JP2009085929A - Toxicity evaluation method, system, and kit - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、海洋性バクテリアを用いた毒性評価方法、毒性評価システム、及び毒性評価用キットに関する。 The present invention relates to a toxicity evaluation method, a toxicity evaluation system, and a toxicity evaluation kit using marine bacteria.
現在、土壌や焼却残滓（焼却残留物（焼却灰）及び煤塵（飛灰）を含む）の毒性を評価する方法としては、主に化学的分析方法が利用されている。この化学的分析方法は、土壌や焼却残滓に含まれる特定の毒性物質の濃度をＧＣＭＳなどにより分析する方法である。化学的分析方法によれば、含有量が微量であったとしても、土壌や焼却残滓に含まれる特定の毒性物質を検出することができるという利点を有する。しかしながら、土壌や焼却残滓中には、多種多様な毒性物質が含まれているために、この化学的分析方法によって特定の毒性物質が検出されなかったとしても、検出対象外の毒性物質の存在によって、土壌や焼却残滓が毒性を有する可能性がある。さらに、土壌や焼却残滓中には化学的分析方法では検出困難な物質が存在している可能性や、毒性物質間の相互作用により土壌や焼却残滓全体の毒性が高まっている可能性もある。つまり、化学的分析方法では、土壌や焼却残滓が生物に与える影響を総合的に評価することができない。 At present, chemical analysis methods are mainly used as a method for evaluating the toxicity of soil and incineration residue (including incineration residue (incineration ash) and dust (fly ash)). This chemical analysis method is a method of analyzing the concentration of a specific toxic substance contained in soil or incineration residue by GCMS or the like. According to the chemical analysis method, there is an advantage that a specific toxic substance contained in soil or incineration residue can be detected even if the content is very small. However, since soil and incineration residues contain a wide variety of toxic substances, even if specific toxic substances are not detected by this chemical analysis method, , Soil and incineration residue may be toxic. Furthermore, there is a possibility that substances that are difficult to detect by chemical analysis methods exist in the soil and incineration residue, and there is a possibility that the toxicity of the soil and incineration residue as a whole is increased by the interaction between toxic substances. In other words, the chemical analysis method cannot comprehensively evaluate the effects of soil and incineration residue on living organisms.
土壌や焼却残滓の毒性を評価する他の方法として、バイオアッセイによる方法がある。バイオアッセイによれば、土壌や焼却残滓が生物へ与える影響を総合的に評価することができる。バイオアッセイによる方法としては、ヒト肝臓ガン由来細胞株による細胞生存率試験、ミジンコ遊泳阻害試験、藻類生長阻害試験、海洋性発光細菌阻害試験等が知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１及び非特許文献２参照）。これらのなかでも、海洋性発光細菌阻害試験は、細胞生存率試験などと比べて、簡便である、短時間で実施することができる、大掛かりな設備を必要としないなどの利点を有する。
As another method for evaluating the toxicity of soil and incineration residue, there is a bioassay method. According to the bioassay, the influence of soil and incineration residue on living organisms can be comprehensively evaluated. As a method using a bioassay, a cell viability test using a human liver cancer-derived cell line, a daphnia swimming inhibition test, an algal growth inhibition test, a marine luminescent bacteria inhibition test, and the like are known (for example,
しかしながら、海洋性発光細菌などの海洋性バクテリアを用いて被検物質の毒性を評価した場合に、海洋性バクテリアにとって有害な物質が被検物質に含まれているにもかかわらず、被検物質によっては海洋性バクテリアの発光強度が異常に増大し、「毒性を有する」という評価結果を得ることができないという問題があった。この問題は、特に焼却残滓の毒性を評価する際に顕著に表れた。 However, when marine bacteria such as marine luminescent bacteria are used to evaluate the toxicity of the test substance, the test substance contains a substance that is harmful to marine bacteria, even though it is contained in the test substance. Has a problem that the luminescence intensity of marine bacteria is abnormally increased and the evaluation result of “toxic” cannot be obtained. This problem was particularly noticeable when evaluating the toxicity of incineration residues.
したがって、本発明は、海洋性バクテリアを用いる毒性評価方法であって、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質が海洋性バクテリアにとって有害な物質を含む場合には、その被検物質について「毒性を有する」という評価結果を得ることができる毒性評価方法を提供することを目的とする。また、本発明は、海洋性バクテリアを用いた毒性評価システムであって、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質の毒性を評価することのできる毒性評価システムを提供することを目的とする。さらに、本発明は、海洋性バクテリアを備えた毒性評価用キットであって、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質の毒性を評価することのできる毒性評価用キットを提供することを目的とする。 Therefore, the present invention is a toxicity evaluation method using marine bacteria, which suppresses an increase in luminescence intensity of marine bacteria, and when the test substance contains a substance harmful to marine bacteria, the test substance It is an object of the present invention to provide a toxicity evaluation method capable of obtaining the evaluation result of “having toxicity”. Another object of the present invention is to provide a toxicity evaluation system using marine bacteria, which can suppress the increase in emission intensity of marine bacteria and can evaluate the toxicity of a test substance. And Furthermore, the present invention provides a toxicity evaluation kit equipped with marine bacteria, which can suppress the increase in luminescence intensity of marine bacteria and can evaluate the toxicity of a test substance. With the goal.
本発明の発明者らは、鋭意検討の結果、海洋性バクテリアと被検物質とを接触させた際に生じる海洋性バクテリアの生物活性の異常な高まりを抑えることのできる物質を見出し本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies, the inventors of the present invention have found a substance capable of suppressing an abnormal increase in the biological activity of marine bacteria that occurs when marine bacteria and test substances are brought into contact with each other. I came to let you.
すなわち、本発明は、海洋性バクテリアを用いた毒性評価方法であって、海洋性バクテリアの生物活性を、被検物質、並びに、カリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質の存在下で測定することを特徴とする毒性評価方法に関する。 That is, the present invention is a toxicity evaluation method using marine bacteria, wherein the biological activity of marine bacteria is selected from the group consisting of a test substance and potassium, magnesium, phosphorus, and sugar. The present invention relates to a toxicity evaluation method comprising measuring in the presence of a marine bacterial activity regulating substance containing
上記毒性評価方法において、海洋性バクテリア活性調整物質が、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含むことが好ましく、カリウム塩を含むことがより好ましい。また、上記毒性評価方法において、海洋性バクテリアが発光性バクテリアであり、生物活性として発光強度を測定することが好ましい。また、好ましくは、発光性バクテリアが、ビブリオ・フィシャリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）である。 In the toxicity evaluation method, the marine bacterial activity regulating substance preferably contains one or more selected from the group consisting of potassium salts, magnesium salts, phosphates, and sugars, and more preferably contains potassium salts. In the toxicity evaluation method, it is preferable that the marine bacterium is a luminescent bacterium and the luminescence intensity is measured as a biological activity. Also preferably, the luminescent bacteria are Vibrio fischeri.
上記毒性評価方法における被検物質としては、例えば、焼却残滓がある。 Examples of the test substance in the toxicity evaluation method include incineration residue.
上記毒性評価方法の一実施態様として、凍結乾燥した海洋性バクテリア及び再活性化溶液を混合し、海洋性バクテリア懸濁液を調製する工程、焼却残滓及び抽出溶媒を混合し、焼却残滓抽出液を調製する工程、海洋性バクテリア懸濁液及び焼却残滓抽出液を混合する工程、を含む毒性評価方法を挙げることができる。 As one embodiment of the toxicity evaluation method, freeze-dried marine bacteria and a reactivation solution are mixed to prepare a marine bacteria suspension, incineration residue and extraction solvent are mixed, and the incineration residue extract is used The toxicity evaluation method including the process of preparing, the process of mixing marine bacterial suspension and incineration residue extract can be mentioned.
海洋性バクテリア活性調整物質存在下で生物活性を測定するために、例えば、海洋性バクテリア懸濁液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有していることが好ましく、再活性化溶液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有していることがさらに好ましい。この場合、好ましくは、再活性化溶液に含まれる海洋性バクテリア活性調整物質の濃度が、１０〜１００，０００ｍｇ／Ｌである。 In order to measure biological activity in the presence of a marine bacterial activity regulator, for example, it is preferred that the marine bacterial suspension contains a marine bacterial activity regulator and the reactivation solution is a marine bacterial activity. More preferably, it contains a conditioning substance. In this case, preferably, the concentration of the marine bacterial activity adjusting substance contained in the reactivation solution is 10 to 100,000 mg / L.
また、海洋性バクテリア活性調整物質存在下で生物活性を測定するために、例えば、焼却残滓抽出液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有していることが好ましく、抽出溶媒が海洋性バクテリア活性調整物質を含有していることがさらに好ましい。この場合、好ましくは、抽出溶媒に含まれる海洋性バクテリア活性調整物質の濃度が、１０〜１００，０００ｍｇ／Ｌである。 In order to measure biological activity in the presence of a marine bacterial activity regulator, for example, the incineration residue extract preferably contains a marine bacterial activity regulator, and the extraction solvent is a marine bacterial activity regulator. It is further preferable to contain. In this case, preferably, the concentration of the marine bacterial activity adjusting substance contained in the extraction solvent is 10 to 100,000 mg / L.
さらに、海洋性バクテリア活性調整物質存在下で生物活性を測定するために、例えば、海洋性バクテリア懸濁液及び焼却残滓抽出液を混合する工程において、さらに海洋性バクテリア活性化物質を加えて混合することが好ましい。 Furthermore, in order to measure the biological activity in the presence of a marine bacterial activity regulator, for example, in the step of mixing the marine bacterial suspension and the incineration residue extract, a marine bacterial activator is further added and mixed. It is preferable.
上記毒性評価方法において、好ましくは、生物活性を測定する際の海洋性バクテリア活性化物質の濃度が、海洋性バクテリア懸濁液及び焼却残滓抽出液、並びに海洋性バクテリア活性化物質を含む混合液全体に対し、５〜５０，０００ｍｇ／Ｌである。 In the toxicity evaluation method, preferably, the concentration of the marine bacterial activator when measuring the biological activity is the marine bacterial suspension and the incineration residue extract, and the entire mixture containing the marine bacterial activator. In contrast, it is 5 to 50,000 mg / L.
また、本発明は、上記毒性評価方法に用いられる毒性評価システムであって、海洋性バクテリアの生物活性を測定する手段を有する毒性評価システムに関する。毒性評価システムは、さらに、得られた測定値を利用して被検物質の毒性を判定する手段を有することが好ましい。 The present invention also relates to a toxicity evaluation system used in the above toxicity evaluation method, and relates to a toxicity evaluation system having means for measuring the biological activity of marine bacteria. The toxicity evaluation system preferably further includes means for determining the toxicity of the test substance using the obtained measurement value.
