JP2009029794A - Method for producing caged compound - Google Patents

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直樹 梅澤
Kazuhiro Ukai
和宏 鵜飼
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To solve the problem that since a conventional method for producing a caged compound comprises repeating synthesis and evaluations in order to estimate a functional group important for activity, so to speak, a try and error method and problems in which much labors are required for the operations, stable and inexpensive supply of functional analysis tool is difficult and side-chain functional groups (alanine, leucine, etc.) can not be modified with a photocleaving protective group exist a peptide and a protein that control bioactivity by caging are limited. <P>SOLUTION: The method for producing a caged compound comprises synthesizing one group of a selective chemical synthetic group pair and a photocleaving amino acid at one of the N-terminal or C-terminal of a biopolymer compound having bioactivity and another group of the selective chemical synthetic group pair at the other terminal, carrying out an intramolecular ring reaction by an intramolecular selective chemical reaction so as to cyclize the conjugate of the biopolymer compound and the photocleaving amino acid to ring formation and to suppress activity of the biopolymer having bioactivity. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、生理活性を有する生体高分子化合物（ペプチド、タンパク質等を含むペプチド類似高分子化合物）の機能解析を行うために、光切断性の保護基（”Cage”）で生理活性分子を保護して一時的にその活性を失わせ、光を照射して保護機能を解除し、生理活性分子を出現させることにより、生理活性物質が機能発現する時期と場所を制御することを可能としたケージド化合物の製造方法に関する。   The present invention protects a bioactive molecule with a photocleavable protecting group (“Cage”) in order to analyze the function of a biopolymer compound having bioactivity (a peptide-like polymer compound including peptides, proteins, etc.). Caged, which temporarily lost its activity, released the protective function by irradiating light, and caused the appearance of a bioactive molecule, thereby controlling the time and place where the bioactive substance manifests its function. The present invention relates to a method for producing a compound.

様々な生命現象を担う生体高分子化合物の機能解析を行う上で、特定の生体高分子化合物の機能を制御する技術が利用される。現在までにRNAiやノックアウトなどの機能阻害法により、様々な生体高分子化合物の機能解析が進められてきたが、これらの方法は、生体高分子化合物が機能する場所や時間を制御することができないという問題があった。生体内における生体高分子化合物の機能解析において最も重要なことは、生体や生細胞において、その生体高分子化合物が実際に機能を発揮する場所と時間での解析であり、より高度な時空間的分解能を有する生体高分子化合物機能制御技術が求められていた。   A technique for controlling the function of a specific biopolymer compound is used to analyze the function of a biopolymer compound responsible for various life phenomena. So far, functional analysis of various biopolymer compounds has been advanced by functional inhibition methods such as RNAi and knockout, but these methods cannot control the place and time at which biopolymer compounds function. There was a problem. The most important thing in functional analysis of biopolymer compounds in vivo is the analysis of the biopolymer compound in the living body and living cells at the place and time at which the biopolymer compound actually performs its function. There is a need for a biopolymer compound function control technology having resolution.

そのような状況下、光によってその生理活性を制御できるケージド化合物を用いた生体高分子化合物機能制御技術が提案され、注目を集めている。ケージド化合物とは、光切断性の保護基（”Cage”）で生理活性分子を保護し、一時的にその活性を失わせた分子である。保護基が光エネルギーによって切断されると保護機能が解除されるため、光の照射により元の生理活性分子を出現させることができ、生理活性物質が機能発現する時期と場所を制御することが可能である。さらに原理的には、照射光量で、発現する量を調節することも可能なため、生理活性物質の時空間動態をリアルタイムで制御する有力な方法と考えられる。   Under such circumstances, a biopolymer compound function control technique using a caged compound capable of controlling its physiological activity by light has been proposed and attracting attention. A caged compound is a molecule in which a bioactive molecule is protected with a photocleavable protecting group ("Cage") and its activity is temporarily lost. Since the protective function is released when the protecting group is cleaved by light energy, the original physiologically active molecule can appear by irradiation with light, and the timing and location of the physiologically active substance can be controlled. It is. Furthermore, in principle, the amount of expression can be adjusted by the amount of irradiation light, so it is considered to be an effective method for controlling the spatiotemporal dynamics of a physiologically active substance in real time.

これまでに、（Kaplan, J. H. et al., Biochemistry, 1978, 17, 1929; Wieboldt, R.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 8752-6; Adams, S.R. et al., Chem. Biol.,1997, 4, 867-878.）に示すように、ATPやグルタミン酸、カルシウムイオンをはじめとする低分子量の生理活性物質を対象にケージド化合物の開発が進められてきたが、最近、（Wood, J. S.et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 7145-7146; Zou, K. et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 8220-8229; Tatsu, Y. et al., FEBS Lett., 2002, 525(1-3):20-4; 特許第2863834[発明の名称：ケージドペプチド、発明者：達吉郎、茂里康、湯元昇、吉川暹]; 達 吉郎,茂里 康,湯元 昇、生物物理 45(3), 161-164(2005)）に示すように、ケージドペプチドやケージドタンパク質といった高分子化合物を対象としたケージド化合物が提案された。ペプチドやタンパク質は、低分子量生理活性物質と比べ、特異的かつ洗練された生理活性機能を有するため、これらのケージド化合物は、様々な細胞機能解明のための有力なツールとして期待されている。   To date (Kaplan, JH et al., Biochemistry, 1978, 17, 1929; Wieboldt, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 8752-6; Adams, SR et al. al., Chem. Biol., 1997, 4, 867-878), caged compounds have been developed for low molecular weight bioactive substances such as ATP, glutamic acid, and calcium ions. Recently, (Wood, JSet al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 7145-7146; Zou, K. et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 8220-8229; Tatsu, Y. et al., FEBS Lett., 2002, 525 (1-3): 20-4; Patent No. 2868334 [Title of Invention: Caged Peptide, Inventor: Tatsuyoshiro, Mouriyasu, Yumoto Noboru, Yoshikawa Satoshi]; Tatsuyoshiro, Shigeru Yasushi, Noboru Yumoto, Biophysics 45 (3), 161-164 (2005)), caged compounds targeting high molecular compounds such as caged peptides and caged proteins was suggested. Peptides and proteins have specific and refined bioactive functions as compared to low molecular weight bioactive substances, and therefore these caged compounds are expected to be effective tools for elucidating various cell functions.

