JP2008528005A - T−betによるTH2系譜コミットメントの調節 - Google Patents

T−betによるTH2系譜コミットメントの調節 Download PDF

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Abstract

本発明は少なくとも一部はT−betがTh2サイトカインの生産を直接調節するメカニズムの同定に基づく。本発明はTec−キナーゼ媒介型のT−betとGATA−3との相互作用を調節する作用物質の同定方法、ならびにその使用方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、「T−betによるTh2系譜コミットメントの調節(Modulation of Th2 Lineage Commitment by T−bet)」という表題の2005年1月20日に出願された特許文献1の利益を主張する。本出願は1999年6月2日に出願された特許文献2の優先権を主張する英語のPCT条項21に従い公開された2000年(失効)6月1日に出願された特許文献3の一部継続出願である2001年12月3日に出願された特許文献4(係属中)の一部継続出願である2002年12月3日に出願された特許文献5(係属中)に関し、これら各々の全内容は引用により本明細書に編入する。
政府の補助金
本明細書に記載する本研究は、少なくともその一部分が米国立衛生研究所により供与された補助金AI/AG37833、AI39646、AI36535、AR6−2227、TGAI07290およびAI48126により支援された。従って、米国政府は本発明における一定の権利を有することができる。
[背景技術]
発明の背景
免疫系の細胞は、細胞外および細胞内シグナルに反応して遺伝子発現のパターンを変化させる。幾つかの細胞型において一連の生物学的活性に影響するサイトカインまたはリンホカインと名付けられたポリペプチド群は、これらのシグナルの中で最も重要なものに属する。免疫系内の多数の細胞型がサイトカインを分泌するが、Tヘルパー(Th)リンパ球はこれらのポリペプチドの主要な供給源である。10年以上前に、Th細胞は、T細胞受容体連結(engagement)の際に2種の異なるサブセット、Th1およびTh2に分化し、これらの異なる機能的能力および独自のサイトカインプロファイルにより両者に定義されることが発見された(非特許文献1:非特許文献2;非特許文献3:非特許文献4)。Th1細胞は遅延型過敏性反応およびマクロファージ活性化を媒介し、一方Th2細胞はB細胞を支援し、そしてアレルギー反応に重要である(非特許文献5:非特許文献6;非特許文献7:非特許文献8;非特許文献9)。Th1細胞が細胞性免疫を指令し、一方Th2細胞が体液性応答に関与するという証拠は、生物体が、病原に反応して細胞性または体液性応答のいずれかを有する傾向があり、しかし両方ではないという観察に良く適合する。Thサブセット間のこれらの機能的な相違は、サイトカイン自体の活性により最も容易に説明できる。Th1細胞はIL−2、TNFおよびLTも生産するが、IFN−γがTh1細胞の「特徴(signatute)」サイトカインである。Th2の相当する「特徴」サイトカインはIL−4である。Th2細胞は、IL−5、IL−6、IL−9、IL−10およびIL−13も分泌する。
抗原に遭遇すると、ナイーブCD4+Tヘルパー前駆体(Thp)細胞は発生プログラムを開始し、最終的にはこれをTh1またはTh2系列に送る。極性化は抗原および同時刺激シグナル、すなわちThpが受ける「シグナル強さ」を操作して達成できるが(非特許文献10)、エフェクターTh細胞の最も強力な誘導物質は、疑いなくサイトカイン自体である。IL−4はTh2分化を促進し、そして同時にTh1発生を遮断し、これはStat6シグナリング経路により媒介される効果である。従って、IL−4またはStat6を欠失するマウスは、Th2細胞を発生しない(非特許文献11;非特許文献12;非特許文献13;非特許文献14;非特許文献15)。反対に、IL−12、IL−18およびIFN−γは、Th1細胞発生に重要なサイトカインである(非特許文献16;非
特許文献17;非特許文献18;非特許文献19;非特許文献20)。Stat1経路を介して作用するIFN−γ(非特許文献19)、およびStat4シグナリング経路を介して作用するIL−12(非特許文献21)は、一緒になってTh1細胞の分化を促進し、そしてTh2系譜コミットメントを遮断する(非特許文献22;非特許文献23)。IL−12またはStat4を欠失するマウスは、Th1細胞を持っていない(非特許文献24;非特許文献25;非特許文献26)。別の重要なTh1誘導サイトカインはIL−18であり、その受容体はIL−1受容体ファミリーに関連する(非特許文献27)。IL−18を欠失するマウスは、生体内Th1反応を欠き(非特許文献28)そしてIL−12およびIL−18の両者はIFN−γ発現を調節する(非特許文献29;非特許文献30;非特許文献31)。次いでこれらのサイトカイン自体はTh極性化を駆動する正および負のフィードバック系を形成する(非特許文献32;非特許文献33;非特許文献34;非特許文献35;非特許文献36;非特許文献37;非特許文献38;非特許文献39;非特許文献40;非特許文献41;非特許文献42)(総説は(非特許文献43;非特許文献44;非特許文献45を参照にされたい)。
最近数年間に、Th2細胞へのTh中の転移を制御する転写因子の同定に著しい進歩がなされ、これはIL−4生産を駆動するこのような因子の能力により証明され(非特許文献46;非特許文献47を検討されたい)。3種の異なるタンパク質、すなわちc−Mafプロト腫瘍遺伝子、転写因子である活性化T細胞の核因子(NFAT)、および新規の核抗原であるNFAT−相互作用タンパク質45kD(NIP45)の生産が、非−T細胞に内因性IL−4生産能力を与えることが示された(非特許文献48;非特許文献49)。これらの因子およびその他、例えばGATA−3(非特許文献50)およびStat6は、明らかにIL−4の生産、従ってTh2細胞の発生を、生体外および生体内の両方で駆動できる。
反対に、Th1分化の分子的基礎はほとんど知られていない。例えば、その不在がTh1細胞生成を不能とする既知のわずかな転写因子は、Stat4(非特許文献51;非特許文献52)およびIRF−1(非特許文献53;非特許文献54)であり、これらはいずれもTh1特異性ではない。Stat4依存の様式でIL−12中に導入されるEtsファミリーメンバーERMは、最近Th1特異性であると報告されたが、しかしこれはTh1サイトカインの生産に影響しない(非特許文献55)。Stat4欠失マウス中のTh1細胞の不在は、Th1プログラムを駆動するIL−12の欠損の結果であり、一方、IRF−1欠失マウス中のTh1細胞の欠失は、IL−12遺伝子の転写制御における直接的効果によるものであるらしい(非特許文献56;非特許文献57)。しかし、このような推定Th1−特異性調節因子の上流にあるシグナリング経路の幾らかは、解明され始めている。
p38キナーゼは、このようなシグナリング分子の一つであり、これはIFN−γ生産をブーストする構成的活性化MAPキナーゼキナーゼ6(MKK−6)の能力により証明される。反対に、ドミナントネガティブ(dominant negative)p38MAPキナーゼの過剰発現またはJnk2もしくはJnk1の標的破壊は、Th1応答を低下させる(非特許文献58;非特許文献59;非特許文献60)。JNKシグナリング経路は、INF−γ遺伝子の転写への直接作用によりTh発生に影響するかもしれないが、しかしこれは証明されていない。例えば、ATF−2およびAP−1転写因子は、両者共にJNKキナーゼの基質であり、そしてこれらの因子ならびにNFκBおよびStat4タンパク質はIFN−γプロモーター内の部位に結合することが知られている(非特許文献61;非特許文献62;非特許文献63;非特許文献64)。しかし、IFN−γの生産は、ATF−2を欠失するマウスでは正常である。T−betはIFNγ遺伝子ならびにIL−12Rβ2鎖の転写を直接駆動することにより前者を達成する。しかしT−betはIL−4プロモーター活性を直接的に抑えないので、後者が達成されるメカニズムに対する手掛かりは存在しない。T−betがTh2サイトカイン生産を直接調節するメカニズムの同定は、これらサイトカインの生産の調節を可能とし、甚大な利益となるだろう。
参考文献
米国特許仮出願第60/645,698号明細書 米国特許仮出願第60/137,085号明細書 国際出願第PCT/US00/15345号パンフレット 米国特許出願第10/008,264号明細書 米国特許出願第10/309,747号明細書 Paul and Seder,Cell 76,241−251,1994 Mosmann and Coffman,Annu.Rev.Immunol.7,145−173,1989 Mosmann et al.,J.Immunol.136,2348−2357,1986 Snapper and Paul,Science 236,944−947,1987 Mosmann and Coffman,Annu.Rev.Immunol.7,145−173,1989 Paul and Seder,Cell 76,241−251,1994 Arthur and Mason,J.Exp.Med.163,774−786,1986 Paliard et al.,J.Immunol.141,849−855,1988 Finkelman et al.,J.Immunol.141,2335−2341,1988 Constant and Bottomly,Annu.Rev.Immunol.15,297−322,1997 Kopf et al.,Nature 362,245−248,1993 Kuhn et al.,Science,254,707−710,1991 Kaplan et al.,Immunity 4,313−319、1996 Shimoda et al.,Nature 380,630−633,1996 Takada et al.,Nature 380,627−630,1996 Hsieh et al.,Science 260,547−549,1993 Okamura et al.,Nature 378,88−91,1995 Gu et al.,Science 275,206−209,1997 Meraz et al.,Cell 84,431−442,1996 Magram et al.,Immunity 4,471−481,1996 Jacobson et al.,J.Exp.Ned.181,1755−61762,1995 Szabo et al.,Immunity2,665−675,1995 Szabo et al.,J.Exp.Med.185:817−825,1997 Magram et al.,Immunity 4,471−481,1996 Takada et al.,Nature 380,627−630,1996 Shimoda et al.,Nature 380,630−633,1996 Cerretti et al.,Science 256,97−100,1992 Takeda et al.,Immunity 8,383−390,1998 Barbulescu et al.,Eur.J.Immunol.,27,1098−1107,1998 Robinson et al.,Immunity 7,571−581,1997 Ahn et al.,J.Immunol.159,2125−2131,1997。 Powrie and Coffman,Immunol.Today 14,270−274,1993 Scott,J.Immunol.147,3149,1991 Maggie et al.,J.Immunol.148,2142,1992 Paronchi et al.,1992,J.Immunol. 