さらに、本発明は、上記毒性評価方法に用いられる毒性評価用キットであって、凍結乾燥した海洋性バクテリア、再活性化溶液、焼却残滓抽出溶媒、及び海洋性バクテリア活性調整物質を備えた毒性評価用キットに関する。また、本発明は、上記毒性評価方法に用いられる毒性評価用キットであって、凍結乾燥した海洋性バクテリア、再活性化溶液、焼却残滓抽出溶媒を備え、再活性化溶液又は焼却残滓抽出溶媒が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する毒性評価用キットに関する。 Furthermore, the present invention is a toxicity evaluation kit for use in the above-described toxicity evaluation method, comprising a freeze-dried marine bacterium, a reactivation solution, an incineration residue extraction solvent, and a marine bacterium activity regulator. For kits. The present invention also relates to a toxicity evaluation kit used in the above toxicity evaluation method, comprising a freeze-dried marine bacterium, a reactivation solution, and an incineration residue extraction solvent, wherein the reactivation solution or the incineration residue extraction solvent is The present invention relates to a toxicity evaluation kit containing a marine bacterial activity regulator.
本発明の毒性評価方法によれば、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑えることができ、被検物質が海洋性バクテリアにとって有害な物質を含む場合には、その被検物質について「毒性を有する」という評価結果を得ることができる。また、本発明の毒性評価システムによれば、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質の毒性を評価することができる。さらに、本発明の毒性評価用キットによれば、海洋性バクテリアの発光強度の増大を抑え、被検物質の毒性を評価することができる。 According to the toxicity evaluation method of the present invention, an increase in the emission intensity of marine bacteria can be suppressed, and when a test substance contains a substance harmful to marine bacteria, the test substance has “toxicity”. Can be obtained. Moreover, according to the toxicity evaluation system of the present invention, it is possible to suppress the increase in the emission intensity of marine bacteria and evaluate the toxicity of the test substance. Furthermore, according to the toxicity evaluation kit of the present invention, an increase in the emission intensity of marine bacteria can be suppressed and the toxicity of the test substance can be evaluated.
本発明の海洋性バクテリアを用いた毒性評価方法は、海洋性バクテリアを被検物質と接触させ、海洋性バクテリアの生物活性を測定することにより、被検物質の毒性を評価する毒性評価方法である。本発明は、海洋性バクテリアを用いた毒性評価方法において、海洋性バクテリアの生物活性を、被検物質、並びに、カリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質の存在下で測定することを特徴とする。 The toxicity evaluation method using marine bacteria of the present invention is a toxicity evaluation method for evaluating the toxicity of a test substance by contacting the marine bacteria with the test substance and measuring the biological activity of the marine bacteria. . In the toxicity evaluation method using marine bacteria, the present invention relates to a marine bacterium that includes biological activity of marine bacteria, including a test substance and at least one selected from the group consisting of potassium, magnesium, phosphorus, and sugar. Measured in the presence of a substance that regulates bacterial activity.
本発明において、海洋性バクテリア活性調整物質（以下、単に「活性調整物質」ともいう。）とは、海洋性バクテリアの生物活性を測定する際に、海洋性バクテリアの活性を安定化させることのできる、安定化剤として作用し得る物質をいう。本発明においては、海洋性バクテリアと被検物質とを接触させる際に、意図的に、海洋性バクテリアの生物活性を十分に高めることのできる物質を存在させることにより、海洋性バクテリアの活性を安定化させ、海洋性バクテリアと被検物質とを接触させたことに起因する海洋性バクテリアの生物活性の異常な高まりを抑制できると考えられる。したがって、海洋性バクテリア活性調整物質としては、被検物質を存在させずに海洋性バクテリアと接触させた際に、海洋性バクテリアの生物活性を高めることのできる物質が用いられる。 In the present invention, a marine bacterial activity regulator (hereinafter also simply referred to as “activity regulator”) can stabilize the activity of marine bacteria when measuring the biological activity of marine bacteria. Refers to a substance that can act as a stabilizer. In the present invention, when the marine bacterium and the test substance are brought into contact with each other, the activity of the marine bacterium is stabilized by intentionally causing a substance that can sufficiently enhance the biological activity of the marine bacterium. It is considered that the abnormal increase in the biological activity of the marine bacteria caused by contacting the marine bacteria with the test substance can be suppressed. Therefore, a substance capable of enhancing the biological activity of marine bacteria when contacted with marine bacteria without the presence of the test substance is used as the marine bacteria activity regulating substance.
海洋性バクテリアとしては、発光性バクテリアを用いることが好ましい。発光性バクテリアとしては、例えば、ビブリオ・フィシャリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）、フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、フォトバクテリウム・フォスフォレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）等を挙げることができる。これらの中でも、ビブリオ・フィシャリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）が好ましく用いられる。 As marine bacteria, it is preferable to use luminescent bacteria. Examples of the luminescent bacteria include Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Photolabdus luminescens, Photobacterium phosphoreph and so on. Can do. Among these, Vibrio fischer is preferably used.
海洋性バクテリアは、凍結乾燥した状態で保存し、必要な時に、再活性化して用いることができる。再活性化は、例えば、凍結乾燥状態の海洋性バクテリアに再活性化溶液を加えて懸濁液とすることにより実施可能である。海洋性バクテリアを十分に再活性化させるために、凍結乾燥状態の海洋性バクテリアに再活性化溶液を加えた後、懸濁液を適切な温度で、適切な時間静置することが好ましい。 Marine bacteria can be stored in a lyophilized state and reactivated when needed. The reactivation can be performed, for example, by adding a reactivation solution to a freeze-dried marine bacterium to form a suspension. In order to sufficiently reactivate the marine bacteria, it is preferable to add the reactivation solution to the lyophilized marine bacteria and then allow the suspension to stand at an appropriate temperature for an appropriate time.
再活性化溶液としては、通常、ナトリウム塩水溶液、好ましくは、ＮａＣｌ水溶液が用いられる。ナトリウム塩水溶液の濃度は、好ましくは０．０５〜１０重量％、より好ましくは０．１〜５重量％、さらに好ましくは０．５〜３重量％である。 As the reactivation solution, an aqueous sodium salt solution, preferably an aqueous NaCl solution is usually used. The concentration of the aqueous sodium salt solution is preferably 0.05 to 10% by weight, more preferably 0.1 to 5% by weight, and still more preferably 0.5 to 3% by weight.
再活性化溶液のｐＨは、４〜９であることが好ましく、５〜８であることがより好ましく、６〜７であることがさらに好ましい。 The pH of the reactivation solution is preferably 4-9, more preferably 5-8, and even more preferably 6-7.
懸濁液の温度は、０〜５０℃であることが好ましく、５〜３０℃であることがより好ましく、１０〜２５℃であることがさらに好ましい。 The temperature of the suspension is preferably 0 to 50 ° C, more preferably 5 to 30 ° C, and further preferably 10 to 25 ° C.
懸濁液を静置する時間は、好ましくは海洋性バクテリアに再活性化溶液を加えてから海洋性バクテリアの生物活性が飽和するまでに要する時間である。時間は、用いる海洋性バクテリアに応じて適宜設定すればよく、１０分間〜２時間であることが好ましく、３０分間〜２時間であることがより好ましく、４０分間〜１時間であることがさらに好ましい。 The time for which the suspension is allowed to stand is preferably the time required for the biological activity of the marine bacteria to be saturated after the reactivation solution is added to the marine bacteria. What is necessary is just to set suitably according to the marine bacteria to be used, It is preferable that it is 10 minutes-2 hours, It is more preferable that it is 30 minutes-2 hours, It is more preferable that it is 40 minutes-1 hour. .
海洋性バクテリアは、再活性化した後、好ましくは、生物活性が飽和した後、保存することができる。保存時間は、５時間以下であることが好ましく、２時間以下であることがより好ましい。 Marine bacteria can be stored after reactivation, preferably after saturation of biological activity. The storage time is preferably 5 hours or less, and more preferably 2 hours or less.
再活性化の際の凍結乾燥バクテリアと再活性化溶液との混合割合として、例えば、凍結乾燥バクテリア１ｍｇに対し、再活性化溶液を好ましくは０．１〜３ｍｌ、より好ましくは０．２〜１ｍｌ、さらに好ましくは０．３〜０．７ｍｌ用いることができる。 As a mixing ratio of freeze-dried bacteria and reactivation solution at the time of reactivation, for example, with respect to 1 mg of freeze-dried bacteria, the reactivation solution is preferably 0.1 to 3 ml, more preferably 0.2 to 1 ml. More preferably, 0.3 to 0.7 ml can be used.
本発明の毒性評価方法においては、上記により得た懸濁液を用い、海洋性バクテリアの生物活性を測定することができる。生物活性の測定は、懸濁液を測定用のマイクロプレート、セル等に分注して行うことが好ましい。また、生物活性の測定には、懸濁液を０．５〜３ｍｌ用いることが好ましく、１〜２．５ｍｌ用いることがより好ましく、１．５〜２ｍｌ用いることがさらに好ましい。 In the toxicity evaluation method of the present invention, the biological activity of marine bacteria can be measured using the suspension obtained as described above. The biological activity is preferably measured by dispensing the suspension into a measurement microplate, cell or the like. For measuring biological activity, it is preferable to use 0.5 to 3 ml of the suspension, more preferably 1 to 2.5 ml, and still more preferably 1.5 to 2 ml.
測定に用いる海洋性バクテリアの量は、生物活性の測定方法、評価の対象となる被検物質などに応じて適宜調節すればよい。海洋性バクテリアは、通常１ｍｌの懸濁液中に乾燥重量で０．５〜２ｍｇ、好ましくは０．８〜１．５ｍｇ、さらに好ましくは１〜１．３ｍｇ用いられる。 The amount of marine bacteria used for the measurement may be appropriately adjusted according to the biological activity measurement method, the test substance to be evaluated, and the like. Marine bacteria are usually used in a dry weight of 0.5 to 2 mg, preferably 0.8 to 1.5 mg, more preferably 1 to 1.3 mg in a 1 ml suspension.
次に、海洋性バクテリアの生物活性を測定する方法として、代謝活性を測定する方法、目視または画像処理により個体数を解析する方法、などがあるが、好ましくは代謝活性を測定する方法である。さらに、代謝活性の測定には、呼吸活性測定、消費酸素量測定、発熱量測定などがあるが、好ましくは、呼吸活性測定である。 Next, as a method for measuring the biological activity of marine bacteria, there are a method for measuring metabolic activity, a method for analyzing the number of individuals by visual observation or image processing, etc., and a method for measuring metabolic activity is preferable. Furthermore, the measurement of metabolic activity includes respiratory activity measurement, oxygen consumption measurement, calorific value measurement, etc., preferably respiratory activity measurement.
呼吸活性の測定の方法としては、海洋性バクテリアが消費する酸素量を酸素電極などを用いて測定する方法、発生する二酸化炭素量を赤外式ガス分析計などを用いて測定する方法などが知られている。いずれも方法も従来公知の方法に従って行うことができる。 Known methods for measuring respiratory activity include a method of measuring the amount of oxygen consumed by marine bacteria using an oxygen electrode and the like, and a method of measuring the amount of generated carbon dioxide using an infrared gas analyzer. It has been. Any of the methods can be performed according to a conventionally known method.