ペプチドやタンパク質等の生体高分子化合物のケージド化について、上記文献に示される従来方法としては、生理活性を一時的に抑制するために、特定の側鎖官能基、或は主鎖アミドに着目し、そこに直接的に光切断性官能基を結合させるという、低分子量生理活性物質のケージド化とほぼ同様の方法を用いている   Regarding the caged formation of biopolymer compounds such as peptides and proteins, as a conventional method shown in the above literature, in order to temporarily suppress physiological activity, attention is paid to a specific side chain functional group or main chain amide. Using a method similar to caged formation of a low molecular weight bioactive substance, in which a photocleavable functional group is directly bonded thereto.

図１（a），（b），（c），（d）を用いて、従来方法により目標とする生体高分子化合物をケージド化する手順を説明する。     A procedure for cage formation of a target biopolymer compound by a conventional method will be described with reference to FIGS. 1 (a), (b), (c), and (d).

図１（a）は、生体高分子化合物として、12個のアミノ酸（A1）〜（A12）の配列を有するペプチド（P）を模式的に示す。   FIG. 1 (a) schematically shows a peptide (P) having a sequence of 12 amino acids (A1) to (A12) as a biopolymer compound.

図１（b）は、活性に重要なアミノ酸残基を予測するプロセスを示す。このプロセスでは、目標ペプチド（P）を構成するアミノ酸（A1）〜（A12）に対して、活性に重要な（1つあるいは複数の）官能基を予測するために、（A1）の位置から順次（A2）〜（A4）・・と置換用標準アミノ酸（TA）（たとえばアラニン）で置換した変異体（P1）〜（P4）・・を合成し、活性の変化を比較する（アラニンスキャン）。   FIG. 1 (b) shows the process of predicting amino acid residues important for activity. In this process, for the amino acids (A1) to (A12) constituting the target peptide (P), in order to predict the functional group (s) that are important for activity, from the position of (A1) (A2) to (A4)... And mutants (P1) to (P4)... Substituted with a standard amino acid for substitution (TA) (for example, alanine) are synthesized and the changes in activity are compared (alanine scan).

図１（c）は、予測されたアミノ酸に光切断性保護基を導入したペプチドを合成し、活性を評価するプロセスを示す。このプロセスでは、図１（b）のプロセスで予測された活性に重要な官能基に対して、光切断性保護基（Ph）を導入し、合成されたペプチド（CP1)〜（CP4）・・・の活性化を評価する。このプロセスでは、光切断性保護基（Ph）で修飾できない側鎖官能基（アラニンやロイシン等）があるため、目標とする生体高分子化合物がこれらの側鎖官能基を有する場合にはケージド化することができない。   FIG. 1 (c) shows a process for synthesizing a peptide having a photocleavable protecting group introduced into a predicted amino acid and evaluating the activity. In this process, a photocleavable protecting group (Ph) is introduced into the functional group important for the activity predicted in the process of FIG. 1 (b), and the synthesized peptides (CP1) to (CP4).・ Evaluate activation. In this process, there are side-chain functional groups (such as alanine and leucine) that cannot be modified with a photocleavable protecting group (Ph), so if the target biopolymer compound has these side-chain functional groups, it is caged. Can not do it.

図１(d)は、目標とする活性が阻害されたケージドペプチドを決定するプロセスを示す。このプロセスでは、図１（c）のプロセスでの合成，評価の結果から、目的とする活性が消失しているケージドペプチド（CP）を選定し、決定する。ここでは、アミノ酸（A4）,（A11）に光切断性保護基（Ph）を導入したときに活性が低下したものとしてケージドペプチド（CP）を例示する。
Kaplan, J. H. et al., Biochemistry, 1978, 17, 1929 Wieboldt, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 8752-6 Adams, S.R. et al., Chem. Biol.,1997, 4, 867-878 Wood, J. S.et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 7145-7146 Zou, K. et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 8220-8229 Tatsu, Y. et al., FEBS Lett., 2002, 525(1-3):20-4 達 吉郎,茂里 康,湯元 昇、生物物理 45(3), 161-164(2005) 特許2863834号 FIG. 1 (d) shows the process of determining caged peptides whose target activity has been inhibited. In this process, a caged peptide (CP) from which the target activity has disappeared is selected and determined from the results of synthesis and evaluation in the process of FIG. 1 (c). Here, caged peptide (CP) is exemplified as an example in which the activity is reduced when a photocleavable protecting group (Ph) is introduced into amino acids (A4) and (A11).
Kaplan, JH et al., Biochemistry, 1978, 17, 1929 Wieboldt, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 8752-6 Adams, SR et al., Chem. Biol., 1997, 4, 867-878 Wood, JSet al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 7145-7146 Zou, K. et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 8220-8229 Tatsu, Y. et al., FEBS Lett., 2002, 525 (1-3): 20-4 Yoshiro Tatsu, Yasushi Mouri, Noboru Yumoto, Biophysics 45 (3), 161-164 (2005) Patent 2868334

以上説明した従来のケージド化合物の製造方法は、活性に寄与する官能基を予測するために、合成、評価を繰り返す、いわゆるトライアンドエラー方式であり、決定までに多大な労力を必要とし、機能解析ツールとしてケージド化合物を安定的、安価に提供することが困難であるという問題点を有し、また、光切断性保護基で修飾できない側鎖官能基（アラニンやロイシン等）があるため、ケージド化して生理活性を制御できる生体高分子化合物に制約を受けるといった問題点を有する。   The conventional caged compound production method described above is a so-called tri-and-error method in which synthesis and evaluation are repeated in order to predict a functional group that contributes to the activity. As a tool, it is difficult to provide caged compounds stably and inexpensively, and there are side-chain functional groups (alanine, leucine, etc.) that cannot be modified with photocleavable protecting groups, so they are caged. Therefore, there is a problem that the biopolymer compound that can control the physiological activity is restricted.

本発明は、生体高分子化合物の生理活性に寄与する官能基を予測するための多大な労力を必要とせず、また、側鎖官能基の種類による制約を受けることなく多様な生体高分子化合物をケージド化することのできる製造方法を提供することを目的とする。   The present invention does not require a great amount of labor for predicting functional groups that contribute to the bioactivity of biopolymer compounds, and various biopolymer compounds can be obtained without being restricted by the types of side chain functional groups. It is an object of the present invention to provide a production method that can be caged.

