JP2008546701A - Ａβ産生へのＢＲＩ蛋白の効果 - Google Patents

Abstract

Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、細胞により、抑制、阻害、または予防する方法、ならびに、アルツハイマー病を持っている被験体を処置する方法が、提供されている。化合物がＢＲＩ２またはＢＲＩ３の模倣体であるかどうか決定する方法も、提供されている。加えて、ＢＲＩ２、ＢＲＩ３、もしくはフリン、またはこれらの蛋白をコード化しているベクターの医薬組成物が、提供されている。

Description

連邦協賛研究開発に関わっている陳述
米国政府は、支払い済みのライセンスを本発明において持ち、その権利を限られた環境において持ち、本特許権者に他者を合理的な期間、ライセンスするよう要求し、Ｇｒａｎｔｓ ＡＧ２２０２４−９５２６４５６２およびＡＧ２１５８８−９５２６４８７８の期間により与えられたとおりであり、ＮＩＨにより報奨された。

（１）本発明の分野
本発明は一般的に、アルツハイマー病におけるＡβ産生の制御（コントロール）に関する。より具体的には、本発明は、ＢＲＩ蛋白の使用に関し、Ｃ９９のγ−セクレターゼ開裂ならびにＡβおよび／またはＡＰＰの細胞内（ドメイン、ＡＩＤ）の放出を阻害する。

（２）関連技術の記述
参考文献
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アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）は、普遍的なＩ型（タイプＩ）膜貫通蛋白（Kangら、１９８７年；Tanziら、１９８７年）であり、一連の内での蛋白溶解現象（SelkoeおよびKopan、２００３年；SisodiaおよびSt.George-Hyslop、２００２年）を受ける。ＡＰＰはまず、原形質膜または細胞内小器官において、β−セクレターゼにより開裂される（Vassarら、１９９９年）。その外の部位（ドメイン）が、細胞外で（ｓＡＰＰβ）、もしくは、細胞内コンパートメントの管腔（ルーメン）中に放出される一方、９９アミノ酸（Ｃ９９）のＣＯＯＨ−末断片が、膜に結合したままである。第２の、膜内蛋白溶解現象において、Ｃ９９が開裂され、ややｌａｘ部位（サイト）特異的であり、γ−セクレターゼによる。２種のペプチドが、１：１化学量論比で放出され、そのアミロイド原性Ａβペプチドは、４０および４２アミノ酸の２種の主要な種（それぞれ、Ａβ４０およびＡβ４２）からなっており、細胞内産物は、ＡＰＰ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ（ＡＩＤもしくはＡＩＣＤ）と名付けられ、非常に短命であり、最近でだけ（Passerら、２０００年；CaoおよびSudhof、２００１年；Cupersら、２００１年）同定されている。代わりの蛋白溶解経路において、ＡＰＰはまず、α−セクレターゼにより、Ａβ配列中においてプロセシングされ、可溶性ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）外部位、および、８３アミノ酸（Ｃ８３）の膜結合ＣＯＯＨ−末断片産生に至る。Ｃ８３も、γ−セクレターゼにより、Ｐ３およびＡＩＤペプチドへと開裂される。Ａβがアルツハイマー病の病理において含まれている一方、ＡＩＤが殆どのＡＰＰシグナル伝達機能を媒介する。ＡＤにおけるＡＰＰプロセシングに関する病理的な役割が、ＡＰＰにおける突然変異を見出すことにより、確認されており（Ｇｏａｔｅら、１９９１）、γ−セクレターゼの鍵（キー）の成分たるＰｒｅｓｅｎｉｌｉｎ類（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９５；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、１９９５ａ，ｂ；Ｒｏｇａｅｖら、１９９５）が、常染色体優性家族形のＡＤを引き起こす。これゆえ、この生物学的および病理学的重要さにより、如何にＡＰＰ開裂が規制されているのか理解していく必要がある。本発明は、この必要性を課題とする。

従って、本発明者らは、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３が、ＡＰＰからの、ＡβおよびＡＰＰ細胞内部位（ドメイン、ＡＩＤ）産生を阻害することを見出した。

これゆえ、ある幾つかの実施形態において、本発明は、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を細胞により、抑制、阻害、または予防していく方法に関する。これら方法は、本細胞をＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体と、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を本細胞により、抑制、阻害、または予防するに有効な量で接触させていくことを含む。

他の実施形態において、本発明は、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を細胞により、抑制、阻害、または予防していく更なる方法に関する。これら方法は、本細胞をフリン（ｆｕｒｉｎ）と、本細胞におけるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防するに有効な量で接触させていくことを含む。

加えて、本発明は、アルツハイマー病を持っている被験体を処置していく方法に関する。これら方法は、本被験体に、本被験体におけるアルツハイマー病を処置するに有効な量のＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を投与していくことを含む。

更なる実施形態において、本発明は、アルツハイマー病を持っている被験体を処置していく他の方法に関する。これら方法は、本被験体に、本被験体におけるアルツハイマー病を処置するに有効な量のフリンを投与していくことを含む。

本発明は、化合物が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体であるかどうか決定していく方法にも関する。これら方法は、本化合物を、機能しているγ−セクレターゼ、および、Ｃ９９を含んでいる膜結合蛋白と組み合わせ、次いで、本化合物が、Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害するかどうか決定していくことを含む。これらの実施形態において、本化合物が、もしγ−セクレターゼによるＣ９９の開裂を阻害すれば、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体である。

更なる実施形態において、本発明は、精製ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を、医薬として許容可能な賦形剤において含んでいる組成物に関する。

更なる実施形態において、本発明は、精製フリンを、医薬として許容可能な賦形剤において含んでいる組成物に関する。

本発明は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３をコード化しているベクターを、医薬として許容可能な賦形剤において含んでいる組成物にも関する。

他の実施形態において、本発明は、フリンをコード化しているベクターを、医薬として許容可能な賦形剤において含んでいる組成物にも関する。

本発明は一部、本発明者らの、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３が、ＡＰＰからのＡβ産生を阻害するとの発見に基づいている。ＡＰＰ細胞内部位（ドメイン）（ＡＩＤ）は混在して、Ａβと共に産生されるので、Ａβ産生を阻害すれば、ＡＩＤ産生をも阻害する。如何なる特定の機序（メカニズム）にも結び付けられることなく、このＡβ産生阻害は、β−セクレターゼによるＡＰＰおよびγ−セクレターゼによるＣ９９の開裂阻害により、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３により、Ｃ９９産生およびＣ９９からのＡβ放出を阻害していると思われている。実施例参照。

これゆえ、ある幾つかの実施形態において、本発明は、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を細胞により、抑制、阻害、または予防していく方法に関する。これら方法は、本細胞をＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体と、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を本細胞により、抑制、阻害、または予防するに有効な量で、接触させていくことを含む。

これらの実施形態において、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３は、脊椎動物の膜統合蛋白であり、＜＜膜統合蛋白２Ｂ＞＞および＜＜膜統合蛋白２Ｃ＞＞としても、それぞれ知られている。ヒトの野生型の形のこれらの蛋白は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ持ち、ｃＤＮＡ配列が、ＧｅｎＢａｎｋ寄託ＮＭ０２１９９９（ＢＲＩ２）、ならびに、ＮＭ０３０９２６、ＮＭ００１０１２５１６、およびＮＭ００１０１２５１４（３種の転写変異体のＢＲＩ３）として提供された。加えて、マカク（Ｍａｃａｑｕｅ）に関するＢＲＩ２アミノ酸配列およびマウスに関するＢＲＩ３アミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｑ６０ＨＣ１およびＮＰ０７１８６２として、それぞれ知られている。このならびに他の既知のＢＲＩ２およびＢＲＩ３情報を用いれば、当業者であれば、日常の（ルーティーン）方法を使用して、如何なる脊椎動物に関しても、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３配列を決定できる。如何なる脊椎動物のＢＲＩ２およびＢＲＩ３蛋白も、少なくとも８０％ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にそれぞれ相同なアミノ酸配列を持つと予期される。

本発明者らは、遺伝子的にＢＲＩ２蛋白の部分を合成して、アミノ酸１〜１０２だけからなっているＢＲＩ２蛋白が、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防するに充分であることも決定している。実施例１および２参照。

ＢＲＩ２またはＢＲＩ３が、本方法において使用されたが、ペプチド模倣体をも含み得る。本明細書において使用される場合、ペプチド模倣体とは、ある１種の蛋白における天然の親種のアミノ酸を模倣可能である化合物であり、当該ペプチド模倣体でのアミノ酸の置換が、当該蛋白の活性に有意に影響を及ぼさない。ペプチド模倣体を含んでいる蛋白は一般的に、プロテアーゼの良くない基質であり、その天然蛋白に比較されると、より長い期間の時間、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性であることが多い。多くの加水分解不可能なペプチド結合類似体が当業界において知られており、このような結合を含有しているペプチド合成への手順を伴っている。加水分解不可能な結合は、−ＣＨ_２ＮＨ、−ＣＯＣＨ_２、−ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ、−ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）、−ＣＨ_２Ｏ、ＣＨ_２Ｓを包含する。加えて、ペプチド模倣体含有ペプチドは、より低アレルゲン性たり得、全体的により高いバイオアベイラビリティーを示し得る。当業者であれば、ペプチド模倣体を含んでいる蛋白の設計（デザイン）および合成が、過度の実験を必要としないと理解する。例えば、Ｒｉｐｋａら（１９９８年）；Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓら（１９９７年）；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９年）参照。

これゆえ、これらの方法の好ましい実施形態において、本細胞が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３と接触されており、これは、アミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、これは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を持っているヒトＢＲＩ２蛋白または配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を持っているヒトＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価であり、ＢＲＩ２蛋白およびＢＲＩ３蛋白は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を、それぞれ持つ。

他の好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、天然蛋白である。ある幾つかの好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、ヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３に、８０％相同的であるよりも、類似している。それらの実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を持ち、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に少なくとも９５％相同的であり、尚より好ましくは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に少なくとも９８％相同的なアミノ酸配列を持つ。最も好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に１００％相同的である。

ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３はこれらの方法において、これらの蛋白の最初の１０２アミノ酸程度からなり得るので、本明細書において使用される場合、”ＢＲＩ２”もしくは”ＢＲＩ３”は、全長ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２において与えられたようなものよりも小さい蛋白を包含する。これゆえ、これら蛋白は、２５０、２００、１５０、もしくは１２５アミノ酸および／またはペプチド模倣体よりも少なくできる。他の好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ持っているヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含む。

ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は本明細書において、更なる有用な部分、例えば、当該蛋白のゆっくりとした放出もしくは抑制された分解を可能とする足場つまりＰＥＧのような部分、または、ある特定の型の細胞に対する標的化を可能とする核酸配列のような部分をも更に含み得る。

これらの方法において、本細胞は、ＢＲＩ２、ＢＲＩ３、またはＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体と接触され得る。本明細書において使用された場合、模倣体とは、天然物ペプチド、ここではＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の生物学的作用を模倣できる如何なるペプチドもしくは非ペプチド化合物をも言い、しばしば、当該模倣体が、当該天然物ペプチドの基本構造を模倣する基本構造を持つか、および／または、当該天然物ペプチドの突出した生物学的特性を持つからである。模倣体は：側鎖のない当該天然物ペプチドとの類似性のような原型からの実質的な修飾を持つペプチド（このような修飾は例えば、分解に対する感受性を減少させることがある）；抗イデオタイプおよび／または触媒抗体もしくはこれらの断片；単離された蛋白の非蛋白部分（例えば、炭水化物の構造体）；あるいは、例えば、コンビナトリアルケミストリーを通じて同定された核酸および薬剤を包含して、合成もしくは天然有機分子を包含し得るが、これらに限られていない。このような模倣体が、当業界において既知の種々の方法を使用して、設計（デザイン）、選択、および／または、さもなくば同定され得る。薬剤設計（ドラッグデザイン）の種々の方法が、本発明において有用な模倣体もしくは他の治療化合物を設計（デザイン）するのに有用であり、Ｍａｕｌｉｋら、１９９７年において開示されており、本明細書においてその全体が援用されている。

これらの方法は、如何なる特定細胞を用いる使用にも限られておらず、但し、当該細胞が、Ａβおよび／またはＡＩＤを産生できる。これらの方法と共に利用され得る細胞の非限定例は、神経、ならびに、ＡＰＰを、天然に、もしくは、遺伝子操作を通して発現する本質的に如何なる他の哺乳類細胞でもある（実施例参照）。本細胞は、神経様でもあり得、もしくは、神経へと分化していくこともできる（例えば、幹細胞）。ある幾つかの好ましい実施形態において、本細胞は、生存哺乳類中にある。好ましくは、本哺乳類は、アルツハイマー病の実験モデル、もしくは、ヒトである。他の好ましい実施形態において、本細胞は、生存哺乳類、好ましくは、ヒトにおける神経である。最も好ましい実施形態において、本ヒトは、アルツハイマー病を持つか、または、アルツハイマー病を獲得してしまうリスクに晒されており、アルツハイマー病に対する遺伝素質を持つような誰かである。

本細胞は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体と、如何なる既知の方法によっても接触され得る。実施例は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体を直接適用してみること、または、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体を本細胞を停留させている哺乳類に投与してみることを包含し、こうして、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体が、例えば、循環系を通って、もしくは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断して、本細胞に辿り着く。ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体が蛋白である場合（つまり、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白）、本細胞は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の少なくとも１部分をコード化している核酸配列を含んでいるウィルスベクターのようなベクターと接触され得、ここで、当該核酸によりコード化されたＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の翻訳が、この接触を有効化させる。後者の方法が好ましい方法であり、特に、当該ベクターが本細胞に入っていくことができる場合である（例えば、本細胞のウィルス感染）。

ＢＲＩ２およびＢＲＩ３はフリンによりプロセシングされ、その産物がＣ９９プロセシング阻害を引き起こす。これゆえ、本細胞におけるフリンの増加も、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防する。

これゆえ、本発明は、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、細胞により、抑制、阻害、または予防していく更なる方法にも関する。これら方法は、本細胞をフリンと、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、本細胞において、抑制、阻害、または予防するのに有効な量で接触させていくことを含む。

フリン、つまり塩基性アミノ酸対開裂酵素は、細胞膜貫通型Ｉ蛋白原蛋白変換酵素（Ｔｈｏｍａｓ、２００２）である。ヒト野生型前原フリン（プレプロフリン）は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を持ち、ｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ寄託ＮＭ００２５６９として与えられている。その成熟蛋白は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３もしくはこれのアミノ酸１０８〜７９４を持つ。加えて、マウスに関するフリンのアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ寄託ＮＰ０３５１７６として知られている。脊椎動物のフリン周辺のこのおよび他の既知の情報を用いれば、当業者であれば、フリン配列を、如何なる脊椎動物に関しても、通常の（ルーティーン）方法を使用して決定できる。如何なる脊椎動物フリン蛋白も、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸１０８〜７９４に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つと予期される。好ましい実施形態において、フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を持っているヒトフリンに少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、最も好ましい実施形態において、フリンはヒトフリンである。

本明細書におけるフリンは更に、更なる有用な部分も含み得、例えば、当該蛋白のゆっくりとした放出もしくは抑えられた分解を可能とする足場もしくはＰＥＧのような部分であるか、または、ある特定の型の細胞に対する標的化を可能とする核酸配列のような部分である。

これらの方法において、本細胞が、天然フリンの活性を促進する化合物、例えばプロフリンをフリンに変換するペプチダーゼ、または、ＢＲＩ蛋白が存在している部位（サイト）へのフリン輸送を促進する化合物と接触され得る。しかしながら、好ましい実施形態において、本細胞が、フリン蛋白と接触され、例えば、フリン蛋白を、本細胞を停留させている哺乳類に投与していくことにより、こうして、フリンが本細胞に辿り着き、例えば、循環系を通して、もしくは、ＢＢＢを横断していくことによる。より好ましい実施形態において、フリンが、フリン蛋白をコード化している核酸配列を含むベクターから発現されている。好ましくは、これらのベクターはウィルスベクターであり、本細胞に感染し、こうして、フリン蛋白をｉｎ ｓｉｔｕにおいて産生していく。

これらの方法は、いずれの特定細胞を用いる使用にも限られておらず、但し、本細胞が、Ａβおよび／またはＡＩＤを産生していくことができる。これらの方法と共に利用され得る非限定例の細胞は、神経、および、天然もしくは遺伝子操作を通してＡＰＰを発現する本質的に如何なる他の哺乳類細胞でもある（実施例参照）。本細胞は、神経様でもあり得、もしくは、神経へと分化していくこともできる（例えば、幹細胞）。ある幾つかの好ましい実施形態において、本細胞は、生存哺乳類中にある。好ましくは、本哺乳類は、アルツハイマー病実験モデル、もしくは、ヒトである。他の好ましい実施形態において、本細胞は、生存哺乳類、好ましくはヒト中の神経である。最も好ましい実施形態において、ヒトがアルツハイマー病を持つか、または、アルツハイマー病を獲得してしまうリスクに晒されており、アルツハイマー病に対する遺伝素因を持つような誰かである。

他の実施形態において、本発明は、アルツハイマー病を持っている被験体を処置していく方法に関する。これら方法は、本被験体に、アルツハイマー病を本被験体において処置するに有効量のＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を投与していることを含む。

これらの方法において、本被験体は好ましくは、ヒトＢＲＩ２蛋白配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１アミノ酸１〜１０２、または、ヒトＢＲＩ３蛋白配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を投与されている。これらの実施形態において、ＢＲＩ２蛋白およびＢＲＩ３蛋白は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を、それぞれ持つ。他の好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、天然起源蛋白である。

これらの方法において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体が直接本被験体の脳に、投与され得る。あるいは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を、本哺乳類のＢＢＢを横断させるような様式で、投与されている。ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体は、医薬組成物中においても製剤され得、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が本被験体のＢＢＢを横断できる能力を促進させる。

他に限られなければ、医薬組成物は、本明細書において記載された如何なる実施形態においても、過度の実験なしに、哺乳類に対する投与用に製剤され得、ヒトを包含し、その特定の適用にとって適切なようにである。加えて、適正な用量のこれら組成物は、過度の実験なしに、標準的な用量−応答プロトコールを使用して、求められ得る。

従って、口、舌、舌下、口腔、および口腔内投与用に設計（デザイン）されたこれら組成物は、過度の実験なしに、当業界においてよく知られた手段により、例えば、不活性稀釈剤を用いてもしくは食べられる担体を用いて、調製され得る。本組成物は、ゼラチンカプセル中において閉じられるか、もしくは、錠剤（タブレット）へと圧縮されてよい。口腔治療投与目的に、本発明の医薬組成物が、賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁、シロップ、ウェハウス、チュウイングガム等の形で使用されてよい。

錠剤、ピル、カプセル、トローチ等が、バインダー、レシピエント、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、および香料をも含有してよい。ある幾つかの例のバインダーは、微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンを包含する。賦形剤の例は、スターチもしくはラクトースを包含する。ある幾つかの例の崩壊剤は、アルギン酸、コーンスターチ等を包含する。潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムを包含する。ある１つの例の潤滑剤は、コロイド状二酸化硅素である。ある幾つかの例の甘味料は、スクロース、サッカリン等を包含する。香料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料等を包含する。これらの種々の組成物を調製していくのに使用される材料は、医薬として純粋であり、使用量において非毒性であるべきである。

本発明の組成物は容易に、例えば、静脈内、筋内、蜘蛛膜内、もしくは皮下注射によるように、非経口投与され得る。非経口投与は、本発明の組成物を溶液もしくは懸濁中に取り込んでいくことにより、達成され得る。このような溶液もしくは懸濁は、注射用水、食塩水、固定化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌稀釈剤をも包含してよい。非経口製剤は、例えばベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えばアスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびに、ＥＤＴＡのようなキレート剤をも包含してよい。酢酸塩（アセテート）、クエン酸塩（シトレート）、もしくは燐酸塩（ホスフェート）のような緩衝剤、ならびに、塩化ナトリウム（食塩）もしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も、加えられてよい。本非経口調製品は、アンプル、使い捨てシリンジ、または、ガラスもしくはプラスチックでできた多数回用量バイアル中において閉じ込められ得る。

直腸投与は、本医薬組成物を、直腸もしくは大腸中に投与していくことを包含する。これは、坐薬もしくは浣腸を使用して、達成され得る。坐薬製剤は容易に、当業界において既知の方法により、調製され得る。例えば、坐薬製剤が、グリセリンを約１２０℃に熱していき、本組成物を該グリセリンに溶解させていき、この熱せられたグリセリンを混合していき、この後精製水が加えられてよく、この熱い混合物を坐薬の型中に注いでいって調製され得る。

経皮投与は、本組成物の、皮膚を通しての経皮吸収を包含する。経皮製剤は、パッチ（よく知られたニコチンパッチのような）、外用薬、クリーム、ゲル、軟膏等を包含する。

本発明は、本哺乳類に、治療有効量の本組成物を経鼻投与していくことを包含する。本明細書において使用された場合、経鼻投与していくもしくは経鼻投与は、本組成物を、本患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜に投与していくことを包含する。本明細書において使用された場合、組成物の経鼻投与用医薬組成物は、例えば、鼻スプレー、鼻ドロップ、懸濁、ゲル、外用剤、クリーム、もしくは粉末として投与されるべく、よく知られた方法により調製された治療有効量の本組成物を包含する。本組成物の投与は、鼻栓もしくは鼻スポンジを使用しても、行われてよい。

更なる実施形態において、本発明は、アルツハイマー病を持っている被験体を処置していく他の方法に関する。これら方法は、本被験体に、アルツハイマー病を本被験体において処置するに有効な量のフリンを投与していくことを含む。本被験体は、これらの実施形態において、好ましくはフリンを投与され、これは、アミノ酸配列１０８〜７９４ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を持っているヒトフリンに等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ。他の好ましい実施形態において、フリンが、天然起源蛋白であり、例えば、ヒトフリンである。

フリンは、これらの実施形態において、直接、本被験体の脳に投与され得る。あるいは、フリンは、この化合物が、本哺乳類のＢＢＢを横断できるような様式で投与され得る。フリンは、フリンの、本被験体のＢＢＢを横断できる能力を高める医薬組成物中においても、製剤され得る。

模倣体を同定していく確立された方法を使用して、当業者は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体を同定でき、Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害する化合物を同定していくことによる。こうして、本発明は、ある化合物が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体であるかどうか決定していく方法にも関する。これら方法は、該化合物を、機能しているγ−セクレターゼおよびＣ９９を含んでいる膜結合蛋白と組み合わせ、次いで、該化合物が、Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害するかどうか決定していくことを含む。これらの実施形態において、γ−セクレターゼによるＣ９９の開裂を阻害すれば、該化合物が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体である。

Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、如何なる既知の方法によっても、例えば、実施例において記載された方法により、決定され得る。このような方法は、Ａβおよび／またはＡＩＤ放出を、例えばＡβおよび／またはＡＩＤ特異的抗体を使用して測定していくことを包含し、ここで、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体が、Ａβおよび／またはＡＩＤの減少を引き起こす。Ｃ９９阻害は、Ｃ９９の変化を測定していくことによっても求められ得、ここで、模倣体が、Ｃ９９の増加を引き起こす（実施例参照）。

実施例においても確立されたとおり、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３によるＣ９９開裂阻害は、Ｃ８３およびｓＡＰＰαの存在の減少を引き起こし、ｓＡＰＰβの存在の増加を引き起こす。こうして、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体が、Ｃ８３およびｓＡＰＰαの減少、ならびに、ｓＡＰＰβの増加を引き起こす。

上の決定は、如何なる既知の方法によっても、なされ得る。好ましい方法は、ＥＬＩＳＡ、質量分析、もしくはウェスタンブロットを包含する。当業界において知られているとおり、ウェスタンブロットしていくことが、ＥＬＩＳＡよりも、不安定でない化合物の同定を可能とするが、より多くの時間を消費し、厄介な手順である。

これらの方法は、評価されるべきいずれの特定の化合物にも、限られていない。例えば、ランダムな化合物のライブラリーが、評価され得る。好ましくは、しかしながら、これら化合物が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ持っているヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含んでいるＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のある一部分を模倣して設計（デザイン）されている。このような化合物は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の該部分の３次元構造および／または電荷を例えば模倣して設計され得る。あるいは、該化合物はペプチド模倣体を含み得、こうして、該化合物がＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３アミノ酸配列を模倣する。

好ましい実施形態において、前記膜結合蛋白は、Ｃ９９を含んでおり、アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）であり、ＡＰＰを発現している細胞において生じるようなものである。

これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、試験管中において）において実施され得る。好ましくは、しかしながら、機能しているγ−セクレターゼおよびＣ９９を含んでいる膜結合蛋白は、生存細胞中にある。このような生存細胞の非限定例は、レポーター遺伝子（レポータージーン、例えば、ルシフェラーゼ）の転写を、γ−セクレターゼによる遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰ開裂時に活性化させる遺伝子構築体を含むものであり、実施例１におけるとおりである。これらの実施形態において、該遺伝子導入ＡＰＰは、好ましくは、更にＧａｌ４を、当該遺伝子導入ＡＰＰの細胞質部位（ドメイン）上でを含む（実施例参照）。

これら方法が生存細胞を利用する場合、機能しているγ−セクレターゼおよびＡＰＰを発現する如何なる細胞も、使用され得る。非限定例は、神経細胞、または、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、もしくはＮ２ａ細胞のような、遺伝子導入ＡＰＰを産生する細胞を包含する。実施例参照。

更なる実施形態において、本発明は、精製ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を、医薬として許容可能な賦形剤中において含んでいる組成物に関する。好ましくは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を持っているヒトＢＲＩ２蛋白のアミノ酸１〜１０２、または、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を持っているヒトＢＲＩ３蛋白に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、ＢＲＩ２蛋白およびＢＲＩ３蛋白が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にそれぞれ少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ。ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、如何なる数のアミノ酸および／またはペプチド模倣体をも含み得、その全長の蛋白から、１０２アミノ酸のアミノ酸および／またはペプチド模倣体までであり、例えば、２５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体、２００よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体、１５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体、あるいは、１２５よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体を包含している。

ある幾つかの実施形態において、医薬として許容可能な前記賦形剤は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、本被験体のＢＢＢを横断できる能力を高める。他の実施形態において、本組成物が、単位（ユニット）用量の形で、アルツハイマー病処置用に製剤されている。

本発明は加えて、精製フリンを、医薬として許容可能な賦形剤中において含んでいる組成物に関する。好ましくは、本フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を持っているヒトフリンに等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、本フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ。好ましくは、本フリンが、天然起源蛋白である。

ある幾つかの実施形態において、医薬として許容可能な前記賦形剤は、本フリンの、本被験体のＢＢＢを横断できる能力を高める。他の実施形態において、本組成物が、単位（ユニット）用量の形で、アルツハイマー病処置用に製剤されている。

本発明は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３をコード化しているベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中において含んでいる組成物にも関する。好ましくは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を持っているヒトＢＲＩ２蛋白もしくは配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を持っているヒトＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含み、ここで、ＢＲＩ２蛋白およびＢＲＩ３蛋白が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にそれぞれ少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ。ある幾つかの実施形態において、医薬として許容可能な本賦形剤が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、被験体の血液脳関門（ＢＢＢ）を横断できる能力を増強させる。他の実施形態において、本組成物が、単位用量の形で、アルツハイマー病処置用に製剤されている。これらの実施形態は、如何なる特定のベクターにも、限られていない。しかしながら、好ましい実施形態において、該ベクターはウィルスである。

本発明は、フリンをコード化しているベクターを、医薬として許容可能な賦形剤において含んでいる組成物にも関する。好ましくは、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を持っているヒトフリンに等価なアミノ酸を含み、ここで、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ。他の好ましい実施形態において、該フリンが、天然起源蛋白である。ある幾つかの実施形態において、医薬として許容可能な本賦形剤が、該フリンの、被験体の血液脳関門（ＢＢＢ）を横断できる能力を増強させる。他の実施形態において、本組成物が、単位用量の形で、アルツハイマー病処置用に製剤されている。好ましくは、該ベクターはウィルスである。

本発明の好ましい実施形態が、以降の実施例において、記載されている。本願請求項の範囲内の他の実施形態が、本明細書において開示されたとおりの本発明の特定もしくは実施の考慮から、当業者に明らかとされる。本明細書が、本実施例と共に、例示的なだけと考慮されるものと意図されており、本発明の範囲および精神が本願請求項により指し示されており、本実施例に続く。

実施例１．家族性痴呆ＢＲＩ２遺伝子によりコード化された蛋白が、ＡＰＰと結合し、Ａβ産生を阻害する
実施例のまとめ
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最もよくある老人性痴呆であり、アミロイド斑、血管性アミロイド、神経繊維の絡み合い、および、進行性神経変性により特徴付けられている。アミロイドは主に、Ａβペプチドにより構成されており、これは、セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）プロセシングに由来する。そのＡＰＰの細胞内部分（ドメイン、ＡＩＤ）が、Ａβと共に放出されるが、シグナル伝達機能を持ち、アポトーシシスおよび転写を調節するからである。その生物学的および病理学的重要さにもかかわらず、ＡＰＰプロセシングを規制している機序（メカニズム）が、良く理解されていない。膜結合蛋白が、セクレターゼによるＮｏｔｃｈ開裂および転写活性細胞内断片の放出を、促進させる。ＡＰＰとＮｏｔｃｈシグナル伝達との間の顕著な類似度を考慮して、我々は、ＡＰＰプロセシングが同様に規制されていると仮定した。ここで、我々は、ＢＲＩ２たるＩＩ型膜蛋白が、ＡＰＰと相互作用することを示す。おもしろいことに、ＡβのＮＨ_２−末部分に対応している１７アミノ酸が、この相互作用に必要である。更に、ＢＲＩ２発現が、ＡＰＰプロセシングを規制し、結果、ＡβおよびＡＩＤ濃度（レベル）が抑えられた。すべからく、これらの知見が、ＢＲＩ２−ＡＰＰ相互作用を、Ａβ産生を阻害するＡＰＰプロセシングの規制機序（メカニズム）として特徴付ける。特記すべきは、ＢＲＩ２突然変異が、家族性英国痴呆（ＦＢＤ）および家族性デンマーク痴呆（ＦＤＤ）を引き起こし、これらは、臨床的および病理学的に、ＡＤに似ている。ＢＲＩ２病原突然変異が、ＡＰＰプロセシングに関するＢＲＩ２の規制機能を代えるとの知見が、ＡＰＰ開裂の脱規制を、ＡＤ、ＦＤＤ、およびＦＢＤに共通な病原機序（メカニズム）として定義する。

はじめに
他のγ−セクレターゼ基質の開裂が膜結合リガンドにより規制されているので、我々は、ＡＰＰと結合し、そのプロセシングを規制する膜統合蛋白の存在を仮定した。ここで、我々は、ＢＲＩ２（Ｄｅｌｅｅｒｓｎｉｊｄｅｒら、１９９６）たるＩＩ型膜蛋白を記載し、本記載を満たす。

実験手順
γ３０細胞が、Ｋｉｍｂｅｒｌｙら、２００３年において記載されたとおり、抗生物質および１０％牛胎児血清を用いて補完されたＤＭＥＭにおいて維持された。

スプリット−ユビキチンイースト２種ハイブリッドスクリーニング
該スプリット−ユビキチンのシステムが、魅力的な代替法を与え、膜統合蛋白間の相互作用を分析する（Ｓｔａｇｌｊａｒら、１９９８）。該スプリット−ユビキチンのシステムおよびヒトの脳ライブラリーが、Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ（チューリッヒ、スイス）から購入された。これらスクリーニングが、製造元のプロトコルに従い、実施された。端的に、ヒトＡＰＰ（アミノ酸１〜６９５）、ヒトＡＰＰ（アミノ酸１〜６６４；ＡＰＰＮｃａｓ）、もしくはヒトＡＰＬＰ２がそれぞれ、ｐＴＭＶ４、ｐＡＭＢＶ４、ｐＡＭＢＶ４餌ベクター中にクローン化され、ユビキチンのＣ末側半分（Ｃｕｂ）に融合されたＡＰＰファミリーの餌蛋白を得、報告（レポーター）断片を伴った（ＬｅｘＡ、ＤＮＡ結合蛋白、ＶＰ１６に融合されたもの、転写活性化）。ヒトの脳ライブラリーが、変異したユビキチン（ＮｕｂＧ）のＮ−末側半分において融合された蛋白を発現する。各ライブラリーに関して、我々は、およそ５×１０^６種の形質転換体をスクリーニングした。ＡＰＰ／ＡＰＬＰ２−Ｃｕｂと相互作用できる蛋白をコードしているクローンが、ＮｕｂＧ：Ｃｕｂ相互作用を促進させ、次いで、ユビキチン特異的プロテアーゼ（１種もしくは複数種）の動員、ＡＰＰ／ＡＰＬＰ２−Ｃｕｂ餌の開裂、ＬｅｘＡ−ＶＰ１６転写因子の放出、および、これら２種のレポーター遺伝子（ＬａｃＺおよびＨＩＳ３）の転写活性化を伴う。ライブラリーのプラスミドが、ＨＩＳ３およびＬａｃＺ陽性イースト形質転換体から回収され、Ｎ−末ＦＬＡＧタグを有するｐｃＤＮＡ３．１中にクローン化され、直接、下記されたとおり、免疫沈降により、ＡＰＰとの相互作用できる能力をテストした。両レポーター遺伝子の共通の活性化因子を求めてのスクリーニングが、結果、Ｆｅ６５（Ｚａｍｂｒａｎｏら、１９９７）のような、既知のＡＰＰ／ＡＰＬＰ２−結合蛋白の同定に至った。

プラスミド
全長ＢＲＩ２およびＢＲＩ２^{１〜１３１}が、これら２種のハイブリッドクローンから、ＰＣＲにより増幅され、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ（Ｍａｔｓｕｄａら、２００１）中にクローン化された。哺乳類発現ベクターＡＰＰたるＡＰＰＮｃａｓが、記載されている（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００２）。ｍｙｃ−タグが、シグナル伝達配列ＡｐｏＥＲ２後挿入され、ｐＥＦ−ＢＯＳ中にクローン化された。ＢＡＣＥが、ｐｃＤＮＡ３ｍｙｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングされていくことにより、マウスの脳ｃＤＮＡからクローン化され、Ｃ−末側でｍｙｃのタグをされた。

抗体
以降の抗体が、使用されている：
αＦＬＡＧ（マウスモノクローナルＭ２、Ｓｉｇｍａ）；
αＡＰＰマウスモノクローナル２２Ｃ１１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ ｌａｂｓ）およびｐ２−１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）；
αｍｙｃ（マウスモノクローナル９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ウサギポリクローナル抗体αＡＰＰｃｔ（ＺＭＤ．３１６、Ｚｙｍｅｄ）（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００２）；
ニワトリコントロール抗体（ＩｇＹ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ニワトリαＢＲＩ２（ＩｇＹ、ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）；
ウサギポリクローナルコントロール抗体（ＩｇＧ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ＥＮ３（Ｐｉｃｋｆｏｒｄら、２００３）（ウサギポリクローナル抗体）；
ウサギαＢＲＩ２（Ｊｏｒｇｅ Ｇｈｉｓｏ博士からの好意）；
マウスポリクローナルが、ヒトＢＲＩ２の細胞質尾部を含んでいるペプチドに対して生じた。抗ＡＰＬＰ１および抗ＡＰＬＰ２Ｃ−末側ウサギポリクローナル抗体が、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入された。

細胞培養および感染
ＨＥＫ２９３、ＡＰＰ安定発現ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３ＡＰＰ）、ＨｅＬａ、Ｎ２ａ細胞が、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％牛胎児血清を用いて補完されたＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）において、５％ＣＯ_２中において、３７℃において維持された。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）もしくはＭｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（Ｂｉｏｎｔｅｘ）が、トランスフェクションに使用された。

免疫沈降およびウェスタン・ブロット
他に記されなかったら、全免疫沈降手順が、４℃において実施された。これらトランスフェクションされた細胞が、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有している緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ） Ａ［２０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨ ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００］中において、３０分間溶解され、これら溶解物が、２０，０００ｇにおいて、１０分間清澄化された。ＦＬＡＧの免疫沈降に関して、これら清澄化された溶解物が、２０μＬのＦＬＡＧ−Ｍ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と、２時間混合され、３回、Ｂｕｆｆｅｒ Ａを用いて洗浄された。これら沈澱が、６０μＬの２×ＳＤＳサンプル緩衝液中において煮沸され、ウェスタン・ブロットに付された。他の免疫沈降に関して、これら清澄化された溶解物が、抗体と共に、１時間インキュベートされ、２０μＬの蛋白Ａ／Ｇビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）と混合され、洗浄され、上のとおり加工された。ヒトの脳（Ｐｅｔｅｒ Ｄａｖｉｅｓ博士からの寛大な好意）が、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有しているＢｕｆｆｅｒ Ａ中において、Ｄｏｕｎｃｅ均一化機を使用して、均一化された。これら蛋白が終夜、５ｍｇ／ｍＬにおける当該蛋白濃度を用いて、抽出された。抽出された蛋白が、２０，０００ｇにおいて、１時間清澄化された。その上清が、指し示された抗体と共にインキュベートされ、蛋白Ａ／Ｇビーズが、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有しているＰＢＳを用いてブロックされた。沈澱が、上記されたとおり、洗浄され、加工された。

代謝標識
ｐｃＤＮＡ３もしくはＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされたＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、メチオニンおよびシステインのない、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％牛胎児血清を用いて補われたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中において、２時間インキュベートされた。細胞が次いで３０分、［^３５Ｓ］標識メチオニンおよびシステイン（ＩＣＮ）をこの培養培地に加えていくことにより、標識された。これら標識された細胞が念入りに洗浄され、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％牛胎児血清を用いて補われたＤＭＥＭ中において、指し示された期間の時間、追跡された。この追跡後、細胞が溶解され、αＡＰＰｃｔと共に、上記したとおり、免疫沈降された。標識された細胞が培地から、２０，０００ｇ１０分間の遠心により清澄化され、次いで、指し示された抗体と共に、免疫沈降された。

ルシフェラーゼ・アッセイ
これらアッセイが、記載されたとおり（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００３）、実施されたが、ＡＰＰ−Ｇａｌ４融合（Ｇｉａｎｎｉら、２００３）がＧａｌ４源として使用されたことを除く。ルシフェラーゼ活性が、同時トランスフェクションされたβ−ガラクトシダーゼ活性により規格化され、このトランスフェクション効率をモニターした。

酵素連結免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、ｐｃＤＮＡ３もしくはＢＲＩ２を用いて、トランスフェクションされた。このトランスフェクションの２４時間後、これら細胞が２４時間、条件を整えられ、前記培地中のＡβ４０およびＡβ４２が、ヒトＡβＥＬＩＳＡキット（ＫＭＩ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用しながら、その製造元のプロトコルに従いつつ、測定された。これらトランスフェクションされた細胞が溶解され、上のとおり清澄化され、抽出された蛋白量が使用されて、ＥＬＩＳＡにより検出されたＡβ量を規格化した。

蛋白決定
蛋白濃度が、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白アッセイにより（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＢＳＡを標準として、求められた。

結果および議論
膜連結蛋白がＡＰＰプロセシングを規制するかどうかテストするために、我々は、スプリットユビキチンシステムを使用して、膜蛋白間の相互作用を同定した。ＡＰＰファミリー蛋白と相互作用する蛋白を求めてのヒト脳ｃＤＮＡライブラリースクリーニングが、結果、ＢＲＩ２（Ｄｅｌｅｅｒｓｎｉｊｄｅｒら、１９９６）およびＢＲＩ３（Ｖｉｄａｌら、２００１）（示さなかった）の同定に至ったが、これらは、ＩＩ型膜蛋白遺伝子ファミリーメンバーであり、Ｂｒｉｃｈｏｓ部位（ドメイン）を含有している。ＢＲＩ蛋白の機能は知られていないが、ＢＲＩ２の突然変異が、ＦＢＤ（Ｖｉｄａｌら、１９９９）およびＦＤＤ（Ｖｉｄａｌら、２０００）を有する患者において見出されている。記すべきことに、ＦＢＤおよびＦＤＤにおける神経病理学的知見が、実質における前兆のアミロイド沈着（ＦＢＤおよびＦＤＤ）および斑（ＦＢＤ）、神経繊維の絡み合い、コンゴレッドに染まるアミロイド血管障害（ＣＡＡ）、および神経変性を包含し、ＡＤに似ている。これゆえ、ＢＲＩ２における突然変異が、ＡＤ様の家族性痴呆を引き起こすので、我々は更に、このＢＲＩ２−ＡＰＰ相互作用の生理学的関連を研究した。

このＢＲＩ２−ＡＰＰ相互作用を哺乳類細胞において査定するために、ＨｅＬａ細胞が、ＢＲＩ２およびＡＰＰ構築体と共に、同時トランスフェクションされた（図１ａ）。αＦＬＡＧ抗体との細胞溶解物の免疫沈降が、ＢＲＩ２が、全長ＡＰＰ（図１ｂおよびｄ）、Ｃ９９（図１ｂおよびｄ）、およびＡＰＰＮｃａｓと相互作用したことを示したが、このことは、Ｃ８３でなく（図１ｂおよびｄ）、ＡＰＰ（図１ｃ）の細胞内領域の殆どの欠損を表す。ＡＰＰが、ダブレットとして、描かれている。より低い方のＡＰＰのバンドが、グリコシル化されなかった未熟なＡＰＰを表し；より上の方の形が代わりに、グリコシル化された成熟ＡＰＰから構成されている。記すべきことに、このグリコシル化された成熟した形のＡＰＰおよびＡＰＰＮｃａｓだけが、ＢＲＩ２と相互作用した（図１ｂ、ｃ、およびｄ）。ＢＲＩ２過剰発現が劇的に、Ｃ９９量を増加させることも、記されるべきである（図１ｂおよび１ｄ）。この知見の意義が、後で展開される。

ＢＲＩ２外側部位（ドメイン）の殆どの欠損が、ＡＰＰに対する結合を廃しなかった（ＢＲＩ２^{１〜１３１}、図１ｄ）。αＡＰＰ抗体を用いるその逆免疫沈降が、ＡＰＰがＢＲＩ２を免疫沈降させることを明らかにした（図１ｅ）。加えて、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞において検出された蛋白溶解〜１７ｋＤａのＢＲＩ２のＮＨ_２−末断片（ＢＲＩ２ｎｔ、ＢＲＩ２^{１〜１３１}にサイズが似ている）も、ＡＰＰと共に沈澱された（図１ｅ）。これらの相互作用の特異性が更に、ＢＲＩ２が、もう１種別のＩ型膜統合蛋白たるＡｐｏＥＲ２に結合しなかった（図１ｃ）との証拠により、裏付けられた。これらの知見が、ＡＰＰの細胞質内尾部およびＡＰＰの殆どおよびＢＲＩ２外側部位がＢＲＩ２／ＡＰＰ相互作用できる一方、ＡＰＰの外側部位における１７アミノ酸の領域が、その膜貫通領域に近く、そのＮＨ_２−末Ａβ配列を含有しており、この結合に必須であることを、証拠付ける。これらのデータが強く、ＢＲＩ２およびＡＰＰがｉｎ ｔｒａｎｓ（つまり、区別される膜上で発現された受容体／リガンドとして）において相互作用しないが、むしろ、分子複合体を細胞膜において形成することを示唆する。

ＡＰＰおよびＢＲＩ２が両方、成熟神経組織において、発現されている。我々はこれゆえ、ＡＰＰも、ＢＲＩ２と、成人ヒト脳において相互作用するかどうか、決定しようとした。まず、我々は、４種の抗ＢＲＩ２抗体をテストし、これらがヒトＢＲＩ２を免疫沈降できるかどうか、決定した。これらのテストに関して、ＨｅＬａ細胞が、ＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされ、これら４種のＢＲＩ２抗体およびコントロールと共に免疫沈降された。図２ａにおいて示されたとおり、ＥＮ３抗ＢＲＩ２抗体だけが、ＢＲＩ２を沈澱させることができた。次に、我々は、ヒトの脳のホモジェネートを調製し、αＡＰＰｃｔ抗体もしくはＥＮ３を用いた免疫沈降を実施した。図２ｂにおいて示されたとおり、Ｃ９９（およびより大きいＣＯＯＨ−末ＡＰＰ断片）が、抗ＡＰＰおよびＥＮ３両方と共に沈澱された一方、Ｃ９９は、ウサギポリクローナルＩｇＧと共に沈澱されなかった。おもしろいことに、この場合においても、Ｃ８３が、ＢＲＩ２と共に沈澱しなかったが、αＡＰＰｃｔにより沈澱した。更に、全長ＡＰＰも、ＥＮ３により沈澱したが、低濃度（レベル）においてであった。すべからく、これらの実験が、内因性ＡＰＰおよびＢＲＩ２が、成人ヒト脳において関連することを指し示す。加えて、これらが、ＢＲＩ２が好ましくは、Ｃ８３とでなく、Ｃ９９およびより大きいＡＰＰのＣ−末断片と相互作用することを示す。

図１ｂおよび１ｄにおいて示されたとおり、ＢＲＩ２構築体の発現が変わっていくことなく、結果、Ｃ９９の濃度（レベル）の上昇に至る。このＣ９９濃度（レベル）の劇的な上昇が、ＡＰＰプロセシングへのＢＲＩ２の効果に依存しているらしい。これに関して直接テストするために、我々は、ＦＬＡＧのタグをされたＢＲＩ２を、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、およびＮ２ａ細胞において、ＡＰＰ−Ｇａｌ４、Ｇａｌ４プロモーター制御下のルシフェラーゼレポーター、およびβ−ガラクトシダーゼ構築体と共に、発現させた。ＡＰＰ−Ｇａｌ４は、ＡＰＰ細胞質部位（ドメイン）に対する、イースト転写因子Ｇａｌ４の融合体である。ＡＰＰ−Ｇａｌ４のγ−開裂が、ＡＩＤ−Ｇａｌ４を、細胞膜から核に放出させ、引き続いてのルシフェラーゼ転写の活性化を伴う（Ｇｉａｎｎｉら、２００３）。図３ａにおいて示されたとおり、ＢＲＩ２がルシフェラーゼ活性を、３種全ての細胞株において抑えたが、ＡＩＤ形成阻害を示唆している。代わりに、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）トランスフェクションが、結果、ＡＩＤ放出の増加に至ったが、予測されたとおりであった（図３ｂ）。ＢＲＩ２^{１〜１３１}変異体が、尚ＡＰＰと相互作用し、上昇したＣ９９濃度（レベル）を産生させ（図１ｄ）、ＡＩＤ放出も阻害する（図３ｃ）。最後に、混合実験が、ＢＲＩ２がＡＩＤ−Ｇａｌ４放出を抑制するには、ＡＰＰ−Ｇａｌ４と共に、同一細胞において、同時発現されなくてはならないことを示す。事実、ＢＲＩ２を発現している細胞を、ＡＰＰ−Ｇａｌ４を発現している細胞と混合していくと、ＡＩＤ放出に影響を及ぼさない（図３ｄ）。このことが更に、ＢＲＩ２およびＡＰＰが、ｉｎ ｔｒａｎｓよりもむしろｉｎ ｃｉｓにおいて相互作用することを示唆する。

この系（システム）を更に確認するために、我々は、ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされたＨＥＫ２９３の条件を整えられた培地中におけるＡβを測定しており、ＢＲＩ２が有意に、Ａβ４０およびＡβ４２濃度（レベル）を消失させた（図３ｂ）ことを見出している。再び、ＢＡＣＥトランスフェクションが、Ａβ４０およびＡβ４２分泌を増加させた（図３ｆ）。

ＢＲＩ２によるＡＩＤおよびＡβ産生の阻害が、ＢＲＩ２発現が、γ−セクレターゼによるＡＰＰの開裂を抑えることを示唆する。しかしながら、ＢＲＩ２が、ＡＰＰのβ−およびα−開裂を調節することも、可能である。上で議論されたとおり、β−もしくはα−セクレターゼによるＡＰＰの開裂がそれぞれ、ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαを、上清中において放出する。ｓＡＰＰαもしくはｓＡＰＰβの量の増加が、α−もしくはβ−開裂の増加を指し示す一方、ｓＡＰＰαもしくはｓＡＰＰβの減少が、α−もしくはβ−開裂の減少に反映する。こうして、ＢＲＩ２がα−もしくはβ−セクレターゼに影響を及ぼすかどうか決定するために、我々は、ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ量を測定した。これらの同一の実験において、我々は、Ｃ９９およびＣ８３の細胞内濃度（レベル）も測定した。ＨＥＫ２９３−ＡＰＰ細胞が、ＦＬＡＧ−ＢＲＩ２もしくはベクターコントロールを用いて、トランスフェクションされた。トランスフェクションされた細胞が、［^３５Ｓ］メチオニン−システインを用いて３０分間、パルス標識され、次いで、０、１、２、および４時間、３７℃において追跡された（図３ｃ）。細胞溶解物が、αＡＰＰ−ｃｔ抗体と共に、各時点において免疫沈降された（図３ｃ）。分泌されたＡＰＰ（ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ）を測定するために、上清が、４時間標識され、抗ＡＰＰ抗体Ｐ２１（ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ両方を沈澱させる）もしくは６Ｅ１０（ｓＡＰＰαだけを沈澱させる）と共に沈澱された細胞から回収された（図３ｄ）。ＢＲＩ２トランスフェクションが、結果、Ｃ８３（図３ｃ）およびｓＡＰＰα（図３ｄ）の量の減少に至った。逆に、Ｃ９９（図３ｃ）およびｓＡＰＰβ（図３ｄ）濃度（レベル）が、増加した。特記すべきことに、ＢＲＩ２が、αＡＰＰ−ｃｔ抗体により、全時点において、同時免疫沈降された。こうして、ＢＲＩ２発現が、α−セクレターゼによるＡＰＰ開裂を抑える一方、β−セクレターゼによるそのプロセシングを上昇させる。γ−セクレターゼの混入による阻害およびＡＰＰのβ−開裂の増加が、Ｃ９９濃度（レベル）の劇的な増加を説明する。

ＡＰＰは、ＡＰＬＰ１およびＡＰＬＰ２を包含する蛋白ファミリーのある一員である。ＡＰＬＰ１およびＡＰＬＰ２も、γ−セクレターゼの基質であり（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００２）、数多くのγ−セクレターゼの基質の中でも、ＡＰＰに対するより多くの配列の類似性を保有するものである。こうして、ＢＲＩ２が、一般的にγ−セクレターゼに影響を及ぼすのか、特異的にＡＰＰのγ−開裂を阻害するのかテストするために、我々は、ＢＲＩ２を、ＡＰＬＰ１もしくはＡＰＬＰ２を用いてトランスフェクションした。抗ＡＰＬＰ１もしくは抗ＡＰＬＰ２Ｃ末抗体を使用してのウェスタン・ブロットが、ＢＲＩ２発現が、ＡＰＬＰ１（示さなかった）およびＡＰＬＰ２（図３ｉ）のＣ末断片の蓄積を促進させないことを指し示す。この結果が、ＢＲＩ２が特異的に、他のγ−基質ではなく、ＡＰＰへのγ−活性をブロックするとの観念を裏付ける。

すべからく、これらの研究が、ＢＲＩ２およびＡＰＰが、多重分子複合体を、細胞膜において形成することを示唆する。このような複合体におけるＡＰＰおよびＢＲＩ２の化学量論量が、調査されなければならず、ＢＲＩ２およびＡＰＰが、他の蛋白を含んでいる構造において見出されるかどうか未知である一方、我々のデータが、ＢＲＩ２が、ＡＰＰプロセシングの内因性制御因子（レギュレーター）として機能することを示唆する。より具体的に、我々はここに、ＢＲＩ２発現が、ＡＰＰのα−およびγ−両方の開裂を減らすことを見出した。これらの機能に相応しい詳細な分子機序（分子レベルでのメカニズム）が直接述べられなければならないが、ＢＲＩ２が、α−およびγ−開裂部位を含んでいるＡＰＰの領域と相互作用するとの知見が、ＢＲＩ２が物理的に、これら２種の標的配列を、これらセクレターゼからマスクすることをほのめかす。

最近、ＢＲＩ２における突然変異が、ＦＢＤ（Ｖｉｄａｌら、１９９９）およびＦＤＤ（Ｖｉｄａｌら、２０００）患者において見出されている。野生型および突然変異体ＢＲＩ２両方が、フリンによりプロセシングされており（Ｋｉｍら、１９９９）、このプロセシングが、結果、Ｃ末ペプチドの分泌に至っている。フリンによる野生型ＢＲＩ２の開裂が、１７アミノ酸（ａａ）長のペプチドを放出させる。ＦＢＤ患者において、ＢＲＩ２の停止（ストップ）コドンでの点突然変異が、結果、３’−非翻訳領域の解読、および、余分な１１アミノ酸をＣ末において含有しているＢＲＩ２分子の合成に至る。フリンによるこの突然変異したＢＲＩ２の開裂が、より長いペプチドたるＡＢｒｉペプチドを生成させ、これがアミロイド繊維として沈着される。デンマークの家系において、正常停止コドンが、そのうちの最終のＣ末３４アミノ酸をアミロイドサブユニットが含む、正常よりも大きい前駆体蛋白を生成させるフレームシフトをＢＲＩ２配列において発生させる前、１０−ｎｔの存在が１コドンを倍とする。ＡＢｒｉおよびＡＤａｎアミロイドの沈着が、これらの痴呆の病原と考えられている。しかしながら、ＢＲＩ２が、ＡＰＰプロセシングを規制するとの知見が、魅惑的であり、代わったＡＰＰプロセシングも、ＦＢＤおよびＦＤＤにおける病原要因であるとの思索を促進させる。この仮定と一致して、ＦＤＤ患者において、上昇した濃度（レベル）のＡβ４２沈着が、ＣＡＡ病巣において、ＡＤａｎと共に検出されている。

実施例２．ＡＰＰプロセシングへのＢＲＩ２の効果に関する更なる研究
実施例１において記載された方法を使用しながら、最初の、８０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１１７、および１３１アミノ酸からなるＢＲＩ２欠損構築体の効果が、測定された。図４（左パネル）において示されたとおり、９９アミノ酸よりも大きい短縮だけが、総溶解物中におけるＣ９９の蓄積を示したが、このことが、Ｃ９９の更なるプロセシングの阻害を指し示す。最初の９６および９９アミノ酸からなる欠損構築体が、遙かにより乏しい阻害効果を示し、８０および９３（アミノ酸）からなるものが、該阻害を示さなかった。Ｃ９９プロセシングへのＢＲＩ２のこの阻害効果が、これらのＢＲＩ２短縮体の、Ｃ９９および全長ＡＰＰに対する結合と平行したが、図４において示されたとおりであった（その右のパネル）。同一セットの欠損構築体が、ＡＩＤ産生へのそれらの効果を求めてみるのに使用された。ＡＰＰ−Ｇａｌ４がドライヴィング・フォースのルシフェラーゼ活性の結果（図５）が更に、最初の９９アミノ酸よりも多くを含んでいるＢＲＩ２構築体が、ＡＩＤ産生の効率的な阻害に必要とされているとの結論を裏付ける。

実施例１が、ｓＡＰＰαがＢＲＩ２存在下に抑えられていることを確立させ、ＢＲＩ２がα−セクレターゼを阻害することを指し示している。更なる実験が実施され、ｓＡＰＰβ産生へのＢＲＩ２の効果を求めた。図６において示されたとおり、ｓＡＰＰβ産生も、ＢＲＩ２存在下に抑えられており、ＢＲＩ２がβ−セクレターゼを阻害することを指し示している。

上に鑑みると、本発明の幾つかの利点が達成されており、他の利点が達成されたことが分かる。

本発明範囲から逸脱してしまうことなく、上の方法および組成物において種々の変更がなされ得るので、上の記載において含有され、添付の図面において示された全事項が、例示として、限定している感覚ではなく解釈されると意図されている。

本明細書において引用された全文献が、本明細書において援用されている。本明細書におけるこれら文献に関する議論が単に、それらの著者によりなされた主張を要約すると意図されており、いずれの文献も、先行技術を構成するとは、全く認められていない。出願人は、これら引用された文献の精確さおよび適切さに挑む権利を確保する。

配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−ヒトＢＲＩ２アミノ酸配列 GenBank Q9Y287
1 mvkvtfhsal aqkeakkdep ksgeealiip pdavavdckd pddwpvgqr rawcwcmcfg
61 lafmlagvil ggaylykyfa lqpddvyycg ikyikddvil nepsadapaa lyqtieenik
121 ifeeeevefi svpvpefads dpanivhdfh kkltayldln ldkcyvipln tsivmpprnl
181 lellinikag tylpqsylih ebmvitdrie nidhlgffiy rlchdketyk lqrretikgi
241 qkreasncfa irhfenkfav etlics
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−ヒトＢＲＩ３アミノ酸配列 GenBank Q9NOX7.
1 mvkisfqpav agikgdkadk asasapapas ateilltpar eeqppqhrsk rggsvggvcy
61 lsmgmwlhn glvfasvyiy ryfflaqlar dnffrcgvly edslssqvrt qmeleedvki
121 yldenyerin vpvpqfgggd padiihdfqr gltayhdisl dkcyvielnt tivlpprnfw
181 ellmnvkrgt ylpqtyiiqe emwtehvsd kealgsfiyh lcngkdtyrl rrratrrrin
241 krgakncnai rhfentfVve tlicgw
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−ヒトフリン前原蛋白 GenBank NP002560
1 melrpwllwv vaatgtlvll aadaqgqkvf tntwavripg gpavansvar khgflnlgqi
61 fgdyyhfwhr gvtkrslsph rprhsrlqre pqvqwleqqv akrrtkrdvy qeptdpkfpq
121 qwylsgvtqr dlnvkaawaq gytghgiws ilddgieknh pdlagnydpg asfdvndqdp
181 dpqprytqmn dnrhgtrcag evaavanngv cgvgvaynar iggvrmldge vtdavearsl
241 glnpnhihiy saswgpeddg ktvdgparla eeaffrgvsq grgglgsifv wasgnggreh
301 dscncdgytn siytlsissa tqfgnvpwys eacsstlatt yssgnqnekq ivttdlrqkc
361 teshtgtsas aplaagiial tleanknltw rdmqhlwqt skpahhiand watngvgrkv
421 shsygyglld agamvalaqn wttvapqrkc iidiltepkd igkrlevrkt vtaclgepnh
481 itrlehaqar ltlsynrrgd laihlvspmg trstllaarp hdysadgfhd wafmtthswd
541 edpsgewvle ientseanny gtltkftlvl ygtapeglpv ppessgcktl tssqacwce
601 egfslhqksc vqhcppgfap qvldthyste ndvetirasv capchascat cqgpaltdcl
661 scpshasldp veqtcsrqsq ssresppqqq pprlppevea gqrlragllp shlpewagl
721 scafivlvfv tvflvlqlrs gfsfrgvkvy tmdrglisyk glppeawqee cpsdseedeg
781 rgertafikd qsal

ウェスタン・ブロットのダイヤグラムおよび写真であり、ＢＲＩ２が、ＡＰＰリガンドであることを確立している。 パネルａ：使用されたＢＲＩ２構築体の、スキーム表示である。これら構築体が、１（アミノ酸１〜２６６、全長）および２（アミノ酸１〜１３１）と付番されている。 パネルｂ−ｄ：抗ＦＬＡＧ免疫沈澱（ＩＰαＦＬＡＧ）のウェスタン・ブロット（ＷＢ）を示し、指し示された蛋白を発現しているＨｅＬａ細胞からの総溶解物（ＴＬ）が、ＢＲＩ２／ＡＰＰ会合の特異性を示し、これら相互作用部位を地図化（マッピング）する。ｐｃが、空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）を指し示し；数字１および２が、ａにおいて示されたＢＲＩ２構築体を指し示し；＊が、抑えられなかった抗ＦＬＡＧ抗体を指し示し；ｍ．が、成熟したグリコシル化された形のＡＰＰを指し；一方、ｉ．が、対応する未熟なグリコシル化されなかったＡＰＰを指し示す。ウェスタン・ブロットに関して、αＡＰＰが、モノクローナル抗体２２Ｃ１１を表す一方、αＡＰＰｃｔが、ＡＰＰのＣ−末に対して惹起されたウサギポリクローナルである。 パネルｅ：実験のウェスタン・ブロットであり、ここで、ＡＰＰおよびＢＲＩ２両方を用いてトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞の溶解物が、ウサギポリクローナルコントロール（ＲＰ）もしくはαＡＰＰ−ｃｔと共に沈澱された。免疫沈澱および総溶解物が、αＡＰＰモノクローナル抗体２２Ｃ１１もしくはαＦＬＡＧを用いてブロットされた。ＢＲＩ２が、〜１７ｋＤａのＢＲＩ２のＮ−末断片（ＢＲＩ２ｎｔ）同様、αＡＰＰｃｔにより、ＡＰＰと共に沈澱された。 ウェスタン・ブロットの写真であり、内因性ＡＰＰおよびＢＲＩ２が、成人脳において相互作用することを確立している。 パネルａ：ＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞からの溶解物が、ニワトリのコントロールの抗体（レーン３）、市販のニワトリのαＢＲＩ２抗体（レーン６）、蛋白Ａ／Ｇビーズ単独（レーン９）、コントロールのウサギポリクローナル抗体（レーン１２）、ウサギポリクローナルＥＮ３αＢＲＩ２抗体（レーン１５）、区別できるウサギαＢＲＩ２血清（レーン１８）、およびマウスαＢＲＩ２ポリクローナル抗体（レーン２１）と共に沈澱された。総溶解物（Ｌ）、上清（Ｓ）、および沈澱（Ｐ）が、ゲル濾過され、αＦＬＡＧを用いて探された。ＥＮ３だけが、ＢＲＩ２を沈澱させていくことができた。〜１７および１４ｋＤａのＢＲＩ２ｎｔ断片が沈澱しなかったが、これは、ＥＮ３により認識されるエピトープが、Ｃ−末〜Ｂｒｉｃｈｏｓ部位（ドメイン）であるからである。 パネルｂ：総脳ホモジェネートが、コントロールのウサギポリクローナル（ＲＰ）、αＡＰＰｃｔ、もしくはＥＮ３と共に免疫沈降された。総脳溶解物（Ｔ．Ｌ．）および免疫沈澱が、αＡＰＰモノクローナル抗体２２Ｃ１１（上のパネル）もしくはαＡＰＰｃｔ（下のパネル）を用いてブロットされた。 ウェスタン・ブロットのグラフおよび写真であり、ＢＲＩ２が、セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを規制することを確立している。 パネルａ−ｃ：ＢＲＩ２が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４がドライヴィング・フォースのルシフェラーゼ活性を、ＨｅＬａ、Ｎ２ａ、およびＨＥＫ２９３細胞において抑える。細胞が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃ）もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２、ＢＲＩ２^{１〜１３１}もしくはＢＡＣＥと共に、同時トランスフェクションされた。データが、空のベクターを用いてトランスフェクションされた細胞において測定されたルシフェラーゼ活性の％として、表現されている。ＢＲＩ２、ＢＡＣＥ、およびｐｃによりトランスフェクションされた細胞が、同様な濃度（レベル）のＡＰＰ−Ｇａｌ４を発現する（示さなかった）。誤差のバーが、３回の独立した実験に関する±ＳＤを表す。 パネルｄ：細胞が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４、ｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃ）、もしくはＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされた。ＡＰＰ−Ｇａｌ４を用いてトランスフェクションされた細胞が次いで、指し示された比において、ＢＲＩ２もしくはｐｃ．ＤＮＡ３．１によりトランスフェクションされた細胞と混合された。サンプルが、ルシフェラーゼ活性に関して、上記したとおり、トランスフェクションおよび混合の２４時間後、解析された。 パネルｅ−ｆ：ＢＲＩ２が、Ａβ４０／Ａβ４２産生を阻害する。安定にＡＰＰを発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ＡＰＰ）が、空のベクター（ｐｃ）、ＢＡＣＥ、もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされ、培地中において分泌されたＡβ４０およびＡβ４２が、ＥＬＩＳＡにより測定された。Ａβ量が、これらトランスフェクションされた細胞の溶解物の蛋白含量により、規格化された。誤差のバーが、３回の独立した実験に関する±ＳＤを表す。 パネルｇ：トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞に関しての、４種の独立の実験の代表たるパルス追跡実験。ＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、空のベクター（ｖｅｃｔｏｒ）もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされた。代謝標識された細胞の溶解物が、αＡＰＰｃｔと共に沈澱された。各レーン上の数字が、これら細胞が追跡された時間を指し示す（ｃ）。ＢＲＩ２発現が、Ｃ８３産生を減らす一方、劇的に、Ｃ９９生成を増やす。 パネルｈ：同様にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞の、条件を整えられた培地が４時間の標識後収集され、ｐ２１もしくは６Ｅ１０と共に沈澱された。ｓＡＰＰα量が、ＢＲＩ２により減った一方、総ｓＡＰＰ（ｓＡＰＰα＋ｓＡＰＰβ）が、ｓＡＰＰβ産生の増加、および、αからβセクレターゼに至るＡＰＰプロセシングの変化（シフト）を指し示している有意な変化を示さなかった。 パネルｉ：細胞が、ＡＰＬＰ２を用いて、ｐｃ．ＤＮＡ３．１もしくはＢＲＩ２と共にトランスフェクションされた。トランスフェクション２４時間後、細胞が、ウェスタン・ブロットにより、ＢＲＩ２およびＡＰＬＰ２ペプチドに関して、解析された。 ウェスタン・ブロットの写真であり、ＢＲＩ２の最初の１０２アミノ酸が、Ｃ９９の効率的な開裂を阻害するのに必要であること、ならびに、同一領域が、ＢＲＩ２の、ＡＰＰのＣ９９に対する結合に必要であることを確立している。左のパネルが、γ３０細胞からの総溶解物（ＴＬ）のウェスタン・ブロットを示し、γ３０細胞は安定にＡＰＰを発現し、空のベクター（ｖｅｃ）、ｍｙｃのタグを付けた全長ＢＲＩ２^{１〜２６６}（ＢＲＩ２）、もしくは、種々のｍｙｃのタグを付けたＢＲＩ２Ｃ−末欠損体を用いてトランスフェクションされた（当該構築体によりコードされたアミノ酸により指し示した）。右のパネルが、対応している溶解物の、抗ｍｙｃ免疫沈澱（ｍｙｃ ＩＰ）を示す。ＨＣが、この免疫沈降において使用されたｍｙｃ抗体の重鎖を指し示す。 ＡＰＰ−Ｇａｌ４がドライヴィング・フォースのルシフェラーゼ活性のグラフであり、ＢＲＩ２の最初の１０２アミノ酸が全て、ＡＩＤ産生を阻害するのに必要であることを確立している。ＨＥＫ２９３細胞が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４を用いて、空のベクター、もしくは、ｍｙｃのタグを付けた全長ＢＲＩ２、もしくは、種々のＢＲＩ２Ｃ−末欠損構築体と共にトランスフェクションされた（当該構築体によりカバーされたアミノ酸範囲により指し示した）。データが、空の該ベクターを用いてトランスフェクションされた細胞において測定されたルシフェラーゼ活性の％として、表現されている。誤差のバーが、３回の独立した実験に関する±ＳＤを表す。 ウェスタン・ブロットの写真であり、ＢＲＩ２が、ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ分泌を阻害することを確立している。ＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、空のベクター（−）もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２（＋）を用いて、トランスフェクションされた。ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβが、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中において４時間条件を整えられたトランスフェクションされた細胞培養から、検出された。ＡＰＰおよびＢＲＩ２発現が、これらトランスフェクションされた細胞の総溶解物のウェスタン・ブロットにより、確認された。ＡＰＰ発現が、有意に変化しない。