149,2977,1992 Fargeas et al.,Eur.J.Immunol.149,2977 Menetti et al.,J.Exp.Med.177,1199,1993 Trinchieri,Immunol Today,14,335−338,1993 Macatonia et al.,Immunol.5,1119,1993 Seder et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,,10188−10192,1993 Wu et al.,1993,J.Immunol.151,1938 Hsieh et al.,Science 260.547−549,1993 Seder and Paul,In Annual Review of Immunology,Vol.12,635−673,1994 Paul and Seder,Cell 76,241−251, 1994 O’Garra,Immunity 8,275−283,1998 Glimcher and Singh,Cell 96,13−23,1999 Szabo et al.,Current Opinions in Immunology 9,776−781,1997 Hodge et al.,Science 274,1903−1905,1996 Hoet al.,J.Exp.Med.188:1859−1866,1998 Zheng and Flavell,Cell 89,587−596,1997 Thierfelder et al.,Nature 382,171−174,1996 Kaplan et al.,Nature 382,174−177,1996 Lohoff et al.,Immunity,681−689,1997 Taki et al.,Immunity 6:673−679,1997 Ouyang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.96:3888,1999 Lohoff et al.,Immunity 6,681−689,1997 Taki et al.,Immunity 6:673−679,1997 Rincon et al.,EMBO J.17,2817−2829,1998 Yang et al.,Imunity 9,575−585,1998 Dong et al.,Scicence 282,2092−2095,1998 Zhang et al.,Immunol.161,6105−6112,1998 Ye et al.,Mol.Cell.Biol.16:4744,1996 Barbulescu et al.,Eur.J.Immunol.27,1098−1107,1997 Sica et al.,J.Biol.Chem.272,30412−30420,1997
発明の要約
本発明は、少なくともその一部分は、T−betがTh2サイトカイン生産を直接的に抑制するメカニズムの同定に基づく。
本発明の1つの観点は、T細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に増加する化合物の同定方法を特徴とし、この方法は化合物の存在下で、T−betおよびTecキナーゼ分子をキナーゼ分子とT−betとの相互作用を可能とする条件下で接触させ;そしてT−betおよびキナーゼ分子の相互作用を検出することを含んでなり、ここでT細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを増加する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示される。1つの態様では、T−betとキナーゼ分子との相互作用は、T−betとキナーゼとの間の複合体の形成を測定することにより決定される。別の態様では、T−betとキナーゼ分子の存在作用がT−betのリン酸化を測定することにより決定される。さらなる態様では、T−betのリン酸化がT−betのアミノ酸525(Y525)位のチロシン残基のリン酸化を測定することにより決定される。1つの態様では、キナーゼ分子がITKである。
本発明の別の観点は、T細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを増加させるために有用な化合物の同定法であり、この方法は:a)ITK、T−betおよびGATA3を含んでなる指標組成物を準備し;b)指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ;c)試験化合物のライブラリーから、ITK媒介型のT−betおよびGATA3のする相互作用を減少させる目的化合物を選択し、これによりTh2系譜コミットメントを増加させる化合物を同定することを含んでなる。1つの態様では、相互作用がT細胞によるTh2サイトカイン生産を測定することにより決定される。さらなる態様では、サイトカインがIL−4、IL−5およびIL−10からなる群から選択される。1つの態様では、ITK−媒介型のT−betとGATA3との相互作用が、T−betとGATA3との間の複合体の形成を測定することにより決定される。別の態様では、ITK媒介型のT−betとGATA3との相互作用が、DNAへのGATA3の結合の低下を測定することにより決定される。さらに別の態様では、指標組成物がT−betポリペプチドを発現する細胞である。さらなる態様では、細胞がT細胞系譜へコミットする。さらに別の態様では、細胞は未だT細胞系譜へコミットしない。
本発明の別の観点は、T細胞中のT−betとGATA3との相互作用を調節(modulate)する化合物の同定方法を特徴とし、化合物およびITKの存在下で、T−betおよびGATA3を、ITK媒介型のT−betとGATA3との結合により複合体を形成することを可能とする条件下で接触させ;そしてT−betとGATA3との複合体の形成を検出することを含んでなり、ここでITKおよび化合物の存在下でT−betとGATA3との間の相互作用を阻害する化合物の能力が、ITKおよび化合物の不存在下で形成される複合体の量と比べた時に複合体の形成の低下により示される。1つの態様では化合物が複合体の形成または安定性を上昇させる。別の態様では、化合物が複合体の形成または安定性を減少させる。
本発明の別の観点では、T細胞による少なくとも1つのTh2サイトカインの生産を直接的に上昇させるために有用な化合物の同定方法を特徴とし、この方法は:a)ITK、T−betおよびGATA3を含んでなる指標組成物を提供し;b)指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ;c)試験化合物のライブラリーから、ITK媒介型のT−betとGATA3との相互作用を減少する目的化合物を選択し、これにより少なくとも1つのサイトカインの生産を上昇させる化合物を同定することを含んでなる。1つの態様ではT−betとGATA3との相互作用が少なくとも1つのサイトカインの生産を測定することにより決定される。別の態様では、T−betとGATA3との相互作用が1より多くのサイトカインの生産を測定することにより決定される。さらに別の態様では、細胞がT細胞、B細胞およびNK細胞からなる群から選択される。
本発明の1つの観点では、T細胞によるTh2サイトカインの生産を直接的に増加する作用物質を用いた処置から利益を受ける障害を処置または防止する方法を特徴とし、この方法は障害を処置または防止するように、該障害を持つ個体にT細胞におけるITK媒介型のT−betとGATA3との結合を減少させる作用物質を投与することを含んでなる。1つの態様では、作用物質がT−betのチロシンリン酸化を阻害する。別の態様では、T細胞がThp細胞である。
本発明の別の観点は、T細胞によるTh2サイトカイン生産を直接的に増加させる方法を特徴とし、この方法はT細胞によるTh2サイトカイン生産が直接的に増加するように
、T細胞におけるITKが媒介するT−betとGATA3との結合を減少させる作用物質と細胞を接触させることを含んでなる。1つの態様では、作用物質がT−betのチロシンリン酸化を阻害する。別の態様では、T細胞がThp細胞である。
本発明のさらに別の観点は、T細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に増加する方法を特徴とし、この方法はT細胞分化の間中のTh2系譜コミットメントが増加するように、T細胞中でのITK媒介型のT−betおよびGATA3結合を減少させる作用物質と細胞を接触させることを含んでなる。1つの態様では、作用物質がT−betのチロシンリン酸化を阻害する。別の態様では、T細胞がThp細胞である。
発明の詳細な説明
本発明は、少なくともその一部分は、T−betによりTh2サイトカイン生産が直接的に調節されるメカニズムの同定に基づく。本発明は、とりわけTecキナーゼが媒介するT−betとGATA−3との相互作用を調節する作用物質の同定法、ならびにその使用法に関する(添付する実施例を参照にされたい)。以下に詳細に検討するように、T−betは種々の細胞外シグナルの重要な細胞内トランスデューサーまたはメディエーターである。より詳細には、T−betは異なる細胞型で細胞外シグナルを遺伝子発現の特異的パターンに伝達するために作動する転写因子である。特にT−betはTh1およびTh2サイトカインの両方の遺伝子発現において中枢的役割を果たすことが証明された。種々の細胞応答を調節するために役立つ種々の細胞型および種々の遺伝子が、T−betに応答する。またT−betは数種の遺伝子、これら遺伝子の発現および同様に影響を受ける他のものの発現も、T−betの発現および/または活性を制御することにより調節することができる(例えば強化または減少)。
Brachyuryまたはは、T−boxと呼ばれる200アミノ酸DNA結合ドメインを共有する転写因子のファミリーの創始メンバーである(総説は、(Smith,1997;Papaioannou,1997;Meisler,1997中)。Brachyury(「短尾」のギリシャ語)突然変異は、短くて少しねじれた尾を持った異型接合変異動物内で、1927年に最初に記載された(Herrmann et al.,1990)。Brachyury T−boxタンパク質のアミノ−末端の半分(アミノ酸1〜229)は、配列特異的なDNA結合活性を表すことが示されたT−boxとして知られる保存ドメインを含む(Kispert,A.& Herrmann,B.G.1993,EMBO J.12:3211;Papapetrou,C.,et al.1997,FEBS Lett.409:201;Kispert.A.,et al.,1995,EMBO J.14:4763)。C−末端の半分は、トランス活性化および抑制ドメインの2対を含む。オルソログ種内のT−box領域の間の配列の類似性は、99%と高くそして非オルソログ遺伝子間では40〜70%である。T−boxドメインは最近DNAと同時結晶化され、そしてタンパク質がDNAと大溝(major groove)および小溝(minor groove)内の両方で接触する新規の配列特異性DNA認識構造を示す(Mueller,C.W.& Herrmann,B.G.,1997,Nature 389,884)。
酵母ワンハイブリッド(yeast one hybrid)法を、Th−1特異性転写因子を同定するために使用した。酵母細胞は、IL−2プロモーター−レポーター遺伝子構築物を発現するように作製され、そして抗−CD3活性化Th1細胞クローンから作製されたcDNAライブラリーを用いて形質転換された。IL−2プロモーターの検査は、NFκB部位の5’−240−220丁度の優れたT−box結合部位を明らかにした。添付の実施例に記載するように、T−betはIL−2プロモーターを結合する能力に基づいて酵母ワンハイブリッドスクリーニングアッセイで単離された。
本発明のT−betタンパク質は、T−boxタンパク質と相同性を有する。現在、Brachyuryを含まずにマウスにおいて8種より多くのT−box遺伝子が存在する。これらには、Tbx1〜6、T−brain−1(Tbr−1)、Eomes、T−pitおよびT−betを含み、それぞれ明確で通常は複雑な発現パターンを有する。例えば、T−brain−1発現は、大部分が大脳皮質内の明確なドメインに限定される(Bulfone,A.et al.,1995,Neuron 15,63)。T−betはTbr−1の配列に最も類似している。T−boxの外で、本発明のT−betタンパク質は他のT−boxタンパク質と一致性を有していない。