上記目的を達成するために本発明は、生理活性を有する生体高分子化合物のN末端あるいはC末端の一方に、選択的化学合成基対の一方の基と光切断性アミノ酸を、他方の末端に選択的化学合成基対の他方の基を合成し、分子内選択的化学反応による分子内環状反応を行うことにより、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化して、生理活性を有する生体高分子の活性を阻害したものである。   To achieve the above object, the present invention provides a biochemically active biopolymer compound having one group of a selective chemically synthesized group and a photocleavable amino acid at one end of the N-terminus or C-terminus. By synthesizing the other group of the selective chemical synthesis group pair and performing an intramolecular cyclic reaction by intramolecular selective chemical reaction, the conjugate of the biopolymer compound and the photocleavable amino acid is cyclized to increase the physiological activity. It inhibits the activity of the biopolymer it has.

また本発明は、光切断性アミノ酸として、式
（式中、R1, R2, R3, R4, 及びR5は、それぞれ独立に水素原子、ニトロ基、ハロゲン原子、メチル基、C2〜6アルキル基、又はC1-6アルコキシ基を示し、nは0-6の整数を示す。）
で示されるアミノ酸を用いたものである。 The present invention also provides a photocleavable amino acid as a formula
(In the formula, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , and R 5 each independently represent a hydrogen atom, a nitro group, a halogen atom, a methyl group, a C2-6 alkyl group, or a C1-6 alkoxy group. , N represents an integer of 0-6.)
The amino acid shown by is used.

さらに本発明は、選択的化学合成基対として、システイン基とベンジルチオエステル基を用いたものである。   Furthermore, the present invention uses a cysteine group and a benzylthioester group as the selective chemical synthesis group pair.

さらに本発明は、選択的化学合成基対として、アジド基とアルキン基を用いたものである。   Furthermore, the present invention uses an azide group and an alkyne group as the selective chemical synthesis group pair.

さらに本発明は、生理活性を有する生体高分子化合物として、式
で示されるペプチドPKIを用いたものである。 Furthermore, the present invention provides a biopolymer compound having physiological activity as a formula
The peptide PKI shown by is used.

本発明は、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化して、生理活性を有する生体高分子の活性を阻害したケージド化合物の製造方法であるから、生体高分子化合物を、その分子配列上の官能基の位置に関係なくケージド化することができ、活性に寄与する官能基を特定する労力を必要としないため、ケージド化合物を安定的、安価に提供できるという効果を奏する。また本発明は、側鎖官能基を直接的に光切断性保護基で修飾することなくケージド化合物を得るものであるため、官能基の種類に制約を受けず、多様な生体高分子化合物の生理活性機能を利用した機能解析ツールや医療応用薬剤を提供する機会を増やすことができるという効果を奏する。   The present invention is a method for producing a caged compound in which a conjugate of a biopolymer compound and a photocleavable amino acid is cyclized to inhibit the activity of a biopolymer having physiological activity. The caged compound can be caged regardless of the position of the functional group on the sequence, and the labor for identifying the functional group contributing to the activity is not required. Therefore, the caged compound can be provided stably and inexpensively. Further, the present invention obtains a caged compound without directly modifying the side chain functional group with a photocleavable protecting group, so that it is not limited by the type of functional group, and the physiological properties of various biopolymer compounds. There is an effect that it is possible to increase opportunities to provide functional analysis tools and medical applied drugs using active functions.

また本発明は、生理活性を有する生体高分子化合物のN末端あるいはC末端に選択的化学合成基対のひとつの基と光切断性アミノ酸を、他方の末端に選択的化学合成基対の他方の基を合成し、分子内選択的化学合成により分子内環状反応するものであるから、環状化反応が効率よく進行し、側鎖官能基の保護が必要なく、特異的に進行するため実用上有用性が高い。   Further, the present invention provides a biochemical compound having bioactivity with one group of a selective chemical synthesis group pair and a photocleavable amino acid at the N-terminus or C-terminus, and the other end of the selective chemical synthesis group pair at the other end. This is useful for practical use because it synthesizes a group and undergoes an intramolecular cyclic reaction by selective intramolecular chemical synthesis, so that the cyclization reaction proceeds efficiently and does not require protection of the side chain functional group and proceeds specifically. High nature.

本発明者等は、生理活性を有する生体高分子化合物を環状化することによりその生理活性が阻害されることを見出し、さらに、この環状化反応に光切断性のアミノ酸を導入すれば、光照射により環状化が解除されて生理活性が機能発現するケージドペプチドが得られることを予見し、これにしたがって、実験を行い、本発明が実現可能であり、期待通りの効果を奏することを確認した。   The present inventors have found that cyclization of a biopolymer compound having bioactivity inhibits its bioactivity, and further, if photocleavable amino acids are introduced into this cyclization reaction, light irradiation is performed. As a result, it was foreseen that a caged peptide in which the cyclization was released and the physiological activity was functionally obtained was obtained, and experiments were performed in accordance with this to confirm that the present invention was feasible and had the expected effect.

以下、図２、図３を用いて本発明のケージド化合物の製造方法の具体例を説明する。   Hereinafter, the specific example of the manufacturing method of the caged compound of this invention is demonstrated using FIG. 2, FIG.

なお、本発明は、以下の実施例で具体的に示す物質や反応方法、反応条件などに限定されるものではなく、技術的思想の範囲内において、その他の適宜な物質や反応方法、反応条件などに置換えることができる。   The present invention is not limited to the substances, reaction methods, reaction conditions and the like specifically shown in the following examples, and other appropriate substances, reaction methods, reaction conditions are within the scope of the technical idea. Etc. can be substituted.

図２（a），（b）,（c）には、光切断性アミノ酸として3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸（図４）を選択し、また、選択的化学反応基対としてシステイン基とベンジルチオエステル基を選択して、分子内選択的化学反応による分子内環状反応を行うことにより、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化する具体例を示す。   In FIGS. 2 (a), (b) and (c), 3-amino- (2-nitrophenyl) propanoic acid (FIG. 4) is selected as the photocleavable amino acid, and as a selective chemical reactive group pair. A specific example in which a conjugate of a biopolymer compound and a photocleavable amino acid is cyclized by selecting a cysteine group and a benzylthioester group and performing an intramolecular cyclic reaction by an intramolecular selective chemical reaction is shown.