Claims (95)

1. 細胞により、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防する方法であって、該細胞を、該細胞により、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防するに有効な量のＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体と接触させることを含む、方法。
2. 前記細胞が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を持っているヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を持っているヒトＢＲＩ３蛋白の、アミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３と接触され、ここで、該ＢＲＩ２蛋白および該ＢＲＩ３蛋白がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項１の方法。
3. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が天然起源蛋白である、請求項２の方法。
4. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくともある部分に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項２の方法。
5. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくともある部分に少なくとも９５％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項２の方法。
6. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくともある部分に少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項２の方法。
7. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくともある部分に１００％相同である、請求項２の方法。
8. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、２５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
9. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、２００よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
10. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、１５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
11. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、１２５よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
12. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を持っているヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含む、請求項２の方法。
13. 前記細胞が、ＢＲＩ２と接触される、請求項１の方法。
14. 前記細胞が、ＢＲＩ３と接触される、請求項１の方法。
15. 前記細胞が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体と接触される、請求項１の方法。
16. 前記細胞が神経である、請求項１の方法。
17. 前記細胞が、神経様であるか、もしくは、神経へと分化していくことができる、請求項１の方法。
18. 前記細胞が、生存動物中にある、請求項１の方法。
19. 前記細胞が、生存動物中の神経である、請求項１の方法。
20. 前記細胞が、生存ヒト中にある、請求項１の方法。
21. 前記細胞が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の少なくともある前記部分をコード化している核酸配列を含んでいるベクターと接触される、請求項１の方法。
22. 前記ベクターが、前記細胞を感染させているウィルスベクターである、請求項２１の方法。
23. 細胞により、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防する方法であって、該細胞をフリンと、該細胞におけるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防するに有効な量で接触させることを含む、方法。
24. 前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を持っているヒトフリンに少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２３の方法。
25. 前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を持っているヒトフリンに少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２３の方法。
26. 前記フリンがヒトフリンである、請求項２３の方法。
27. 前記細胞が、フリン蛋白と接触される、請求項２３の方法。
28. 前記フリン蛋白が、当該フリン蛋白をコード化している核酸配列を含んでいるベクターにより発現されている、請求項２７の方法。
29. 前記ベクターがウィルスベクターである、請求項２８の方法。
30. 前記細胞が神経である、請求項２３の方法。
31. 前記細胞が、神経様であるか、もしくは、神経へと分化していくことができる、請求項２３の方法。
32. 前記細胞が、生存動物中にある、請求項２３の方法。
33. 前記細胞が、生存動物中における神経である、請求項２３の方法。
34. 前記細胞が、生存ヒト中にある、請求項２３の方法。
35. アルツハイマー病を持っている被験体を処置する方法であって、該被験体に、該被験体におけるアルツハイマー病を処置するに有効量のＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を投与することを含む、方法。
36. 前記被験体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヒトＢＲＩ２蛋白配列、もしくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヒトＢＲＩ３蛋白配列の、アミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を投与され、ここで、該ＢＲＩ２蛋白および該ＢＲＩ３蛋白がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項３５の方法。
37. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が天然起源蛋白である、請求項３６の方法。
38. 前記被験体が、ＢＲＩ２を投与される、請求項３５の方法。
39. 前記被験体が、ＢＲＩ３を投与される、請求項３５の方法。
40. 前記被験体が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体を投与される、請求項３５の方法。
41. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が直接、前記被験体の脳に投与される、請求項３５の方法。
42. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体の、前記被験体の血液脳関門を横断できる能力を高める医薬組成物中において製剤されている、請求項３５の方法。
43. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を、前記動物の血液脳関門を横断するようにさせるよう投与される、請求項３５の方法。
44. アルツハイマー病を持っている被験体を処置する方法であって、該被験体に、該被験体におけるアルツハイマー病を処置するに有効量のフリンを投与することを含む、方法。
45. 前記被験体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を持っているヒトフリンに等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含むフリンを投与され、ここで、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項４４の方法。
46. 前記フリンが天然起源蛋白である、請求項４４の方法。
47. 前記フリンが直接、前記被験体の脳に投与される、請求項４４の方法。
48. 前記フリンが、当該フリンの、前記被験体の血液脳関門を横断できる能力を高める医薬組成物中において製剤されている、請求項４４の方法。
49. 前記フリンが、前記化合物を、前記動物の血液脳関門を横断するようにさせるよう投与される、請求項４４の方法。
50. 化合物が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体であるかどうか決定する方法であって：
    該化合物を、機能しているγ−セクレターゼ、および、Ｃ９９を含んでいる膜結合蛋白と組み合わせ、次いで、該化合物が、Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害するかどうか決定することを含み、ここで、該化合物が、もしγ−セクレターゼによるＣ９９の開裂を阻害すれば、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体である、方法。
51. Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物が、Ａβおよび／またはＡＩＤの放出を阻害するかどうか決定することにより決定される、請求項５０の方法。
52. Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物が、Ｃ９９存在の増加を引き起こすかどうか決定することにより決定される、請求項５０の方法。
53. Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物が、Ｃ８３存在の減少を引き起こすかどうか決定することにより決定される、請求項５０の方法。
54. Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物が、ｓＡＰＰα存在の減少を引き起こすかどうか決定することにより決定される、請求項５０の方法。
55. Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物が、ｓＡＰＰβ存在の増加を引き起こすかどうか決定することにより決定される、請求項５０の方法。
56. 前記方法がＥＬＩＳＡを利用し、ペプチドを定量する、請求項５０の方法。
57. 前記方法が質量分析を利用する、請求項５０の方法。
58. 前記方法がウェスタン・ブロットを利用し、ペプチドを同定および／または定量する、請求項５０の方法。
59. 前記化合物が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ持っているヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含んでいるＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のある部分を模倣するよう設計（デザイン）されている、請求項５０の方法。
60. 前記化合物が、前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の前記部分の３次元構造および／または電荷を模倣する、請求項５９の方法。
61. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白が、ＢＲＩ２蛋白である、請求項５９の方法。
62. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白が、ＢＲＩ３蛋白である、請求項５９の方法。
63. Ｃ９９を含んでいる前記膜結合蛋白が、アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）である、請求項５０の方法。
64. 機能している前記γ−セクレターゼ、および、Ｃ９９を含んでいる膜結合蛋白が、生存細胞中にある、請求項５０の方法。
65. 前記生存細胞が、γ−セクレターゼによる遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰ開裂時、レポーター遺伝子の転写を活性化させる遺伝子構築体を含む、請求項５０の方法。
66. 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項６５の方法。
67. 前記遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰが更に、Ｇａｌ４を、当該遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰの細胞質部位（ドメイン）で含む、請求項６５の方法。
68. 前記生存哺乳類細胞が、神経細胞である、請求項６４の方法。
69. 前記生存哺乳類細胞が、遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰを産生する、請求項６４の方法。
70. 前記生存哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、もしくはＮ２ａ細胞由来である、請求項６９の方法。
71. 精製ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を、医薬として許容可能な賦形剤中において含む組成物。
72. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を持っているヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を持っているヒトＢＲＩ３蛋白の、アミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、該ＢＲＩ２蛋白および該ＢＲＩ３蛋白がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項７１の組成物。
73. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がＢＲＩ２である、請求項７１の組成物。
74. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がＢＲＩ３である、請求項７１の組成物。
75. 前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、２５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
76. 前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、２００よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
77. 前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、１５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
78. 前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、１２５よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
79. 医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、前記被験体の血液脳関門を横断できる能力を高める、請求項７１の組成物。
80. 前記組成物が、単位用量の形で、アルツハイマー病処置用に製剤されている、請求項７１の組成物。
81. 精製フリンを、医薬として許容可能な賦形剤中において含む組成物。
82. 前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を持っているヒトフリンに等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項８１の組成物。
83. 前記フリンが天然起源蛋白である、請求項８１の組成物。
84. 医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記フリンの、前記被験体の血液脳関門を横断できる能力を高める、請求項８１の組成物。
85. 前記組成物が、単位用量の形で、アルツハイマー病処置用に製剤されている、請求項８１の組成物。
86. ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３をコード化しているベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中において含む組成物。
87. 前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を持っているヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を持っているヒトＢＲＩ３蛋白の、アミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含み、ここで、該ＢＲＩ２蛋白および該ＢＲＩ３蛋白がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項８６の組成物。
88. 医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、前記被験体の血液脳関門を横断できる能力を高める、請求項８６の組成物。
89. 前記組成物が、単位用量の形で、アルツハイマー病処置用に製剤されている、請求項８６の組成物。
90. 前記ベクターがウィルスである、請求項８６の組成物。
91. フリンをコード化しているベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中において含む組成物。
92. 前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を持っているヒトフリンに等価なアミノ酸を含み、ここで、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項９１の組成物。
93. 前記フリンが天然起源蛋白である、請求項９１の組成物。
94. 医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記フリンの、前記被験体の血液脳関門を横断できる能力を高める、請求項９１の組成物。
95. 前記組成物が、単位用量の形で、アルツハイマー病処置用に製剤されている、請求項９１の組成物。

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