JP2009112225A - Skin model structure - Google Patents
Skin model structure Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009112225A JP2009112225A JP2007287663A JP2007287663A JP2009112225A JP 2009112225 A JP2009112225 A JP 2009112225A JP 2007287663 A JP2007287663 A JP 2007287663A JP 2007287663 A JP2007287663 A JP 2007287663A JP 2009112225 A JP2009112225 A JP 2009112225A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- cells
- skin
- epidermal basal
- layer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 209
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 119
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 49
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 23
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 37
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 37
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 claims description 20
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 14
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 90
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 81
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 102000007236 involucrin Human genes 0.000 description 12
- 108010033564 involucrin Proteins 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 102000004958 Caspase-14 Human genes 0.000 description 10
- 108090001132 Caspase-14 Proteins 0.000 description 10
- 108700038219 Syntaxin-2 Proteins 0.000 description 10
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 9
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 9
- 102100035936 Syntaxin-2 Human genes 0.000 description 9
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 9
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 7
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 7
- 102100040445 Keratin, type I cytoskeletal 14 Human genes 0.000 description 7
- 102100025756 Keratin, type II cytoskeletal 5 Human genes 0.000 description 7
- 108010066321 Keratin-14 Proteins 0.000 description 7
- 108010070553 Keratin-5 Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 102100022905 Keratin, type II cytoskeletal 1 Human genes 0.000 description 6
- 101710194922 Keratin, type II cytoskeletal 1 Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 3
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 3
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000008202 epithelial morphogenesis Effects 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 102100031784 Loricrin Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102100027184 Periplakin Human genes 0.000 description 2
- 101710202907 Periplakin Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 108010079309 loricrin Proteins 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000751 Ceramidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000009331 Experimental Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- -1 For example Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000642676 Homo sapiens Syntaxin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100023970 Keratin, type I cytoskeletal 10 Human genes 0.000 description 1
- 101710183404 Keratin, type I cytoskeletal 10 Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 101000642675 Mus musculus Syntaxin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000030412 Plakin Human genes 0.000 description 1
- 108091000120 Plakin Proteins 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100038094 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E Human genes 0.000 description 1
- 101710182788 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E Proteins 0.000 description 1
- 102100030944 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase K Human genes 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- VGPYEHKOIGNJKV-UHFFFAOYSA-N asulam Chemical group COC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 VGPYEHKOIGNJKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009421 cellmass formation Effects 0.000 description 1
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000000736 corneocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 102000045329 human STX2 Human genes 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108010058734 transglutaminase 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、皮膚モデル構築物に関する。より詳しくは、本発明は、皮膚モデル構築物、前記皮膚モデル構築物の製造方法及び皮膚の分化のシミュレーション方法に関する。 The present invention relates to a skin model construct. More specifically, the present invention relates to a skin model construct, a method for producing the skin model construct, and a skin differentiation simulation method.
動物において、細胞分化や形態形成に際しては、種々の因子が発現していることが知られている。例えば、マウスにおいて、集塊状で培養された間充織細胞では、上皮の形態形成が行なわれるが、偏平な細胞形態をとる単層で培養された間充織細胞では、上皮の形態形成が行なわれないことが知られている。マウスにおける前記上皮の形態形成に関与する因子として、集塊状で培養された間充織細胞で産生され、偏平な細胞形態をとる単層で培養された間充織細胞では産生されないエピモルフィンが単離されている（特許文献１を参照）。さらに、前記特許文献１には、マウスのエピモルフィンのホモログとして、ヒトのエピモルフィンが開示されている。 It is known that various factors are expressed in animal differentiation and morphogenesis in animals. For example, in mice, epithelial morphogenesis occurs in mesenchymal cells cultured in agglomerated form, whereas epithelial morphogenesis occurs in mesenchymal cells cultured in a monolayer that assumes a flat cell morphology. It is known not to. As a factor involved in the epithelial morphogenesis in the mouse, epimorphin produced by a mesenchymal cell cultured in agglomerated form and not produced by a mesenchymal cell cultured in a monolayer having a flat cell shape is single. (See Patent Document 1). Further, Patent Document 1 discloses human epimorphin as a homolog of mouse epimorphin.
一方、皮膚の疾患の発症機構の解明や前記疾患の治療又は予防薬の開発には、疾患モデル動物や、三次元培養皮膚モデル（非特許文献１、非特許文献２を参照のこと）が用いられている。 On the other hand, disease model animals and three-dimensional cultured skin models (see Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2) are used to elucidate the onset mechanism of skin diseases and develop therapeutic or preventive drugs for the diseases. It has been.
しかしながら、前記疾患モデル動物の場合、個体間でのバラツキが大きく、多検体のスクリーニングに十分な再現性を得ることが困難であるという欠点がある。さらに、前記疾患モデル動物の場合、ヒトにおける特定の疾患状態を示すモデルの樹立が困難である場合があり、疾患モデルの種類そのものが少ないという欠点がある。 However, in the case of the disease model animal, there is a drawback that variation among individuals is large and it is difficult to obtain sufficient reproducibility for screening of multiple specimens. Furthermore, in the case of the disease model animal, it may be difficult to establish a model showing a specific disease state in humans, and there is a drawback that there are few types of disease models themselves.
また、非特許文献１及び非特許文献２記載の三次元培養皮膚モデルは、培養法が確立されている正常表皮細胞を、線維芽細胞を含むコラーゲンゲル層などの支持体に播種し、三次元に培養して、層形成を行なうことにより、正常状態の皮膚構造を擬した構造を構築したモデルである。そのため、非特許文献１及び非特許文献２記載の三次元培養皮膚モデルは、前記疾患モデル動物に比べて、モデル間のバラツキが小さいため、多検体のスクリーニングに適した再現性を得ることができる。しかしながら、非特許文献１及び非特許文献２記載の三次元培養皮膚モデルは、製造に際して、層形成による正常状態の皮膚構造を擬した構造の構築に時間がかかるという欠点がある。
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、皮膚モデル構築物を、短時間で簡便に製造することができる、皮膚モデル構築物の製造方法を提供することを１つの目的とする。また、本発明は、短時間で簡便に製造することができ、種々の皮膚状態を簡便に再現することができる、皮膚モデル構築物を提供することを他の目的とする。本発明は、短時間で簡便に皮膚の分化をシミュレーションすることができる、皮膚の分化のシミュレーション方法を提供することをさらに他の目的とする。 This invention is made | formed in view of the said prior art, and it aims at providing the manufacturing method of a skin model construct which can manufacture a skin model construct simply in a short time. Another object of the present invention is to provide a skin model construct that can be easily produced in a short time and that can easily reproduce various skin conditions. It is still another object of the present invention to provide a skin differentiation simulation method that can easily simulate skin differentiation in a short time.
すなわち、本発明の要旨は、
（１） 表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することを特徴とする皮膚モデル構築物の製造方法、
（２） 前記表皮基底細胞が、外因的に核酸が導入された遺伝子導入表皮基底細胞である前記（１）記載の皮膚モデル構築物の製造方法、
（３） 前記支持体が、コラーゲンゲルである前記（１）又は（２）に記載の皮膚モデル構築物の製造方法。
（４） 前記（１）〜（３）いずれかに記載の製造方法により得られる皮膚モデル構築物、
（５） 表皮基底細胞と前記表皮基底細胞の分化細胞とを含む細胞クラスターからなり、
前記細胞クラスターの最表部に形成され、前記表皮基底細胞を含有した基底層と、
前記基底層の内側に形成され、前記表皮基底細胞の分化細胞を含有した分化細胞層と
を有してなり、
前記分化細胞層の内側に空間が形成されてなる皮膚モデル構築物、
（６） 前記分化細胞層が、前記基底層の内側に形成され、有棘細胞を含有した有棘層と、
前記有棘層の内側に形成され、顆粒細胞を含有した顆粒層と、
前記顆粒層の内側に形成された角化層と
からなる前記（５）記載の皮膚モデル構築物、並びに
（７） 表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することを特徴とする皮膚の分化のシミュレーション方法、
に関する。
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) A method for producing a skin model construct, comprising culturing cell aggregates of epidermal basal cells in a support body containing a component of an extracellular matrix and serving as a scaffold,
(2) The method for producing a skin model construct according to (1), wherein the epidermal basal cells are gene-introduced epidermal basal cells into which a nucleic acid has been introduced exogenously,
(3) The manufacturing method of the skin model structure as described in said (1) or (2) whose said support body is a collagen gel.
(4) A skin model construct obtained by the production method according to any one of (1) to (3),
(5) a cell cluster comprising epidermal basal cells and differentiated cells of the epidermal basal cells,
A basal layer formed on the outermost part of the cell cluster and containing the epidermal basal cells;
A differentiated cell layer formed inside the basal layer and containing differentiated cells of the epidermal basal cell,
A skin model construct in which a space is formed inside the differentiated cell layer,
(6) The spinous layer, wherein the differentiated cell layer is formed inside the basal layer and contains spinous cells;
A granule layer formed inside the barbed layer and containing granule cells;
The skin model construct according to (5), comprising a keratinized layer formed inside the granule layer, and (7) a cell aggregate of epidermal basal cells containing an extracellular matrix component, and a scaffold A method of simulating the differentiation of skin, characterized by culturing in a support body,
About.
本発明の皮膚モデル構築物の製造方法は、皮膚モデル構築物を、短時間で簡便に製造することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の皮膚モデル構築物は、短時間で簡便に製造することができ、種々の皮膚状態を簡便に再現することができるという優れた効果を奏する。本発明の皮膚の分化のシミュレーション方法は、短時間で簡便に皮膚の分化をシミュレーションすることができるという優れた効果を奏する。 The method for producing a skin model construct of the present invention has an excellent effect that the skin model construct can be easily produced in a short time. In addition, the skin model construct of the present invention can be easily produced in a short time, and has an excellent effect that various skin states can be easily reproduced. The skin differentiation simulation method of the present invention has an excellent effect that skin differentiation can be simulated easily in a short time.
本発明の皮膚モデル構築物の製造方法は、表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することを特徴としている。したがって、本発明の製造方法は、皮膚モデル構築物を、短時間で簡便に製造することができるという優れた効果を奏する。 The method for producing a skin model construct of the present invention is characterized in that cell aggregates of epidermal basal cells are cultured in a support containing an extracellular matrix component and serving as a scaffold. Therefore, the production method of the present invention has an excellent effect that the skin model construct can be easily produced in a short time.