本発明においては、海洋性バクテリアとして発光性バクテリアが好ましく使用される。発光性バクテリアは、例えば、代謝（呼吸）時に熱としてのエネルギーを放出すると同時に、可視光を放出する。発光性バクテリアが放出する可視光のピーク波長は、好ましくは４００〜５５０ｎｍであり、より好ましくは４７０〜５００ｎｍである。発光性バクテリアの発光強度を測定することにより、発光性バクテリアの代謝（呼吸）活性を評価することが可能である。被検物質が毒性を有する場合、被検物質と接した発光性バクテリアの代謝（呼吸）活性が低下、すなわち、発光性バクテリアの発光強度が低下するために、発光強度を毒性評価の指標として用いることができる。 In the present invention, luminescent bacteria are preferably used as marine bacteria. Luminescent bacteria, for example, emit energy as heat during metabolism (respiration) and at the same time emit visible light. The peak wavelength of visible light emitted by the luminescent bacteria is preferably 400 to 550 nm, more preferably 470 to 500 nm. By measuring the luminescence intensity of the luminescent bacteria, the metabolic (respiratory) activity of the luminescent bacteria can be evaluated. When the test substance is toxic, the metabolic (respiratory) activity of the luminescent bacteria in contact with the test substance decreases, that is, the luminescent intensity of the luminescent bacteria decreases. Therefore, the luminescent intensity is used as an index for toxicity evaluation. be able to.
次に、毒性の評価の対象としては、例えば、土壌、焼却残滓、粉塵、河川水、湖水、海水、地下水、埋立地底部からの浸出水、工場排水、廃棄油、植物への付着物、植物など（以下、「土壌等」ともいう。）が挙げられる。より好ましくは、土壌又は焼却残滓であり、さらに好ましくは、焼却残滓である。 Next, toxicity assessment targets include, for example, soil, incineration residue, dust, river water, lake water, seawater, groundwater, leachate from the bottom of landfills, industrial wastewater, waste oil, plant deposits, plants (Hereinafter also referred to as “soil etc.”). More preferably, it is soil or incineration residue, and still more preferably incineration residue.
したがって、海洋性バクテリアと接触させる被検物質としては、例えば、土壌からの抽出物、焼却残滓からの抽出物、粉塵からの抽出物、河川水、湖水、海水、地下水、埋立地底部からの浸出水、工場排水、廃棄油、植物への付着物、植物からの抽出物などを含む試料、または、これらの混合試料が挙げられる。より好ましくは、土壌からの抽出物又は焼却残滓からの抽出物を含む試料であり、さらに好ましくは、焼却残滓からの抽出物を含む試料である。 Therefore, test substances to be contacted with marine bacteria include, for example, extracts from soil, extracts from incineration residues, extracts from dust, river water, lake water, seawater, groundwater, and leaching from the bottom of landfills. Samples containing water, industrial wastewater, waste oil, plant deposits, extracts from plants, etc., or mixed samples thereof can be mentioned. More preferably, it is a sample containing an extract from soil or an extract from incineration residue, and more preferably a sample containing an extract from incineration residue.
土壌等から抽出されて評価の対象となる具体的な被検出物としては、土壌の汚染に係る環境基準（環境庁告示第４６号）で指定された物質、水質汚濁に係る環境基準（環境庁告示第５９号）で指定された物質、地下水の水質汚濁に係る環境基準（環境庁告示第１０号）で指定された物質などが挙げられるが、これらに限定されず、種々の物質を挙げることができる。例えば、Ｐｂ、Ｃｄ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｐｂ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｈｇ等の金属、トルエン、ベンゼン、エチルベンゼン、キシレン、四塩化炭素、ジクロロメタン、パラジクロロベンゼン、トリメチルベンゼン、クロロホルム、テトラクロロエチレン、ＴＰＨ（Ｔｏｔａｌ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）、ＰＡＨ（Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）等の有機化合物等である。 Specific detected objects that are extracted from the soil and are subject to evaluation include substances specified in the environmental standards for soil contamination (Environment Agency Notification No. 46), environmental standards for water pollution (Environment Agency) Substances specified in Notification No. 59), environmental standards related to water pollution of groundwater (Environment Agency Notification No. 10), etc., but are not limited to these, and list various substances Can do. For example, metals such as Pb, Cd, Cu, Ni, Cr, Pb, Zn, Fe, Hg, toluene, benzene, ethylbenzene, xylene, carbon tetrachloride, dichloromethane, paradichlorobenzene, trimethylbenzene, chloroform, tetrachloroethylene, TPH (Total Organic compounds such as Petroleum Hydrocarbons) and PAH (Polycyclic Aromatic Hydrocarbon).
また、被検出物として、土壌等に含まれることに起因して人の健康に係る被害を生ずるおそれがある物質が挙げられ、具体的には、土壌汚染対策法に基づく調査等の対象である、揮発性物質（四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、１，３−ジクロロプロペン、ジクロロメタン、テトラクロロエチレン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、トリクロロエチレン、ベンゼン）、重金属等（カドミウム及びその化合物、六価クロム化合物、シアン化合物、水銀及びその化合物、セレン及びその化合物、鉛及びその化合物、砒素及びその化合物、ふっ素及びその化合物、ほう素及びその化合物）、農薬等（シマジン、チオベンカルブ、チウラム、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、有機リン化合物）などの物質が挙げられる。 In addition, substances to be detected include substances that may cause damage to human health due to inclusion in soil, etc., and are specifically targets for investigations based on the Soil Contamination Countermeasures Law Volatile substances (carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, 1,1-dichloroethylene, cis-1,2-dichloroethylene, 1,3-dichloropropene, dichloromethane, tetrachloroethylene, 1,1,1-trichloroethane, 1, 1,2-trichloroethane, trichloroethylene, benzene), heavy metals, etc. (cadmium and its compound, hexavalent chromium compound, cyanide compound, mercury and its compound, selenium and its compound, lead and its compound, arsenic and its compound, fluorine and its Compounds, boron and its compounds), agricultural chemicals, etc. (simazine, thiobencarb, thiuram, polysalt) Biphenyl (PCB), organic phosphorus compounds) include materials such as.
毒性評価の対象となる土壌等は、測定が必要とされる場所について、目的に応じて採取すればよく、採取箇所、採取深さ、採取量等、適宜設定することができる。揮発性有機化合物の評価を目的とする場合には、土壌等を密閉容器内に採取することが好ましい。 The soil or the like to be subjected to toxicity evaluation may be collected according to the purpose at a place where measurement is required, and the collection location, collection depth, collection amount, etc. can be appropriately set. For the purpose of evaluating volatile organic compounds, it is preferable to collect soil or the like in a sealed container.
被検出物を土壌等から抽出する方法としては、目的に応じ種々の方法を用いることが可能である。例えば、土壌等と、適宜選択された抽出溶媒とを混合し、一定時間激しく撹拌して抽出液を得る方法が挙げられる。さらに得られた抽出液について、固形成分と溶出成分（抽出物）とをフィルターなどにより分離し、固形成分が除去された抽出液を得ることもできる。 As a method for extracting the detection object from the soil or the like, various methods can be used depending on the purpose. For example, there can be mentioned a method in which soil or the like and an appropriately selected extraction solvent are mixed and vigorously stirred for a certain time to obtain an extract. Furthermore, about the obtained extract, a solid component and an elution component (extract) can be isolate | separated with a filter etc., and the extract from which the solid component was removed can also be obtained.
また、環境庁告示第４６号、第１９号、又は第１３号で規定された抽出方法を用いてもよい。 Moreover, you may use the extraction method prescribed | regulated by the environmental agency notification 46th, 19th, or 13th.
抽出溶媒としては、目的に応じ種々の溶媒を用いることが可能である。例えば、被検出物として金属を抽出したい場合には酸性水溶液、好ましくは０．１〜１規定の塩酸を使用することができる。また、例えば、有機化合物を抽出したい場合には有機溶媒、好ましくはメチルアルコール、エチルアルコール、アセトン等を使用することができる。さらに、例えば、水溶性物質を抽出したい場合には水、好ましくは蒸留水やイオン交換水等を使用することができる。 As the extraction solvent, various solvents can be used depending on the purpose. For example, when it is desired to extract a metal as an object to be detected, an acidic aqueous solution, preferably 0.1 to 1 N hydrochloric acid can be used. For example, when an organic compound is desired to be extracted, an organic solvent, preferably methyl alcohol, ethyl alcohol, acetone, or the like can be used. Furthermore, for example, when it is desired to extract a water-soluble substance, water, preferably distilled water, ion-exchanged water, or the like can be used.
さらに、環境庁告示第４６号、第１９号、又は第１３号で規定された抽出溶媒を用いてもよい。 Furthermore, you may use the extraction solvent prescribed | regulated by the environmental agency notification 46th, 19th, or 13th.
抽出の際の土壌等と抽出溶媒との混合割合として、例えば、土壌等など１ｍｌに対し、抽出溶媒を好ましくは０．１〜１０ｍｌ、より好ましくは１〜５ｍｌ、さらに好ましくは１．５〜２．５ｍｌ用いることができる。 As a mixing ratio of the soil or the like and the extraction solvent in the extraction, for example, the extraction solvent is preferably 0.1 to 10 ml, more preferably 1 to 5 ml, further preferably 1.5 to 2 with respect to 1 ml of the soil or the like .5 ml can be used.
撹拌時間は特に限定されないが、迅速な毒性評価を行う観点から、２分間〜５時間であることが好ましく、２分間〜２時間であることがより好ましく、２分間〜１時間３０分であることがさらに好ましい。 The stirring time is not particularly limited, but is preferably 2 minutes to 5 hours, more preferably 2 minutes to 2 hours, and more preferably 2 minutes to 1 hour 30 minutes from the viewpoint of rapid toxicity evaluation. Is more preferable.
固形成分が除去された抽出液を得るためには、土壌等と抽出溶媒とを含む懸濁液をしばらく静置した後、上澄み液をろ過することが好ましい。ろ過には、好ましくは孔径０．６５μｍ以下、より好ましくは０．５μｍ以下、さらに好ましくは０．４５μｍ以下のフィルターを用いることが可能である。 In order to obtain the extract from which the solid component has been removed, it is preferable to leave the suspension containing the soil and the extraction solvent for a while and then filter the supernatant. For filtration, a filter having a pore size of preferably 0.65 μm or less, more preferably 0.5 μm or less, and even more preferably 0.45 μm or less can be used.
なお、工場廃水などの液体を毒性評価の対象とする場合には、被検出物を抽出する工程を行う必要はない。工場廃水などの液体は、そのままで被検物質とするか、あるいは、適宜、フィルターを用いてろ過する、抽出溶媒を用いて希釈するなどして被検物質とすることができる。 In addition, when a liquid such as factory waste water is a target for toxicity evaluation, it is not necessary to perform a process of extracting an object to be detected. A liquid such as factory wastewater can be used as a test substance as it is, or can be used as a test substance by appropriately filtering using a filter or diluting with an extraction solvent.
本発明の毒性評価方法においては、被検物質（抽出液）を上述の海洋性バクテリア懸濁液を分注したマイクロプレート、セル等に加え、海洋性バクテリアの生物活性を測定することができる。また、生物活性の測定には、被検物質（抽出液）を０．０１〜５ｍｌ用いることが好ましく、０．０２〜２ｍｌ用いることがより好ましく、０．０５〜１ｍｌ用いることがさらに好ましい。 In the toxicity evaluation method of the present invention, the biological activity of marine bacteria can be measured by adding a test substance (extract) to a microplate, a cell or the like into which the above-mentioned marine bacterial suspension is dispensed. Moreover, it is preferable to use 0.01-5 ml of test substances (extraction liquid) for a biological activity measurement, It is more preferable to use 0.02-2 ml, It is further more preferable to use 0.05-1 ml.
本発明の毒性評価方法は、カリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質の存在下で海洋性バクテリアを被検物質と接触させ、海洋性バクテリアの生物活性を測定する方法である。活性調整物質は、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、及びグルコースからなる群より選ばれる物質であることが好ましく、カリウム塩であることがさらに好ましい。活性調整物質は、水溶液の状態で用いることが好ましい場合もある。 In the toxicity evaluation method of the present invention, marine bacteria are brought into contact with a test substance in the presence of a marine bacterial activity-regulating substance containing at least one selected from the group consisting of potassium, magnesium, phosphorus, and sugar. It is a method for measuring the biological activity of bacteria. The activity adjusting substance is preferably a substance selected from the group consisting of a potassium salt, a magnesium salt, a phosphate, and glucose, and more preferably a potassium salt. In some cases, the activity adjusting substance is preferably used in the form of an aqueous solution.
カリウム塩としては、塩化カリウム、硫酸カリウム、硝酸カリウム、臭化カリウム、亜硫酸カリウムなどを用いることができる。好ましくは塩化カリウムである。 As the potassium salt, potassium chloride, potassium sulfate, potassium nitrate, potassium bromide, potassium sulfite and the like can be used. Potassium chloride is preferred.
マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウムなどを用いることができる。好ましくは塩化マグネシウムである。 As the magnesium salt, magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium carbonate and the like can be used. Magnesium chloride is preferred.
リンを含む海洋性バクテリア活性調整物質としては、リン酸塩を用いることができる。リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウムなどを用いることができる。 As the marine bacterial activity regulating substance containing phosphorus, phosphate can be used. As the phosphate, sodium phosphate, potassium phosphate, ammonium phosphate, or the like can be used.
糖を含む海洋性バクテリア活性調整物質としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトースなどを用いることができる。好ましくはグルコースである。
これらの活性調整物質は、単独でまたは２種類以上を混合して用いることができる。
Glucose, fructose, sucrose, galactose, maltose, etc. can be used as the marine bacterial activity regulating substance containing sugar. Glucose is preferable.
These activity adjusting substances can be used alone or in admixture of two or more.
生物活性測定時の活性調整物質の濃度は、海洋性バクテリア、被検物質、及び活性調整物質を含む混合物（好ましくは混合液）全体に対し、５〜５０，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましく、５０〜５，０００ｍｇ／Ｌであることがより好ましい。特に、活性調整物質がカリウム塩である場合は５０〜５，０００ｍｇ／Ｌ、マグネシウム塩である場合は５０〜５，０００ｍｇ／Ｌ、リン酸塩である場合は５０〜１０，０００ｍｇ／Ｌ、グルコースである場合は５００〜５０，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。なお、海洋性バクテリア、被検物質、及び活性調整物質を含む混合物（好ましくは混合液）全体とは、例えば、海洋性バクテリアとして海洋性バクテリアの懸濁液を使用し、被検物質として土壌等の抽出液を使用し、活性調整物質として活性調整物質の水溶液を使用した場合には、海洋性バクテリアの懸濁液、土壌等の抽出液、及び活性調整物質の水溶液を混合して得た混合液全体である。 The concentration of the activity adjusting substance at the time of measuring the biological activity is preferably 5 to 50,000 mg / L with respect to the entire mixture (preferably mixed solution) containing the marine bacteria, the test substance, and the activity adjusting substance, More preferably, it is 50-5,000 mg / L. In particular, when the activity adjusting substance is a potassium salt, 50 to 5,000 mg / L, when it is a magnesium salt, 50 to 5,000 mg / L, when it is a phosphate, 50 to 10,000 mg / L, glucose When it is, it is preferable that it is 500-50,000 mg / L. In addition, the whole mixture (preferably mixed solution) containing marine bacteria, a test substance, and an activity adjusting substance is, for example, a suspension of marine bacteria as marine bacteria and soil as a test substance. When an aqueous solution of an activity regulator is used as an activity regulator, a mixture obtained by mixing a marine bacterial suspension, an extract of soil, etc., and an aqueous solution of an activity regulator The whole liquid.
活性調整物質は、海洋性バクテリアの生物活性測定時に、海洋性バクテリア及び被検物質と共に存在すればよい。 The activity regulating substance may be present together with the marine bacterium and the test substance when the biological activity of the marine bacterium is measured.
したがって、活性調整物質を、上述の海洋性バクテリア及び被検物質を分注した（あるいは、分注する）マイクロプレート、セル等に、直接加えることができる。この場合、活性調整物質の水溶液として加えることが好ましい。また、活性調整物質の濃度が、上述の濃度となるように加えることが好ましい。なお、マイクロプレート、セル等へ加える順序としては、活性調整物質、海洋性バクテリア、被検物質の順、海洋性バクテリア、活性調整物質、被検物質の順、海洋性バクテリア、被検物質、活性調整物質の順などが挙げられる。 Therefore, the activity-regulating substance can be directly added to the microplate, cell, or the like into which the above-mentioned marine bacteria and the test substance are dispensed (or dispensed). In this case, it is preferable to add it as an aqueous solution of an activity adjusting substance. Moreover, it is preferable to add so that the density | concentration of an activity adjustment substance may become the above-mentioned density | concentration. The order of addition to microplates, cells, etc. is as follows: activity regulating substance, marine bacteria, test substance order, marine bacteria, activity regulating substance, test substance order, marine bacteria, test substance, activity Examples include the order of substances to be adjusted.
また、活性調整物質が、海洋性バクテリア懸濁液に含有されていてもよい。この場合、活性調整物質は、予め再活性化溶液に含有されていてもよく、あるいは、再活性化した海洋性バクテリアが含有されている懸濁液に活性調整物質を添加してもよい。または、再活性化溶液として、活性調整物質を含有する溶液を用いることもできる。すなわち、従来好ましく用いられていたＮａＣｌ水溶液に活性調整物質を加えてもよく、あるいは、ＮａＣｌ水溶液に代え活性調整物質の水溶液を用いてもよい。本発明においては、再活性化溶液として、ナトリウム塩及びカリウム塩とからなる塩の水溶液を用いることが好ましく、ＮａＣｌ及びＫＣｌとからなる塩の水溶液を用いることがより好ましい。 Moreover, the activity adjusting substance may be contained in the marine bacterial suspension. In this case, the activity adjusting substance may be previously contained in the reactivation solution, or the activity adjusting substance may be added to a suspension containing the reactivated marine bacteria. Alternatively, a solution containing an activity adjusting substance can be used as the reactivation solution. That is, the activity adjusting substance may be added to the NaCl aqueous solution that has been preferably used conventionally, or an aqueous solution of the activity adjusting substance may be used instead of the NaCl aqueous solution. In the present invention, as the reactivation solution, an aqueous solution of a salt composed of a sodium salt and a potassium salt is preferably used, and an aqueous solution of a salt composed of NaCl and KCl is more preferably used.
再活性化溶液に含有される活性調整物質の濃度は、１０〜１００，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましく、１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌであることがより好ましい。特に、活性調整物質がカリウム塩である場合は１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌ、マグネシウム塩である場合は１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌ、リン酸塩である場合は１００〜２０，０００ｍｇ／Ｌ、グルコースである場合は１，０００〜１００，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。 The concentration of the activity adjusting substance contained in the reactivation solution is preferably 10 to 100,000 mg / L, and more preferably 100 to 10,000 mg / L. In particular, when the activity regulating substance is a potassium salt, 100 to 10,000 mg / L, when it is a magnesium salt, 100 to 10,000 mg / L, when it is a phosphate, 100 to 20,000 mg / L, glucose When it is, it is preferable that it is 1,000-100,000 mg / L.
さらには、活性調整物質が、被検物質に含まれていてもよい。被検物質が土壌等の抽出液である場合、活性調整物質は、予め抽出溶媒に含まれていてもよく、あるいは、土壌等から抽出された被検出物を含む抽出液に活性調整物質を添加してもよい。すなわち、活性化調整物質を、上述の酸性水溶液、有機溶媒、水などの抽出溶媒や、これらを用いた抽出液に加えることができる。工場廃水等の液体を被検物質とする場合には、被検物質に直接、活性調整物質を加えればよい。 Furthermore, the activity adjusting substance may be contained in the test substance. When the test substance is an extract of soil or the like, the activity adjusting substance may be previously contained in the extraction solvent, or the activity adjusting substance is added to the extract containing the detected substance extracted from the soil or the like. May be. That is, the activation regulating substance can be added to the above-described acidic aqueous solution, organic solvent, extraction solvent such as water, or an extract using these. When a liquid such as factory waste water is used as the test substance, the activity adjusting substance may be added directly to the test substance.
抽出溶媒に含まれる活性調整物質の濃度は、１０〜１００，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましく、１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌであることがより好ましい。特に、活性調整物質がカリウム塩である場合は１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌ、マグネシウム塩である場合は１００〜１０，０００ｍｇ／Ｌ、リン酸塩である場合は１００〜２０，０００ｍｇ／Ｌ、グルコースである場合は１，０００〜１００，０００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。 The concentration of the activity adjusting substance contained in the extraction solvent is preferably 10 to 100,000 mg / L, and more preferably 100 to 10,000 mg / L. In particular, when the activity regulating substance is a potassium salt, 100 to 10,000 mg / L, when it is a magnesium salt, 100 to 10,000 mg / L, when it is a phosphate, 100 to 20,000 mg / L, glucose When it is, it is preferable that it is 1,000-100,000 mg / L.
本発明の毒性評価方法においては、具体的には、被検物質と接触させる前の海洋性バクテリアの生物活性と、被検物質と接触させた後の海洋性バクテリアの生物活性とを測定し、生物活性測定値の相対変化を利用して評価することが好ましい。相対変化を利用して評価する場合には、測定値については単位補正を行わなくてもよい。この方法は、海洋性バクテリア懸濁液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する場合、海洋性バクテリア懸濁液及び海洋性バクテリア活性調整物質を分注したマイクロプレート、セル等に、被検物質を加える場合に有効である。 In the toxicity evaluation method of the present invention, specifically, the biological activity of marine bacteria before contact with the test substance and the biological activity of marine bacteria after contact with the test substance are measured, It is preferable to evaluate using a relative change in the biological activity measurement value. When the evaluation is performed using the relative change, the unit correction is not necessary for the measurement value. In this method, when the marine bacterial suspension contains a marine bacterial activity regulating substance, the test substance is placed on a microplate, a cell or the like into which the marine bacterial suspension and marine bacterial activity regulating substance has been dispensed. Effective when added.
相対評価を行う方法について、海洋性バクテリア懸濁液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する場合を例に説明する。まず、生物活性測定用のセルに海洋性バクテリア活性調整物質を含む海洋性バクテリア懸濁液を加え、被検物質を海洋性バクテリアと接触させる前の生物活性（生物活性１（任意単位））を測定する。次いで被検物質を加え、被検物質を海洋性バクテリアと接触させた後の生物活性（生物活性２（任意単位））を測定する。（生物活性２／生物活性１）×１００［％］で求められる値、あるいは単に（生物活性２／生物活性１）で求められる値が、一定の基準値未満である場合を「毒性あり」と、一定の基準値以上である場合を「毒性なし」と評価することができる。
A method for performing the relative evaluation will be described by taking as an example a case where the marine bacterial suspension contains a marine bacterial activity regulating substance. First, add a marine bacterial suspension containing a marine bacterial activity-regulating substance to a cell for measuring biological activity, and the biological activity (biological activity 1 (arbitrary unit)) before contacting the test substance with marine bacteria. taking measurement. Next, the test substance is added, and the biological activity (biological activity 2 (arbitrary unit)) after the test substance is brought into contact with marine bacteria is measured. A value obtained by (
さらに、被検物質と接触させない海洋性バクテリアの生物活性（コントロール）に対する、被検物質と接触させた後の海洋性バクテリアの生物活性の比率を求めることにより評価することも可能である。この方法は、海洋性バクテリア懸濁液が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する場合、被検物質が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する場合、海洋性バクテリア懸濁液及び被検物質を分注したマイクロプレート、セル等に、海洋性バクテリア活性調整物質を加える場合に有効である。 Furthermore, it is also possible to evaluate by determining the ratio of the biological activity of marine bacteria after contact with the test substance to the biological activity (control) of marine bacteria not contacted with the test substance. In this method, when the marine bacterial suspension contains a marine bacterial activity regulating substance, or when the test substance contains a marine bacterial activity regulating substance, the marine bacterial suspension and the test substance are dispensed. This is effective when adding a marine bacterial activity-regulating substance to the microplate or cell.
コントロールを用いる方法について、被検物質が海洋性バクテリア活性調整物質を含有する場合を例に説明する。まず、生物活性測定用のセルＡに海洋性バクテリア懸濁液、被検物質をこの順に加え、被検物質を海洋性バクテリアと接触させた後の生物活性（生物活性Ａ（任意単位））を測定する。次いで、別のセルＢに海洋性バクテリア懸濁液、海洋性バクテリア活性調整物質をこの順に加え、被検物質と接触させない海洋性バクテリアの生物活性（生物活性Ｂ（任意単位）、コントロール）を測定する。（生物活性Ａ／生物活性Ｂ）×１００［％］で求められる値、あるいは単に（生物活性Ａ／生物活性Ｂ）で求められる値が、一定の基準値未満である場合を「毒性あり」と、一定の基準値以上である場合を「毒性なし」と評価することができる。 The method using the control will be described by taking as an example the case where the test substance contains a marine bacterial activity regulating substance. First, a marine bacterial suspension and a test substance are added in this order to the cell A for biological activity measurement, and the biological activity (biological activity A (arbitrary unit)) after contacting the test substance with the marine bacteria is calculated. taking measurement. Next, a marine bacterial suspension and a marine bacterial activity-regulating substance are added to another cell B in this order, and the biological activity (biological activity B (arbitrary unit), control) of marine bacteria not brought into contact with the test substance is measured. To do. When the value obtained by (biological activity A / biological activity B) × 100 [%] or simply obtained by (biological activity A / biological activity B) is less than a certain reference value, it is “toxic”. When the value is above a certain reference value, it can be evaluated as “no toxicity”.
なお、被検物質と接触させた後の海洋性バクテリアの生物活性測定値の絶対値により毒性を評価することもできる。 In addition, toxicity can also be evaluated based on the absolute value of the biological activity measurement value of marine bacteria after contact with the test substance.
被検物質が、酸性水溶液である場合、酸性分により海洋性バクテリアが失活することを防ぐ目的で、緩衝液、アルカリ水溶液等を用いて生物活性測定時のｐＨを調整することが好ましい。生物活性測定時のｐＨは、４〜９であることが好ましく、５〜８であることがより好ましく、６〜７であることがさらに好ましい。 When the test substance is an acidic aqueous solution, it is preferable to adjust the pH at the time of measuring the biological activity using a buffer solution, an alkaline aqueous solution or the like for the purpose of preventing marine bacteria from being deactivated by acidic components. The pH at the time of biological activity measurement is preferably 4-9, more preferably 5-8, and even more preferably 6-7.
被検物質を海洋性バクテリアと接触させてから生物活性測定までの時間は、用いる海洋性バクテリアの種類によって適宜設定することができ、好ましくは５〜６０分、より好ましくは７〜３０分、さらに好ましくは１０〜２０分である。 The time from the contact of the test substance with marine bacteria to the measurement of biological activity can be appropriately set according to the type of marine bacteria used, preferably 5 to 60 minutes, more preferably 7 to 30 minutes, Preferably it is 10 to 20 minutes.
次に本発明の毒性評価システムについて説明する。本発明の毒性評価システムは、海洋性バクテリアの生物活性を測定する手段を有する。生物活性を測定する手段としては、発光測定装置、生物学的酸素消費量（ＢＯＤ）測定器、質量分析機などを挙げることができる。好ましくは、発光測定装置である。発光測定装置は特に限定されず、受光部は外部からの光が入らないよう遮光された構造であり、かつ、発光性バクテリアからの発光のみを内蔵のフォトマル、フォトダイオード、ＣＣＤ等の受光部により検出できる装置を用いることができる。測定値は受光部が検出する光子（フォトン）の数量に比例する値であればよい。発光測定装置としては、市販のルミノメーターを使用することができる。さらに、毒性評価システムは、生物活性を測定する手段により得られた測定値を利用し、被検物質の毒性を判定する手段、例えば、コンピューターを備えていることが好ましい。 Next, the toxicity evaluation system of the present invention will be described. The toxicity evaluation system of the present invention has means for measuring the biological activity of marine bacteria. Examples of means for measuring biological activity include a luminescence measuring device, a biological oxygen consumption (BOD) measuring device, a mass spectrometer, and the like. Preferably, it is a luminescence measuring device. The light emission measuring device is not particularly limited, and the light receiving portion has a structure that is shielded so that light from the outside does not enter, and the light receiving portion such as a photomultiplier, a photodiode, a CCD, or the like that contains only light emitted from luminescent bacteria It is possible to use an apparatus that can detect the above. The measured value may be a value proportional to the number of photons (photons) detected by the light receiving unit. A commercially available luminometer can be used as the luminescence measuring device. Furthermore, the toxicity evaluation system preferably includes means for determining the toxicity of the test substance, for example, a computer, using the measurement value obtained by the means for measuring the biological activity.
毒性評価システムによれば、例えば、以下のステップに沿って被検物質の毒性を評価することができる（図１）。まず、海洋性バクテリア活性調整物質を含む海洋性バクテリア懸濁液の生物活性を、生物活性を測定する手段により測定することにより初期測定値（生物活性１）を得て（Ｓ１）、この初期測定値（生物活性１）を被検物質の毒性を判定する手段に記憶させる（Ｓ２）。次いで、海洋性バクテリア懸濁液に被検物質を加えた混合液の生物活性を、生物活性を測定する手段により測定し（生物活性２）（Ｓ３）、混合液の測定値（生物活性２）を被検物質の毒性を判定する手段に記憶させる（Ｓ４）。その後、被検物質の毒性を判定する手段により、生物活性１を１００とした生物活性２の相対値について、評価基準値に従い判定する（Ｓ５）。
According to the toxicity evaluation system, for example, the toxicity of the test substance can be evaluated along the following steps (FIG. 1). First, an initial measurement value (biological activity 1) is obtained by measuring the biological activity of the marine bacterial suspension containing the marine bacterial activity regulating substance by means of measuring the biological activity (S1). The value (biological activity 1) is stored in the means for determining the toxicity of the test substance (S2). Next, the biological activity of the mixed solution obtained by adding the test substance to the marine bacterial suspension is measured by means for measuring the biological activity (biological activity 2) (S3), and the measured value of the mixed solution (biological activity 2). Is stored in the means for determining the toxicity of the test substance (S4). Thereafter, the relative value of the
次に本発明の毒性評価用キットについて説明する。毒性評価用キットは、凍結乾燥海洋性バクテリア、再活性化溶液、焼却残滓抽出溶媒を備え、再活性化溶液又は焼却残滓抽出溶媒がカリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質を含有している。あるいは、本発明の毒性評価キットは、凍結乾燥海洋性バクテリア、再活性化溶液、焼却残滓抽出溶媒、カリウム、マグネシウム、リン、及び糖からなる群より選ばれる１種以上を含む海洋性バクテリア活性調整物質を備える。 Next, the toxicity evaluation kit of the present invention will be described. The kit for toxicity evaluation comprises freeze-dried marine bacteria, reactivation solution, and incineration residue extraction solvent, and the reactivation solution or incineration residue extraction solvent is selected from the group consisting of potassium, magnesium, phosphorus, and sugar Contains marine bacterial activity regulators including the above. Alternatively, the toxicity evaluation kit of the present invention is a marine bacterial activity control comprising one or more selected from the group consisting of freeze-dried marine bacteria, reactivation solution, incineration residue extraction solvent, potassium, magnesium, phosphorus, and sugar. Provide material.
さらにこれらの毒性評価キットは、本発明の毒性評価方法に用いることができる、マイクロプレート、セル、ｐＨ試験紙、フィルター、ピペット、シリンジなどを備えることも可能である。 Furthermore, these toxicity evaluation kits can include a microplate, a cell, a pH test paper, a filter, a pipette, a syringe and the like that can be used in the toxicity evaluation method of the present invention.
次いで本発明の毒性評価方法について、海洋性バクテリアとしてビブリオ・フィシャリを用い、焼却残滓の毒性を評価する場合を例に、さらに詳細に説明する。この例においては、ビブリオ・フィシャリを、海洋性バクテリア活性調整物質を含有する再活性化溶液を用いて再活性化した。 Next, the toxicity evaluation method of the present invention will be described in more detail, taking as an example the case where the toxicity of incineration residue is evaluated using Vibrio Fischer as marine bacteria. In this example, Vibrio Fischer was reactivated with a reactivation solution containing a marine bacterial activity modifier.
１．ビブリオ・フィシャリの再活性化
凍結乾燥ビブリオ・フィシャリ（目的に応じ５０又は７５ｍｇ）に対し、海洋性バクテリア活性調整物質を含有する再活性化溶液として１，０００ｍｇ／Ｌの塩化カリウム水溶液と２重量％のＮａＣｌ水溶液との混合水溶液（目的に応じ２７又は５０ｍｌ）を加え、室温で５０分間保持し、ビブリオ・フィシャリ懸濁液を得る。懸濁液のｐＨは、６．５〜７．５であることが好ましい。
1. Reactivation of Vibrio Fischer For lyophilized Vibrio Fischer (50 or 75 mg depending on the purpose), 1,000 mg / L potassium chloride aqueous solution and 2% by weight as a reactivation solution containing a marine bacterial activity regulator A mixed aqueous solution (27 or 50 ml depending on the purpose) is added and kept at room temperature for 50 minutes to obtain a Vibrio Fischer suspension. The pH of the suspension is preferably 6.5 to 7.5.
２．発光性バクテリアの発光強度測定
上記により得られたビブリオ・フィシャリ懸濁液（目的に応じ１又は２ｍｌ）を、発光強度測定用のセルに加え、ビブリオ・フィシャリ懸濁液の発光強度（発光強度１）を測定する。
2. Measurement of luminous intensity of luminescent bacteria The Vibrio Fischer suspension obtained above (1 or 2 ml depending on the purpose) is added to a cell for measuring luminous intensity, and the luminous intensity of the Vibrio Fischer suspension (luminescence intensity 1). ).
発光強度の測定には、プラスチック製の多検体測定セルを用いることができる。セル底面が透明であれば、その下部に受光部を設置することにより、個々のセル内の発光強度を測定することができる。この場合、各セル同士は、非透明のプラスチックにより遮光され、相互のセル内における発光が周囲に広がらない構造とする。また、発光強度の測定に、黒色等の有色のマイクロタイタープレートを用いた場合は、各ウェル上部の光を測光するように受光部が設置されたスキャン式のプレートリーダー（ルミノメーター）等を用いて、効率的に発光量を測定することができる。底面部のみが透明のマイクロプレートを用いた場合は、受光部が下部に設置されたタイプのプレートリーダーを用いることができる。 A plastic multi-analyte measurement cell can be used for measuring the emission intensity. If the bottom surface of the cell is transparent, the light emission intensity in each cell can be measured by installing a light receiving portion below the cell. In this case, each cell is shielded from light by a non-transparent plastic so that light emission in each cell does not spread to the surroundings. In addition, when a black or other colored microtiter plate is used to measure the emission intensity, a scanning plate reader (luminometer) with a light receiving unit installed to measure the light above each well is used. Thus, the amount of luminescence can be measured efficiently. In the case where a microplate having only a bottom surface portion is used, a plate reader of a type in which a light receiving portion is installed at the lower portion can be used.
３．焼却残滓の採取
５ｍｌの焼却残滓をへらなどを用いて、シリンジ内にサンプリングする。シリンジ先端はキャップができる構造であることが好ましく、特に揮発性有機化合物の測定をする場合や、サンプルの測定が速やかにできない場合等は、焼却残滓を採取した後キャップをし、密閉する。
3. Collection of incineration residue Sample 5 ml of incineration residue into a syringe using a spatula or the like. The tip of the syringe is preferably structured so that it can be capped. In particular, when measuring a volatile organic compound or when the sample cannot be measured quickly, the incineration residue is collected and then capped and sealed.
４．被検出物の抽出
５ｍｌの焼却残滓試料中に、１０ｍｌの溶媒（焼却残滓：溶媒＝１：２（体積比））を加え、２分間以上激しく撹拌して焼却残滓抽出液（懸濁液）を得る。迅速な評価を行う観点から、撹拌時間は短時間であることが好ましい。
4). Extraction of detected substance Into a 5 ml sample of incineration residue, add 10 ml of solvent (incineration residue: solvent = 1: 2 (volume ratio)) and stir vigorously for 2 minutes or more to prepare an incineration residue extract (suspension). obtain. From the viewpoint of performing a quick evaluation, the stirring time is preferably a short time.
溶媒は、金属（例えば、重金属等の含有毒性）を測定する場合は０．１Ｍ塩酸水溶液を用い、水溶性物質（例えば、重金属等の溶出毒性もしくは浸出性水溶毒性）を測定する場合はイオン交換水または蒸留水などの水を用い、また有機化合物（例えば、揮発性有機化合物や有機性毒性物質）を測定する場合はメチルアルコール（好ましくは試薬１級以上）を用いることができる。抽出溶媒のｐＨは、抽出が可能であればいずれのｐＨであってもよい。
The solvent is 0.1M hydrochloric acid aqueous solution when measuring metals (eg, heavy metals), and ion exchange when measuring water-soluble substances (eg, elution toxicity or leachable water toxicity of heavy metals). When water such as water or distilled water is used and an organic compound (for example, a volatile organic compound or an organic toxic substance) is measured, methyl alcohol (preferably
５．被検物質の調整
さらに、上記により得られた抽出液（懸濁液）をしばらく静置後、上澄み液を孔径０．４５μｍ以下のフィルターを用いろ過し、固形成分を除去した抽出液を被検物質として用いることが好ましい。
5). Preparation of test substance Furthermore, after leaving the extract (suspension) obtained as described above for a while, the supernatant was filtered using a filter with a pore size of 0.45 μm or less, and the extract from which the solid component was removed was tested. It is preferable to use it as a substance.
６．毒性の評価
バクテリア懸濁液と被検物質は、プラスチック製の多検体測定セル内で混合される。
酸抽出により調製された被検物質については、バクテリア懸濁液１ｍｌ（乾燥重量にして１．８５ｍｇの発光性バクテリアを含む）に、アルカリ水溶液を加えｐＨを７とし、これに被検物質１ｍｌを加え発光強度の変化を測定する。
6). Toxicity assessment The bacterial suspension and the test substance are mixed in a plastic multi-analyte measuring cell.
For the test substance prepared by acid extraction, 1 ml of the bacterial suspension (containing 1.85 mg of luminescent bacteria in dry weight) is added with an alkaline aqueous solution to adjust the pH to 7, and 1 ml of the test substance is added thereto. In addition, the change in emission intensity is measured.
水抽出により調製された被検物質については、バクテリア懸濁液１ｍｌ（乾燥重量にして１．８５ｍｇの発光性バクテリアを含む）に対し被検物質１ｍｌを加えて発光強度の変化を測定する。 For the test substance prepared by water extraction, 1 ml of the test substance is added to 1 ml of bacterial suspension (containing 1.85 mg of luminescent bacteria in dry weight), and the change in luminescence intensity is measured.
有機溶媒抽出により調製された被検物質については、バクテリア懸濁液２ｍｌ（乾燥重量にして３ｍｇの発光性バクテリアを含む）に被検物質０．０５ｍｌ（５０μｌ）を加え発光強度の変化を測定する。 For the test substance prepared by organic solvent extraction, 0.05 ml (50 μl) of the test substance is added to 2 ml of bacterial suspension (containing 3 mg of luminescent bacteria in dry weight) and the change in luminescence intensity is measured. .
バクテリア懸濁液と抽出液を混合した後、１５分間静置し、１５分後の発光強度を測定し、これを測定値（発光強度２）とする。また、０分から１５分までの間の測定値を、連続的にデータとして保存し、発光強度の変化を追跡することも可能である。 After mixing the bacterial suspension and the extract, the mixture is allowed to stand for 15 minutes, the luminescence intensity after 15 minutes is measured, and this is taken as the measured value (luminescence intensity 2). It is also possible to continuously store the measured values from 0 minute to 15 minutes as data and track the change in the emission intensity.
測定値は、発光強度測定装置（ルミノメーター）と付随のコンピュータープログラムによって処理される。フォトダイオードを内蔵した測定装置により、発光強度の絶対値がコンピューターに送り続けられ、コンピューターが測定データを記憶する。コンピューターは、「発光強度１」の絶対値を記憶し、１５分後に「発光強度２」の絶対値を記憶し、「発光強度１」に対する「発光強度２」の相対値を算出し、被検物質の毒性を判定する。
The measured values are processed by a luminescence intensity measuring device (luminometer) and an accompanying computer program. The absolute value of the emission intensity is continuously sent to the computer by the measurement device incorporating the photodiode, and the computer stores the measurement data. The computer stores the absolute value of “
毒性の判定には、発光強度の相対変化を１００分率（％）（あるいは単なる比）で表した数値を用いる。すなわち、バクテリア懸濁液のみの発光強度（発光強度１）を１００とし、バクテリア懸濁液と抽出液との反応後の発光強度（発光強度２）の相対変化を０〜１００％（しばし１００％を超えることもある）の整数値で表す。 To determine the toxicity, a numerical value representing the relative change in luminescence intensity in terms of 100 percent (%) (or simply ratio) is used. That is, the luminescence intensity of only the bacterial suspension (luminescence intensity 1) is 100, and the relative change in the luminescence intensity (luminescence intensity 2) after the reaction between the bacterial suspension and the extract is 0-100% (often 100% It may be expressed as an integer value.
本発明の毒性評価方法によれば、土壌や焼却残滓が総合的に生物に与える影響を総合的に、評価することが可能である。 According to the toxicity evaluation method of the present invention, it is possible to comprehensively evaluate the influence of soil and incineration residue on living organisms.
また、本発明の毒性評価方法は、現場での迅速な評価が可能な、簡便な評価方法であるために、吸光光度分析装置、原子吸光分析装置、ＩＣＰ発光分光分析装置、ＧＣＭＳ等の化学的分析方法による評価に先立ち、生体への毒性を即座に判断する方法、特に急性毒性を評価する方法として用いることができる。 In addition, since the toxicity evaluation method of the present invention is a simple evaluation method capable of rapid on-site evaluation, chemical methods such as an absorptiometric analyzer, an atomic absorption analyzer, an ICP emission spectroscopic analyzer, and GCMS are used. Prior to the evaluation by the analysis method, it can be used as a method for immediately judging toxicity to a living body, particularly as a method for evaluating acute toxicity.
また、例えば、化学的分析方法によって毒性なしと判断された被検物質について、本発明の毒性評価方法により評価を行うことにより、複合毒性の可能性を含め、被検物質が生体へ毒性を有するものであるか否かを総合的に確認することができる。 In addition, for example, a test substance determined to be non-toxic by a chemical analysis method is evaluated by the toxicity evaluation method of the present invention, so that the test substance has toxicity to the living body including the possibility of complex toxicity. It is possible to comprehensively check whether or not it is a thing.
これらの他、本発明の毒性評価方法において、使用する海洋性バクテリアの量、被検出物の抽出方法、発光強度を測定するまでの時間、判定基準等を適宜設定することにより、環境基準に沿った評価を行うことも可能である。 In addition to these, in the toxicity evaluation method of the present invention, the amount of marine bacteria to be used, the extraction method of the detection object, the time to measure the luminescence intensity, the determination criteria, etc. are set appropriately, in accordance with the environmental standards. It is also possible to make an evaluation.
また、汚染された土壌等を、抽出処理、洗浄処理、熱処理、化学処理、生物処理等により浄化する際に、本発明の毒性評価方法によって浄化の程度を確認しながら、土壌の浄化を行うこともできる。 In addition, when purifying contaminated soil, etc. by extraction treatment, washing treatment, heat treatment, chemical treatment, biological treatment, etc., the soil should be purified while confirming the degree of purification by the toxicity evaluation method of the present invention. You can also.
本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
（実施例１）
再活性化溶液として、１、１０、１００、１，０００、１０，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ水溶液と２重量％のＮａＣｌ水溶液との混合水溶液（実施例中、「１０，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液」などと表す場合もある。）、又は２重量％ＮａＣｌ水溶液を用いて、海洋性バクテリアを再活性化し、６種類の海洋性バクテリア懸濁液を得た。
６種類の海洋性バクテリア懸濁液について、海洋性バクテリアの生物活性（発光強度）を測定した。発光強度の測定には、Ｒａｐｉｄ Ｏｎｓｉｔｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｕｄｉｔ Ｓｙｓｔｅｍ（略称ＲＯＴＡＳ、発光性バクテリアを用いたバイオアッセイシステム、Ｃｙｂｅｒｓｅｎｓｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
Example 1
As a reactivation solution, a mixed aqueous solution of 1, 10, 100, 1,000, 10,000 mg / L KCl aqueous solution and 2 wt% NaCl aqueous solution (in the examples, “10,000 mg / L KCl + 2 wt% Or 2 wt% NaCl aqueous solution to reactivate marine bacteria to obtain 6 types of marine bacterial suspensions.
The biological activity (luminescence intensity) of marine bacteria was measured for six types of marine bacterial suspensions. For the measurement of luminescence intensity, Rapid Onsite Toxicity Audit System (abbreviation: ROTAS, bioassay system using luminescent bacteria, manufactured by Cybersense Biosystems) was used.
海洋性バクテリア：ビブリオ・フィシャリ ５０ｍｇ
再活性化溶液：１、１０、１００、１，０００、１０，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液、２重量％ＮａＣｌ水溶液 各２７ｍｌ
海洋性バクテリア懸濁液ｐＨ：７
１セル中の海洋性バクテリア懸濁液量：１ｍＬ（乾燥重量にして１．８５ｍｇのバクテリアを含む）
測定時間：海洋性バクテリア懸濁液を調製してから５０分後に測定
Marine bacteria: Vibrio Fisali 50mg
Reactivation solution: 1, 10, 100, 1,000, 10,000 mg / L KCl + 2 wt% NaCl aqueous solution, 2 wt% NaCl aqueous solution 27 ml each
Marine bacterial suspension pH: 7
Amount of marine bacteria in one cell: 1 mL (contains 1.85 mg of bacteria in dry weight)
Measurement time: Measured 50 minutes after preparing the marine bacterial suspension
結果を図２に示す。グラフ縦軸は、発光強度の実測値（任意単位）である。２重量％ＮａＣｌ水溶液を用いた場合の発光強度は、８００であった。再活性化溶液としてＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液を用いた場合は、従来のＮａＣｌ水溶液を用いた場合と比べ、海洋性バクテリアの生物活性が高められた。 The results are shown in FIG. The vertical axis of the graph is a measured value (arbitrary unit) of the emission intensity. The emission intensity when using a 2 wt% NaCl aqueous solution was 800. When KCl + 2 wt% NaCl aqueous solution was used as the reactivation solution, the biological activity of marine bacteria was enhanced as compared with the case of using the conventional NaCl aqueous solution.
（実施例２）
ＫＣｌに代えＫ２ＳＯ４又はＫＢｒを用いた他は、実施例１と同様にして海洋性バクテリアの生物活性を測定した。
Ｋ２ＳＯ４又はＫＢｒとＮａＣｌとからなる水溶液を用いた場合にも、ＮａＣｌ水溶液を用いた場合と比べ、海洋性バクテリアの生物活性を高めることができた。
(Example 2)
The biological activity of marine bacteria was measured in the same manner as in Example 1 except that K 2 SO 4 or KBr was used instead of KCl.
Even when an aqueous solution composed of K 2 SO 4 or KBr and NaCl was used, the biological activity of marine bacteria could be enhanced as compared with the case where an aqueous NaCl solution was used.
（実施例３）
１０、１００、１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ水溶液を調製した。ＲＯＴＡＳ−Ｌｅａｃｈａｂｌｅプロトコルに従い、２重量％ＮａＣｌ水溶液を用いて海洋性バクテリアを再活性化し、海洋性バクテリア懸濁液を得た。海洋性バクテリア懸濁液とＫＣｌ水溶液とを混合した後、海洋性バクテリアの生物活性（発光強度）を測定した。
(Example 3)
10, 100, and 1,000 mg / L KCl aqueous solutions were prepared. According to the ROTAS-Leachable protocol, marine bacteria were reactivated using a 2% by weight aqueous NaCl solution to obtain a marine bacterial suspension. After mixing the marine bacterial suspension and the aqueous KCl solution, the biological activity (luminescence intensity) of the marine bacteria was measured.
海洋性バクテリア：ビブリオ・フィシャリ ５０ｍｇ
再活性化溶液：２重量％ＮａＣｌ水溶液 ２７ｍｌ
海洋性バクテリア懸濁液ｐＨ：７
１セル中の海洋性バクテリア懸濁液量：１ｍＬ（乾燥重量にして１．８５ｍｇのバクテリアを含む）
１セル中のＫＣｌ水溶液の添加量：１ｍＬ
測定時間：海洋性バクテリア懸濁液を調製してから５０分後の発光強度（ＫＣｌ添加前の発光強度）を測定、その後、海洋性バクテリア懸濁液にＫＣｌ水溶液を添加してから１５分後の発光強度（ＫＣｌ添加後の発光強度）を測定
Marine bacteria: Vibrio Fisali 50mg
Reactivation solution: 2% NaCl aqueous solution 27 ml
Marine bacterial suspension pH: 7
Amount of marine bacteria in one cell: 1 mL (contains 1.85 mg of bacteria in dry weight)
Amount of KCl aqueous solution added in 1 cell: 1 mL
Measurement time: Measure the luminescence intensity 50 minutes after preparing the marine bacterial suspension (luminescence intensity before adding KCl), then 15 minutes after adding the KCl aqueous solution to the marine bacterial suspension Luminescence intensity (emission intensity after addition of KCl)
図３に結果を示す。縦軸は、（ＫＣｌ添加後の発光強度／ＫＣｌ添加前の発光強度）を表す。海洋性バクテリア懸濁液にＫＣｌ水溶液を添加することにより、海洋性バクテリアの生物活性が高められた。 The results are shown in FIG. The vertical axis represents (emission intensity after addition of KCl / emission intensity before addition of KCl). The biological activity of marine bacteria was enhanced by adding an aqueous KCl solution to the marine bacteria suspension.
（実施例４）
焼却灰Ａ、Ｂ及びＣについて、ＲＯＴＡＳ−Ｌｅａｃｈａｂｌｅプロトコル（水抽出）に従い焼却灰抽出液及びそれらの希釈液を調製し、毒性の評価を行った。再活性化溶液には、１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液、又は２重量％ＮａＣｌ水溶液を用いた。なお、焼却灰Ｂ及びＣは、化学的分析方法により毒性を有する物質を含有することが確認されている。
Example 4
About incineration ash A, B, and C, the incineration ash extract and those dilution liquids were prepared according to ROTAS-Leachable protocol (water extraction), and toxicity evaluation was performed. As the reactivation solution, 1,000 mg / L KCl + 2 wt% NaCl aqueous solution or 2 wt% NaCl aqueous solution was used. Incineration ash B and C have been confirmed to contain toxic substances by chemical analysis methods.
海洋性バクテリア：ビブリオ・フィシャリ、５０ｍｇ
再活性化溶液：１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液、又は２重量％ＮａＣｌ水溶液 各２７ｍｌ
海洋性バクテリア懸濁液ｐＨ：７
１セル中の海洋性バクテリア懸濁液量：１ｍＬ（乾燥重量にして１．８５ｍｇのバクテリアを含む）
１セル中の焼却灰抽出液の添加量：１ｍＬ
測定時間：海洋性バクテリア懸濁液を調製してから５０分後の発光強度（焼却灰抽出液添加前の発光強度）を測定、その後、海洋性バクテリア懸濁液に焼却灰抽出液を添加してから１５分後の発光強度（焼却灰抽出液添加後の発光強度）を測定
Marine bacteria: Vibrio Fisali, 50mg
Reactivation solution: 1,000 mg / L KCl + 2 wt% NaCl aqueous solution or 2 wt% NaCl aqueous solution 27 ml each
Marine bacterial suspension pH: 7
Amount of marine bacteria in one cell: 1 mL (contains 1.85 mg of bacteria in dry weight)
Addition amount of incinerated ash extract in 1 cell: 1 mL
Measurement time: Measure the luminescence intensity (luminescence intensity before adding the incinerated ash extract) 50 minutes after preparing the marine bacterial suspension, and then add the incinerated ash extract to the marine bacterial suspension. Measures the luminescence intensity after 15 minutes (luminescence intensity after adding incinerated ash extract)
結果を図４（ａ）及び（ｂ）に示す。グラフ縦軸は、（焼却灰抽出液添加後の発光強度／焼却灰抽出液添加前の発光強度）を表す。グラフ横軸は、焼却灰抽出液（原液）を１とした場合の希釈液濃度を表す。（ａ）は、再活性化溶液としてＫＣｌ＋ＮａＣｌ水溶液を用いた場合の結果、（ｂ）は、再活性化溶液としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合の結果である。ＫＣｌ＋ＮａＣｌ水溶液を用いた場合には、焼却灰抽出液Ｂ及びＣと接触させた海洋性バクテリアの生物活性が低下しており、焼却灰抽出液Ｂ及びＣを毒性があると評価することができた。ＮａＣｌ水溶液を用いた場合には、焼却灰Ｂ及びＣと接触させた海洋性バクテリアの生物活性が増しており、焼却灰Ｂ及びＣを毒性があると評価することができなかった。 The results are shown in FIGS. 4 (a) and (b). The vertical axis of the graph represents (luminescence intensity after adding incinerated ash extract / luminescence intensity before adding incinerated ash extract). The horizontal axis of the graph represents the diluted solution concentration when the incinerated ash extract (stock solution) is 1. (A) is a result when a KCl + NaCl aqueous solution is used as the reactivation solution, and (b) is a result when an NaCl aqueous solution is used as the reactivation solution. When the KCl + NaCl aqueous solution was used, the biological activity of marine bacteria brought into contact with the incinerated ash extracts B and C was lowered, and it was possible to evaluate that the incinerated ash extracts B and C were toxic. . When the NaCl aqueous solution was used, the biological activity of marine bacteria brought into contact with the incineration ash B and C was increased, and the incineration ash B and C could not be evaluated as toxic.
（実施例５）
１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液に代え、１，０００ｍｇ／ＬのＫ２ＳＯ４＋２重量％のＮａＣｌ水溶液、又は１，０００ｍｇ／ＬのＫＢｒ＋２重量％のＮａＣｌ水溶液を用いた他は、実施例４と同様にして海洋性バクテリアの生物活性を測定した。
Ｋ２ＳＯ４＋ＮａＣｌ水溶液、又はＫＢｒ＋ＮａＣｌ水溶液を用いた場合にも、焼却灰Ｂ及びＣと接触させた海洋性バクテリアの生物活性が低下しており、焼却灰Ｂ及びＣを毒性があると評価することができた。
(Example 5)
Instead of 1,000 mg / L KCl + 2 wt% NaCl aqueous solution, 1,000 mg / L K 2 SO 4 +2 wt% NaCl aqueous solution or 1,000 mg / L KBr + 2 wt% NaCl aqueous solution was used. In the same manner as in Example 4, the biological activity of marine bacteria was measured.
