、０．５%イーストエキストラクト、０．５％軟寒天、６５６ｍＭ塩化ナトリウム）を煮沸により溶解後、約４０℃に冷まし、５ｍＬをＡＹプレート培地上の細胞懸濁液に加え、混合したのち固まるまで静置した。ＡＹ培地とＡＹ軟寒天培地に撒かれた細胞懸濁液を２８℃にて４〜５日間培養した。その結果、アスペルギルス・オリゼのカルボキシン耐性を獲得した転換体を得ることができた。アスペルギルス・パラシチカスについてもプロトプラスト化溶液に２０ｍｇ／ｍＬのヤタラーゼを用い、カルボキシンの濃度を７５μｇ／ｍＬとしたことの他は、上記アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０と同様の方法で、カルボキシン耐性を獲得した転換体を得ることができた。
(Transformation of microorganisms belonging to the genus Aspergillus by protoplast-PEG method)
Using the two types of plasmids obtained above as vectors, transformation of Aspergillus oryzae RIB40 and Aspergillus parasites NRRL 2999 was attempted using the protoplast-PEG method. First, Aspergillus oryzae was added to a CD liquid medium (Tuapec Docs liquid medium; 1% glucose, 0.6% sodium nitrate, 0.052% potassium chloride, 0.152% potassium dihydrogen phosphate, 2 mM magnesium sulfate, 0. 1% iron sulfate, 0.88% zinc sulfate, 0.04% copper sulfate, 0.01% sodium borate, 0.005% ammonium molybdate, adjusted to pH 6.5 with potassium hydroxide) Then, after static culture for 18 to 20 hours, glass beads (5 to 6 mm; manufactured by Sansho Co., Ltd.) were added, and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours. Subsequently, the mycelium was collected by filtration through a glass filter (1G), and washed with sterilized water and 0.8 M saline. After sufficient dehydration, the microbial cells were treated with 10 mL protoplast solution [0.8 M sodium chloride, 10 mM sodium phosphate buffer, 15 mg / mL Yatarase (Takara Shuzo), 10 mg / mL cellulase (Yakult), 1 mM DTT) It was suspended in. After reacting for 2 hours while shaking at 30 ° C., the mixture was filtered with Miracloth (22-25 μm; manufactured by CALBIOCHEM), and the filtrate was centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded, and 1 mL of Solution 1 (0.8 M sodium chloride, 10 mM calcium chloride, 10 mM Tris-HCl pH 8.0) was added and centrifuged again. Solution 1 is added so that the protoplast is 2 × 10 8 / mL, and 0.2 mM of Solution 2 (40% (W / V) polyethylene glycol (PEG 4000), 50 mM calcium chloride, 50 mM Tris-HCl) is added to 1 mM. Add DTT and mix well. 5 μg or 10 μg of pCBR-L or pCBR-N was added per 0.1 mL protoplast solution. After 30 minutes on ice, 0.5 mL of Solution 2 was added and left at room temperature for 20 minutes. Thereafter, 5 mL of Solution 1 was added and mixed well, followed by centrifugation at 2,000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, the precipitated cells were suspended in 0.15 mL of Solution 1. 50 μL of the cell suspension was placed in the center of AY plate medium (containing 656 mM sodium chloride) supplemented with carboxin to a concentration of 50 μg / mL. To this was dissolved an AY soft agar medium (144 mM acetic acid pH 6.5, 0.5% yeast extract, 0.5% soft agar, 656 mM sodium chloride) having a concentration of carboxin of 50 μg / mL by boiling. The mixture was cooled to 40 ° C., 5 mL was added to the cell suspension on the AY plate medium, mixed and allowed to stand until solidified. Cell suspensions seeded in AY medium and AY soft agar medium were cultured at 28 ° C. for 4-5 days. As a result, it was possible to obtain a transformant that acquired the resistance of Aspergillus oryzae to carboxin. Aspergillus parasites was also converted in a manner similar to that of Aspergillus oryzae RIB40 except that 20 mg / mL yatalase was used in the protoplastization solution and the concentration of carboxin was 75 μg / mL. I was able to get a body.
（簡便な組換え体の検出方法）
遺伝子組換えによってカルボキシン耐性を獲得した、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０及びアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９について、カルボキシン耐性遺伝子が導入されたかどうかの確認を試みた。
(Simple recombinant detection method)
For Aspergillus oryzae RIB40 and Aspergillus parasites NRRL2999 that acquired carboxin resistance by genetic recombination, it was attempted to confirm whether the carboxin resistance gene was introduced.
