JP2009109325A - Sugar chain analysis method and sugar chain analysis apparatus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、CE-MS（キャピラリー電気泳動質量分析）による糖鎖分析方法および糖鎖分析に使用されるCE-MS装置に関する。より詳しくは、試料中の微量糖鎖を高感度に分析することができる糖鎖分析方法および糖鎖分析装置に関する。 The present invention relates to a sugar chain analysis method by CE-MS (capillary electrophoresis mass spectrometry) and a CE-MS apparatus used for sugar chain analysis. More specifically, the present invention relates to a sugar chain analysis method and a sugar chain analyzer that can analyze a minute amount of sugar chains in a sample with high sensitivity.
細胞に存在する複合糖鎖は極微量で多彩な生理機能を有する重要な生体構成成分であることから、生体に存在する複合糖鎖の極微量構造解析法の早急な確立は極めて重要である。 Since complex sugar chains existing in cells are an extremely small amount of important biological components having various physiological functions, it is extremely important to quickly establish a method for analyzing the structure of trace amounts of complex sugar chains present in living bodies.
糖鎖構造解析の分野では、糖鎖をピリジルアミノ(PA)化などの芳香族アミノ蛍光標識誘導体として、蛍光検出器を用いて検出することが広く行われている（例えば非特許文献１参照）。分離分析装置としては、蛍光検出器を有する高速液体クロマトグラフィー(HPLC)やキャピラリー電気泳動(CE)などが通常使用されている。しかし、HPLCによる分析では、HPLCの吸着性により微量試料の高感度分析は困難である。そのため、複合糖鎖の分析法としてはCEが好適である。特にレーザー励起蛍光検出器(LIF)と直結したCE-LIFは、CEが有する低吸着性故、現在のところ極微量糖鎖の検出を可能にする唯一の方法であると考えられる（例えば非特許文献２および３参照）。 In the field of sugar chain structure analysis, sugar chains are widely detected using a fluorescence detector as an aromatic amino fluorescent labeled derivative such as pyridylamino (PA) (see, for example, Non-Patent Document 1). As the separation / analysis apparatus, high performance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis (CE) or the like having a fluorescence detector is usually used. However, in the analysis by HPLC, high-sensitivity analysis of a trace amount sample is difficult due to the adsorptivity of HPLC. Therefore, CE is suitable as a method for analyzing complex sugar chains. In particular, CE-LIF, which is directly connected to a laser-excited fluorescence detector (LIF), is considered to be the only method that enables detection of extremely small amounts of sugar chains at present because of the low adsorptivity of CE. Reference 2 and 3).
しかし、細胞には多種多様な糖鎖が含まれ、それらの含有量は極微量である。そのため細胞に含まれる糖鎖を高感度分析するためには、試料が極微量であっても複数の糖鎖を良好に分離できる手段が必要である。更に糖鎖には複数の異性体が存在するため、将来的にはそれら異性体をも同定するために、質量分析計の導入が不可欠となると考えられる。 However, cells contain a wide variety of sugar chains, and their content is extremely small. Therefore, in order to perform high-sensitivity analysis of sugar chains contained in cells, a means capable of satisfactorily separating a plurality of sugar chains is required even if the amount of the sample is extremely small. Furthermore, since there are a plurality of isomers in the sugar chain, it will be indispensable to introduce a mass spectrometer in order to identify these isomers in the future.
従来のCE-MS（キャピラリー電気泳動質量分析）では、CE-MSインターフェイスがイオンスプレー幅の大きいシースフローインターフェイスである。これに対し、例えば非特許文献４および５には、CE-MSの新たなインターフェイスとして、シースレスインターフェイスが提案されている。シースフローインターフェイスでは、シース液とネブライズガスのアシストによってイオン化が行われるのに対し、シースレスインターフェイスは、上記アシストなしにイオン化を行う。シースフローインターフェイスは、操作が簡便であるものの、イオン化の直前に試料溶液がシース液により希釈されてしまい、更にスプレー幅が大きく拡散してしまうために、物理的に感度低下を免れることができない。例えば非特許文献５には、シースフローインターフェイスを用いた場合、シースレスインターフェイスでの分析結果に比べ１０倍ほどの感度低下が見られたことが報告されている。上記感度低下は、微量糖鎖の分析では高感度分析の大きな妨げとなる。
以上の知見から、本発明者らは、高感度なシースレスCE-MS法により微量糖鎖を分析するために検討を重ねた。しかしその結果、従来のシースレスCE-MSでは、安定なイオン化が困難であったり、スプレー部先端とMSの試料導入口との間でグロー放電が起こることにより、MSにおいて検出可能な量のイオンを得ることが困難であることが判明した。 Based on the above findings, the present inventors have repeatedly studied to analyze a trace amount of sugar chain by a highly sensitive sheathless CE-MS method. However, as a result, with conventional sheathless CE-MS, stable ionization is difficult, or glow discharge occurs between the tip of the spray unit and the sample inlet of the MS. It turned out to be difficult to obtain.
そこで本発明の目的は、シースレスCE-MSにより微量糖鎖を高感度に分析するための手段を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a means for analyzing trace sugar chains with high sensitivity by sheathless CE-MS.
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、キャピラリー電気泳動に使用するキャピラリーだけでなく、該キャピラリーに連結した排出部にまで泳動電流を流すとともに、キャピラリーの内径と、試料溶液を排出する排出部先端内径との比を所定範囲とし、かつ排出部への電圧印加を行わずに試料を含む泳動液を排出することにより、シース液やネブライザガスによるアシストなしに安定な噴霧およびイオン化が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the inventors of the present invention flow not only the capillary used for capillary electrophoresis but also the discharge portion connected to the capillary, and the inner diameter of the capillary Stable without the assistance of sheath liquid and nebulizer gas by discharging the electrophoretic solution containing the sample without applying voltage to the discharge part within the specified range of the ratio of the tip of the discharge part to discharge the sample solution. As a result, it was found that nebulization and ionization were possible, and the present invention was completed.
即ち、上記目的は、下記手段によって達成された。
［１］電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの一方の端部に連結された排出部、該排出部先端と非接触状態に配置された開口を有する質量分析部、を含む分析装置により、糖鎖を含む試料を分析する糖鎖分析方法であって、
上記排出部に連結された端部とは反対のキャピラリー端部から前記試料を導入すること、
泳動液が充填されたキャピラリーおよび排出部に泳動電流を流すことにより、該キャピラリーおよび排出部において、前記導入された試料中の糖鎖を電気泳動させること、
上記電気泳動後の糖鎖を含む泳動液を、上記排出部への電圧印加を行うことなく、該排出部先端から排出することにより前記開口に導入すること、
を含み、かつ、
上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有することを特徴とする糖鎖分析方法。
［２］前記試料導入側のキャピラリー端部を、電源と接続した電極を配置した溶液槽中の溶液に浸漬した状態で、該電源から電圧を印加することによって、前記泳動電流を流す［１］に記載の糖鎖分析方法。
［３］前記泳動液は、有機酸および／または有機酸塩を含む緩衝液である［１］または［２］に記載の糖鎖分析方法。
［４］前記試料導入を、前記排出部と連結された端部とは反対の端部に泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電圧を印加することにより行う［１］〜［３］のいずれかに記載の糖鎖分析方法。
［５］前記質量分析部は、イオントラップ型質量分析部を含み、前記イオントラップ型質量分析部において、目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比から目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比+４amuの範囲の質量対電荷比を有するイオンを捕捉し質量分析することを含む［１］〜［４］のいずれかに記載の糖鎖分析方法。
［６］前記質量分析部は、イオントラップ型質量分析部および飛行時間型質量分析部を含み、
前記イオントラップ型質量分析部において、目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比から目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比+４amuの範囲の質量対電荷比を有するイオンを捕捉すること、および、前記イオントラップ型質量分析部において捕捉されたイオンを上記飛行時間型質量分析部へ導入し質量分析を行うこと、を含む［１］〜［４］のいずれかに記載の糖鎖分析方法。
［７］前記イオントラップ型質量分析部において捕捉されたイオンを開裂し、該開裂により生成したイオンを前記飛行時間型質量分析部へ導入して質量分析を行う［６］に記載の糖鎖分析方法。
［８］前記試料中に含まれる糖鎖の総量は、試料１μｌあたりアトモル量〜フェムトモル量の範囲である［１］〜［７］のいずれかに記載の糖鎖分析方法。
［９］電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの一方の端部に連結された排出部、該排出部先端と非接触状態で配置された開口を有する質量分析部を含み、かつ前記排出部への電界印加を行わない糖鎖分析装置であって、
上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有することを特徴とする糖鎖分析装置。
［１０］前記質量分析部はイオントラップ型質量分析部と飛行時間型質量分析部を含む［９］に記載の糖鎖分析装置。
［１１］［１］〜［８］のいずれかに記載の糖鎖分析方法に使用される［９］または［１０］に記載の糖鎖分析装置。
That is, the above object has been achieved by the following means.
[1] By using an analyzer including an electrophoresis capillary, a discharge part connected to one end of the capillary, and a mass spectrometer having an opening arranged in a non-contact state with the tip of the discharge part, A sugar chain analysis method for analyzing a sample containing,
Introducing the sample from the end of the capillary opposite to the end connected to the discharge section;
By causing an electrophoresis current to flow through the capillary filled with the electrophoresis solution and the discharge part, thereby causing the sugar chain in the introduced sample to be electrophoresed in the capillary and the discharge part;
Introducing the electrophoresis solution containing the sugar chain after electrophoresis into the opening by discharging from the tip of the discharge unit without applying a voltage to the discharge unit;
Including, and
The sugar chain analysis method, wherein the tip of the discharge section has an inner diameter of 50% or more and less than 100% of the inner diameter of the capillary.
[2] The electrophoresis current is caused to flow by applying a voltage from the power source while the capillary end on the sample introduction side is immersed in a solution in a solution tank in which an electrode connected to the power source is arranged [1] The method for analyzing a sugar chain as described in 1.
[3] The sugar chain analysis method according to [1] or [2], wherein the electrophoresis solution is a buffer solution containing an organic acid and / or an organic acid salt.
[4] In the sample introduction, a plug region holding a liquid different from the electrophoresis solution is formed at an end opposite to the end connected to the discharge unit, and the end surface of the plug region is a sample including the sample. The sugar chain analysis method according to any one of [1] to [3], which is performed by applying a voltage to the capillary in contact with a solution.
