JP2009072186A - Method for controlling undifferentiated state in stem cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Fibrillarinをコードする核酸（Fibrillarin遺伝子）を幹細胞に導入して、発現させるなどの方法により幹細胞中にFibrillarinタンパク質を存在させることによる幹細胞における未分化状態の制御方法、及びFibrillarin遺伝子で形質転換された幹細胞等に関する。また、体細胞を幹細胞化する際の脱分化促進方法に関する。さらに、幹細胞を分化する際に、Fibrillarin発現抑制物質やFibrillarin活性抑制物質を用いることによる、幹細胞の死滅化方法にも関する。 The present invention relates to a method for controlling an undifferentiated state in a stem cell by introducing a fibrillarin protein into the stem cell by introducing and expressing a nucleic acid encoding fibrillarin (Fibrillarin gene) into the stem cell, and transforming with the fibrillarin gene. It relates to converted stem cells and the like. The present invention also relates to a method for promoting dedifferentiation when somatic cells are transformed into stem cells. Furthermore, the present invention also relates to a method for killing stem cells by using a fibrillarin expression inhibitor or a fibrillarin activity inhibitor when differentiating the stem cells.
幹細胞の再生医療への応用が期待され、多くの医療・研究機関において、その実用化に向けた検討が行われている。しかし、盲目的で偶然に頼る研究が多く、現時点では目的とする細胞を効率よく分化誘導し安定供給することはおろか、分化誘導後の細胞の安定性等、問題が山積している。
多能性幹細胞を生み出す技術として注目されている「体細胞核移植」は、実際のところ再プログラム化の効率は非常に低く、不完全であることが確認されている（非特許文献１）。体細胞核移植の調製に卵子を使用することで、再プログラム化の効率は高まるが、ヒトに適用することは、ヒト卵子由来のES細胞を用いた組織分化誘導の場合と同様、倫理的な問題を回避できない。
それゆえ最近では患者自身の幹細胞を利用した再生医療の実現が待望されている。その際、患者自身の体細胞の幹細胞化（脱分化）は有望な方法であるが、特にヒトでは体細胞の幹細胞化はなかなか実現化しなかった。
最近、４つの転写因子（Oct3/4、Sox2、Klf-4、c-Myc）またはそのうちの３つ（Oct3/4、Sox2、Klf-4）を導入することにより、繊維芽細胞などの体細胞を脱分化して幹細胞化する方法が相次いで報告された（非特許文献１１〜１４）が、作成された幹細胞（iPS細胞）の安定性が低いことと共に、その脱分化の効率がきわめて低いことが問題となっている。
現在の再生医療研究がこれらの問題に窮しているのは、ひとえに幹細胞の制御方法が極めて不十分であることに原因がある。これまでに、幹細胞の制御に関して報告されている（非特許文献２−５）が、未だ上記目的を十分に達成する為には満足のいくものではない。
It has been confirmed that “somatic cell nuclear transfer”, which is attracting attention as a technique for generating pluripotent stem cells, is actually incompletely reprogramming and incomplete (Non-patent Document 1). Although the efficiency of reprogramming is increased by using an egg for the preparation of somatic cell nuclear transfer, application to humans is an ethical issue, as is the case for induction of tissue differentiation using ES cells derived from human eggs. Cannot be avoided.
Therefore, recently, the realization of regenerative medicine using the patient's own stem cells is awaited. At that time, the stem cell conversion (dedifferentiation) of the patient's own somatic cells is a promising method, but in particular, the somatic cell stem cell conversion has not been realized.
Recently, somatic cells such as fibroblasts by introducing four transcription factors (Oct3 / 4, Sox2, Klf-4, c-Myc) or three of them (Oct3 / 4, Sox2, Klf-4) Has been reported one after another (Non-Patent Documents 11 to 14), but the stability of the prepared stem cells (iPS cells) is low and the efficiency of the dedifferentiation is extremely low Is a problem.
Current regenerative medicine research is at risk of these problems, mainly because of the inadequate control of stem cells. So far, it has been reported regarding the control of stem cells (Non-patent Documents 2-5), but it is still not satisfactory in order to sufficiently achieve the above object.
本発明の主な目的は、幹細胞の未分化状態を制御する因子を同定し、多分化能を持つ幹細胞を簡便に培養する方法を提供することである。また、体細胞を幹細胞に脱分化する際の脱分化促進方法、及び幹細胞を分化する際に残った幹細胞を死滅させる方法を提供することも目的とする。 The main object of the present invention is to identify a factor that controls the undifferentiated state of stem cells and to provide a method for easily culturing stem cells having multipotency. Another object of the present invention is to provide a method for promoting dedifferentiation when dedifferentiating somatic cells into stem cells, and a method for killing remaining stem cells when differentiating stem cells.
マウスES細胞はLIF（Leukemia inhibitory factor:白血病阻害因子）存在下で、未分化状態を維持しながら増殖することができるが、LIFを除くとES細胞は徐々に分化していくことが知られていた（非特許文献２）。
そこで、発明者は、LIFが存在することで、培養中の幹細胞中で未分化状態を維持するための物質が産生されている可能性があると考え、マウスES細胞をLIF存在下あるいは非存在下で培養して、ES細胞の核と細胞質から蛋白質抽出液を調製し、２次元電気泳動で変動のある蛋白質を質量分析により解析した。
その結果、LIF存在下の未分化状態幹細胞に特異的に発現する蛋白質のうちでも特に発現量の高いFibrillarinを同定した。そして、Fibrillarin遺伝子を導入したマウスES細胞が、LIF非存在下においても未分化状態を維持しながら長期間（数週間）増殖することができることを初めて見出し、係る知見に基づき本発明を完成した。
また、繊維芽細胞に対してiPS細胞化するための4遺伝子又は3遺伝子に、さらにFibrillarin遺伝子を追加してiPS細胞化への効果を調べたところ、顕著に促進することを見出し、Fibrillarin遺伝子を用いた体細胞の脱分化促進法についての本発明も完成した。
さらに、ES細胞のFibrillarin遺伝子の発現をノックダウンにより抑制したところ不活性化し、死滅する細胞も多数存在した。一方、分化が進んだ細胞には影響を与えないことから、幹細胞を分化させる際に、残存した未分化状態の細胞を死滅化させる方法についての本発明も完成した。
Mouse ES cells can proliferate in the presence of LIF (Leukemia inhibitory factor) while maintaining an undifferentiated state, but ES cells are known to gradually differentiate when LIF is removed. (Non-Patent Document 2).
Therefore, the inventor considered that the presence of LIF may produce a substance to maintain an undifferentiated state in the stem cells in culture, and mouse ES cells were present in the presence or absence of LIF. Then, a protein extract was prepared from the nuclei and cytoplasm of ES cells, and the proteins with fluctuations were analyzed by mass spectrometry by two-dimensional electrophoresis.
As a result, among the proteins specifically expressed in the undifferentiated stem cells in the presence of LIF, Fibrillarin having a particularly high expression level was identified. The inventors found for the first time that mouse ES cells introduced with the Fibrillarin gene can proliferate for a long period (several weeks) while maintaining an undifferentiated state even in the absence of LIF, and completed the present invention based on such findings.
In addition, when Fibrillarin gene was added to 4 or 3 genes for iPS cell formation for fibroblasts and the effect on iPS cell formation was examined, it was found that it was significantly promoted, and Fibrillarin gene was The present invention about the method for promoting dedifferentiation of somatic cells used was also completed.
In addition, there were many cells that were inactivated and killed when the expression of the Fibrillarin gene in ES cells was suppressed by knockdown. On the other hand, since the cells that have undergone differentiation are not affected, the present invention for a method for killing the remaining undifferentiated cells when the stem cells are differentiated has also been completed.
即ち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕 Fibrillarinをコードする核酸を含む組換え核酸又は当該組換え核酸が挿入された組換え発現ベクターを幹細胞に導入し、幹細胞内でFibrillarinを発現させることを特徴とする、幹細胞における未分化状態の制御方法。
〔２〕 Fibrillarinをコードする核酸が哺乳動物由来遺伝子である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕 幹細胞にFibrillarinタンパク質を導入し、Fibrillarin量を調節することで幹細胞が分化する時期を調節することを特徴とする、幹細胞における未分化状態の制御方法。
〔４〕 幹細胞がES細胞である、前記〔１〕ないし〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 Fibrillarinをコードする核酸を含む組換え核酸又は当該組換え核酸が挿入された組換え発現ベクターを活性成分とする、幹細胞の未分化状態制御剤。
〔６〕 Fibrillarinタンパク質を活性成分とする、幹細胞の未分化状態制御剤。
〔７〕 Fibrillarinをコードする核酸を含む組換え核酸又は当該組換え核酸が挿入された組換え発現ベクターが導入された形質転換幹細胞であって、Fibrillarinを過剰発現する形質転換幹細胞。
〔８〕 幹細胞がES細胞である、前記〔７〕に記載の形質転換幹細胞。
〔９〕 幹細胞が体細胞を脱分化させたiPS細胞である、前記〔７〕に記載の形質転換細胞。
〔１０〕 体細胞を脱分化させてiPS細胞化する工程において、Fibrillarinをコードする核酸を含む組換え核酸又は当該組換え核酸が挿入された組換え発現ベクターを体細胞に導入し、体細胞内でFibrillarinを発現させることを特徴とする、脱分化促進方法。
〔１１〕 体細胞が繊維芽細胞であり、iPS細胞化する工程が、体細胞にOct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、Klf-4遺伝子の3遺伝子又はさらにc-Myc遺伝子を加えた4遺伝子を導入する工程を含むことを特徴とする、前記〔１０〕に記載の脱分化促進方法。
〔１２〕 Fibrillarinをコードする核酸を含む組換え核酸又は当該組換え核酸が挿入された組換え発現ベクターを活性成分とする、体細胞の脱分化促進剤。
〔１３〕 幹細胞中のFibrillarin遺伝子の発現を抑制するか、又はFibrillarinの活性を抑制することを特徴とする、幹細胞の増殖抑制又は死滅化する方法。
〔１４〕 幹細胞を分化させる際に、未分化状態に残った幹細胞を不活化又は死滅させるための前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕 幹細胞がES細胞である、前記〔１３〕又は〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕 幹細胞がiPS細胞である、前記〔１３〕又は〔１４〕に記載の方法。
〔１７〕 Fibrillarin遺伝子の発現を抑制するか、又はFibrillarinの活性を抑制する作用を有する薬剤を活性成分とする、幹細胞の増殖抑制剤又は死滅剤。
That is, the present invention is as follows.