また、本発明の製造方法では、表皮基底細胞の細胞凝集物を前記支持体内で培養するため、本発明の製造方法は、従来の三次元培養皮膚モデルの製造方法のように、例えば、線維芽細胞を含む支持体を用いることに比べ、より均質化された条件下で行なうことができる。これにより、本発明の製造方法は、皮膚モデル構築物を、再現性よく実質的に均質に製造することができるという優れた効果を奏する。 Further, in the production method of the present invention, cell aggregates of epidermal basal cells are cultured in the support. Therefore, the production method of the present invention is, for example, a fibroblast as in the conventional method of producing a three-dimensional cultured skin model. Compared to using a support containing cells, it can be performed under more homogenized conditions. Thereby, the manufacturing method of this invention has the outstanding effect that a skin model structure can be manufactured substantially homogeneously with high reproducibility.
表皮基底細胞の細胞凝集物は、例えば、表皮基底細胞を細胞との接着性の極めて低い表面上で旋回培養すること、細胞との接着性の極めて低い容器で静置培養することなどにより得られる。前記旋回培養は、水平面上の回転運動を培養容器に負荷することにより行なわれる。なお、前記細胞との接着性は、細胞を播種後、少なくとも１時間、好ましくは細胞塊形成が完了する１０時間以上、静置させても表面に接着しない程度であればよい。 Cell aggregates of epidermal basal cells can be obtained, for example, by rotating and culturing epidermal basal cells on a surface with extremely low adhesion to cells, or stationary culture in a container with extremely low adhesion to cells. . The swivel culture is performed by loading a culture vessel with a rotational motion on a horizontal plane. The adhesion to the cells may be such that it does not adhere to the surface even if the cells are allowed to stand for at least 1 hour after seeding, preferably 10 hours or more after completion of cell mass formation.
前記旋回培養における旋回速度は、細胞凝集物を良好に形成させる観点から、好ましくは１０ｒｐｍ以上、より好ましくは５０ｒｐｍ以上であり、細胞の状態を良好に維持する観点から、好ましくは１８０ｒｐｍ以下、より好ましくは１５０ｒｐｍ以下である。 The rotation speed in the rotation culture is preferably 10 rpm or more, more preferably 50 rpm or more from the viewpoint of favorably forming cell aggregates, and preferably 180 rpm or less, more preferably from the viewpoint of maintaining a good cell state. Is 150 rpm or less.
前記旋回培養における二酸化炭素（ＣＯ2）濃度は、適宜設定することができる。前記ＣＯ2濃度は、好ましくは５体積％である。 The carbon dioxide (CO 2 ) concentration in the swirl culture can be set as appropriate. The CO 2 concentration is preferably 5% by volume.
前記旋回培養における培養温度は、細胞を良好に生育させる観点から、好ましくは３６℃〜３８℃、より好ましくは３６．５℃〜３７．５℃（例えば、３７℃など）である。 The culture temperature in the swirl culture is preferably 36 ° C. to 38 ° C., more preferably 36.5 ° C. to 37.5 ° C. (for example, 37 ° C., etc.) from the viewpoint of favorably growing the cells.
前記表皮基底細胞の旋回培養に用いられる培地は、表皮基底細胞の生育に適した培地であればよい。前記培地としては、特に限定されないが、例えば、熱不活性化血清（例えば、熱不活性化ＦＣＳなど）を含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）とＨａｍＦ１２との混合培地（熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地）、熱不活性化血清を含むＤＭＥＭ培地、熱不活性化血清を含むＭＥＭ培地などが挙げられる。なかでも、細胞のコロニー増殖に適する観点から、好ましくは熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地である。なお、前記熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地は、遺伝子導入表皮基底細胞の三次元培養に際して当該熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地を用いた場合、例えば、特定の物質に対する抗体により当該物質を阻害する操作を行なうことが可能になり、疾患の発症機構の解明や前記疾患の治療又は予防薬の開発への応用性に優れる点で有利である。 The medium used for the rotation culture of the epidermal basal cells may be any medium suitable for the growth of epidermal basal cells. The medium is not particularly limited. For example, a mixed medium of Dulbecco's modified medium (DMEM) containing heat-inactivated serum (for example, heat-inactivated FCS) and HamF12 (DMEM / containing heat-inactivated FCS) HamF12 medium), DMEM medium containing heat-inactivated serum, MEM medium containing heat-inactivated serum, and the like. Among these, from the viewpoint of being suitable for cell colony growth, a heat-inactivated FCS-containing DMEM / HamF12 medium is preferable. When the heat-inactivated FCS-containing DMEM / HamF12 medium is used in the three-dimensional culture of the transgenic epidermal basal cells, the heat-inactivated FCS-containing DMEM / HamF12 medium can be obtained, for example, by an antibody against a specific substance. It is possible to perform an operation for inhibiting a substance, which is advantageous in that it is excellent in applicability to elucidation of the onset mechanism of a disease and the development of a therapeutic or preventive drug for the disease.
前記旋回培養における培養容器には、細胞凝集物を形成させる観点から、細胞との接着性が低い培養容器、好ましくは細胞非接着性の培養容器が用いられる。 From the viewpoint of forming cell aggregates, a culture vessel with low adhesion to cells, preferably a cell non-adhesive culture vessel, is used as the culture vessel in the swirl culture.
前記旋回培養における培養時間は、用いられる表皮基底細胞の種類に応じて適宜設定することができる The culture time in the swirl culture can be appropriately set according to the type of epidermal basal cells used.
前記表皮基底細胞としては、表皮の基底層を構成する細胞であればよく、ケラチノサイト及びメラノサイトが挙げられる。前記表皮基底細胞は、ケラチノサイト単独又はメラノサイト単独であってもよく、ケラチノサイトとメラノサイトとの混合物であってもよい。 The epidermal basal cells may be cells constituting the basal layer of the epidermis, and include keratinocytes and melanocytes. The epidermal basal cells may be keratinocytes alone or melanocytes alone or a mixture of keratinocytes and melanocytes.
前記表皮基底細胞としては、特に限定されないが、例えば、ヒト表皮基底細胞、マウス表皮基底細胞などが挙げられる。なかでも、ヒトの皮膚構造を良好に再現する観点及びヒトの皮膚の状態を十分に再現する観点から、正常に分化する能力を有したヒト表皮基底細胞が好ましい。前記ヒト表皮基底細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨａＣａＴ細胞（ブライトクロイツ（Breitkreutz D）、ヨーロピアン ジャーナル オブ セル バイオロジー(European Journal of Cell Biology)、1998年発行、第75巻、p.273-286.）、正常ヒト皮膚表皮角化細胞(ＮＨＥＫ)などが挙げられる。なかでも、前記ヒト表皮基底細胞は、細胞の性質が継代回数によらず比較的均一であり、細胞分化状態が正常である観点から、好ましくは、ＨａＣａＴ細胞が望ましい。 The epidermal basal cells are not particularly limited, and examples thereof include human epidermal basal cells and mouse epidermal basal cells. Of these, human epidermal basal cells having the ability to differentiate normally are preferable from the viewpoint of well reproducing the human skin structure and sufficiently reproducing the human skin state. The human epidermal basal cells are not particularly limited, and examples thereof include HaCaT cells (Breitkreutz D, European Journal of Cell Biology, 1998, Vol. 75, p.273. -286.), Normal human skin epidermal keratinocytes (NHEK) and the like. Among these, the human epidermal basal cells are preferably HaCaT cells from the viewpoint that the cell properties are relatively uniform regardless of the number of passages and the cell differentiation state is normal.
前記表皮基底細胞は、正常表皮基底細胞であってもよく、外因的に核酸が導入された遺伝子導入表皮基底細胞であってもよい。表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、本発明の製造方法における支持体内における前記細胞凝集物の培養の過程において、正常な表皮基底細胞から角質層の細胞への分化過程が再現される。このように、表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、本発明の製造方法によれば、正常な皮膚と同様の層を有する皮膚モデル構築物を得ることができる。また、表皮基底細胞が遺伝子導入表皮基底細胞である場合、本発明の製造方法によれば、導入された核酸に含まれる遺伝子に応じる挙動を反映する皮膚モデル構築物を得ることができる。 The epidermal basal cell may be a normal epidermal basal cell or a gene-introduced epidermal basal cell into which a nucleic acid has been introduced exogenously. When the epidermal basal cells are normal epidermal basal cells, the differentiation process from normal epidermal basal cells into stratum corneum cells is reproduced in the process of culturing the cell aggregate in the support in the production method of the present invention. Thus, when the epidermal basal cells are normal epidermal basal cells, according to the production method of the present invention, a skin model construct having a layer similar to normal skin can be obtained. When the epidermal basal cells are gene-introduced epidermal basal cells, according to the production method of the present invention, it is possible to obtain a skin model construct that reflects the behavior according to the gene contained in the introduced nucleic acid.
前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、前記正常表皮基底細胞の増殖性を維持して、良好な状態の皮膚モデル構築物を得る観点から、前記正常表皮基底細胞は、好ましくは未分化状態に維持され、かつ継代培養の回数が少ない細胞である。 When the epidermal basal cell is a normal epidermal basal cell, the normal epidermal basal cell is preferably in an undifferentiated state from the viewpoint of maintaining the proliferative property of the normal epidermal basal cell and obtaining a good skin model construct. And the number of subcultures is low.
前記遺伝子導入表皮基底細胞は、核酸を、前記正常表皮基底細胞に、外因的に導入することなどにより得ることができる。かかる遺伝子導入表皮基底細胞では、外因的に導入された前記核酸に由来するタンパク質などが発現する。 The gene-introduced epidermal basal cell can be obtained by exogenously introducing a nucleic acid into the normal epidermal basal cell. In such gene-introduced epidermal basal cells, proteins derived from the exogenously introduced nucleic acids and the like are expressed.
なお、前記遺伝子導入表皮基底細胞は、正常表皮基底細胞が有する特定の内因性タンパク質の発現量を増加又は減少させるための転写調節エレメントからなる核酸を、前記正常表皮基底細胞に、外因的に導入することなどにより得られる細胞であってもよい。かかる遺伝子導入表皮基底細胞では、正常表皮基底細胞の特定の内因性タンパク質の発現量が、正常状態での発現量に比べ増加又は減少する。 The gene-introduced epidermal basal cell exogenously introduces into the normal epidermal basal cell a nucleic acid comprising a transcriptional regulatory element for increasing or decreasing the expression level of a specific endogenous protein possessed by the normal epidermal basal cell. It may be a cell obtained by doing so. In such a transgenic epidermal basal cell, the expression level of a specific endogenous protein in the normal epidermal basal cell is increased or decreased compared to the expression level in a normal state.