変異遺伝子が導入されたかどうかを確認するためにＤＮＡの解析が必要である場合がある。なぜならば、内在の遺伝子が組換え処理中に突然変異を起こし、カルボキシン耐性を獲得することも大変低いが可能性があるためである。しかし、変異遺伝子はもともと内在の遺伝子の１塩基置換であるため、通常のＰＣＲ法では区別をつけることは困難であり、時間がかかり作業が煩雑なサザン解析でしかその確認ができない。そこで迅速に組換え法で導入した遺伝子を検出するために、カルボキシン耐性遺伝子がコードするアミノ酸配列を代えず、１塩基を置換することにより制限酵素MspI認識部位の導入を試みた（図３参照）。 DNA analysis may be necessary to confirm whether the mutated gene has been introduced. This is because the endogenous gene is mutated during the recombination process to acquire carboxin resistance, although it is very unlikely. However, since a mutated gene is originally a single base substitution of an endogenous gene, it is difficult to distinguish by a normal PCR method, and it can be confirmed only by Southern analysis, which is time consuming and complicated. Therefore, in order to quickly detect a gene introduced by a recombinant method, an attempt was made to introduce a restriction enzyme MspI recognition site by replacing one base without changing the amino acid sequence encoded by the carboxin resistance gene (see FIG. 3). ).
ｐＣＢＲ−Ｌを制限酵素StyI（EcoT14Ｉ）を用いて３７℃にて１１時間処理し、６３塩基を除いたＤＮＡ断片を作製した。この除いた部分に相当するＤＮＡ配列に対して１塩基置換によりMspI認識部位を創出したＤＮＡ断片を合成するために、センスオリゴヌクレオチド（5’-ACGCCTTGGATAACAGCATGAGCGTCTACCGGTGCCTCACCATTCTTA-3’配列番号１０）（図４に示されるように、配列の下線部は左からStyI、MspI、及び変異が入った塩基配列でコードされるアミノ酸のロイシン（ＣＴＣ）を含む）と、アンチセンスオリゴヌクレオチド
（5’-GACCCTTGGGGCAAGTCCGCGAGCAGTTAAGAATGGT-3’; 配列番号１２）を作製し、これらを混合した後、プロメガのＰＣＲマスターミックスを用いて下記の反応により二本鎖ＤＮＡを合成した（図４参照）。反応条件は、９４℃にて３０秒の後、３７℃にて３分、７２℃にて１分であった。得られた断片をStyIを用いて３７℃にて１３時間処理し、エタノール沈殿して精製した。これをStyIで処理したｐＣＢＲ−ＬにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃にて、４時間処理してライゲーションし、この反応液を大腸菌に形質転換した。この組換えプラスミドを持つ大腸菌からプラスミドを精製し、正確に置き換えたＤＮＡ断片を有することを精製したプラスミドの塩基配列を決定することにより確認した。このプラスミドをロイシン置換型のｐＣＢＲ−ＬＭとした。また、センスオリゴヌクレオチド（5’-ACGCCTTGGATAACAGCATGAGCGTCTACCGGTGCAACACCATTCTTA-3’;配列番号１１）（配列番号１０と同様に、左からStyI、MspIを含む。また、変異が入った塩基配列でコードされるアミノ酸のアスパラギン（ＡＡＣ）を含む）を用いたことのほかは上記と同様の方法で、アスパラギン置換型のｐＣＢＲ−ＮＭを作製した。アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・パラシチカスＮＲＲＬ２９９９に対しｐＣＢＲ−ＬＭ又はｐＣＢＲ−ＮＭを上記プロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて形質転換を行った。選択培地上に増殖した耐性コロニーから菌体を取って５０μｇ／ｍＬのカルボキシン入りのＡＹ培地上で２８℃にて２日間培養して、安定した耐性が得られた株を選抜した。増殖した菌体から簡便な核酸抽出法（Wen et al., Appl. Environ. Microbiol., 71,3192-3198 (2005)）を用い、ゲノムＤＮＡを抽出した。野生型株のゲノムＤＮＡも同様に抽出を行った。抽出したゲノムＤＮＡに対しプロメガのＰＣＲマスターミックスを用いてＰＣＲを行い、コハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニット遺伝子の増幅を試みた。ＰＣＲのプライマーは、プライマー７（フォワード）（配列番号１３）（5’- CTGGTGCCCGATCTGAC -3’）とプライマー８（リバース）（5’-GCCGATCCATAACCTTCA -3’; 配列番号１４）を使用した。ＰＣＲサイクルの条件は、９５℃にて４分の後、９５℃にて３０秒、５６℃にて３０秒、７２℃にて５０秒を３０サイクルした後、７２℃にて７分処理し、１５℃で保存した。その結果、野生型株、形質転換株とも約０．８３Ｋｂのゲノム遺伝子産物が増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素MspIを用いて３７℃にて１８時間ほど処理し、それをアガロースゲルで電気泳動した（図５参照）。その結果、試験した全てのカルボキシン耐性株において、約０．４６Ｋｂと約０．３７Ｋｂのバンドが得られた一方で、野生型株ではこれらの切断断片は生じなかった。この結果から、カルボキシン耐性株はすべて組換え体であることが確認された（表２参照）。アスペルギルス・オリゼの形質転換効率は表３に、アスペルギルス・パラシチカスの形質転換効率は表４に示す。
pCBR-L was treated with the restriction enzyme StyI (EcoT14I) at 37 ° C. for 11 hours to prepare a DNA fragment excluding 63 bases. In order to synthesize a DNA fragment in which an MspI recognition site was created by substituting one base for the DNA sequence corresponding to this excluded portion, a sense oligonucleotide (5′-ACG CCTTGG ATAACAGCATGAGCGTCTA CCGG TGC CTC ACCATTCTTA-3 ′ SEQ ID NO: 10 (As shown in FIG. 4, the underlined portion of the sequence includes, from the left, StyI, MspI, and the amino acid leucine (CTC) encoded by the mutation-containing nucleotide sequence) and an antisense oligonucleotide (5 ′ -GACCCTTGGGGCAAGTCCGCGAGCAGTTAAGAATGGT-3 '; SEQ ID NO: 12) were prepared, mixed, and then double-stranded DNA was synthesized by the following reaction using Promega PCR