JP2009002696A - Apparatus and method for screening particulate - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微細粒子のスクリーニング装置に関し、特に微細粒子(例えば細胞など)に対して光を当てて微細粒子から発する蛍光を標識として標的とする微細粒子を探索して、その探索した微細粒子を選択的に吸引して回収するための微細粒子のスクリーニング装置および微細粒子のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a screening apparatus for fine particles, and in particular, applies light to fine particles (for example, cells) to search for fine particles targeted by using fluorescence emitted from the fine particles as a label. The present invention relates to a fine particle screening apparatus and a fine particle screening method for selectively sucking and collecting.
標的対象物である細胞を探索して回収する探索回収装置としては、次のようなものがある。試料台の上には、細胞を載せた試料板を載せるようになっており、照明と対物レンズがこの試料板を挟んで対向する位置に配置されている。細胞を吸引するためのノズルは、細胞に対して斜め下方向に向けて配置されていて、吸引できるようになっている。試料台はXYステージにより移動可能である。この探索回収装置では、スライドグラス上に塗布した細胞を顕微鏡により探索し、形状・色・サイズ等から回収対象を選定し、その部分に剥離液を滴下した後に剥離液ごと回収するものである(例えば、特許文献1参照)。また、粒子サンプルを蛍光情報によって分種する技術としては、セルソーターが広く用いられている。
ところで、全ての計測対象である細胞のような微細粒子を計測して全体の輝度分布状況を確認した上で回収対象とする微細粒子を選択することで、異物によるノイズなどが確実に除去された微細粒子の回収が望まれている。 By the way, by measuring fine particles such as cells that are all measurement objects and confirming the overall luminance distribution status, selecting fine particles to be collected has surely eliminated noise caused by foreign matters. The collection of fine particles is desired.
そこで、本発明は上記課題を解消するために、全ての計測対象である細胞のような微細粒子を計測して全体の分布状況を確認した上で回収対象とする微細粒子を選択して、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる微細粒子のスクリーニング装置および微細粒子のスクリーニング方法を提供することを目的とする。 Therefore, in order to solve the above problems, the present invention measures fine particles such as cells that are all measurement targets and confirms the overall distribution state, and then selects the fine particles to be collected, It is an object of the present invention to provide a fine particle screening apparatus and a fine particle screening method capable of efficiently searching for and selectively recovering target fine particles from a number of fine particles.
上記課題を解消するために、本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、微細粒子から発する光情報を標識として微細粒子の探索を行い、探索された微細粒子を選択的に取得するための微細粒子のスクリーニング装置であって、装置の土台となるベースと、光を透過する材料で形成され、前記微細粒子を含む懸濁液を注入することで、前記微細粒子が収納されるウェルが形成された計測用チップと、オートフォーカス機能を有し、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に少なくとも1つ以上の光源より導かれる光を照射することにより得られる前記微細粒子および/またはウェルに関する光情報を取得する計測部と、前記光情報を解析することで、前記ウェル内に収納されている前記の各微細粒子からの光情報を抽出する解析部と、前記ベースに設置され、前記計測用チップと、前記計測用チップから選択的に取得された前記微細粒子を収容するための回収プレートとが搭載され、前記計測用チップと前記回収プレートを、前記計測部に対して第1方向と少なくとも前記第1方向と直交する第2方向に移動可能な移動部と、前記ベースに設置され、吸引・吐出キャピラリを有し、前記吸引・吐出キャピラリにより前記計測用チップに設けられた前記ウェル内の微細粒子を吸入して前記回収プレートの所定の位置に吐出して回収するための回収部と、を備え、前記光情報の解析結果から、解析輝度の下限と上限から成る1つ以上の輝度領域を指定することによって、回収対象候補の前記ウェルが選択されることを特徴とする。 In order to solve the above-described problems, the fine particle screening apparatus of the present invention searches for fine particles using light information emitted from the fine particles as a label, and selects fine particles for selectively acquiring the searched fine particles. A screening device, which is formed of a base serving as a base of the device and a light-transmitting material, and in which a well containing the fine particles is formed by injecting a suspension containing the fine particles. And a fine particle obtained by irradiating the measurement chip and the fine particle accommodated in the measurement chip with light guided from at least one light source, and / or an autofocus function. Alternatively, the optical information from each fine particle accommodated in the well by measuring the optical information with a measuring unit that acquires optical information about the well An analysis unit to be extracted, mounted on the base, mounted on the measurement chip, and a collection plate for containing the fine particles selectively acquired from the measurement chip, the measurement chip and the The recovery plate is disposed on the base and movable unit is movable in a first direction and at least a second direction orthogonal to the first direction with respect to the measurement unit, and has a suction / discharge capillary, A recovery unit for sucking fine particles in the well provided in the measurement chip by a discharge capillary and discharging and discharging the fine particles to a predetermined position of the recovery plate, from the analysis result of the optical information The well of the collection target candidate is selected by designating one or more luminance regions consisting of a lower limit and an upper limit of analysis luminance.
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは計測対象である前記ウェル内の前記微細粒子の輝度分布をグラフ表示して、測定者が前記グラフ上で輝度領域を指定することを特徴とする。 The fine particle screening apparatus of the present invention is preferably characterized in that a luminance distribution of the fine particles in the well to be measured is displayed in a graph, and a measurer designates a luminance region on the graph.
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記ウェル内の前記微細粒子を複数回計測して、各計測の解析結果および複数回計測の解析結果から演算された演算結果に基づいて、前記回収対象候補の前記ウェルが選択されることを特徴とする。 The fine particle screening apparatus of the present invention preferably measures the fine particles in the well a plurality of times, and collects the recovery based on the analysis result of each measurement and the calculation result calculated from the analysis result of the plurality of measurements. The well of the candidate object is selected.
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記複数回計測結果から演算された前記演算結果は、同一箇所の計測結果の差分であるか、同一箇所の計測結果の比率であることを特徴とする。 The fine particle screening apparatus of the present invention is preferably characterized in that the calculation result calculated from the measurement results of the plurality of times is a difference between measurement results at the same location or a ratio of measurement results at the same location. To do.
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記各計測結果、および前記複数回の計測結果から演算された前記演算結果のそれぞれより選択した前記回収対象候補から、論理和、論理積、もしくはその組み合わせにより成る論理式を用いて前記回収対象候補の前記ウェルを決定できることを特徴とする。 The fine particle screening apparatus of the present invention is preferably a logical sum, a logical product, or a logical sum, a logical product, or the like, from each of the measurement results and the recovery target candidates selected from the calculation results calculated from the measurement results of the plurality of times. The well of the collection target candidate can be determined using a logical expression formed by combination.
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記複数回計測の各結果および前記複数回計測結果から演算された前記演算結果をグラフ表示して、各々の前記グラフ上で測定者によって輝度領域の選択が行われることを特徴とする。 The fine particle screening apparatus of the present invention preferably displays each result of the plurality of measurements and the calculation result calculated from the plurality of measurement results in a graph, and a luminance region is measured by a measurer on each graph. The selection is performed.
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記サンプルである前記微細粒子の発する蛍光輝度の経時変化によるスクリーニングを実施するため、前記複数回計測の間に時間間隔が設けられることを特徴とする。 The fine particle screening apparatus of the present invention is preferably characterized in that a time interval is provided between the plurality of measurements in order to carry out screening based on temporal changes in fluorescence luminance emitted from the fine particles as the sample. .
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記サンプルである前記微細粒子の発する蛍光輝度の特定試薬との反応性によるスクリーニングを実施するため、前記複数回計測間に試薬が供給されることを特徴とする。 The fine particle screening apparatus according to the present invention is preferably configured such that the reagent is supplied between the multiple measurements in order to perform screening based on reactivity with a specific reagent of fluorescence intensity emitted by the fine particles as the sample. Features.
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記サンプルである前記微細粒子の発する複数種類の蛍光情報によるスクリーニングを実施するため、前記複数回計測の合間に照射光もしくは蛍光の光路にて透過または反射させるためのフィルタの少なくとも1枚を自動的に切り替える機能を持つことを特徴とする。 The screening apparatus for fine particles of the present invention preferably performs screening with a plurality of types of fluorescence information emitted by the fine particles as the sample, so that it is transmitted through the optical path of irradiation light or fluorescence between the multiple measurements. It has a function of automatically switching at least one of the filters for reflection.