前記核酸としては、特に限定されないが、発生分化制御因子の遺伝子又は前記遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、皮膚構成タンパク質の遺伝子又は前記遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、皮膚構成物質の産生に関与する因子の遺伝子又は前記遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、皮膚疾患関連因子の遺伝子又は前記遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、細胞死制御因子の遺伝子をコードする核酸、転写調節因子をコードする核酸、転写調節エレメントからなる核酸などが挙げられる。 The nucleic acid is not particularly limited, but a nucleic acid encoding a gene for a developmental differentiation regulator or a mutant gene corresponding to the gene, a gene for a skin constituent protein, a nucleic acid encoding a mutant gene corresponding to the gene, or a skin constituent A nucleic acid encoding a gene of a factor involved in the production of a gene or a mutant gene corresponding to the gene, a nucleic acid encoding a gene of a skin disease-related factor or a mutant gene corresponding to the gene, a nucleic acid encoding a gene of a cell death controlling factor , Nucleic acids encoding transcriptional regulatory factors, nucleic acids comprising transcriptional regulatory elements, and the like.
本明細書において、前記発生分化制御因子とは、分化に関与する分子であり、個体の形態形成過程で発現し、機能する因子をいう。前記発生分化制御因子の中では、好ましくは皮膚組織の分化に作用する発生分化制御因子である。また、本明細書において、皮膚構成タンパク質とは、皮膚構造を構成するタンパク質をいう。前記皮膚構成タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン、ケラチンなどが挙げられる。さらに、本明細書において、皮膚構成物質の産生に関与する因子とは、セラミド脂質などの皮膚構成物質の合成・分解に関与する酵素などが挙げられる。なお、本明細書においては、前記発生分化制御因子の概念及び皮膚構成タンパク質の概念には、それぞれ、皮膚疾患関連因子の概念が包含されていてもよい。また、前記転写調節因子とは、前記発生分化制御因子、前記皮膚構成タンパク質又は前記皮膚疾患関連因子の発現制御に関与する転写調節因子をいう。前記転写調節因子としては、特に限定されないが、例えば、Ｃ/ＥＢＰなどが挙げられる。さらに、前記転写調節エレメントとは、前記発生分化制御因子、前記皮膚構成タンパク質又は前記皮膚疾患関連因子の発現制御に関わる塩基配列からなるエレメントをいう。 In the present specification, the developmental differentiation regulator is a molecule involved in differentiation, and refers to a factor that is expressed and functions in the morphogenesis process of an individual. Among the developmental differentiation regulators, developmental differentiation regulators that act on the differentiation of skin tissue are preferable. Moreover, in this specification, a skin constituent protein means the protein which comprises a skin structure. Although it does not specifically limit as said skin constituent protein, For example, collagen, keratin, etc. are mentioned. Furthermore, in the present specification, factors involved in the production of skin constituents include enzymes involved in the synthesis and degradation of skin constituents such as ceramide lipids. In the present specification, the concept of the developmental differentiation control factor and the concept of the skin constituent protein may each include the concept of a skin disease-related factor. The transcriptional regulatory factor refers to a transcriptional regulatory factor involved in the expression control of the developmental differentiation regulator, the skin constituent protein, or the skin disease-related factor. Although it does not specifically limit as said transcriptional regulatory factor, For example, C / EBP etc. are mentioned. Furthermore, the transcriptional regulatory element refers to an element comprising a base sequence involved in the expression control of the developmental differentiation regulator, the skin constituent protein, or the skin disease-related factor.
前記核酸としては、具体的には、例えば、エピモルフィンの遺伝子をコードする核酸、コラーゲンの遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、ケラチンの遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸、セラミダーゼの遺伝子に対応する変異遺伝子をコードする核酸などが挙げられる。 Specific examples of the nucleic acid include a nucleic acid encoding an epimorphin gene, a nucleic acid encoding a mutant gene corresponding to a collagen gene, a nucleic acid encoding a mutant gene corresponding to a keratin gene, and a ceramidase gene. And a nucleic acid encoding a mutant gene corresponding to.
正常表皮基底細胞への核酸の導入は、特に限定されないが、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いる方法〔例えば、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、ザンブルーク（Sambrook）ら、コールドスプリングハーバープレス（Cold Spring Harbor Press）、1989年発行など参照）などにより行なうことができる。前記ウイルスベクターを用いる方法のなかでは、前記核酸の発現産物を安定に発現させる場合には、レトロウイルスベクターを用いる方法が望ましく、発現量を自在に制御して前記核酸の発現産物を発現させる場合、アデノウイルスベクターを用いる方法が望ましい。なお、本発明の皮膚構築物の製造方法では、前記正常表皮基底細胞への核酸の導入は、表皮基底細胞の旋回培養に際して、前記レトロウイルスベクターに前記核酸を挿入して得られたベクターを用いて得られた組換えレトロウイルスを、前記正常表皮基底細胞を含む培養物に添加して、前記組換えレトロウイルスを前記正常表皮基底細胞に感染させること、又は前記アデノウイルスベクターに前記核酸を挿入して得られたベクターを用いて得られた組換えアデノウイルスを、前記正常表皮基底細胞を含む培養物に添加して、前記組換えアデノウイルスを前記正常表皮基底細胞に感染させることにより行なうことができる。 The introduction of the nucleic acid into normal epidermal basal cells is not particularly limited. For example, a method using a viral vector such as a retroviral vector or an adenoviral vector [eg, Molecular Cloning: A Laboratory Manual] For example, see Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, published in 1989). Among the methods using the viral vector, when the expression product of the nucleic acid is stably expressed, a method using a retroviral vector is desirable, and the expression product of the nucleic acid is expressed by freely controlling the expression level. A method using an adenovirus vector is desirable. In the method for producing a skin construct of the present invention, the introduction of the nucleic acid into the normal epidermal basal cell is carried out using a vector obtained by inserting the nucleic acid into the retroviral vector during the rotation culture of the epidermal basal cell. The obtained recombinant retrovirus is added to the culture containing the normal epidermal basal cells and the normal epidermal basal cells are infected with the recombinant retrovirus, or the nucleic acid is inserted into the adenoviral vector. The recombinant adenovirus obtained using the vector obtained above is added to a culture containing the normal epidermal basal cells, and the normal adenovirus is infected with the normal epidermal basal cells. it can.
前記遺伝子導入表皮基底細胞は、得られた細胞中における導入された核酸の存在、細胞における前記核酸の発現産物の機能の発現などを指標として選択することができる。 The gene-introduced epidermal basal cell can be selected using as an index the presence of the introduced nucleic acid in the obtained cell, the expression of the function of the expression product of the nucleic acid in the cell, and the like.
前記細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体は、基底膜成分である細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ内部で表皮基底細胞を生育させることができる支持体であればよい。前記支持体としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、細胞外マトリックス成分代用物、これらの少なくとも１つを含有する合成高分子化合物などが挙げられる。前記細胞外マトリックス成分代用物としては、特に限定されないが、例えば、ＥＨＳザルコーマ（Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma）抽出物などが挙げられる。前記合成高分子化合物としては、特に限定されないが、例えば、メチルセルロース、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。また、前記支持体は、前記細胞外マトリックスの成分を含むものであれば、温度、光照射などの物理的刺激によりゾル−ゲル転移を生じるポリマーであってもよい。これらのなかでは、真皮に豊富に含まれており、高純度で均一なものが容易に、かつ安価に調製できるとともに、細胞の接着・増殖を良好に促進する観点から、好ましくは前記コラーゲンゲル、より好ましくはＩ型コラーゲンからなるコラーゲンゲルである。 The support that contains the extracellular matrix component and serves as a scaffold may be any support that contains the extracellular matrix component that is a basement membrane component and that can grow epidermal basal cells inside. . The support is not particularly limited, and examples thereof include collagen, laminin, an extracellular matrix component substitute, and a synthetic polymer compound containing at least one of these. Although it does not specifically limit as said extracellular matrix component substitute, For example, an EHS sarcoma (Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma) extract etc. are mentioned. The synthetic polymer compound is not particularly limited, and examples thereof include methyl cellulose and polyvinyl alcohol. In addition, the support may be a polymer that causes a sol-gel transition by physical stimulation such as temperature and light irradiation as long as it includes a component of the extracellular matrix. Among these, the collagen gel, which is abundantly contained in the dermis, can be prepared easily and inexpensively with high purity and uniformity, and from the viewpoint of favorably promoting cell adhesion and proliferation, preferably the collagen gel, More preferred is a collagen gel comprising type I collagen.
前記コラーゲンゲルは、前記細胞凝集物から皮膚モデル構築物を効率よく得る観点から、好ましくは前記細胞凝集物の最表部の細胞を前記コラーゲンゲルに接触させて足場依存性増殖条件下に維持しつつ、当該細胞凝集物の内部の細胞を前記コラーゲンゲルから隔離させて足場非依存性増殖条件下に維持できるゲル強度を有するゲルである。 From the viewpoint of efficiently obtaining a skin model construct from the cell aggregate, the collagen gel is preferably maintained under anchorage-dependent growth conditions by contacting the outermost cell of the cell aggregate with the collagen gel. The gel has a gel strength that allows the cells inside the cell aggregate to be isolated from the collagen gel and maintained under anchorage-independent growth conditions.
前記支持体がコラーゲンゲルである場合、前記細胞凝集物は、コラーゲンゲル内に包埋される。前記コラーゲンゲルは、例えば、氷水浴中で、表皮基底細胞の培養に適した培地の１０倍濃縮培地に、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（２−〔４−(２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．４）を最終濃度：２０ｍＭ、炭酸水素ナトリウムを最終濃度：２６ｍＭ、水酸化ナトリウムを最終濃度：５ｍＭ、０．５質量％Ｉ型コラーゲン酸可溶化溶液をＩ型コラーゲンの最終濃度として０．４質量％となるように添加することにより混合物を得、得られた混合物を３７℃で維持してゲル形成を行なうことにより製造することができる。コラーゲンゲル内への前記細胞凝集物の包埋は、前記ゲル形成に際して、前記混合物中に前記細胞凝集物を入れ、得られた混合物を３７℃で維持してゲル形成させることにより行なわれる。 When the support is a collagen gel, the cell aggregate is embedded in the collagen gel. The collagen gel is prepared by adding 100 mM HEPES (2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid in a 10-fold concentrated medium suitable for culturing epidermal basal cells in an ice water bath, for example. ) Final concentration of buffer solution (pH 7.4): 20 mM, final concentration of sodium bicarbonate: 26 mM, final concentration of sodium hydroxide: 5 mM, 0.5 mass% type I collagen acid solubilized solution of final type I collagen A mixture can be obtained by adding to a concentration of 0.4% by mass, and the obtained mixture can be maintained at 37 ° C. to form a gel. Embedding the cell aggregates in a collagen gel is performed by placing the cell aggregates in the mixture and forming the gel by maintaining the mixture at 37 ° C. during gel formation.