T−betは、T細胞内のみで発現されるT−boxタンパク質であり、そしてTbr−1に配列が最も類似している。他の種もBrachyury様の遺伝子を発現する。そのような脊椎動物種は、ゼノプス(Xenopus)、ミノカサゴ(Zebrafish)、ヒヨコおよびヒトであり(Rao,1994;Horb and Thomsen,1997;Conlon et al.,1996;Ryan et al.,1996;Schulte−Merker et al.,1994;Edwards et al.,1996;Morrison et al.,1996;Law et al.,1995;Cambell et al.,1998)ならびにさらに遠位の種、例えばナメクジウオ(amphioxus)、ホヤ(ascidians)、キョク皮動物(echinoderm)、C.エレガンス(Caenorhabditis elegans)、ショウジョウバエ(drosophila)などの昆虫である(Holland et al.,1995)。これらの遺伝子は配列でも発現パターンでも保存されている。
T−betはチロシンリン酸化される唯一のT−boxタンパク質という点で特異である。3個の予想されるチロシンリン酸化部位がヒトT−betのTyr76、Tyr119およびTyr531、およびネズミT−betのTrr525に存在する。また核局在化配列も、ヒトT−betのアミノ酸498−501およびマウスT−betの493−496にも存在する。マッピング実験は、2個のトランス活性化ドメイン、すなわち1つはT−boxドメインの5’、そして1つは3’に位置決定した。T−betは共通T−ボックス部位に(標的部位選択(すなわちEMSAおよびDNA免疫沈降アッセイ)によりin vitroで、5’−GGGAATTTCACACCTAGGTGTGAAATTCCC−3’と決定)、およびヒトIL−2プロモーター、マウスIL−2プロモーター、ヒトIFN−γイントロンIIIに結合し、およびマウスIFN−γ近位プロモーター内の2つの結合部位に部位を示した(Szabo et al.2000.Cell 100:655−669)。T−betは胸腺内および末梢リンパ系内で発現する。末梢系においてT−betはTh1細胞内のみで発現され、ここでこれはTcR刺激およびIL−12の両方に応答して誘導される。胸腺内においてT−betのレベルは、DNおよびRag2−/−胸腺細胞内で最高である。
これらのデータは、T−betの組選択的発現が組織特異性IFN−γ発現の原因となることを証明する。T−betは、Th1内でのみ発現されTh2細胞内では発現されず、そしてT細胞受容体を介するシグナルの伝達に応じて前者内で誘導される。
さらにT−betはIFN−γ遺伝子の有力なトランス活性化剤である。T−betの発現は、Th1細胞、B細胞、NK細胞および樹状細胞を含む適応および先天性免疫系の細胞でIFN−γ発現と相関する。T−betはナイーブなThp細胞からTh1系列発生を開始する発生プログラムの原因であり、そしてTh1発生プログラムを開始することにより、およびTh2細胞中の対立プログラムを抑制することの両方により作用する。
本発明がより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。
本明細書でT−betに関連して使用する用語「調節する(modulated)」には、T−betの発現、活性または機能を、同じ条件下で自然に生じるT−betの発現、機能または活性とは異なる様式に変化させることを含む。例えば発現、機能または活性は、例えば結合特異性における変化により自然に生じるT−betの発現、機能または活性よりも大きく、または小さくなることができる。本明細書で使用するように、様々な形の用語「調節する」には、刺激(例えば特定の応答または活性の増加またはアップレギュレーション)、および阻害(例えば特定の応答又は活性の減少またはダウンレギュレーション)を含む。
本明細書で使用する用語「T−bet分子」には、配列番号1および3に記載の核酸分子と構造的特徴を共有するT−bet核酸分子および配列番号2および4に記載のT−betタンパク質の際立った構造および機能的特徴を共有するT−betタンパク質を含む。T−betタンパク質は、タンパク質のT−boxファミリーのメンバーであり、そしてBranchyury、Tbxl−6、T−brain−1(Tbr−1)といくらかのアミノ酸配列相同を共有する。T−boxタンパク質は、T−box結合部位でDNAに結合するT−boxドメインを含んでなる。さらにT−betタンパク質の構造および機能的特徴は以下に記載する。
本明細書で使用する用語「核酸分子」は、DNA分子(例えばcDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えばmRNA)を含むと考える。核酸分子は、一本鎖状または二本鎖状でもよいが、しかし好ましくは二本鎖状DNAである。核酸散分子という用語は、それらのフラグメントまたは等価物(例えばT−bet、Itkおよび/またはGATA3のフラグメントまたは等価物)も含むことを意図している。用語「等価物」とは、機能的に等価のT−betタンパク質、すなわち相互作用、例えばT−betの自然な結合パートナーへ結合する能力を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことを意図している。
本明細書中に使用するところの、「単離された核酸分子」は、核酸が誘導された生物体のゲノムDNA内の核酸に本来的に近接する遺伝子配列(すなわち、核酸が誘導された生物体のゲノムDNA内の単離された核分子に対する遺伝子に近接して位置する遺伝子配列)を含まない核酸分子を呼ぶ。例えば、種々の態様において、単離されたT−bet核酸分子は、典型的には、核酸が誘導された細胞のゲノムDNA内の核酸分子に本来的に近接するヌクレオチド配列の約10kb以下を含み、そしてさらに好ましくは、本来的に近接するヌクレオチド配列の約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb以下を含む。しかし、「単離された」T−bet核酸分子は、ゲノムDNA内のT−bet配列に正常では近接しない他のヌクレオチド配列に連結してもよい(例えば、T−betヌクレオチド配列はベクター配列に連結してもよい)。特定の好適な態様では、「単離された」核酸分子、例えばcDNA分子は、他の細胞物質を含まなくてもよい。しかし、T−bet核酸分子が「単離された」と考えられるために他の細胞物質を含まないという必要はない(例えば、他の哺乳類から分離されそして細菌細胞内に挿入されたT−bet DNA分子は、まだ「単離された」と考えられる)。
本発明の核酸は、例えば標準的な組換えDNA技法により調製することができる。本発明の核酸は、標準的技法を使用して化学的に合成することもできる。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法が知られており、そしてそれらには市販されているDNA合成器で自動化された固相合成がある(例えばItakura et al.,米国特許第4,598,049号明細書;Caruthers et al.,米国特許第4,458,066号明細書;およびItakura et al.,米国特許第4,401,796号および同第4,373,071号明細書を参照にされたい。これらは引用により編入する)。
本明細書で使用する用語「高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、たがいに実質的な相同性(例えば典型的には70%相同以上)を有するヌクレオチド配列が互いに安定してハイブリダイズされたままであるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明することを意図する。高いストリンジェンシー条件の好ましい非限定的例は、6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムを含むハイブリダイゼーション緩衝液(SSC)中、温度約45℃で数時間から一晩ハイブリダイゼーションし、次いで0.2XSSC、0.1%SDSを含む洗浄緩衝液中、温度約50〜65℃での1もしくは複数回の洗浄である。
用語「パーセント(%)一致」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の内容で使用される場合(例えば、一つのアミノ酸配列が他のアミノ酸配列にX%一致である場合)に、最適に配列された場合に2個の配列の間で共有する同一の残基の百分率を呼ぶ。2個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性の百分率を決定するために、配列を最適比較の目的で整列する(例えば一つの配列を他の配列と最適に整列するためにギャップを挿入してもよい)。次いで、相当する位置にある残基を比較しそして一方の配列内の位置が他の配列の相当する位置に相当して同じ残基で占められている場合に、分子はその位置で一致する。従って、2個の配列の間の一致百分率は、2個の配列が共有する一致した位置の数の関数である(すなわち、%一致=(一致した位置の数#/位置の全数#)x100)。
当該技術分野で公知のコンピューターアルゴリズムは、2個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を最適に整列しそして比較して、2個の配列間の一致百分率を決定するために使用できる。2個の配列の比較のために使用される数学アルゴリズムの好ましいが非限定的な例は、Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−2268、変更はKarlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873−5877のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al.,(1990)J.Mol.Biol.215:403−10のNBLASTおよびXBLASTプログラム中に組み込まれている。比較のためにギャップ入りの整列を得るためには、ギャップ入りBLASTがAltschul et al.,(1997)Nucleic Acids Research 25(17):3389−3402に記載されている。BLASTおよびギャップ入りBLASTプログラムを使用する場合に、それぞれのプログラム(例えばXBLASTおよびNBLAST)のデフォールトパラメーターが使用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ギャップペナルティーをexistance 5およびextension 2に設定したデフォルトBlastinマトリックス1−3を使用してBLAST処理した。本発明のアミノ酸配列は、下記のデフォールト設定を用いてBLAST処理した:ギャップペナルティーをexistance 11およびextension 1に設定したBlosum62マトリックス。
配列の比較のために使用した数学アルゴリズムの別の好ましい非限定的例は、Myers and Miller,CABIOS(1989)のアルゴリズムである。このアルゴリズムは、GCG配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)内に組み込まれている。アミノ酸配列比較のためにALIGNプログラムを用いる場合には、PAM120重量残基表(weight residue table)、12のgギャップ長ペナルティ(gap length penalty)および4のギャップペナルティが使用できる。配列比較のために複数のプログラムを使用する場合には、最適の整列(例えば2個の配列間の最高の一致パーセント)を与えるプログラムが比較の目的で使用される。
本明細書で使用するところの、「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子を指す(例えば天然タンパク質をコードする)。
本明細書で使用するように、「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的、例えば二本鎖cDNA分子のコーディング鎖に相補的、mRNA配列に相補的または遺伝子のコーディング鎖に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。
