JP2008545430A - 短い核酸のマルチプレックス増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
本教示は、分子および細胞生物学の分野、特に短い核酸(例えば、マイクロRNA)のマルチプレックス増幅の分野中に存在する。
分子生物学における非常に多くの分野は、標的ポリヌクレオチド配列の同定を必要とする。逆転写および増幅は、標的ポリヌクレオチドの正体を尋ねるため(query)に用いられる、二つの頻繁に使用される手順である。ポストゲノミクス(post−genomics)時代において、科学者に利用可能な配列情報の量の増加は、複雑な核酸試料を尋ねるために、迅速な、信頼性のある、低コストで、高スループットであり、感度の高く、かつ正確な方法のための、増加した必要性を生み出した。細胞を規定および特徴付ける方法は、強固な増幅技術、および慣習的に分析された分子(例えば、メッセンジャーRNA)の分子の複雑さによって妨げられている。マイクロRNAは、細胞機能の理解において顕著な見込みを提供する、最近発見された分子クラスである。しかしながら、マイクロRNAの定量的分析は、これらの比較的短いサイズにより、妨げられている。
いくつかの実施形態においては、本教示は、短い標的核酸のそれぞれが18〜30ヌクレオチド長である、少なくとも300の異なる短い標的核酸を定量する方法を提供し、上記方法は、以下、上記少なくとも300の異なる短い標的核酸と、少なくとも300の異なる標的特異的ステムループ逆転写プライマーとを接触させる工程であって、ここで、上記少なくとも300のステムループ逆転写プライマーのそれぞれが、独特の3’標的特異的部分、独特のzipコード化ステム、およびループを含む、工程;上記少なくとも300のステムループ逆転写プライマーを、逆転写反応において伸長させ、逆転写産物の収集物を形成する工程;PCRに基づくプレ増幅産物の収集物を形成するために、逆転写産物の収集物に対し、PCRに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで上記PCRに基づくプレ増幅が、少なくとも300の異なるフォワードプライマーおよび少なくとも一つのリバースプライマーを含み、ここで上記リバースプライマーの配列が、少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、およびTm増大テイルを含む、工程;(この工程においては、少なくとも300の異なるフォワードプライマーのそれぞれが、i)特定の逆転写産物の配列の5’末端に相補的である3’標的特異的部分、およびii)特定の逆転写産物の配列に独特である5’zipコードテイルを含む);そして、PCRに基づくプレ増幅産物の収集物を、少なくとも300の異なる反応容器へ分割する工程;上記少なくとも300の異なる反応容器において復号PCRを行う工程であって、ここでそれぞれの復号PCRは、特定の標的核酸配列のための上記PCRに基づくプレ増幅反応におけるフォワードプライマーと実質的に同じ配列を含むフォワードプライマー、リバースプライマー、および検出プローブを含み、ここで上記検出プローブの配列は、i)特定のステムループ逆転写プライマーの3’ステム領域と同じである、少なくとも6核酸塩基の配列、およびii)特定のステムループ逆転写プライマーにより尋ねられる短い標的核酸に相補的である、少なくとも6核酸塩基の配列を含む、工程;上記少なくとも300の異なる反応容器において、検出プローブを検出する工程;ならびに、上記少なくとも300の異なる短い標的核酸を定量する工程を包含する。
本教示の局面は、以下の実施例を考慮してさらに理解され得る(あらゆる方法において、本教示の範囲は限定的に解釈されるべきではない)。本明細書で使用されるセクションの表題は、単に構成的目的のためであり、そしていかなる方法においても記述された主題を限定するとは解釈されない。本出願に引用されるすべての文献および類似の資料(特許、特許出願、記事、書籍、論文、およびインターネットのウエブページが挙げられるが、これらには限定されない)は、あらゆる目的のためにそれらの全体が、参考として明示的に援用される。援用された参考文献中の用語の定義が、本教示中に規定された定義と異なっている場合、本教示中の定義が統制する。わずかなそして実質のない偏差が、本明細書の教示の範囲内であるように、本教示中において、論議される温度、濃度、時間、などの前の含意された「約」が存在することが理解される。本出願において、別に具体的に述べられない限り、単数形の使用は複数形を含む。例えば、「プライマー」は、1より多いプライマーが、存在し得る(しかし存在する必要はない)ということを意味する;例えば、1コピー以上の特定のプライマー種のおよび1様式以上の特異的プライマー型(しかしこれらに制限されない)、例えば、複数の異なったフォーワードプライマー(しかしこれらに制限されない)。