前記コラーゲンゲルの製造に用いられる前記表皮基底細胞の培養に適した培地は、表皮基底細胞の生育に適した培地であればよい。前記培地としては、特に限定されないが、例えば、熱不活性化血清（例えば、熱不活性化ＦＣＳなど）を含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）とＨａｍＦ１２との混合培地（熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地）、熱不活性化血清を含むＤＭＥＭ培地、熱不活性化血清を含むＭＥＭ培地などが挙げられる。なかでも、細胞のコロニー増殖に適する観点から、好ましくは熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地である。なお、前記熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地は、遺伝子導入表皮基底細胞の三次元培養に際して当該熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地を用いた場合、例えば、特定の物質に対する抗体により当該物質を阻害する操作を行なうことが可能になり、疾患の発症機構の解明や前記疾患の治療又は予防薬の開発への応用性に優れる点で有利である。なお、前記培地は、例えば、 The medium suitable for culturing the epidermal basal cells used for the production of the collagen gel may be any medium suitable for the growth of epidermal basal cells. The medium is not particularly limited. For example, a mixed medium of Dulbecco's modified medium (DMEM) containing heat-inactivated serum (for example, heat-inactivated FCS) and HamF12 (DMEM / containing heat-inactivated FCS) HamF12 medium), DMEM medium containing heat-inactivated serum, MEM medium containing heat-inactivated serum, and the like. Among these, from the viewpoint of being suitable for cell colony growth, a heat-inactivated FCS-containing DMEM / HamF12 medium is preferable. When the heat-inactivated FCS-containing DMEM / HamF12 medium is used in the three-dimensional culture of the transgenic epidermal basal cells, the heat-inactivated FCS-containing DMEM / HamF12 medium can be obtained, for example, by an antibody against a specific substance. It is possible to perform an operation for inhibiting a substance, which is advantageous in that it is excellent in applicability to elucidation of the onset mechanism of a disease and the development of a therapeutic or preventive drug for the disease. The medium is, for example,
前記支持体内における前記細胞凝集物の培養に際して、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度は、適宜設定することができる。前記ＣＯ2濃度は、好ましくは５体積％である。 In culturing the cell aggregate in the support, the carbon dioxide (CO 2 ) concentration can be appropriately set. The CO 2 concentration is preferably 5% by volume.
前記支持体内における前記細胞凝集物の培養における培養温度は、細胞を良好に生育させる観点から、好ましくは３６℃〜３８℃、より好ましくは３６．５℃〜３７．５℃（例えば、３７℃など）である。 The culture temperature for culturing the cell aggregate in the support is preferably 36 ° C. to 38 ° C., more preferably 36.5 ° C. to 37.5 ° C. (for example, 37 ° C., etc.) from the viewpoint of favorable cell growth. ).
前記支持体内における前記細胞凝集物の培養は、前記支持体を、表皮基底細胞が生育できる培地中に浸漬させて維持することにより行なわれる。前記支持体内における前記細胞凝集物の培養に用いられる培地としては、特に限定されないが、ケラチノサイト用無血清培地に５〜２０質量％程度の牛胎仔血清を添加した培地などが挙げられる。前記ケラチノサイト用無血清培地としては、特に限定されないが、例えば、無血清のダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）とＨａｍＦ１２との混合培地（ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地）、α―ＭＥＭ、ＤＭＥＭなどが挙げられる。前記培地は、インスリン等の細胞増殖促進因子を適宜含有していてもよい。 The cell aggregates in the support are cultured by immersing and maintaining the support in a medium in which epidermal basal cells can grow. The medium used for culturing the cell aggregate in the support is not particularly limited, and examples thereof include a medium obtained by adding about 5 to 20% by mass of fetal calf serum to a serum-free medium for keratinocytes. The serum-free medium for keratinocytes is not particularly limited, and examples thereof include a serum-free Dulbecco's modified medium (DMEM) and HamF12 mixed medium (DMEM / HamF12 medium), α-MEM, DMEM, and the like. The medium may appropriately contain a cell growth promoting factor such as insulin.
前記支持体内における前記細胞凝集物の培養に用いられる培養容器としては、特に限定されるものではなく、通常の培養容器に、アガロース、ポリヒドロキシエチルメタクリレートなどを均一にコートした容器、超低接着表面プレート（コーニング社製、商品名：ウルトラローアタッチメントプレート）などが挙げられる。 The culture vessel used for culturing the cell aggregate in the support is not particularly limited, and a normal culture vessel coated with agarose, polyhydroxyethyl methacrylate or the like uniformly, an ultra-low adhesion surface Plate (made by Corning, trade name: Ultra Low Attachment Plate) and the like.
前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、前記支持体内における前記細胞凝集物の培養における培養時間は、この正常表皮基底細胞の分化により細胞凝集物から形成される細胞クラスターの内部に空間が形成されるに適した時間であればよい。前記培養時間は、細胞凝集物から形成される細胞クラスターの内部に空間を形成させる観点から、好ましくは少なくとも３日間、より好ましくは５日間以上であり、短期間に分化を追跡することができる観点から、好ましくは１０日以下である。このように、本発明の製造方法は、例えば、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルなどの支持体を調製し、当該支持体上で正常表皮細胞の三次元培養を行なう従来の三次元培養皮膚モデルの製造方法に比べ、短い時間で皮膚モデル構築物を得ることができるという優れた効果を奏する。 When the epidermal basal cell is a normal epidermal basal cell, the culture time for culturing the cell aggregate in the support is such that there is a space inside the cell cluster formed from the cell aggregate due to the differentiation of the normal epidermal basal cell. It may be a time suitable for forming. The culture time is preferably at least 3 days, more preferably 5 days or more from the viewpoint of forming a space inside the cell cluster formed from cell aggregates, and the viewpoint that differentiation can be followed in a short time Therefore, it is preferably 10 days or less. Thus, the production method of the present invention is, for example, a conventional three-dimensional cultured skin model in which a support such as a collagen gel containing fibroblasts is prepared and normal epidermal cells are three-dimensionally cultured on the support. Compared to the production method, the skin model structure can be obtained in a short time.
一方、前記表皮基底細胞が遺伝子導入表皮基底細胞である場合、前記支持体内における前記細胞凝集物の培養における培養時間は、目的に応じて適宜設定することができる。 On the other hand, when the epidermal basal cells are gene-introduced epidermal basal cells, the culture time for culturing the cell aggregate in the support can be appropriately set according to the purpose.
前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、前記支持体内における前記細胞凝集物の培養に際しては、培養時間の経過に伴い、前記細胞凝集物から表皮基底細胞と前記表皮基底細胞の分化細胞とを含む細胞クラスターが形成される。細胞クラスターでは、当該細胞クラスターの最表部から内部方向に向かって、正常な皮膚と同様に、前記正常表皮基底細胞を含有する基底層と、前記正常表皮基底細胞が分化した細胞を含有する分化細胞層、具体的には、細胞凝集物の内部方向に向かって順に、有棘層と、顆粒層と、角質層とが形成され、この細胞凝集物の最内部に空間が形成されていく。 When the epidermal basal cell is a normal epidermal basal cell, when culturing the cell aggregate in the support body, as the culture time elapses, the cell aggregate from the epidermal basal cell and the differentiated cell of the epidermal basal cell A cell cluster containing is formed. In the cell cluster, from the outermost part of the cell cluster toward the inside, the normal layer containing the normal epidermal basal cell and the differentiation containing the differentiated cell of the normal epidermal basal cell, as in normal skin A cell layer, specifically, a spiny layer, a granule layer, and a stratum corneum are formed in order toward the inner direction of the cell aggregate, and a space is formed in the innermost part of the cell aggregate.
ここで、ヒトの正常な皮膚構造は、下層から順に、真皮と、基底層と、有棘層と、顆粒層と、角質層とからなる。また、ヒトの正常な皮膚構造では、基底層のケラチノサイトは、サイトケラチン−５及びサイトケラチン−１４が発現し、その後、分化の過程で、正常な皮膚構造の有棘層のケラチノサイトでは、サイトケラチン−１及びサイトケラチン−１０が発現し、エンボプラキン、ペリプラキン、インボルクリンが発現するようになる。さらに、前記エンボプラキンとペリプラキンとがヘテロダイマーを形成し、形成されたヘテロダイマーと前記インボルクリンとが細胞膜上で結合するとともに、トランスグルタミナーゼ１が、発現し、ヘテロダイマーと前記インボルクリンとの間以外に、細胞膜上の他のタンパク質との間に架橋構造を形成する。また、正常な皮膚構造の顆粒層では、上層部で、ロリクリンが発現し、発現したロリクリンが、トランスグルタミナーゼ−３の作用によりＳＰＲ分子との架橋を形成し、これにより、前記有棘層で生成した架橋構造が補強される。正常な皮膚構造の角質層では、前記顆粒層まで存在していた細胞核や、細胞内小器官が消失する。また、正常な皮膚構造の角質層では、成熟コーニファイドエンベロープが生成する。 Here, a normal human skin structure is composed of a dermis, a basal layer, a spiny layer, a granular layer, and a stratum corneum in order from the lower layer. In the normal human skin structure, keratinocytes in the basal layer express cytokeratin-5 and cytokeratin-14, and then, in the process of differentiation, in the keratinocytes in the spinous layer of the normal skin structure, cytokeratin -1 and cytokeratin-10 are expressed, and emboplatin, periplakin, and involucrin are expressed. Further, the embossed plakin and periplakin form a heterodimer, the formed heterodimer and the involucrin bind on the cell membrane, and transglutaminase 1 is expressed, in addition to between the heterodimer and the involucrin, A cross-linked structure is formed with other proteins on the cell membrane. In the granular layer of normal skin structure, loricrin is expressed in the upper layer, and the expressed loricrin forms a cross-link with the SPR molecule by the action of transglutaminase-3, thereby generating in the spiny layer. The crosslinked structure is reinforced. In the stratum corneum having a normal skin structure, the cell nuclei and intracellular organelles existing up to the granular layer disappear. In the stratum corneum with normal skin structure, a mature, confined envelope is generated.
このように、表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することにより、短時間で簡便に皮膚の分化をシミュレーションすることができる。 In this way, by culturing cell aggregates of epidermal basal cells in a support body containing an extracellular matrix component and serving as a scaffold, differentiation of skin can be simulated easily in a short time.
本発明には、表皮基底細胞の細胞凝集物を、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することを特徴とする皮膚の分化のシミュレーション方法も含まれる。 The present invention also includes a method for simulating skin differentiation, which comprises culturing cell aggregates of epidermal basal cells in a support body containing an extracellular matrix component and serving as a scaffold.