1つの態様では、本発明の核酸分子はsiRNA分子である。1つの態様では、本発明の核酸分子はRNAiを媒介する。RNA干渉(RNAi)は、dsRNAと同じ配列を含有するメッセンジャーRNA(mRNA)に分解するために、二本鎖RNA(dsRNA)を使用する翻訳後の標的化遺伝子サイレンシング法である(Sharp,P.A.and Zamore,P.D.287,2431−2432(2000);Zamore,P.D.,et al.,Cell 101,25−33(2000).Tuschl,T.et al.,Genes Dev,13,3191−3197(1999);Cottrell TR,and Doering TL.2003.Trends Microbiol.11:37−43;Bushman F.2003.Mol Therapy.7:9−10;McManus MT and Sharp PA.2002.Nat Rev Genet.3:737−47)。このプロセスは、内因性のリボヌクレアーゼが長いdsRNAを短い、例えば21−もしくは22−ヌクレオチド長のRNA(小干渉RNAまたはsiRNAを呼ばれる)に分解する場合に起こる。次いで、より短いRNAセグメントは、標的をmRNAの分解を媒介する。RNAi合成のためのキットは、例えばニューイングランドバイオラボ(New England Biolab)またはアンビオン(Ambion)から市販されている。1つの態様では、アンチセンスRNAに使用するための上記の1もしくは複数の化学を、RNAiを媒介する分子に使用することができる。
本明細書で使用する用語「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域を指し、一方用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域を指す(例えば5’および3’非翻訳領域)。
本明細書で使用する用語「ベクター」は、それが連結している他の核酸を輸送できる核酸分子を呼ぶ。ベクターの一つの種類は、「プラスミド」であり、これはその中にさらなるDNAセグメントを連結することができる環状二本鎖DNAループを称する。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでさらなるDNAセグメントをウイルスゲノム内に連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製することができる(例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳類ベクター)。他のベクター(例えば非−エピソーマル哺乳類ベクター)は、宿主細胞内への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、そしてこれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に連結している遺伝子の発現を指令できる。そのようなベクターは、本明細書中では「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えDNA技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本明細書中で、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用されるが、それはプラスミドがベクターの最も普通に使用される形であるからである。しかし本発明は、同等の機能に役立つ発現ベクター、例えばウイルスベクター(例えば複製欠失レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形も含むと考える。
本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、本発明の核酸、例えば本発明の組換え発現ベクターが導入された細胞を指すものとする。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中では互換的に使用される。このような用語は、特定の主題の細胞を指すだけでなく、そのような細胞の後代または可能な後代も指すものとする。ある種の変化が、突然変異または環境の影響により後続世代に起こるかもしれないので、このような後代は実際には親細胞と同等ではないが、しかし本明細書中に使用される用語の範囲内に含まれる。
本明細書で使用するところの、「トランスジェニック動物」は動物の1個もしくは複数の細胞が「導入遺伝子」を含む非−ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスを指す。用語「導入遺伝子」は、これからトランスジェニック動物が発生し、そして成熟動物のゲノム内に残る細胞のゲノム内に組み込まれる外因性DNAを指し、例えばトランスジェニック動物の1もしくは複数の細胞タイプまたは組織内にコードされた遺伝子産物の発現を指令する。
本明細書で使用するところの、「相同的組換え動物」は、動物の発生に先立って、内因性遺伝子が、その中で内因性遺伝子と動物の細胞、例えば動物の胚細胞内に導入された外因性DNA分子との間の相同性組換えにより改変されている種類をトランスジェニック非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスを指す。
本明細書中に使用される場合に、「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、細胞から単離されるかまたは組換えDNA技術により生産された場合に他のタンパク質、ポリペプチド、細胞物質および培地を、または化学的に合成された場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質またはポリペプチドを呼ぶ。「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、タンパク質が誘導された細胞または組織源から細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成された場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」とは、タンパク質が単離または組換え的に生産された細胞の細胞成分から分離されているT−betタンパク質の調製物を含む。
本明細書で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫学的に活性な免疫グロブリン分子、すなわちFabおよびF(ab’)2フラグメントのような抗原に特異的に結合(免疫反応)する抗原結合部位を含む分子である。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、抗原の特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位の一種のみを含む抗体分子の集団を指し、一方「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相互作用可能な抗原結合部位の複数の種類を含む抗体分子の集団を呼ぶ。従って、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、これが免疫反応する特定の抗原に対する単一結合親和性を示す。
本明細書で使用する用語「イントラボディ(intrabody)」は、細胞内側の標的、例えばT−betのような細胞内タンパク質に対し向けられた細胞内で発現される抗体構築物、通常は一本鎖Fv(scFv)抗体を指す。
本明細書で使用する用語「ドミナントネガティブT−betタンパク質」は、天然の(すなわち天然に生じる野生型)T−bet分子と競合するがしかしT−bet活性を有しないT−bet分子(例えばその部分もしくはバリアント)を含む。そのような分子は細胞中のT−bet活性を効果的に減少させる。本明細書で使用する「ドミナントネガティブのT−betタンパク質」は、T−bet活性の強力なインヒビターである修飾された形態のT−betを指す。
本明細書で使用する用語「細胞」は、原核生物および真核生物細胞を含む。1つの態様では本発明の細胞は細菌細胞である。別の態様では本発明の細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。別の態様では本発明の細胞は脊椎動物細胞、例えばトリもしくは哺乳動物細胞である。好適な態様では、本発明の細胞はマウスもしくはヒト細胞である。
本明細書で使用する用語「免疫細胞」は造血起源の細胞であり、そして免疫応答に役割を果たす細胞を含む。免疫細胞には、B細胞およびT細胞のようなリンパ球;ナチュラルキラー細胞;および単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球のような骨髄性細胞を含む。
本明細書で使用する用語「樹状細胞」は、T細胞の刺激においてとりわけ活性である1つの型の抗原提示細胞を指す。樹状細胞はGM−CSFの存在下で骨髄細胞を培養すること、ならびにMHCクラスII分子およびCD11cを発現する細胞を選択することにより得ることができる。樹状細胞はCD11b、DEC−205、CD8−アルファもまた発現することができる。
本明細書で使用する用語「ナイーブなT細胞への抗原提示の部位」は、例えばin vivoの初期免疫応答の間に樹状細胞を相互連結することにより提示される抗原とナイーブなCD4 T細胞が最初に接触するようになるリンパ組織内の部位を含む。
用語「抗原提示細胞」および「APC」は、本明細書では互換的に使用し、専門的な抗原提示細胞(例えばBリンパ球、単球、樹状細胞およびランゾルハンス細胞)、ならびに他の抗原提示細胞(例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞および希突起膠細胞)を含む。
本明細書で使用する用語「T細胞」(すなわちTリンパ球)という用語は、哺乳動物(例えばヒト)からの胸腺細胞、未熟T細胞、成熟T細胞などを包含するT細胞系列内のすべての細胞を含むものとする。T細胞は、CD4またはCD8のいずれか(しかし両方ではない)、およびT細胞受容体を発現する成熟T細胞を含む。本明細書に記載する種々のT細胞群は、それらのサイトカインプロファイルおよびそれらの機能に基づき定義することができる。
本明細書で使用する「前駆T細胞」(“Thp”)は、CD4を発現するナイーブな多能性細胞である。
本明細書で使用する用語「ナイーブなT細胞」には、コグネイト抗原に暴露されたことがなく、したがって活性化されないT細胞または記憶細胞を含む。ナイーブなT細胞は循環せず、そしてヒトのナイーブなT細胞はCD45RA+である。ナイーブなT細胞が限定するわけではないが抗原の量、投与の経路および投与時期に依存して抗原を認識し、そしてさらなるシグナルを受けるならば、それらは増殖し、そしてT細胞の種々のサブセット、例えばエフェクターT細胞に分化する可能性がある。
本明細書で使用する用語「末梢T細胞」は、胸腺を離れかつ末梢循環に進入する成熟シングルポジティブT細胞を指す。
本明細書で使用する用語「分化した」とは、刺激剤と接触したT細胞を指し、そしてエフェクターT細胞(例えばTh1、Th2)および記憶T細胞を含む。分化したT細胞はナイーブなT細胞と比べて数種の表面タンパク質の発現が異なり、そして他の細胞を活性化するサイトカインを分泌する。
本明細書で使用する用語「記憶T細胞」は、抗原への暴露後に機能的に静止となり、そして抗原の不存在下で長期間、生存することができるリンパ球を含む。ヒトの記憶T細胞はCD45RA−である。
本明細書で使用する用語「エフェクターT細胞」には、抗原を排除するために機能するT細胞を含む(例えば他の細胞の活性化を調節するサイトカインを生産することにより、または細胞傷害活性により)。用語「エフェクターT細胞」には、Tヘルパー細胞(例えばTh1およびTh2細胞)および細胞傷害性T細胞を含む。Th1細胞は遅延型の過敏応答およびマクロファージの活性化を媒介し、一方Th2細胞はB細胞に対する援助を提供し、そしてアレルギー性応答に重要である(Mosmann and Coffman,1989,Annu.Rev.Immunol.7,145−173;Paul and Seder,1994,Cell 76,241−251;Arthur and Mason,1986,J.Exp.Med.163,774−786;Paliard et al.,1988,J.Immunol.141,849−855;Finkelman et al.,1988,J.Immunol.141,2335−2341)。本明細書で使用する用語「Tヘルパー1型応答」(Th1応答)は、IFN−γ、IL−2、TNF、ならびにリンホトキシン(LT)、およびTh2細胞よりむしろTh1細胞により優先的にもしくは独占的に生産される他のサイトカインから選択される1もしくは複数のサイトカインの生産を特徴とする応答を指す。
