JP2008531035A - ポリヌクレオチド配列の特徴づけを改善するための方法 - Google Patents
ポリヌクレオチド配列の特徴づけを改善するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008531035A JP2008531035A JP2007557582A JP2007557582A JP2008531035A JP 2008531035 A JP2008531035 A JP 2008531035A JP 2007557582 A JP2007557582 A JP 2007557582A JP 2007557582 A JP2007557582 A JP 2007557582A JP 2008531035 A JP2008531035 A JP 2008531035A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- signal
- polynucleotide
- target
- control sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
- C12Q1/6855—Ligating adaptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
標的分子の少なくとも1つの特徴を同定する方法は、以下のステップ:(i)上記少なくとも1つの特徴をシグナルポリヌクレオチドに変換し;(ii)上記シグナルポリヌクレオチドを同定し、それによって上記標的分子の少なくとも1つの特徴を同定し、ここで、各シグナルポリヌクレオチドは該シグナルポリヌクレオチドの特徴を定義する少なくとも1つの制御配列を含み、さらにここで、該制御配列の同定が、前記シグナルポリヌクレオチドが正確に同定されたかを確認し、そして場合により、該同定が正確でない場合には、正確なシグナルポリヌクレオチド配列が何であるべきかを決定するために必要な情報を提供する、を含む。
Description
本発明は、ポリヌクレオチド配列の特徴づけにおける正確性を改善するための方法に関する。
分子の研究における進歩は、部分的に、分子又はそれらの生物学的反応を特徴づけるために使用される技術における改善によって導かれた。特に、核酸DNA及びRNAの研究は、配列解析に使用される技術の開発及びハイブリダイゼーション事象の研究の恩恵を受けた。
大規模なDNA配列決定に一般的に使用される主な方法は、連鎖停止法である。この方法は、Sanger及びCoulson(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977; 74: 5463-5467)により最初に開発され、そしてポリメラーゼ反応において新生ポリヌクレオチド鎖中へ組み込まれる4つのヌクレオチドのジデオキシ誘導体を使用することに依存する。取り込みによってジデオキシ誘導体はポリメラーゼ反応を停止し、そして、特定のジデオキシ誘導体が鎖の中に組み込まれた位置を明らかにするために、生成物がゲル電気泳動により分離され、そして解析される。
この方法は広く使用され、信頼できる結果を生じるが、それは遅く、労働集約的かつ高価であると認識されている。
米国特許出願第US-A-5302509号は、固体支持体上に固定化されたポリヌクレオチドの配列決定法を開示する。該方法は、DNAポリメラーゼの存在下での異なる蛍光標識を含む3位がブロックされた塩基A、G、C及びTの固定化されたポリヌクレオチドへの取り込みに依存する。ポリメラーゼは標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を取り込むが、3’−ブロック基によって更なる付加を妨害される。次に、取り込まれた塩基の標識が決定されることができ、そして化学的切断によってブロック基が除去されてさらなる重合化がおこることが可能となる。しかしながら、このやり方によってブロック基を除去する必要性は、時間がかかり、そして高い効率で実施されなくてはならない。
PCT国際特許出願公開第WO-A-00/39333号は、標的ポリヌクレオチド配列を定義された配列及びその中に含まれる位置情報を有する第二のポリヌクレオチドに変換することによる、ポリヌクレオチドの配列決定法を記載する。標的の配列情報は、第二のポリヌクレオチド中で「拡大される」といわれ、標的分子上の個々の塩基間の識別を大いに容易にする。これは、核酸配列の所定の単位である「拡大タグ(magnifying tags)」を用いて達成される。標的分子上の塩基、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンのそれぞれは個別の拡大タグによって表され、元の標的配列を拡大された配列に変換する。そして、拡大タグの順番を決定するために慣用技術が使用され、そしてそれによって標的ポリヌクレオチド上の特定の配列を決定する。
好ましい配列決定法においては、各拡大タグは、蛍光標識などの標識を含み、これが次に同定され、そして拡大タグを特徴づけるために使用されることができる。
PCT国際特許出願公開第WO-A-04/094664号は、PCT国際特許出願公開第WO-A-00/39333号に開示された変換方法の改変を記載する。どちらの方法においても、各拡大タグは、1つの単位は「0」で表し、他は「1」であらわす、二進法として使用可能な2つの単位の異なる配列を含むことが好ましい。標的上の各塩基は、2つの単位、例えばアデニンは「0」+「0」で、シトシンは「0」+「1」で、グアニンは「1」+「0」で、そしてチミンは「1」+「1」により表されることができる。
すべての配列決定方法と同様に、配列決定反応の成功には高い正確性の維持が必須である。したがって、長い間、いかなる配列決定反応からも最大の正確性を得ることが必要であるとされてきた。
発明の要約
本発明は、配列決定反応の正確性を増加させる方法、特に、(どちらも参考文献として本明細書中に援用されている)PCT国際特許出願公開第WO-A-00/39333号及び同第WO-A-04/094664号中に記載されたような、二進数のシグナルを使用することを含むもの、又は連結−近接アッセイ(ligation proximity assay)などの塩基ごとのシグナルを含むものを提供する。本発明は、配列決定反応が、ポリヌクレオチドなどの標的分子が異なる単位の配列情報を含むポリヌクレオチドに変換されることを含む場合、得られた配列データの正確性は、配列決定の間違いの検出を確実にするために測定可能な内部制御として作用する定義された配列をポリヌクレオチド中に取り込むことによって改善されることができる、という認識に基づく。これらの制御配列は標的ポリヌクレオチドの配列を直接表さない。