本発明の皮膚の分化のシミュレーション方法では、前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、前記支持体内における前記細胞凝集物の培養に際して、正常な皮膚と同様の表皮基底細胞の分化過程を再現することができる。 In the skin differentiation simulation method of the present invention, when the epidermal basal cell is a normal epidermal basal cell, the differentiation process of the epidermal basal cell similar to normal skin is reproduced when the cell aggregate is cultured in the support. can do.
本発明の皮膚モデル構築物は、本発明の製造方法により得られる皮膚モデル構築物である。 The skin model construct of the present invention is a skin model construct obtained by the production method of the present invention.
また、本発明の皮膚モデル構築物は、表皮基底細胞と前記表皮基底細胞の分化細胞とを含む細胞クラスターからなり、
前記細胞クラスターの最表部に形成され、前記表皮基底細胞を含有した基底層と、
前記基底層の内側に形成され、前記表皮基底細胞の分化細胞を含有した分化細胞層と
を有し、
前記分化細胞層の内側に空間が形成されている構築物である。本発明の皮膚モデル構築物は、本発明の製造方法で得ることができるため、短時間で簡便に製造することができる。
The skin model construct of the present invention comprises a cell cluster comprising epidermal basal cells and differentiated cells of the epidermal basal cells,
A basal layer formed on the outermost part of the cell cluster and containing the epidermal basal cells;
A differentiated cell layer formed inside the basal layer and containing differentiated cells of the epidermal basal cell,
It is a construct in which a space is formed inside the differentiated cell layer. Since the skin model construct of the present invention can be obtained by the production method of the present invention, it can be easily produced in a short time.
また、本発明の皮膚モデル構築物は、前記表皮基底細胞と、前記表皮基底細胞の分化細胞とを含む細胞クラスターからなるため、前記表皮基底細胞として用いる細胞の種類などに応じて、種々の皮膚状態を簡便に再現することができるという優れた効果を奏する。 Further, since the skin model construct of the present invention comprises a cell cluster including the epidermal basal cells and differentiated cells of the epidermal basal cells, various skin states can be used depending on the types of cells used as the epidermal basal cells. It is possible to easily reproduce the above.
前記表皮基底細胞の分化細胞としては、前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、有棘細胞、顆粒細胞、角質細胞などが挙げられる。 Examples of the differentiated cells of the epidermal basal cells include spiny cells, granule cells, and corneocytes when the epidermal basal cells are normal epidermal basal cells.
また、前記表皮基底細胞が正常表皮基底細胞である場合、前記分化細胞層は、前記基底層の内側に形成され、有棘細胞を含有した有棘層と、
前記有棘層の内側に形成され、顆粒細胞を含有した顆粒層と、
前記顆粒層の内側に形成された角化層と
からなる。
When the epidermal basal cell is a normal epidermal basal cell, the differentiated cell layer is formed inside the basal layer, and includes a spiny layer containing spinous cells,
A granule layer formed inside the barbed layer and containing granule cells;
It consists of a keratinized layer formed inside the granular layer.
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（シグマ−アルドリッチ社製）に、終濃度：１０質量％となるように熱不活性化ＦＣＳを添加し、熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２培地（以下、「ＤＨ１０」という）を得た。
(Example 1)
Heat-inactivated FCS was added to DMEM / HamF12 (manufactured by Sigma-Aldrich) to a final concentration of 10% by mass, and a heat-inactivated FCS-containing DMEM / HamF12 medium (hereinafter referred to as “DH10”) was added. Obtained.
正常ヒト表皮ケラチノサイト細胞株であるＨａＣａＴ細胞を、ＤＨ１０中、５体積％ＣＯ2下、３７℃で培養した。 HaCaT cells, a normal human epidermal keratinocyte cell line, were cultured in DH10 at 37 ° C. under 5% by volume CO 2 .
つぎに、得られたＨａＣａＴ細胞を、１０００Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ（シグマ−アルドリッチ社製）を含むＤＨ１０ ３５０μｌに懸濁した。得られた懸濁物を、２４−ウェルディッシュ（コーニング社製、超低接着表面）中、１００ｒｐｍで回転させながら、５体積％ＣＯ2下、３７℃で２４時間旋回培養して、平滑で丸い細胞凝集物を形成させた。 Next, the obtained HaCaT cells were suspended in 350 μl of DH10 containing 1000 U / ml DNase I (manufactured by Sigma-Aldrich). The resulting suspension was cultivated in a 24-well dish (manufactured by Corning, ultra-low adhesion surface) at 100 rpm, rotating at 5 ° C. CO 2 for 24 hours at 37 ° C., and smooth and round. Cell aggregates were formed.
形成された細胞凝集物を、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液（株式会社高研製）で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋した。包埋後の細胞凝集物を、終濃度５μｇ／ｍｌのインスリンを含むＤＨ１０中、５体積％ ＣＯ2下、３７℃で３日間培養して、細胞クラスターを得た。また、得られた細胞クラスターを位相差顕微鏡下で観察した。結果を図１に示す。図１は、実施例１で培養開始から３日目の細胞クラスターの位相差顕微鏡により観察結果を示す図面代用写真である。図中、スケールバーは、５０μｍを示す。 The formed cell aggregate was embedded in a high-density collagen gel prepared with a 0.5 mass% type IA collagen solution (manufactured by Koken Co., Ltd.). The cell aggregates after embedding were cultured in DH10 containing insulin at a final concentration of 5 μg / ml for 3 days at 37 ° C. under 5 vol% CO 2 to obtain cell clusters. Moreover, the obtained cell cluster was observed under the phase-contrast microscope. The results are shown in FIG. FIG. 1 is a drawing-substituting photograph showing the observation results of a cell cluster on the third day from the start of culture in Example 1 using a phase contrast microscope. In the figure, the scale bar indicates 50 μm.
図１の結果から、培養開始から３日目の細胞クラスターは、複数の層が形成され、その最内部に空間が形成されたほぼ球状の構造を有することがわかる。 From the results of FIG. 1, it can be seen that the cell cluster on the third day from the start of the culture has a substantially spherical structure in which a plurality of layers are formed and a space is formed in the innermost part.
以上のように、予め、表皮基底細胞の旋回培養を行なうことにより細胞凝集物を形成させ、ついで、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することにより、複数の層が形成され、その最内部に空間が形成されたほぼ球状の構造を有する細胞クラスターが得られることがわかる。 As described above, by rotating the epidermal basal cells in advance, cell aggregates are formed and then cultured in a support body that contains extracellular matrix components and serves as a scaffold. It can be seen that a cell cluster having a substantially spherical structure in which a space is formed in the innermost part is obtained.
（実施例２）
（１）培養期間の経過に伴う細胞クラスターの構造の変化
実施例１と同様にして、表皮基底細胞の旋回培養を行なうことにより、平滑で丸い細胞凝集物を形成させた。
(Example 2)
(1) Changes in the structure of cell clusters with the passage of the culture period In the same manner as in Example 1, by rotating the epidermal basal cells, smooth and round cell aggregates were formed.
形成された細胞凝集物を、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液（株式会社高研製）で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋し、終濃度５μｇ／ｍｌのインスリンを含むＤＨ１０中、５体積％ ＣＯ2下、３７℃で培養するとともに、培養過程での細胞クラスターの構造の変化を電子顕微鏡下で観察した。結果を図２に示す。 The formed cell aggregate was embedded in a high-density collagen gel prepared with a 0.5 mass% type IA collagen solution (manufactured by Koken Co., Ltd.), and in DH10 containing insulin at a final concentration of 5 μg / ml, While culturing at 37 ° C. under 5% by volume CO 2 , changes in the structure of cell clusters during the culturing process were observed under an electron microscope. The results are shown in FIG.
図２は、実施例２における培養過程での細胞クラスターの構造の変化を概略的に示す概略説明図である。図中、１は、培養開始から一日目の細胞クラスターを示し、２は、培養開始から４日目の細胞クラスターを示し、３は、培養開始から８日目の細胞クラスターを示す。図中、スケールバーは、１００μｍを示す。 FIG. 2 is a schematic explanatory view schematically showing changes in the structure of cell clusters during the culture process in Example 2. FIG. In the figure, 1 indicates a cell cluster on the first day from the start of culture, 2 indicates a cell cluster on the fourth day from the start of culture, and 3 indicates a cell cluster on the eighth day from the start of culture. In the figure, the scale bar indicates 100 μm.
また、図２に示されるように、細胞クラスターは、培養開始から１日目では、密に凝集した構造であったが、培養開始から４日目では、複数の層が形成され、その最内部に空間が形成されたほぼ球状の構造を形成していった。その後、培養開始から８日目では、培養開始から４日目の細胞クラスターに比べ、細胞クラスターの内部に形成されている空間が大きくなり、培養物の大きさ自体も大きくなっていた。 In addition, as shown in FIG. 2, the cell cluster had a densely aggregated structure on the first day from the start of the culture, but on the fourth day from the start of the culture, a plurality of layers were formed, and the innermost An almost spherical structure was formed in which a space was formed. After that, on the 8th day from the start of the culture, the space formed inside the cell cluster was larger and the size of the culture itself was larger than the cell cluster on the 4th day from the start of the culture.
以上のことから、予め、表皮基底細胞の旋回培養を行なうことにより細胞凝集物を形成させ、ついで、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することにより、培養期間の経過とともに、細胞凝集物から生じる細胞クラスターの構造が変化することがわかる。 Based on the above, cell aggregates are formed in advance by swirling culture of epidermal basal cells, and then cultured in a support body that contains extracellular matrix components and serves as a scaffold. It can be seen that the structure of the cell cluster resulting from the cell aggregate changes with time.
（２）培養期間の経過に伴う細胞クラスターにおける各種分化マーカーの発現プロファイル
前記培養開始から１日目の細胞クラスター、培養開始から４日目の細胞クラスター及び培養開始から１日目の細胞クラスターについて、皮膚の分化の各分化段階の分化マーカーの発現を調べた。
(2) Expression profiles of various differentiation markers in the cell cluster over the course of the culture period About the cell cluster on the first day from the start of culture, the cell cluster on the fourth day from the start of culture, and the cell cluster on the first day from the start of culture, The expression of differentiation markers at each differentiation stage of skin differentiation was examined.
培養開始から１日目、４日目及び８日目の細胞クラスターそれぞれを、ＳＤＳサンプルバッファー（組成：６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１０質量％グリセロール、２質量％ ＳＤＳ、５体積％ ２−メルカプトエタノール、０．００２５質量％ブロモフェノールブルー）に添加して、５分間煮沸し、全細胞ライゼート試料を得た。 The cell clusters on the first day, the fourth day, and the eighth day from the start of the culture were respectively mixed with an SDS sample buffer (composition: 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.5), 10% by mass glycerol, 2% by mass SDS, 5 volumes). % 2-mercaptoethanol, 0.0025 mass% bromophenol blue) and boiled for 5 minutes to obtain a whole cell lysate sample.