[5] The mass spectrometric unit includes an ion trap type mass spectrometric unit, and in the ion trap type mass spectrometric unit, the mass-to-charge ratio of the target pseudo-molecule ion to the mass-to-charge ratio of the target pseudo-molecular ion The method for analyzing a sugar chain according to any one of [1] to [4], comprising capturing ions having a mass-to-charge ratio in the range of +4 amu and performing mass analysis.
[6] The mass spectrometer includes an ion trap mass analyzer and a time-of-flight mass analyzer.
Capturing an ion having a mass-to-charge ratio in a range from the mass-to-charge ratio of the target pseudo-molecular ion to the mass-to-charge ratio of the target pseudo-molecular ion + 4 amu in the ion trap mass analyzing unit; The method for analyzing a sugar chain according to any one of [1] to [4], further comprising introducing ions trapped in the ion trap mass spectrometer to the time-of-flight mass analyzer and performing mass analysis.
[7] The glycan analysis according to [6], wherein the ions trapped in the ion trap mass spectrometer are cleaved, and the ions generated by the cleavage are introduced into the time-of-flight mass analyzer to perform mass analysis. Method.
[8] The method for analyzing a glycan according to any one of [1] to [7], wherein the total amount of glycans contained in the sample is in the range of attomole to femtomole per 1 μl of sample.
[9] A capillary for electrophoresis, a discharge part connected to one end of the capillary, a mass spectrometer having an opening arranged in a non-contact state with the tip of the discharge part, and an electric field to the discharge part A sugar chain analyzer that does not apply,
The sugar chain analyzer according to claim 1, wherein the tip of the discharge part has an inner diameter of 50% or more and less than 100% of the inner diameter of the capillary.
[10] The sugar chain analyzer according to [9], wherein the mass spectrometer includes an ion trap mass analyzer and a time-of-flight mass analyzer.
[11] The sugar chain analyzer according to [9] or [10], which is used in the sugar chain analysis method according to any one of [1] to [8].
本発明によれば、複数種の糖鎖を各々数百アトモル絶対量程度の極微量含有する試料から、各糖鎖の構造を迅速かつ正確に解析することが可能になる。これにより、生体に存在する極微量糖鎖の詳細な一斉構造解析が可能となり、糖鎖の質的および量的変化を伴う各種悪性腫瘍、神経疾患など多くの疾患の迅速な生化学的確定診断、ならびに病気予後の病態追跡に極めて有用なシステムを提供することができるものと期待される。 According to the present invention, it is possible to quickly and accurately analyze the structure of each sugar chain from a sample containing a plurality of kinds of sugar chains in an extremely small amount of about several hundred attomole absolute amounts. This enables detailed simultaneous structural analysis of ultra-small sugar chains in living organisms, and rapid biochemical definitive diagnosis of many diseases such as various malignant tumors and neurological diseases that involve qualitative and quantitative changes in sugar chains. In addition, it is expected to provide a system that is extremely useful for tracking the pathology of disease prognosis.
本発明は、電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの一方の端部に連結された排出部、該排出部先端と非接触状態に配置された開口を有する質量分析部、を含む分析装置により、糖鎖を含む試料を分析する糖鎖分析方法に関する。
本発明の糖鎖分析方法は、上記排出部に連結された端部とは反対のキャピラリー端部から前記試料を導入すること、泳動液が充填されたキャピラリーおよび排出部に泳動電流を流すことにより、該キャピラリーおよび排出部において、前記導入された試料中の糖鎖を電気泳動させること、上記電気泳動後の糖鎖を含む泳動液を、上記排出部への電圧印加を行うことなく、該排出部先端から排出することにより前記開口に導入すること、を含む。更に、上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有する。
The present invention provides a sugar chain by an analyzer comprising an electrophoresis capillary, a discharge part connected to one end of the capillary, and a mass spectrometer having an opening arranged in a non-contact state with the tip of the discharge part. The present invention relates to a sugar chain analysis method for analyzing a sample containing
In the sugar chain analysis method of the present invention, the sample is introduced from the end of the capillary opposite to the end connected to the discharge part, and the electrophoresis current is passed through the capillary filled with the electrophoresis solution and the discharge part. In the capillary and the discharge part, the sugar chain in the introduced sample is electrophoresed, and the electrophoresis solution containing the sugar chain after the electrophoresis is discharged without applying a voltage to the discharge part. And introducing into the opening by discharging from the tip of the part. Furthermore, the discharge part tip has an inner diameter of 50% or more and less than 100% of the capillary inner diameter.
一般的なシースフローCE-MS装置の概略図を図１に示し、本発明において使用可能なシースレスCE-MS装置の概略図を図２に示す。但し、本発明において使用されるCE-MS装置は、図２に示す態様に限定されるものではない。以下、図面に基づき本発明の糖鎖分析方法の概要を説明する。 A schematic view of a general sheath flow CE-MS apparatus is shown in FIG. 1, and a schematic view of a sheathless CE-MS apparatus usable in the present invention is shown in FIG. However, the CE-MS apparatus used in the present invention is not limited to the embodiment shown in FIG. Hereinafter, the outline of the sugar chain analysis method of the present invention will be described with reference to the drawings.
本発明の糖鎖分析方法は、CE（キャピラリー電気泳動）とMS（質量分析計）のインターフェイスとしてシースレスインターフェイスを使用する。一般的なシースフローインターフェイスは、図１に示すように、キャピラリー外へ排出された泳動液にシース液およびＮ2ガス等のネブライザガスを混合した後、スプレーチップ先端から噴霧することにより、エレクトロスプレーイオン化によって分析対象物質をイオン化した上でＭＳへ導入する。これに対し、本発明において使用されるシースフローCE-MSでは、図２に示すように、CEにおいて電気泳動した糖鎖は、引き続き排出部（図２に示す態様ではコネクタおよびスプレーチップ）において電気泳動した後、排出部先端から排出される。ここで、排出前の泳動液へのシース液やネブライザガスの混合は行われない。シースフローCE-MSは、シース液およびネブライザガスによるアシストによりエレクトロスプレーイオン化（ESI）を容易に行うことができるものの、シース液による希釈やスプレー中の拡散による感度低下の問題がある。これに対し、シースフローCE-MSによれば、上記の希釈化や拡散は生じない。しかし、先に説明したように、本発明者らの検討の結果、従来のシースレスCE-MS装置において、糖鎖を含む試料溶液をスプレーチップ先端から噴霧しようとすると、スプレーチップ先端とMSの試料導入口との間でグロー放電が生じたり、イオン化が不十分であるために、MSにおいて検出可能な量のイオンを得ることが困難であることが判明した。しかし驚くべきことに、本発明者らの更なる検討により、従来のシースレスCE-MSにおいて行われていたスプレーチップ先端への電圧印加を行わず、分析対象の糖鎖をキャピラリー内だけでなくMS開口へ向けて排出されるまで電気泳動を行い、かつスプレーチップ（排出部）先端の内径をCEに使用するキャピラリー内径の５０％以上１００％未満の範囲とすることにより、電気泳動後の糖鎖を含む泳動液を排出部先端から噴霧し、MSにおいて検出可能な量のイオンを安定に得ることができることが新たに見出された。これにより微量糖鎖の高感度分析が可能となる。従来のCE-MSでは、CEでの泳動液の流量は微量であるため泳動液をそのまま排出しても安定なイオン化を行うことができないと考えられていた。そのため、シース液やネブライザガスによるアシストや、スプレーチップ先端へ電圧印加を行わなければエレクトロスプレーイオン化による安定なイオン化は困難と考えられていたにもかかわらず、本発明によりシース液やネブライザガスの混合およびスプレーチップ先端への電圧印加なしに、安定なイオン化が可能となったことはきわめて驚くべき点である。この理由は定かではないが、キャピラリー内径とスプレーチップ先端内径との比の最適な範囲を見出したこと、およびMS開口に向けて排出されるまで泳動液に泳動電流を印加し続けることが理由と推察される。シース液やネブライザガスの混合のための装置や、スプレーチップ先端へ電圧を印加するための装置を導入することなくCE-MSが可能になったことは、装置の小型化、コスト低減等の点で、大きな利点である。
以下に、本発明の糖鎖分析方法について、更に詳細に説明する。
The sugar chain analysis method of the present invention uses a sheathless interface as an interface between CE (capillary electrophoresis) and MS (mass spectrometer). As shown in FIG. 1, a general sheath flow interface is obtained by mixing a sheath solution and a nebulizer gas such as N 2 gas into the electrophoresis solution discharged out of the capillary, and then spraying it from the tip of the spray tip, thereby performing electrospraying. The substance to be analyzed is ionized by ionization and then introduced into the MS. On the other hand, in the sheath flow CE-MS used in the present invention, as shown in FIG. 2, the sugar chains electrophoresed in CE continue to be discharged in the discharge part (connector and spray tip in the embodiment shown in FIG. 2). After the electrophoresis, it is discharged from the tip of the discharge part. Here, mixing of the sheath liquid and the nebulizer gas into the electrophoretic liquid before discharge is not performed. Although the sheath flow CE-MS can easily perform electrospray ionization (ESI) with the assistance of the sheath liquid and the nebulizer gas, there is a problem of sensitivity reduction due to dilution with the sheath liquid and diffusion in the spray. On the other hand, according to sheath flow CE-MS, the above dilution and diffusion do not occur. However, as described above, as a result of the study by the present inventors, when a sample solution containing a sugar chain is to be sprayed from the tip of the spray tip in the conventional sheathless CE-MS apparatus, the tip of the spray tip and the sample of MS It has been found that it is difficult to obtain a detectable amount of ions in MS due to glow discharge between the inlet and insufficient ionization. Surprisingly, however, the inventors further studied that, without applying a voltage to the tip of the spray tip, which was performed in conventional sheathless CE-MS, the sugar chain to be analyzed was not only in the capillary but also in the MS. Electrophoresis is carried out until it is discharged toward the opening, and the inner diameter of the tip of the spray tip (discharge section) is in the range of 50% to less than 100% of the inner diameter of the capillary used for CE, so that the sugar chain after electrophoresis It has been newly found that the electrophoresis solution containing can be sprayed from the tip of the discharge part to stably obtain an amount of ions detectable in MS. Thereby, highly sensitive analysis of a trace amount sugar chain is attained. In conventional CE-MS, it was thought that stable ionization cannot be performed even if the electrophoresis solution is discharged as it is because the flow rate of the electrophoresis solution in CE is very small. For this reason, it is considered that stable ionization by electrospray ionization is difficult unless an electric voltage is applied to the tip of the spray tip or the tip of the spray tip. It is very surprising that stable ionization is possible without applying voltage to the tip of the spray tip. The reason for this is not clear, but the reason is that the optimum range of the ratio between the capillary inner diameter and the spray tip tip inner diameter has been found and that the electrophoresis current is continuously applied to the electrophoresis solution until it is discharged toward the MS opening. Inferred. The fact that CE-MS has become possible without introducing a device for mixing sheath fluid and nebulizer gas or a device for applying voltage to the tip of the spray tip is the reason for downsizing the device and reducing costs. It is a big advantage.