Even when K 2 SO 4 + NaCl aqueous solution or KBr + NaCl aqueous solution is used, the biological activity of marine bacteria brought into contact with incinerated ash B and C is lowered, and incinerated ash B and C are evaluated as toxic. I was able to.
（実施例６）
海洋性バクテリア活性調整物質として１００、１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ水溶液、１００、１，０００ｍｇ／ＬのＫ２ＳＯ４水溶液、及び１００、１，０００ｍｇ／ＬのＫＢｒ水溶液を調製し、ＲＯＴＡＳを用いて焼却灰Ａ、Ｂ及びＣの毒性評価を行った。
(Example 6)
Prepare 100, 1,000 mg / L KCl aqueous solution, 100, 1,000 mg / L K 2 SO 4 aqueous solution, and 100, 1,000 mg / L KBr aqueous solution as marine bacterial activity regulators, and use ROTAS Incineration ash A, B and C were evaluated for toxicity.
海洋性バクテリア：ビブリオ・フィシャリ ５０ｍｇ
再活性化溶液：２重量％ＮａＣｌ水溶液 ２７ｍｌ
海洋性バクテリア懸濁液ｐＨ：７
１セル中の海洋性バクテリア懸濁液量：１ｍＬ（乾燥重量にして１．８５ｍｇのバクテリアを含む）
１セル中の焼却灰抽出液の添加量：１ｍＬ
１セル中の海洋性バクテリア活性調整物質の添加量：１００μＬ
測定時間：海洋性バクテリア懸濁液を調製してから５０分後の発光強度（焼却灰抽出液添加前の発光強度）を測定、その後、海洋性バクテリア懸濁液に焼却灰抽出液及び海洋性バクテリア活性調整物質を添加してから１５分後の発光強度（焼却灰抽出液添加後の発光強度）を測定
Marine bacteria: Vibrio Fisali 50mg
Reactivation solution: 2% NaCl aqueous solution 27 ml
Marine bacterial suspension pH: 7
Amount of marine bacteria in one cell: 1 mL (contains 1.85 mg of bacteria in dry weight)
Addition amount of incinerated ash extract in 1 cell: 1 mL
Addition amount of marine bacterial activity regulator in one cell: 100 μL
Measurement time: Measure the luminescence intensity (luminescence intensity before adding the incinerated ash extract) 50 minutes after preparing the marine bacterial suspension, and then add the incinerated ash extract and marine to the marine bacterial suspension. Measures the luminescence intensity 15 minutes after adding the bacterial activity regulator (luminescence intensity after adding incinerated ash extract)
海洋性バクテリア活性調整物質としてＫＣｌ水溶液、Ｋ２ＳＯ４水溶液、又はＫＢｒ水溶液を加えた場合のいずれにおいても、焼却灰Ｂ及びＣを毒性があると評価することができた。 It was possible to evaluate that the incinerated ash B and C were toxic in any case where a KCl aqueous solution, a K 2 SO 4 aqueous solution, or a KBr aqueous solution was added as a marine bacterial activity regulator.
（実施例７）
抽出溶媒として１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ水溶液、１，０００ｍｇ／ＬのＫ２ＳＯ４水溶液、及び１，０００ｍｇ／ＬのＫＢｒ水溶液を用いて、焼却灰Ａ、Ｂ及びＣより焼却灰抽出液を調製した。ＲＯＴＡＳを用いて焼却灰Ａ、Ｂ及びＣの毒性評価を行った。
(Example 7)
Using the 1,000 mg / L KCl aqueous solution, 1,000 mg / L K 2 SO 4 aqueous solution, and 1,000 mg / L KBr aqueous solution as the extraction solvent, the incinerated ash extract from the incinerated ash A, B and C Prepared. Toxicity evaluation of incineration ash A, B, and C was performed using ROTAS.
海洋性バクテリア：ビブリオ・フィシャリ ５０ｍｇ
再活性化溶液：２重量％ＮａＣｌ水溶液 ２７ｍｌ
海洋性バクテリア懸濁液ｐＨ：７
１セル中の海洋性バクテリア懸濁液量：１ｍＬ（乾燥重量にして１．８５ｍｇのバクテリアを含む）
１セル中の焼却灰抽出液の添加量：１ｍＬ
測定時間：海洋性バクテリア懸濁液を調製してから５０分後の発光強度（焼却灰抽出液添加前の発光強度）を測定、その後、海洋性バクテリア懸濁液に焼却灰抽出液を添加してから１５分後の発光強度（焼却灰抽出液添加後の発光強度）を測定
Marine bacteria: Vibrio Fisali 50mg
Reactivation solution: 2% NaCl aqueous solution 27 ml
Marine bacterial suspension pH: 7
Amount of marine bacteria in one cell: 1 mL (contains 1.85 mg of bacteria in dry weight)
Addition amount of incinerated ash extract in 1 cell: 1 mL
Measurement time: Measure the luminescence intensity (luminescence intensity before adding the incinerated ash extract) 50 minutes after preparing the marine bacterial suspension, and then add the incinerated ash extract to the marine bacterial suspension. Measures the luminescence intensity after 15 minutes (luminescence intensity after adding incinerated ash extract)
抽出溶媒としてＫＣｌ水溶液、Ｋ２ＳＯ４水溶液、又はＫＢｒ水溶液を用いた場合のいずれにおいても、焼却灰Ｂ及びＣを毒性があると評価することができた。 In any case where an aqueous KCl solution, an aqueous K 2 SO 4 solution, or an aqueous KBr solution was used as the extraction solvent, the incinerated ash B and C could be evaluated as toxic.
（実施例８）
以下の組成を有する４種の水溶液を調製した。
水溶液ａ：２０，０００ｍｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２００ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４
水溶液ｂ：２０，０００ｍｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３，７００ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、１，０００ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、５００ｍｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４
水溶液ｃ：２０，０００ｍｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２，０００ｍｇ／Ｌ グルコース
水溶液ｄ：２０，０００ｍｇ／Ｌ ＮａＣｌ
再活性化溶液として水溶液ａ〜ｄを用い、被検物質として焼却灰抽出液Ｄを用いた他は実施例４と同様にして、海洋性バクテリア懸濁液に焼却灰抽出液Ｄを添加してから１５分後の発光強度を測定した。
(Example 8)
Four aqueous solutions having the following compositions were prepared.
Aqueous solution a: 20,000 mg / L NaCl, 200 mg / L MgSO 4
Aqueous solution b: 20,000 mg / L NaCl, 3,700 mg / L Na 2 HPO 4 , 1,000 mg / L KH 2 PO 4 , 500 mg / L (NH 4 ) 2 HPO 4
Aqueous solution c: 20,000 mg / L NaCl, 2,000 mg / L glucose aqueous solution d: 20,000 mg / L NaCl
The incinerated ash extract D was added to the marine bacterial suspension in the same manner as in Example 4 except that the aqueous solutions a to d were used as the reactivation solution and the incinerated ash extract D was used as the test substance. The luminescence intensity 15 minutes after was measured.
評価結果を表１に示す。水溶液ａ〜ｃを用いた場合には、水溶液ｄを用いた場合と比べ、発光強度が低下した。 The evaluation results are shown in Table 1. When the aqueous solutions a to c were used, the emission intensity was lower than when the aqueous solution d was used.
（実施例９）
以下の組成を有する３種の水溶液を調製した。
水溶液ｅ：２０，０００ｍｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２，０００ｍｇ／Ｌ グルコース
水溶液ｆ：２０，０００ｍｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２，０００ｍｇ／Ｌ グルコース、２００ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４
水溶液ｇ：２０，０００ｍｇ／Ｌ ＮａＣｌ
再活性化溶液として水溶液ｅ〜ｇを用い、被検物質として焼却灰抽出液Ｆを用いた他は実施例４と同様にして、毒性を評価した。
Example 9
Three aqueous solutions having the following compositions were prepared.
Aqueous solution e: 20,000 mg / L NaCl, 2,000 mg / L glucose aqueous solution f: 20,000 mg / L NaCl, 2,000 mg / L glucose, 200 mg / L MgSO 4
Aqueous solution g: 20,000 mg / L NaCl
Toxicity was evaluated in the same manner as in Example 4 except that the aqueous solutions e to g were used as the reactivation solution and the incinerated ash extract F was used as the test substance.
評価結果を表２に示す。水溶液ｅ又はｆを用いた場合には、焼却灰抽出液Ｆを毒性があると評価することができた。 The evaluation results are shown in Table 2. When the aqueous solution e or f was used, it was possible to evaluate that the incinerated ash extract F was toxic.
（実施例１０）
再活性化溶液として、人工海水を用いて海洋性バクテリアを再活性化し、海洋性バクテリア懸濁液を得た。人工海水の主成分は、次のとおりである。塩素１９．３５４ｇ／ｋｇ、ナトリウム１０．７７ｇ／ｋｇ、硫黄２．７１２ｇ／ｋｇ、マグネシウム１．２９ｇ／ｋｇ、カルシウム０．４１２ｇ／ｋｇ、カリウム０．３９９ｇ／ｋｇ、炭素０．１４２ｇ／ｋｇ、臭素０．０６７３ｇ／ｋｇ、ストロンチウム０．０００７９ｇ／ｋｇ、ホウ素０．００４５ｇ／ｋｇ、及びフッ素０．００１３ｇ／ｋｇ
得られた海洋性バクテリア懸濁液について、実施例１と同様の方法で海洋性バクテリアの生物活性（発光強度）を測定した。
その結果、実施例１の再活性化溶液として１，０００ｍｇ／ＬのＫＣｌ水溶液と２重量％のＮａＣｌ水溶液との混合水溶液を用いた例に対して、４０％程度の発光強度が得られた。
(Example 10)
As a reactivation solution, marine bacteria were reactivated using artificial seawater to obtain a marine bacteria suspension. The main components of artificial seawater are as follows. Chlorine 19.354 g / kg, sodium 10.77 g / kg, sulfur 2.712 g / kg, magnesium 1.29 g / kg, calcium 0.412 g / kg, potassium 0.399 g / kg, carbon 0.142 g / kg, bromine 0.0673 g / kg, strontium 0.00079 g / kg, boron 0.0045 g / kg, and fluorine 0.0013 g / kg
About the obtained marine bacterial suspension, the biological activity (luminescence intensity) of marine bacteria was measured in the same manner as in Example 1.
As a result, an emission intensity of about 40% was obtained as compared with the example using a mixed aqueous solution of 1,000 mg / L KCl aqueous solution and 2 wt% NaCl aqueous solution as the reactivation solution of Example 1.
Claims (21)
焼却残滓及び抽出溶媒を混合し、焼却残滓抽出液を調製する工程、
海洋性バクテリア懸濁液及び焼却残滓抽出液を混合する工程、
を含む請求項１〜６いずれか記載の毒性評価方法。 Mixing lyophilized marine bacteria and reactivation solution to prepare marine bacteria suspension;
A step of mixing the incineration residue and the extraction solvent to prepare an incineration residue extract,
Mixing the marine bacterial suspension and the incineration residue extract,
The toxicity evaluation method in any one of Claims 1-6 containing these.
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