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、好ましくは前記回収対象候補である前記ウェルの前記微細粒子の上限個数を指定し、輝度領域の指定による前記回収対象候補の前記ウェルのうち、前記上限個数だけが回収されることを特徴とする。 The fine particle screening apparatus of the present invention preferably designates the upper limit number of the fine particles of the well that is the collection target candidate, and only the upper limit number of the wells of the collection target candidate by specifying the luminance region Is recovered.
本発明の微細粒子のスクリーニング方法は、微細粒子から発する光情報を標識として微細粒子の探索を行い、探索された微細粒子を選択的に取得するための微細粒子のスクリーニング方法であって、装置の土台となるベースと、光を透過する材料で形成され、前記微細粒子の懸濁液を注入することで、前記微細粒子が収納されるウェルが形成された計測用チップと、オートフォーカス機能を有し、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に少なくとも1つ以上の光源より導かれる光を照射することにより得られる前記微細粒子および/またはウェルに関する光情報を取得する計測部と、前記光情報を照合・解析することで、前記ウェル内に収納されている前記の各微細粒子からの光情報を抽出する解析部と、前記ベースに設置され、前記計測用チップと、前記計測用チップから選択的に取得された前記微細粒子を収容するための回収プレートとが搭載され、前記計測用チップと前記回収プレートを、前記計測部に対して第1方向と少なくとも前記第1方向と直交する第2方向に移動可能な移動部と、前記ベースに設置され、吸引・吐出キャピラリを有し、前記計測用チップと前記回収プレート間で移動可能であり、前記吸引・吐出キャピラリにより前記計測用チップに設けられた前記ウェル内の微細粒子を吸入して前記回収プレートの所定の位置に吐出して回収するための回収部と、を用い、前記光情報の解析結果から、解析輝度の下限と上限から成る1つ以上の輝度領域を指定することによって、回収対象候補の前記ウェルを選択することを特徴とする。 The fine particle screening method of the present invention is a fine particle screening method for searching for fine particles using light information emitted from the fine particles as a label, and for selectively acquiring the searched fine particles. It has a base, a measuring chip formed of a material that transmits light, and a well in which the fine particles are stored by injecting a suspension of the fine particles, and an autofocus function. And measuring to obtain optical information on the fine particles and / or wells obtained by irradiating the fine particles accommodated in the measurement chip and the measurement chips with light guided from at least one light source. And an analysis unit for extracting optical information from each of the fine particles stored in the well by collating and analyzing the optical information, A measuring plate and a recovery plate for accommodating the fine particles selectively acquired from the measuring chip are mounted on the measuring chip, and the measuring chip and the recovery plate are mounted on the measuring chip. A moving part movable in a first direction and at least a second direction perpendicular to the first direction with respect to the part, and a suction / discharge capillary installed on the base, between the measuring chip and the recovery plate A collection unit for sucking fine particles in the well provided in the measurement chip by the suction / discharge capillary, and discharging and collecting the fine particles in a predetermined position of the collection plate; And selecting the well as the collection target candidate by designating one or more luminance regions composed of a lower limit and an upper limit of the analysis luminance from the analysis result of the optical information. .
本発明によれば、全ての計測対象である細胞のような微細粒子を計測して全体の分布状況を確認した上で回収対象とする微細粒子を選択して、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる。 According to the present invention, after measuring fine particles such as cells that are all measurement objects and confirming the overall distribution status, the fine particles to be collected are selected, and a target is selected from a large number of fine particles. It is possible to efficiently search for fine particles to be selectively recovered.
以下、図面を参照して、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。
図1は、本発明の微細粒子のスクリーニング装置の好ましい実施形態を示す正面図である。図2は、図1の微細粒子のスクリーニング装置の好ましい実施形態を示す斜視図である。
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
FIG. 1 is a front view showing a preferred embodiment of the fine particle screening apparatus of the present invention. FIG. 2 is a perspective view showing a preferred embodiment of the fine particle screening apparatus of FIG.
図1と図2に示す微細粒子のスクリーニング装置1は、計測用チップ90内の複数の微細粒子(例えば生体の細胞など)に対して光を当てることで微細粒子から発する蛍光を標識として、標的とする微細粒子を探索して、回収条件を満たした微細粒子の入っているウェルにある全ての微細粒子を標的対象物として選択的に吸引して、回収プレート80に回収するための装置である。
The fine particle screening apparatus 1 shown in FIG. 1 and FIG. 2 uses a fluorescent light emitted from a fine particle as a label by applying light to a plurality of fine particles (for example, living cells) in the
図1に示す微細粒子のスクリーニング装置1は、ベース11と、支持部12と、回収部13と、計測部14と、画像解析部15と、移動部16と、を備え、図2に示すように、各部がカバー19により覆われている。カバー19は、外部からの光や異物の進入を防いでいる。なお、ベース11は、スクリーニング装置1の各要素を保持するための本体フレームである。
The fine particle screening apparatus 1 shown in FIG. 1 includes a base 11, a
図1に示すように、図1の紙面垂直方向がX方向(第1方向)であり、左右方向がY方向(第2方向)である。Z方向は、X方向とY方向に対して垂直な方向である。 As shown in FIG. 1, the vertical direction in FIG. 1 is the X direction (first direction), and the left-right direction is the Y direction (second direction). The Z direction is a direction perpendicular to the X direction and the Y direction.
ベース11は、回収部13と、計測部14と、移動部16を保持しており、ベース11はプレート部材20,21,22を有している。これらのプレート部材20,21は、複数の垂直部材23により平行に固定されており、プレート部材20,22は、複数の部材24により平行に固定されている。この部材24は、高さの調整をするとともに、振動を遮断する材質により構成されている。
The base 11 holds the collecting unit 13, the measuring unit 14, and the moving