Hereinafter, the sugar chain analysis method of the present invention will be described in more detail.
電気泳動
本発明における電気泳動は、電気泳動用キャピラリー内だけでなく排出部内でも行われる。本発明におけるシースレスCE-MS装置への泳動電流印加方法の説明図を図３に示す。以下に、図３に基づき本発明における電気泳動について説明する。但し本発明は、図３に示す態様に限定されるものではない。
Electrophoresis Electrophoresis in the present invention is performed not only in the electrophoresis capillary but also in the discharge portion. FIG. 3 is an explanatory diagram of a method for applying an electrophoretic current to the sheathless CE-MS apparatus according to the present invention. Hereinafter, electrophoresis in the present invention will be described with reference to FIG. However, the present invention is not limited to the embodiment shown in FIG.
一般的なCE-MSでは、キャピラリーの一端側に陽極、他端側に陰極を配置し、両電極間に電圧を印加する。この状態では陽極と陰極との間に泳動電流が流れる。これに対し、本発明では、図３に示すように、キャピラリーの試料導入側の端部を、電源と接続した電極を配置した溶液槽中の溶液に浸漬した状態で、電源から電圧を印加することが好ましい。これにより、キャピラリー内だけでなく排出部先端まで泳動電流を流すことができる。なお、ここでグランド（アース電位）を取ることは行わなくてよい。 In general CE-MS, an anode is arranged at one end of a capillary and a cathode is arranged at the other end, and a voltage is applied between both electrodes. In this state, an electrophoretic current flows between the anode and the cathode. On the other hand, in the present invention, as shown in FIG. 3, a voltage is applied from the power source in a state in which the end portion on the sample introduction side of the capillary is immersed in a solution in a solution tank in which an electrode connected to the power source is disposed. It is preferable. As a result, the migration current can flow not only in the capillary but also to the tip of the discharge part. It is not necessary to take the ground (earth potential) here.
キャピラリー電気泳動を行うための装置としては、キャピラリーから排出部先端まで泳動電流を流すことができる装置であればよく、公知のキャピラリー電気泳動装置の電源の接続方法を適宜変更し使用すればよい。また、使用するキャピラリーは、分離対象の糖鎖の性質や分離能を考慮し市販品から選択することができる。例えば、ポリイミドなどの樹脂でコーティングされたフューズドシリカキャピラリー等を使用することができる。 The apparatus for performing capillary electrophoresis may be any apparatus that can flow an electrophoretic current from the capillary to the tip of the discharge section, and may be used by appropriately changing a method for connecting a power source of a known capillary electrophoresis apparatus. In addition, the capillary to be used can be selected from commercially available products in consideration of the properties and separation ability of the sugar chain to be separated. For example, a fused silica capillary coated with a resin such as polyimide can be used.
キャピラリー内への試料導入は、排出部と連結した端部とは反対の端部から行われる。試料導入は、圧力を加えることにより試料溶液をキャピラリー内へ導入する、一般に加圧導入法と呼ばれる方法を用いることもできるが、泳動液を充填したキャピラリーの一端に、泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電界を印加することにより行うことが好ましい。 Sample introduction into the capillary is performed from the end opposite to the end connected to the discharge section. For sample introduction, a method called a pressure introduction method, in which a sample solution is introduced into the capillary by applying pressure, can be used. However, a liquid different from the electrophoresis solution is put on one end of the capillary filled with the electrophoresis solution. It is preferable to form the held plug region and apply an electric field to the capillary in a state where the end surface of the plug region is in contact with the sample solution containing the sample.
上記加圧導入法は、圧力を加えることにより試料溶液をキャピラリー内に導入する。例えば、泳動液を充填したキャピラリーの一端を、ゴム栓等により密閉されたバイアル中の試料溶液に浸漬した後、ゴム栓を上から押すことにより液面に圧がかかり試料溶液中に浸漬したキャピラリーの開口から試料溶液がキャピラリーに導入される。このような加圧導入法では、キャピラリー内への試料導入量はわずか数ｎｌ〜数１０ｎｌ程度である。装置にセットする試料溶液量を、操作上実用的な５μｌ（５，０００ｎｌ）程度にする場合、加圧導入法による試料導入では、９９．８％以上の試料が注入されず分析に供されないこととなる。
一方、泳動液を充填したキャピラリーの一端にプラグ領域（濃縮ゾーン）を形成し、この領域に試料（溶質）を電気泳動させることにより導入すれば、試料を溶液として導入する加圧導入法に比べて、多量の試料をキャピラリー内に導入することができる。試料中の分析対象糖鎖が少ないほど、試料導入時のロスは避けるべきである。従って、本発明では、上記方法によりキャピラリー内へ分析対象糖鎖を導入することにより、試料導入時のロスを低減し、検出感度を高めることが好ましい。
以下に、上記試料導入方法について更に詳細に説明する。
In the pressure introduction method, the sample solution is introduced into the capillary by applying pressure. For example, after immersing one end of a capillary filled with electrophoresis solution in a sample solution in a vial sealed with a rubber stopper, the capillary is immersed in the sample solution by pressing the rubber stopper from above to apply pressure to the liquid surface. The sample solution is introduced into the capillary through the opening. In such a pressure introduction method, the amount of sample introduced into the capillary is only a few nl to a few tens of nl. When the amount of sample solution to be set in the device is about 5 μl (5,000 nl), which is practical for operation, 99.8% or more of the sample is not injected and not used for analysis in the sample introduction by the pressure introduction method. It becomes.
On the other hand, if a plug region (concentration zone) is formed at one end of a capillary filled with an electrophoretic solution and the sample (solute) is introduced by electrophoresis in this region, compared to the pressure introduction method in which the sample is introduced as a solution. Thus, a large amount of sample can be introduced into the capillary. The less the sugar chain to be analyzed in the sample, the more loss during sample introduction should be avoided. Therefore, in the present invention, it is preferable to reduce loss during sample introduction and increase detection sensitivity by introducing the sugar chain to be analyzed into the capillary by the above method.
Hereinafter, the sample introduction method will be described in more detail.
前記プラグ領域は、プラグ領域形成用の溶液を、加圧導入法と同様に圧力を加えてキャピラリーの一端から導入することにより形成することができる。プラグ領域の範囲は、濃縮効率と電気泳動時の分離効率を考慮し決定することが好ましく、例えばキャピラリー内の泳動液容量の60分の１〜200分の１程度とすることが好ましい。 The plug region can be formed by introducing a solution for forming the plug region from one end of the capillary by applying pressure in the same manner as in the pressure introduction method. The range of the plug region is preferably determined in consideration of the concentration efficiency and the separation efficiency during electrophoresis. For example, the range of the plug region is preferably about 1/60 to 1/200 of the volume of the electrophoresis solution in the capillary.
プラグ領域形成用溶液としては、試料溶液をそのまま用いてもよいが、試料溶液調製用の溶媒（試料未含有）を使用することが好ましい。またプラグ領域において良好に濃縮を行うためには、キャピラリー内に充填した泳動液とは異なる種類の溶液を使用することが好ましく、泳動液中での電気泳動を良好に行うためには、泳動液の伝導度が高く、プラグ領域形成用溶液の伝導度が低いことが好ましい。具体的には、アセトニトリル、アセトニトリル／水混合溶液、アセトン、アセトン／水混合溶液等を使用することができる。 As the plug region forming solution, the sample solution may be used as it is, but it is preferable to use a solvent for sample solution preparation (sample free). Also, in order to perform good concentration in the plug region, it is preferable to use a different type of solution from the electrophoresis solution packed in the capillary, and in order to perform electrophoresis in the electrophoresis solution well, Preferably, the conductivity of the plug region forming solution is low. Specifically, acetonitrile, acetonitrile / water mixed solution, acetone, acetone / water mixed solution and the like can be used.
次いで、プラグ領域を形成した側のキャピラリー末端を、試料を含む溶液（試料溶液）に浸漬することにより、プラグ領域端面を試料溶液と接触させる。この状態でキャピラリーに電界を印加すると、電気泳動により、試料溶液中の試料がプラグ領域内に導入される。プラグ領域形成用溶液は泳動液とは異なる溶液であり伝導度に差があるため、プラグ領域内に導入された試料は両液の界面付近に留まる。電界を印加するほど試料溶液の導入量が多くなるため、プラグ領域に試料を濃縮することができる。上記試料導入時に印加する電圧が過度に高いと、両溶液間に伝導度の差がある場合であっても試料が越えて泳動液中（泳動ゾーン）に導入されてしまう。そのため、試料導入時に印加する電圧は、界面での試料濃縮を良好に行うことができる範囲に設定することが好ましく、具体的には、5〜30ｋＶ程度とすることが好ましい。また、試料導入のための電界印加時間は、プラグ領域の容量等によって適宜設定すればよいが、例えば0.5〜2分間程度とすることができる。なお、上記電圧印加は、キャピラリー両端に陽極および陰極をそれぞれ配置して行ってもよく、前述のようにキャピラリーから排出部にかけて電流が流れるように行ってもよい。試料導入終了後、試料溶液中に浸漬していたキャピラリー末端をそのまま試料溶液中に浸漬した状態で、または適当な溶液（例えば電解液等）中に浸漬し、電気泳動を行う。 Next, the end of the capillary on the side where the plug region is formed is immersed in a solution containing the sample (sample solution), thereby bringing the end surface of the plug region into contact with the sample solution. When an electric field is applied to the capillary in this state, the sample in the sample solution is introduced into the plug region by electrophoresis. Since the plug region forming solution is different from the electrophoresis solution and has a difference in conductivity, the sample introduced into the plug region remains near the interface between the two solutions. Since the amount of sample solution introduced increases as the electric field is applied, the sample can be concentrated in the plug region. If the voltage applied at the time of sample introduction is excessively high, the sample will be introduced into the electrophoresis solution (electrophoresis zone) even if there is a difference in conductivity between the two solutions. Therefore, the voltage applied at the time of sample introduction is preferably set in a range in which sample concentration at the interface can be satisfactorily performed, and specifically, it is preferably about 5 to 30 kV. The electric field application time for introducing the sample may be set as appropriate depending on the capacity of the plug region, etc., and can be set to about 0.5 to 2 minutes, for example. The voltage application may be performed with the anode and the cathode disposed at both ends of the capillary, or may be performed such that a current flows from the capillary to the discharge portion as described above. After the introduction of the sample, electrophoresis is performed with the capillary end immersed in the sample solution immersed in the sample solution as it is, or in an appropriate solution (for example, an electrolytic solution).