本発明は、配列決定反応の正確性を増加させる方法、特に、(どちらも参考文献として本明細書中に援用されている)PCT国際特許出願公開第WO-A-00/39333号及び同第WO-A-04/094664号中に記載されたような、二進数のシグナルを使用することを含むもの、又は連結−近接アッセイ(ligation proximity assay)などの塩基ごとのシグナルを含むものを提供する。本発明は、配列決定反応が、ポリヌクレオチドなどの標的分子が異なる単位の配列情報を含むポリヌクレオチドに変換されることを含む場合、得られた配列データの正確性は、配列決定の間違いの検出を確実にするために測定可能な内部制御として作用する定義された配列をポリヌクレオチド中に取り込むことによって改善されることができる、という認識に基づく。これらの制御配列は標的ポリヌクレオチドの配列を直接表さない。
本発明の最初の側面によれば、標的分子の少なくとも1つの特徴を同定する方法であって、以下のステップ:
(i)少なくとも1つの特徴をシグナルポリヌクレオチド配列に変換し;そして
(ii)上記シグナルポリヌクレオチド配列を同定し、それによって該標的分子の少なくとも1つの特徴を同定し、ここで、各シグナルポリヌクレオチド配列は、該シグナルポリヌクレオチド配列の特徴を定義する少なくとも1つの制御配列を含み、さらにここで、該制御配列の同定が、該シグナルポリヌクレオチド配列が正確に同定されたかを確認し、そして場合により、該同定が正確でない場合には、正確なシグナルポリヌクレオチド配列が何であるべきかを決定するために必要な情報を提供する、
を含む。
(i)少なくとも1つの特徴をシグナルポリヌクレオチド配列に変換し;そして
(ii)上記シグナルポリヌクレオチド配列を同定し、それによって該標的分子の少なくとも1つの特徴を同定し、ここで、各シグナルポリヌクレオチド配列は、該シグナルポリヌクレオチド配列の特徴を定義する少なくとも1つの制御配列を含み、さらにここで、該制御配列の同定が、該シグナルポリヌクレオチド配列が正確に同定されたかを確認し、そして場合により、該同定が正確でない場合には、正確なシグナルポリヌクレオチド配列が何であるべきかを決定するために必要な情報を提供する、
を含む。
本発明の第二の側面によれば、標的ポリヌクレオチドの配列決定法は以下のステップ:
(i)該標的ポリヌクレオチド上の少なくとも1つの塩基をシグナル配列に変換し;そして
(ii)該シグナル配列を同定し、それによって標的ポリヌクレオチドの配列を同定し、ここで、各シグナル配列は、該シグナル配列の特徴を定義する少なくとも1つの制御配列を含み、さらにここで、該制御配列の同定が、該シグナル配列が正確に同定されたかを確認し、そして場合により、同定が正確でない場合には、正確なシグナル配列が何であるべきかを決定するために必要な情報を提供する、
を含む。
(i)該標的ポリヌクレオチド上の少なくとも1つの塩基をシグナル配列に変換し;そして
(ii)該シグナル配列を同定し、それによって標的ポリヌクレオチドの配列を同定し、ここで、各シグナル配列は、該シグナル配列の特徴を定義する少なくとも1つの制御配列を含み、さらにここで、該制御配列の同定が、該シグナル配列が正確に同定されたかを確認し、そして場合により、同定が正確でない場合には、正確なシグナル配列が何であるべきかを決定するために必要な情報を提供する、
を含む。
本発明は、付随する図面を参照することにより記載される。
発明の記述
本発明は、標的分子が定義されたポリヌクレオチド配列に変換されることができ、そして最終的な読み取りステップの正確性が、制御配列を形成されたポリヌクレオチド配列中に取り込みそして制御配列の存否を検出することによって評価されることができるという認識に基づく。
本発明は、標的分子が定義されたポリヌクレオチド配列に変換されることができ、そして最終的な読み取りステップの正確性が、制御配列を形成されたポリヌクレオチド配列中に取り込みそして制御配列の存否を検出することによって評価されることができるという認識に基づく。
本発明の方法は、配列決定反応の正確性を改善するために特に好適であり、その中では標的ポリヌクレオチドが、本明細書中で「シグナル配列」と呼ばれる定義された配列の第二のポリヌクレオチドに変換される。該方法は、上記シグナル配列中への制御配列の付加が、得られた配列データの内部チェックを提供し、そして読み取りステップ中の潜在的な間違いの同定を可能とするという認識に基づく。
標的分子に関しては、シグナルポリヌクレオチド配列(に変換されること)によって表されることができることを特徴とする。例えば、標的分子がタンパク質である場合、各アミノ酸モノマーはシグナルポリヌクレオチド配列上の特定の配列によって表されることができる。好ましい実施態様においては、標的分子はポリヌクレオチドであり、そして変換は、ポリヌクレオチド配列の増幅によって実施される。本発明はさらに、標的分子としてのポリヌクレオチドとともに記載される。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本分野で周知であり、そして一連の連結された核酸分子、例えば、DNA又はRNA、を指すために使用される。核酸模倣物、例えば、PNA、LNA(固定核酸)及び2'-O-methRNAも本発明の範囲内にある。
本明細書中の塩基A、T(U)、G及びCへの言及は、本分野で理解されるとおり、ヌクレオチド塩基、アデニン、チミン(ウラシル)、グアニン及びシトシンに関する。ポリヌクレオチドがRNAである場合、これも本分野で理解されるとおり、ウラシルがチミンにとってかわるか、又はそれはdUTPを用いてDNA中に導入されることができる。
「シグナル配列」は、核酸配列の異なる「単位」を含む、一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドである。標的上の塩基A、T(U)、G及びCのそれぞれは、シグナル配列中の異なる所定の単位または単位の独特の組みあわせによって表される。各単位は、2以上のヌクレオチド塩基、好ましくは2〜50塩基、より好ましくは2〜20塩基、そして最も好ましくは4〜10塩基、例えば6塩基を含むことが好ましい。各単位には少なくとも2つの異なる塩基が含まれる。単位の設計は、例えば、検出可能に標識されたヌクレオチドを重合化反応中又は相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにおいて取り込むことを含むなど、「読み取り」ステップの間にそれが異なる単位を識別できるようにする。その中で標的が第二のポリヌクレオチド「シグナル配列」に変換される配列決定法は、例えば、PCT国際特許出願公開第WO-A-00/39333号又は同第WO-A-04/094664号に記載されたように、本分野で周知である。