最も上に位置するプレート部材21の上には、支持部12と支持台30が固定されている。支持部12は、プレート部材21の上においてZ方向に沿って垂直に立てて配置されている。支持台30は、脚部30Rと支持板30Pを有している。プレート部材20,21,22と支持板30Pは、Z方向に沿って相互に間隔をおいて配置されている。
On the uppermost plate member 21, the
次に、図1と図3を参照して、移動部16の構造例について説明する。
図3は、移動部16とその移動部16の上に搭載されている搭載用テーブル4と回収プレート80と計測用チップ90を示している。
Next, a structural example of the moving
FIG. 3 shows the moving
図3と図1に示すこの移動部16は、図1に示すベース11の支持台30に固定されている。移動部16は、移動対象物である搭載用テーブル40を搭載しており、この搭載用テーブル40をX方向とY方向に沿ってそれぞれ移動して位置決めすることができる。
3 and 1 is fixed to a
図3に示すように、移動部16は、第1テーブル51と第2テーブル52を有している。第1テーブル51は、図1の支持台30に固定されており、第2テーブル52をX方向に沿って移動して位置決め可能に搭載している。第2テーブル52は、搭載用テーブル4をY方向に沿って移動して位置決め可能に搭載している。
As shown in FIG. 3, the moving
図3に示すように、第1テーブル51の上面には、ガイドレール53,53と第1モータ55が設けられている。第2テーブル52の下面には、断面U字型の部材54,54とナット57が設けられている。ガイドレール53,53がそれぞれに部材54,54にかみ合っている。第1モータ55の送りねじ56は、ナット57にかみ合っている。これにより、制御部100が指令して第1モータ55を作動して送りねじ56を回転することで、第2テーブル52はX方向に沿って移動して位置決め可能である。
As shown in FIG. 3,
図3に示すように、第2テーブル52の上面には、ガイドレール63,63と第2モータ65が設けられている。搭載用テーブル40の下面には、断面U字型の部材64,64とナット67が設けられている。ガイドレール63,63がそれぞれに部材64,64にかみ合っている。第2モータ65の送りねじ66は、ナット67にかみ合っている。これにより、制御部100が指令して第2モータ65を作動して送りねじ66を回転することで、搭載用テーブル40はY方向に沿って移動して位置決め可能である。
As shown in FIG. 3,
図3に示すように、第1テーブル51は第1開口部59を有しており、第2テーブル52は第2開口部69を有しており、さらに搭載用テーブル40は第3開口部79を有している。これらの第1開口部59と第2開口部69と第3開口部79は、第2テーブル52がX方向に移動し、搭載用テーブル40がY方向に移動しても常に重なるような大きさを有しており、計測部14の対物レンズ110側からの光(照射光)Lを、搭載用テーブル40の上の計測用チップ90の微細粒子に対して導くための開口部である。
As shown in FIG. 3, the first table 51 has a
これにより、第2テーブル52がX方向に移動し搭載用テーブル40がY方向に移動しても、対物レンズ110側からの光Lは、第1開口部59と第2開口部69と第3開口部79を通過して、搭載用テーブル40上の計測用チップ90の微細粒子に対して照射され、微細粒子から蛍光を発生させることができる。
As a result, even if the second table 52 moves in the X direction and the mounting table 40 moves in the Y direction, the light L from the
なお、図3に示す移動部16の搭載用テーブル40は、モータと送りネジを用いてX、Y方向に移動可能であるが、これに限らずリニアモータなどを用いても良い。
The mounting table 40 of the moving
図4は、搭載用テーブル40と回収プレート80と計測用チップ90を示している。図4に示すよう、搭載用テーブル40は、例えば長方形状の板状部材であり、この搭載用テーブル40の搭載面70の上には回収プレート80と計測用チップ90が着脱可能にY方向に沿って並べて搭載できる。
FIG. 4 shows the mounting table 40, the
回収プレート80は、板状の部材であり、回収プレート80には多数のウェル81がX方向とY方向に沿って等間隔をおいてマトリックス状に配列されている。これらのウェル81は、生物の細胞のような微細粒子が吸引・吐出キャピラリ140から順次排出されてくるときに、順次排出されてくる微細粒子が別々に回収して格納することができる微細粒子回収格納部である。ウェル81は、例えば断面でみて、ほぼU字型の凹部あるいはカップ型の凹部である。
The
図4に示す計測用チップ90は、固定具120により固定されており、この固定具120は、搭載用テーブル40の所定の位置に位置決めして固定されている。
The
図5は、計測用チップ90とこの計測用チップ90の固定具120の形状例を示す断面図である。
FIG. 5 is a cross-sectional view showing an example of the shape of the
この固定具120は、計測用チップ90を搭載用テーブル40の搭載面70に対して一定の高さの基準面CLの位置で固定して保持するためのものである。図5の例では、固定部材120は、第1ケース部121と第2ケース部122と弾性部材123を有している。弾性部材123は例えば長方形のリングであり、弾性部材123は第2ケース部122の内側のフラット面126に固定されている。
The
計測用チップ90は、第1ケース部121と第2ケース部122の間に配置されており、計測用チップ90が弾性部材123によりZ1方向に押し上げられることで、計測用チップ90の上面90Sは、第1ケース部121のフラットな内面124に対して突き当てられている。
The
これにより、計測用チップ90の上面90Sは常に位置精度の出た基準面124に押し付けられて、計測用チップ90の上面90Sは基準面CLに位置決めすることができるので、例えば計測用チップ90の厚みのバラツキや反りがあったとしても、厚みのバラツキの影響や反りの影響を低減することができる。
As a result, the
従って、計測用チップ90の上面90Sと、計測部14の対物レンズ110および回収プレート80とのZ方向に関する距離を正確に管理できる。言い換えれば、図7に示す計測用チップ90のウェル200内の微細粒子Mの位置と、計測部14の対物レンズ110および回収プレート80との距離を正確に管理できる。
Therefore, the distance in the Z direction between the
第1ケース部121は第2ケース部122に対して例えばヒンジ機構部を用いて開閉することができ、これにより、固定具120内の計測用チップ90を取り出して、新たな計測用チップ90と交換することができる。
The
次に、図3、図5および図7を参照して計測用チップ90について説明する。
計測用チップ90の形状例は、図7(A)に例示しており、計測用チップ90は透光性を有する材料、例えばガラスやプラスチックにより作られている。
Next, the
An example of the shape of the
図3と図5に示す計測用チップ90は、光を透過する材料で形成され、例えば長方形の板状部材であり、複数の微細粒子をそれぞれ格納するために複数のウェル200がX方向とY方向に沿って等間隔をおいてマトリックス状に配列されている。図5に示すように、各ウェル200は、微細粒子の懸濁液500を分注もしくは一括注入することで、微細粒子Mの少なくとも1個が格納され得る大きさを持つ。
The
計測用チップ90の上面90Sには、ウェル200の深さよりも浅い複数の凹部が形成されていることが望ましい。この浅い複数の凹部は、計測用チップ90のZ方向に関する位置を、計測部14がオートフォーカスするための基準に用いられる。すなわち、計測用チップ90の上面のウェル以外の部分にオートフォーカス用のマーキングとしての凹部が形成されるが、画像処理によるコントラスト解析の際にその凹部の深さはなるべく急峻で浅い方が好ましく、例えば3μm以下が好ましい。凹部は、計測用チップ90の上面の決まった位置に形成してもよいし、ランダムに形成してもよいが、凹部の形成位置は、計測対象の吸着性などを考慮して決定すべきである。
It is desirable that a plurality of recesses shallower than the depth of the well 200 be formed on the
図1と図5に示すように計測用チップ90は、移動部16に対して、固定具120を用いて固定されている。この固定具120は、少なくとも計測用チップのウェル200の形成されている側の面と接する面(以下、基準面)124が、計測用チップ90よりも剛性の高い材質で形成されている。計測用チップ90は、ウェル200が形成されている上面90Sを固定具120の基準面CLに当接させ、ウェル200の形成されている側と反対の面から弾性を有する弾性部材123によって押し付ける。また、シール部材222が固定具120の基準面CLと計測用チップ90の上面90Sの間をシールしている。この固定構造により、計測用チップ90自体の反りを矯正するとともに、固定具90に対する位置決めを行ない、更に計測用チップ90上面90Sより滴下する懸濁液500がもれないように確実にシールすることができる。
As shown in FIGS. 1 and 5, the measuring
図7(A)に例示するように、各ウェル200は、生物細胞のような微細粒子Mを格納するための微細粒子回収格納部であり、例えば断面形状は、ほぼU字型の凹部あるいはカップ型の凹部である。各ウェル200には、複数の微細粒子Mが格納されるようになっており、計測用チップ90の上面90Sには懸濁液500の膜が形成されている。各ウェル200の直径Dは例えば10μmであり、各ウェル200はX方向とY方向に例えばそれぞれ500個配列されている。
As illustrated in FIG. 7A, each well 200 is a fine particle collection and storage unit for storing fine particles M such as biological cells. For example, the cross-sectional shape is a substantially U-shaped recess or cup. It is a recess of the mold. Each well 200 stores a plurality of fine particles M, and a film of the
次に、図1と図6を参照して、回収部13の構造例を説明する。
図1に示す回収部13は、ベース11に配置され、X方向とY方向に対して直交するZ方向に移動して位置決め可能な吸引・吐出キャピラリ140を有しており、吸引・吐出キャピラリ140により、図5に例示する輝度条件を満たした微細粒子M1が収納されているウェル200内の微細粒子全数を吸入して回収プレート80の所定の位置に吐出して回収する。
Next, with reference to FIG. 1 and FIG. 6, the structural example of the collection | recovery part 13 is demonstrated.