得られた各全細胞ライゼート試料を、４−２０質量％濃度勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに負荷した後、電気泳動を行なった。つぎに、全てのタンパク質バンドをＰＶＤＦ膜（商品名：イモビロン−Ｐ、ミリポアコーポレーション製）に転写させた。転写後のＰＶＤＦ膜を、５質量％スキムミルクＴＢＳ溶液とともに室温で６０分間インキュベーションした。その後、得られたＰＶＤＦ膜を、一次抗体とともに、室温で６０分間インキュベーションし、その後、ＨＲＰ−標識二次抗体とともに、室温で６０分間インキュベーションした。前記一次抗体として、サイトケラチン−１４に対するポリクローナル抗体（コバンス社製）、サイトケラチン−５に対するモノクローナル抗体（コバンス社製）、サイトケラチン−１に対するポリクローナル抗体（コバンス社製）、インボルクリンに対するモノクローナル抗体（サンタクルズバイオテクノロジーインコーポレーティッド製）、β−アクチンに対するモノクローナル抗体（シグマ−アルドリッチ社製）、プロカスペース−３および活性化カスペース−３について、カスペース−３に対するポリクローナル抗体（ストレスジェン社製）、プロカスペース−１４および活性化カスペース−１４について、カスペース−１４に対するポリクローナル抗体（イムジェネックス社製）それぞれを用いた。また、ＨＲＰ−標識二次抗体として、一次抗体に応じて、ＨＲＰ−標識抗マウスＩｇＧ抗体及びＨＲＰ−標識抗ラビットＩｇＧ抗体を用いた。サイトケラチン−１は、有棘層及び顆粒層、サイトケラチン−５は、基底層、サイトケラチン−１４は、基底層の分化マーカーであり、インボルクリンは、有棘層及び顆粒層の分化マーカーであり、β−アクチンは、内部対照であり、プロカスペース−３は、アポトーシスの最終段階で働くプロテアーゼのマーカーであり、活性化カスペース−３は、プロカスペース−３が切断され実行因子としての機能をもったもののマーカーであり、プロカスペース−１４は、皮膚の終末分化において発現する角質層の分化マーカーであり、活性化カスペース−１４は、プロカスペース−１４が切断され実行因子としての機能をもったもののマーカーである。結果を図３に示す。 Each obtained whole cell lysate sample was loaded on a 4-20 mass% concentration gradient SDS-polyacrylamide gel and then subjected to electrophoresis. Next, all protein bands were transferred to a PVDF membrane (trade name: Immobilon-P, manufactured by Millipore Corporation). The transferred PVDF membrane was incubated with a 5% by weight skim milk TBS solution for 60 minutes at room temperature. The resulting PVDF membrane was then incubated with the primary antibody for 60 minutes at room temperature, and then incubated with the HRP-labeled secondary antibody for 60 minutes at room temperature. Examples of the primary antibody include a polyclonal antibody against cytokeratin-14 (manufactured by Covance), a monoclonal antibody against cytokeratin-5 (manufactured by Covance), a polyclonal antibody against cytokeratin-1 (manufactured by Covans), and a monoclonal antibody against involcrine (Santa Cruz). Biotechnology Inc., monoclonal antibody against β-actin (Sigma-Aldrich), procaspace-3 and activated caspase-3, polyclonal antibody against caspase-3 (manufactured by StressGen), For Procaspase-14 and Activated Caspase-14, polyclonal antibodies against Caspase-14 (Imgenex) were used. Further, as the HRP-labeled secondary antibody, an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody and an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody were used according to the primary antibody. Cytokeratin-1 is a spiny layer and granule layer, cytokeratin-5 is a basal layer, cytokeratin-14 is a basal layer differentiation marker, involucrin is a spiny layer and granule layer differentiation marker , Β-actin is an internal control, procaspace-3 is a marker for proteases that act in the final stages of apoptosis, and activated caspase-3 is cleaved from procaspace-3 as an executioner Procaspace-14 is a functional marker, and is a stratum corneum differentiation marker expressed in the terminal differentiation of skin. Activated caspase-14 is cleaved from procaspace-14 as an execution factor It is a marker with the function of. The results are shown in FIG.
図３は、培養開始から１日目、４日目及び８日目の細胞クラスターにおける各種分化マーカーのイムノブロット解析の結果を示す図面代用写真である。図中、レーン１、レーン２及びレーン３は、それぞれ、図２の１、２及び３に対応する。また、図中、（ａ）は、サイトケラチン−１４、（ｂ）は、サイトケラチン−５、（ｃ）は、サイトケラチン−１、（ｄ）は、インボルクリン、（ｅ）は、β−アクチン、（ｆ）は、プロカスペース−３、（ｇ）は、活性化カスペース−３、（ｈ）は、プロカスペース−１４、（ｉ）は、活性化カスペース−１４を示す。 FIG. 3 is a drawing-substituting photograph showing the results of immunoblot analysis of various differentiation markers in the cell clusters on day 1, 4 and 8 from the start of culture. In the figure, lane 1, lane 2, and lane 3 correspond to 1, 2, and 3 in FIG. 2, respectively. In the figure, (a) is cytokeratin-14, (b) is cytokeratin-5, (c) is cytokeratin-1, (d) is involucrin, and (e) is β-actin. , (F) shows procaspace-3, (g) shows activated caspase-3, (h) shows procaspace-14, and (i) shows activated caspase-14.
図３の結果から、培養開始から１日目の細胞クラスターに比べ、最内部に空間が形成されている培養開始から４日目の細胞クラスター及び培養開始から８日目の細胞クラスターでは、有棘層及び顆粒層の分子マーカーであるインボルクリン及びサイトケラチン１の発現が増加していることがわかる。したがって、細胞クラスター中において、表皮基底細胞が有棘層の細胞及び顆粒層の細胞へ分化していることが示唆される。 From the results shown in FIG. 3, compared to the cell cluster on the first day from the start of the culture, the cell cluster on the fourth day from the start of the culture and the cell cluster on the eighth day from the start of the culture in which a space is formed in the innermost part It can be seen that expression of involucrin and cytokeratin 1, which are molecular markers of the layer and the granule layer, is increased. Therefore, it is suggested that in the cell cluster, epidermal basal cells are differentiated into spinous layer cells and granule layer cells.
また、図３の結果から、培養開始から４日目の細胞クラスターに比べ、最内部に空間が形成されている培養開始から８日目の細胞クラスターでは、有棘層及び顆粒層の分子マーカーであるインボルクリン及びサイトケラチン１の発現が、より増加していることがわかる。したがって、培養期間の経過に伴って、表皮基底細胞から有棘層の細胞及び顆粒層の細胞への分化が進行することがわかる。 In addition, from the results shown in FIG. 3, compared with the cell cluster on the 4th day from the start of the culture, the cell cluster on the 8th day from the start of the culture in which the space is formed in the innermost part, the molecular markers of the spinous layer and the granular layer are used. It can be seen that the expression of certain involucrin and cytokeratin 1 is increased. Therefore, it can be seen that differentiation from epidermal basal cells into spinous layer cells and granule layer cells progresses as the culture period elapses.
また、図３の結果から、培養開始から１日目の細胞クラスターに比べ、培養開始から４日目の細胞クラスターにおいて、基底層の分子マーカーであるサイトケラチン５及びサイトケラチン１４が増加していることがわかる。さらに、図３の結果から、培養開始から４日目の細胞クラスターに比べ、培養開始から８日目の細胞クラスターにおいて、基底層の分子マーカーであるサイトケラチン５及びサイトケラチン１４がやや増加していることがわかる。これらの結果より、培養期間の経過に伴って、最内部に形成される空間が大きくなることに伴い、細胞クラスターにおいて、基底層の分子マーカーであるサイトケラチン５及びサイトケラチン１４が増加していることがわかる。かかる結果より、培養期間の経過に伴って、細胞クラスターの球状の構造の直径が大きくなり、コラーゲンゲルと接触している細胞が多くなるためであることが示唆される。 Moreover, from the result of FIG. 3, the cytokeratin 5 and the cytokeratin 14 which are the molecular markers of a basal layer are increasing in the cell cluster of the 4th day from the culture start compared with the cell cluster of the 1st day from the culture start. I understand that. Further, from the results of FIG. 3, cytokeratin 5 and cytokeratin 14 which are molecular markers of the basal layer are slightly increased in the cell cluster on the 8th day from the start of the culture as compared with the cell cluster on the 4th day from the start of the culture. I understand that. From these results, with the progress of the culture period, cytokeratin 5 and cytokeratin 14, which are molecular markers of the basal layer, increase in the cell cluster as the space formed in the innermost portion increases. I understand that. From these results, it is suggested that the diameter of the spherical structure of the cell cluster increases with the passage of the culture period, and the number of cells in contact with the collagen gel increases.
さらに、図３の結果から、培養開始から１日目の細胞クラスター、培養開始から４日目の細胞クラスター及び培養開始から８日目の細胞クラスターにおいて、プロカスペース−３の量の変化が見られず、活性化カスペース−３の発現量にも変化がないことがわかる。したがって、培養期間の経過に伴う細胞クラスターの最内部における空間の形成は、プロカスペース−３からの活性化カスペース−３の生成が見られないため、細胞傷害由来のアポトーシスにより引き起こされる事象ではないことが示唆される。 Further, from the results of FIG. 3, changes in the amount of procaspace-3 were observed in the cell cluster on the first day from the start of culture, the cell cluster on the fourth day from the start of culture, and the cell cluster on the eighth day from the start of culture. It can be seen that there is no change in the expression level of activated caspase-3. Therefore, the formation of the space in the innermost part of the cell cluster with the progress of the culture period does not show the generation of activated caspase-3 from procaspase-3, so that in the event caused by apoptosis derived from cytotoxicity Not suggested.