図２（a）には、生理活性を有する直鎖状ペプチド（P）のN末端（Pn）とC末端（Pc）に、システイニル光切断性アミノ酸（Cys-Anp）とグリシンベンジルチオエステル（Gly-SBn）をそれぞれ合成したときの構造を示す。   Fig. 2 (a) shows the linear peptide (P) with physiological activity at the N-terminus (Pn) and C-terminus (Pc), with a cysteinyl photocleavable amino acid (Cys-Anp) and glycine benzylthioester (Gly- SBn) is synthesized respectively.

図２（b）には、適切な反応条件のもとで、上記システイン基とベンジルチオエステル基を反応（縮合反応）させ、光切断性アミノ酸（Anp）を組み込んで環状化した環状ペプチド（CCP）を得ることを示す。選択的化学反応基対であるシステイン基とベンジルチオエステル基を用いた分子内選択的化学反応は、中性緩衝液中で効率よく進行する。この反応は、側鎖官能基の保護が必要なく、特異的に進行するため実用的にきわめて有用である。   Fig. 2 (b) shows a cyclic peptide (CCP) obtained by reacting the cysteine group and benzylthioester group (condensation reaction) under appropriate reaction conditions and cyclizing by incorporating a photocleavable amino acid (Anp). Show that you get. Intramolecular selective chemical reaction using a cysteine group and a benzylthioester group, which are selective chemical reaction group pairs, efficiently proceeds in a neutral buffer. This reaction is extremely useful practically because it does not require side chain functional group protection and proceeds specifically.

次いで、図２（c）に示すように、得られた環状化ペプチド（CCP）は、光照射を受けることにより、アミノ酸（Am）の窒素−炭素結合（J-NC）が切断されて環状化が解除され、元の生理活性を有する直鎖状ペプチド（P）を含んだ直鎖状化合物となる。   Next, as shown in FIG. 2 (c), the obtained cyclized peptide (CCP) is subjected to light irradiation, whereby the nitrogen-carbon bond (J-NC) of the amino acid (Am) is cleaved and cyclized. Is released, and a linear compound containing a linear peptide (P) having the original physiological activity is obtained.

図３（a），（b）,（c）には、光切断性アミノ酸として3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸（図４: Anp）を選択し、また、選択的化学反応基対としてアジド基とアルキン基を選択して、分子内選択的化学反応による分子内環状反応を行うことにより、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化する具体例を示す。   In FIGS. 3 (a), (b), and (c), 3-amino- (2-nitrophenyl) propanoic acid (FIG. 4: Anp) is selected as the photocleavable amino acid, and a selective chemical reactive group. A specific example in which a conjugate of a biopolymer compound and a photocleavable amino acid is cyclized by selecting an azide group and an alkyne group as a pair and performing an intramolecular cyclic reaction by an intramolecular selective chemical reaction is shown.

図３（a）には、生理活性を有する直鎖状ペプチド（P）のN末端（Pn）とC末端（Pc）に、（2-アジド酢酸：光切断性アミノ酸）（N3-Gly-Npp）と（プロパルギルグリシン propargyl glycine）（Pag-NH2）をそれぞれ合成したときの構造を示す。 FIG. 3 (a) shows (2-azidoacetic acid: photocleavable amino acid) (N 3 -Gly-) at the N-terminus (Pn) and C-terminus (Pc) of a linear peptide (P) having physiological activity. Npp) and (propargyl glycine) (Pag-NH 2 ) are respectively synthesized.

図３（b）には、適切な反応条件のもとで、上記アルキル基とアルキン基を反応させ、光切断性アミノ酸（Am）を組み込んで環状化した環状ペプチド（CCP）を得ることを示す。選択的化学反応基対であるアルキル基とアルキン基を用いた分子内選択的化学反応は1価の銅触媒の存在下で効率よく進行する。アルキル基とアルキン基の反応は、クリックケミストリーと呼ばれ、特異的に進行するため実用的にきわめて有用である。クリックケミストリーの参考文献として、たとえば、R. A. Turner, A. G. Oliver, R. S. Lokey, Org. Lett., 9, 5011-5014 (2007)がある。   FIG. 3 (b) shows that the above alkyl group and alkyne group are reacted under appropriate reaction conditions to obtain a cyclic peptide (CCP) that is cyclized by incorporating a photocleavable amino acid (Am). . Intramolecular selective chemical reaction using an alkyl group and an alkyne group, which are selective chemical reactive group pairs, proceeds efficiently in the presence of a monovalent copper catalyst. The reaction between an alkyl group and an alkyne group is called click chemistry, and is practically very useful because it proceeds specifically. References to click chemistry include, for example, R. A. Turner, A. G. Oliver, R. S. Lokey, Org. Lett., 9, 5011-5014 (2007).

次いで、図３（c）に示すように、得られた環状化ペプチド（CCP）は、光照射を受けることにより、アミノ酸（Am）の窒素−炭素結合（J-NC）が切断されて環状化が解除され、元の生理活性を有するペプチド（P）を含んだ直鎖状化合物となる。   Next, as shown in FIG. 3 (c), the obtained cyclized peptide (CCP) undergoes light irradiation to cleave the nitrogen-carbon bond (J-NC) of the amino acid (Am). Is released to become a linear compound containing the peptide (P) having the original physiological activity.