[1] An undifferentiated state in a stem cell, wherein a recombinant nucleic acid containing a nucleic acid encoding fibrillarin or a recombinant expression vector into which the recombinant nucleic acid is inserted is introduced into the stem cell, and fibrillarin is expressed in the stem cell Control method.
[2] The method according to [1] above, wherein the nucleic acid encoding Fibrillarin is a mammal-derived gene.
[3] A method for controlling an undifferentiated state in a stem cell, wherein the fibrillarin protein is introduced into the stem cell and the amount of fibrillarin is regulated to regulate the time when the stem cell differentiates.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the stem cell is an ES cell.
[5] A stem cell undifferentiated state control agent comprising a recombinant nucleic acid containing a nucleic acid encoding Fibrillarin or a recombinant expression vector into which the recombinant nucleic acid has been inserted as an active ingredient.
[6] An agent for controlling the undifferentiated state of stem cells, comprising Fibrillarin protein as an active ingredient.
[7] A transformed stem cell into which a recombinant nucleic acid containing a nucleic acid encoding Fibrillarin or a recombinant expression vector into which the recombinant nucleic acid is inserted is introduced, and overexpresses Fibrillarin.
[8] The transformed stem cell according to [7], wherein the stem cell is an ES cell.
[9] The transformed cell according to [7], wherein the stem cell is an iPS cell obtained by dedifferentiating a somatic cell.
[10] In the step of dedifferentiating somatic cells into iPS cells, a recombinant nucleic acid containing a nucleic acid encoding fibrillarin or a recombinant expression vector having the recombinant nucleic acid inserted therein is introduced into somatic cells, A method for promoting dedifferentiation, comprising expressing Fibrillarin in
[11] The somatic cell is a fibroblast, and the step of becoming an iPS cell introduces 4 genes in which 3 genes of Oct3 / 4 gene, Sox2 gene, Klf-4 gene or further c-Myc gene are added to the somatic cell. The method for promoting dedifferentiation according to [10] above, comprising the step of:
[12] A somatic cell dedifferentiation promoter comprising a recombinant nucleic acid containing a nucleic acid encoding fibrillarin or a recombinant expression vector into which the recombinant nucleic acid has been inserted as an active ingredient.
[13] A method for inhibiting or killing stem cell proliferation, comprising suppressing fibrillarin gene expression in stem cells or suppressing fibrillarin activity.
[14] The method according to [13] above, wherein when stem cells are differentiated, the stem cells remaining in an undifferentiated state are inactivated or killed.
[15] The method according to [13] or [14] above, wherein the stem cell is an ES cell.
[16] The method according to [13] or [14] above, wherein the stem cell is an iPS cell.
[17] A stem cell proliferation inhibitor or killing agent comprising, as an active ingredient, a drug having an action of suppressing the expression of Fibrillarin gene or suppressing the activity of Fibrillarin.
本発明方法に従い、Fibrillarinをコードする核酸を導入するか、もしくは幹細胞にFibrillarinタンパク質を導入することによって、幹細胞における未分化状態の制御を行うことが出来る。すなわち、Fibrillarin遺伝子の発現を促進するか、幹細胞内のFibrillarin濃度を増加させることにより、幹細胞を未分化状態を維持したまま、安定かつ容易に大量培養することが可能となる。また従来効率がきわめて悪かった体細胞を脱分化する際の脱分化促進剤としても有効であり、従来よりも効率よく幹細胞を調製することができる。また、幹細胞を望みの細胞に分化する際に、活性なFibrillarin濃度を減少させることにより、将来的に癌化が危惧される未分化状態の幹細胞を死滅させることが可能になる。 According to the method of the present invention, an undifferentiated state in a stem cell can be controlled by introducing a nucleic acid encoding Fibrillarin or introducing a Fibrillarin protein into a stem cell. That is, by promoting the expression of the Fibrillarin gene or increasing the Fibrillarin concentration in the stem cells, the stem cells can be stably and easily cultured in large quantities while maintaining an undifferentiated state. Moreover, it is also effective as a dedifferentiation promoter when dedifferentiating somatic cells, which have been extremely poor in efficiency, and stem cells can be prepared more efficiently than in the past. Further, when differentiating the stem cells into the desired cells, it is possible to kill undifferentiated stem cells that are likely to become cancerous in the future by reducing the active Fibrillarin concentration.
本発明第一の態様は、Fibrillarinをコードする核酸（Fibrillarin遺伝子）を導入することから成る、幹細胞における未分化状態の制御方法に係る。本明細書において、「幹細胞」は未分化状態にある細胞を広く意味し、例えば、胎性幹細胞（ES細胞）の他、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚組織幹細胞等、様々な組織性幹細胞等を包含する概念である。また、体細胞に幹細胞特異的発現遺伝子などを導入して脱分化させた幹細胞（iPS細胞）なども包まれる。 The first aspect of the present invention relates to a method for controlling an undifferentiated state in stem cells, which comprises introducing a nucleic acid encoding Fibrillarin (Fibrillarin gene). In the present specification, “stem cell” broadly means a cell in an undifferentiated state. For example, in addition to embryonic stem cells (ES cells), various stem cells such as hematopoietic stem cells, neural stem cells, skin tissue stem cells, etc. It is a concept to include. Also included are stem cells (iPS cells) that have been dedifferentiated by introducing a stem cell-specific expression gene into somatic cells.
多くの脊椎動物のFibrillarin蛋白質のアミノ酸配列は公知であり、その機能としては、リボソーム生合成、核小体低分子リボ核酸タンパク質の生合成やmRNAのプロセッシングに関与することが知られており（非特許文献６、７）、それらは脊椎動物間で広く保存されている。特に、ヒト由来のFibrillarinは３２１個のアミノ酸からなる蛋白質（National Center for Biotechnology Information (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）であり、サル、ウシ、イヌ、ラット、及びマウス等の哺乳動物では、アミノ酸配列において約９０％以上の相同性があり、さらに、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫、シロイヌナズナ、酵母等の非哺乳類由来、非脊椎動物由来のFibrillarinを含めても、アミノ酸配列において約７５％以上の高い相同性がある（図１）。Fibrillarinの機能はこれらの生物間で広く保存されていることが確認されており、また、実際に酵母におけるFibrillarin遺伝子の欠損をヒトのFibrillarin遺伝子を導入することにより機能的に補完することができることからも実証されている（非特許文献８）。 The amino acid sequences of many vertebrate Fibrillarin proteins are known, and their functions are known to be involved in ribosome biosynthesis, biosynthesis of small nucleolar ribonucleic acid proteins and mRNA processing (non- Patent Documents 6 and 7) are widely conserved among vertebrates. In particular, human-derived Fibrillarin is a protein consisting of 321 amino acids (National Center for Biotechnology Information (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), including monkeys, cows, dogs, rats, and Mammals such as mice have about 90% or more homology in amino acid sequences, and include Fibrillarin derived from non-mammalian and non-vertebrate animals such as Xenopus, zebrafish, Drosophila, nematodes, Arabidopsis thaliana, and yeasts. However, there is a high homology of about 75% or more in amino acid sequence (FIG. 1). It has been confirmed that the function of Fibrillarin is widely conserved among these organisms, and the fact that Fibrillarin gene defects in yeast can actually be complemented functionally by introducing the human Fibrillarin gene. Has also been demonstrated (Non-patent Document 8).
従って、Fibrillarin遺伝子は、広く真核生物由来のものを含み、典型的には上記の哺乳動物に由来するものである。 Accordingly, the Fibrillarin gene includes a wide range derived from eukaryotes and is typically derived from the above-mentioned mammals.
たとえば、本発明における好ましいFibrillarin遺伝子は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の蛋白質をコードするものとして示すことができる。
（ａ）哺乳動物由来のFibrillarin蛋白質（配列番号１〜６）、
（ｂ）（ａ）記載のいずれかのFibrillarin蛋白質のアミノ酸配列において、その一部分が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ、幹細胞の未分化状態を維持する活性を有する蛋白質、又は
（ｃ）（ａ）記載のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、幹細胞の未分化状態を維持する活性を有する蛋白質。
For example, a preferred Fibrillarin gene in the present invention can be shown as encoding the protein described in the following (a), (b) or (c).