本明細書で使用する用語「調節T細胞」には、低レベルのIL−2、IL−4、IL−5およびIL−12を生産するT細胞を含む。調節T細胞はエフェクターT細胞よりも低レベルにもかかわらずTNFα、TGFβ、IFN−γおよびIL−10を生産する。TGFβは調節T細胞により生産される優勢なサイトカインであるが、このサイトカインはTh1またはTh2細胞よりも低いレベルで生産され、例えばその規模はTh1またはTh2細胞よりも1次元低い。調節T細胞は細胞のCD4+CD25+群に見い出すことができる(例えばWaldmann and Cobbold.2001.Immunity.14:399を参照にされたい)。調節T細胞は培養中に活性化シグナル(例えば抗原および抗原提示細胞、またはMHCの内容において抗原を模するシグナルを用いて、例えば−CD3抗体に−CD28抗体を加えて)で刺激されたTh1またはTh2またはナイーブなT細胞の分化およびサイトカイン生産を活発に抑制する。
本明細書で使用する用語「細胞分化」には、細胞の発生能が制限され、そして細胞が特異的な発生の運命を獲得するプロセスを含む。分化した細胞は他の細胞型から異なって認識できるように分化する。
本明細書で使用する用語「系譜コミットメント(lineage commitment)」という用語は、前駆細胞例えばThp細胞から特異的な1系列の完全に分化したエフェクター細胞、例えばTh1もしくはTh2細胞のような受容体媒介性の刺激に際してサイトカインの特異的プロファイルを分泌するT細胞へのT細胞系列の発生を開始するプログラムを指す。
本明細書で使用する用語「Th2系譜コミットメント(Th2 lineage commitment)」は、前駆細胞例えばThp細胞から特異的な1系譜の完全に分化したTh2エフェクター細胞へのT細胞系譜への発生を開始する発生プログラムを指し、例えばTh2発生プログラムを駆動すると同時に、反対のTh1発生プログラムの発生を抑えることを指す。本明細書に記載するように、例えばT−betとキナーゼ分子、例えばチロシンキナーゼ分子、例えばTec分子、例えばItkとの相互作用はT−betのリン酸化を導き、そして引き続いてTh2系譜コミットメントの減少を導く。Th2系譜コ
ミットメントの減少は、例えばTh2−特異的サイトカイン、例えばIL−4、IL−5およびIL−10またはTh1サイトカイン、例えばIFNγを測定することにより測定することができる。
本明細書で使用する用語「Th2系譜コミットメントを直接的に調節する」とは、キナーゼが媒介するT−betのGATA−3への結合を調節することにより、Th2系譜コミットメントを調節し、これによりTh2サイトカイン遺伝子の転写を制御することを指す。例えば上記で検討したように、未コミットメント(uncommitteted)、またはナイーブなT細胞の分化され、コミットされたT細胞への分極は、ポジティブおよびネガティブフィードバックシステムを形成することにより、サイトカイン自体により制御されると以前は考えられていた(Powrie and Coffman,1993,Immunol.Today 14,270−274;Scott,1991,j.Immunol.147,3149;Maggi et al.,1992,J.Immunol.148,2142;Parronchi et al.,1992,J.Immunol.149,2977;Fargeas et al.,1992,Eur.J.Immunol.149,2977;Manetti et al.,1993,J.Exp.Med.177,1199;Trinchieri,1993,Immunol.Today 14,335−338;Macatonia et al.,1993,Immunol.5,1119;Seder et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,10188−10192;Wu et al.,1993,J.Immunol.151,1938;Hsieh et al.,1993,Science 260,547−549)(Seder and Paul,1994,In Annual Review of Immunology,Vol.12,635−673;Paul and Seder,1994,Cell 76,241−251;O’Garra,1998,Immunity 8,275−283を再考されたい)。しかし本明細書に記載するように、Th1またはTh2サイトカイン自体の、またはTh1サイトカインの活性化には反対しないが、これはむしろTh2サイトカインの発現を促進する転写因子であるGATA3の抑制指令である。さらに詳細には、Th2系譜コミットメントは、キナーゼが媒介するGATA−3とT−betとの間の相互作用により抑制される。逆に、Th2系譜コミットメントは、キナーゼが媒介するGATA−3とT−betとの間の相互作用の減少により上昇する。キナーゼ−例えばチロシンキナーゼ−が媒介するGATA−3とT−betとの間の相互作用、またはキナーゼ、例えばチロシンキナーゼ、例えばItkによるT−betのリン酸化を強化または低下する作用物質は、Th2サイトカイン生産を調節することによりTh2系譜コミットメントを直接調節する作用物質である。
本明細書で使用するところの用語「Th2系譜コミットメントを間接的に調節する」とは、キナーゼが媒介するT−betGATA−3相互作用の直接的調節によるのではなく、サイトカイン環境(milieu)を調節することにより、例えばTh1サイトカイン生産を調節することにより、またはT−betが関与するシグナル伝達経路の他の成分を調節することによりTh2系譜コミットメントの調節を指す。
本明細書で使用する用語「受容体」は、抗原、複合化抗原(例えばMHC分子の内容において)、または抗体に結合する免疫細胞受容体を含む。活性化受容体には、T細胞受容体(TCR)、B細胞受容体(BCR)、サイトカイン受容体、LPS受容体、補体受容体およびFc受容体を含む。例えばT細胞受容体はT細胞上に提示され、そしてCD3分子と会合する。T細胞受容体は、MHC分子の内容では抗原により刺激される(ならびにポリクローナルT細胞活性化試薬により)。TCRを介するT細胞の活性化は多くの変化、例えばタンパク質リン酸化、膜脂質の変化、イオンの流動、環式ヌクレオチドの改変、RNA転写の変化、タンパク質合成の変化、および細胞容量の変化をもたらす。
本明細書で使用する用語「免疫応答」は、免疫細胞活性化の調節により影響を受ける免疫細胞媒介型の(例えばT細胞媒介型および/もしくはB細胞媒介型)免疫応答を含む。例示的免疫応答はB細胞応答(例えば抗体生産、例えばIgA生産)、T細胞応答(例えば増殖、サイトカイン生産および細胞傷害性)、およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化を含む。本発明の1つの態様では、免疫応答はT細胞媒介型である。本発明の別の態様では、免疫応答はB細胞媒介型である。免疫応答と関連して本明細書で使用する用語「ダウンレギュレーション」は、任意の1もしくは複数の免疫応答、好ましくはT細胞応答における減損を含むが、免疫応答と関連して用語「アップレギュレーション」は、任意の1もしくは複数の免疫応答、好ましくはT細胞応答における上昇を含む。1つのタイプの免疫応答のアップレギュレーションは、別のタイプの免疫応答において対応するダウンレギュレーションを導く可能性がある。例えば特定のサイトカイン(例えばIL−10)の生産のアップレギュレーションは、細胞性免疫応答のダウンレギュレーションを導く可能性がある。
本明細書で使用する用語「Tヘルパー1型応答」は、IFN−γ、IL−2、TNFおよびリンホトキシン(LT)、およびTh2細胞よりむしろTh1細胞により優先的に、または排他的に生産される他のサイトカインから選択される1もしくは複数のサイトカインの生産により特徴つけられる応答を称する。
本明細書で使用する用語「Tヘルパー2型応答」(Th2応答)は、IL−4、IL−5、IL−6およびIL−10から選択される1もしくは複数のサイトカインの生産を特徴とし、かつTh2細胞により提供される効率的なB細胞の「援助(help)」(例えば高められたIgG1および/もしくはIgE生産)を特徴とするCD4T細胞による応答を称する。
本明細書で使用する用語「Th2系譜コミットメントを増す作用物質での処置から利益を得る障害」とは、T−bet活性が異常であるか、またはT−bet活性の調節から利益を得る障害を含む。作用物質はTh2系譜への発生を直接的に、または間接的に増すことができる。
本明細書で使用する用語「接触させること」(すなわち細胞、たとえば1個の細胞を化合物と接触させること)という用語は、化合物および細胞をin vitroで一緒にインキュベーションすること(例えば化合物を培養物中の細胞に添加すること)、ならびに化合物および個体の細胞がin vivoで接触するように個体に化合物を投与することを含む。「接触させること」という用語は個体中に天然に存在しうるT−bet調節物質への細胞の曝露(すなわち天然の生理学的過程の結果として起こりうる曝露)を含まない。
添付する実施例に記載するように、T−betはTh1およびTh2サイトカインの生産を調節する。加えてT−betが阻害される場合(例えばT−bet欠損細胞において)、これはTh2系譜コミットメントの増加をもたらす。1つの態様では、T−bet活性はT−bet−標的分子またはT−betと結合パートナー例えばGATA3およびTecキナーゼとの複合体との会合のような直接的活性である。本明細書で使用する用語「標的分子」または「結合パートナー」は、T−betが自然に結合または相互作用し、そしてその相互作用が生物学的応答を生じる分子である。標的分子はタンパク質または核酸分子であることができる。本発明の例示的標的分子には、T−betタンパク質と同じシグナリング経路中のタンパク質、例えば上流(活性の刺激物質および阻害物質の両方を含む)、または例えばT細胞系譜コミットメントの調節、サイトカイン生産の調節、TGF−β媒介型シグナリングの調節、Jak1/STAT−1経路の調節、IgGクラススイッチングの調節、Bリンパ球機能の調節、および自己免疫疾患の調節に関与する経路におけるT−betタンパク質の下流で機能することができるタンパク質を含む。T−bet標的分子の例には、T−betが相互作用して遺伝子の転写を調節するチロシンキナーゼ、例えばITKまたはRlkのようなTecキナーゼまたはDNA配列を含む。
本明細書で使用する用語「その転写がT−betにより調節される遺伝子」には、T−betにより調節される制御領域を有する遺伝子を含む。そのような遺伝子はT−betにより正もしくは負に調節される可能性がある。この用語は、T−betにより間接的に調節される、すなわちT−betが関与するシグナリング経路の活性化の結果として調節される遺伝子も包含する。T−betにより調節される例示的遺伝子は例えばGATA3、およびサイトカイン遺伝子、例えばIL−2、IFN−γ、IL−4、IL−5、TNFα、TGF−β、LT(リンホトキシン)およびIL−10を含む。
本明細書で使用する用語「Th1−関連サイトカイン」とは、Th2細胞というよりはむしろTh1細胞により優先的または専ら生産されるサイトカインを指すものとする。Th1−関連サイトカインの例には、IFN−γ、IL−2、TNFおよびリンホトキシン(LT)を含む。
本明細書で使用する用語「Th2−関連サイトカイン」とは、Th1細胞というよりはむしろTh2細胞により優先的または排他的に生産されるサイトカインを指すものとする。Th1−関連サイトカインの例には、IL−4、IL−5およびIL−10を含む。
本明細書で使用する用語「相互作用」とは、例えば酵母2ハイブリッドアッセイもしくは同時免疫沈降を使用して検出できるような分子間の検出可能な相互作用を含むことを意味する。また相互作用するという用語は、分子間の「結合」相互作用も含む。相互作用は自然なタンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸でよい。
「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語は、本発明の方法もしくはアッセイで使用されるか、または組成物中に存在する試薬もしくは試験作用物質を含む。「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語は、T−bet発現もしくは活性の調節物質として以前に同定もしくは認識されていない化合物を含む。1つの態様では、1種以上の化合物、例えば複数の化合物を、T−betまたはシグナル伝達経路中のT−betの上流もしくは下流で作用する分子の発現および/もしくは活性を調節するそれらの能力についてのスクリーニングアッセイで同時に試験し得る。「試験化合物のライブラリー」という用語は多数の試験化合物を含んでなる一団を指す。
1つの態様において、「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語はサイトカインのような自然に存在する化合物を除外する。別の態様において、作用物質という用語は自然に存在するサイトカインに結合する抗体を除外する。別の態様において、「作用物質」という用語はサイトカイン受容体に結合する抗体を除外する。さらに別の態様において、「作用物質」という用語はT細胞受容体を介してシグナルを伝達する作用物質、例えばT細胞受容体複合体の成分に対するMHC分子もしくは抗体の情況における抗原を除外する。1つの態様では、作用物質もしくは試験化合物は、T−betと直接相互作用するか、もしくはT−betが相互作用する分子と直接相互作用する化合物(例えばT−betとT−bet標的分子との間の相互作用を阻害もしくは刺激する化合物、例えばDNAもしくは他のタンパク質)である。別の態様において、化合物は例えばT−betが関与するシグナル伝達経路中でT−betの上流もしくは下流にある分子の活性を調節することによりT−bet発現および/もしくは活性を間接的に調節するものである。そのような化合物は下に詳細に記述するように、そのような化合物を選択するスクリーニングアッセイを使用して同定可能である。
「低分子」という用語は当該技術分野の1用語であり、かつ約1000分子量未満もしくは約500分子量未満である分子を含む。1つの態様において、低分子はペプチド結合を排他的に含むわけではない。別の態様において、低分子はオリゴマーでない。活性についてスクリーニング可能な例示的低分子化合物には、限定するわけではないがペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、低有機分子(例えばポリケチド)(Cane et al.1998.Science 282:63)および天然産物抽出物ライブラリーを挙げることができる。さらなる態様において、低分子は生合成的でない。
本明細書で使用する用語「試験化合物」は、T−bet活性および/または発現の調節物質、および/または細胞増殖、生存、分化および/または運動の調節物質とこれまでに同定されたことがないか、または認識されるべき化合物を含む。
用語「試験化合物のライブラリー」は、複数の試験化合物を含んでなる一団を指すものとする。
本明細書で使用する用語「工作された」(工作された細胞でのような)は、T−betタンパク質をコードする核酸分子が導入された細胞を指す。
本明細書で使用する用語「レポーター遺伝子」という用語は検出可能な遺伝子産物、例えばRNAもしくはタンパク質を発現する任意の遺伝子を指す。好適なレポーター遺伝子は容易に検出可能であるものである。またレポーター遺伝子は、所望の転写制御配列を含む、または他の所望の特性を表す遺伝子との融合遺伝子の形態の構築物中に包含されてもよい。レポーター遺伝子の例は、限定するわけではないがCAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)(Alton and Vapnek(1979)、Nature 282:864−869)ルシフェラーゼ、ならびにベータ−ガラクトシダーゼ;ホタルルシフェラーゼ(deWet et al.,(1987)、Mol.Cell.Biol.7:725−737);細菌のルシフェラーゼ(Engebrecht and Silverman(1984)、PNAS 1:4154−4158;Baldwinら(1984)、Biochemistry 23:3663−3667);アルカリホスファターゼ(Tohら(1989)Eur.J.Biochem.182:231−238、Hallら(1983)J.Mol.Appl.Gen.2:101)、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ(Cullen and Malim(1992)Methods in Enzymol.216:362−368)、および緑色蛍光タンパク質(米国特許第5,491,084号明細書;国際公開第96/23898号パンフレット)のような他の酵素検出系を挙げることができる。
本明細書で使用する用語「T−bet−応答要素」とは、T−betの活性により直接的または間接的に調節されるDNA配列を指す(これにより例えばレポーター遺伝子の転写を介してT−betの活性を監視することができる)。
本明細書で使用する用語「T−betが欠損の細胞」という用語は、T−betが自然に欠損である個体の細胞、ならびに非ヒトT−bet欠損動物、例えばそれらがT−betが欠損であるような変えられたマウスの細胞を含むことを意図している。また「T−betが欠損の細胞」という用語はin vitroで培養される非ヒトのT−bet欠損動物もしくは個体から単離された細胞も包含することを意図している。
本明細書で使用する用語「無細胞組成物」は、無欠の細胞を含有しない単離された組成物を指す。無細胞組成物の例には、細胞抽出物および単離されたタンパク質を含有する組成物を含む。
本明細書で使用する用語「指標組成物」という用語は目的のタンパク質(例えばT−bet)を含む組成物、例えばタンパク質を自然に発現する細胞、タンパク質をコードする発現ベクターを細胞中に導入することによりタンパク質を発現するよう工作された細胞、または該タンパク質を含有する無細胞組成物(例えば精製された天然に生じるタンパク質もしくは組換え的に工作されたタンパク質)を指す。
本明細書で使用する用語「T−betの調節物質」という用語は、T−betの発現、プロセシング、翻訳後修飾もしくは活性の調節物質を包含する。この用語は、T−bet遺伝子の転写、T−bet mRNAのプロセシング、T−bet mRNAの翻訳、T−betタンパク質の翻訳後修飾(例えばグリコシル化、ユビキチン化もしくはリン酸化)またはT−betタンパク質の活性を調節する作用物質、例えば化合物(1もしくは複数)を含む。「T−bet活性の調節物質」はT−bet活性を直接もしくは間接的に調節する化合物を包含する。例えば、T−bet活性の間接的調節物質はT−betを含むシグナル伝達経路を調節することができる。T−bet活性を直接調節する調節物質の例は、T−bet mRNAもしくはゲノムDNAに結合するアンチセンス核酸分子、T−betに細胞内で結合しかつT−bet活性を調節(すなわち阻害)する細胞内抗体、標的分子とT−betの相互作用を阻害するT−betペプチド、および細胞中でのT−bet活性の増大された発現を可能とするT−betをコードする発現ベクター、ドミナントネガティブの形態のT−bet、T−betの活性を特異的に調節するよう作用する化合物、ならびにチロシン残基525(Y525)でリン酸化するTecキナーゼであるItkを(例えばチロシンはT−betをリン酸化する)包含する。
本明細書で使用するT−betタンパク質の「アゴニスト」は、自然に存在する形態のT−betタンパク質の生物学的活性と同じ生物学的活性もしくはその1サブセットを実質的保持し得る。T−betタンパク質の「アンタゴニスト」は、例えばT−betタンパク質の細胞活性を競合的に調節することにより自然に存在する形態のT−betタンパク質活性の1種もしくはそれ以上を阻害することができる。
本明細書で互換的に使用されるように、「T−bet活性」、「T−betの生物学的活性」または「T−betの機能的活性」には、標準的な技術に従いin vivoもしくはin vitroで測定されるようなT−betタンパク質がT−bet応答細胞もしくは組織(例えばT細胞、樹状細胞、NK細胞)、またはT−bet標的分子(例えば核酸分子もしくはタンパク質標的分子)に発揮する活性を含む。1つの態様では、T−bet活性はT−bet−標的分子との会合のような直接的活性である。あるいはT−bet活性は、T−betタンパク質とT−bet標的分子との相互作用に媒介される下流の生物学的な出来事のような間接的活性である。T−betの生物学的活性は本明細書に記載され、そして限定するわけではないが:調節、例えばTh2細胞系譜コミットメントの減少、先天的および適応免疫系の細胞でのIFN−γ生産の調節、サイトカイン生産の調節、TGF−β媒介型シグナリングの調節、Jak1/STAT−1経路の調節、IgGクラススイッチングの調節、Bリンパ球機能の調節、およびT−betの調節から利益を得る障害、例えば自己免疫疾患、多発性硬化症または慢性関節リウマチ、例えばウイルスもしくは細菌の感染、喘息およびTh1もしくはTh2サイトカインがかかわる他の障害もしくは望ましくない状態、例えば炎症の調節を含む。これらの知見は薬剤標的および種々の疾患、障害もしくは状態における治療的介入としてのT−bet(およびT−betが関与する経路の他の分子)の使用を提供する。さらに本発明は、ワクチンのようなT−bet活性を調節する作用物質を含んでなる免疫調節組成物を提供する。
本明細書で使用する用語「シグナル伝達経路」は、細胞が細胞外の影響すなわちシグナル(例えばサイトカイン受容体もしくは抗原受容体のような細胞の表面上の受容体により
伝達されるシグナル)を細胞応答(例えば遺伝子転写の調節)に転換する手段を含む。例示的シグナル伝達経路は、JAK1/STAT−1経路(Leonard,W.2001.Int.J.Hematol.73:271)およびTGF−β経路(AttisanoとWrana.2002.Science.296:1646)を含む。「T−betがかかわるシグナル伝達経路」は、T−betがシグナルを伝達する1シグナル伝達分子であるものである。
本明細書で使用する用語「Tecキナーゼ」とは、チロシンキナーゼ(ホスホチロシンキナーゼ(PTK))のファミリーを指す。Srcファミリーのキナーゼと構造は類似するが、TecキナーゼはC−末端の調節チロシンおよびSrcファミリーの特徴であるN−末端ミリストイル化シグナルを欠いている。代わりにTecキナーゼはSH3ドメインのすぐ上流にプロリン−リッチ領域を有する。このようにTecキナーゼは、NH2−末端ホスファチジルイノシトールホスフェート結合プレクストリン相同ドメイン、(PH)ドメイン(Txkが不存在)、続いてプロリンリッチ領域、Src−相同3(SH3)およびSH2相互作用ドイメン、そしてCOOH−末端および触媒ドメイン(PTKまたはSH1ドメイン、すなわち配列番号14のアミノ酸残基355〜615)を特徴とする。TecキナーゼはT細胞中で発現され、そしてサイトカイン受容体、抗原受容体およびT細胞のT細胞抗原受容体媒介型の活性化のような他のリンパ系細胞表面受容体から放出されるシグナルに関与する(M.J.Czar,et al.(2001)Biochem.Soc.Trans.29:863−867)。
Tecファミリーのタンパク質チロシンキナーゼは、TCR、BCRおよびFcε受容体のような抗原受容体を介するシグナリングにおいて重要な役割を演じている。チロシンキナーゼのTecキナーゼファミリーのメンバーは例えばTec、Btk、Itk、RlkおよびBmxを含む。ヒトTecのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばGenBank寄託番号gi:4507428およびgi:4507429(配列番号5および6)に記載されている。マウスTecのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばGenBank寄託番号gi:24475948およびgi:7305569(配列番号7および8)に記載されている。ヒトITKのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばGenBank寄託番号gi:21614549およびgi:15718680(配列番号13および14)に記載されている。マウスItkのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばGenBank寄託番号gi:6754385およびgi:6754386(配列番号15および16)に記載されている。ヒトRLKのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばGenBank寄託番号gi:4507742およびgi:4507743(配列番号18および19)に記載されている。マウスRLkのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばGenBank寄託番号gi:7305600よびgi:7305601(配列番号15および16)に記載されている。
「GATA3」はTh2細胞の発生に必要なTh2特異的転写因子である。GATA−結合タンパク質は、コンセンサスWGATAR(W=AまたはTそしてR=AまたはG)と確認される標的部位を認識する転写因子のファミリーを構成する。ヒトGATA3のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばGenBank寄託番号gi:4503928、gi:50541957およびgi:4503929(配列番号9、10および17)に記載されている。マウスGATA3のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばGenBank寄託番号gi:40254638およびgi:6679951(配列番号11および12)に記載されている。特異的なDNA結合部位の認識(アミノ酸303〜348)およびトランス活性化(アミノ酸30〜74)の原因となるGATA3のドメインが同定された。ヒトGATA−3の核局在化に関するシグナリング配列は、タンパク質のアミノ酸フィンガー(アミノ酸249〜311)内およびその周りの配列により付与された特性である。転写がGATA3により調節される遺伝子の例には、IL−5、IL−12、IL−13およびIL−12Rβ2を含む。
本発明の多様な観点を以下の小区分でさらに詳細に記述する:
I.単離された核酸分子
本発明の1つの観点はT−betをコードする単離された核酸分子に関する。そのような分子は、本方法に使用するための例えばT−betポリペプチドまたはその部分を作成するために使用することができる。好適な態様において、本発明の核酸分子は配列番号1もしくは配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、本発明の核酸分子は配列番号1の最低約700の連続するヌクレオチドもしくは配列番号3の最低約500の連続するヌクレオチドを含んでなる。好適な態様において、本発明の核酸分子は配列番号1の少なくとも約800、少なくとも約1000、少なくとも約1200、少なくとも約1400もしくは少なくとも約1600の連続するヌクレオチドを含んでなる。別の好適な態様において、本発明の核酸分子は配列番号3の少なくとも約600、少なくとも約800、少なくとも約1000、少なくとも約1200もしくは少なくとも約1400の連続するヌクレオチドを含んでなる。
他の態様において、核酸分子は:配列番号1の少なくとも約700、少なくとも約800、少なくとも約1000、少なくとも約1200、少なくとも約1400もしくは少なくとも約1600の連続するヌクレオチドを含んでなる核酸分子と少なくとも70%の同一性、より好ましくは80%の同一性、そしてさらにより好ましくは90%の同一性を有する。他の態様において、核酸分子は:配列番号3の少なくとも約600、少なくとも約800、少なくとも約1000、少なくとも約1200もしくは少なくとも約1400の連続するヌクレオチドを含んでなる核酸分子と少なくとも70%の同一性、より好ましくは80%の同一性、そしてさらにより好ましくは90%のヌクレオチド同一性を有する。
遺伝暗号の縮重により配列番号1もしくは3と異なり、かつ従って配列番号1および3によりコードされるものと同一のT−betタンパク質をコードする核酸分子が本発明に含まれる。従って、別の態様では、本発明の単離された核酸分子は配列番号2もしくは配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
加えて、T−betタンパク質をコードする核酸分子は標準的な分子生物学技術および本明細書に提供される配列情報を使用して他の供給源から単離され得る。例えば、T−bet DNAは、ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号1もしくは3の全部もしくは部分、および標準的ハイブリダイゼーション技術(例えばSambrook,J.らモレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989に記述される)を使用してヒトゲノムDNAライブラリーから単離することができる。さらにT−bet遺伝子の全部もしくは一部分を包含する核酸分子は配列番号1もしくは3の配列に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により単離し得る。例えば、mRNAを(例えばChirgwinら(1979)Biochemistry 18:5294−5299のチオシアン酸グアニジウム抽出手順により)細胞から単離し得、そして逆転写酵素(例えばギブコ/BRL(Gibco/BRL)、メリーランド州ベセスダから入手可能なモロニーMLV逆転写酵素;もしくはセイカガクアメリカインク(Seikagaku America,Inc.)、フロリダ州セントピーターズバーグから入手可能なAMV逆転写酵素)を使用してcDNAを調製し得る。PCR増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号1もしくは3に示されるヌクレオチド配列に基づき設計が可能である。本発明の核酸は標準的PCR増幅技術に従い、鋳型としてのcDNAあるいはゲノムDNAおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し得る。そのように増幅した核酸を適切なベクターにクローン化し、そしてDNA配列分析により特徴づけが可能である。さらに、T−betヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは例えば自動DNA合成装置を使用する標準的合成技術により製造し得る。
配列番号1および3に示されるT−betヌクレオチド配列に加え、T−betのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の小さな変化につながるDNA配列多形が集団内に存在しうることが当業者により認識されるであろう。T−bet遺伝子中のこうした遺伝子多形は自然な対立遺伝子変異により集団内の個体間で存在しうる。こうした自然の対立遺伝子変異は典型的には1遺伝子のヌクレオチド配列中の1〜2%の変化をもたらし得る。自然の対立遺伝子変異の結果でありかつT−betの機能的活性を変えないT−bet中のいかなるそして全部のこうしたヌクレオチド変異および生じるアミノ酸の多形も、本発明の範囲内にあることを意図している。
本発明のT−bet DNAの自然な対立遺伝子バリアントに対応する核酸分子は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標準的ハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとしてヒトDNAもしくはその一部分を使用して本明細書に開示されるT−bet核酸分子に対するそれらの相同性に基づき単離が可能である。例示的な高ストリンジェンシー条件は、約45℃の温度で数時間ないし一夜の6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中でのハイブリダイゼーション、次いで約50〜65℃の温度での0.2×SSC、0.1%SDSを含有する洗浄緩衝液中での1回もしくは複数回の洗浄を含む。従って、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号1もしくは3のヌクレオチド配列を含んでなる第二の核酸分子に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。好ましくは、配列番号1もしくは3の配列番号の配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子。1つの態様では、こうした核酸分子は長さが少なくとも約700、800、900、1000、1200、1300、1400、1500もしくは1600ヌクレオチドである。別の態様では、こうした核酸分子は配列番号1の少なくとも約700、800、900、1000、1200、1300、1400、1500もしくは1600の連続するヌクレオチド、または配列番号3の少なくとも約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400もしくは1500の連続するヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、単離された核酸分子はT−bet核酸分子の自然に生じる対立遺伝子バリアントに対応する。
集団中に存在しうるT−bet配列の自然に生じる対立遺伝子バリアントに加え、当業者は、配列番号1もしくは3のヌクレオチド配列中に突然変異により小さな変化を導入してそれによりT−betタンパク質の機能的活性を変えることなくコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることをさらに認識するであろう。例えば、「非必須の」アミノ酸残基のアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を配列番号1もしくは3の配列中に作成することができる。1個の「非必須の」アミノ酸残基はDNAと相互作用するその能力もしくはIFN−γプロモーターからの転写を高めるその能力のようなT−betの機能的活性を変えることなくT−betの野性型配列(例えば配列番号1もしくは3の配列)から変えることができる残基である一方、「必須の」アミノ酸残基は機能的活性に必要とされる。
従って本発明の別の観点は、T−bet活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含有するT−betタンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなT−betタンパク質は配列番号2もしくは4とアミノ酸配列が異なるがそれでもなおT−bet活性を保持する。T−betタンパク質の非天然のバリアントをコードする単離された核酸分子は、コードされるタンパク質に1もしくは複数のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失が導入さ
れるような配列番号1もしくは3のヌクレオチド配列中に1もしくは複数のヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失を導入することにより創製することができる。突然変異は部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介性突然変異誘発のような標準的技術により配列番号1もしくは3に導入可能である。好ましくは、保存的アミノ酸置換を1もしくは複数の非必須アミノ酸残基で行う。「保存的アミノ酸置換」はアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるものである。塩基性側鎖(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分枝状側鎖(例えばトレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義されている。従って、T−bet中の非必須なアミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換える。