The recovery unit 13 shown in FIG. 1 includes a suction /
回収部13は、X方向とY方向に対して直交するZ方向に移動して位置決め可能な吸引・吐出キャピラリ140を有しており、この吸引・吐出キャピラリ140により前記輝度条件を満たした微細粒子M1が収納されているウェル内の微細粒子全数Mを吸入して回収プレート80の所定の位置に吐出して回収するためのものである。
The collection unit 13 has a suction /
図6に示すように、回収部13は、操作部130と基部131を有しており、基部131は支持部12に固定されている。操作部130は、吸引ポンプ133と、吸引・吐出キャピラリ140を備えている。吸引・吐出キャピラリ140はZ2方向(下方向)に沿って先細り状の中空部材であり、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142は、図1と図5に示すように、計測用チップ90のウェル200に接近されるようになっており、吸引・吐出キャピラリ140の後端部143は吸引ポンプ133に接続されている。
As shown in FIG. 6, the collection unit 13 includes an
図6に示すように、モータ251の送りねじ252が操作部130のナット253にかみ合っており、制御部100がモータ251を作動させて送りねじ252を回転することで、ナット253とともに操作部130をZ方向(Z1方向とZ2方向)に沿って上下移動して位置決めすることができる。
As shown in FIG. 6, the
これにより、図6の回収部13はZステージと呼ぶことができ、図3の移動部16はX・Yステージとも呼ぶことができる。
Accordingly, the collection unit 13 in FIG. 6 can be called a Z stage, and the moving
次に、図1を参照して、計測部14および解析部15を説明する。
図1に示す計測部14は、計測用チップ90の複数のウェル200が含まれる領域に対して光Lを照射することで、その領域内の微細粒子Mから蛍光を発生させて、その蛍光を受光する。受光した微細粒子Mからの蛍光は、画像解析部15により画像解析する。画像解析部15は、各ウェル200内の複数の微細粒子Mの内の、少なくとも最大輝度の蛍光を発する微細粒子M1の蛍光強度を算出する。
Next, the measurement unit 14 and the
1 irradiates light L to a region including a plurality of
これにより、X方向とY方向で構成される平面内において、回収条件を満たした最大輝度の蛍光を発する微細粒子M1が収納されているウェル200の位置を制御部100が認識する。制御部100は、図3に示す第1モータ55と第2モータ65に対して制御駆動信号を与えることで、移動部16上の計測用チップ90のウェル200を、吸引・吐出キャピラリ140の真下に位置させることができる。つまり、吸引・吐出キャピラリ140は、ウェル単位でそのウェル内の微細粒子を吸引することができるようになっている。吸引・吐出キャピラリ140は、回収条件を満たした微細粒子の入っているウェルにある全ての微細粒子を吸引する。吸引・吐出キャピラリ140は、複数のウェルの内の選択されたウェル、すなわち回収条件を満たした微細粒子の入っているウェル内から全ての微細粒子を吸引することができる。
As a result, the
図1に示す計測部14は、計測用チップ90および計測用チップ90に収容された微細粒子Mに少なくとも1つ以上の光源より導かれる光を照射することによって、透過光もしくは反射光による形状および位置情報、および蛍光・化学発光等の輝度情報を個々の微細粒子の平均サイズより細かい分解能で取得するとともに、計測チップ自体の形状や、計測用チップ90上に配置されたウェル200の位置や大きさ等の情報を取得する。
The measurement unit 14 shown in FIG. 1 irradiates the
図1に示す画像解析部15は、計測された形状情報および光情報を解析することで、少なくとも各ウェル200内に、測定者によって設定できる輝度条件を満たす微細粒子M1が1個以上存在することを確認するためのデータを取得する。そして、微細粒子のスクリーニング装置1は、透過光もしくは反射光によるウェル200の位置認識情報と蛍光・化学発光の光情報とを合わせ照合することにより微細粒子からの光情報を特定し、さらに計測部14はオートフォーカス機能を有し、合焦した状態で計測を行なうとともに、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142と計測用チップ90上面との位置関係を、両者に対するオートフォーカスの実施により判断することができる。
The
図1に示すように、計測部14は、対物レンズ110を有しており、対物レンズ110は計測用チップ90に対して光を導く。対物レンズ110は、計測用チップ90と移動部16の下方に配置されており、吸引・吐出キャピラリ140は、計測用チップ90と移動部16の上方に配置されている。これにより、計測用チップ90とその移動部16は、対物レンズ110と吸引・吐出キャピラリ140の間に配置させることができる。
As shown in FIG. 1, the measurement unit 14 includes an
図1の計測部14では、励起光源260は、例えばレーザ光源や水銀ランプを採用できる。シャッターユニット261は、励起光源260と蛍光フィルタユニット262の間に配置されており、シャッターユニット261は計測用チップ90の微細粒子Mに対して光Lを照射しない場合には、励起光源260の発生する光Lが蛍光フィルタユニット262の手前で遮断することができる。
In the measurement unit 14 of FIG. 1, for example, a laser light source or a mercury lamp can be used as the
図1に示す計測部14についてさらに説明する。
図1に示すように、計測部14は、少なくとも、光源としての励起光源260と、光源より照射される光のうち所望の励起波長帯域のみを選択するための光学フィルタ(励起フィルタ)720と、計測用チップ90からの光情報の所望の波長帯域のみを選択するための光学フィルタ(蛍光フィルタ)721と、励起光と光情報との波長帯域の差によって光路を切り替えるためのダイクロイックミラー751から構成される少なくとも1つの蛍光フィルタユニット262と、励起光源から出射された光を計測用チップ90に導くとともに計測用チップ90から得られる光情報を収集するための対物レンズ110と、対物レンズ110を光軸方向に可動させるオートフォーカス機能を持つフォーカスユニット265と、計測対象からの光情報を検出するための光検出部としての受光部266と、から構成される。図1に示すように、蛍光フィルタユニット262と受光部266は、蛍光落射ユニット750に固定されている。
The measuring unit 14 shown in FIG. 1 will be further described.
As shown in FIG. 1, the measurement unit 14 includes at least an
さらに、計測部14はハーフミラー(図示せず)を有しており、ハーフミラーと蛍光フィルタユニット262とを切り替えることで、光源260からの光の一部を観察対象に照射すると同時に、観察対象からの反射光の一部を光検出部である受光部266に導くことによって、計測用チップ90の上面90Sおよびこの上面90Sに形成されたウェル200の形状および位置情報を計測することができる。なお、ハーフミラーとは、一般的に入射された光を50%強度ずつ分光する機能を有する光部品であるが、この実施形態では、分光の光強度を必ずしも50%にする必要はない。ただし、受光部266に入射される光強度は、大きい方ほど測定精度が向上するため、受光部266に分光される光強度が大きい分岐ミラーを使用する方が好ましい。
Furthermore, the measurement unit 14 includes a half mirror (not shown), and by switching between the half mirror and the fluorescent filter unit 262, the observation target is irradiated with a part of the light from the
蛍光フィルタユニット262では、光源260からの光が光学フィルタ720(励起フィルタ)によって励起光の波長成分のみが透過され、ダイクロイックミラー751で反射(透過)されて対物レンズ110に入射され、計測用チップ90に照射される。計測用チップ90から反射光として戻ってくる光は、再びダイクロイックミラー751で反射(透過)するため、光源260側に戻って行き、受光部266側には向かわない。
In the fluorescence filter unit 262, only the wavelength component of the excitation light is transmitted through the optical filter 720 (excitation filter), reflected (transmitted) by the
一方、蛍光については励起光よりも波長が長いためダイクロイックミラー751を透過(反射)し、さらに光学フィルタ721(蛍光フィルタ)によって検出したい波長帯域のみが、検出部(CCDカメラなど)である受光部266に伝播される。すなわち、蛍光フィルタユニット262を用いる場合、基本的に反射光は検出部まで伝播されず、検出することが困難である。なお、反射光によって計測チップ表面、ウェル、および回収部先端の形状や位置を計測する場合は、蛍光フィルタユニット262の代わりにハーフミラーのみを用いることとする。このようにハーフミラーを用いる場合には、ダイクロイックミラー751の場所にハーフミラーを置き、他2つの光学フィルタ720,721は基本的に必要ないが、蛍光フィルタユニットにおける励起フィルタに対応する位置のフィルタとして計測対象の蛍光を退色させにくい波長を選択透過するフィルタを用いるのが更に好ましい。
このようにハーフミラーを用いた、反射光による位置情報の計測には、蛍光計測と共通の光源を用いることができるという利点がある。このことは計測機能と回収機能を持つスクリーニング装置に限らず、計測のみの装置であっても共通の利点である。
On the other hand, since the wavelength of fluorescence is longer than that of the excitation light, the light receiving unit that transmits (reflects) the
Thus, the measurement of position information by reflected light using a half mirror has an advantage that a light source common to fluorescence measurement can be used. This is not limited to a screening apparatus having a measurement function and a recovery function, and is a common advantage even in an apparatus that only measures.