master mix (see FIG. 4). The reaction conditions were 94 ° C for 30 seconds, 37 ° C for 3 minutes, and 72 ° C for 1 minute. The obtained fragment was treated with StyI at 37 ° C. for 13 hours, and purified by ethanol precipitation. This was treated with StyI-treated pCBR-L using T4 DNA ligase at 16 ° C. for 4 hours for ligation, and this reaction solution was transformed into E. coli. The plasmid was purified from Escherichia coli having this recombinant plasmid, and it was confirmed by determining the nucleotide sequence of the purified plasmid that it had a DNA fragment that was correctly replaced. This plasmid was designated as leucine-substituted pCBR-LM. In addition, sense oligonucleotide (5′-ACG CCTTGG ATAACAGCATGAGCGTCTA CCGG TGC AAC ACCATTCTTA-3 ′; SEQ ID NO: 11) (Sequence No. 10 includes StyI and MspI from the left. Asparagine-substituted pCBR-NM was prepared in the same manner as described above except that the amino acid used was asparagine (including AAC). Aspergillus oryzae or Aspergillus parasites NRRL2999 was transformed with pCBR-LM or pCBR-NM using the protoplast-PEG method. Bacteria were collected from resistant colonies grown on the selective medium and cultured at 28 ° C. for 2 days on an AY medium containing 50 μg / mL carboxin to select a strain with stable resistance. Genomic DNA was extracted from the grown cells using a simple nucleic acid extraction method (Wen et al., Appl. Environ. Microbiol., 71, 3192-3198 (2005)). Wild-type genomic DNA was extracted in the same manner. PCR was performed on the extracted genomic DNA using a Promega PCR master mix to attempt amplification of the succinate dehydrogenase Ip subunit gene. Primers 7 (forward) (SEQ ID NO: 13) (5′-CTGGTGCCCGATCTGAC -3 ′) and primer 8 (reverse) (5′-GCCGATCCATAACCTTCA -3 ′; SEQ ID NO: 14) were used as PCR primers. The PCR cycle conditions were as follows: 95 ° C for 4 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 50 seconds, then treated at 72 ° C for 7 minutes, Stored at 15 ° C. As a result, a genomic gene product of about 0.83 Kb was amplified in both the wild type strain and the transformed strain. The obtained PCR product was treated with the restriction enzyme MspI at 37 ° C. for about 18 hours and electrophoresed on an agarose gel (see FIG. 5). As a result, bands of about 0.46 Kb and about 0.37 Kb were obtained in all the carboxin resistant strains tested, whereas these cut fragments were not generated in the wild type strain. From this result, it was confirmed that all the carboxin resistant strains were recombinant (see Table 2). Table 3 shows the transformation efficiency of Aspergillus oryzae, and Table 4 shows the transformation efficiency of Aspergillus parasite.
Claims (17)
（１）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４９番目のヒスチジンが、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、さらに２４９番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸を炭素源とする培地でカルボキシン感受性微生物にカルボキシン耐性を付与する機能を有するタンパク質 DNA encoding the following protein (1) or (2).
(1) a protein comprising an amino acid sequence in which the 249th histidine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is substituted with another amino acid (2) the 249th in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing In the amino acid sequence in which histidine is substituted with another amino acid, one or several amino acids other than the 249th amino acid sequence are substituted, deleted, or added, and carboxylate in a medium containing acetic acid as a carbon source. Proteins that have the function of imparting carboxin resistance to sensitive microorganisms
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