(A) a Fibrillarin protein derived from a mammal (SEQ ID NOs: 1 to 6),
(B) a protein comprising an amino acid sequence partially deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of any of the fibrillarin proteins described in (a), and having an activity of maintaining an undifferentiated state of a stem cell Or (c) an amino acid sequence having 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 99% or more homology with the amino acid sequence described in (a), and A protein having an activity of maintaining an undifferentiated state.
更に、Fibrillarin遺伝子は以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の核酸を含むものとしても表すことができる。
（ａ）哺乳動物由来のFibrillarinをコードする塩基配列（配列番号１５〜１７）から成る核酸、
（ｂ）上記（ａ）に記載の塩基配列から成る核酸と相補的な塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ES細胞の未分化状態を維持する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
Furthermore, the Fibrillarin gene can also be expressed as a nucleic acid described in (a) or (b) below.
(A) a nucleic acid comprising a base sequence (SEQ ID NO: 15 to 17) encoding Fibrillarin derived from a mammal;
(B) a protein that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to the nucleic acid consisting of the base sequence described in (a) above and has an activity of maintaining the undifferentiated state of ES cells Nucleic acid encoding
本発明の方法において、Fibrillarin遺伝子は、導入する幹細胞と同じ生物種又は異なる生物種由来のもののいずれでも良いが、出来るだけ互いに近縁種であることが好ましく、特に、同じ生物種由来であることが好ましい。 In the method of the present invention, the Fibrillarin gene may be of the same species as the stem cell to be introduced or one derived from a different species, but it is preferable that the Fibrillarin genes are closely related to each other as much as possible. Is preferred.
本発明において、幹細胞における未分化状態を制御するとは、未分化状態を安定に維持、あるいは積極的に未分化状態に移行させることを意味する。幹細胞の分化状態は、当業者に公知の任意の方法・手段で検出・確認することが出来る。例えば、本明細書の実施例に記載されているように、細胞の形態的特徴、又は、アルカリホスファターゼ及び転写因子Nanog, Oct3/4及び表面抗原蛋白質SSEA1等の適当な未分化マーカーを利用する抗体反応等により幹細胞の分化状態を確認することが出来る。従って、未分化状態を維持及び／又は促進するとは、例えば、上記の各未分化マーカーの発現（活性）の程度がLIF存在下で培養した未分化状態のES細胞に近いか又は実質的に同程度であることを意味する。
その具体例として、例えば、Fibrillarin遺伝子をES細胞に導入し、ES細胞の未分化状態を維持する方法がある。
In the present invention, controlling an undifferentiated state in a stem cell means maintaining the undifferentiated state stably or actively shifting to an undifferentiated state. The differentiation state of the stem cell can be detected and confirmed by any method / means known to those skilled in the art. For example, as described in the Examples herein, an antibody that utilizes morphological characteristics of cells or appropriate undifferentiation markers such as alkaline phosphatase and transcription factors Nanog, Oct3 / 4 and surface antigen protein SSEA1 The differentiation state of stem cells can be confirmed by reaction or the like. Therefore, maintaining and / or promoting the undifferentiated state means, for example, that the degree of expression (activity) of each of the above undifferentiated markers is close to or substantially the same as that of undifferentiated ES cells cultured in the presence of LIF. Means about.
As a specific example, for example, there is a method of introducing the Fibrillarin gene into ES cells and maintaining the undifferentiated state of ES cells.
また、体細胞を転写因子などの導入により初期化、脱分化する際に、体細胞にあらかじめ、又は同時にFibrillarin遺伝子を導入することで、脱分化を促進することができる。例えば、繊維芽細胞などの体細胞に、幹細胞特異的に発現する転写因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycの４因子、又はOct3/4, Sox2, Klf4の３因子）をウイルスで遺伝子導入することによりES細胞様の細胞（iPS細胞）に脱分化させる方法（非特許文献１１、１２、１３、１４）において、これらの転写因子に加えてFibrillarin遺伝子をウイルスで繊維芽細胞に遺伝子導入することにより、ES細胞様の幹細胞に脱分化を著しく加速化することができる。そして、脱分化されたiPS細胞に対しては、Fibrillarin遺伝子又はFibrillarinはES細胞の場合と同様に、未分化状態の維持及び安定化に寄与する。 In addition, when a somatic cell is initialized and dedifferentiated by introducing a transcription factor or the like, dedifferentiation can be promoted by introducing the Fibrillarin gene into the somatic cell in advance or simultaneously. For example, a transcription factor (4 factors of Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc, or 3 factors of Oct3 / 4, Sox2, Klf4) expressed specifically in stem cells in somatic cells such as fibroblasts with viruses In a method of dedifferentiation into ES cell-like cells (iPS cells) by gene introduction (Non-patent Documents 11, 12, 13, and 14), in addition to these transcription factors, the fibrillarin gene is transferred to fibroblasts with a virus. By introducing, it is possible to remarkably accelerate dedifferentiation into ES cell-like stem cells. And for dedifferentiated iPS cells, the Fibrillarin gene or Fibrillarin contributes to the maintenance and stabilization of the undifferentiated state as in the case of ES cells.
本発明において、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基どうし又は各塩基どうしの互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できるが、本発明において用いた相同性はヒトFibrillarinアミノ酸配列を元に、NCBIのデータベースのホモロジー検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on）を行い決定したものである。 In the present invention, “homology” means each amino acid residue constituting each chain between two chains in a polypeptide sequence (or amino acid sequence) or polynucleotide sequence (or base sequence) or It means the amount (number) of things that can be determined to be identical in the mutual compatibility of bases, and means the degree of sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences. Although the homology can be easily calculated, the homology used in the present invention is based on the homology search of NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast. cgi? PAGE = Proteins & PROGRAM = blastp & BLAST_PROGRAMS = blastp & PAGE_TYPE = BlastSearch & SHOW_DEFAULTS = on).
本発明においては、Fibrillarinをコードする核酸も、Fibrillarinタンパク質をコードする核酸も同様の意味で用いており、単にFibrillarin遺伝子ということもある。本発明における「コードする」とは、本発明の蛋白質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味しているので、Fibrillarin遺伝子の全長ではなくそのフラグメントであっても、Fibrillarinタンパク質としての活性を有してさえいればよい。また、「コードする」とは、本発明のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は本発明の蛋白質を適当な介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者を含んでいる。 In the present invention, the nucleic acid encoding Fibrillarin and the nucleic acid encoding Fibrillarin protein are used in the same meaning, and may be simply referred to as Fibrillarin gene. The term “encode” in the present invention means that the protein of the present invention is expressed in a state having the activity. Therefore, even if it is not the full length of the Fibrillarin gene but a fragment thereof, It only needs to have activity. The term “encode” includes both encoding the protein of the present invention as a continuous structural sequence (exon) or encoding the protein of the present invention via an appropriate intervening sequence (intron). Yes.
「核酸」とは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はいずれの核酸の修飾体をも含む。また、核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡを含んでいる。 "Nucleic acid" includes ribonucleic acid, deoxyribonucleic acid, or any modified nucleic acid. The nucleic acid includes single-stranded or double-stranded DNA.
本明細書において、「ストリンジェント（stringent）な条件」とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。 As used herein, “stringent conditions” are conditions that enable selective and detectable specific binding between the polynucleotide or oligonucleotide and genomic DNA. Stringent conditions are defined by a suitable combination of salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. That is, stringency increases depending on whether the salt concentration is reduced, the organic solvent concentration is increased, or the hybridization temperature is increased. In addition, washing conditions after hybridization also affect stringency. This wash condition is also defined by salt concentration and temperature, and the stringency of the wash increases with decreasing salt concentration and increasing temperature.
従って、「ストリンジェントな条件」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度150〜900mM、好ましくは600〜900mM、pH 6〜8であるような条件を挙げることが出来る。ストリンジェントな条件の一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。 Therefore, “stringent conditions” means that the degree of homology between each base sequence is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more on the average on the whole. It means that the hybrid is specifically formed only between base sequences having high homology. Specifically, for example, the conditions include a sodium concentration of 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and a pH of 6 to 8 at a temperature of 60 to 68 ° C. As a specific example of stringent conditions, hybridization is performed under the conditions of 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 1% SDS, 5 x Denhardt's solution 50% formaldehyde, and 42 ° C. Washing is performed under conditions of 0.1 × SSC (15 mM NaCl, 1.5 mM trisodium citrate), 0.1% SDS, and 55 ° C.
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 Hybridization may be performed by a method known in the art, such as, for example, the method described in Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987). It can carry out according to the method according to it. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
本発明の遺伝子は、当業者に公知の公的機関のデータベース又は本明細書に記載の塩基配列に基づき作製したプライマー又はプローブ等を用いて、当業者に公知の任意の方法で調製することが出来る。例えば、各種のＰＣＲ、並びに、その他のNASBA（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法及びSDA（Strand Displacement Amplification）法等の当業者に公知の任意ＤＮＡ増幅技術を用いることにより、該遺伝子のｃＤＮＡとして容易に得ることが可能である。 The gene of the present invention can be prepared by any method known to those skilled in the art using a primer or probe prepared based on a public institution database known to those skilled in the art or a base sequence described herein. I can do it. For example, various PCR and other DNA amplification techniques known to those skilled in the art such as NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, TMA (Transcription-mediated amplification) method and SDA (Strand Displacement Amplification) method are used. Thus, it can be easily obtained as cDNA of the gene.