また、図３の結果から、培養開始から１日目の細胞クラスターに比べ、培養開始から４日目の細胞クラスターにおいて、プロカスペース−１４が減少し、活性化カスペース−１４が増加しているため、カスペース−１４の活性化が生じていることがわかる。さらに、図３の結果から、培養開始から４日目の細胞クラスターに比べ、培養開始から８日目の細胞クラスターにおいて、プロカスペース−１４が減少し、活性化カスペース−１４が増加しているため、カスペース−１４の活性化が生じていることがわかる。これらの結果より、細胞クラスターにおいて、三次元培養皮膚モデル及びヒトの皮膚の角質層で見られるのと同様に、培養期間の経過に伴って、カスペース−１４の活性化が見られるため、培養期間の経過に伴う細胞クラスターの最内部における空間の形成は、表皮基底細胞から角質層の細胞への終末分化により引き起こされることが示唆される。 In addition, from the results shown in FIG. 3, procaspase-14 decreased and activated caspase-14 increased in the cell cluster on the fourth day from the start of the culture as compared to the cell cluster on the first day from the start of the culture. Therefore, it can be seen that activation of caspase-14 occurs. Further, from the results shown in FIG. 3, procaspase-14 decreased and activated caspase-14 increased in the cell cluster on the eighth day from the start of the culture as compared to the cell cluster on the fourth day from the start of the culture. Therefore, it can be seen that activation of caspase-14 occurs. From these results, the activation of caspase-14 is observed with the passage of the culture period in the cell cluster as in the three-dimensional cultured skin model and the stratum corneum of human skin. It is suggested that the formation of the innermost space of the cell cluster with the passage of time is caused by terminal differentiation from epidermal basal cells to stratum corneum cells.
以上のことから、予め、表皮基底細胞の旋回培養を行なうことにより細胞凝集物を形成させ、ついで、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養することにより得られる細胞クラスターは、ヒトの皮膚と同様に、コラーゲンの接している基底層から脱核した角質層までの各層の分化状態を反映していることがわかる。したがって、前記細胞クラスターは、皮膚のモデルとして用いることができる皮膚モデル構築物であることが示唆される。また、前記細胞クラスターは、前記支持体内での培養時間の経過に伴って、皮膚における表皮基底細胞の分化と同様の分化過程が見られるため、前記皮膚モデル構築物の製造方法は、皮膚の分化過程モデルとして有用である。 From the above, cell clusters obtained by swirling culture of epidermal basal cells in advance to form cell aggregates and then culturing in a support body that contains extracellular matrix components and serves as a scaffold As in human skin, it can be seen that it reflects the differentiation state of each layer from the basal layer in contact with collagen to the enucleated stratum corneum. Therefore, it is suggested that the cell cluster is a skin model construct that can be used as a skin model. In addition, since the cell cluster shows a differentiating process similar to the differentiation of epidermal basal cells in the skin as the culture time in the support body elapses, the method for producing the skin model construct includes a process of skin differentiation. Useful as a model.
従来の三次元培養皮膚モデルは、製造に際して、煩雑な操作を行なう必要があるとともに、製造に、２０日間を要する。 The conventional three-dimensional cultured skin model requires complicated operations during production, and requires 20 days for production.
しかしながら、前記皮膚モデル構築物は、表皮基底細胞の旋回培養の開始から、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とを有するヒトの皮膚と同様の層を形成するまでの期間は、わずか４日間である。したがって、前記皮膚モデル構築物は、従来の三次元培養皮膚モデルに比べ、製造が簡単で、製造に要する時間が少ない点で優れる。また、平板培養では、表皮基底細胞は、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とを有するヒトの皮膚と同様の層を形成せず、かつヒトの皮膚の角質層で見られるカスペース−１４の活性化が見られないのに対し、前記皮膚モデル構築物では、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とを有するヒトの皮膚と同様の層を形成し、ヒトの皮膚や三次元培養皮膚モデルと同様に、カスペース−１４の活性化が見られる。したがって、前記皮膚モデル構築物は、平面培養により培養された表皮基底細胞に比べ、より皮膚に近いモデルである点で優れる。 However, in the skin model construct, the period from the start of swiveling culture of epidermal basal cells to the formation of a layer similar to human skin having a basal layer, a spiny layer, a granule layer, and a stratum corneum is only 4 Days. Therefore, the skin model construct is superior to the conventional three-dimensional cultured skin model in that it is easy to manufacture and requires less time for manufacturing. In plate culture, epidermal basal cells do not form a layer similar to human skin having a basal layer, a spiny layer, a granule layer, and a stratum corneum, and are found in the stratum corneum of human skin. In contrast, the skin model construct forms a layer similar to human skin having a basal layer, a spiny layer, a granule layer, and a stratum corneum. As with the original cultured skin model, activation of caspase-14 is observed. Therefore, the skin model construct is superior in that it is a model closer to the skin than the epidermal basal cells cultured by planar culture.
（実施例３）
ＩＬ−２シグナルペプチド（配列番号：３）をコードする核酸（配列番号：４）を、発生分化制御因子であるエピモルフィンをコードするｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるエピモルフィン（配列番号：２）のＮ末端に対応する部位に付加し、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードする核酸を得た。得られたＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードする核酸と、アデノウイルス発現システム（クローンテック社製、商品名：Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １）とを用いて、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィン発現用の組換えアデノウイルスを構築した。
(Example 3)
The nucleic acid (SEQ ID NO: 4) encoding the IL-2 signal peptide (SEQ ID NO: 3) is converted into epimorphin (SEQ ID NO: 2) in the cDNA (SEQ ID NO: 1) encoding epimorphin, which is a developmental differentiation regulator. Was added to the site corresponding to the N-terminus of the nucleic acid to obtain a nucleic acid encoding IL-2 signal peptide-bound epimorphin. Using the obtained nucleic acid encoding IL-2 signal peptide-bound epimorphin and an adenovirus expression system (Clontech, trade name: Adeno-X Expression System 1), IL-2 signal peptide-bound epimorphin A recombinant adenovirus for expression was constructed.
ＨａＣａＴ細胞を、１０００Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ（シグマ−アルドリッチ社製）を含むＤＨ１０ ３５０μｌに懸濁し、得られた懸濁物を、２４−ウェルディッシュ（超低接着表面、コーニング社製）中、１００ｒｐｍで回転させた。 HaCaT cells were suspended in 350 μl of DH10 containing 1000 U / ml DNase I (Sigma-Aldrich), and the obtained suspension was suspended at 100 rpm in a 24-well dish (super low adhesion surface, Corning). It was rotated with.
いくつかのウェルに、前記組換えアデノウイルス（１０７ｐｆｕ）を添加して、ＨａＣａＴ細胞に導入し、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンを一過性発現する遺伝子導入表皮基底細胞（ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞）を得た。 In some wells, the recombinant adenovirus (10 7 pfu) is added, introduced into HaCaT cells, and a transgenic epidermal basal cell (HaCaT-Av) that transiently expresses IL-2 signal peptide-bound epimorphin. -EPM cells).
また、いくつかのウェルに、ＩＬ−２シグナルペプチド結合エピモルフィンをコードするｃＤＮＡをもたないアデノウイルスを添加して、ＨａＣａＴ細胞に導入し、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞を得た。 In addition, adenovirus without cDNA encoding IL-2 signal peptide-binding epimorphin was added to some wells and introduced into HaCaT cells to obtain HaCaT-Av-control cells.
得られたＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞を、前記実施例１と同様に培養して、細胞クラスターを形成させた。その後、形成された細胞クラスターを、前記実施例１と同様に、０．５質量％タイプＩＡコラーゲン溶液（株式会社高研製）で調製された高密度のコラーゲンゲル中に包埋し、終濃度５μｇ／ｍｌのインスリンを含むＤＨ１０中、５体積％ ＣＯ2下、３７℃で３日間培養し、細胞クラスターを得た。 The obtained HaCaT-Av-EPM cells were cultured in the same manner as in Example 1 to form cell clusters. Thereafter, the formed cell cluster was embedded in a high-density collagen gel prepared with a 0.5 mass% type IA collagen solution (manufactured by Koken Co., Ltd.) in the same manner as in Example 1, and the final concentration was 5 μg. Cell clusters were obtained by culturing for 3 days at 37 ° C. in 5% by volume CO 2 in DH10 containing / ml insulin.
また、ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞に代えて、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞を用い、同様にして、細胞クラスターを得た。 Further, instead of HaCaT-Av-EPM cells, HaCaT-Av-control cells were used to obtain cell clusters in the same manner.
前記ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスター及び前記ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターそれぞれを、インボルクリンに対するアフィニティー精製抗体（サンタクルズバイオテクノロジーインコーポレーティッド製）と、室温で６０分間インキュベーションし、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−標識二次抗体（インビトロジェン社製、商品名：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−標識抗マウスＩｇＧ抗体）とともに、室温で６０分間インキュベーションして、免疫細胞化学染色を行なった。なお、細胞核を、ヨウ化プロピジウムで対比染色した。また、前記ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスター及びＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターそれぞれを位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡により観察した。これにより、表皮基底細胞に発生分化制御因子をコードする核酸を導入した場合の細胞クラスターの形態及び前記細胞クラスターでのマーカーの発現を調べた。結果を図４に示す。 The cell cluster obtained from the HaCaT-Av-control cell and the cell cluster obtained from the HaCaT-Av-EPM cell were each treated with an affinity purified antibody against involucrin (manufactured by Santa Cruz Biotechnology Inc.) for 60 minutes at room temperature. After incubation, immunocytochemical staining was performed by incubation with AlexaFluor488-labeled secondary antibody (Invitrogen, trade name: AlexaFluor488-labeled anti-mouse IgG antibody) for 60 minutes at room temperature. Cell nuclei were counterstained with propidium iodide. The cell clusters obtained from the HaCaT-Av-control cells and the cell clusters obtained from the HaCaT-Av-EPM cells were observed with a phase contrast microscope and a fluorescence microscope. Thereby, the morphology of the cell cluster when the nucleic acid encoding the developmental differentiation regulator was introduced into the epidermal basal cell and the expression of the marker in the cell cluster were examined. The results are shown in FIG.
図４は、表皮基底細胞に発生分化制御因子をコードする核酸を導入した場合の細胞クラスターの形態及び前記細胞クラスターでのマーカーの発現への影響を調べた結果を示す図面代用写真である。図中、スケールバーは、いずれも５０μｍである。図４（Ａ）の（ａ）は、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスターの位相差顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真、（ｂ）は、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスターの免疫細胞化学染色の結果を示す図面代用写真であり、図４（Ｂ）の（ａ）は、ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターの蛍光顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真、（ｂ）は、ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターの免疫細胞化学染色の結果を示す図面代用写真である。図中、４は、形成された空間、５は、インボルクリンに対する染色位置の一例、６は、ヨウ化プロピジウムに対する染色位置の一例である。 FIG. 4 is a drawing-substituting photograph showing the results of examining the morphology of a cell cluster and the effect of marker expression on the cell cluster when a nucleic acid encoding a developmental differentiation regulator is introduced into epidermal basal cells. In the figure, the scale bars are all 50 μm. FIG. 4 (A) (a) is a drawing-substituting photograph showing the results of phase contrast microscopic observation of a cell cluster obtained from HaCaT-Av-control cells, and (b) is obtained from HaCaT-Av-control cells. 4A is a drawing-substituting photograph showing the result of immunocytochemical staining of the cell cluster, and FIG. 4B is a drawing showing the result of fluorescence microscope observation of the cell cluster obtained from HaCaT-Av-EPM cells. A substitute photo, (b), is a drawing substitute photo showing the results of immunocytochemical staining of a cell cluster obtained from HaCaT-Av-EPM cells. In the figure, 4 is a formed space, 5 is an example of a staining position for involucrin, and 6 is an example of a staining position for propidium iodide.