図1に示す計測部14の複数の対物レンズ110,264は、例えばレボルバー式で回転することで、必要な倍率の対物レンズを計測用チップ90の下方位置に位置決めすることができる。フォーカスユニット265は、例えば制御部100からの指令によりモータ265Mを作動することで、計測用チップ90の下方位置に配置された例えば対物レンズ110をZ方向に沿って移動して位置決めすることで、計測用チップ90の微細粒子Mに対する対物レンズ110のフォーカス調整を行うことができる。
The plurality of
図1に示すように、計測部14では、光源260とは別に計測用チップ90の上方に複数の光源250を備える。光源250は、計測用チップ90の上面90Sと垂直な軸に対して対称な2つ以上の方向より光を照射する。計測用チップ90からの透過光によって計測用チップ90の上面90Sおよびこの上面90Sに形成されたウェル200等の形状および位置情報を計測することができる。この計測においても蛍光フィルタは不要であるが、ダイクロイックミラーと蛍光フィルタを通っても十分な光量が残るように光源波長と光量を選択することで、光路に蛍光フィルタユニットを配置したまま、これを除去したり切り替えたりしなくても観察が可能という利点がある。
As shown in FIG. 1, the measurement unit 14 includes a plurality of
計測部14は、計測データのコントラスト値を指標としたオートフォーカス機能を有し、計測時に透過光もしくは反射光によるオートフォーカスによって計測用チップ90の上面90Sへの合焦を維持するともに、反射光によって吸引・吐出キャピラリ140先端部142のオートフォーカスを行なうことで、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142の計測視野内の位置、および計測チップ面との距離を計測することができる。
The measurement unit 14 has an autofocus function using the contrast value of the measurement data as an index, maintains the focus on the
微細粒子のスクリーニング装置1は、光情報が蛍光であって、反射光もしくは透過光による形状情報計測による計測用チップ90のウェル200の位置情報と、励起光による光情報計測による微細粒子からの蛍光情報の両方を用いて計測・解析を行い、励起光を照射することによる蛍光計測を実施した後に、同一視野における透過光計測を実施する。すなわち、微細粒子のスクリーニング装置1では、蛍光計測データのうち、形状情報によって特定されるウェル200の位置の部分のみの解析を行なう。その際、形状情報の計測を先に行なうと、計測対象である微細粒子の蛍光が退色してしまい、正確な情報の取得ができなくなるために、蛍光輝度を反射光もしくは透過光による形状情報計測よりも先に計測することが有効である。
In the fine particle screening apparatus 1, the light information is fluorescence, and the position information of the well 200 of the
更に励起光を計測用チップ90上の複数のウェル200を含む領域に照射することによって、1視野で複数のウェル200を含む領域内に存在する微細粒子を計測する。この時に、実質的に自家蛍光の均質な部材に励起光を照射した際に光検出部である受光部266によって検出される輝度分布を用いて微細粒子からの蛍光計測値の補正を行なう時には、前記輝度分布の複数ピクセルの平均化処理、もしくは周波数フィルタによって画素ノイズの除去を行う。
Further, by irradiating the region including the plurality of
補正データの取得方法としては、例えば自家蛍光の均質な部材として計測用チップ90を用いて、微細粒子の懸濁に用いる液体のみを注入した状態で励起光強度分布を取得する方法や、実際の計測結果からウェル200以外の部分の輝度分布を抽出し、このデータを補完することによって計測視野全面の輝度分布を取得する方法、更にはチップ面の中で前記ウェルの形成されていない部分の輝度情報を取得する方法などがある。更には微細粒子を含んだ計測情報から、データ処理によって計測視野全面の輝度分布に対する微細粒子の影響を低減させた結果を用いることもできる。
As a method for acquiring correction data, for example, using a
自家蛍光の均質な部材としては、計測用チップを用いてウェルの形成されていない部分の輝度分布を取得するものである。 As the autofluorescent homogeneous member, a luminance distribution of a portion where no well is formed is obtained using a measurement chip.
補正の対象となるのは、計測視野内に照射される励起光の強度分布(不均一性)だけではなく、レンズやフィルタ等の各光学系の透過効率等による検出効率の不均一性もある。これらの不均一性は、励起光自体の径方向分布、および励起光及び蛍光を導くレンズ等の光学部品の径方向分布への依存性が高いため、取得した輝度分布を処理することで輝度の高周波成分を除去することが好ましい。仮に元画像が微細粒子を含む計測情報から得られたものであっても、処理の過程において微細粒子の輝度の影響を実質的に取り除くことができるため、必要精度によっては予め補正用情報を取得しておくのではなく、計測と同時に補正することが可能である。処理方法としては、平均化、周波数解析、クラスター解析等を用いたデータ処理等を用いることが考えられる。これらの複数の手法は、求められる補正精度によって選択すべきである。 The target of correction is not only the intensity distribution (non-uniformity) of the excitation light irradiated in the measurement field of view, but also the non-uniformity of detection efficiency due to the transmission efficiency of each optical system such as a lens or filter. . These non-uniformities are highly dependent on the radial distribution of the excitation light itself and the radial distribution of optical components such as lenses that guide the excitation light and fluorescence. It is preferable to remove high frequency components. Even if the original image is obtained from measurement information containing fine particles, the effect of fine particle brightness can be substantially eliminated during the process, so depending on the required accuracy, information for correction can be obtained in advance. Rather than doing so, it is possible to correct simultaneously with the measurement. As a processing method, it is conceivable to use data processing using averaging, frequency analysis, cluster analysis, or the like. These multiple methods should be selected according to the required correction accuracy.
図1において、シャッターユニット261のシャッターを開けると、励起光源260の光は、蛍光フィルタユニット262の蛍光フィルタ720で励起波長帯域のみ透過し、ダイクロイックミラー751で反射され、対物レンズ110を透過して、計測用チップ90に照射される。これにより、計測用チップ90内の微細粒子Mが例えば蛍光を発生すると、その蛍光はダイクロイックミラー751を透過し、蛍光フィルタ721で任意の波長帯域のみ透過して受光部266により受光されて、光信号―電気信号変換されて画像解析部15によりその蛍光が画像解析される。
In FIG. 1, when the shutter of the shutter unit 261 is opened, the light of the
次に、図1に示す微細粒子のスクリーニング装置1を用いて、計測用チップ90のウェル内における蛍光を発する微細粒子を含む全数の微細粒子を、他のウェル内の微細粒子からは選択して吸引して回収プレート80に回収するスクリーニング方法の一例について、図7〜図9を参照しながら説明する。
Next, using the fine particle screening apparatus 1 shown in FIG. 1, the total number of fine particles including the fine particles emitting fluorescence in the well of the
図7(A)は、計測用チップ90の一部分を示す断面図であり、計測用チップ90のウェル200内にはまだ微細粒子は入っていない。図7(B)は、計測用チップ90の各ウェル200内に複数の微細粒子Mが配置された状態を示している。
FIG. 7A is a cross-sectional view showing a part of the
図8(A)は、ウェル200内の複数の微細粒子Mに光(照射光、励起光)Lが照射されて複数の微細粒子Mが蛍光を発するが、特に最大輝度の蛍光を発する微細粒子M1が蛍光を発している例を示す。図8(B)は、吸引・吐出キャピラリ140が各ウェル200に対して順番に近づいて、最大輝度の蛍光を発している微細粒子M1を含む全数の微細粒子Mを吸引して回収する様子を示す。
FIG. 8A shows a case where a plurality of fine particles M in the well 200 are irradiated with light (irradiation light, excitation light) L, and the plurality of fine particles M emit fluorescence. An example in which M1 emits fluorescence is shown. FIG. 8B shows a state in which the suction /
図9は、最大輝度の蛍光を発している微細粒子M1を含む全ての微細粒子を計測用プレート90のウェル200から吸引して、回収プレート80のウェル81に対して回収する例を示す。
FIG. 9 shows an example in which all the fine particles including the fine particles M1 emitting fluorescence with the maximum luminance are sucked from the well 200 of the
図1に示すように、搭載用テーブル40の搭載面70には、回収テーブル80と計測用チップ90の固定具120がそれぞれ所定の位置に配置されている。固定具120は、対物レンズ11の上方位置に配置されている。吸引・吐出キャピラリ140は、計測用チップ90の上に位置されている。
As shown in FIG. 1, on the mounting
励起光源260の光は、上述したように対物レンズ11まで伝播され、光Lとして計測用チップ90に照射される。これにより、図8(A)に示す計測用チップ90内の複数の微細粒子Mが蛍光を発生するが、これらの複数の微細粒子Mの蛍光は、上述したように、ダイクロイックミラー751を通過して光学フィルタ(蛍光フィルタ)721によって検出したい波長帯域のみ透過されて受光部266により受光されて、光信号―電気信号変換されて画像解析部15によりその蛍光が画像解析される。
The light from the
画像解析部15では、各ウェル200内の複数の微細粒子Mの内の、少なくとも最大輝度の微細粒子M1の蛍光強度を解析する。この解析結果を基に、輝度条件を満たす微細粒子を、その微細粒子が収納されたウェル200から回収することになる。
The
画像解析部15の結果から、制御部100では、最大輝度の微細粒子M1の収納されているウェルの位置情報を基にして、図3に示す制御部100が指令して第1モータ55を作動することで、第2テーブル52をX方向に沿って移動して位置決めし、第2モータ65を作動することで、搭載用テーブル40をY方向に沿って移動可能および位置決めする。そして、図6に示す制御部100が指令してモータ251を作動することで、吸引・吐出キャピラリ140がZ2方向に下降する。
Based on the result of the
これにより、吸引・吐出キャピラリ140は、その先端部142を、図8(B)に示すように、計測用プレート90の各ウェル200に近づけて、任意の1つのウェルに位置決めすることができる。
As a result, the suction /
その後、図9に示すように、制御部100が指令して吸引ポンプ133を作動することで、吸引・吐出キャピラリ140が、最大輝度の蛍光を発している微細粒子M1を含めた全数の微細粒子Mを有するウェル200から、微細粒子M1を含めた全数の微細粒子Mを他のウェル200の微細粒子とは区別して選択的に吸引する。
Thereafter, as shown in FIG. 9, when the
さらに、図6に示す制御部100が指令してモータ251を作動することで、吸引・吐出キャピラリ140がZ1方向に上昇する。図3に示す制御部100が指令して第1モータ55を作動することで、第2テーブル52をX方向に沿って移動して位置決めし、第2モータ65を作動することで、搭載用テーブル40をY方向に沿って移動して位置決めすることで、吸引・吐出キャピラリ140が、回収プレート80の任意のウェル81上に相対的に移動して位置決めされる。そして、図6に示す制御部100が指令してモータ251を作動することで、吸引・吐出キャピラリ140がZ2方向に下降すると、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142が回収プレート80のあらかじめ定められた位置のウェル81に近づく。
Furthermore, when the
このウェル81には予め培養液などの液体LDが入れられており、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142がこの液体LDの中に入るようになっている。
The well 81 is preliminarily filled with a liquid LD such as a culture solution, and the
吸引ポンプ133を逆に作動することで、吸引・吐出キャピラリ140がその微細粒子M1を含めた全数の微細粒子Mを回収プレート80のあらかじめ定められた位置のウェル81の液中に排出できる。これによって、最大輝度の蛍光を発している微細粒子M1を含めた全数の微細粒子Mは回収プレート80のウェル81内に回収することができる。
By operating the
上述した最大輝度の蛍光を発している微細粒子M1を含む全数の微細粒子の吸引および回収動作は、計測用チップ90の、回収条件を満たした微細粒子が収納されている各ウェル200について順番に行う。
The above-described suction and collection operations for all the fine particles including the fine particles M1 emitting fluorescence with the maximum luminance are performed in order for each well 200 of the
このようにして、各ウェル200内の蛍光を発している微細粒子M1を含む全数の微細粒子は、移動部16による計測用チップ90のX方向とY方向の移動操作と、回収部13による吸引・吐出キャピラリ140のZ方向の上下移動操作により、確実かつ効率よく、回収プレート80のあらかじめ定められた位置のウェル81から回収することができる。この結果、多くの数の微細粒子から標的とする微細粒子を効率良く探索して選択的に効率よく回収することができる。
In this way, the total number of fine particles including the fine particles M 1 emitting fluorescence in each well 200 is moved by the moving
本発明の微細粒子のスクリーニング装置1では、吸引・吐出キャピラリ140は、計測用チップ90に対して垂直方向(Z方向)に移動して計測用チップ90の各ウェル200に対して接近する。これにより、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142は、各ウェル200に対して確実に近づいて、標的とする微細粒子M1を含む全数の微細粒子をウェル200内から、他のウェル内の微細粒子とは区別して吸引して回収できる。
In the fine particle screening apparatus 1 of the present invention, the suction /
図10は、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142の高さ合わせ用基準面の例を示している。この高さ合わせ用基準面890は、固定具121に設定されており、計測用チップ90面からの高さが既知である。この高さ合わせ用基準面890は、固定具121の内面124に一致している。図1に示す対物レンズ110はこの高さ合わせ用基準面890にフォーカスをあわせ、その位置に対物レンズ110を保持したまま、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142にフォーカスが合う位置まで回収部13を移動させる。これにより、計測用チップ90の上面90Sとの距離を確定し、このときの回収部13の位置座標からの相対移動によって、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142は計測用チップ90の上面90Sから所望の距離VだけZ2方向に沿って位置891まで下降して上面90Sに接近させる。これにより、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142は、高さ合わせ用基準面890を利用してZ方向に沿って確実に位置合わせすることができる。
FIG. 10 shows an example of a reference surface for height adjustment of the
図11は、吸引・吐出キャピラリ140によりシリンジ方式によって微細粒子を回収した際の回収成功率を示す。回収成功率の定義は、回収目的のウェル内のすべての微細粒子が吸引・吐出キャピラリ140により回収され、隣接するウェルからは1つの微細粒子も回収されない確率を言う。
FIG. 11 shows the recovery success rate when the fine particles are recovered by the syringe method using the suction /
試行回数は各条件で10回とし、吸引はストローク制御によるものである。吸引量は各条件で回収率が最大になる条件とした。吸引速度は一定とした。吸引対象は、PBS(Phosphate buffered saline、リン酸緩衝生理食塩水)中の固定化酵母細胞を使用した。ウェル径は約10μmであり、ウェルピッチは約30μmである。計測用チップへの吸引・吐出キャピラリ140の接近距離(間隔)を、10,20,30,40μmの4条件とし、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142の内径を、10,20,30,40μmの4条件とした。
The number of trials is 10 under each condition, and suction is by stroke control. The amount of suction was set such that the recovery rate was maximized under each condition. The suction speed was constant. As the suction target, immobilized yeast cells in PBS (Phosphate buffered saline) were used. The well diameter is about 10 μm and the well pitch is about 30 μm. The approach distance (interval) of the suction /
図11を参照すると、計測用チップへの接近距離(μm)が小さいほど回収成功率が高く、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142の内径(μm)が小さいほど回収成功率が高かった。
Referring to FIG. 11, the recovery success rate is higher as the approach distance (μm) to the measurement chip is smaller, and the recovery success rate is higher as the inner diameter (μm) of the
すなわち、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142の内径は、ウェルの直径の2倍以下であることが好ましく、計測用チップへの接近距離は、ウェルピッチ以下であることが好ましい。このようにすることで、吸引・吐出キャピラリ140は、シリンジ方式によって対象となるウェルから微細粒子をより確実に回収できる。
That is, the inner diameter of the
計測視野内での吸引・吐出キャピラリ140の先端部142を記録し、移動部16によって計測用チップ90の回収対象のウェル側をこのキャピラリ先端位置に合わせるようにすることで、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142の中心とウェルの中心を合わせる。これにより、より確実にウェル内の全数の微細粒子を回収することができる。
The suction /
吸引・吐出キャピラリ140により微細粒子を吸引する際に、吸引量を制御する場合、吸引速度を一定、もしくは引き始めの吸引速度を基準として、吸引途中で段階的にもしくは連続的に速度を低下させる。すなわち、微細粒子の種類によっては、微細粒子がウェル壁面に吸着している場合があり、この吸着力に勝るだけの吸引力が必要になるが、一度吸着が剥がれれば、それ以後はそれほどの吸引力は必要なくなる。逆に、その後は隣接するウェルからの誤吸引を防止するために、吸引力を減じる必要がある。このように、吸引する際に、吸引力を制御することで、微細粒子をウェル内から確実に吸引することができる。
When the amount of suction is controlled when the fine particles are sucked by the suction /
なお、図9に示すように、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142内には、液体の一例である懸濁液500を予め充填することができる。このように先端部142に液体を予め入れておかないと、回収部13の気密性が完全でない限り、毛細管現象によって、吸引・吐出キャピラリ140の先端部142から液体が流入してくる。液体の流入のスピードは回収部13の気密性の度合いに依存するが、最終的な流入量は、吸引・吐出キャピラリ140と液体の物性と吸引・吐出キャピラリ140の径にのみ依存し、流入した液体の重さとつりあいの位置まで入ってくる。このため、液体と一緒に不要な微細粒子も流入してしまう。入れておく液体は、実際に計測微粒子を懸濁するのに用いるものが好ましいが、この限りではない。
As shown in FIG. 9, the
充填量としては、溶液の物性(粘度・密度)、吸引・吐出キャピラリ140と溶液との親和性、及びキャピラリの内径によって決まる、毛細管現象によるつりあい位置のレベルが望ましいが、充填量に誤差がある場合でも流入のスピードを下げることができ、吸引・吐出動作の精度を上げることができる。
The filling amount is preferably a balance position by capillary action, which is determined by the physical properties of the solution (viscosity / density), the affinity between the suction /
図12は、微細粒子の光信号を1回計測した場合のグラフ例を示す図である。図12に示す例では、縦軸には微細粒子の蛍光の輝度を検出した度数を示し、横軸には計測値(輝度)を示している。
図1の画像解析部15は、図12に示す1つのグラフ860の計測結果において計測曲線MK1を表示しており、この計測曲線MK1に対しては、任意に輝度領域TR1と輝度領域TR2を指定することができる。輝度領域TR1は下限871と上限872によりなる領域であり、輝度領域TR2は下限873と上限874によりなる領域である。これらの輝度領域TR1と輝度領域TR2は、それぞれ微細粒子の回収対象FH1と回収対象FH2となる。
FIG. 12 is a diagram illustrating an example of a graph when the optical signal of fine particles is measured once. In the example shown in FIG. 12, the vertical axis indicates the frequency at which the fluorescence intensity of the fine particles is detected, and the horizontal axis indicates the measured value (luminance).
The
このように図1の画像解析部15は、微細粒子の光情報の解析の結果から、グラフ860を提供し、これに対して測定者が解析輝度の下限と上限からなる1つ以上の輝度領域を設定することによって、回収対象候補のウェルを指定することができる。すなわち図12のグラフ860は、計測対象の輝度分布をグラフ表示しており、このグラフ860を用いて容易に回収対象とする微細粒子の輝度領域を指定することができる。
As described above, the
図13は、微細粒子の光信号を複数回計測した場合のグラフ例を示す図である。図13に示す例では、縦軸には微細粒子の蛍光の輝度を検出した度数を示し、横軸には計測値(輝度)を示している。
図13に示す例では、図1の画像解析部15は、3つのグラフ881,882,883を提供する。グラフ881は計測結果(1)を示し、グラフ882は計測結果(2)を示し、さらにグラフ883は計測結果(1)、(2)の演算結果(3)を示している。
FIG. 13 is a diagram illustrating an example of a graph when the optical signal of fine particles is measured a plurality of times. In the example shown in FIG. 13, the vertical axis represents the frequency at which the fluorescence brightness of the fine particles is detected, and the horizontal axis represents the measured value (brightness).
In the example shown in FIG. 13, the
図13の例では、同一のサンプル(微細粒子)を複数回(この例では2回)計測して、各計測の解析結果(1)、(2)、および複数回計測の解析結果から演算された演算結果(3)に基づいて、回収対象を選択することができる。 In the example of FIG. 13, the same sample (fine particles) is measured a plurality of times (in this example, twice), and is calculated from the analysis results (1) and (2) of each measurement and the analysis results of the plurality of times of measurement. Based on the calculation result (3), the collection target can be selected.
図13(A)に示す計測結果(1)は、図12に示す計測結果と同じものである。図13(B)に示す計測結果(2)では、計測曲線MK2に対して輝度領域TR3が設定されている。輝度領域TR3は、下限888と上限889によりなる領域である。図13(C)に示す演算結果(3)は、図13(A)に示す計測結果(1)と図13(B)に示す計測結果(2)の演算結果(差分)を示しており、計測曲線MK3に対して輝度領域TR4が設定されている。輝度領域TR4は、下限898と上限899によりなる領域である。すなわち、複数回の計測結果から演算された結果は、同一箇所(同一ウェル)の計測結果の差分である。図13(A)に示す計測結果(1)、図13(B)に示す計測結果(2)、そして図13(C)に示す演算結果(3)は、1つ以上の論理和あるいは論理積を用いて任意に組み合わせて、ウェル内の微細粒子の回収対象を選択して決定することができる。図13(A)に示す計測結果(1)、図13(B)に示す計測結果(2)は、同じサンプルにおいて計測する条件が異なっている、例えば経過時間や、特定の試薬を滴下する前か後か、等の条件が異なっている場合の計測例である。例えば図13(A)に示す計測結果(1)、図13(B)に示す計測結果(2)、そして図13(C)に示す演算結果(3)のそれぞれにて設定される輝度領域の全てを満たす条件のウェル内の微細粒子を回収対象とすることができる。
The measurement result (1) shown in FIG. 13A is the same as the measurement result shown in FIG. In the measurement result (2) shown in FIG. 13B, the luminance region TR3 is set for the measurement curve MK2. The luminance region TR3 is a region having a
上述した例では、図13(C)に示す演算結果(3)は、図13(A)に示す計測結果(1)と図13(B)に示す計測結果(2)の演算結果(差分)を示している。しかし、他の実施形態としては、複数回の計測結果から演算された演算結果は、同一箇所の計測結果の比率であっても良い。
例えば、図13(A)に示す計測結果(1)を得てから、所定時間経過した後の測定結果として図13(B)に示す計測結果(2)を得る際に、微細粒子の発する蛍光輝度の経時変化によるスクリーニングを実施するために、複数回の計測間に、所定の時間間隔を設けることができる。
In the example described above, the calculation result (3) shown in FIG. 13C is the calculation result (difference) between the measurement result (1) shown in FIG. 13A and the measurement result (2) shown in FIG. Is shown. However, as another embodiment, the calculation result calculated from a plurality of measurement results may be a ratio of measurement results at the same location.
For example, when the measurement result (1) shown in FIG. 13 (A) is obtained and the measurement result (2) shown in FIG. 13 (B) is obtained as a measurement result after a predetermined time has elapsed, fluorescence emitted by fine particles is emitted. In order to carry out screening based on changes in luminance over time, a predetermined time interval can be provided between a plurality of measurements.
例えば、図13(A)に示す計測結果(1)を得て、図13(B)に示す計測結果(2)を得る際に、微細粒子の発する蛍光輝度の特定試薬との反応性によるスクリーニングを実施するために、これらの計測間に、手動もしくは自動で所定の試薬を供給できる。
例えば、図13(A)に示す計測結果(1)を得て、図13(B)に示す計測結果(2)を得る際これらの複数回の計測の間に、照射光もしくは蛍光の光路にて透過または反射させるためのフィルタの少なくとも1つを自動的に切り替えることにより、複数種の蛍光を計測することによるスクリーニングを実施できる。
For example, when obtaining the measurement result (1) shown in FIG. 13 (A) and obtaining the measurement result (2) shown in FIG. 13 (B), screening based on the reactivity of the fluorescent luminance emitted by the fine particles with the specific reagent. Therefore, a predetermined reagent can be supplied manually or automatically between these measurements.
For example, when the measurement result (1) shown in FIG. 13 (A) is obtained and the measurement result (2) shown in FIG. 13 (B) is obtained, the optical path of irradiation light or fluorescence is used during these multiple measurements. By automatically switching at least one of the filters for transmitting or reflecting the light, screening by measuring a plurality of types of fluorescence can be performed.
図1に示す回収部13は、回収対象候補のウェル内の微細粒子の上限個数を指定して、輝度領域の指定による回収対象候補のウェルのうち、この上限個数だけを実際に回収する機能を有している。これは、例えばウェル数が数10万個以上という大規模スクリーニングを効率的に実施するために特に有効な機能である。 The recovery unit 13 shown in FIG. 1 has a function of specifying the upper limit number of fine particles in the recovery target candidate well and actually recovering only the upper limit number of the recovery target candidate wells by specifying the luminance region. Have. This is a particularly effective function for efficiently carrying out large-scale screening in which, for example, the number of wells is several hundred thousand or more.
フローサイトメータ(セルソータ)に代表されるように、始めに回収条件輝度を与えておく場合には、予め同様のサンプルによって輝度の確認を行い、条件を決めておく必要がある。このようにすると、手間がかかり、更に確認用サンプルと本番計測用サンプルで退色や異物など、品質が異なる場合は所望のサンプルを回収できない可能性がある。
しかし、本発明の実施形態では、回収対象となるサンプルが含まれる母集団自体の計測結果の分布を見た上で直接選択できるため、サンプルそれ自体の品質(例えば退色状況や劣化状況、異物などの混入状況など)に応じて、回収対象の選定が可能となる。
As represented by a flow cytometer (cell sorter), when the collection condition luminance is given at the beginning, it is necessary to confirm the luminance in advance with the same sample and determine the condition. In this case, it takes time, and if the quality is different between the confirmation sample and the actual measurement sample, such as fading or foreign matter, the desired sample may not be collected.
However, in the embodiment of the present invention, since the distribution of the measurement result of the population itself including the sample to be collected can be directly selected, the quality of the sample itself (for example, the color fading status, the degradation status, the foreign matter, etc.) It is possible to select the collection target according to the contamination status.