また、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(contain)」、「含む」(contains)、「含む(containing)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、および「含む(including)」の使用は、制限を意図しない。前述の一般的な記述および次の詳細な記述の両方は、単に例示的および説明的であり、そして本発明の制限とはならないことを理解すべきである。
本明細書中で使用される、用語「標的核酸」は、増幅および/または定量されることが求められるポリヌクレオチド配列を指す。上記標的ポリヌクレオチドは、あらゆる供給源から獲得し得、そしてかなり多数の異なった組成の構成部分を含み得る。例えば、上記標的は、核酸(例えば、DNAまたはRNA)、トランスファーRNA、siRNAであり得、そして核酸アナログまたは他の核酸模倣物(mimic)を含み得る(一般的には、上記標的は、メッセンジャーRNA(mRNA)および/またはマイクロRNA(miRNA)であるが)。上記標的は、メチル化され得るか、メチル化され得ないか、またはその両方をされ得る。上記標的は、ウラシルへ変換される、亜硫酸水素塩処理され、かつメチル化されていないシトシンであり得る。さらに、「標的ポリヌクレオチド」は、標的ポリヌクレオチドそのもの、およびその代用物(surrogate)(例えば、増幅産物)、ならびに本来の配列を指し得ることが理解される。いくつかの実施形態において、上記標的ポリヌクレオチドは、減成された供給源由来の短いDNA分子であり、このような標的ヌクレオチドは、例えば、法医学試料(例えば、Butler,2001,Forensic DNA Typing:Biology and Technology Behind STR Markersを参照のこと)(しかし、これらには制限されない)に存在し得る。本教示の標的ポリヌクレオチドは、任意の多数の供給源(限定するものではないが、ウイルス、原核生物、真核生物(例えば、植物、真菌、および動物(しかしこれらに制限されない))が挙げられる)に由来し得る。これらの供給源として、全血、組織バイオプシー、リンパ、骨髄、羊水、毛、皮膚、精液、生物戦争用薬品(biowarfare agent)、肛門分泌、膣分泌、発汗、唾液、頬側スワブ、種々の環境試料(例えば、農業、水、および土壌の試料)、一般的な研究試料、一般的な精製試料、培養細胞、溶解させた細胞を含み得るが、これらに制限されない。標的ポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知である任意のいろいろな手順(例えば、Applied Biosystems ABI PrismTM 6100 Nucleic Acid PrepStation,およびABI PrismTM 6700 Automated Nucleic Acid Workstation、Boom et al.,米国特許第5,234,809号,mirVana RNA isolation kit(Ambion)、など)を使用し、試料から単離され得ることが理解される。標的ポリヌクレオチドは、分析より前に、切断または剪断され得る(機械的な力、超音波処理、制限エンドヌクレアーゼ切断、または当該技術分野で任意の公知の方法、のような手順の使用が挙げられる)ことが理解される。いくつかの実施形態においては、標的ポリヌクレオチドは二重鎖であり得、そして一本鎖は変性に起因し得るが、一般に、本教示の標的ポリヌクレオチドは一本鎖である。
図1は、本教示のいくつかの実施形態に記載の特定の構成内容を描写する。上段、miRNA分子(1、破線)が描写される。中段、ステムループ逆転写プライマー(2)が描写される(3’標的特異的部分(3)、ステム(4)、およびループ(5)を例示する)。下段、ステムループプライマー(2)にハイブリダイズさせた、miRNA(1)が描写される(miRNA(1)の3’末端領域(6)にハイブリダイズさせた、ステムループプライマー(2)の3’標的特異的部分(3)を例示する)。
配列番号2:5’UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU3’
配列番号3:5’CATATCAACTACTCCTTTAACGGCTGAGGTGCTGTGAGGAGTAG3’
配列番号4:5’TTTCCTCATCAACTATAC3’
配列番号5:5’CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCAA3’。
いくつかの実施形態においては、本教示は、サーマルサイクリングによる増強された逆転写プライマー利用のための方法を提供する。無意識的に制限を意図することなく、本教示のサイクリング方法は、誤ったプライマーの低温での会合を破壊し、そして反復性の相同的なプライマー/RNA核形成を可能にする、と考えられており、従って逆転写反応産物量を増加させている。本教示の方法は、miRNA逆転写反応において逆転写産物を増加させること、および標的核酸としてメッセンジャーRNA(mRNA)を含むマルチプレックスRT−PCR反応において逆転写産物を増加させること、を含むいくらかの状況に応用され得る。
いくつかの実施形態においては、最初の温度(変性温度)は、47℃〜53℃であり、そして2番目の温度(アニーリング/伸長温度)は37℃〜43℃である。
いくつかの実施形態においては、サイクリングは、以下の3つのセグメントを含む:低温セグメント、中温セグメント、高温セグメント。制限することを意図することなく、3つのセグメントそれぞれの間に起こる優勢な反応は、次のように考えられ得る:上記低温セグメントは、アニーリングセグメントと考えられ得、上記中温セグメントは、伸長セグメントと考えられ得、そして上記高温セグメントは、変性セグメントと考えられ得る。したがって、いくつかの実施形態においては、サイクリング逆転写反応は、最初16℃での30分間のインキュベーションを含み得、これに20℃での30秒間、42℃での30秒間、および50℃での1秒間の、60サイクルが続く。これらの60サイクルに、逆転写酵素を不活性化する工程、例えば、5分間、温度を85℃まで上昇させることが続き得る。
特定の実施形態において、本教示はまた、特定の方法を行うことをはかどらせるために設計されたキットを提供する。いくつかの実施形態においては、キットは、この方法を実行することに使用される2以上の構成要素を集合させることにより、目的の方法を行うことをはかどらせるのに役立つ。いくつかの実施形態においては、キットは、最終消費者による測定のために必要なことを最小にするために、あらかじめ測定した単位量の構成要素を含み得る。いくつかの実施形態においては、キットは、本教示の1以上の方法を行うことのための説明書を含み得る。特定の実施形態において、上記キットの構成要素は、お互いに関連して機能するように最適化されている。
5ulの逆転写反応は、10倍濃度のcDNA Archivingキットバッファー(Applied Biosystems)を5ul、0.335ulのMMLV逆転写酵素(50U/ul)、100mM dNTPを0.25ul、AB RNase阻害剤20u/ulを0.065ul、330構成単位のリバースステムループプライマー(それぞれ50nM)を0.5ul、ヒト肺精製総RNAを2ul、および1.35ulのH2Oを含む。反応混合物を、RNA試料の2ulを、少なくとも10反応のための残りの反応成分を含む新たに調製したストック反応混合物の3ulへ加えることにより調製した。上記反応を次のインキュベーション条件を用いて行った:(20℃/30秒〜42℃/30秒〜50℃/1秒)60サイクル。続いて、85℃で5分間のインキュベーションにより、上記酵素を不活性化した。
PCRに基づくプレ増幅は、25ulを含んだ。この中に、UNGを含まない2倍濃度のUniversal Master Mix 9R(Applied Biosystems)を12.5ul、RT試料を5ul、330構成単位のフォワードプライマー(500nM)それぞれを2.5ul、100uMのユニバーサルリバースプライマーを1.25ul、5u/ulのAmpliTaq Gold(登録商標)を1.25ul、100mM dNTPを0.5ul、100mM MgCl2を0.5ul、および1.5ulのdH2Oを含む。反応に関する温度のプロフィールは、Taq−GOLD(登録商標)を活性化するための95℃で10分間のインキュベーション、55℃での2分間のインキュベーションを含み、これに、95℃で1秒間および65℃で1分間の18サイクルが続いた。
PCRに基づくプレ増幅からの産物の25ulへ、75ulのH2Oを加え、100ulへ希釈した。それぞれのTaqMan(登録商標)反応についての検出プローブは、5’側にFamおよび3’側にクエンチャーMGB(マイナーグルーブ結合剤)を含んだ。リアルタイム反応の混合物は、UNGを含まない2倍濃度のUniversal Master Mix(登録商標)(Applied Biosystems)を5ul、5uMのフォワードプライマーと1uMのTaqMan(登録商標)プローブとの混合物を、2ul、100uMユニバーサルリバースプライマーを0.1ul、4倍濃度の希釈したPCRに基づくプレ増幅試料を0.1ul、および2.8ulのdH2Oを含んだ。リアルタイム反応の混合物を、個々のフォワードプライマーおよびTaqMan(登録商標)プローブの2ulを、リアルタイムPCR試薬の残りを含む、新たに調製したストック溶液の8ulへ加えることにより集めた。リアルタイムPCRを、95℃、10分間でのホットスタート、続いて95℃で15秒間および60℃で1分間の、40サイクルからなる温度管理様式を用いて、384ウェル形式におけるAB 7900 HT Sequence Detection Systemに基づいて行った。それぞれのmiRNAに関しての上記リアルタイムPCRを、二連で処理した。
最近(Lao et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications(2006),343:85−89)、本発明者らは、上記短いmiRNAを、はるかに長いステムループプライマーの3’末端に位置していた、短い8ヌクレオチドのプライミングRT配列と、3’末端に上記miRNA配列の残りを有するフォワードの、二番目の鎖合成プライマーと5’末端における任意のTm増大配列との間で分配することによって、複数のmiRNAの概略を提示し得ることを示した。これらのプライマーを、マルチプレックスな方法でmiRNAを逆転写およびPCR増幅することに使用し、個別のシングルプレックスリアルタイムPCRのための十分な試料を提供し、増幅されたmiRNAのそれぞれの相対的濃度を決定した。上記反応は、PCRに基づくプレ増幅反応の多くのサイクルに関して強固であったが、マルチプレックスのレベルの増加は、総ヒト肺miRNAの、シングルプレックスプロフィールとマルチプレックスプロフィールとを比較するプロットへ、ばらつき度の増加を加える。ばらつき度を減ずるために、本発明者らは、miRNAを、48のmiRNAに対するプライマーのマルチプレックス群へ分類した。
Claims (41)
- それぞれの短い標的核酸が18〜30ヌクレオチド長である、少なくとも300の異なる短い標的核酸を定量するための方法であって、該方法が、以下、
該少なくとも300の異なる短い標的核酸と、少なくとも300の異なる標的特異的ステムループ逆転写プライマーとを接触させる工程であって、ここでそれぞれの該少なくとも300のステムループ逆転写プライマーが、固有の3’標的特異的部分、固有のzipコード化ステム、およびループを含む、工程;
逆転写産物の収集物を形成するために、逆転写反応において、該少なくとも300のステムループ逆転写プライマーを伸長する工程;
PCRに基づくプレ増幅(PCR−based pre−amplification)産物の収集物を形成するために該逆転写産物の収集物に対し、PCRに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで、該PCRに基づくプレ増幅が、少なくとも300の異なるフォワードプライマーおよび少なくとも一つのリバースプライマーを含み、ここで該リバースプライマーの配列が、該少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、およびTm増大テイルを含み、;
この工程においては、それぞれの該少なくとも300の異なるフォワードプライマーが、i)特定の逆転写産物の配列の5’末端に相補的である3’標的特異的部分、およびii)特定の逆転写産物の配列に独特である5’zipコードテイルを含む、工程;そして
該PCRに基づくプレ増幅産物の収集物を少なくとも300の異なる反応容器へ分ける工程;
該300の異なる反応容器のそれぞれにおいて復号PCRを行う工程であって、ここでそれぞれの復号PCRは、特定の標的核酸配列に関する該PCRに基づくプレ増幅反応におけるフォワードプライマーと実質的に同じ配列を含むフォワードプライマー、リバースプライマー、および検出プローブを含み、ここで、該検出プローブの配列は、i)特定のステムループ逆転写プライマーの3’ステム領域と同じである少なくとも6核酸塩基の配列、およびii)該特定のステムループ逆転写プライマーにより尋ねられる該短い標的核酸に対して相補的である少なくとも6核酸塩基の配列を含む、工程;
該少なくとも300の異なる反応容器のそれぞれにおいて、該検出プローブを検出する工程;ならびに、
該少なくとも300の異なる短い標的核酸を定量する工程を含む、方法。 - 前記逆転写がサイクリングを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記サイクリングが、20℃で30秒間、42℃で30秒間、および50℃で1秒間の60サイクルを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記PCRに基づくプレ増幅が、12〜20サイクルを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記PCRに基づくプレ増幅が、14〜18サイクルを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記12〜20サイクルそれぞれが、95℃で1秒間および65℃で1分間を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記少なくとも300の短い標的核酸が、マイクロRNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも300の短い標的核酸が、単一の細胞から収集される、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも300のステムループ逆転写プライマーが、実質的に同じループ配列を含み、そして前記PCRに基づくプレ増幅反応において使用される前記リバースプライマーの配列が、該ループの配列の少なくとも70パーセントを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記PCRに基づくプレ増幅反応における少なくとも一つのリバースプライマーの前記Tm増大テイルが、少なくとも4核酸塩基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記PCRに基づくプレ増幅反応における、少なくとも一つのリバースプライマーの前記Tm増大テイルが、5核酸塩基である、請求項1に記載の方法。
- 標的核酸を定量するための方法であって、以下、
該標的核酸と標的特異的ステムループ逆転写プライマーを接触させる工程であって、該ステムループ逆転写プライマーが、3’標的特異的部分、zipコード化ステム、およびループを含む、工程;
逆転写産物を形成するために、逆転写反応において該ステムループ逆転写プライマーを伸長する工程;
PCRに基づくプレ増幅産物を形成するために、該逆転写産物に対しPCRに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで該PCRに基づくプレ増幅が、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで該リバースプライマーの配列が、該少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、および非相補的テイルを含み、ここで該フォワードプライマーの配列が、i)特定の逆転写産物の配列の5’末端に相補的である配列、およびii)5’zipコードテイルを含む、工程;
該PCRに基づくプレ増幅の産物のアリコートに対し復号PCRを行う工程であって、該復号PCRは、該PCRに基づくプレ増幅反応におけるフォワードプライマーと同じ配列であるフォワードプライマー、該PCRに基づくプレ増幅反応におけるリバースプライマーと実質的に同じ配列を含むリバースプライマー、および、検出プローブを含み、該検出プローブの配列が、i)該ステムループリバースプライマーの3’ステム領域と同じである、少なくとも6塩基の配列、およびii)該標的核酸に対して相補的である、少なくとも6塩基の配列を含む、工程;
該検出プローブを検出する工程;ならびに
該標的核酸を定量する工程を含む、方法。 - 前記逆転写がサイクリングを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記標的核酸がマイクロRNAである、請求項12に記載の方法。
- 前記標的核酸が単一の細胞から収集される、請求項12に記載の方法。
- 前記PCRに基づくプレ増幅反応において使用される前記リバースプライマーが、前記ステムループ逆転写プライマーのループと、実質的に同じ配列を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記標的核酸が18〜30ヌクレオチド長である、請求項12に記載の方法。
- 前記逆転写がサイクリングを含み、そして該サイクリングが、20℃で30秒間、42℃で30秒間、および50℃で1秒間の60サイクルを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記PCRに基づくプレ増幅が12〜20サイクルを含む、請求項12に記載の方法。
- それぞれの短い標的核酸が18〜30ヌクレオチド長である、少なくとも300の短い標的核酸を定量するための方法であって、該方法が、
マルチプレックスの逆転写反応を行う工程;
マルチプレックスのPCRに基づくプレ増幅反応を行う工程;
少なくとも300の異なる復号PCRを行う工程;および
それぞれの短い標的核酸が18〜30ヌクレオチド長である、すくなくとも300の短い標的核酸を定量する工程を含む、方法。 - 前記マルチプレックスの逆転写反応がサイクリングを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記短い標的核酸がマイクロRNAである、請求項20に記載の方法。
- 前記短い標的核酸が単一の細胞から収集される、請求項20に記載の方法。
- 前記短い標的核酸が18〜30ヌクレオチド長である、請求項20に記載の方法。
- 前記マルチプレックスの逆転写反応が、サイクリングを含み、そして、該サイクリングが、20℃で30秒間、42℃で30秒間、および50℃で1秒間の60サイクルを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記マルチプレックスのPCRに基づくプレ増幅が、12〜20サイクルを含む、請求項20に記載の方法。
- 標的核酸を増幅するための方法であって、以下、
該標的核酸と標的特異的ステムループ逆転写プライマーとを接触させる工程であって、該ステムループ逆転写プライマーが、3’標的特異的部分、zipコード化ステム、およびループを含む、工程;
逆転写産物を形成するために、逆転写反応において該ステムループ逆転写プライマーを伸長する工程であって、該逆転写反応がサイクリングを含む、工程;
PCRに基づくプレ増幅産物を形成するために、該逆転写産物に対してPCRに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで該PCRに基づくプレ増幅が、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、該リバースプライマーの配列が、該少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、およびTm増大テイルを含み、そして該フォワードプライマーの配列が、i)特定の逆転写産物の配列の5’末端に相補的である配列、およびii)5’zipコードテイルを含む、工程;ならびに
該標的核酸を増幅する工程を含む、方法。 - 前記マルチプレックスの逆転写反応が、サイクリングを含む、請求項27に記載の方法。
- 前記短い標的核酸が、マイクロRNAである、請求項27に記載の方法。
- 前記短い標的核酸が、単一の細胞から収集される、請求項27に記載の方法。
- 前記短い標的核酸が18〜30ヌクレオチド長である、請求項27に記載の方法。
- 前記マルチプレックスの逆転写反応が、サイクリングを含み、ならびに、該サイクリングが20℃で30秒間、42℃で30秒間、および、50℃で1秒間の60サイクルを含む、請求項27に記載の方法。
- 前記マルチプレックスのPCRに基づくプレ増幅が12〜20サイクルを含む、請求項27に記載の方法。
- 少なくとも300の短い標的核酸を増幅するためのキットであって、該キットが、以下、
それぞれ実質的に同じループ配列を含む、少なくとも300のステムループ逆転写プライマー;
それぞれ別個の3’標的特異的部分および別個の5’テイルを含む、少なくとも300のフォワードプライマー;
ユニバーサルリバースプライマーであって、ここで該ユニバーサルリバースプライマーの配列が、該少なくとも300のステムループ逆転写プライマーのループ中に含まれている配列と実質的に同じ配列、およびTm増大テイルを含む、ユニバーサルリバースプライマーを含む、キット。 - さらに逆転写酵素を含む、請求項34に記載のキット。
- さらにdNTPを含む、請求項34に記載のキット。
- さらにDNAポリメラーゼを含む、請求項34に記載のキット。
- さらにマイクロタイタープレートを含む、請求項34に記載のキットであって、少なくとも330のフォワードプライマーのそれぞれ、および前記ユニバーサルリバースプライマーが別々のウェルに配置させられている、キット。
- 18〜35核酸塩基長の少なくとも300の異なる短い標的核酸を含む組成物であって、該少なくとも300の異なる短い標的核酸のそれぞれが、固有のステムループ逆転写プライマーにハイブリダイズされ、該少なくとも300のステムループ逆転写プライマーのそれぞれが、実質的に同じループ配列ならびに固有のzipコードステム部分および固有の3’標的特異的部分を含む、組成物。
- さらに逆転写酵素を含む、請求項39に記載の組成物。
- さらにdNTPを含む、請求項39に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (13)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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