或いは、上記遺伝子は当業者に周知の方法により、本明細書に記載のcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。更に、該遺伝子のcDNAに、当業者に公知の部位特異的突然変異誘発に基づき、市販のミューテーションシステム等を用いて塩基変異を導入して調製することも可能である。 Alternatively, the gene can be isolated by screening the cDNA libraries described herein by methods well known to those skilled in the art. Furthermore, the cDNA of the gene can be prepared by introducing a base mutation using a commercially available mutation system or the like based on site-directed mutagenesis known to those skilled in the art.
又、上記遺伝子は、公知の方法（例えば、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid RES. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することもできる。また、本発明のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断する等の方法によって作製することもできる。 In addition, the above gene can be obtained by a known method (for example, Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997). ) Nucleic Acid RES. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90 Synthesized in vitro by well-known chemical synthesis techniques such as described in Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859; US Pat. No. 4,458,066) You can also It can also be produced by a method such as cleaving the polynucleotide of the present invention with an appropriate restriction enzyme.
本発明の遺伝子は、当業者に公知の任意の方法で幹細胞に導入し、該幹細胞を形質転換し、分化状態が制御された形質転換体を得ることが出来る。例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、トランスフェリン受容体を使用する方法、ペネトラチン等の膜透過性ペプチドを使用する方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション及びパーティクルガン等の物理的方法、更には、レトロウイルス及びアデノウイルス等の適当なウイルスを用いる方法を挙げることが出来る。 The gene of the present invention can be introduced into a stem cell by any method known to those skilled in the art, and the stem cell can be transformed to obtain a transformant with a controlled differentiation state. For example, calcium phosphate method, lipofection method, method using transferrin receptor, method using membrane-permeable peptide such as penetratin, physical method such as microinjection, electroporation and particle gun, and retrovirus and adeno A method using an appropriate virus such as a virus can be mentioned.
上記の各種形質転換法に応じて、各遺伝子は、そのまま単独の形態（例えば、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ分子、又は上流にプロモーターなどの制御配列を付加した状態）の組換え核酸として、又は適当なベクター（同じベクター又は別のベクター）に組み込んで作製した発現用組換えベクターの形態で導入される。例えば、このようなベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター等の各種ウィルスベクター、非ウィルス型ベクター又は混成型ベクター等を挙げることが出来る。このようなベクターには、発現調節配列には、適当なプロモーター、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコードする遺伝子における開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、及びストップコドン等の各種の遺伝子発現調節配列、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子等の各種要素が適宜含まれており、当業者に公知の任意の方法で作製することができる。 Depending on the various transformation methods described above, each gene can be used as a recombinant nucleic acid in a single form (for example, mRNA or cDNA molecule, or a control sequence such as a promoter added upstream) or an appropriate vector ( It is introduced in the form of a recombinant vector for expression prepared by being incorporated into the same vector or another vector. Examples of such vectors include various viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors, non-viral vectors, and mixed vectors. For such vectors, expression control sequences include appropriate promoters, enhancers, transcription terminators, start codons (ie, ATG) in genes encoding proteins, splicing signals for introns, polyadenylation sites, stop codons, etc. Various elements such as various gene expression regulatory sequences, cloning sites, drug resistance genes and the like are appropriately included, and can be prepared by any method known to those skilled in the art.
したがって、このようにして調製される、Fibrillarinをコードする核酸を含む組換え核酸、又は当該組換え核酸が挿入された発現用組換えベクターは、本発明方法において、幹細胞の未分化状態制御剤（組成物）の活性成分として使用することが出来る。また、体細胞を脱分化してiPS細胞とする際の脱分化促進剤の活性成分として用いることもできる。 Therefore, a recombinant nucleic acid containing a nucleic acid encoding Fibrillarin, or a recombinant expression vector into which the recombinant nucleic acid is inserted, prepared as described above, is used in the method of the present invention to control the undifferentiated state of a stem cell ( It can be used as an active ingredient of the composition. Moreover, it can also be used as an active ingredient of a dedifferentiation promoting agent when dedifferentiating somatic cells into iPS cells.
形質転換体の培養の諸条件及びそれに用いる培地は、培養する細胞の種類、細胞外分泌を促進させたい目的の蛋白質の種類、及び使用する発現ベクターの構成（プロモーターの種類等）等に応じて適当なものを適宜選択することができる。又、こうして作製されるFibrillarinをコードする核酸で形質転換された幹細胞（形質転換体）においては、Fibrillarinが安定的に発現されており、それによって、該形質転換体における未分化状態が維持されている。
たとえば、ES細胞の場合、Fibrillarin遺伝子が導入されたES細胞は、LIF非存在下における長期間の培養においても未分化状態を維持すことができるので、多分化能を保持したES細胞を安定かつ容易に大量培養することが可能となる。
The conditions for culturing the transformant and the medium used therefor are appropriate depending on the type of cells to be cultured, the type of the target protein to promote extracellular secretion, the configuration of the expression vector used (type of promoter, etc.), etc. Can be appropriately selected. Further, in the stem cells (transformants) transformed with the nucleic acid encoding Fibrillarin thus produced, Fibrillarin is stably expressed, whereby the undifferentiated state in the transformant is maintained. Yes.
For example, in the case of ES cells, ES cells into which the Fibrillarin gene has been introduced can maintain an undifferentiated state even in a long-term culture in the absence of LIF. Large-scale culture can be easily performed.
また、幹細胞は、Fibrillarinの存在によって未分化状態が維持されるのであるから、幹細胞培養液中にFibrillarinタンパク質を添加して、幹細胞内に機能性タンパク質として取り込ませることによっても同様の効果が奏せられる。たとえば、細胞膜透過性シグナルなどをFibrillarinタンパク質に付加することによって可能になる（非特許文献８）。また、市販のタンパク質用のリポフェクション試薬などによって細胞内にタンパク質を容易に取り込ませることが可能である（非特許文献９、１０）。 In addition, since stem cells are maintained in an undifferentiated state due to the presence of fibrillarin, the same effect can be obtained by adding fibrillarin protein to the stem cell culture medium and incorporating it as a functional protein into the stem cells. It is done. For example, it becomes possible by adding a cell membrane permeability signal or the like to the Fibrillarin protein (Non-patent Document 8). In addition, proteins can be easily taken up into cells by commercially available lipofection reagents for proteins (Non-Patent Documents 9 and 10).
Fibrillarinは幹細胞の生存、維持に欠かせない物質であり、幹細胞内におけるFibrillarinの活性を抑制することで幹細胞の未分化状態が維持できず、さらに抑制すると幹細胞は生存できなくなる。反対に、分化が進んだ細胞ではFibrillarin活性の抑制は影響を与えない。従って、幹細胞中のFibrillarin発現量を調節することで、必要に応じて幹細胞の増殖を停止させ、さらにはアポトーシスさせることが可能になる。ES細胞などの胎生幹細胞は、生体内に移植すると奇形腫という癌を形成することが知られているので、幹細胞を移植する際など望みの細胞組織へ分化させたいときには、未分化状態のままに残っている細胞を速やかに死滅させる必要がある。実際に幹細胞自身のゲノム中にもFibrillarin遺伝子は存在し、通常もFibrillarinタンパク質を発現しており、特にＬＩＦ存在下で未分化状態を維持しやすい状態で培養するときにはFibrillarinを高発現して未分化状態を続ける可能性がある。したがって、幹細胞の移植時など、未分化状態の幹細胞を速やかに死滅させたい場合には、幹細胞内にFibrillarin遺伝子発現抑制剤を存在させてFibrillarin遺伝子発現を抑制するか、又は幹細胞内に抗Fibrillarin抗体などのFibrillarin活性抑制剤を存在させて、幹細胞内のFibrillarinの働きを抑えることで、幹細胞の増殖を停止させるか死滅させることは有効であり、幹細胞の奇形腫形成の危険性を現弱させる薬剤として用いることができる。Fibrillarin遺伝子の発現を抑制するためには、典型的にはsiRNAの手法を用いるが、Fibrillarin遺伝子発現抑制剤として、miRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイム等を幹細胞内に導入してもよい。Fibrillarin活性抑制剤として典型的なものは抗Fibrillarin抗体であるが、Fibrillarinタンパク質由来の、Fibrillarin活性を有さないペプチド断片も活性抑制剤として働くことが多い。 Fibrillarin is an indispensable substance for the survival and maintenance of stem cells. By suppressing the activity of fibrillarin in the stem cells, the undifferentiated state of the stem cells cannot be maintained, and if it is further suppressed, the stem cells cannot survive. In contrast, suppression of Fibrillarin activity does not affect cells that have undergone differentiation. Therefore, by controlling the expression level of Fibrillarin in the stem cells, it becomes possible to stop the proliferation of the stem cells and further to cause apoptosis as necessary. Embryonic stem cells such as ES cells are known to form teratocarcinoma when transplanted in vivo, so leave them undifferentiated when you want to differentiate into the desired cellular tissue, such as when transplanting stem cells. It is necessary to quickly kill the remaining cells. In fact, the Fibrillarin gene is also present in the genome of the stem cell itself, and it usually expresses the Fibrillarin protein. Especially when cultured in a state where it is easy to maintain an undifferentiated state in the presence of LIF, Fibrillarin is highly expressed and undifferentiated. The state may continue. Therefore, if you want to quickly kill undifferentiated stem cells, such as during stem cell transplantation, suppress the expression of the Fibrillarin gene in the stem cell to suppress the expression of the Fibrillarin gene, or anti-Fibrillarin antibody in the stem cell. It is effective to stop or kill stem cell proliferation by suppressing the activity of fibrillarin in stem cells in the presence of fibrillarin activity inhibitors such as Can be used as In order to suppress the expression of the Fibrillarin gene, siRNA techniques are typically used, but miRNA, antisense RNA, antisense oligonucleotide, ribozyme, etc. can be introduced into stem cells as fibrillarin gene expression inhibitor. Good. A typical Fibrillarin activity inhibitor is an anti-Fibrillarin antibody, but a peptide fragment derived from Fibrillarin protein and not having Fibrillarin activity often acts as an activity inhibitor.