図５に、この実施例において用いる生体高分子化合物として、プロテインキナーゼA（PKA）の阻害ペプチド（PKI）（Ac-Gly-Arg-Thr-Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-lle-NH2）（配列番号１）を示す。また、この実施例では、光切断性アミノ酸として、図４に示す3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸を選択し、選択的化学反応基対としてシステイン基とベンジルチオエステル基を選択し、ペプチド（PKI）のC末端（Pc）とN末端（Pn）に、システイニル光切断性アミノ酸（Cys-Anp）とグリシンベンジルチオエステル（Gly-SBn）を導入（常法により個相合成）して得られた直鎖状化合物（図６）を、中性緩衝液中で希薄条件下処理することで分子内選択的化学反応法により分子内環状化反応させ、アミノ酸（Anp）が組み込まれた環状化高分子化合物を得る（図７）。得られた環状ペプチドに紫外光を照射すると、アミノ酸（Anp）のO-ニトロフェニル基の窒素-炭素結合（J-NC）が分解して、元の生理活性ペプチド（PKI）のN末端に2-ニトロソフェニルカルボニルメチル基（Npc）が、C末端にはグリシルシステイニルアミド（Gly-Cys-NH2）が結合した鎖状ペプチドとなる（図８）。 5, as the biological polymer used in this example, the inhibitory peptide of protein kinase A (PKA) (PKI) ( Ac-Gly-Arg-Thr-Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-lle-NH 2 ) (SEQ ID NO: 1). Further, in this example, 3-amino- (2-nitrophenyl) propanoic acid shown in FIG. 4 is selected as the photocleavable amino acid, and a cysteine group and a benzylthioester group are selected as the selective chemical reaction group pair, Obtained by introducing a cysteinyl photocleavable amino acid (Cys-Anp) and glycine benzylthioester (Gly-SBn) into the C-terminus (Pc) and N-terminus (Pn) of the peptide (PKI) (single-phase synthesis using conventional methods) The resulting linear compound (FIG. 6) is treated under dilute conditions in a neutral buffer to cause an intramolecular cyclization reaction by an intramolecular selective chemical reaction method, thereby cyclization incorporating an amino acid (Anp). A polymer compound is obtained (FIG. 7). When the obtained cyclic peptide is irradiated with ultraviolet light, the nitrogen-carbon bond (J-NC) of the O-nitrophenyl group of the amino acid (Anp) is degraded, and 2 is added to the N-terminus of the original physiologically active peptide (PKI). A nitrosophenylcarbonylmethyl group (Npc) becomes a chain peptide in which glycylcysteinylamide (Gly-Cys-NH 2 ) is bonded to the C-terminus (FIG. 8).

図９(a),(b),(c),(d)を用いて、以上の実施例における環状ペプチドの合成プロセスをさらに詳細に説明する。なお、アミノ酸（Anp）は、既知物質であるため、合成の説明は省略した。   The process for synthesizing the cyclic peptide in the above examples will be described in more detail with reference to FIGS. 9 (a), (b), (c) and (d). In addition, since the amino acid (Anp) is a known substance, description of the synthesis was omitted.

１）C末端アミノ酸の導入 （図９（a））：
(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)-グリシン（Fmoc-Gly-OH；119mg, 400μmol)とジイソプロピルエチルアミン（DIPEA：105μL, 600μmol)とベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-（ジメチルアミノ）-ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート(PyBOP；208mg, 400μmol)をジメチルホルムアミド(DMF； 2mL)に溶解し、4-スルファミルブチリル AMレジン(1.10 mmol/g, Novabiochem) (91mg, 100μmol)に加え、反応混合物を、室温で15時間震盪し、Fmoc-グリシンを担持したレジン（式１）を得る。 1) Introduction of C-terminal amino acid (FIG. 9 (a)):
(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) -glycine (Fmoc-Gly-OH; 119 mg, 400 μmol), diisopropylethylamine (DIPEA: 105 μL, 600 μmol) and benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (dimethylamino)- Phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP; 208 mg, 400 μmol) is dissolved in dimethylformamide (DMF; 2 mL), added to 4-sulfamylbutyryl AM resin (1.10 mmol / g, Novabiochem) (91 mg, 100 μmol), and the reaction mixture Is shaken at room temperature for 15 hours to obtain a resin (formula 1) carrying Fmoc-glycine.

２）ペプチドの合成と、N末端システイニルアミノ酸（Cys-Anp）の導入（図９（b））
この工程では、上記（式１）のレジンに対し、通常のFmoc法によりペプチド鎖を固相合成する。各アミノ酸は、レジンに対して3当量用いた。縮合にはジイソプロピルエチルアミン（DIPEA；6当量)、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-（ジメチルアミノ）-ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（PyBOP；3当量)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT；3当量)を用い、ジメチルホルムアミド（DMF）中で反応を行った。次の工程で行うヨードアセトニトリルによるレジンの活性化は、塩基条件下で行うため、N末端のシステインのみ、塩基条件下で脱保護されないtert-ブトキシカルボニル（Boc）をアミノ基の保護基として用いた。結果として、（式２）に示すように、システイニル-光切断性アミノ酸（Cys-Anp）をC末端に、グリシンをN末端にそれぞれ有するペプチド（PKI）（配列番号１）が得られた。 2) Peptide synthesis and introduction of N-terminal cysteinyl amino acid (Cys-Anp) (Fig. 9 (b))
In this step, the peptide chain is solid-phase synthesized by the usual Fmoc method with respect to the resin of the above (formula 1). Each amino acid was used in an amount of 3 equivalents with respect to the resin. For condensation, diisopropylethylamine (DIPEA; 6 equivalents), benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (dimethylamino) -phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP; 3 equivalents), 1-hydroxybenzotriazole (HOBT; 3 equivalents) The reaction was performed in dimethylformamide (DMF). Since the activation of the resin with iodoacetonitrile performed in the next step is performed under basic conditions, only the N-terminal cysteine and tert-butoxycarbonyl (Boc), which is not deprotected under basic conditions, were used as protecting groups for amino groups. . As a result, as shown in (Formula 2), a peptide (PKI) (SEQ ID NO: 1) having a cysteinyl-photocleavable amino acid (Cys-Anp) at the C-terminus and glycine at the N-terminus was obtained.

３）レジンの活性化（図９（c））
ペプチドが結合している（式２）のレジン(6μmol)をN-メチル-2-ピロリドン（NMP）で5回洗浄した。その後、N-メチル-2-ピロリドン（NMP；120μL)、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA；5.2μL, 30μmol)、ヨードアセトニトリル（8.8μL, 120μmol）を加え、遮光して室温で18時間震盪した。溶液を濾過して除いた後、N-メチル-2-ピロリドン（NMP）で5回、ジクロロメタンで5回洗浄し、（式３）に示すように、レジンの水素をシアン基に置換し、活性化をおこなった。 3) Resin activation (FIG. 9 (c))
The resin (6 μmol) to which the peptide was bound (Formula 2) was washed 5 times with N-methyl-2-pyrrolidone (NMP). Thereafter, N-methyl-2-pyrrolidone (NMP; 120 μL), diisopropylethylamine (DIPEA; 5.2 μL, 30 μmol) and iodoacetonitrile (8.8 μL, 120 μmol) were added, and the mixture was shaken at room temperature for 18 hours while protected from light. After removing the solution by filtration, it was washed 5 times with N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) and 5 times with dichloromethane. As shown in (Formula 3), the hydrogen in the resin was replaced with a cyan group and activated. Made.