糖鎖分離のための電気泳動における印加電圧は、前記界面に濃縮された試料が泳動液中に導入されるように、前述の試料導入時の印加電圧より高く設定することが好ましく、具体的には、20〜30ｋＶ程度とすることができる。また、電界印加時間は分離すべき糖鎖の性質を考慮して設定すればよく特に限定されるものではないが、例えば10〜40分間程度とすることができる。前述のように、本発明では、電気泳動後の糖鎖を含む泳動液を、キャピラリーの一端に連結された排出部の先端から排出する。安定な噴霧およびイオン化を行うためには、少なくとも排出時まで泳動電流を流し続けることが好ましい。更に、安定な噴霧およびイオン化を行うためには、電気泳動開始から排出までの間、キャピラリーの試料導入側の端部から排出部に向けて、キャピラリー内および排出部内に圧力を加えることが好ましい。上記圧力は、前述の加圧導入法に準じて加えることができる。キャピラリー内および排出部内へ加える圧力は、1.4×104〜6.9×104Pa程度とすることができる。また、泳動液の温度は特に限定されるものではないが、例えば15〜50℃程度とすることができる。 The applied voltage in electrophoresis for separation of glycans is preferably set higher than the applied voltage at the time of introducing the sample so that the sample concentrated at the interface is introduced into the electrophoresis solution. Can be about 20-30 kV. The electric field application time is not particularly limited as long as it is set in consideration of the nature of the sugar chain to be separated, and can be, for example, about 10 to 40 minutes. As described above, in the present invention, the electrophoresis solution containing the sugar chain after electrophoresis is discharged from the tip of the discharge portion connected to one end of the capillary. In order to perform stable spraying and ionization, it is preferable to continue running the electrophoretic current at least until discharging. Furthermore, in order to perform stable spraying and ionization, it is preferable to apply pressure in the capillary and in the discharge part from the end of the capillary to the sample introduction side toward the discharge part from the start of electrophoresis to discharge. The pressure can be applied according to the aforementioned pressure introduction method. The pressure applied to the capillary and the discharge part can be about 1.4 × 10 4 to 6.9 × 10 4 Pa. In addition, the temperature of the electrophoresis solution is not particularly limited, but can be, for example, about 15 to 50 ° C.
本発明において糖鎖の電気泳動のために使用される泳動液としては、有機酸および／または有機酸塩を含む緩衝液（以下、「有機酸系バッファー」ともいう）を使用することが好ましい。有機酸系バッファーは揮発性が高いため、有機酸系バッファーの使用により、本発明におけるシースレスCE-MSにおいてエレクトロスプレーイオン化を良好に行うことができる。また、無機バッファーのようにMSを汚染することがないため、CEとMSを直接接続するCE-MSにおいて使用する泳動液として好適である。前記緩衝液としては、ギ酸緩衝液、ギ酸／ギ酸塩（例えばギ酸ナトリウム）緩衝液、酢酸緩衝液、酢酸／酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）緩衝液等を用いることができる。前記泳動液のｐHは、分離対象の糖鎖が電荷を帯びるように設定すればよい。 As the electrophoresis solution used for electrophoresis of sugar chains in the present invention, a buffer solution containing an organic acid and / or an organic acid salt (hereinafter also referred to as “organic acid buffer”) is preferably used. Since the organic acid buffer has high volatility, electrospray ionization can be favorably performed in the sheathless CE-MS of the present invention by using the organic acid buffer. Moreover, since MS does not contaminate unlike an inorganic buffer, it is suitable as an electrophoretic solution used in CE-MS in which CE and MS are directly connected. As the buffer, formic acid buffer, formic acid / formate (for example, sodium formate) buffer, acetic acid buffer, acetic acid / acetate (for example, sodium acetate) buffer, and the like can be used. The pH of the electrophoresis solution may be set so that the sugar chain to be separated is charged.
後述するように酸性糖鎖と中性糖鎖との混合物を分析するためには、酸性糖鎖と中性糖鎖と逆向きの電界で電気泳動することが好ましい。酸性糖鎖は負電荷を帯び得るため、上記観点からは、中性糖鎖には塩基性置換基を導入することが好ましい。塩基性置換基としては、一般に糖鎖を蛍光標識するために使用される各種の芳香族アミノ基を挙げることができる。中性糖鎖と酸性糖鎖との混合物を分析する場合等では、カルボキシル基等の酸性基を持たない置換基を用いることが好ましい。好ましい置換基としては、具体的には、２−アミノピリジニル基、２−アミノベンズアミド基を挙げることができる。中でも、２−アミノピリジニル基は、糖鎖の蛍光標識化（ピリジルアミノ化（PA化））に広く用いられており糖鎖への導入方法も確立されているため特に好ましい。前記置換基の導入は公知の方法で行うことができ、例えばPA化については前述の非特許文献１〜３等を参照することができる。また、分析対象糖鎖は、例えば、糖脂質、糖タンパク、糖アミノ酸等から公知の方法で遊離することにより得ることができる。また、酸性糖鎖と中性糖鎖の混合物を分析するために、該混合物に対して置換基導入のための試薬を作用させ、混合物中の酸性糖鎖と中性糖鎖の両方に置換基を導入することもできる。この場合、酸性糖鎖と中性糖鎖を個別に分離可能とするためには塩基性置換基を導入することが好ましい。前述の２−アミノピリジニル基は、酸性糖鎖および中性糖鎖の還元末端にきわめて効率良く反応し、キャピラリー内および排出部内に充填した緩衝液のｐHの微妙な変化に対応して中性糖鎖と酸性糖鎖を個別かつ良好に分離することができるため特に好ましい。 As will be described later, in order to analyze a mixture of an acidic sugar chain and a neutral sugar chain, it is preferable to perform electrophoresis in an electric field opposite to that of the acidic sugar chain and the neutral sugar chain. Since acidic sugar chains can be negatively charged, it is preferable to introduce a basic substituent into a neutral sugar chain from the above viewpoint. Examples of basic substituents include various aromatic amino groups that are generally used for fluorescently labeling sugar chains. When analyzing a mixture of a neutral sugar chain and an acidic sugar chain, it is preferable to use a substituent having no acidic group such as a carboxyl group. Specific examples of preferred substituents include a 2-aminopyridinyl group and a 2-aminobenzamide group. Among them, the 2-aminopyridinyl group is particularly preferable because it is widely used for fluorescent labeling of sugar chains (pyridylamination (PA conversion)) and a method for introducing it into sugar chains has been established. The introduction of the substituent can be performed by a known method. For example, for the PA formation, the above-mentioned Non-Patent Documents 1 to 3 can be referred to. Further, the sugar chain to be analyzed can be obtained by, for example, releasing it from a glycolipid, glycoprotein, sugar amino acid or the like by a known method. In addition, in order to analyze a mixture of acidic sugar chains and neutral sugar chains, a reagent for introducing a substituent is allowed to act on the mixture, and both the acidic sugar chains and neutral sugar chains in the mixture are substituted. Can also be introduced. In this case, it is preferable to introduce a basic substituent so that the acidic sugar chain and the neutral sugar chain can be separated separately. The aforementioned 2-aminopyridinyl group reacts very efficiently with the reducing ends of acidic sugar chains and neutral sugar chains, and neutral sugar chains corresponding to subtle changes in the pH of the buffer solution filled in the capillary and in the discharge part. And acidic sugar chains are particularly preferred because they can be separated individually and satisfactorily.
異なる性質（帯電性等）を有する複数種の糖鎖を含む試料を分析するためには、電気泳動を二工程以上に分けて行い、第二工程以降の電気泳動を、直前に行われた電気泳動においてキャピラリー内および排出部内に充填した泳動液とはｐＨの異なる泳動液をキャピラリーおよび排出部内に充填した後、または直前に行われた電気泳動においてキャピラリー内および排出部内に充填した泳動液のｐHを変更した後に行うことが好ましい。または、直前に行われた電気泳動とは逆向きの電圧を印加して電気泳動を行ってもよく、電圧の向きの変更と泳動液の変更を組み合わせて行なってもよい。泳動液のｐHを変えることにより、該ｐHで帯電し得る糖鎖のみを選択的に電気泳動させることができ、電圧の印加方向を逆向きとすることにより、正電荷を帯びた糖鎖と負電荷を帯びた糖鎖のいずれか一方のみを選択的に電気泳動させることができる。より好ましくは、泳動液の変更と電圧の印加方向の変更を併せて行う。具体的には、塩基性の泳動液を使用し、プラグ領域側が−、他方が＋となるように電圧印加を行い酸性糖鎖の分離分析を行った後、泳動液を酸性に変更した上でプラグ領域側が+、他方が−となるように電圧印加を行い、塩基性置換基を導入した中性糖鎖の分離分析を行うことができる。これにより、中性糖鎖と酸性糖鎖を選択的に分離分析することができる。ほとんどの生体試料では、中性糖鎖と酸性糖鎖が混在しているため、同一試料中の中性糖鎖と酸性糖鎖を独立して分離分析できることは、糖鎖解析にきわめて有用である。 In order to analyze a sample containing multiple types of sugar chains having different properties (chargeability, etc.), electrophoresis is performed in two or more steps, and electrophoresis after the second step is performed immediately before The pH of the electrophoresis solution filled in the capillary and the discharge portion after the electrophoresis solution having a different pH from that of the electrophoresis solution filled in the capillary and the discharge portion in the electrophoresis or in the electrophoresis performed immediately before It is preferable to carry out after changing. Alternatively, electrophoresis may be performed by applying a voltage in the opposite direction to the electrophoresis performed immediately before, or a change in voltage direction and a change in electrophoresis solution may be combined. By changing the pH of the electrophoresis solution, only sugar chains that can be charged with the pH can be selectively electrophoresed. By reversing the direction of voltage application, a positively charged sugar chain and a negatively charged sugar chain are negatively charged. Only one of the charged sugar chains can be selectively electrophoresed. More preferably, the change of the electrophoresis solution and the change of the voltage application direction are performed together. Specifically, after using a basic electrophoresis solution and applying a voltage so that the plug region side is-and the other is + and performing separation analysis of acidic sugar chains, the electrophoresis solution is changed to acidic. By applying a voltage so that the plug region side is + and the other side is-, the separation and analysis of the neutral sugar chain into which the basic substituent is introduced can be performed. Thereby, a neutral sugar chain and an acidic sugar chain can be selectively separated and analyzed. In most biological samples, neutral sugar chains and acidic sugar chains are mixed, and the ability to separate and analyze neutral sugar chains and acidic sugar chains in the same sample is extremely useful for sugar chain analysis. .