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、当該技術分野における常法及び当業者に公知の標準的な方法、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory PrESs, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施した。又、本明細書中に参考文献などとして引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, the technical scope of this invention is limited and is not interpreted at all by description of a following example. Also, unless otherwise noted, the following examples are routine methods in the art and standard methods known to those skilled in the art, such as Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. Laboratory PrESs, New York, 1989; Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1995. Moreover, the description content of the literature cited as a reference etc. in this specification constitutes a part of the disclosure content of this specification.
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。尚、本明細書中で引用される技術文献の内容は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The technical scope of the present invention is not limited by these descriptions. In addition, the content of the technical literature quoted in this specification is considered as a part of the content of an indication of this specification.
（実施例１）
［Fibrillarinの同定］
マウスES細胞（American Type Culture Collection: cat No. CRL-11632）をLIF非存在下で培養すると、未分化マーカーのひとつとして知られるアルカリフォスファターゼ活性を１週間程度で喪失することが知られている（非特許文献３）。
マウスES細胞はLIF存在下では未分化状態を保つので、７日間培養後もアルカリフォスファターゼ陽性でコロニーを形成するが、LIF非存在下で７日間培養するとアルカリフォスファターゼ陰性で平たく広がった形態の中内胚葉様の細胞に分化してしまう（図２）。
この結果からDay0とDay7の蛋白質サンプルを比較することで、プロテオーム解析により未分化特異的な蛋白質を判別することが可能と考え、LIF+の状態で培養したマウスES細胞及びLIF−の状態で７日間培養した細胞からクロマチン画分を精製しタンパク質を抽出した。LIF＋/−で培養した細胞から抽出したタンパク質をそれぞれ緑及び赤の蛍光色素でラベルした後、混合し、二次元ディファレンシャル電気泳動解析(2D-DIGE)を行った（図３）。
その結果、数十個の量的変動のある蛋白質を同定し、質量分析器により解析したところ、マウスES細胞で未分化特異的に発現するタンパク質のひとつがFibrillarinであることを見出した。
Example 1
[Identification of Fibrillarin]
When mouse ES cells (American Type Culture Collection: cat No. CRL-11632) are cultured in the absence of LIF, it is known that alkaline phosphatase activity known as one of undifferentiated markers is lost in about one week ( Non-patent document 3).
Since mouse ES cells remain undifferentiated in the presence of LIF, they form colonies that are positive for alkaline phosphatase after 7 days of culturing. However, when cultured for 7 days in the absence of LIF, mouse ES cells are negative and alkaline phosphatase is negative. It differentiates into germ layer-like cells (FIG. 2).
From these results, it is considered that the protein samples of Day 0 and Day 7 can be compared to identify undifferentiated specific proteins by proteome analysis, and the mouse ES cells cultured in the LIF + state and the LIF− state for 7 days. The chromatin fraction was purified from the cultured cells and the protein was extracted. Proteins extracted from cells cultured in LIF +/− were labeled with green and red fluorescent dyes, mixed, and subjected to two-dimensional differential electrophoresis analysis (2D-DIGE) (FIG. 3).
As a result, several tens of proteins with quantitative fluctuations were identified and analyzed with a mass spectrometer, and it was found that one of the proteins expressed specifically in mouse ES cells was Fibrillarin.
なお、本明細書に記載の実施例において、マウスES細胞はゼラチンコートしたディッシュ上で37℃、5％CO2雰囲気下で培養し、DMEM培地(high glucose)に以下の添加物を加えた培地で培養を行った（2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-ESsential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 15% ES cell-qualified FBS, 1000 IU/ml LIF (ESGRO, Chemicon)、及びpenicillin/streptomycin）。 In the examples described herein, mouse ES cells were cultured on a gelatin-coated dish at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere, and the following additives were added to DMEM medium (high glucose). (2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-ESsential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 15% ES cell-qualified FBS, 1000 IU / ml LIF (ESGRO, Chemicon), and penicillin / streptomycin) .
クロマチン画分の精製は以下のとおり行った。LIF存在下/非存在下で培養した細胞に、培養6.5日目の時点で、培養液中に最終濃度が0.06μg/mlになるように細胞周期のＭ期への進行を妨げる薬剤コルセミド(和光純薬工業)を添加した。さらに12時間培養した後、ポリアミンバッファー(15mM トリス塩酸(pH7.4), 0.2mM スパーミン, 0.5mM スパーミジン, 2mM EDTA, 80mM KCl, 0.1mM PMSF)中で細胞をかき取り、780×g, 4℃, 10分間遠心して細胞を回収し、0.1%(w/v)ジギトニンを含むポリアミンバッファーに再懸濁して15秒×3回ボルテックスによって細胞膜を破壊した。これを190×g, 4℃, 3分間遠心し、上清を回収してクロマチン粗画分を得た。次に、このクロマチン粗画分を5%-20%のショ糖密度勾配を持つ密度勾配管に静かに重層し、2380×g, 4℃, 15分間ショ糖密度勾配遠心によって精製した。精製されたクロマチン画分をDNA除去カラム(Vivapure D Maxi H: VIVASCIENCE)にかけ、さらにNuclease Mix (GEヘルスケアバイオサイエンス)を添加しDNAとRNAを除去した。こうして得られたクロマチン結合タンパク質サンプルを限外濾過によって脱塩し、電気泳動試料溶解液(7M 尿素, 2M チオ尿素, 4% CHAPS, 30mM トリス塩酸(pH8.5))に溶解した。 Purification of the chromatin fraction was performed as follows. Cells cultured in the presence / absence of LIF were treated with the drug colcemid, which prevents progression to the M phase of the cell cycle to a final concentration of 0.06 μg / ml in the culture at the 6.5th day of culture. Added. After further culturing for 12 hours, the cells were scraped in polyamine buffer (15 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.2 mM Sparmine, 0.5 mM Sparmidine, 2 mM EDTA, 80 mM KCl, 0.1 mM PMSF), and 780 × g, 4 ° C. The cells were collected by centrifugation for 10 minutes, resuspended in a polyamine buffer containing 0.1% (w / v) digitonin, and disrupted by vortexing 15 seconds × 3 times. This was centrifuged at 190 × g, 4 ° C. for 3 minutes, and the supernatant was recovered to obtain a crude chromatin fraction. Next, this crude chromatin fraction was gently layered on a density gradient tube having a sucrose density gradient of 5% -20% and purified by sucrose density gradient centrifugation at 2380 × g, 4 ° C. for 15 minutes. The purified chromatin fraction was applied to a DNA removal column (Vivapure D Maxi H: VIVASCIENCE), and then Nuclease Mix (GE Healthcare Bioscience) was added to remove DNA and RNA. The chromatin-binding protein sample thus obtained was desalted by ultrafiltration and dissolved in an electrophoresis sample lysate (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris-HCl (pH 8.5)).