これらの配列決定技術の好ましい実施態様においては、標的ポリヌクレオチド中の各塩基は、シグナル配列中で2つの単位の異なる配列によって表される。この実施態様によれば、2つの単位は、1つの単位を「0」で表し、他を「1」で表す、二進数として使用可能であり、標的中の各塩基はそれによって2−ビット二進数コードで表される。「0」又は「1」のそれぞれは、本明細書中で「配列ビット」と呼ばれる。標的上の各塩基は、該2つのビットの組み合わせによって特徴付けられる。例えば、アデニンは「0」+「0」、シトシンは「0」+「1」、グアニンは「1」+「0」、そしてチミンは「1」+「1」により表されることができる。単位を区別することが必要であり、そして「停止」シグナルが各単位中に組み込まれることができる。標的(鋳型)ポリヌクレオチド上の塩基が奇数位又は偶数位にあるかによって、「1」及び「0」で表す別の単位を使用することも好ましい。
これは以下のように示される:
奇数の鋳型配列:
「0」:TTTTTTA(CCC)
「1」:TTTTTTG(CCC)
偶数の鋳型配列:
「0」:CCCCCCA(TTT)
「1」:CCCCCCG(TTT)
奇数の鋳型配列:
「0」:TTTTTTA(CCC)
「1」:TTTTTTG(CCC)
偶数の鋳型配列:
「0」:CCCCCCA(TTT)
「1」:CCCCCCG(TTT)
この例においては、下線を付した塩基は、ポリメラーゼ反応における標識ヌクレオチドの標的であり、括弧の中の塩基は停止シグナルとして使用され、残りの塩基は標識間の分離を提供するためのものである。
好適なシグナル配列は、PCT国際特許出願公開第WO-A-00/39333号にも記載されている。
この二進数法はしたがって、シグナル配列を形成するために配列の「ビット」を組み合わせることを含む。本発明の方法は、シグナル配列中に「制御ビット」を取り込む。本明細書で使用されるとおり、「制御ビット」という用語は、それに隣接するシグナル配列中のビット列を定義することを目的とする予め定義された配列単位を意味し、各制御ビットはそれに隣接する配列の概要を提供する。読み取りステップの間、制御ビット中に含まれる情報は、隣接配列から読み取られる情報が正確であることを証明する。「制御ビット」及び「制御配列」という用語は交換可能に使用される。
その最も単純な形態において、シグナル配列中の各ビットには、制御ビットとして働く同一の第二のビットが直後(又は直前)に続くことができる。この実施態様においては、シグナル配列中の各配列ビットは、制御ビットにより繰り返され、内部制御及びシグナル配列の最終的な配列決定のチェックを提供する。
好ましい実施態様においては、各制御ビットは複数の配列ビットを定義する。好ましくは、各制御ビットは、2〜10個の配列ビット、より好ましくは2〜5ビットを定義する。最も好ましくは、各制御ビットは図1Aに示すように、3つの配列ビットを定義する。各制御ビットが3つの配列ビットを定義する場合、制御ビットは、図1Bに図示されるように配列ビットを定義することができる。3連の配列ビットが「0」ビットを含まないか又は2つ含む場合、「0」制御ビットは該3つと関連する。3連のビットが「1」ビットを0又は2つ含む場合、制御ビット「1」が使用される。この系においては、3連のビット中の単一のビットの変更が常に制御ビットの変化を引きこし、そして読み取りステップの間のビットの誤った解釈、すなわち、「0」を「1」と間違える、が(2つのビットが同時に同じ3つの中で誤って解釈されない限り)制御ビットを用いて検出されるであろう。図1Bに図示した好ましい制御システムを用いて制御ビットが「1」である場合、これは、先の3つが2つの「1」ビット及び1つの「0」を含まなければならないことを示す。「1」が「0」と読まれたなど、塩基の1つが誤って読まれた場合、制御ビットはこの間違いを強調する。したがって、制御ビットは、それぞれの種類のビットの数又はそれが関連する各3連の配列ビットの「ビット内容」を定義する。このシステムは読み取り相のための内部制御を提供する。
この好ましいシステムは、コンピュータプログラミング分野からの「奇偶検査ビット」の概念を利用し、それを分子生物学及び生化学の分野に応用する。この好ましい実施態様においては、制御ビットは、それが関連する配列の各3連のビット−含量(又は他の数)を定義することによって、奇偶検査ビットとして機能する。「奇数」又は「偶数」性が使用されることができる、すなわち、奇偶(制御)ビットが、奇偶(制御)ビットに関連するシグナルポリヌクレオチドの領域中に奇数又は偶数の特定の配列ビット(「0」又は「1」)があることを定義する。
3つの配列ビットごとに1つの制御ビットを用いることによって得られた正確性の増加を以下の表に示す。
本発明の好ましい実施態様においては、各シグナル配列は、標的ポリヌクレオチド中の3つの塩基をコードする二進数情報、すなわち6ビットの情報を含む。制御ビットは、各3番目のビットの後においてシグナル配列中に取り込まれ、図1A及び1Bに示すとおり、配列中の先行する3つのビットを定義する。したがって、各シグナル配列は8ビットの情報であって、そのうちの6つが標的ポリヌクレオチド中の塩基を表し、そして2つが制御ビットである。シグナル配列への標的ポリヌクレオチドの「変換」の各サイクルにおいて、標的中の3つの塩基についての情報はシグナル配列に表される。PCT国際特許出願第WO-A-00/39333号及び同第WO-A-04/094664号に記載のとおり、この好ましい実施態様を用いて3つを超える塩基を配列決定するために、シグナル配列付加のさらなるサイクルが使用されて、定義された一連のシグナル配列を含む単一の鎖が形成されることができる。
ある実施態様においては、制御ビットは特定のポリヌクレオチドシグナル配列(又は該配列の一部)についての定義された配列特性のものであってよい。シグナル配列中に間違いがある場合、例えば、読み取りステップにおいて間違った数の塩基が配列決定された場合、制御ビットが同定されることができ、そしてそのアイデンティティーが正確なシグナル配列(又は該シグナル配列の部分)が何であるべきかの同定を可能とする。この方法によって、制御ビットは、コンピュータ設計において使用される誤り訂正符号(例えば、ハミングコード)と類似の方法で誤り訂正配列としての役割を果たす。したがって、制御ビットは、シグナル配列(又はその一部)の特定の特徴づけを可能とするために十分な長さのものでなければならない。例えば、シグナル配列の一部が特定のヌクレオチド塩基Aに対応する場合、制御ビットは、シグナル配列が間違って配列決定されるか又は元の標的分子から間違って形成された場合にそれがAに対応すると決定するためのシグナル配列の一部の特徴づけを可能としなくてはならない。
本発明の方法は、各シグナル配列中に存在する制御ビットに加えて、シグナル配列の構築中に、定義された領域または間隔で追加の制御ビットを挿入することによって実施されることができる。規則的な間隔で追加の制御ビットを有することは、ポリヌクレオチドシグナル配列が正しいフォーマット(配列)中に存在し、そしてしたがって変換及び/又は読み取りステップが正確に行われたことを使用者が確認することを可能とする。例えば、標的分子がポリヌクレオチドであり、そして変換が標的を配列決定するために行われる場合、(標的上の)10塩基ごとに相当する間隔で予想される追加の制御ビットの存在は、いかなるフレームシフトも検出されるという可能性を増加させる。例えば、配列決定実験がシグナル配列の配列決定の間にフレームシフトを引き起こした場合、追加の制御ビットは予想された10塩基に相当する配列の後に同定されることはなく;これは最後の追加の制御ビットが検出された後に配列中のどこかに間違いがあったことを示す。これらの追加の制御ビットは、定義されたいかなる数の標的の塩基(又は他の特徴)の後に挿入されてもよい。例えば、それらは、1〜10塩基の変換ごとに挿入されてよい。例えば、塩基A、C、G及びTは、以下に示す二進数列、および各「変換された」塩基を分離する制御ビット列によって表される。
配列01は、制御ビットであり、これは各塩基のためのコードの配列決定において同定されなくてはならない。01が塩基の配列決定において同定されない場合、それは、その読み取りステップが配列を見逃し、そして配列決定/読み取りステップが繰り返して行われることを示す。
さらに別の実施態様においては、一連の「0」又は「1」によって特徴づけられた塩基の配列決定において読み取りステップが正確に実施されることを確実にするために、制御ビットが使用されてよい。読み取りプラットフォームにとって、例えば4つの連続する「0」を判定するよりも、一連の「0」又は「1」を識別することはしばしば困難であるため、読み取りは3つのみを決定する。したがって、連続的な「0」(又は「1」)の分離が起こることを確実にすることが好ましい。これは、塩基に対応する各配列内に冗長制御ビット列を導入して、限定数の「0」のみが連続的であることを確実にすることによって達成可能である。正確な配列を同定するために、冗長制御ビットは(通常はコンピュータアルゴリズムによって)配列決定において除去される。
上記のA、G、C及びTのための二進数コードを例にとると、冗長制御ビットは以下のように導入されることができる:
第2位における下線を付した数列は制御ビットである。これは、シグナル配列が3つ以上の連続した「0」又は3つ以上の連続した「1」のいずれかを含まないことを確実にする。そして、読み取りステップが実施され、そして(冗長制御ビットが第2位にあることを知りながら)冗長制御ビットが除去されることができる。冗長制御ビットは、PCT国際特許出願公開第WO-A-04/094664号に開示されたとおり、正しいリンカー分子の使用によって正しい位置に挿入されることができる。
少なくとも1つの制御配列を含むシグナル配列が作られたら、「読み取りステップ」を実施してその中にコードされた配列情報を得ることが必要である。
読み取りステップは、例えば、PCT国際特許出願公開第WO-A-00/39333号及び同第WO-A-04/094663号に記載され、そして本明細書中に概説された、任意の好適な技術を用いて実施されてよい。好ましい検出技術は、シグナル配列上の塩基に相補的な塩基を取り込むためのポリメラーゼ反応を用い、検出可能に標識されたヌクレオチド又はその後の間接的な標識化のための基を取り込んだヌクレオチドのどちらかの選択されたものを用い、そしていかなる取り込み事象もモニターする、上記で検討されたとおりのものである。
ポリメラーゼ反応に基づく読み取りステップを実施するために、通常、最初にプライマー配列をシグナル配列ポリヌクレオチドにアニーリングすることが必要であり、該プライマー配列は、ポリメラーゼ酵素によって認識され、その後の相補鎖の伸長のための開始部位としての役割を果たす。プライマー配列は、該ポリヌクレオチドとは別の成分として付加されてもよく、プライマーのアニーリングを可能とする相補鎖を含む。ポリメラーゼ反応は、一度に1単位の相補的ヌクレオチドの制御された取り込みを可能とする条件下で実施されることが好ましい。これは、各拡大されたシグナル配列単位が、取り込まれた標識の検出によって分類されることを可能とする。好ましくは各単位が「停止」配列を含むため、上記のように、最初の単位への取り込みに必要なヌクレオチドのみを供給することによって取り込みを制御することが可能である。各単位が特定の標識によって認識されるため、各サイクル内で2つの異なる単位(0及び1)を識別することが可能である。これは、いかなる取り込まれた標識の検出も可能とし、そして単位の同定を可能とする。
読み取り方法は以下のように実施されてよい:
i)重合化反応の進行を許容する条件下で、定義された単位を含むシグナル配列を、ヌクレオチドdATP、dTTP、dGTP及びdCTPのうちの少なくとも1つと接触させ、ここで、少なくとも1つのヌクレオチドがそのヌクレオチドに特異的な検出可能な標識を含み;
ii)いかなる取り込まれないヌクレオチドも除去し、そしていかなる取り込み事象も検出し;
iii)上記標識を取り込まれたヌクレオチドから除去し;そして
iv)ステップi)〜iv)を繰り返し、それによってさまざまな単位を同定し、そしてそれによって標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
i)重合化反応の進行を許容する条件下で、定義された単位を含むシグナル配列を、ヌクレオチドdATP、dTTP、dGTP及びdCTPのうちの少なくとも1つと接触させ、ここで、少なくとも1つのヌクレオチドがそのヌクレオチドに特異的な検出可能な標識を含み;
ii)いかなる取り込まれないヌクレオチドも除去し、そしていかなる取り込み事象も検出し;
iii)上記標識を取り込まれたヌクレオチドから除去し;そして
iv)ステップi)〜iv)を繰り返し、それによってさまざまな単位を同定し、そしてそれによって標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
各サイクルのステップ(i)において必要とされる異なるヌクレオチドの数は、シグナル配列単位の設計に依存するであろう。各単位が1種類のみの塩基を含む場合、(検出可能に標識された)1つのヌクレオチドのみが必要である。しかしながら、(検出可能に標識されたヌクレオチドのための標的として、及び異なる標的塩基間のギャップを提供するものとして)2つの塩基が使用される場合、2つのヌクレオチドが(標的塩基に結合するもの及び標的塩基間の隙間を埋めるためのものとして)必要とされるだろう。
停止シグナルとしての塩基の使用は、ポリメラーゼ反応中の制御されない取り込みを防止するためのブロックされたヌクレオチドを必要とせずに検出ステップが実施されることを可能とする。「停止」塩基に相補的なものがポリメラーゼ混合物中にないため、停止シグナルは効果的である。したがって、各単位は、見逃したヌクレオチドを用いて「埋め込み」ステップが実施されて停止塩基の相補物を取り込む前に、特徴づけされることができ、これが次の単位の特徴づけを可能とする。これは、検出ステップのあとに実施される。ある単位の「停止」塩基は、次の単位の最初の塩基と同じ種類ではない。これは、「埋め込み」手順が次の単位に進まないことを確実にする。そして、「埋め込み」手順において使用される、取り込まれないヌクレオチドは除去されることができ、そして、次の単位が特徴づけされることができる。
ポリメラーゼ及び検出可能な標識の選択は、当業者に明らかとなるであろう。以下は、指針としてのみ使用される:
1.クレノー(Klenow)及びクレノー (exo-)は、テトラメチルローダミン−4−dUDP及びローダミン−110−dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)(Brakmann and Nieckchen, 2001, Brakmann and Lobermann, 2000)を効率よく取り込むことができる。
2.Vent, Taq及びTgo DNAポリメラーゼは、ジゴキシゲニン及びAMCA様のフルオロフォア、テトラメチルローダミン、フルオレセイン及びCy5を、数個を超える位置の間隔を空けずに効率よく取り込むことができる(Augustin et al., 2001)。
3.T4 DNAポリメラーゼは、フルオロフォアで標識されたヌクレオチドの埋め込みにおいて効率的である。
1.クレノー(Klenow)及びクレノー (exo-)は、テトラメチルローダミン−4−dUDP及びローダミン−110−dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)(Brakmann and Nieckchen, 2001, Brakmann and Lobermann, 2000)を効率よく取り込むことができる。
2.Vent, Taq及びTgo DNAポリメラーゼは、ジゴキシゲニン及びAMCA様のフルオロフォア、テトラメチルローダミン、フルオレセイン及びCy5を、数個を超える位置の間隔を空けずに効率よく取り込むことができる(Augustin et al., 2001)。
3.T4 DNAポリメラーゼは、フルオロフォアで標識されたヌクレオチドの埋め込みにおいて効率的である。
好ましいポリメラーゼは、クレノーラージフラグメント(exo-)及びT4 DNAポリメラーゼである。
温度、pH、緩衝剤組成などのポリメラーゼ反応を実施するために必要な他の条件は、当業者に明らかであろう。重合化ステップは、塩基を最初の単位に取り込むことを可能とするのに十分な時間進行するだろう。そして、組み込まれないヌクレオチドは、アレイを洗浄ステップに供することなどによって除去され、そして組み込まれた標識の検出が次に実施されることができる。
他の読み取り方法は、拡大された読み取り可能なシグナル配列及び/又は位置決めタグ上の単位にハイブリダイズする、短い検出可能に標識されたヌクレオチドを使用すること、及びいかなるハイブリダイゼーション事象も検出することである。短いオリゴヌクレオチドは、読み取り可能なシグナル配列の特定の単位に相補的な配列を有する。例えば、二進数法が使用され、サンプル断片中の各モノマーが、(1つは「0」そして1つは「1」を表す)シグナル配列単位の異なる組み合わせによって定義される場合、本発明は、「1」単位に特異的なオリゴヌクレオチドを必要とするであろう。この実施態様においては、オリゴヌクレオチドの選択的ハイブリダイゼーションは、他の単位に対して異なるポリヌクレオチド配列となる各単位を設計することによって達成されることができる。これは、ハイブリダイゼーション事象が、特定の単位が存在する場合にのみ起こること、そしてハイブリダイゼーション事象の検出がサンプル断片の特徴を同定することを確実にする。
好ましい実施態様においては、標識は蛍光を発する部分である。上記のとおり、使用されることのできるフルオロフォアの多くの例が従来技術において知られている。好適なフルオロフォアのヌクレオチドへの結合は、慣用手段によって実施可能である。好適に標識されたヌクレオチドは商業的供給源からも入手可能である。標識は、検出ステップのあとの除去を許容する方法で結合される。これは、以下のものを含む任意の慣用方法によって実施されてよい:
I.シグナル自体への攻撃
1)退色
1)光退色
2)化学的退色
2)蛍光の消光
i)蛍光色素に対する抗体(例えば、抗フルオレセイン抗体、抗オレゴングリーン抗体)による
ii)FRET(Taqman法などの、クエンチャーのシグナルの隣への取り込みはシグナルの消光に使用可能である)による
3)シグナルの切断
i)化学的切断(例えば、塩基とシグナル間のジスルフィド架橋の還元)
ii)光切断(例えば、ニトロベンジル又はtert-ブチルケトン基の導入)
iii)酵素によるもの(例えば、ペプチドリンカーのα−キモトリプシン消化)
II.シグナル担持ヌクレオチド:
1)エキソヌクレオライシスによる除去
i)3’−5’エキソヌクレアーゼによる、埋め込みヌクレオチドの分解(例えば、エキソヌクレアーゼIII又は一定のヌクレオチドがない場合のDNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ作用の活性化)
2)制限酵素消化
ii)シグナルを担持する二本鎖DNAの消化(例えば、停止シグナルに取り込まれることのできる、Apal、Dral、Saml部位)
1)退色
1)光退色
2)化学的退色
2)蛍光の消光
i)蛍光色素に対する抗体(例えば、抗フルオレセイン抗体、抗オレゴングリーン抗体)による
ii)FRET(Taqman法などの、クエンチャーのシグナルの隣への取り込みはシグナルの消光に使用可能である)による
3)シグナルの切断
i)化学的切断(例えば、塩基とシグナル間のジスルフィド架橋の還元)
ii)光切断(例えば、ニトロベンジル又はtert-ブチルケトン基の導入)
iii)酵素によるもの(例えば、ペプチドリンカーのα−キモトリプシン消化)
II.シグナル担持ヌクレオチド:
1)エキソヌクレオライシスによる除去
i)3’−5’エキソヌクレアーゼによる、埋め込みヌクレオチドの分解(例えば、エキソヌクレアーゼIII又は一定のヌクレオチドがない場合のDNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ作用の活性化)
2)制限酵素消化
ii)シグナルを担持する二本鎖DNAの消化(例えば、停止シグナルに取り込まれることのできる、Apal、Dral、Saml部位)
除去を許容する標識の使用の代替法は、生化学プロセスの間に再活性化される不活性化標識を使用することである。
好ましい方法は、光または化学的切断による。
標識がフルオロフォアである場合、取り込みによって生成された蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡などによる光学的手段によって測定されることができる。或いは、電荷結合素子検出器(CCD)などの感度の高い2−D検出器が、生成された個別のシグナルを可視化するために使用されることができる。
光学的検出のための一般的な設備は以下のとおりである:
顕微鏡: 落射蛍光顕微鏡
対物レンズ: オイルエマージョン(Oil emersion)(100×、1.3NA)
光源: レーザー又はランプ
フィルター: バンドパス
ミラー: ダイクロイックミラー及びダイクロイックウエッジ
検出器: 光電子増倍管(PMT)又はCCDカメラ
顕微鏡: 落射蛍光顕微鏡
対物レンズ: オイルエマージョン(Oil emersion)(100×、1.3NA)
光源: レーザー又はランプ
フィルター: バンドパス
ミラー: ダイクロイックミラー及びダイクロイックウエッジ
検出器: 光電子増倍管(PMT)又はCCDカメラ
以下のものを含む変更も使用されてよい。
A.全反射照明蛍光顕微鏡(TIRFM)
光源: 1つ以上のレーザー
バックグラウンド制御: ピンホールは必要ない
検出: CCDカメラ(ビデオ及びデジタル画像処理システム)
B.共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)
光源: 1つ以上のレーザー
バックグラウンド低減: 1つ又は数個のピンホール開口
検出: a)単一ピンホール:異なる蛍光波長のための光電子増倍管
(PMT)(最終的な画像は、コンピュータにより、経時的
に点ごとに構築される。)
b)数千のピンホール(回転するNipkowディスク):CCD
カメラによる画像の検出(最終的な画像は、カメラによって
直接記録されることができる。)
C.二光子(TPLSM)及び多光子励起レーザー顕微鏡
光源: 1つ以上のレーザー
バックグラウンド制御: ピンホールは必要ない
検出: CCDカメラ(ビデオ及びデジタル画像処理システム)
A.全反射照明蛍光顕微鏡(TIRFM)
光源: 1つ以上のレーザー
バックグラウンド制御: ピンホールは必要ない
検出: CCDカメラ(ビデオ及びデジタル画像処理システム)
B.共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)
光源: 1つ以上のレーザー
バックグラウンド低減: 1つ又は数個のピンホール開口
検出: a)単一ピンホール:異なる蛍光波長のための光電子増倍管
(PMT)(最終的な画像は、コンピュータにより、経時的
に点ごとに構築される。)
b)数千のピンホール(回転するNipkowディスク):CCD
カメラによる画像の検出(最終的な画像は、カメラによって
直接記録されることができる。)
C.二光子(TPLSM)及び多光子励起レーザー顕微鏡
光源: 1つ以上のレーザー
バックグラウンド制御: ピンホールは必要ない
検出: CCDカメラ(ビデオ及びデジタル画像処理システム)
好ましい方法は、TIRFM及び共焦点顕微鏡である。
読み取りプラットフォームは、その内容が参考文献として本明細書中に援用されているPCT国際特許出願公開第WO00/39333号に開示されたとおり、ナノポアに基づいてもよい。
シグナル配列の読み取りに好適な技術の特定の例が本明細書中に与えられるが、シグナル配列が任意の好適な読み取りプラットフォームを用いて読まれてよいことは理解されるであろう。
Claims (16)
- 標的分子の少なくとも1つの特徴を同定する方法であって、以下のステップ:
(i)上記少なくとも1つの特徴をシグナルポリヌクレオチドに変換し;そして、
(ii)上記シグナルポリヌクレオチド配列を同定し、それによって前記標的分子の少なくとも1つの特徴を同定し、ここで、各シグナルポリヌクレオチドは該シグナルポリヌクレオチドの特徴を定義する少なくとも1つの制御配列を含み、さらにここで、該制御配列の同定が、前記シグナルポリヌクレオチド配列が正確に同定されたかを確認し、そして場合により、該同定が正確でない場合には、正確なシグナルポリヌクレオチド配列が何であるべきかを決定するために必要な情報を提供する、
を含む、前記方法。 - 前記標的分子がポリマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記同定されるべき特徴が少なくとも1つのモノマーである、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのモノマーがヌクレオチドである、請求項3に記載の方法。
- 前記標的ポリマーの各特徴が、前記シグナルポリヌクレオチド中の少なくとも1つの異なる配列の単位によって表される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的ポリマーの特徴が、前記シグナルポリヌクレオチド中の2つ以上の異なるポリヌクレオチド配列単位の特定の組み合わせにより表される、請求項5に記載の方法。
- 前記標的ポリマーの各特徴が、前記シグナルポリヌクレオチド中の「0」及び「1」と指定された2つ以上のポリヌクレオチド配列単位の特定の組み合わせにより表され、それによって二進数シグナルポリヌクレオチドを作り出す、請求項6に記載の方法。
- 前記標的ポリマー上の3つのモノマーがステップ(i)においてシグナルポリヌクレオチドに変換される、請求項2〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 制御配列が所定の間隔で前記シグナルポリヌクレオチド中に取り込まれる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 制御配列が、3つの配列単位の後ごとに前記シグナルポリヌクレオチド中に取り込まれる、請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記制御配列が、それが関連する単位の組み合わせを定義する、請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記制御配列が、それが関連する前記シグナルポリヌクレオチドの領域内の「0」又は「1」単位の数を定義する、「0」又は「1」単位である、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記制御配列が、3つ超の同じ種類の配列単位が前記標的の特徴を表すこととならないように、前記シグナル配列中の定義された位置に存在する、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(i)及び(ii)が繰り返されて、前記標的分子の特徴を表す一連のポリヌクレオチドシグナル配列を有する分子を形成する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 追加の制御配列の同定が、正確な数のシグナル配列が取り込まれたかを明らかにするように、前記追加の制御配列が定義された間隔で前記形成された分子中に取り込まれる、請求項13に記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチドの配列決定方法であって、以下のステップ:
(i)前記標的ポリヌクレオチド上の少なくとも1つの塩基をシグナル配列に変換し;そして
(ii)前記シグナル配列を同定し、それによって前記標的ポリヌクレオチドの配列を同定し、ここで、各シグナル配列が該シグナル配列の特徴を定義する少なくとも1つの制御配列を含み、さらにここで、前記制御配列の同定が、前記シグナル配列が正確に同定されたかを確認し、そして場合により、該同定が正確でない場合には、正確なシグナル配列が何であるべきかを決定するために必要な情報を提供する、
を含む、前記方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0504182.7A GB0504182D0 (en) | 2005-03-01 | 2005-03-01 | Method |
PCT/GB2006/000719 WO2006092588A1 (en) | 2005-03-01 | 2006-03-01 | Method for improving the characterisation of a polynucleotide sequence |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008531035A true JP2008531035A (ja) | 2008-08-14 |
Family
ID=34430419
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007557582A Pending JP2008531035A (ja) | 2005-03-01 | 2006-03-01 | ポリヌクレオチド配列の特徴づけを改善するための方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090047744A1 (ja) |
EP (1) | EP1853726A1 (ja) |
JP (1) | JP2008531035A (ja) |
CN (1) | CN101142324A (ja) |
AU (1) | AU2006219698A1 (ja) |
CA (1) | CA2599377A1 (ja) |
EA (1) | EA200701663A1 (ja) |
GB (1) | GB0504182D0 (ja) |
NO (1) | NO20074896L (ja) |
WO (1) | WO2006092588A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015079709A1 (ja) * | 2013-11-29 | 2015-06-04 | 静岡県 | 抗蛍光色素モノクローナル抗体 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009092035A2 (en) | 2008-01-17 | 2009-07-23 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for the analysis of biological molecules |
CN105762095B (zh) * | 2014-12-18 | 2018-08-24 | 北京北方华创微电子装备有限公司 | 反应腔室及半导体加工设备 |
US20170141793A1 (en) * | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Microsoft Technology Licensing, Llc | Error correction for nucleotide data stores |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003503007A (ja) * | 1998-12-23 | 2003-01-28 | プレバン ルクソウ | 拡大タグを使用したシークエンシング方法 |
WO2004094664A1 (en) * | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Lingvitae As | Method for characterising polynucleotides |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6258533B1 (en) * | 1996-11-01 | 2001-07-10 | The University Of Iowa Research Foundation | Iterative and regenerative DNA sequencing method |
WO2000039333A1 (en) * | 1998-12-23 | 2000-07-06 | Jones Elizabeth Louise | Sequencing method using magnifying tags |
AU2002360272A1 (en) * | 2001-10-10 | 2003-04-22 | Superarray Bioscience Corporation | Detecting targets by unique identifier nucleotide tags |
US20040259118A1 (en) * | 2003-06-23 | 2004-12-23 | Macevicz Stephen C. | Methods and compositions for nucleic acid sequence analysis |
-
2005
- 2005-03-01 GB GBGB0504182.7A patent/GB0504182D0/en not_active Ceased
-
2006
- 2006-03-01 WO PCT/GB2006/000719 patent/WO2006092588A1/en active Application Filing
- 2006-03-01 US US11/817,177 patent/US20090047744A1/en not_active Abandoned
- 2006-03-01 CN CN200680006772.XA patent/CN101142324A/zh active Pending
- 2006-03-01 EA EA200701663A patent/EA200701663A1/ru unknown
- 2006-03-01 CA CA002599377A patent/CA2599377A1/en not_active Abandoned
- 2006-03-01 JP JP2007557582A patent/JP2008531035A/ja active Pending
- 2006-03-01 AU AU2006219698A patent/AU2006219698A1/en not_active Abandoned
- 2006-03-01 EP EP06709943A patent/EP1853726A1/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-09-26 NO NO20074896A patent/NO20074896L/no not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003503007A (ja) * | 1998-12-23 | 2003-01-28 | プレバン ルクソウ | 拡大タグを使用したシークエンシング方法 |
WO2004094664A1 (en) * | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Lingvitae As | Method for characterising polynucleotides |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015079709A1 (ja) * | 2013-11-29 | 2015-06-04 | 静岡県 | 抗蛍光色素モノクローナル抗体 |
JPWO2015079709A1 (ja) * | 2013-11-29 | 2017-03-16 | 静岡県 | 抗蛍光色素モノクローナル抗体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EA200701663A1 (ru) | 2008-02-28 |
CN101142324A (zh) | 2008-03-12 |
CA2599377A1 (en) | 2006-09-08 |
WO2006092588A1 (en) | 2006-09-08 |
US20090047744A1 (en) | 2009-02-19 |
GB0504182D0 (en) | 2005-04-06 |
NO20074896L (no) | 2007-09-26 |
AU2006219698A1 (en) | 2006-09-08 |
EP1853726A1 (en) | 2007-11-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11821026B2 (en) | Chemical compositions and methods of using same | |
US8795971B2 (en) | Centroid markers for image analysis of high density clusters in complex polynucleotide sequencing | |
US20070031875A1 (en) | Signal pattern compositions and methods | |
JP2008515453A (ja) | ポリマー分子のシーケンシング | |
EP1597397B1 (en) | Dna sequence analysis | |
EP1319718A1 (en) | High throughput analysis and detection of multiple target sequences | |
WO2005093094A2 (en) | Methods and means for nucleic acid sequencing | |
US20170016056A1 (en) | Accurate detection of rare genetic variants in next generation sequencing | |
WO2008003244A1 (en) | Methods for identification of alleles | |
US20090239213A1 (en) | Identifying a target polynucleotide | |
JP2008531035A (ja) | ポリヌクレオチド配列の特徴づけを改善するための方法 | |
US20070254280A1 (en) | Method of Identifying Characteristic of Molecules |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100713 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101207 |