電気泳動を二工程以上に分けて行う場合、第二工程以降の電気泳動と直前に行われた電気泳動との間に、泳動液を充填したキャピラリーの一端に泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電界を印加することにより、キャピラリー内へ前記試料の少なくとも一部を導入する試料導入工程を再度行うこともできる。第一の工程で酸性糖鎖を分離分析し、続く第二の工程で塩基性置換基を導入した中性糖鎖を分離分析する場合のように、異なる向きの電荷を帯び得る糖鎖を個別に分離する際には、第一の工程で印加した電界とは逆向きの電界を印加することにより、プラグ領域内へ目的の糖鎖を選択的に導入することができる。 When electrophoresis is performed in two or more steps, a liquid different from the electrophoresis solution is held at one end of the capillary filled with the electrophoresis solution between the electrophoresis after the second step and the electrophoresis performed immediately before. A sample introduction step of introducing at least a part of the sample into the capillary by forming an plug region and applying an electric field to the capillary in a state where the end surface of the plug region is in contact with the sample solution containing the sample. You can do it again. Separate sugar chains that can be charged in different directions, as in the case of separating and analyzing acidic sugar chains in the first step and then separating and analyzing neutral sugar chains with basic substituents introduced in the second step. When separating into two, the target sugar chain can be selectively introduced into the plug region by applying an electric field opposite to the electric field applied in the first step.
電気泳動により分離した試料は、シースレスインターフェイスを経て質量分析部へ導入される。以下、シースレスインターフェイスについて説明する。 The sample separated by electrophoresis is introduced into the mass spectrometer through a sheathless interface. Hereinafter, the sheathless interface will be described.
シースレスインターフェイス
上記のように電気泳動後の糖鎖を含む泳動液は、キャピラリーの一端に連結された検出部の先端から排出され、その少なくとも一部が質量分析部の開口へ導入される。本発明では、前記排出部先端の内径を、キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の範囲とする。これにより、上記排出時にエレクトロスプレーイオン化を起こし、質量分析部により検出可能な量のイオンを安定に発生させることができる。前記排出部先端の内径が、キャピラリー内径の５０％未満では、グロー放電が生じたり、排出部先端から溶液を安定に噴霧することが困難となることにより、エレクトロスプレーイオン化を起こすことが困難となる。一方、前記排出部先端の内径が、キャピラリー内径と同サイズまたはそれ以上、即ち１００％以上では、安定な噴霧のために排出部を連結する意義が薄れる。排出部先端のキャピラリー内径に対する比の上限は、安定な噴霧を行うためには、７０％程度が好ましく、６０％程度がさらに好ましいと考えられる。なお、本発明において「噴霧」とは、エレクトロスプレーイオン化が可能な程度に溶液を霧状に排出することをいい、排出部先端で噴霧が行われたことは、例えば質量分析によりフラグメントが検出されたことで確認することができる。
Sheathless interface As described above, the electrophoresis solution containing the sugar chain after electrophoresis is discharged from the tip of the detection unit connected to one end of the capillary, and at least a part thereof is introduced into the opening of the mass analysis unit. In the present invention, the inner diameter of the distal end of the discharge section is set in a range of 50% or more and less than 100% of the capillary inner diameter. Thereby, electrospray ionization is caused at the time of the discharge, and an amount of ions detectable by the mass spectrometer can be stably generated. When the inner diameter of the discharge section tip is less than 50% of the capillary inner diameter, glow discharge occurs or it becomes difficult to stably spray the solution from the discharge section tip, which makes it difficult to cause electrospray ionization. . On the other hand, if the inner diameter of the tip of the discharge section is the same as or larger than the capillary inner diameter, that is, 100% or more, the significance of connecting the discharge section for stable spraying is reduced. The upper limit of the ratio of the tip of the discharge portion to the capillary inner diameter is preferably about 70% and more preferably about 60% in order to perform stable spraying. In the present invention, “spraying” refers to discharging the solution in a mist form to the extent that electrospray ionization is possible. The fact that the spraying was performed at the tip of the discharge unit is that, for example, fragments were detected by mass spectrometry. This can be confirmed.
前記排出部先端の内径は、前述のように、キャピラリー内径の５０％以上１００％未満であり、好ましくは５０％〜７０％、さらに好ましくは５０％〜６０％である。キャピラリー内径は、例えば１０〜１００μｍ程度である。通常、キャピラリー全長にわたって内径は略一定であるが、キャピラリー内で内径差がある場合、排出部先端の内径は、キャピラリーの最大内径に対する比で規定するものとする。本発明では、キャピラリー内径に応じて排出部先端内径を決定することもでき、排出部先端内径に応じて好適な内径を有するキャピラリーを選択することもできる。 As described above, the inner diameter of the discharge portion tip is 50% or more and less than 100% of the capillary inner diameter, preferably 50% to 70%, more preferably 50% to 60%. The capillary inner diameter is, for example, about 10 to 100 μm. Usually, the inner diameter is substantially constant over the entire length of the capillary, but when there is a difference in the inner diameter within the capillary, the inner diameter of the discharge portion tip is defined by a ratio to the maximum inner diameter of the capillary. In the present invention, the discharge portion tip inner diameter can be determined according to the capillary inner diameter, and a capillary having a suitable inner diameter can be selected according to the discharge portion tip inner diameter.
キャピラリーの全長は、特に限定されるものではないが、排出部先端から泳動液を噴霧しエレクトロスプレーイオン化を良好に行うためには、９０〜１３０μｍ程度とすることが好ましい。 The total length of the capillary is not particularly limited, but is preferably about 90 to 130 μm in order to spray electrophoretic liquid from the tip of the discharge part and perform electrospray ionization satisfactorily.
キャピラリーと連結される排出部は、キャピラリーの一端とスプレーチップとを連結するためのコネクタと、該コネクタを介してキャピラリー一端と接続されるスプレーチップからなることができる。コネクタは、キャピラリーとスプレーチップを連結できるものであればよく特に限定されるものではない。但し、図２に示すようにコネクタをコネクタホルダーにより固定する場合、コネクタホルダーが伝導性であるのであれば、不要な電流リークを回避するためにコネクタは非伝導性であることが好ましい。コネクタの内径は、キャピラリー内径と略同一であることが好ましい。また、スプレーチップとしては、コネクタと接続される側の端部の内径がコネクタ内径と略同一であり、他方の端部の内径がキャピラリー内径の５０％以上１００％未満の範囲のスプレーチップを用いることができる。スプレーチップとしては、一般にナノエレクトロスプレー用として市販されているスプレーチップが好適であり、例えばナノエレクトロスプレー用として市販されているガラス細管を使用することができる。安定な噴霧およびイオン化のためには、金属コーティングされたスプレーチップを使用することが好ましい。 The discharge unit connected to the capillary may include a connector for connecting one end of the capillary and the spray tip, and a spray tip connected to one end of the capillary via the connector. The connector is not particularly limited as long as it can connect the capillary and the spray tip. However, when the connector is fixed by the connector holder as shown in FIG. 2, if the connector holder is conductive, the connector is preferably nonconductive to avoid unnecessary current leakage. The inner diameter of the connector is preferably substantially the same as the inner diameter of the capillary. Further, as the spray tip, a spray tip is used in which the inner diameter of the end connected to the connector is substantially the same as the inner diameter of the connector, and the inner diameter of the other end is in the range of 50% to less than 100% of the capillary inner diameter. be able to. As the spray tip, a spray tip generally marketed for nanoelectrospray is suitable, and for example, a glass capillary tube marketed for nanoelectrospray can be used. For stable spraying and ionization, it is preferable to use a metal coated spray tip.
上記コネクタおよびスプレーチップを含む排出部の全長は特に限定されるものではないが、安定なイオン化のためには５〜６ｃｍ程度であることが好ましい。また、安定な連結が可能であれば、コネクタを使用せずスプレーチップをキャピラリー端部に直接接続することも可能である。この場合、排出部全長とはスプレーチップの全長を意味する。 The total length of the discharge portion including the connector and the spray tip is not particularly limited, but is preferably about 5 to 6 cm for stable ionization. Further, if stable connection is possible, the spray tip can be directly connected to the end of the capillary without using a connector. In this case, the full length of the discharge part means the full length of the spray tip.
前記排出部先端から排出された泳動液は、少なくとも一部が排出部先端と非接触状態に配置された質量分析部開口へ導入される。排出部先端と質量分析部開口との距離は、グロー放電を起こさず、かつエレクトロスプレーイオン化によりイオン化された糖鎖を大きなロスなく捕捉できる範囲に設定することが好ましく、例えば１〜２ｍｍ程度とすることができる。開口の径は、少なくとも排出部先端内径より大きくすることが好ましく、排出部先端からの噴霧物の噴霧幅に応じて決定することが更に好ましい。また、質量分析部開口は、図２に示すように排出部（スプレーチップ）先端の開口部と対向するように配置してもよく、図３に示すように、例えば３０〜５０°程度傾斜をつけて配置しても構わない。
次に、上記開口から導入されたイオン化された糖鎖を分析する質量分析部について説明する。
At least a part of the electrophoresis solution discharged from the front end of the discharge unit is introduced into the mass analysis unit opening disposed in a non-contact state with the front end of the discharge unit. The distance between the discharge tip and the mass spectrometer opening is preferably set to a range that does not cause glow discharge and can capture sugar chains ionized by electrospray ionization without significant loss, for example, about 1 to 2 mm. be able to. The diameter of the opening is preferably at least larger than the inner diameter of the discharge portion tip, and more preferably determined according to the spray width of the spray from the discharge portion tip. Further, the opening of the mass analysis unit may be disposed so as to face the opening at the tip of the discharge unit (spray tip) as shown in FIG. 2, and as shown in FIG. You may arrange it.