４）直鎖状ペプチドベンジルチオエステルの合成（図９（d））
ジメチルホルムアミド（DMF；120μL)、ベンジルメルカプタン（5.6μL, 48μmol）を、（式３）のレジン（6μmol）に加え、室温で48時間撹拌した。撹拌後の溶液を濾過し、その濾液を減圧下で留去した。脱保護用反応液（250μL; トリフルオロ酢酸（TFA）:H2O：エタンジチオール（EDT）:トリイソプロピルシラン（TIPS）=94.5:2.5:2.5:1）を丸底フラスコ中のペプチドに加え、室温で2時間攪拌した。濃縮した後、氷冷した蒸留エーテルを加えた。生じた沈殿を氷冷エーテルで3回洗浄し、（式４=図６）で示すペプチドベンジルチオエステル（MALDI-MS:1459[M+H]＋）を得た。 4) Synthesis of linear peptide benzylthioester (FIG. 9 (d))
Dimethylformamide (DMF; 120 μL) and benzyl mercaptan (5.6 μL, 48 μmol) were added to the resin (6 μmol) of (Formula 3) and stirred at room temperature for 48 hours. The stirred solution was filtered, and the filtrate was distilled off under reduced pressure. Add the deprotection reaction solution (250 μL; trifluoroacetic acid (TFA): H 2 O: ethanedithiol (EDT): triisopropylsilane (TIPS) = 94.5: 2.5: 2.5: 1) to the peptide in the round bottom flask, Stir at room temperature for 2 hours. After concentration, ice-cold distilled ether was added. The resulting precipitate was washed with ice-cold ether three times to obtain a peptide benzylthioester (MALDI-MS: 1459 [M + H] + ) represented by (Formula 4 = FIG. 6).

上記（式４）で示すペプチドベンジルチオエステルのHPLCクロマトグラムを図１０に示す。26分経過付近でピークが2本見られるのは、用いた3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸（Anp）がラセミ体であるために、得られたペプチドがジアステレオマーの混合物となっているためである。目的とするペプチドのピークが主生成物として得られたため、精製は行わず、次の工程に進んだ。   FIG. 10 shows an HPLC chromatogram of the peptide benzylthioester represented by the above (formula 4). Two peaks are observed around 26 minutes, because the 3-amino- (2-nitrophenyl) propanoic acid (Anp) used is a racemate, and the resulting peptide is a mixture of diastereomers and It is because it has become. Since the peak of the target peptide was obtained as the main product, purification was not performed and the process proceeded to the next step.

５）環状ペプチドの合成（図９（e））
（式４）で示すペプチドベンジルチオエステルを水（500μL）に溶かし、エチレンジアミン四酢酸（EDTA；1mM）、ベンゼンチオール (0.02％v/v)、ベンジルメルカプタン (0.02％v/v)を含む、0.1Mリン酸緩衝液 (pH7.6, 10mL)中に、5分間かけて滴下した。その溶液を0℃で1.5時間攪拌し、光切断性アミノ酸（Anp）を組み込んだ環状ペプチド（式５=図７）の合成を進行させた。合成が進んだところで溶液の凍結乾燥を行い、HPLCにより精製した。
[HPLC精製条件] カラムはInertsil PREP-ODS (20×250mm)を用いた。検出は、220nmの吸光度を用いた。溶離液として、0.1% TFA/H2O と0.1% TFA/CH3CNを用い、リニア−グラジエントを行った（MALDI-MS：1335[M+H] +）。 5) Synthesis of cyclic peptide (FIG. 9 (e))
The peptide benzylthioester represented by (Formula 4) is dissolved in water (500 μL) and contains 0.1 M of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA; 1 mM), benzenethiol (0.02% v / v), benzyl mercaptan (0.02% v / v). The solution was dropped into a phosphate buffer (pH 7.6, 10 mL) over 5 minutes. The solution was stirred at 0 ° C. for 1.5 hours to proceed with the synthesis of a cyclic peptide (formula 5 = FIG. 7) incorporating a photocleavable amino acid (Anp). When the synthesis progressed, the solution was lyophilized and purified by HPLC.
[HPLC purification conditions] Inertsil PREP-ODS (20 x 250 mm) was used as the column. For detection, absorbance at 220 nm was used. A linear gradient was performed using 0.1% TFA / H 2 O and 0.1% TFA / CH 3 CN as the eluent (MALDI-MS: 1335 [M + H] + ).

図１１に、環状化反応後、精製操作前のHPLCクロマトグラムを示す。溶出時間26分付近に存在した原料のピークはほぼ完全に消失し、溶出時間20分付近に目的物のピークが現れている（50分付近の2本のピークは、反応に用いたベンゼンチオールとベンジルメルカプタンである）。環状化反応の収率は、約80％であった。環状ペプチドの合成において、選択的化学反応基対であるシステイン基とベンジルチオエステル基による分子内選択的化学反応は、中性緩衝液中で効率よく進行し、側鎖官能基の保護が必要なく、特異的に進行するため実用的にきわめて有用である。なお環状ペプチド合成法（ネイティブケミカルライゲーション（Native Chemical Ligation）を用いる方法）は次の文献に報告されている（J. A. Camarero, T. W. Muir, Chem. Commun. 1997, 1369.）。   FIG. 11 shows an HPLC chromatogram after the cyclization reaction and before the purification operation. The peak of the raw material that existed near the elution time of 26 minutes disappeared almost completely, and the peak of the target compound appeared around the elution time of 20 minutes (the two peaks around 50 minutes are the same as the benzenethiol used in the reaction). Benzyl mercaptan). The yield of the cyclization reaction was about 80%. In the synthesis of cyclic peptides, the intramolecular selective chemical reaction by the cysteine group and the benzylthioester group, which is a selective chemical reactive group pair, proceeds efficiently in a neutral buffer, and it is not necessary to protect the side chain functional group. Since it progresses specifically, it is extremely useful in practice. The cyclic peptide synthesis method (method using native chemical ligation) has been reported in the following literature (J. A. Camarero, T. W. Muir, Chem. Commun. 1997, 1369.).