本発明の実施形態では、計測結果を示すグラフにおいて輝度値自体よりも輝度分布が重要であり、すべてのウェル内の微細粒子の蛍光輝度の計測をして、度数のピーク輝度等、全体の輝度分布状況を確認した上で、その分布そのものから回収対象ウェルを選択することで、ノイズ部分などが確実に除去された回収条件を指定することができる。
上述したように、図1の画像解析部15は、輝度分布を複数回計測することにより、例えば計測時間差や、試薬滴下後の計測タイミングなどを正確にコントロールするか、もしくはその履歴を正確に記録することができる。複数回計測する場合には、図13に示すような3回の計測に限らず、2回あるいは4回以上であっても良い。
In the embodiment of the present invention, the luminance distribution is more important than the luminance value itself in the graph showing the measurement result, and the fluorescence luminance of the fine particles in all the wells is measured, and the entire luminance such as the peak luminance of the frequency is measured. By confirming the distribution status and selecting a collection target well from the distribution itself, it is possible to specify a collection condition in which a noise portion or the like is reliably removed.
As described above, the
ところで、本発明は、上記実施形態に限定されず種々の変形例を採用できる。
例えば、本発明の実施形態では、標的とする微細粒子として生体の細胞を例に挙げているが、これに限らず他の種類の微細粒子であっても良い。
By the way, this invention is not limited to the said embodiment, A various modified example is employable.
For example, in the embodiment of the present invention, biological cells are exemplified as target fine particles, but the present invention is not limited to this, and other types of fine particles may be used.
また、図3に示すように、搭載用プレート40の上には、1枚の回収プレート80が配置されているが、複数枚の回収プレートを並べて配置しても良い。
Further, as shown in FIG. 3, one
移動部16の直線移動用の駆動系として、回転型の電動モータと送りねじとガイドレールを用いているが、回転型の電動モータに代えてリニアモータなどを用いることができる。
As the drive system for linear movement of the moving
回収プレート80のウェル81の断面形状と計測用チップ90のウェル200の断面形状は、図示例に限らず他の形状、例えば半球形状を採用することもできる。
The cross-sectional shape of the well 81 of the
本発明の微細粒子のスクリーニング装置は、遺伝子、免疫系、タンパク質、アミノ酸、糖類の生体高分子に関する検査、解析、分析が要求される分野、例えば工学分野、食品、農産、水産加工等の農学全般、薬学分野、衛生、保健、免疫、疫病、遺伝等の医学分野、化学もしくは生物学等の理学分野等、あらゆる分野に適用できる。 The fine particle screening apparatus of the present invention is a field that requires testing, analysis and analysis of biopolymers of genes, immune systems, proteins, amino acids, and sugars, such as engineering, food, agriculture, fishery processing, etc. It can be applied to various fields such as pharmaceutical field, hygiene, health, immunity, plague, genetic field such as heredity, and scientific field such as chemistry or biology.
1 微細粒子のスクリーニング装置
11 ベース
12 支持部
13 回収部
14 計測部
15 画像解析部
16 移動部
19 カバー
30 支持台
40 搭載用テーブル
51 第1テーブル
52 第2テーブル
55 第1モータ
56 送りねじ
57 ナット
65 第2モータ
66 送りねじ
67 ナット
70 搭載面
80 回収プレート
81 回収プレートのウェル
90 計測用チップ
100 制御部
110 対物レンズ
120 計測チップの固定具
130 操作部
133 吸引ポンプ
140 吸引・吐出キャピラリ
142 吸引・吐出キャピラリの先端部
200 計測用チップのウェル
260 励起光源
251 モータ
252 送りねじ
253 ナット
261 シャッターユニット
262 蛍光フィルタユニット
264 対物レンズ
500 懸濁液
LD 液体
L 光(励起光、照射光)
X 第1方向
Y 第2方向
Z 第3方向(垂直方向)
CL 計測チップの上面の基準面
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Fine particle screening apparatus 11
X 1st direction Y 2nd direction Z 3rd direction (vertical direction)
CL Reference surface on top of measurement chip
Claims (11)
装置の土台となるベースと、
光を透過する材料で形成され、前記微細粒子を含む懸濁液を注入することで、前記微細粒子が収納されるウェルが形成された計測用チップと、
オートフォーカス機能を有し、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に少なくとも1つ以上の光源より導かれる光を照射することにより得られる前記微細粒子および/またはウェルに関する光情報を取得する計測部と、
前記光情報を解析することで、前記ウェル内に収納されている前記の各微細粒子からの光情報を抽出する解析部と、
前記ベースに設置され、前記計測用チップと、前記計測用チップから選択的に取得された前記微細粒子を収容するための回収プレートとが搭載され、前記計測用チップと前記回収プレートを、前記計測部に対して第1方向と少なくとも前記第1方向と直交する第2方向に移動可能な移動部と、
前記ベースに設置され、吸引・吐出キャピラリを有し、前記吸引・吐出キャピラリにより前記計測用チップに設けられた前記ウェル内の微細粒子を吸入して前記回収プレートの所定の位置に吐出して回収するための回収部と、
を備え、
前記光情報の解析結果から、解析輝度の下限と上限から成る1つ以上の輝度領域を指定することによって、回収対象候補の前記ウェルが選択されることを特徴とする微細粒子のスクリーニング装置。 A fine particle screening device for performing a search for fine particles using light information emitted from the fine particles as a label, and selectively acquiring the searched fine particles,
A base that is the basis of the device,
A measuring chip formed of a material that transmits light and injecting a suspension containing the fine particles to form a well in which the fine particles are stored; and
Light relating to the fine particles and / or wells having an autofocus function and obtained by irradiating the fine particles housed in the measurement chip and the measurement chip with light guided from at least one light source A measurement unit that obtains information;
By analyzing the optical information, an analysis unit that extracts optical information from each of the fine particles stored in the well;
The measurement chip and the collection plate for accommodating the fine particles selectively acquired from the measurement chip are mounted on the base, and the measurement chip and the collection plate are measured with the measurement chip. A moving part movable in a first direction and at least a second direction perpendicular to the first direction with respect to the part;
It has a suction / discharge capillary installed on the base, and fine particles in the well provided in the measuring chip are sucked by the suction / discharge capillary and discharged to a predetermined position of the recovery plate for recovery. A collection unit for
With
The fine particle screening apparatus, wherein the well to be collected is selected by designating one or more luminance regions having a lower limit and an upper limit of analysis luminance from the analysis result of the optical information.
装置の土台となるベースと、
光を透過する材料で形成され、前記微細粒子の懸濁液を注入することで、前記微細粒子が収納されるウェルが形成された計測用チップと、
オートフォーカス機能を有し、前記計測用チップおよび前記計測用チップの収容された前記微細粒子に少なくとも1つ以上の光源より導かれる光を照射することにより得られる前記微細粒子および/またはウェルに関する光情報を取得する計測部と、
前記光情報を照合・解析することで、前記ウェル内に収納されている前記の各微細粒子からの光情報を抽出する解析部と、
前記ベースに設置され、前記計測用チップと、前記計測用チップから選択的に取得された前記微細粒子を収容するための回収プレートとが搭載され、前記計測用チップと前記回収プレートを、前記計測部に対して第1方向と少なくとも前記第1方向と直交する第2方向に移動可能な移動部と、
前記ベースに設置され、吸引・吐出キャピラリを有し、前記計測用チップと前記回収プレート間で移動可能であり、前記吸引・吐出キャピラリにより前記計測用チップに設けられた前記ウェル内の微細粒子を吸入して前記回収プレートの所定の位置に吐出して回収するための回収部と、を用い、
前記光情報の解析結果から、解析輝度の下限と上限から成る1つ以上の輝度領域を指定することによって、回収対象候補の前記ウェルを選択することを特徴とする微細粒子のスクリーニング方法。
A fine particle screening method for searching for fine particles by using light information emitted from the fine particles as a label, and for selectively acquiring the searched fine particles,
A base that is the basis of the device,
A measurement chip formed of a material that transmits light and injecting a suspension of the fine particles to form a well in which the fine particles are stored; and
Light relating to the fine particles and / or wells having an autofocus function and obtained by irradiating the fine particles housed in the measurement chip and the measurement chip with light guided from at least one light source A measurement unit that obtains information;
By collating and analyzing the optical information, an analysis unit that extracts optical information from each of the fine particles stored in the well; and
The measurement chip and the collection plate for accommodating the fine particles selectively acquired from the measurement chip are mounted on the base, and the measurement chip and the collection plate are measured with the measurement chip. A moving part movable in a first direction and at least a second direction perpendicular to the first direction with respect to the part;
A suction / discharge capillary installed on the base, which is movable between the measurement chip and the recovery plate. Fine particles in the well provided on the measurement chip by the suction / discharge capillary Using a recovery unit for inhaling and discharging and recovering to a predetermined position of the recovery plate;
A fine particle screening method, wherein, from the analysis result of the optical information, the well to be collected is selected by designating one or more luminance regions having a lower limit and an upper limit of analysis luminance.
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