Next, a mass spectrometer that analyzes ionized sugar chains introduced from the openings will be described.
質量分析部
質量分析部として使用する質量分析装置としては、磁場型質量分析装置（Sector MS）、四重極型質量分析装置（QMS）、飛行時間型質量分析装置（TOFMS）、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分析装置（FT-ICRMS）、イオントラップ型質量分析装置（ITMS）等を挙げることができる。本発明におけるMS分析のためにはイオントラップ型質量分析装置を使用することが好ましい。但し、一般的なイオントラップ型質量分析装置では、トラップするイオンの質量数の範囲は比較的広域（例えば目的物の擬似分子イオン［M＋H］+（Mは目的物）の質量対電荷比(m/z)が200〜2,000amu程度）であるのに対し、本発明では、目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比から目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比＋４amuの範囲の質量対電荷比を有するイオンを捕捉することが好ましい。これは、上記広域質量範囲設定では、イオントラップ部に捕捉可能なイオン量が制限されている（一般に数千〜数万個のイオンが捕捉可能と言われている）ため、設定した質量範囲内の質量数を有するイオンの一部が捕捉されず排出されてしまうことによりロスが生じることが、感度低下の原因となるためである。微量分析では、このロスによる感度低下も回避すべきである。これに対し、トラップするイオンの質量範囲を上記の通りきわめて狭レンジとすれば、分析すべきイオンのロスを顕著に低減することができ、高感度分析可能な量のイオンをイオントラップ部へトラップし分析することができる。これにより、更なる高感度分析が可能となる。
Mass spectrometers used as mass spectrometers include magnetic field mass spectrometer (Sector MS), quadrupole mass spectrometer (QMS), time-of-flight mass spectrometer (TOFMS), Fourier transform ion cyclotron Type mass spectrometer (FT-ICRMS), ion trap mass spectrometer (ITMS), and the like. For the MS analysis in the present invention, it is preferable to use an ion trap mass spectrometer. However, in a general ion trap mass spectrometer, the mass number range of ions to be trapped is relatively wide (for example, the pseudo-molecular ion [M + H] + (M is the target) of the target product) / z) is about 200 to 2,000 amu), in the present invention, the mass-to-charge in the range from the mass-to-charge ratio of the target pseudo-molecular ion to the mass-to-charge ratio of the target pseudo-molecular ion + 4 amu. It is preferable to capture ions having a ratio. This is because the amount of ions that can be trapped in the ion trap part is limited in the above-mentioned wide mass range setting (generally, it is said that thousands to tens of thousands of ions can be trapped). This is because a loss occurs due to a part of ions having a mass number of being trapped and discharged without causing a decrease in sensitivity. In trace analysis, sensitivity loss due to this loss should also be avoided. On the other hand, if the mass range of ions to be trapped is set to a very narrow range as described above, the loss of ions to be analyzed can be remarkably reduced, and a quantity of ions that can be analyzed with high sensitivity can be trapped in the ion trap section. Can be analyzed. Thereby, further high sensitivity analysis becomes possible.
更に、混合物の分析に適するMS/MS等のMSn測定（nは多段分析におけるMSスペクトルの測定回数）を行うためにはタンデム型質量分析装置を使用することが好ましく、イオントラップ型質量分析部と飛行時間型質量分析部とを含むイオントラップ（IT）／TOF-MSを使用することが更に好ましい。この場合もイオントラップ型質量分析部にトラップする質量対電荷比は、上記範囲とすることが好ましい。イオントラップ型質量分析部に捕捉したイオンを、例えば、不活性ガスを導入しつつ外部から交流電圧を印加して共振させることによって開裂させてフラグメントイオンを生成した後、生成したフラグメントイオンを飛行時間型質量分析部において質量分析することにより、MS/MS測定が可能となる。これにより、目的糖鎖の構造解析を行うことができる。イオントラップ型質量分析部における質量範囲の設定を変え2回以上イオントラップとTOF-MSによる質量分析を行えば、様々な質量数を有するイオンを高感度に分析することができ、結果的に上記広域質量設定による分析と比べて、例えば20倍以上の感度向上が可能となる。上記スイッチング回数は、試料中に含まれる糖鎖の種類に応じて設定すればよく、例えば4種の糖鎖を含む試料を分析するためには4回のスイッチングにより計8種のスペクトル（1種の糖鎖に対しイオントラップ型質量分析部において取得されるMSスペクトルと飛行時間型質量分析部において取得されるMS/MSスペクトルの計2種のスペクトル×試料中の糖鎖種の数4）を得ることができ、これにより各糖鎖の構造解析が可能となる。例えば、現在市販されている質量分析装置によれば、上記MS測定は1測定当たり100msec程度ときわめて高速に行うことができ、MS測定とMS/MS測定の1サイクルは1秒程度で行うことができる。前記IT/TOF-MSとしては、例えば株式会社島津製作所製商品名LCMS-IT-TOF質量分析計のIT-TOF質量分析部を使用することができる。 Further, in order to perform MS n measurement such as MS / MS suitable for analysis of a mixture (n is the number of times of MS spectrum measurement in multistage analysis), it is preferable to use a tandem mass spectrometer, and an ion trap mass spectrometer And an ion trap (IT) / TOF-MS including a time-of-flight mass spectrometer. Also in this case, the mass-to-charge ratio trapped in the ion trap mass spectrometer is preferably in the above range. The ions trapped in the ion trap mass spectrometer are cleaved by, for example, introducing an inert gas and applying an AC voltage from the outside to resonate to generate fragment ions. MS / MS measurement can be performed by performing mass analysis in the mass spectrometer. Thereby, the structure analysis of the target sugar chain can be performed. By changing the mass range setting in the ion trap mass spectrometer and performing mass analysis by ion trap and TOF-MS more than once, ions with various mass numbers can be analyzed with high sensitivity. The sensitivity can be improved by, for example, 20 times or more compared to the analysis by the wide-area mass setting. The number of times of switching may be set according to the type of sugar chain contained in the sample. For example, in order to analyze a sample containing 4 types of sugar chains, a total of 8 types of spectra (1 type) are obtained by switching 4 times. MS spectrum acquired in the ion trap mass spectrometer and MS / MS spectrum acquired in the time-of-flight mass spectrometer for a total of two sugar chains x number of sugar chains in the sample 4) This makes it possible to analyze the structure of each sugar chain. For example, according to currently available mass spectrometers, the MS measurement can be performed at a very high speed of about 100 msec per measurement, and one cycle of MS measurement and MS / MS measurement can be performed in about 1 second. it can. As the IT / TOF-MS, for example, an IT-TOF mass analysis unit of a trade name LCMS-IT-TOF mass spectrometer manufactured by Shimadzu Corporation can be used.
以上説明したように、本発明によれば、シースレスCE-MSによる安定なイオン化が可能になることにより、インターフェイスにおける試料ロスを大幅に低減することができ、これにより微量糖鎖の分析における検出感度を大幅に高めることができる。本発明によれば、例えば２種以上、更には４種以上の異なる種類の糖鎖を含む試料の高感度分析が可能となる。更に、前記プラグ領域形成による試料導入→前記シースレスインターフェイスの使用→狭レンジでの高速スイッチチングによる質量分析、により、加圧試料導入→シースフローインターフェイスの使用→広域質量範囲設定での質量分析、による糖鎖分析と比べて、例えば2万倍以上の感度向上を達成することができる。こうして本発明によれば、試料中に含まれる糖鎖の総量が、例えば試料１μｌあたりアトモル(amol)量〜フェムトモル(fmol)量と極微量であったとしても、高感度に糖鎖の構造解析を行うことができる。なお、アトモルとは10-18mol、フェムトモルとは10-15molを意味する。一般に、細胞１つに存在する糖鎖量は数アトモルオーダーと言われているため、アトモルオーダーの分析を可能にすることは、糖鎖分析の最終目標である。従って、本発明は、糖鎖分析において極めて大きな意義を有する。 As described above, according to the present invention, stable ionization by sheathless CE-MS is possible, so that the sample loss at the interface can be greatly reduced, thereby detecting sensitivity in the analysis of trace sugar chains. Can be greatly increased. According to the present invention, it is possible to perform a highly sensitive analysis of a sample containing, for example, two or more kinds, or four or more kinds of different sugar chains. Furthermore, sample introduction by the plug region formation → use of the sheathless interface → mass analysis by high-speed switching in a narrow range, pressure sample introduction → use of a sheath flow interface → mass analysis in a wide mass range setting, Compared with the sugar chain analysis by, the sensitivity can be improved by 20,000 times or more, for example. Thus, according to the present invention, even if the total amount of sugar chains contained in the sample is extremely small, for example, from attomole (amol) to femtomole (fmol) per 1 μl of the sample, the structure analysis of the sugar chain is highly sensitive. It can be performed. Incidentally, 10 -18 mol and amol, the fmol means 10 -15 mol. Generally, since it is said that the amount of sugar chains present in one cell is on the order of several atomic moles, it is the ultimate goal of sugar chain analysis to enable analysis on the atomic mole order. Therefore, the present invention has extremely great significance in sugar chain analysis.
更に本発明は、電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの一方の端部に連結された排出部、該排出部先端と非接触状態で配置された開口を有する質量分析部、を含み、かつ前記排出部への電界印加を行わない糖鎖分析装置であって、上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有することを特徴とする糖鎖分析装置に関する。本発明の糖鎖分析装置は、本発明の糖鎖分析方法において好適に使用することができる。その詳細は、本発明の糖鎖分析方法において説明した通りである。 The present invention further includes a capillary for electrophoresis, a discharge part connected to one end of the capillary, and a mass spectrometer having an opening arranged in a non-contact state with the tip of the discharge part, and the discharge part The present invention relates to a glycan analyzer that does not apply an electric field to the glycan analyzer, wherein the discharge section tip has an inner diameter that is 50% or more and less than 100% of the capillary inner diameter. The sugar chain analyzer of the present invention can be suitably used in the sugar chain analysis method of the present invention. The details are as described in the sugar chain analysis method of the present invention.
以下、本発明を実施例に基づき説明する。但し、本発明は実施例に示す態様に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described based on examples. However, this invention is not limited to the aspect shown in the Example.
分析対象糖鎖
下記実施例、比較例および参考例で使用したPA化中性糖鎖は以下の四種類で、すべてタカラバイオから購入した。
CDH-PA (Galβ1-4Glc-PA)、質量数＝420（擬似分子イオン=421）
CTH-PA (Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)、質量数＝582（擬似分子イオン=583）
Globoside-PA (GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)、質量数＝785（擬似分子イオン=786）
Forssman antigen-PA (GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)、質量数＝988（擬似分子イオン=989）
Analytical sugar chains PA neutral sugar chains used in the following examples, comparative examples and reference examples were the following four types, all purchased from Takara Bio.
CDH-PA (Galβ1-4Glc-PA), mass number = 420 (pseudomolecular ion = 421)
CTH-PA (Galα1-4Galβ1-4Glc-PA), mass number = 582 (pseudomolecular ion = 583)
Globoside-PA (GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-PA), mass number = 785 (pseudomolecular ion = 786)
Forssman antigen-PA (GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-PA), mass number = 988 (pseudomolecular ion = 989)
［実施例１］
シースレスCE-MSによる糖鎖分析
図２に概略を示すシースレスCE-MS装置により、以下の方法によってGloboside-PAの質量分析を行った。
(i)CE分析装置
CE分析装置として、P/ACE MDQ型キャピラリー電気泳動装置(Beckman Coulter製)に、[100mMギ酸-5mMギ酸アンモニウム水溶液(pH2.7)]-アセトニトリル(4:1, v/v)の混合溶媒を充填したフューズドシリカキャピラリー(50μm i.d. x 95 cm、GLサイエンス製)を装着し、CEキャピラリーにスプレーチップ（New Objective製PicoTip、50/30μm i.d.）をコネクタ（φ50μm、長さ2cm、New Objective 製PicoClear）で接続し、島津製作所製LCMS-IT-TOFのIT-TOF部と直接結合したオンラインシステムを使用した。後述するプラグ形成、試料導入および電気泳動時の電圧印加は、図３に示すようにキャピラリーの一端を浸漬した試料溶液に白金電極を介してプラス30kVの電圧を印加することで行った。コネクタとスプレーチップからなる排出部の全長は約5cm、スプレーチップ先端と質量分析部開口との距離は1〜2mm程度とした。質量分析部開口は、水平面から30〜50°程度傾斜をつけて配置した。
(ii)プラグ形成
ミクロバイアル(PCRチューブ、Axgen製PCR-02-NC)に予め分注したアセトニトリルにキャピラリーの一端を浸漬し、3.4x103Pa、10秒の条件下でアセトニトリルを加圧導入し、プラグを形成した。キャピラリー中の泳動液（上記排出部中の泳動液は含まず）は、約2000nl、プラグ容量は約10nlであった。
(iii)試料導入
次に、100amol/μl濃度のGloboside-PA溶液（溶媒：アセトニトリル-水（7:3、v/v））10μlをPCRチューブに分注後、プラグを形成した側のキャピラリー末端を浸漬し、10kVの電圧（プラグ側が+、他方がマイナス）を120秒印加することで、予めキャピラリーに注入したアセトニトリルプラグの中に上記糖鎖を電気的に導入した。
(iv)キャピラリー電気泳動およびスプレーチップ先端からの溶液噴霧
次に、カラム温度を25℃、印加電圧を30kV（プラグ側が+、他方が−）に設定し、かつプラグ側からスプレーチップ側へ向かって6.9×104Paの圧力を加えることにより、キャピラリーからスプレーチップにわたり電気泳動を行った。上記条件において、電気泳動後の泳動液をスプレーチップ先端から噴霧することができた。噴霧物を質量分析部へ導入し、質量対電荷比m/z786-790のイオンをイオントラップ部においてトラップした後、飛行時間型質量分析部に導入しマススペクトル測定を行った。質量分析に要した時間は100msecであった。質量分析計の検出器電圧を2.0kV、CDL(脱溶媒管)の温度を200℃に設定した。得られたマススペクトルおよびマスクロマトグラムを図４（ａ）に示す。
[Example 1]
Sugar chain analysis by sheathless CE-MS The mass spectrometry of Globoside-PA was performed by the following method using a sheathless CE-MS apparatus schematically shown in FIG.
(i) CE analyzer
As a CE analyzer, a mixed solvent of [100 mM formic acid-5 mM ammonium formate aqueous solution (pH 2.7)]-acetonitrile (4: 1, v / v) was added to a P / ACE MDQ capillary electrophoresis apparatus (manufactured by Beckman Coulter). A filled fused silica capillary (50 μm id x 95 cm, manufactured by GL Sciences) is installed, and a spray tip (New Objective PicoTip, 50/30 μm id) is attached to the CE capillary with a connector (φ50 μm, length 2 cm, New Objective PicoClear) ) And connected to the IT-TOF part of Shimadzu LCMS-IT-TOF. The voltage formation during plug formation, sample introduction and electrophoresis described later was performed by applying a voltage of plus 30 kV via a platinum electrode to a sample solution in which one end of a capillary was immersed as shown in FIG. The total length of the discharge part consisting of the connector and the spray tip was about 5 cm, and the distance between the tip of the spray tip and the mass analysis part opening was about 1-2 mm. The mass analysis part opening was arranged with an inclination of about 30 to 50 ° from the horizontal plane.
(ii) Plug formation One end of the capillary is immersed in acetonitrile dispensed in advance into a microvial (PCR tube, PCR-02-NC manufactured by Axgen), and acetonitrile is introduced under pressure under conditions of 3.4 x 10 3 Pa and 10 seconds. A plug was formed. The electrophoresis solution in the capillary (not including the electrophoresis solution in the discharge part) was about 2000 nl, and the plug capacity was about 10 nl.
(iii) Sample introduction Next, 10 μl of Globoside-PA solution (solvent: acetonitrile-water (7: 3, v / v)) with a concentration of 100 amol / μl was dispensed into a PCR tube and the end of the capillary on the side where the plug was formed And the sugar chain was electrically introduced into an acetonitrile plug previously injected into the capillary by applying a voltage of 10 kV (+ on the plug side and minus on the other side) for 120 seconds.
(iv) Capillary electrophoresis and spraying of solution from the tip of the spray tip Next, the column temperature is set to 25 ° C., the applied voltage is set to 30 kV (+ on the plug side, − on the other side), and from the plug side toward the spray tip side. Electrophoresis was performed from the capillary to the spray tip by applying a pressure of 6.9 × 10 4 Pa. Under the above conditions, the electrophoresis solution after electrophoresis could be sprayed from the tip of the spray tip. The spray was introduced into the mass spectrometer, and ions having a mass-to-charge ratio of m / z 786-790 were trapped in the ion trap, and then introduced into the time-of-flight mass analyzer, and mass spectrum measurement was performed. The time required for mass spectrometry was 100 msec. The detector voltage of the mass spectrometer was set to 2.0 kV, and the temperature of the CDL (desolvent tube) was set to 200 ° C. The obtained mass spectrum and mass chromatogram are shown in FIG.
［比較例１］
加圧試料導入−シースフローCE-MS（広域質量範囲設定）による糖鎖分析
図１に概略を示すシースフローCE-MS装置により、以下の方法によってGloboside-PAの質量分析を行った。
CE分析装置として、P/ACE MDQ型キャピラリー電気泳動装置(Beckman Coulter製)に、[100mMギ酸-5mMギ酸アンモニウム水溶液(ｐH2.7)]-アセトニトリル(4:1, v/v)の混合溶媒を充填した、参考例１で使用したものと同様のフューズドシリカキャピラリー(50μm i.d. x 95 cm、GLサイエンス製)を装着し、CEキャピラリーに島津製作所製シースフローインターフェースを装着し、４μl/minの[100mMギ酸-5mMギ酸アンモニウム水溶液(pH2.7)]-アセトニトリル(4:1, v/v)の混合溶媒と、約1L/minの窒素ガスを導入し、シースフローインターフェースに2.0Kvの電圧を加えてイオン化を行った。試料導入は、2pmol/μlのGloboside-PAを10μlミクロバイアル(PCRチューブ、Axgen製PCR-02-NC)に採取し、3.4x103Paの圧力で60秒間加圧することで行った。マススペクトル測定には参考例１と同様に島津製作所製LCMS-IT-TOFを使用したが、イオントラップ部の質量範囲設定を質量対電荷比m/z200〜2,000とした。質量分析に要した時間は100msecであった。得られたマススペクトルおよびマスクロマトグラムを図４（ｂ）に示す。
[Comparative Example 1]
Sugar chain analysis by pressurized sample introduction-sheath flow CE-MS (wide range mass range setting) Mass spectrometry of Globoside-PA was performed by the following method using a sheath flow CE-MS apparatus schematically shown in FIG.
As a CE analyzer, a mixed solvent of [100 mM formic acid-5 mM ammonium formate aqueous solution (pH 2.7)]-acetonitrile (4: 1, v / v) was added to a P / ACE MDQ capillary electrophoresis apparatus (manufactured by Beckman Coulter). Attach the filled fused silica capillary (50 μm id x 95 cm, manufactured by GL Sciences) similar to that used in Reference Example 1, and install the Shimadzu sheath flow interface on the CE capillary, 4 μl / min [ 100mM formic acid-5mM ammonium formate aqueous solution (pH2.7)]-acetonitrile (4: 1, v / v) and about 1L / min nitrogen gas were introduced, and a voltage of 2.0Kv was applied to the sheath flow interface. Ionization was performed. Sample introduction was performed by collecting 2 pmol / μl Globoside-PA in a 10 μl microvial (PCR tube, PCR-02-NC manufactured by Axgen) and pressurizing it at a pressure of 3.4 × 10 3 Pa for 60 seconds. LCMS-IT-TOF manufactured by Shimadzu Corporation was used for mass spectrum measurement as in Reference Example 1, but the mass range of the ion trap was set to a mass-to-charge ratio of m / z 200 to 2,000. The time required for mass spectrometry was 100 msec. The obtained mass spectrum and mass chromatogram are shown in FIG.
図４(ａ)に示すマスクロマトグラム（Ｂ）と図４（ｂ）に示すマスクロマトグラム（Ｂ）は、強度およびそのS/Nがほぼ同じであった。これにより、Globoside-PAを20pmol/tube用いた比較例１の結果と、Globoside-PAを1fmol/tube用いた実施例１の結果がほぼ同等であることがわかる。この結果から、プラグ形成による試料導入によるキャピラリー電気泳動→シースレスインターフェイスによるMSへの試料導入→狭レンジスキャンによる質量分析により、従来型CE-MSに比べ約20,000倍の感度向上が達成できることが明らかとなった。 The mass chromatogram (B) shown in FIG. 4 (a) and the mass chromatogram (B) shown in FIG. 4 (b) had almost the same intensity and S / N. This shows that the result of Comparative Example 1 using Globoside-PA at 20 pmol / tube and the result of Example 1 using Globoside-PA at 1 fmol / tube are almost equivalent. From this result, it is clear that capillary electrophoresis by sample introduction by plug formation → sample introduction to MS by sheathless interface → mass analysis by narrow range scan can achieve about 20,000 times higher sensitivity than conventional CE-MS It became.
［実施例２］
試料溶液中のGloboside- PA量を5fmol/tubeに変更した以外は実施例１と同様の操作を行ったところ、スプレーチップ先端から安定な噴霧を行うことができ、質量分析部において高感度な質量分析が可能であった（感度：2psi）。
[Example 2]
Except that the amount of Globoside-PA in the sample solution was changed to 5 fmol / tube, the same operation as in Example 1 was performed. As a result, stable spraying can be performed from the tip of the spray tip, and the mass analyzer has a highly sensitive mass. Analysis was possible (sensitivity: 2 psi).
［比較例２］
スプレーチップとして先端内径が８μｍのものを使用した以外実施例２と同様の操作を行ったが、スプレーチップからの噴霧が不安定となり、質量分析部において質量分析可能な量のイオンを得ることができなかった。
[Comparative Example 2]
The same operation as in Example 2 was performed except that a tip having an inner diameter of 8 μm was used as the spray tip. However, spraying from the spray tip became unstable, and an amount of ions capable of mass analysis was obtained in the mass spectrometer. could not.
［比較例３］
スプレーチップとして先端内径が５μｍのものを使用した以外実施例２と同様の操作を行ったところ、スプレーチップ先端からの噴霧が不安定となり放電も観察され、質量分析部において質量分析可能な量のイオンを得ることができなかった。
[Comparative Example 3]
When the same operation as in Example 2 was performed except that a tip having an inner diameter of 5 μm was used as the spray tip, the spray from the tip of the spray tip became unstable and discharge was observed, and the mass analyzer was able to perform mass analysis. Ion could not be obtained.
［実施例３］
試料溶液としてGloboside-PAを10μl中に100fmol含む試料溶液を使用した点以外は実施例１と同様の操作を行い、マススペクトルを得た。
[Example 3]
A mass spectrum was obtained in the same manner as in Example 1 except that a sample solution containing 100 fmol of Globoside-PA in 10 μl was used as the sample solution.
［比較例４〜６］
スプレーチップに高圧アンプにより1〜3kVの電圧を印加した点以外は実施例２と同様の操作を行い、マススペクトルを得た。
[Comparative Examples 4 to 6]
A mass spectrum was obtained in the same manner as in Example 2 except that a voltage of 1 to 3 kV was applied to the spray tip with a high-voltage amplifier.
スプレーチップへの電圧印加の影響
実施例３および比較例４〜６で得られたマススペクトルを図５に示す。図５に示すように、スプレーチップに電圧を印加した比較例４〜６では、電圧を印加しなかった実施例３と比較して約３０〜４０％の感度低下が観察された。更に、スプレーチップに電圧を印加した場合には、たびたび放電が観察された。放電が観察された場合には極端に感度が低下し、スペクトルを得ることができなかった。
Influence of voltage application to spray tip Mass spectra obtained in Example 3 and Comparative Examples 4 to 6 are shown in FIG. As shown in FIG. 5, in Comparative Examples 4 to 6 in which a voltage was applied to the spray tip, a sensitivity reduction of about 30 to 40% was observed compared to Example 3 in which no voltage was applied. Furthermore, when a voltage was applied to the spray tip, discharge was frequently observed. When discharge was observed, the sensitivity was extremely lowered and a spectrum could not be obtained.
[実施例４]
高感度CE-MSによるPA化中性糖鎖混合物の構造解析
試料溶液として以下のPA化中性糖鎖混合物を使用した点および下記方法により質量分析を行った点を除き、実施例１と同様の方法により糖鎖分析を行った。
(i)PA化中性糖鎖混合物
前述の4種のPA化中性糖鎖混合物（各500amol/l、5 x 10-15モル）の溶液10μl（溶媒：アセトニトリル-水（7:3、v/v））を使用した。
(ii)質量分析
各PA化中性糖鎖について、イオントラップ部においてMSスペクトル取得を行うとともに、捕捉したイオンを開裂させ得られたフラグメントイオンを飛行時間型質量分析部へ導入しMS/MSスペクトル取得を行った。各PA化中性糖鎖のMSスペクトル取得に各100msec、MS/MSスペクトル取得に各150msecを設定し、4種のMSスペクトルおよび4種のMS/MSスペクトル計8種のスペクトルを、１サイクル１.0秒でスイッチングしながら繰り返し測定するという手法を用い、検出器電圧2.0kVで検出した。各々の質量対電荷比の範囲は、CDH-PAでm/z420-424、CTH-PAでm/z582-586、Globoside-PAでm/z786-790、antigen-PAでm/z 989-993とした。マススペクトル測定結果を図６に示す。
[Example 4]
Structural analysis of PA-linked neutral sugar chain mixture by high-sensitivity CE-MS Same as Example 1 except that the following PA-linked neutral sugar chain mixture was used as a sample solution and mass spectrometry was performed by the following method The sugar chain was analyzed by the method described above.
(i) PA-modified neutral sugar chain mixture 10 μl of the above-mentioned four types of PA-activated neutral sugar chain mixture (each 500 amol / l, 5 x 10 -15 mol) (solvent: acetonitrile-water (7: 3, v / v)) was used.
(ii) Mass Spectrometry For each PA neutral sugar chain, MS spectra are obtained in the ion trap section, and fragment ions obtained by cleaving the captured ions are introduced into the time-of-flight mass spectrometer section and MS / MS spectra are obtained. Acquired. 100 ms each for MS spectrum acquisition of each neutralized glycan PA, 150 msec each for MS / MS spectrum acquisition, 4 types of MS spectra and 4 types of MS / MS spectrum total of 8 spectra per cycle 1 Detection was performed at a detector voltage of 2.0 kV using a method of repeated measurement while switching at 0.0 second. Each mass to charge ratio range is m / z 420-424 for CDH-PA, m / z 582-586 for CTH-PA, m / z 786-790 for Globoside-PA, m / z 989-993 for antigen-PA. It was. The mass spectrum measurement results are shown in FIG.
図６左図に示すように、上記４種のPA化中性糖鎖について、それぞれを構成する単糖の種類およびその配列が、MS/MSスペクトルで明瞭に示された。さらに、図４右図に示すマスクロマトグラムにおいて、[M+H]イオンおよびMS/MSで得られた構造特異的なフラグメントイオンが明瞭に分離された状態で検出できることから、キャピラリー電気泳動による分離が良好に行われ、かつMSにより検出可能な量のイオンを質量分析部へ導入できたことがわかる。ターゲットとなる糖鎖の分子量情報を前もって得ることができれば、本方法はきわめて有用な高感度構造解析法となる。 As shown in the left diagram of FIG. 6, the types of monosaccharides constituting each of the four types of PA-modified neutral sugar chains and their sequences were clearly shown in the MS / MS spectrum. Furthermore, in the mass chromatogram shown in the right figure of FIG. 4, the [M + H] ions and the structure-specific fragment ions obtained by MS / MS can be detected in a clearly separated state, so that separation by capillary electrophoresis is possible. It can be seen that the ion was introduced into the mass spectrometric part in an amount that was successfully performed and that could be detected by MS. If the molecular weight information of the target sugar chain can be obtained in advance, this method will be a very useful highly sensitive structural analysis method.
本発明により、細胞レベルの糖鎖分析が可能となるものと期待される。 The present invention is expected to enable cell-level sugar chain analysis.
Claims (11)
上記排出部に連結された端部とは反対のキャピラリー端部から前記試料を導入すること、
泳動液が充填されたキャピラリーおよび排出部に泳動電流を流すことにより、該キャピラリーおよび排出部において、前記導入された試料中の糖鎖を電気泳動させること、
上記電気泳動後の糖鎖を含む泳動液を、上記排出部への電圧印加を行うことなく、該排出部先端から排出することにより前記開口に導入すること、
を含み、かつ、
上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有することを特徴とする糖鎖分析方法。 A sample containing a sugar chain is analyzed by an analyzer including a capillary for electrophoresis, a discharge part connected to one end of the capillary, and a mass spectrometer having an opening arranged in a non-contact state with the tip of the discharge part. A sugar chain analysis method for analyzing,
Introducing the sample from the end of the capillary opposite to the end connected to the discharge section;
By causing an electrophoresis current to flow through the capillary filled with the electrophoresis solution and the discharge part, thereby causing the sugar chain in the introduced sample to be electrophoresed in the capillary and the discharge part;
Introducing the electrophoresis solution containing the sugar chain after electrophoresis into the opening by discharging from the tip of the discharge unit without applying a voltage to the discharge unit;
Including, and
The sugar chain analysis method, wherein the tip of the discharge section has an inner diameter of 50% or more and less than 100% of the inner diameter of the capillary.
前記イオントラップ型質量分析部において、目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比から目的物の擬似分子イオンの質量対電荷比+４amuの範囲の質量対電荷比を有するイオンを捕捉すること、および、前記イオントラップ型質量分析部において捕捉されたイオンを上記飛行時間型質量分析部へ導入し質量分析を行うこと、を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖鎖分析方法。 The mass analyzer includes an ion trap mass analyzer and a time-of-flight mass analyzer,
Capturing an ion having a mass-to-charge ratio in a range from the mass-to-charge ratio of the target pseudo-molecular ion to the mass-to-charge ratio of the target pseudo-molecular ion + 4 amu in the ion trap mass analyzing unit; The glycan analysis method according to any one of claims 1 to 4, further comprising introducing ions captured by the ion trap mass spectrometer to the time-of-flight mass analyzer and performing mass analysis.
上記排出部先端は、前記キャピラリー内径の５０％以上１００％未満の内径を有することを特徴とする糖鎖分析装置。 A capillary for electrophoresis, a discharge part connected to one end of the capillary, a mass analysis part having an opening arranged in a non-contact state with the tip of the discharge part, and applying an electric field to the discharge part No glycan analyzer,
The sugar chain analyzer according to claim 1, wherein the tip of the discharge part has an inner diameter of 50% or more and less than 100% of the inner diameter of the capillary.
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| US11371997B2 (en) | 2018-02-28 | 2022-06-28 | Shimadzu Corporation | Glycan analysis method, glycan analysis system, program for glycan analysis, and kit for glycan analysis |
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