図１２に、得られた環状ペプチドのＰＫＡ阻害活性を、PKAの基質ペプチドとして知られるKemptide（Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly）（配列番号２）のリン酸化率をHPLCを用いて測定した結果を示す。図のグラフ（a）は、環状化ペプチド（図７，図９（e））に紫外光を照射したとき、時間経過と共に阻害活性が上昇することを示す。即ち、ペプチド（PKI）が環状化により、その生理活性が阻害されていたものが、光照射で環状化が解除されることにより、元の生理活性ペプチド（PKI）を含む鎖状ペプチドの状態（図８）となり、活性が発現することが確認された。「直鎖状インヒビターの阻害活性」として示す値（au=約0.76）は、直鎖状PKAインヒビター（Ac-GRTGRRNAI（配列番号1）-NH2）の活性数値を示し、環状化ペプチドに対する20分光照射により、活性がインヒビターの活性の95％（au=約0.72）まで回復することが確認された。なお、活性を回復するための紫外線照射時間は、照射光のエネルギー強度を上げることにより短縮することが可能であり、照射部位の深さ、光透過率などの状況に応じて光種別（紫外光やレーザーなど）や強度を選択し、目的に応じて使い分けて用いれば良い。 FIG. 12 shows the PKA inhibitory activity of the obtained cyclic peptide, and the phosphorylation rate of Kemptide (Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly) (SEQ ID NO: 2) known as PKA substrate peptide by HPLC. The result measured using this is shown. The graph (a) in the figure shows that the inhibitory activity increases with time when the cyclized peptide (FIG. 7, FIG. 9 (e)) is irradiated with ultraviolet light. In other words, the peptide (PKI) whose physiological activity was inhibited by cyclization was released from the cyclization, and the state of the chain peptide containing the original physiologically active peptide (PKI) ( Fig. 8), confirming that the activity was expressed. The value shown as “inhibitory activity of linear inhibitor” (au = about 0.76) indicates the activity value of linear PKA inhibitor (Ac-GRTGRRNAI (SEQ ID NO: 1) -NH 2 ), and 20 spectra for cyclized peptide It was confirmed that irradiation restored the activity to 95% of the inhibitor activity (au = about 0.72). In addition, the ultraviolet irradiation time for recovering the activity can be shortened by increasing the energy intensity of the irradiation light, and the light type (ultraviolet light) depends on the conditions such as the depth of the irradiated part and the light transmittance. Or laser) and intensity, and use them according to the purpose.

一方、光切断により生じるニトロソ基等の阻害活性への影響の有無を調べるため、上記生理活性ペプチド（PKI）と同様な手順により、阻害活性を持たないコントロールペプチド（Ac-Gly-Arg-Thr-Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-NH2）（配列番号３）を環状化した後に光照射してアミノ酸を分解し、ニトロソ基を生じさせて活性を測定したところ、図１２のグラフ（b）に示すように、時間が経過しても活性の上昇は全く見られなかった。このことから、光分解により生じるニトロソ基等は活性機能へ影響せず、図１２のグラフ（a）に示す活性の上昇は、生理活性ペプチド（PKI）の環状化解除により生じたものであることが確認された。 On the other hand, in order to investigate the influence on the inhibitory activity such as nitroso group generated by photocleavage, a control peptide having no inhibitory activity (Ac-Gly-Arg-Thr-) was used in the same procedure as the above bioactive peptide (PKI). irradiated with light to decompose the amino acid Leu-Arg-Arg-Ala- Ala-Leu-NH 2) (SEQ ID NO: 3) after circularization, the measured activity causing nitroso group, the graph of FIG. 12 As shown in (b), no increase in activity was observed over time. Therefore, the nitroso group and the like generated by photolysis do not affect the active function, and the increase in activity shown in the graph (a) of FIG. 12 is caused by decyclization of the bioactive peptide (PKI). Was confirmed.

他の生体高分子化合物においても、上記ペプチド（PKI）の場合の環状化プロセスと同様に、それぞれの生体高分子化合物のN末端あるいはC末端に、図３に例示するような光切断性アミノ酸と選択的化学反応基を結合させ、その後に分子内環状化反応を生じさせて、光切断性アミノ酸を組み込んだケージド高分子化合物を得ることができ、これによってさまざまな機能研究や薬剤、治療方法の進展が期待できる。   Similarly to the cyclization process in the case of the above-mentioned peptide (PKI), other biopolymer compounds also have a photocleavable amino acid as illustrated in FIG. 3 at the N-terminus or C-terminus of each biopolymer compound. A selective chemical reaction group can be attached, followed by an intramolecular cyclization reaction to obtain a caged polymer compound incorporating a photocleavable amino acid, which enables various functional studies, drugs, and therapeutic methods. Progress can be expected.