二次元ディファレンシャル電気泳動解析(2D-DIGE)については、GEヘルスケアのホームページに掲載されている方法に従って行った。（http://www5.gelifESciencES.com/APTRIX/upp00919.nsf/2A3643B6787885E0C12570BE000DC671/$file/80642960.pdf）また、タンパク質の蛍光色素によるラベル化についても、GEヘルスケアのホームページに掲載されている方法に則って行った。（http://www4.gelifESciencES.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/19C068C563CD12BBC12572680002C5C0/$file/RPK0272_Rev_D_2006_web.pdf）
タンパク質サンプルはBradford法により定量し、１回の2D-DIGE解析に用いる試料として、未分化細胞と分化細胞それぞれから精製したクロマチン結合タンパク質を75μgずつ使用した。未分化細胞クロマチン結合タンパク質(50μg)はCy3で、分化細胞クロマチン結合タンパク質(50μg)はCy5でラベルし、残りの25μgずつは混合した後Cy2でラベルし、複数のゲルを補正するための内部標準として用いた。ラベルされたこれらの試料を全て混合し、DEStreak Rehydration Solution (以下試薬・機器は全てGEヘルスケアバイオサイエンス)を添加した。これをimmobilized pH gradient (IPG) strips (pH 3-11, 24cm, またはpH 7-11, 24cm)に添加し、20℃で12時間再膨潤後、Ettan IPGphorを用いて等電点電気泳動(一次元目)を行った(泳動条件： Step1; 500V, 2Hrs., Step2; 1000V, 1Hr., Step3; 6000V, 12Hrs.)。次に等電点電気泳動後のゲルを12% アクリルアミドゲル(24cm×24cm)上に重層し、SDS-PAGE (二次元目) を行った。
泳動終了後、ゲルを専用蛍光スキャナーによりスキャンし、画像をImageMaster DIGEソフトウエアによって解析して未分化細胞と分化細胞とで発現量に変動のあるタンパク質のスポットを検出した。電気泳動後のゲルから目的のタンパク質スポットを切り出し、トリプシンでゲル内消化した。回収したペプチドをCap LC Pump (Waters)により分離し、Q-Tof Micro (Micromass)によりESI-Q-TOF-MS/MS解析を行った。さらにMascot Search (Matrix Science)を用いて、NCBIのデータベースに対して検索を行い、タンパク質の同定を行った。
Two-dimensional differential electrophoresis analysis (2D-DIGE) was performed according to the method posted on the GE Healthcare website. (Http://www5.gelifESciencES.com/APTRIX/upp00919.nsf/2A3643B6787885E0C12570BE000DC671/$file/80642960.pdf) In addition, the labeling of proteins with fluorescent dyes can be done by the method posted on the GE Healthcare website. I went along. (Http://www4.gelifESciencES.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/19C068C563CD12BBC12572680002C5C0/$file/RPK0272_Rev_D_2006_web.pdf)
Protein samples were quantified by the Bradford method, and 75 μg of chromatin-binding protein purified from each of undifferentiated cells and differentiated cells was used as a sample to be used for one 2D-DIGE analysis. Undifferentiated cell chromatin-binding protein (50 μg) is labeled with Cy3, differentiated cell chromatin-binding protein (50 μg) is labeled with Cy5, the remaining 25 μg is mixed and then labeled with Cy2, and an internal standard for correcting multiple gels Used as. All of these labeled samples were mixed, and DEStreak Rehydration Solution (hereinafter, all reagents and equipment were GE Healthcare Bioscience) was added. This was added to immobilized pH gradient (IPG) strips (pH 3-11, 24 cm, or pH 7-11, 24 cm), re-swelled at 20 ° C for 12 hours, and then isoelectric focusing (primary electrophoresis) using Ettan IPGphor. (Electrophoretic conditions: Step 1; 500V, 2Hrs., Step2; 1000V, 1Hr., Step3; 6000V, 12Hrs.). Next, the gel after isoelectric focusing was layered on a 12% acrylamide gel (24 cm × 24 cm) and subjected to SDS-PAGE (second dimension).
After the completion of electrophoresis, the gel was scanned with a dedicated fluorescence scanner, and the image was analyzed with ImageMaster DIGE software to detect protein spots with variable expression levels between undifferentiated cells and differentiated cells. The target protein spot was cut out from the gel after electrophoresis and digested in the gel with trypsin. The collected peptides were separated by Cap LC Pump (Waters) and subjected to ESI-Q-TOF-MS / MS analysis by Q-Tof Micro (Micromass). Furthermore, using Mascot Search (Matrix Science), the NCBI database was searched to identify proteins.
（実施例２）
［FibrillarinによるES細胞の未分化状態促進］
マウスES細胞において、野生型Fibrillarinを遺伝子導入し安定発現させた細胞株を樹立し、LIFを培地から除去し２週間培養することで通常のマウスES細胞が中内胚葉に完全に分化してしまう状況にあっても多くの細胞において、形態的にLIF存在下で培養した未分化状態のES細胞に近く、細胞がぎっしり密集したパンケーキ状の形態を示すことが分かった。また、このとき未分化マーカーの一つであるアルカリホスファターゼの活性染色を行ったところ、未分化状態を維持していることが確認された（図４）。
更に、各クローンをLIF非存在下で10日間培養した後、細胞抽出液を調製し、未分化マーカーであるOct3/4 及びNanog タンパク質の発現を調べた。その結果、このようなLIF非存在下における培養でもこれらの未分化マーカー転写因子の発現が維持されていることがウエスタンブロットにより確認された（図５）。
また、未分化マーカーであるOct3/4に対する抗体（sc-9081, SANTA CRUZ）及びSSEA1に対する抗体（協和発酵）を用いた、常法による免疫蛍光染色によってもこれら未分化マーカーの発現が認められ、未分化状態の維持が確認された（図６）。
従って、Fibrillarinの遺伝子導入によりES細胞の未分化状態が維持・促進されることが分かった。実験の詳細は以下の通りである。
(Example 2)
[Promotion of undifferentiated state of ES cells by fibrillarin]
In mouse ES cells, a cell line in which wild-type fibrillarin is introduced and stably expressed is established, and when LIF is removed from the medium and cultured for 2 weeks, normal mouse ES cells completely differentiate into mesendoderm. Even in the situation, many cells were morphologically similar to undifferentiated ES cells cultured in the presence of LIF, and the cells were found to have a closely packed pancake-like morphology. At this time, activity staining of alkaline phosphatase, which is one of undifferentiated markers, was performed, and it was confirmed that the undifferentiated state was maintained (FIG. 4).
Furthermore, after each clone was cultured for 10 days in the absence of LIF, a cell extract was prepared, and the expression of Oct3 / 4 and Nanog protein as undifferentiated markers was examined. As a result, it was confirmed by Western blot that the expression of these undifferentiated marker transcription factors was maintained even in the culture in the absence of LIF (FIG. 5).
In addition, expression of these undifferentiated markers was also observed by conventional immunofluorescence staining using antibodies against undifferentiated markers Oct3 / 4 (sc-9081, SANTA CRUZ) and antibodies against SSEA1 (Kyowa Hakko), Maintenance of the undifferentiated state was confirmed (FIG. 6).
Therefore, it was found that the undifferentiated state of ES cells is maintained and promoted by the introduction of Fibrillarin gene. The details of the experiment are as follows.
＜遺伝子導入方法＞
Fibrillarin発現ベクターは以下の方法で調製した。Flagタグを付加した5’側特異的プライマー（5’-CTCCTCGAGGCCACCATGGACTACAAGGAC-3’（配列番号１）と、3’側特異的プライマー配列（5’-CTACTCAGACAATGCGATGC-3’（配列番号２）を用いてPCRを行い、Fibrillarin遺伝子を増幅した。PCRの条件は、KOD plas(TOYOBO)をポリメラーゼとして使用し、94℃２分加熱変性後、94℃15秒、60℃30秒、68℃1分のサイクルを25回繰り返し、68℃で10分伸長反応した後4℃で保管した。伸長生成物をフェノール/クロロホルム抽出しエタノール沈殿で精製した後、XhoI及びNotIで制限酵素処理した。同じ条件下でpCAG-IPベクター（pCAG-IP-Flag, Yoshida-Koide et al, Biochem. Biophys. RES. Commun. (2004) 313, 475-481）をXhoI及びNotIで制限酵素処理した。これらのDNA断片を1%のアガロースゲルにより電気泳動（100ボルト、20分）で分離し、エチジウムブロマイドで20分処理しUVを照射しFlag-Fibrillarin DNAのバンド及びベクターDNAのバンドを検出した。
これらDNAバンドをナイフで切り出し精製した後、精製したFlag-FibrillarinDNA断片をpCAG-IPべクターにライゲーションし、発現ベクターpCAG-IP-Flag- Fibrillarinを構築した。このようにして作成した発現ベクターをリポフェクション試薬、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いてマウスES細胞に遺伝子導入した。
<Gene transfer method>
Fibrillarin expression vector was prepared by the following method. PCR using a 5'-specific primer (5'-CTCCTCGAGGCCACCATGGACTACAAGGAC-3 '(SEQ ID NO: 1) and a 3'-specific primer sequence (5'-CTACTCAGACAATGCGATGC-3' (SEQ ID NO: 2)) with a Flag tag Fibrillarin gene was amplified by PCR using KOD plas (TOYOBO) as a polymerase and heat denaturation at 94 ° C for 2 minutes, followed by a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute. Repeated 25 times, extended for 10 minutes at 68 ° C. and then stored at 4 ° C. The extension product was extracted with phenol / chloroform and purified by ethanol precipitation, followed by restriction enzyme treatment with XhoI and NotI. An IP vector (pCAG-IP-Flag, Yoshida-Koide et al, Biochem. Biophys. RES. Commun. (2004) 313, 475-481) was digested with XhoI and NotI. Separated by electrophoresis (100 volts, 20 minutes) on an agarose gel, treated with ethidium bromide for 20 minutes, irradiated with UV, F A lag-Fibrillarin DNA band and a vector DNA band were detected.
These DNA bands were cut out with a knife and purified, and then the purified Flag-Fibrillarin DNA fragment was ligated to a pCAG-IP vector to construct an expression vector pCAG-IP-Flag-Fibrillarin. The expression vector thus prepared was introduced into mouse ES cells using a lipofection reagent, Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
＜アルカリホスファターゼ活性染色＞
アルカリホスファターゼ活性染色については、細胞をPBSで洗浄後、３％ホルマリン/PBSで5分処理した後、アルカリホスファターゼ発色試薬（BM purple AP substrate（Roche））を加え、室温で30分インキュベートした。その後、細胞をPBSで2回洗浄した後、光学顕微鏡で観察した。
<Alkaline phosphatase activity staining>
For alkaline phosphatase activity staining, the cells were washed with PBS, treated with 3% formalin / PBS for 5 minutes, added with alkaline phosphatase coloring reagent (BM purple AP substrate (Roche)), and incubated at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the cells were washed twice with PBS and then observed with an optical microscope.
（実施例３）
［FibrillarinによるiPS細胞化促進］
マウス繊維芽（MEF）細胞に４つの遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf-4、c-Myc）または３つの遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf-4）を導入することにより、体細胞を初期化して脱分化させることで、ES細胞と同等の形態・性質をもつ細胞であるiPS細胞（induced pluripotent stem cell, iPS cell）を取得する方法が知られている（非特許文献１１、１４）。当該方法において用いられた4遺伝子または3遺伝子に、それぞれさらにFibrillarin遺伝子を追加して同様の方法を追試することにより、FibrillarinのiPS化に対する効果を調べた。4遺伝子・3遺伝子どちらの場合にもそれぞれ培養10日目・30日目までにES細胞様のコロニーが観察され、それらは高いアルカリホスファターゼ活性を示し、未分化性を獲得したことが分かった（図７）。さらに、Fibrillarin遺伝子導入下ではコントロール（空ベクター導入）に比べてiPS細胞化したコロニーの数が増加することが分かった（図８）。
この結果は、FibrillarinがiPS細胞化,すなわち脱分化を促進する効果をもつことを示している。実験の詳細は以下の通りである。
(Example 3)
[Promotion of iPS cellization by fibrillarin]
By introducing 4 genes (Oct3 / 4, Sox2, Klf-4, c-Myc) or 3 genes (Oct3 / 4, Sox2, Klf-4) into mouse fibroblast (MEF) cells, somatic cells A method of obtaining iPS cells (induced pluripotent stem cells, iPS cells), which are cells having the same morphology and properties as ES cells, by reinitializing and dedifferentiating is known (Non-Patent Documents 11 and 14). . The effect of Fibrillarin on iPS was examined by adding the Fibrillarin gene to each of the 4 genes and 3 genes used in the method and following the same method. In both cases of 4 genes and 3 genes, ES cell-like colonies were observed by the 10th and 30th days of culture, respectively, and they showed high alkaline phosphatase activity and acquired undifferentiated properties ( FIG. 7). Furthermore, it was found that the number of colonies transformed into iPS cells increased when Fibrillarin gene was introduced compared to control (empty vector introduction) (FIG. 8).
This result indicates that Fibrillarin has an effect of promoting iPS cell transformation, that is, dedifferentiation. The details of the experiment are as follows.
＜Fibrillarin発現レトロウイルス作製＞
Fibrillarin発現レトロウイルスベクターは以下の方法で調製した。Flagタグを付加した5’側特異的プライマー（5’-GGAATTCGCCACCATGGACTACAAGGAC-3’（配列番号３）と、Fibrillarin C末側特異的プライマー（5’-CTCGCGGCCGCTCAGTTCTTCACCTTGGGGGG-3’（配列番号４）を用いてPCRを行い、FibrillarinをコードするDNA断片を増幅した。PCRの条件は、KOD plus（TOYOBO）をポリメラーゼとして使用し、94℃２分加熱変性後、94℃2分、60℃1分、68℃1分のサイクルを25回繰り返し、68℃で10分伸長反応した後4℃で保管した。伸長生成物をフェノール/クロロホルム抽出しエタノール沈殿で精製した後、EcoRI及びNotIで制限酵素処理した。同じ条件下でpMYsレトロウイルスベクターをEcoRI及びNotIで制限酵素処理した。これらのDNAを1%のアガロースゲルにより電気泳動（100ボルト、20分）で分離し、エチジウムブロマイドで20分処理しUVを照射しFlag-Fibrillarin DNAのバンド及びレトロウイルスベクターDNAのバンドを検出した。
これらDNAバンドをナイフで切り出し精製した後、精製したFlag-FibrillarinDNA断片をpMYsレトロウイルスベクターにライゲーションし、発現レトロウイルスベクターpMYs-Flag- Fibrillarinを構築した。このようにして作成した発現レトロウイルスベクターをリポフェクション試薬、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いてPlatE細胞に遺伝子導入し、導入後24時間後に培地を交換し、さらに24時間後に回収した培地を遠心（1000rpm、5分）、濾過（0.45μmポアサイズフィルター）し、pMYs-Flag-Fibrillarinレトロウイルス液を回収した。
４つの遺伝子（Oct3/4、Sox2、Klf-4、c-Myc）の発現ベクター[pMXs-Oct3/4、pMXs-Sox2、pMXs-Klf-4、pMXs-c-Myc]は、Adgeneから購入し、pMYs-Flag-FBLと同様の手順で、レトロウイルス液を作製した。
<Fibrillarin expression retrovirus production>
Fibrillarin-expressing retroviral vector was prepared by the following method. PCR using a 5'-side specific primer (5'-GGAATTCGCCACCATGGACTACAAGGAC-3 '(SEQ ID NO: 3) and a Fibrillarin C-terminal specific primer (5'-CTCGCGGCCGCTCAGTTCTTCACCTTGGGGGG-3' (SEQ ID NO: 4)) The DNA fragment encoding Fibrillarin was amplified using PCR using KOD plus (TOYOBO) as a polymerase, heat denaturation at 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 2 minutes, 60 ° C for 1 minute, 68 ° C1 The cycle of min was repeated 25 times, followed by extension reaction at 68 ° C. for 10 minutes and then stored at 4 ° C. The extension product was extracted with phenol / chloroform, purified by ethanol precipitation, and then treated with restriction enzymes with EcoRI and NotI. The pMYs retroviral vector was treated with restriction enzymes with EcoRI and Not I. These DNAs were separated by electrophoresis (100 volts, 20 minutes) on a 1% agarose gel, treated with ethidium bromide for 20 minutes, and then irradiated with UV. Flag-Fibrillarin DNA band and It was detected a band of retroviral vector DNA.
These DNA bands were cut out with a knife and purified, and then the purified Flag-Fibrillarin DNA fragment was ligated to a pMYs retrovirus vector to construct an expression retrovirus vector pMYs-Flag-Fibrillarin. The expression retroviral vector thus prepared was transfected into PlatE cells using lipofection reagent, Lipofectamine 2000 (Invitrogen), the medium was replaced 24 hours after the introduction, and the collected medium was centrifuged (1000 rpm) 24 hours later. 5 minutes) and filtration (0.45 μm pore size filter) to recover the pMYs-Flag-Fibrillarin retrovirus solution.
Four genes (Oct3 / 4, Sox2, Klf-4, c-Myc) expression vectors [pMXs-Oct3 / 4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf-4, pMXs-c-Myc] were purchased from Adgene. A retrovirus solution was prepared in the same manner as pMYs-Flag-FBL.
＜iPS細胞作製方法＞
マウス繊維芽細胞（P3-4）培養培地中に、各ウイルス液[空ベクターまたはFibrillarinと4因子（ Oct3/4、Sox2、Klf-4、c-Myc）または3因子（Oct3/4、Sox2、Klf-4）]とポリブレン（8 μg/ml）を添加し、24時間後に培地を交換した。培養5日目にマイトマイシン処理したマウス繊維芽細胞上に撒き、培養6日目からES細胞用培地に培地を変え、10日から30日間培養した。その後、アルカリホスファターゼ活性染色によりiPS細胞を確認した。
<IPS cell production method>
In the mouse fibroblast (P3-4) culture medium, each virus solution [empty vector or Fibrillarin and 4 factors (Oct3 / 4, Sox2, Klf-4, c-Myc) or 3 factors (Oct3 / 4, Sox2, Klf-4)] and polybrene (8 μg / ml) were added, and the medium was changed after 24 hours. On day 5 of culture, the cells were plated on mitomycin-treated mouse fibroblasts, and the medium was changed to a medium for ES cells from day 6 of culture and cultured for 10 days to 30 days. Thereafter, iPS cells were confirmed by alkaline phosphatase activity staining.
＜アルカリホスファターゼ活性染色＞
アルカリホスファターゼ活性染色については、細胞をPBSで洗浄後、3.8％ホルマリン/PBSで5分処理した後、アルカリホスファターゼ発色試薬[BM purple AP substrate（Roche）]を加え、室温で30分インキュベートした。その後、細胞をEDTA/PBSで2回洗浄した後、光学顕微鏡で観察した。
<Alkaline phosphatase activity staining>
For alkaline phosphatase activity staining, cells were washed with PBS, treated with 3.8% formalin / PBS for 5 minutes, added with alkaline phosphatase coloring reagent [BM purple AP substrate (Roche)], and incubated at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the cells were washed twice with EDTA / PBS and then observed with an optical microscope.
（実施例４）
［Fibrillarin発現抑制によるES細胞の生存制御］
マウスES細胞において、Tet-offシステムをもちいた人工miRNA発現によるFibrillarin遺伝子発現抑制細胞株を樹立した。この細胞株は、テトラサイクリン存在下ではFibrillarinを発現するが、テトラサイクリンを培地から除くとFibrillarin遺伝子発現が抑制される（図９、１０）。テトラサイクリンを除きFibrillarin遺伝子発現を抑制した状態で3日間培養すると、細胞総数はFibrillarinを発現し続ける条件（テトラサイクリン投与）の約20%程度と少なく（図１１）、その後も増加することはなかった。さらにTUNEL法により、Fibrillarin遺伝子発現抑制下では細胞死が促進されることが確認された（図１２）。
反対に、上記細胞株が分化してしまった後では、テトラサイクリンを培地から除いてFibrillarin遺伝子発現を抑制しても、分化した細胞の生存状態に変化はなかった。（図示せず。）
従って、FibrillarinがES細胞において未分化性の維持・促進のみならずES細胞の生存にも重要であることが分かった。実験の詳細は以下の通りである。
Example 4
[Control of ES cell survival by suppressing fibrillarin expression]
In mouse ES cells, we established a fibrillarin gene expression-suppressed cell line by artificial miRNA expression using the Tet-off system. This cell line expresses Fibrillarin in the presence of tetracycline, but the fibrillarin gene expression is suppressed when tetracycline is removed from the medium (FIGS. 9 and 10). When cultured for 3 days in a state in which fibrillarin gene expression was suppressed except for tetracycline, the total number of cells was as low as about 20% of the condition for continuous expression of fibrillarin (tetracycline administration) (FIG. 11), and it did not increase thereafter. Furthermore, it was confirmed by TUNEL method that cell death was promoted under the suppression of Fibrillarin gene expression (FIG. 12).
On the other hand, after the cell line had differentiated, even if tetracycline was removed from the medium and fibrillarin gene expression was suppressed, there was no change in the survival state of the differentiated cells. (Not shown)
Therefore, it was found that fibrillarin is important not only for maintenance and promotion of undifferentiation in ES cells but also for survival of ES cells. The details of the experiment are as follows.
＜Fibrillarin発現抑制細胞作製法＞
Fibrillarin遺伝子発現抑制miRNA発現ベクターはBLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kitをもちいて以下の方法で調製した。マウスFibrillarin塩基配列をもとに設計したmiRNAオリゴヌクレオチドTop strand oligo [5’-TGCTGAAATCACAAAGTGTCCTCCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGGAGGACTTTGTGATTT-3’（配列番号５）]と、Bottom strand oligo [5’-CCTGAAATCACAAAGTCCTCCATGTCAGTCAGTGGCCAAAACATGGAGGACACTTTGTGATTTC-3’（配列番号６）]を95℃4分加熱し、室温で冷ましてdouble strand oligoを形成し、pcDNATM6.2-GW/miR linearized（invitrogen）とライゲーションし、miR RNAi発現ベクターpcDNATM6.2-GW/ miR-Fibrillarinを構築した。本発明では、Fibrillarin遺伝子発現抑制を厳密に制御するために、テトラサイクリン投与中はFibrillarin発現が維持されるTet-Offシステムを使用した（非特許文献１５）。Tet-Off Fibrillarin遺伝子発現抑制細胞株を得るために、構築したmiR RNAi発現ベクターを鋳型として、CMV由来最小プロモーター配列情報をもとに作成した特異的プライマー[5’-AAACTCGAGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGAATTCGCCACCCTGGAGGCTTGCTGAAG-3’（配列番号７）]と、ポリAを付加した特異的プライマー[5’-TTTGCGGCCGCACACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTGGGCCATTTGTTCCATGTGA-3’（配列番号８）]をもちいてPCRを行った。PCRの条件は、KOD plus(TOYOBO)をポリメラーゼとして使用し、94℃２分加熱変性後、94℃1分、45℃1分、68℃1分のサイクルを2回繰り返し、94℃1分、60℃1分、68℃1分のサイクルを13回繰り返し、68℃で10分伸長反応した後4℃で保管した。伸長生成物をフェノール/クロロホルム抽出しエタノール沈殿で精製した後、XhoI及びNotIで制限酵素処理した。同じ条件下でExchangeベクター（非特許文献１５）をXhoI及びNotIで制限酵素処理した。これらのDNAを1%のアガロースゲルにより電気泳動（100ボルト、20分）で分離し、エチジウムブロマイドで20分処理しUVを照射しFibrillarin miRNAのバンド及びベクターDNAのバンドを検出した。これらDNAバンドをナイフで切り出し精製した後、精製したmiR-Fibrillarin断片をExchangeべクターにライゲーションし、tet-offタイプのmiR-Fibrillarin発現ベクターを構築した。このようにして作成した発現ベクターを、Creリコンビナーゼを発現するベクターpCAGGSCre（非特許文献１５）とともにリポフェクション試薬、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いてマウスES細胞EBRTcH3株（Riken Cell Bank, RCB2325）に遺伝子導入した。
コントロールとしては、BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kit （Invitrogen）添付のpcDNATM6.2-GW/miR-neg control plasmid を鋳型としてPCRを行い、miR-Fibrillarin発現ベクター構築と同様の手順でコントロールベクターを構築し、pCAGGSCreとともにリポフェクション試薬、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いてマウスES細胞EBRTcH3株に遺伝子導入した。
<Fibrillarin expression-suppressing cell preparation method>
Fibrillarin gene expression-suppressed miRNA expression vector was prepared by the following method using BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kit. MiRNA oligonucleotides designed based on mouse Fibrillarin nucleotide sequence Top strand oligo [5'-TGCTGAAATCACAAAGTGTCCTCCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGGAGGACTTTGTGATTT-3 '(SEQ ID NO: 5)] and Bottom strand oligo [5'-CCTGAAATCACAAAGTCCTCCATGTCAGTCAGTGGCCAATTCATGGGATC The mixture was heated at 95 ° C. for 4 minutes and cooled at room temperature to form a double strand oligo and ligated with pcDNA ™ 6.2-GW / miR linearized (invitrogen) to construct a miR RNAi expression vector pcDNA ™ 6.2-GW / miR-Fibrillarin. In the present invention, in order to strictly control the suppression of Fibrillarin gene expression, a Tet-Off system that maintains Fibrillarin expression during tetracycline administration was used (Non-patent Document 15). In order to obtain a Tet-Off Fibrillarin gene expression-suppressed cell line, the specific primer [5'-AAACTCGAGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGAATTCGCCACCAGTGGAGGCTTGCTAGTGGAGGCTTGCTAG number using the constructed miR RNAi expression vector as a template 7)] and a specific primer [5′-TTTGCGGCCGCACACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTGGGCCATTTGTTCCATGTGA-3 ′ (SEQ ID NO: 8)] to which poly A was added. PCR conditions were as follows: KOD plus (TOYOBO) was used as a polymerase, heat denaturation at 94 ° C for 2 minutes, and then a cycle of 94 ° C for 1 minute, 45 ° C for 1 minute, 68 ° C for 1 minute was repeated twice. The cycle of 60 ° C. for 1 minute and 68 ° C. for 1 minute was repeated 13 times, followed by extension reaction at 68 ° C. for 10 minutes and then stored at 4 ° C. The extension product was extracted with phenol / chloroform and purified by ethanol precipitation, followed by restriction enzyme treatment with XhoI and NotI. Under the same conditions, the Exchange vector (Non-patent Document 15) was treated with restriction enzymes with XhoI and NotI. These DNAs were separated by electrophoresis (100 volts, 20 minutes) on a 1% agarose gel, treated with ethidium bromide for 20 minutes, and irradiated with UV to detect the bands of fibrillarin miRNA and vector DNA. After cutting out and purifying these DNA bands with a knife, the purified miR-Fibrillarin fragment was ligated to an Exchange vector to construct a tet-off type miR-Fibrillarin expression vector. The expression vector thus prepared is introduced into mouse ES cell EBRTcH3 strain (Riken Cell Bank, RCB2325) using the lipofection reagent Lipofectamine 2000 (Invitrogen) together with the vector pCAGGSCre (Non-patent Document 15) expressing Cre recombinase. did.
For control, PCR was performed using pcDNATM6.2-GW / miR-neg control plasmid attached to BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kit (Invitrogen) as a template, and the control vector was constructed in the same procedure as miR-Fibrillarin expression vector construction. Was constructed and transfected into mouse ES cell strain EBRTcH3 using a lipofection reagent, Lipofectamine 2000 (Invitrogen) together with pCAGGSCre.
＜TUNEL法＞
TUNEL法は、DeadEndTM Fluorometric TUNEL System （Promega）をもちい、プロトコルに従って行った。2日間培養したES細胞PBSで洗浄後、3.8%ホルマリン/PBSで30分処理した後、PBSで洗浄し、0.5% TritonX-100/PBSで5分処理した。さらにPBSで洗浄し、平衡化バッファーで10分処理後、反応液中で37度、1時間インキュベートした。2×SSCで5分処理した後DAPI染色し、PBSで2回洗浄した後、光学顕微鏡で観察した。
<TUNEL method>
The TUNEL method was performed according to the protocol using DeadEnd ™ Fluorometric TUNEL System (Promega). After washing with ES cell PBS cultured for 2 days, it was treated with 3.8% formalin / PBS for 30 minutes, washed with PBS, and treated with 0.5% TritonX-100 / PBS for 5 minutes. The plate was further washed with PBS, treated with equilibration buffer for 10 minutes, and incubated in the reaction solution at 37 ° C. for 1 hour. After treatment with 2 × SSC for 5 minutes, DAPI staining was performed, the plate was washed twice with PBS, and then observed with an optical microscope.
本発明で同定されたFibrillarinの遺伝子を導入することにより幹細胞の未分化状態が安定的に維持でき、かつ体細胞の幹細胞化を促進する技術が提供される。
更に、幹細胞移植の際に、Fibrillarinの活性を抑制する薬剤を用いることで、未分化状態の幹細胞を死滅させ、奇形腫形成の危険性を現弱させることができるので、再生医療をより強力に推進することも可能となる。
By introducing the Fibrillarin gene identified in the present invention, a technique for stably maintaining the undifferentiated state of stem cells and promoting somatic cell stem cells is provided.
Furthermore, by using a drug that suppresses Fibrillarin activity during stem cell transplantation, it is possible to kill undifferentiated stem cells and reduce the risk of teratoma formation, making regenerative medicine more powerful. It can also be promoted.
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