図４（Ａ）の（ａ）の結果及び図４（Ａ）の（ｂ）の結果から、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスターの最内部に空間が形成され、前記空間に隣接する層では、細胞核が見られないことがわかる。かかる図４の結果と、図３の結果とから、この空間の形成は、表皮基底細胞から角質層の細胞への終末分化に起因する脱核を伴うことが示唆される。 From the result of (a) in FIG. 4 (A) and the result of (b) in FIG. 4 (A), a space is formed in the innermost part of the cell cluster obtained from the HaCaT-Av-control cell and is adjacent to the space. It can be seen that there is no cell nucleus in the layer. The results of FIG. 4 and FIG. 3 suggest that the formation of this space is accompanied by enucleation due to terminal differentiation from epidermal basal cells to stratum corneum cells.
また、図４（Ａ）の（ｂ）の結果から、コラーゲンゲルと接触しておらず、形成された空間の内側に沿って、有棘層及び顆粒層の分子マーカーであるインボルクリンの発現が見られている。したがって、ＨａＣａＴ−Ａｖ−対照細胞から得られた細胞クラスターでは、コラーゲンと接している基底層、コラーゲンとの結合が消失することにより分化し、インボルクリンを発現した有棘層と顆粒層および脱核した空間が示す角質層とを有するヒトの皮膚と同様の層を形成していることが示唆される。 In addition, from the result of (b) of FIG. 4 (A), expression of involucrin, which is a molecular marker of the spinous layer and the granular layer, is observed along the inner side of the formed space without being in contact with the collagen gel. It has been. Therefore, in the cell cluster obtained from the HaCaT-Av-control cells, the basal layer in contact with collagen, the spinal layer and granule layer expressing involucrin, and enucleated were differentiated by the loss of the binding to collagen. It is suggested that a layer similar to human skin having a stratum corneum indicated by a space is formed.
一方、図４（Ｂ）の（ａ）の結果及び図４（Ｂ）の（ｂ）の結果から、ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターは、空間が形成されず、インボルクリンの粒子が沈着している構造を有している。図４（Ａ）の（ａ）、（ｂ）、図４（Ｂ）の（ａ）及び（ｂ）の結果から、ＨａＣａＴ−Ａｖ−ＥＰＭ細胞から得られた細胞クラスターでは、外因的に導入されたエピモルフィンの遺伝子の過剰発現が、ヒトの皮膚と同様の層の形成を阻害していることが示唆される。これらの結果から、予め、表皮基底細胞の旋回培養を行なうことにより細胞凝集物を形成させ、ついで、細胞外マトリックスの成分を含有し、かつ足場となる支持体内で培養する前記皮膚モデル構築物の製造方法において、表皮基底細胞として、発生分化制御因子をコードする核酸などを導入した遺伝子導入基底細胞を用いることにより、当該発生分化制御因子の機能を調べることができることがわかる。また、前記皮膚モデル構築物の製造方法において、表皮基底細胞として、疾患関連因子の遺伝子を導入した遺伝子導入表皮基底細胞を用いることにより、簡便に、皮膚の疾患状態を再現できる可能性があることが示唆される。 On the other hand, from the result of (a) in FIG. 4B and the result of (b) in FIG. 4 (B), the cell cluster obtained from the HaCaT-Av-EPM cell does not form a space, and particles of involucrin Has a deposited structure. From the results of (a) and (b) of FIG. 4 (A) and (a) and (b) of FIG. 4 (B), the cell cluster obtained from the HaCaT-Av-EPM cells was introduced exogenously. It is suggested that overexpression of the epimorphin gene inhibits the formation of layers similar to human skin. From these results, production of the skin model construct is carried out in which cell aggregates are formed in advance by swirling culture of epidermal basal cells, and then cultured in a support body containing an extracellular matrix component and serving as a scaffold. In the method, it can be seen that the function of the developmental differentiation regulator can be examined by using, as the epidermal basal cell, a transgenic basal cell into which a nucleic acid encoding a developmental differentiation regulator is introduced. In addition, in the method for producing a skin model construct, it may be possible to easily reproduce a skin disease state by using a gene-introduced epidermal basal cell into which a gene of a disease-related factor is introduced as an epidermal basal cell. It is suggested.
配列番号：３は、ＩＬ−２シグナルペプチドのアミノ酸配列である。 SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the IL-2 signal peptide.
配列番号：４は、ＩＬ−２シグナルペプチドをコードする核酸の塩基配列である。 SEQ ID NO: 4 is the base sequence of nucleic acid encoding IL-2 signal peptide.
Claims (7)
前記細胞クラスターの最表部に形成され、前記表皮基底細胞を含有した基底層と、
前記基底層の内側に形成され、前記表皮基底細胞の分化細胞を含有した分化細胞層と
を有してなり、
前記分化細胞層の内側に空間が形成されてなる皮膚モデル構築物。 A cell cluster comprising epidermal basal cells and differentiated cells of the epidermal basal cells,
A basal layer formed on the outermost part of the cell cluster and containing the epidermal basal cells;
A differentiated cell layer formed inside the basal layer and containing differentiated cells of the epidermal basal cell,
A skin model construct in which a space is formed inside the differentiated cell layer.
前記有棘層の内側に形成され、顆粒細胞を含有した顆粒層と、
前記顆粒層の内側に形成された角化層と
からなる請求項５記載の皮膚モデル構築物。 The differentiated cell layer is formed inside the basal layer and contains spinous cells;
A granule layer formed inside the barbed layer and containing granule cells;
The skin model construct according to claim 5, comprising a keratinized layer formed inside the granular layer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007287663A JP5408520B2 (en) | 2007-11-05 | 2007-11-05 | Skin model construct |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007287663A JP5408520B2 (en) | 2007-11-05 | 2007-11-05 | Skin model construct |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009112225A true JP2009112225A (en) | 2009-05-28 |
| JP5408520B2 JP5408520B2 (en) | 2014-02-05 |
Family
ID=40780083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007287663A Expired - Fee Related JP5408520B2 (en) | 2007-11-05 | 2007-11-05 | Skin model construct |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5408520B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012016311A (en) * | 2010-07-08 | 2012-01-26 | Mandom Corp | Method for evaluating substance to be tested |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000060560A (en) * | 1998-08-20 | 2000-02-29 | Sumitomo Electric Ind Ltd | Artiodactyla epimorphine |
| JP2003523201A (en) * | 2000-02-18 | 2003-08-05 | ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ | Genetically engineered skin cell types and toxicity assays |
| JP2009112224A (en) * | 2007-11-05 | 2009-05-28 | Kyoto Univ | Three-dimensional diseased skin restructure |
-
2007
- 2007-11-05 JP JP2007287663A patent/JP5408520B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000060560A (en) * | 1998-08-20 | 2000-02-29 | Sumitomo Electric Ind Ltd | Artiodactyla epimorphine |
| JP2003523201A (en) * | 2000-02-18 | 2003-08-05 | ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ | Genetically engineered skin cell types and toxicity assays |
| JP2009112224A (en) * | 2007-11-05 | 2009-05-28 | Kyoto Univ | Three-dimensional diseased skin restructure |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6012061861; 実験医学 Ｖｏｌ．１２， Ｎｏ．１, 1994, ｐ．４７-５２ * |
| JPN6012061862; 実験医学 Ｖｏｌ．１０， Ｎｏ．１６, 1992, ｐ．２０９９-２１０１ * |
| JPN6012061864; 細胞工学 Ｖｏｌ．１３， Ｎｏ．９, 1994, ｐ．７９８-８０２ * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012016311A (en) * | 2010-07-08 | 2012-01-26 | Mandom Corp | Method for evaluating substance to be tested |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5408520B2 (en) | 2014-02-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Benny et al. | Making more matrix: enhancing the deposition of dermal–epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding | |
| Krontiras et al. | Adipogenic differentiation of stem cells in three‐dimensional porous bacterial nanocellulose scaffolds | |
| Ehrlich et al. | Collagen organization critical role in wound contraction | |
| Guo et al. | Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid–stimulated human corneal fibroblasts | |
| JP2024133358A (en) | Three-dimensional structure, method for producing the same, and agent for forming the three-dimensional structure | |
| Zhang et al. | Cellular nanofiber structure with secretory activity-promoting characteristics for multicellular spheroid formation and hair follicle regeneration | |
| Rubinstein et al. | In vitro characteristics of human glioblastomas maintained in organ culture systems: light microscopy observations | |
| US6607720B1 (en) | Genetically altered mammalian embryonic stem cells, their living progeny, and their therapeutic application for improving cardiac function after myocardial infarction | |
| JP2005525088A (en) | Skin / hair equivalent with reconstituted teat | |
| TW201233800A (en) | Lung tissue model | |
| Van Kilsdonk et al. | An in vitro wound healing model for evaluation of dermal substitutes | |
| JPWO2006093207A1 (en) | Substrate for controlling cell differentiation/proliferation | |
| Ravindran et al. | Development of three-dimensional biomimetic scaffold to study epithelial–mesenchymal interactions | |
| JP2017525438A (en) | Tissue graft | |
| WO2020203369A1 (en) | Cell construct and cell construct production method | |
| WO2019208832A1 (en) | Extracellular-matrix-containing composition, method for producing same, three-dimensional tissue construct, and three-dimensional tissue construct formation agent | |
| Hu et al. | Efficient induction of functional ameloblasts from human keratinocyte stem cells | |
| Pillet et al. | Importance of endogenous extracellular matrix in biomechanical properties of human skin model | |
| LaNasa et al. | Influence of ECM proteins and their analogs on cells cultured on 2-D hydrogels for cardiac muscle tissue engineering | |
| KR20200055673A (en) | Organoid using carrier for cell culture and method for evaluating drug toxicity using the same | |
| WO2019093477A1 (en) | Artificial fat tissue and method for producing same, method for producing artificial skin and agent for fat cell culture | |
| KR20200002655A (en) | Method of Noninvasive Preparation of Human-Derived 3-Dimensional Organoid | |
| EP4095234A1 (en) | Method for controlling young's modulus of three-dimensional tissue body, method for producing three-dimensional tissue body, and three-dimensional tissue body | |
| JP5228246B2 (en) | Three-dimensional disease skin reconstruction | |
| JP5408520B2 (en) | Skin model construct |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101022 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121211 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131015 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131024 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |