JP2008545395A - アンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節する化合物の同定方法 - Google Patents
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Abstract
アンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できるかどうかを決定する方法が開示される。試験化合物が、β−カテニン−Wntシグナル化経路よりもアンドロゲンレセプターシグナル化経路を、あるいはアンドロゲンレセプターシグナル化経路よりもβ−カテニン−Wntシグナル化経路を選択的に調節するかどうかを決定する方法も開示される。
Description
本出願は、全体として本発明の一部として参照される、2005年5月19日に出願された、米国仮出願番号60/682,580の優先権を主張する。
本発明は、アンドロゲンレセプター(AR)とβ−カテニン間のアンドロゲン−依存性相互作用を調節する化合物を同定するための分析法に関する。本発明は特に、アンドロゲンレセプターとβ−カテニン間の相互作用を妨害でき、これにより、ARシグナル化に対するβ−カテニンの影響を特異的に除去するか、またはβカテニンおよびWntシグナル化に対するARの影響を除去する分子の同定に関する。
本発明は、アンドロゲンレセプター(AR)とβ−カテニン間のアンドロゲン−依存性相互作用を調節する化合物を同定するための分析法に関する。本発明は特に、アンドロゲンレセプターとβ−カテニン間の相互作用を妨害でき、これにより、ARシグナル化に対するβ−カテニンの影響を特異的に除去するか、またはβカテニンおよびWntシグナル化に対するARの影響を除去する分子の同定に関する。
伝統的に、核/ステロイドレセプター結合リガンドは、試験化合物の、核/ステロイドレセプターに対して反応性のコンセンサス核レセプターDNAエレメントを含有する遺伝子の転写に影響を及ぼす能力についてスクリーニングすることにより同定される。しかしながら、いくつかのステロイドレセプターも影響を及ぼし、その古典的なステロイド転写制御メカニズムに加えて、非ステロイドシグナル化経路により影響を受ける。多くの場合において、かかるレセプターと関連する非ステロイドシグナル化経路のみの調節において選択的に有効である特定化合物、またはかかるレセプターに対して伝統的に反応性である遺伝子に対するレセプターの転写活性のみの調節において選択的に有効な化合物を同定する手段を有することが有用である。かかる選択性を有する化合物は、非ステロイド経路の調節が望ましいが、古典的ステロイドレセプターによる転写の阻害が望ましくないか、またはその逆である状況において潜在的な医薬的有用性を有する。
例えば、AR反応性遺伝子の転写を活性化することが知られている古典的ステロイドレセプターであるアンドロゲンレセプター(AR)は、ARとβ−カテニンのアンドロゲンによる相互作用によりWntシグナル化経路にも影響を及ぼすことが知られている(1,2,3)。Wnt経路は、骨、腸、皮膚、および毛包をはじめとする様々な組織の分化および機能的活性において重要な役割を果たす。Wnt経路における変化は、骨粗鬆症ならびに前立腺癌および結腸癌などの病状に関与している。Wntシグナル化が変わる他の状態は、多嚢胞性卵巣症候群におけるインスリン耐性および男性ホルモン性脱毛症を包含する(4,5)。これらの状態の多くにおいて、アンドロゲンおよびARは、Wnt経路の潜在的なモジュレーターとして関与する。
米国特許第5,283,173号公報
米国特許第5,468,614号公報
Yang F、Li X、Sharma M、Sasaki C、Longo D、Lim B、Sun Z. (2002) J. Biol. Chem. 277: 13; 11336−11344
Pawlowski J、Ertel J、Allen M、Xu M、Butler C、Wilson E、Wierman M. (2002) J. Biol. Chem. 277: 23; 20702−20710
Song L、Herrell R、Byers S、Shah S、Wilson E、Gelmann E. (2003) Mol. Cell. Biol. 23: 5; 1674−1687
Sharma M、Chuang W、Sun Z (2002) J. Biol. Chem. 277: 34; 3093530941
Truica C、Byers S、Gelmann E. (2000) Cancer Res. 60: 4709−4713
本発明は、アンドロゲンレセプターのβ−カテニンとの相互作用を調節する化合物を同定するための新規スクリーニング分析法を記載している。古典的なアンドロゲンによるAR依存性転写の調節を測定する標準的分析法と併せて用いられる場合、本発明の分析法は、古典的AR作用物質または拮抗物質活性、例えば、ARによるアンドロゲン性転写などに影響を及ぼすことなく、β-カテニンと相互作用し、その活性を調節するARの能力を選択的に阻害する新種のARモジュレーターを使用者が同定することを可能にする。この選択的活性を有する化合物は、古典的AR転写分析のみを用いて検出することができない。
本発明は、試験化合物がアンドロゲンレセプター(AR)とβ−カテニンの間の相互作用を調節できるかどうかを決定する方法であって:
(a)(i)β−カテニンのNH3−末端領域と融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするDNA配列、
(ii)レポーター遺伝子と操作可能に結合し、レポーター遺伝子の転写を調節する前記DNA結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むDNA配列、および
(iii)アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするDNA配列を含む細胞を提供し、
(b)試験化合物を、任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に導入し;そして
(c)レポーター遺伝子の発現を測定することを含む方法を提供し、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示す。
(a)(i)β−カテニンのNH3−末端領域と融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするDNA配列、
(ii)レポーター遺伝子と操作可能に結合し、レポーター遺伝子の転写を調節する前記DNA結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むDNA配列、および
(iii)アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするDNA配列を含む細胞を提供し、
(b)試験化合物を、任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に導入し;そして
(c)レポーター遺伝子の発現を測定することを含む方法を提供し、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示す。
好ましい態様において、本発明は(i)のDNA結合ドメインがGAL−4 DNA結合ドメインを含み;(ii)のレポーター遺伝子と操作可能に結合した上流活性化DNA配列がレポーター遺伝子と操作可能に結合したGAL−4 UASを含む方法をさらに提供する。
さらに好ましい態様において、本発明は、(i)のNH3−末端領域β−カテニンがヒトβ−カテニンのアミノ酸2〜424を含み;レポーター遺伝子がルシフェラーゼであり;ルシフェラーゼ遺伝子と操作可能に結合したGAL−4 UAS配列のコピーがいくつか存在し;試験化合物により達成される調節が、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の減少であり;工程(b)のアンドロゲンがDHTである方法をさらに提供する。
本発明のもう一つ別の態様は、試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節することができるかどうかを決定する方法であって:
(a)(i)β−カテニンと融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするDNA配列、
(ii) レポーター遺伝子と操作可能に結合した前記DNA結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むDNA配列、および
(iii)アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするDNA配列を含む細胞を提供し、
(b)試験化合物を任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に導入し;そして
(c)レポーター遺伝子の発現を測定する工程を含む方法を提供し、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験分子がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示す。
(a)(i)β−カテニンと融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするDNA配列、
(ii) レポーター遺伝子と操作可能に結合した前記DNA結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むDNA配列、および
(iii)アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするDNA配列を含む細胞を提供し、
(b)試験化合物を任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に導入し;そして
(c)レポーター遺伝子の発現を測定する工程を含む方法を提供し、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験分子がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示す。
もう一つ別の態様は、試験化合物が、アンドロゲンレセプターシグナル化経路よりもβ−カテニン−Wntシグナル化経路を選択的に調節するかどうか決定する方法であって:
(a)β−カテニンとのAR性相互作用を阻害することにより、遺伝子の発現を増加または減少させる試験化合物を同定し(ここで、試験化合物は、アンドロゲン−AR性転写を抑制することなく、Wntシグナル化に対するアンドロゲン−リガンド型AR抑制を除去する);
(b)試験化合物が、β−カテニン非依存性アンドロゲンレセプターシグナル化経路による遺伝子発現を増加させるか、または減少させるかを決定するために、(a)の試験化合物を分析することを含む方法に関し、
これにより、試験化合物がアンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させないならば、アンドロゲン−リガンド型ARのβ−カテニンと相互作用する能力を阻害することにより、(a)の試験化合物はβ−カテニン−Wntシグナル化経路を選択的に調節する。
(a)β−カテニンとのAR性相互作用を阻害することにより、遺伝子の発現を増加または減少させる試験化合物を同定し(ここで、試験化合物は、アンドロゲン−AR性転写を抑制することなく、Wntシグナル化に対するアンドロゲン−リガンド型AR抑制を除去する);
(b)試験化合物が、β−カテニン非依存性アンドロゲンレセプターシグナル化経路による遺伝子発現を増加させるか、または減少させるかを決定するために、(a)の試験化合物を分析することを含む方法に関し、
これにより、試験化合物がアンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させないならば、アンドロゲン−リガンド型ARのβ−カテニンと相互作用する能力を阻害することにより、(a)の試験化合物はβ−カテニン−Wntシグナル化経路を選択的に調節する。
さらに別の態様は、試験化合物が、β−カテニン−Wntシグナル化経路よりもアンドロゲンレセプターシグナル化経路を選択的に調節するかどうかを決定する方法であって:
(a)アンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させる試験化合物を同定し;そして
(b)試験化合物が、アンドロゲン−リガンド型ARまたは非リガンド型ARのβ−カテニン/Wntシグナル化を阻害する能力を増加させるか、または減少させるかを決定するために、(a)の試験化合物を分析することを含む方法に関し;
これにより、(a)の試験化合物は、Wntシグナル化のアンドロゲン−リガンド型AR抑制を除去することなくアンドロゲンレセプターシグナル化経路を選択的に調節するか、またはAR作用物質の不在下で、ARとβ−カテニンの間の相互作用を促進せず、その結果、β−カテニン−Wntシグナル化経路により調節された遺伝子の発現の増加または減少において活性を有さない試験化合物が得られる。
(a)アンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させる試験化合物を同定し;そして
(b)試験化合物が、アンドロゲン−リガンド型ARまたは非リガンド型ARのβ−カテニン/Wntシグナル化を阻害する能力を増加させるか、または減少させるかを決定するために、(a)の試験化合物を分析することを含む方法に関し;
これにより、(a)の試験化合物は、Wntシグナル化のアンドロゲン−リガンド型AR抑制を除去することなくアンドロゲンレセプターシグナル化経路を選択的に調節するか、またはAR作用物質の不在下で、ARとβ−カテニンの間の相互作用を促進せず、その結果、β−カテニン−Wntシグナル化経路により調節された遺伝子の発現の増加または減少において活性を有さない試験化合物が得られる。
出願者らは、特に、本開示において言及される全ての文献の全内容を組み入れる。さらに、量、濃度、あるいは他の値またはパラメータが範囲、好ましい範囲、あるいは好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられる場合、これは、範囲が別に開示されているかどうかに関係なく、任意の上限または好ましい値および任意の下限または好ましい値の任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示すると理解するべきである。数値の範囲が本明細書において記載されている場合、特に記載しない限り、この範囲は、その終点、ならびにこの範囲内の全ての整数および有理数を含むことが意図される。本発明の範囲は、ある範囲が規定されている場合に、記載された特定の値に限定されることを意図されない。
本発明は、ARとβ−カテニン間のアンドロゲン依存性相互作用を評価し、i)β−カテニンと融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするDNAを含む第一DNA配列、ii)(i)のDNA結合ドメインを認識できる上流活性化配列を含む第二DNA配列であって、レポーター遺伝子と操作可能に結合したもの;およびiii)ARタンパク質をエンコードする第三DNA配列を利用する。本発明の方法は、試験化合物を、DNA配列i、iiおよびiiiを含み、任意にアンドロゲンの存在下で発現できる細胞に提供して、試験化合物が、レポーター遺伝子の発現の検出により測定される、β−カテニンとアンドロゲンレセプターのアンドロゲンにより刺激される相互作用を調節できるかどうかを決定することを含む。レポーター遺伝子の発現が、試験化合物を細胞に添加することにより影響を受けないならば、このような化合物は、β−カテニンのアンドロゲンレセプターとのアンドロゲン依存性相互作用を調節できない。好ましい態様において、(i)のDNA結合ドメインは、GAL4のDNA結合ドメインを含み;(ii)のレポーター遺伝子に操作可能に結合した上流活性化配列はGAL−4−UASであり;レポーター遺伝子はルシフェラーゼである。本発明の最も好ましい実施形態において、複数の上流活性化配列のコピーは、レポーター遺伝子と操作可能に結合し、DNA結合ドメインと融合した(i)のβ−カテニンはヒトβ−カテニンのアミノ酸2〜424を含む。
出願者らは、その分析法が、ARとβ−カテニンの間のアンドロゲン依存性相互作用の選択的測定であることを証明した。一般に、スクリーニング様式において、本発明のDNA配列で形質転換された細胞をアンドロゲン、例えば、ジヒドロテストステロン(DHT)で処理し、これは、ARとβ−カテニンの間の相互作用を引き起こし、その結果、レポーター活性が増大する。レポーター活性を低下させる分子を同定することができ、ARおよび、リガンド型ARと結合し、転写の活性化または阻害を引き起こすDNA反応コンセンサスエレメント間の相互作用を妨害するその能力についての二次分析においてさらに分析することができる。このスクリーンにおいて、この方法により同定される分子は、男性ホルモン性脱毛症、前立腺癌、および多嚢胞性卵巣症候群におけるインスリン感受性の治療法として特に有用であり得る。
出願者らの分析法は、フィールズ(Fields)ら(6,7)(DNA結合ドメインと融合したタンパク質を含む1つのハイブリッド、および転写活性化ドメインと融合したタンパク質を含む第二ハイブリッドを使用する)の2ハイブリッド結合分析に類似している。しかしながら、現行の1ハイブリッド結合分析は、ARとβ−カテニンの相互作用を妨害することができ、これによりβ−カテニンのARシグナル化に対する影響およびARのβ−カテニンおよびWntシグナル化に対する影響を特異的に除去する分子の同定が好ましい点で異なる。さらに、好ましい態様において、β−カテニンコーディング配列の一部のみがGAL4 DNA結合ドメイン(GAL4 DBD)と融合している。本分析法は、完全長野生型ARを利用するので、全ARタンパク質をターゲティングに利用可能であり、試験化合物は融合構造物によりARと結合することを妨害されない。対照的に、2ハイブリッド分析法(6,7)において、2つの組み換え融合タンパク質構造物の使用は、標的タンパク質の天然の構造が融合構造物において変更されているという欠点を有する。
本発明の分析法は、例えば、十分に特徴づけられ、広く用いられるCV−1細胞(アフリカミドリザル腎臓細胞系)またはCOS細胞(アフリカミドリザル腎臓細胞系)において行うことができるが、当業者は、他の細胞系も好適であることを認識するであろう。
本発明のさらに別の態様は、試験化合物が、β−カテニン−Wntシグナル化経路をアンドロゲンレセプターシグナル化経路よりも選択的に調節するかどうかを決定する方法についてである。この方法において、試験化合物はβ−カテニン−Wntシグナル化経路のアンドロゲン−ARによる抑制を調節することにより遺伝子の発現を増加または減少させるその能力に基づいて同定される。「β−カテニン−Wntシグナル化経路のアンドロゲンリガンドアンドロゲンレセプターによる調節」は本明細書において用いられるように、アンドロゲンレセプター/β−カテニン相互作用により開始されるWntによるシグナル化経路により調節される任意の遺伝子の転写の増加または減少をもたらすシグナル化経路を意味する(例えば、Mulholland DJ et al.、J. Biol. Chem. 277:17933−43 (2002); Yang F. et al.、J. Biol. Chem. 277:11336−44 (2002); Song L−N et al.、Mol. Cell. Biol. 23:1674−87 (2003)参照)。
アンドロゲンレセプターのβ−カテニンとの相互作用を評価する方法は、ARおよびβ−カテニンの相互作用を調節することにより遺伝子の発現を増加または減少させることができ、その結果、β−カテニン−Wntシグナル化経路に対するアンドロゲン−ARによる抑制の抑制または阻害をもたらす試験化合物を同定するために優先的に使用される。細胞型特異性に関連して、ARとβ−カテニン間の相互作用は、Wntシグナル化またはARによるシグナル化に対してプラスの効果を有し得る。この実施形態において、AR−β−カテニン相互作用のプラスのレギュレーターは、Wntアクチベーターとして生じるであろう。
アンドロゲン−リガンド型ARの、β−カテニン−Wnt転写シグナル化を調節する能力にプラスまたはマイナスの影響を及ぼす試験化合物を次に分析して、試験化合物がアンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加させるか、または減少させるかを決定した。「アンドロゲンレセプターシグナル化経路」または「ARシグナル化経路」は、本明細書において用いられる場合、アンドロゲンレセプターの伝統的な転写経路を意味する。リガンド結合に反応して、アンドロゲンレセプターは細胞の核に移動し、ここでホモダイマーを形成する。ホモダイマーとしてアンドロゲン反応性エレメント(ARE)と結合すると、作用物質結合ARは、GRIP1/TIF2、CBP/p300、および他のコアクチベーターを含む大酵素コアクチベーター複合体を補充することにより、転写を刺激する。加えて、リガンド結合ARは、AP1、NF−κB、およびEtsファミリーなどの転写因子複合体とのタンパク質−タンパク質相互作用により転写を抑制することもできる。
当業者は、ARシグナル化経路評価が本発明において有用であることを認識するであろう。
天然の内因性または外因性アンドロゲンの存在下または不在下で、アンドロゲンシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させない試験化合物は、β−カテニン−Wntシグナル化経路を選択的に調節する。「遺伝子の発現を増加または減少させない」とは、当業者に公知の分析技術、例えば、ノザン・ブロッティング、ウェスタン・ブロッティング、サザン・ブロッティング、プラスミドレポーター分析、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、あるいはアンドロゲンまたはβ−カテニンにより調節されることが知られているインビボ(動物)臓器系形態または機能において全体的な変化を観察することにより、遺伝子発現の増加または減少が観察されないことを意味する。アンドロゲンの公知動物モデル効果の一例は、齧歯類/哺乳動物における前立腺増殖/重量に対するARモジュレーターおよびWntモジュレーターの効果であり、ここで、AR作用物質は前立腺細胞増殖および臓器重量を増大させ、AR拮抗物質は、アンドロゲンのこの効果を阻害する。
別の実施形態は、試験化合物がアンドロゲンレセプターシグナル化経路をβ−カテニン−Wntシグナル化経路よりも選択的に調節するかどうかを決定する方法についてである。この方法において、試験化合物は、当業者に周知の方法により、アンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させるその能力に基づいて同定される。ARシグナル化に対してプラスまたはマイナスの影響を及ぼす試験化合物を次いで分析して、この試験化合物が、前記のようなARによるβ−カテニン−Wntシグナル化経路により、遺伝子の発現を増加させるか、または減少させるかを決定する。
出願者らの開示に関連して、用語は、特に記載しない限り、慣習的な技術的意味を有する。いくつかの用語および本発明の態様を以下でさらに説明する。
「アンドロゲンレセプター」または「AR」なる用語は、活性または天然の構造におけるその保存アミノ酸コーディング配列により規定されるARタンパク質を意味する。
「ハイブリッド形成」は、1以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を包含する。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対合、Hoogstein結合、または任意の他の配列特異的方法で起こり得る。複合体は、二本鎖構造を形成する2つのストランド、マルチストランド複合体を形成する3以上のストランド、1つの自己ハイブリッド形成ストランド、またはこれらの任意の組み合わせを含む。ハイブリッド形成反応は、PCR反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的開裂などの、より広範囲のプロセスにおける工程を構成する。
ハイブリッド形成反応は、異なる「ストリンジェンシー(stringency)」の条件下で行うことができる。ハイブリッド形成反応のストリンジェンシーは、任意の2つの核酸分子が互いにハイブリッド形成する困難さを包含する。ストリンジェントな条件下で、互いに少なくとも65%、70%、75%またはそれ以上の同一性を有する核酸分子は、互いにハイブリッド形成したままであり、一方、低パーセントの同一性を有する分子はハイブリッド形成したままでいることができない。非常にストリンジェントなハイブリッド形成条件の好ましい非制限的例は、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃でハイブリッド形成し、続いて、0.2×SSC、0.1% SDS中、50℃、好ましくは55℃、さらに好ましくは60℃、なおいっそう好ましくは65℃で1回以上洗浄することである。
ハイブリッド形成は、2つの一本鎖ポリヌクレオチド間の逆平行構造において起こり、この反応は「アニーリング」と呼ばれ、これらのポリヌクレオチドは「相補性である」と記載される。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリッド形成が第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチドのストランドの1つの間で生じ得るならば、別のポリヌクレオチドと「相補性」または「相同性」であり得る。「相補性」または相同性は、一般に承認されている塩基対合則にしたがって、互いに水素結合すると予想される、相対するストランドにおける塩基の割合について定量化できる。
「β−カテニン」なる用語は、例えば、ヒトタンパク質において、781アミノ酸を含む完全長タンパク質および、例えば、図6(配列番号1)において開示されるような、β−カテニンアミノ酸配列のフラグメントも包含するために使用される。タンパク質の好ましい形態は、特に、約1〜約423のアミノ酸を包含する。他の実施形態において、β−カテニンタンパク質は、配列番号1において示されるアミノ酸配列またはその一部分と、少なくとも65%、少なくとも70%のアミノ酸同一性、さらに好ましくは90%、そしてなおいっそう好ましくは、95%のアミノ酸同一性を有する。
もう一つ別の実施形態において、「β−カテニン」なる用語は、配列番号1のアミノ酸配列、あるいはそのフラグメントまたは補体をエンコードするポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりエンコードされる、完全長タンパク質またはそのフラグメントを包含するために使用される。好ましくは、条件は、少なくとも65%、好ましくは少なくとも約70%、さらに好ましくは、少なくとも約80%、なおいっそう好ましくは、少なくとも約85%または90%互いに相同性である配列が、典型的には互いにハイブリッド形成したままであるようなものである。好ましくは、ストリンジェントな条件下で、配列番号1のアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは相補体をエンコードするポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成するβ−カテニンポリヌクレオチドは天然に存在する核酸分子に対応する。
集団において存在し得るβ−カテニン配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、さらに、例えば、配列番号1のアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド配列における突然変異により、小さな変化を導入でき、これによりβ−カテニンタンパク質の機能的活性を変更することなく、エンコードされたタンパク質のアミノ酸配列における変化に至ることを理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換に至るヌクレオチド置換は、配列番号1のアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドにおいて調製することができる。「非必須」アミノ酸残基は、β−カテニンポリヌクレオチドの野生型配列(例えば、配列番号1のアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド)から、β−カテニン分子の機能的活性を変更することなく、変更できる。非必須であり、従って置換を受けやすい残基の例は、当業者により、β−カテニン関連分子のアミノ酸位置合わせを行い、保存されない残基を決定することにより同定できる。このような残基は、保存されなかったので、より置換を受けやすい。
したがって、「β−カテニン」なる用語は、β−カテニン活性について必須でないアミノ酸残基において変化を含有する、β−カテニンタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドにも関する。このようなβ−カテニンタンパク質は、依然として本来のβ−カテニン活性を保持する配列番号1のアミノ酸配列において異なる。β−カテニンタンパク質の非天然変異体をエンコードする、単離されたポリヌクレオチドは、1以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を、配列番号1のアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド配列中に導入して、1以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がエンコードされたタンパク質中に導入されるようにすることにより、形成できる。突然変異は、標準的技術、例えば、部位指向性突然変異誘発およびPCRによる突然変異誘発により、配列番号1中に導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、1以上の非必須アミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義され、例えば、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ−分岐鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を包含する。したがって、β−カテニンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換されている。
別法として、別の実施形態において、突然変異は、例えば、飽和突然変異誘発などにより、β−カテニンコーディング配列の全部または一部にそってランダムに導入することができる。
「β−カテニンのNH3−末端領域」なる用語は、アミノ酸1からアンドロゲンレセプターと相互作用できるβ−カテニンのアルマジロ繰り返し領域までの任意の連続したアミノ酸配列を含む。従って、NH3−末端領域は、例えば、アミノ酸1〜アミノ酸424、アミノ酸2〜アミノ酸424、アミノ酸3〜アミノ酸424、アミノ酸1〜アミノ酸423、アミノ酸2〜423、アミノ酸3〜423などを含む。NH3−末端領域は好ましくは、β−カテニンのアルマジロ反復配列1−6、さらに好ましくは、β−カテニンのアルマジロ反復配列1−7、なおいっそう好ましくは、β−カテニンのアルマジロ反復配列1−12を含む。もう一つ別の好ましい実施形態において、NH3−末端領域は、ヒトβ−カテニンのアミノ酸2〜424を含む。NH3−末端領域は、アルマジロ繰り返し領域のみからのアミノ酸配列を含み得る。β−カテニンのC−末端領域の少なくとも一部と接触しているNH3−末端領域アミノ酸配列を含む実施形態も、β−カテニンのC末端トランス活性化ドメインが不活性である限り、想定される。アミノ酸の保存的置換、欠失、または挿入も、β−カテニンとアンドロゲンレセプター間の相互作用が保持される限り想定される。
典型的な置換としては、例えば、アミノ酸の、類似した電荷、疎水性、または電気化学的特性を有するアミノ酸での置換が挙げられる。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、この位置でのアミノ酸残基の極性または電荷に対してほとんどまたは全く影響がないような、天然のアミノ酸残基の非天然残基での置換を含む。所望のアミノ酸置換(保存的または非保存的に関係なく)は、当業者により、かかる置換が望ましい時点で決定することができる。例えば、アミノ酸置換は、分子配列の重要な残基を同定するために、あるいは本明細書において記載された分子の親和性を増加または減少させるために使用できる。ある実施形態において、保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物学的系における合成よりも化学ペプチド合成により組み入れられる、天然に存在しないアミノ酸残基も包含する。
「アンドロゲンレセプターとの相互作用」なる用語は、ARのリガンド結合ドメインとβ−カテニンのアルマジロ領域間のタンパク質−タンパク質相互作用を意味する。これらの2つのタンパク質間の相互作用は、ARに対するアンドロゲン結合により刺激されるARタンパク質二次/三次構造における変化により引き起こされる。
「調節」なる用語は、活性における減少または増加のいずれかを包含し;例えば、試験化合物は、本発明の分析においてかかる試験化合物が存在する結果、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が減少または増加するならば、アンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節すると考えることができる。
「DNA結合ドメイン」なる用語は、配列特異的な方法で、その保存された上流活性化配列(特異的ヌクレオチド配列を含有する「DNA反応エレメント」またはタンパク質DNA結合ドメインにより認識される「認識配列」とも呼ばれる)と結合する保存DNA結合モチーフを有する任意のタンパク質結合ドメインを表す。DNA反応エレメントはレポータープラスミド中に配置され、DNA反応エレメントと結合するタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用によりレポーターと近接した転写アクチベーターと結合でき、その結果、レポーター転写が活性化される。
「上流活性化配列」または「UAS」なる用語は、β−カテニンとの融合タンパク質として分析において使用するために選択された、DNA結合ドメインと結合できる任意のDNA配列を包含する。
「レポーター遺伝子」なる用語は、検出でき、定量化できるタンパク質またはアミノ酸配列を発現できる任意の遺伝子コーディング配列を説明するために、当該分野において一般的に知られている方法で使用される。本発明の分析において使用できる周知のレポーター遺伝子産生の例は、例えば、酵素ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアクチルトランスフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼを包含する。当業者は、多くの他の好適なレポーター遺伝子を知っているであろう。
「試験化合物」なる用語は、既知の化学構造を有するが、既知の機能または生物学的活性を有する必要はない化合物を包含する。試験化合物はさらに、未確認の構造を有するか、または、例えば、植物抽出物などの粗生物サンプルからの未知の化合物の混合物であってもよい。多数の化合物を、精製化合物の集団または様々な供給源からの粗抽出物の集団をさす「化学ライブラリー」からランダムにスクリーンすることができる。化学ライブラリーは、化学的に合成されたか、または天然の産物から精製された化合物を含有し得る。化合物は、無機または有機小分子またはより大きな有機化合物、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、ステロイド、脂質、リン脂質、核酸、およびリポタンパク質を含むことができる。試験される化合物の量は、化学ライブラリーに応じて変化し得るが、精製(相同性)化合物ライブラリーに関しては、10μMが、典型的には試験される最高の初回量である。
試験化合物を細胞に導入する方法は、当該分野において周知である。
「アンドロゲン」なる用語は、アンドロゲン活性を有するすべての公知化合物を包含する。化合物のアンドロゲン活性は、細胞ベースのAR転写分析を包含する様々な方法において、および化合物が公知アンドロゲンの活性と類似した活性を有することが証明できる生物学的活性分析において決定することができる。これらの分析は、動物または組織を用いて行うことができる。例えば、前立腺においてアンドロゲン活性を有する化合物は、齧歯類において前立腺増殖を刺激できる。天然のアンドロゲン代謝物であって、生物学的活性を有するものを使用でき、例えば、テストステロン、アンドロステンジオン、アンドロスタンジオン、およびジヒドロテストステロン(DHT)を包含し、DHTが特に好ましい。
分析は、アンドロゲンの幅広い濃度範囲に寛容である。好ましい態様において、DHT用量は、化合物をスクリーンするために1nMである。0.1から10nMの間のアンドロゲンを初回量として用いて、細胞系における分析を最適化することができる。
アンドロゲンの不在下で、本発明の分析は、ARとβ−カテニンの間の相互作用を刺激する化合物を同定するためにも使用できる。例えば、DHTと類似した活性を有する化合物は、ARおよびβ−カテニン間の相互作用の刺激によりレポーター活性を活性化する。
「操作可能に結合した」なる用語は、核酸分子、すなわち、DNA、および1以上の調節配列(例えば、プロモーターまたはその部分)が、核酸分子からのmRNAの転写を許容するか、または、適切な分子が調節配列と結合している場合に、核酸分子の産物(すなわち、ポリペプチド)の発現を許容するような方法で結合していることを意味する。
「発現構築物」なる用語は、RNA、例えば、興味のある下流遺伝子またはコーディング領域(例えば、cDNAまたはタンパク質をエンコードするゲノムDNAフラグメント、あるいは興味のある任意のRNA)と操作可能に結合した少なくとも1つのプロモーターを含有する構築物を転写するために設計された二本鎖DNAまたは二本鎖RNAを意味する。発現構築物の受容細胞へのトランスフェクションまたは形質転換は、細胞がRNAまたは発現構築物によりエンコードされるタンパク質を発現することを可能にする。発現構築物は、遺伝子組み換えプラスミド、ウイルス、あるいは、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルス由来の人工染色体であるか、あるいは下記の「発現ベクター」で記載されるさらなる実施形態であってよい。発現構築物は、生細胞において複製できるか、または合成的に調製できる。本出願の目的に関して、「発現構築物」、「発現構築物」、「発現ベクター」、「ベクター」、および「プラスミド」なる用語はほとんど同じ意味で用いられて、本発明の用途は、一般に例示的な意味で、本発明を特定の種類の発現構築物に限定されることを意図しないことを示す。さらに、発現構築物またはベクターなる用語は、分析に用いられる細胞が、かかるDNA配列をすでに内因的に含む場合も包含することを意図する。
本明細書において用いられる場合、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる用語は、ほぼ同じ意味で使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、あるいはその類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を包含する。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し、既知または未知の任意の機能を果たす。以下は、ポリヌクレオチドの非制限的例である:遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマー構築の前または後に付与できる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは重合後、標識成分との結合などにより、さらに修飾できる。この用語は、二本鎖分子および一本鎖分子の両方も包含する。特に記載するか、または必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが知られているか、または予想される2つの相補一本鎖形態のそれぞれを包含する。
ポリヌクレオチドは、4つのヌクレオチド塩基:アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびポリヌクレオチドがRNAである場合は、グアニンのかわりにウラシル(U)の特異的配列からなる。従って、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に、特定のポリペプチドまたはタンパク質をエンコードできる少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを包含する。本明細書において記載される任意のポリヌクレオチド配列は、これらが関連する遺伝子の大フラグメントまたは完全長コーディング配列を同定するために使用できる。大フラグメント配列の単離法は当業者に公知であり、そのいくつかは本明細書において記載されている。
本明細書において用いられる場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがmRNA中に転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを包含する。ポリヌクレオチドがゲノムDNAから誘導されるならば、真核性宿主細胞が選択される場合、適当な発現はmRNAのスプライシングを含む。発現に必要な調節エレメントは、RNAポリメラーゼを結合するためのプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列を包含する。例えば、細菌発現ベクターは、プロモーター、例えば、lacプロモーターを含み、転写開始に関して、Shine−Dalgarno配列および開始コドンAUGを含む(Sambrook、J.、Fritsh、E. F.、およびManiatis、T.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd、ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989)。同様に、真核性発現ベクターは、RNAポリメラーゼIIの非相同性または相同性プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンAUG、およびリボソームの分離のための終始コドンを包含する。かかるベクターは、商業的に入手できるか、または当該分野において周知の方法、例えば、一般にベクターの構築について下記の方法に記載されている配列により組み立てることができる。
本発明を以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のみのために提示されると理解すべきである。前記論議およびこれらの実施例から、当業者は本発明の好ましい特徴を確認し、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って、様々な用途および条件に適応させることができる。
この実施例は、培養された細胞がGAL4 DNA反応エレメント−ルシフェラーゼレポータープラスミド、ヒトβ−カテニンのアミノ酸2〜424のcDNAコーディング領域と融合したGAL4 DBDのコーディング領域を発現するプラスミド(GAL4−β−カテニン)および完全長野生型ヒトARを発現するプラスミドで形質転換される、好ましい実施形態を説明する(図1)。β−カテニンcDNAフラグメントは、テンプレートとしてpcDNA3.1β−カテニン発現ベクター(Invitrogen)およびそれぞれBam HIおよびXba I制限部位を含有する一本鎖DNAプライマーを用いて、ヒトβ−カテニンからのアミノ酸2〜424のDNAコーディング配列のPCR増幅により調製された。増幅されたDNAフラグメントを、制限酵素Bam HIおよびXba I(Promega)を用いて直線状にされ、複数のクローニング部位の上流にGAL4 DBDのコーディング配列を含有する、pMプラスミドの複数のクローニング部位中に挿入した。5つのGAL4上流活性化配列(UAS)を、ルシフェラーゼのcDNAコーディング配列を含有するpGL3−Basic(Promega)中にサブクローニングすることにより、レポータープラスミドを調製した。AR発現ベクターは、Leonard Freedman(Sloan Kettering)から入手したpcDNA3(Invitrogen)中のヒト完全長AR cDNAであった。ヒトARのcDNA配列は、GenBank(登録商標)の遺伝子配列情報ウェブサイト(受入番号M35884、本発明の一部として参照される)で入手可能である。
CV−1細胞を96ウェルプレート上で培養し、24時間後、リポフェクタミン法(Invitrogen)を用いて発現およびレポータープラスミドでトランスフェクトした。この手順において、使用した3つの異なるプラスミド構築物を細胞培養培地およびリポフェクタミン中で混合し、製造業者の指示(Invitrogen)に従って15分間インキュベートした。プラスミド−リポフェクタミン混合物を培地中で希釈し、細胞に添加し、4時間インキュベートした。細胞をリンスし、次いで培地で処理した。トランスフェクションの24時間後、細胞をアンドロゲン作用物質および拮抗物質またはビヒクルで処理した。18時間後、細胞溶解物を収穫し、ルシフェラーゼ試薬(Promega)および照度計(Wallac)を用いてルシフェラーゼ活性について分析した。例えば、リン酸カルシウム沈降トランスフェクション技術をはじめとする他の公知トランスフェクション技術を用いることができる。
1ハイブリッド分析において用いられるプラスミド構築物を図1に示す。点線は、1ハイブリッド分析において用いられるタンパク質−タンパク質またはタンパク質−DNA相互作用領域を示す。矢印は転写開始部位を示す。
内因的に両タンパク質を発現する細胞系におけるARおよびβ−カテニン間の相互作用を刺激するかどうかを決定するためにL929細胞を使用した。内因性ARおよびβ−カテニンを発現するL929細胞を10 nM DHT、300 nMヒドロキシフルタミド(flut)、DHT+flut、またはビヒクル(veh)で17時間処理した。細胞溶解物を収穫し、タンパク質A/Gセファロースであらかじめ清澄化し、アガロース(Santa Cruz Biotechnology)に対して接合したβ−カテニンに対するヤギポリクローナルIgGを用いてβ−カテニンを免疫沈降させた。免疫沈降物をポリアクリルアミドゲル電気泳動と、続いて必要に応じてSanta Cruzから得た抗体を用いてARおよびβ−カテニン(β−cat)についてのウェスタン分析により分析した(図2)。10nMのアンドロゲン作用物質DHTは、ARおよびβ−カテニン間の相互作用を刺激することが判明した。DHTの不在下で、これらのタンパク質間に検出可能な相互作用はなかった。細胞をDHTより30倍過剰のAR拮抗物質ヒドロキシフルタミド(300 nM)の存在下で処理する場合、タンパク質−タンパク質相互作用が弱められた(図2)。これらの結果は、ARおよびβ−カテニン相互作用はアンドロゲン作用物質DHTにより刺激されることを示す。結果は、この相互作用が小分子、例えば、ヒドロキシフルタミドによる妨害を受けやすいことも証明する。
CV−1細胞におけるルシフェラーゼ活性についての各発現ベクターの要件を決定するために実験を行った。
本発明の分析は、ARおよびβ−カテニン間のDHT依存性相互作用を測定することが証明される。5XGAL4−UAS DNA反応エレメントの転写制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミド(GAL4−ルシフェラーゼ)を必要に応じて、アンドロゲンレセプター発現ベクター(AR)、GAL4−DBD−β−カテニン融合タンパク質発現ベクター(GAL4−β−カテニン)の存在下または不在下でCV−1細胞中にトランスフェクトした。細胞を1 nM DHT(+)またはビヒクル(−)で18時間必要に応じて処理した。細胞溶解物を収穫し、ルシフェラーゼ活性について分析した。DHT (1 nM)は、ARおよびGAL4−β−カテニン発現ベクターをどちらも5XGAL4−ルシフェラーゼレポーターで細胞中にトランスフェクトした場合、レポーター活性の大きな活性化を引き起こした(図3)。ARおよびDHTは、レポーター活性に対して、GAL4−β−カテニン発現ベクターの不在下で影響を及ぼさず、このことは、GAL4 プロモーター−レポーター構築物に対するARおよびDHTの直接的影響がないことを示す(図3)。
エストロゲンレセプター(ER)およびプロゲステロンレセプター(PR)も、そのレポーター活性に対する影響(図4)を測定することによりβ−カテニンとの相互作用をする能力について試験し、β−カテニンと核レセプター間のタンパク質−タンパク質相互作用は、ARについて特異的であることが示された。CV−1細胞を5XGAL4−ルシフェラーゼレポーターおよびGAL4−β−カテニン発現プラスミドで、核レセプター発現ベクターの不在下(−)で、AR、PR、またはER発現プラスミドでトランスフェクトした。細胞を18時間、ビヒクル、10nm DHT、10nMトリメゲストン(Trim)、または10 nM 17β−エストラジオール(E2)で必要に応じて処理した。細胞溶解物を収穫し、ルシフェラーゼ活性について分析した。ERおよびPRレセプターはトリメゲストン、17β−エストラジオール、またはDHTの存在下、1ハイブリッド分析において活性を有さなかった。DHTをAR発現細胞に添加した場合、レポーター活性において大きな増加があったが、10 nM 17β−エストラジオールまたはトリメゲストンに関してはなかった。これらの結果は、ERおよびPRと比較した場合、ARについて特異性であるらしい核レセプターと、この分析におけるβ−カテニンの相互作用を示す。
本出願者らの分析が、ARおよびβ−カテニンのDHT依存性相互作用を妨害する化合物を同定する可能性を有するかどうかを決定するために、酢酸シプロテロン(CA)、AR拮抗物質の影響を、DHTの存在下で試験した(図5)。
CV−1細胞を、図1に記載されたARおよびGAL4−β−カテニン発現およびルシフェラーゼレポータープラスミドでトランスフェクトした。細胞を18時間1 nM DHTあり(+)またはなし(−)、表示された濃度のAR拮抗物質、酢酸シプロテロンで処理した。細胞溶解物を収穫し、ルシフェラーゼ活性について試験した。DHTにより刺激されたARおよびβ−カテニン間の相互作用は、AR拮抗物質、酢酸シプロテロンにより阻害される。CAの不在下で、1nMのDHTは、レポーター活性の大きな活性化を引き起こした。DHTのこの効果は、1から1000 nMの間のCAにより用量依存的に阻止された(図5)。
Claims (28)
- 試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できるかどうかを決定する方法であって:
(a)(i)β−カテニンのNH3−末端領域と融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするDNA配列、
(ii)レポーター遺伝子と操作可能に結合し、その転写を調節する前記DNA結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むDNA配列、および
(iii)アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするDNA配列
を含む細胞を提供する工程;
(b)試験化合物を、任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に導入する工程;および
(c)レポーター遺伝子の発現を測定する工程を含み、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示すものである、方法。 - (i)のDNA結合ドメインがGAL−4 DNA結合ドメインを含む、請求項1記載の方法。
- (ii)のレポーター遺伝子と操作可能に結合した上流活性化配列がGAL−4 UASを含む、請求項1記載の方法。
- レポーター遺伝子と操作可能に結合したGAL−4 UAS配列の1つまたは複数のコピーが存在する、請求項3記載の方法。
- レポーター遺伝子がルシフェラーゼである請求項1記載の方法。
- (i)のβ−カテニンのNH3−末端領域がヒトβ−カテニンのアミノ酸2〜424を含む請求項1記載の方法。
- (i)のβ−カテニンのNH3−末端領域が、配列番号1のアミノ酸2〜424と少なくとも65%同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む請求項1記載の方法。
- (i)のβ−カテニンのNH3−末端領域が、配列番号1のアミノ酸2〜424と少なくとも75%同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む請求項7記載の方法。
- (i)のβ−カテニンのNH3−末端領域が、配列番号1のアミノ酸2〜424と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む請求項8記載の方法。
- (i)のβ−カテニンのNH3−末端領域が、配列番号1のアミノ酸2〜424と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む請求項9記載の方法。
- (i)のβ−カテニンのNH3−末端領域が、以下の条件:45℃で6×SSC、および50℃で0.2×SSC、0.1% SDSで少なくとも1回の洗浄の下で配列番号1のアミノ酸2〜424をエンコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の方法。
- (i)のβ−カテニンのNH3−末端領域が、以下の条件:45℃で6×SSC、および55℃で0.2×SSC、0.1% SDSで少なくとも1回の洗浄の下で配列番号1のアミノ酸2〜424をエンコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む、請求項11記載の方法。
- (i)のβ−カテニンのNH3−末端領域が、以下の条件:45℃で6×SSC、および65℃で0.2×SSC、0.1% SDSで少なくとも1回の洗浄の下で配列番号1のアミノ酸2〜424をエンコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である請求項1記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である請求項14記載の方法。
- レポーター遺伝子の発現の調節が、発現における減少である請求項1記載の方法。
- 工程(b)での前記アンドロゲンがDHTである請求項1記載の方法。
- (i)のDNA結合ドメインが、GAL−4 DNA結合ドメインを含み;(i)のβ−カテニンのNH3−末端領域がヒトβ−カテニンのアミノ酸2〜424を含み;レポーター遺伝子と操作可能に結合した上流活性化配列GAL−4 UASの1つより多くのコピーがあり;レポーター遺伝子がルシフェラーゼであり;工程(b)のアンドロゲンがDHTであり;調節が発現の減少であるところの、請求項1記載の方法。
- β−カテニンのNH3−末端領域がアルマジロ反復配列1〜12を含む請求項1記載の方法。
- β−カテニンのNH3−末端領域がアルマジロ反復配列1〜7を含む請求項1記載の方法。
- β−カテニンのNH3−末端領域がアルマジロ反復配列1〜6を含む請求項1記載の方法。
- 試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用の調節をすることができるかどうかを決定する方法であって:
(a)(i)β−カテニンと融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするDNA配列、
(ii)レポーター遺伝子と操作可能に結合し、その転写を調節する前記DNA結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むDNA配列、および
(iii)アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするDNA配列
を含む細胞を提供する工程、
(b)試験化合物を、任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に導入する工程;および
(c)レポーター遺伝子の発現を測定する工程を含み、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験分子がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示すものである、方法。 - 試験化合物が、アンドロゲンレセプターシグナル化経路よりもβ−カテニン−Wntシグナル化経路を選択的に調節するかどうかを決定する方法であって:
(a)ARによるβ−カテニンとの相互作用を阻害することにより、遺伝子の発現を増加または減少させる試験化合物を同定し(ここで、試験化合物は、アンドロゲン−ARによる転写を抑制することなく、Wntシグナル化に対するアンドロゲン−リガンド型AR抑制を除去する);そして
(b)試験化合物が、β−カテニン非依存性アンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加させるか、または減少させるかを決定するために、(a)の試験化合物を分析することを含み;
これにより、(a)の試験化合物は、この試験化合物がアンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させることができないならば、アンドロゲン−リガンド型ARのβ−カテニンと相互作用する能力を阻害することにより、β−カテニン−Wntシグナル化経路を選択的に調節する方法。 - 工程(a)が
(A)(i)β−カテニンと融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするDNA配列;
(ii)レポーター遺伝子と操作可能に結合し、その転写を調節する前記DNA結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むDNA配列;および
(iii)アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするDNA配列
を含む細胞を提供する工程;
(B)試験化合物を、任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に対して導入する工程;および
(C)レポーター遺伝子の発現を測定する工程を含み、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験分子がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節することができることを示すものである、請求項23記載の方法。 - (i)のDNA配列が、β−カテニンのNH3−末端領域と融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードする、請求項24記載の方法。
- 試験化合物が、β−カテニン−Wntシグナル化経路よりも、アンドロゲンレセプターシグナル化経路を選択的に調節するかどうかを決定する方法であって:
(a)アンドロゲンレセプターシグナル化経路による遺伝子の発現を増加または減少させる試験化合物を同定する工程;および
(b)試験化合物が、アンドロゲン−リガンド型ARまたは非リガンド型ARのβ−カテニン/Wntシグナル化を阻害する能力を増加させるか、または減少させるかを決定するために、(a)の試験化合物を分析する工程を含み;
これにより(a)の試験化合物は、Wntシグナル化のアンドロゲン−リガンド型AR抑制を除去することなく、アンドロゲンレセプターシグナル化経路を選択的に調節するか、またはAR作用物質の不在下でARとβ−カテニン間の相互作用を促進せず、その結果、β−カテニン−Wntシグナル化経路により調節される遺伝子の発現の増加または減少において活性を有さない試験化合物が得られる方法。 - 工程(b)が:
(A)(i)β−カテニンと融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするDNA配列;
(ii)レポーター遺伝子に操作可能に結合し、レポーター遺伝子の転写を制御する前記DNA結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むDNA配列;および
(iv)アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするDNA配列
を含む細胞を提供する工程;
(B)任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に対して(a)の試験化合物を導入する工程;および
(C)レポーター遺伝子の発現を測定する工程
を含み、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示すものである方法。 - (i)のDNA配列が、β−カテニンのNH3−末端領域と融合したDNA結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードする、請求項27記載の方法。
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