（a）,（b）,（c）,（d）は、従来のケージド高分子化合物の製造プロセスを示す図である。(A), (b), (c), (d) is a figure which shows the manufacturing process of the conventional caged polymer compound. （a），（b）,（c）は、光切断性アミノ酸として3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸を選択し、また、選択的化学反応基対としてシステイン基とベンジルチオエステル基を選択して、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化する具体例を示す図である。(A), (b) and (c) select 3-amino- (2-nitrophenyl) propanoic acid as a photocleavable amino acid, and a cysteine group and a benzylthioester group as a selective chemical reactive group pair. It is a figure which shows the specific example which selects and cyclizes the conjugate | bonded_body of a biopolymer compound and a photocleavable amino acid. （a），（b）,（c）は、光切断性アミノ酸として3-アミノ-（2-ニトロフェニル）プロパン酸を選択し、また、選択的化学反応基対としてアジド基とアルキン基を選択して、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化する具体例を示す図である。(A), (b), and (c) select 3-amino- (2-nitrophenyl) propanoic acid as the photocleavable amino acid, and select the azide group and alkyne group as the selective chemical reactive group pair FIG. 3 is a diagram showing a specific example of cyclizing a conjugate of a biopolymer compound and a photocleavable amino acid. 光切断性アミノ酸の具体例の化学構造式を示す図である。It is a figure which shows the chemical structural formula of the specific example of a photocleavable amino acid. 生理活性生体高分子化合物の具体例としてPKIの化学構造式を示す図である。It is a figure which shows the chemical structural formula of PKI as a specific example of a bioactive biopolymer compound. PKIのN末端にCys-Anpを、C末端にGlyのベンジルチオエステルを合成した直鎖ペプチドの化学構造式を示す図である。It is a figure which shows the chemical structural formula of the linear peptide which synthesize | combined Cys-Anp at the N terminal of PKI and benzylthioester of Gly at the C terminal. 図６の直鎖ペプチドを環状化してケージド化したときの化学構造式を示す図である。It is a figure which shows a chemical structural formula when the linear peptide of FIG. 6 is cyclized and caged. 図７の環状化したケージドペプチドに光照射して直鎖状になったペプチドの化学構造式を示す図である。It is a figure which shows the chemical structural formula of the peptide which irradiated the light to the circular caged peptide of FIG. 7, and became linear. （a）,（b）,（c）,（d）は、図５〜図７に示すペプチドの環状化プロセスに関して、さらに詳細に合成プロセスを説明する図を示す図である。(A), (b), (c), (d) is a figure which shows the figure explaining a synthetic | combination process in detail regarding the cyclization process of the peptide shown in FIGS. は、図９（d）の工程で得られたペプチドベンジルチオエステルのHPLCクロマトグラムを示す図である。These are figures which show the HPLC chromatogram of the peptide benzyl thioester obtained at the process of FIG.9 (d). は、環状化反応後、精製操作前のHPLCクロマトグラムを示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an HPLC chromatogram after a cyclization reaction and before a purification operation. 本発明のケージド高分子化合物に光照射したときの生理活性の時間変化を示すグラフ（a）および、生理活性を持たないコントロールペプチドを光切断性アミノ酸を組み込んで環状化し、それに光照射したときの生理活性の時間変化を示すグラフ（b）を示す図である。Graph (a) showing the time change of physiological activity when the caged polymer compound of the present invention is irradiated with light, and a control peptide having no physiological activity, which is cyclized by incorporating a photocleavable amino acid, and irradiated with light It is a figure which shows the graph (b) which shows the time change of bioactivity.

符号の説明Explanation of symbols

P：生理活性ペプチド
A1，A2，A3，A4，・・・，A12：アミノ酸基
TA：アラニン（置換アミノ酸）
P1，P2，P3，P4：アラニンによってアミノ酸基を置換したペプチド
Ph：光分解性アミノ酸（保護基）
CP1，CP2，CP3，CP4：光切断性アミノ酸を合成したペプチド
CP：生理活性の阻害を確認されたケージドペプチド
CCP：環状化ケージドペプチド
PKI：PKA阻害ペプチド
Pn：直鎖状生体高分子化合物のN末端
Pc：直鎖状生体高分子化合物のC末端
Anp：環状化高分子化合物に組み込まれた光切断性アミノ酸
J-NC：光照射によって切断される窒素-炭素結合部
P: Bioactive peptide
A1, A2, A3, A4, ..., A12: Amino acid group
TA: Alanine (Substituted amino acid)
P1, P2, P3, P4: Peptides with amino acid substitution by alanine
Ph: Photodegradable amino acid (protecting group)
CP1, CP2, CP3, CP4: Peptides synthesized with photocleavable amino acids
CP: Caged peptide with confirmed inhibition of physiological activity
CCP: Cyclized caged peptide
PKI: PKA inhibitory peptide
Pn: N-terminal of linear biopolymer compound
Pc: C-terminal of linear biopolymer compound
Anp: Photocleavable amino acid incorporated in a cyclized polymer
J-NC: Nitrogen-carbon bond cut by light irradiation

Claims (5)

生理活性を有する生体高分子化合物のN末端あるいはC末端の一方に、選択的化学合成基対の一方の基と光切断性アミノ酸を、他方の末端に選択的化学合成基対の他方の基を合成し、分子内選択的化学反応 による分子内環状反応を行うことにより、生体高分子化合物と光切断性アミノ酸の結合体を環状化して、生理活性を有する生体高分子の活性を阻害したことを特徴とするケージド化合物の製造方法。   One group of a selective chemically synthesized group pair and a photocleavable amino acid are placed on one of the N-terminal or C-terminal of a biopolymer having biological activity, and the other group of the selectively chemically synthesized group pair is placed on the other end. By synthesizing and performing an intramolecular cyclic reaction by intramolecular selective chemical reaction, the conjugate of biopolymer compound and photocleavable amino acid was cyclized to inhibit the activity of biopolymers with bioactivity. A method for producing a caged compound. 光切断性アミノ酸として、式
（式中、R1，R2，R3，R4,及びR5は、それぞれ独立に水素原子、ニトロ基、ハロゲン原子、メチル基、C2-6アルキル基、又はC1-6アルコキシ基を示し、nは0-6の整数を示す。）
で示されるアミノ酸を用いた請求項１に記載のケージド化合物の製造方法。 As a photocleavable amino acid, the formula
(In the formula, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , and R 5 each independently represent a hydrogen atom, a nitro group, a halogen atom, a methyl group, a C 2-6 alkyl group, or a C 1-6 alkoxy group. , N represents an integer of 0-6.)
The manufacturing method of the caged compound of Claim 1 using the amino acid shown by these. 選択的化学反応基対としてシステイン基とベンジルチオエステル基を用いる請求項１のケージド化合物の製造方法。   The method for producing a caged compound according to claim 1, wherein a cysteine group and a benzylthioester group are used as the selective chemical reaction group pair. 選択的化学反応基対としてアジド基とアルキン基を用いる請求項１のケージド化合物の製造方法。   The method for producing a caged compound according to claim 1, wherein an azide group and an alkyne group are used as the selective chemical reaction group pair. 生理活性を有する生体高分子化合物として、式
で示されるペプチドPKIを用いた請求項１に記載のケージド化合物の製造方法。


As a biopolymer compound having physiological activity,
The manufacturing method of the caged compound of Claim 1 using the peptide PKI shown by these.


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