あるいは別の態様では、突然変異は飽和突然変異誘発によるようにT−betのコーディング配列の全部もしくは一部に沿って無作為に導入可能であり、そして結果として生じる変異体は、DNAに結合するおよび/もしくは転写を活性化するそれらの能力についてスクリーニングして機能的活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後に、コードされるT−bet変異体タンパク質を宿主細胞中で組換え的に発現させることができ、そしてT−bet活性を評価するための当該技術分野で利用可能なアッセイを使用して(例えばDNA中に存在するTボックス結合配列に結合する該タンパク質の能力を測定することにより、またはT細胞のTh1もしくはTh2表現型を調節する該タンパク質の能力を測定することにより突然変異体タンパク質の機能的活性を測定し得る。
本発明の別の観点はT−bet mRNAもしくは遺伝子のコーディング鎖に対しアンチセンスである単離された核酸分子に関する。本発明のアンチセンス核酸はT−betコーディング鎖全体もしくはその一部分のみに相補的であり得る。1つの態様では、アンチセンス核酸分子はタンパク質のT−betファミリーに独特であるかもしくは特定の種からのT−bet配列に独特であるT−betをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖のコーディング領域に対しアンチセンスである。別の態様において、アンチセンス核酸分子はタンパク質のT−betファミリーに独特であるかもしくは特定の種からのT−bet配列に独特であるT−betをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コーディング領域に対しアンチセンスである。好適な態様では、本発明のアンチセンス分子は配列番号1の非コーディング鎖の少なくとも約700の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列番号1の非コーディング鎖の少なくとも800、1000、1200、1400もしくは1600の連続するヌクレオチド、または配列番号3の非コーディング鎖の少なくとも約500の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列番号3の非コーディング鎖の少なくとも600、800、1000、1200もしくは1400の連続するヌクレオチドを含んでなる。
本明細書に開示されるT−betをコードするコーディング鎖配列(例えば配列番号1および3が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸はワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って設計が可能である。アンチセンス核酸分子はT−bet mRNAのコーディング領域全体に相補的であってよく、あるいはT−bet mRNAのコーディングもしくは非コーディング領域の一部分のみに対しアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであることができる。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、T−bet mRNAの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的である可能性がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば長さが約15、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45もしくは50ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は当該技術分野で
既知の手順を使用した化学合成および酵素的連結反応を使用して構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、自然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大させるかもしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるよう設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的合成が可能であり、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用可能である。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンスの向きでサブクローニングした発現ベクターを使用して生物学的に製造し得る(すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは、以下の小区分にさらに記述される目的の標的核酸に対しアンチセンスの向きのものであることができる)。
別の態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するmRNAのような一本鎖核酸を切断することが可能であるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒的RNA分子である。T−betをコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されるT−bet遺伝子のヌクレオチド配列に基づき設計し得る。例えば、活性部位の塩基配列がT−betをコードするmRNA中の切断されるべき塩基配列に相補的であるテトラヒメナ(Tetrahymena)のL−19 IVS RNAの誘導体を構築し得る。例えばCechら米国特許第4,987,071号明細書;およびCechら 米国特許第5,116,742号明細書を参照されたい。あるいは、T−bet mRNAを使用してRNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的RNAを選択し得る。例えばBartel,D.and Szostak,J.W.(1993)Science261:1411−1418を参照されたい。
別の態様では、RNAiを使用してT−bet発現を阻害することができる。RNA干渉(RNAi)は二本鎖RNA(dsRNA)を使用してdsRNAと同一の配列を含有するメッセンジャーRNA(mRNA)を分解する転写後の標的を定められた遺伝子サイレンシング技術である(Sharp,P.A.and Zamore,P.D.287、2431−2432(2000);Zamore,P.D.et al.,Cell 101、25−33(2000)。Tuschl,T.et al.,Genes Dev.13、3191−3197(1999))。このプロセスは、内因性リボヌクレアーゼがより長いdsRNAを低分子干渉RNAすなわちsiRNAと命名されるより短い21もしくは22ヌクレオチド長のRNAに切断する場合に起こる。このより小さいRNAセグメントがその後標的mRNAの分解を媒介する。
RNAiのアンチセンスRNA鎖は、T−betのコーディング領域の少なくとも一部分またはT−bet遺伝子の5’もしくは3’非翻訳領域の少なくとも一部分に対しアンチセンスであり得る。1つの態様において、siRNA二重鎖は2ntの3’オーバーハングを有するための様式で対にされた21ntのセンスおよび21ntのアンチセンス鎖から構成される。1つの態様ではオーバーハング中にTTを伴うsiRNA配列。標的領域は例えば開始コドンの50ないし100nt下流であり得、3’−UTRもまた標的とされうる。1つの態様において、23ntの配列モチーフAA(N19)TT(N、任意のヌクレオチド)を探索し、そして約30〜70%の間のG/C含量を伴うヒットを選択し得る。適する配列が見出されない場合は、モチーフNA(N21)を使用して検索を拡大する。siRNAは好ましくは適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび通例のDNA/RNA合成装置を使用して化学的に合成する。siRNAは例えばダーマコン(Dharmacon)、ゼラゴンインク社(Xeragon Inc)、プロリゴ(Proligo)およびアムビオン(Ambion)から商業的に入手可能である。1つの態様において、アンチセンスRNAでの使用について上述された化学の1もしくは複数を使用することができる。
本発明のさらに別の観点は、T−bet融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。非T−betタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列に操作可能に連結されたT−betタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする少なくとも1種の第一のヌクレオチド配列を含んでなるこうした核酸分子が、標準的組換えDNA技術により製造可能である。T−bet融合タンパク質は下の小区分IIIにさらに詳細に記述する。
II.組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の観点は、T−bet(もしくはその一部分)をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは組換え発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは宿主細胞中での核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含んでなり、これは組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に操作可能に連結されている発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された1もしくは複数の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「操作可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が(例えばin vitro転写/翻訳系でもしくはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞中で)、ヌクレオチド配列の発現を可能とする様式で制御配列(1もしくは複数)に連結されることを意味することを意図している。「制御配列」という用語はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節領域(例えばポリアデニル化シグナル)を包含する。そのような制御配列は例えばGoeddel;Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185、アカデミックプレス(Academic Press)、カリフォルニア州サンディエゴ(1990)に記載されている。制御配列は、多くの型の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、およびある宿主細胞中でのみ該ヌクレオチド配列の発現を指図するもの(例えば組織特異的制御配列)を含む。発現ベクターの設計は形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル等のような因子に依存しうることが当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入し、それにより本明細書に記述される核酸によりコードされる融合タンパク質もしくはペプチド(例えばT−betタンパク質、突然変異体の形態のT−betタンパク質、T−bet融合タンパク質など)を含むタンパク質またはペプチドを生産することができる。
本発明の組換え発現ベクターは原核生物もしくは真核生物細胞中でのT−betタンパク質の発現のために設計することができる。例えば、T−betは大腸菌(E.coli)のような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用する)、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞中で発現させることができる。適切な宿主細胞はGoeddel、Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185、アカデミックプレス(Academic Press)、カリフォルニア州サンディエゴ(1990)にさらに論考されている。あるいは、組換え発現ベクターは例えばT7プロモーター制御配列およびT7ポリメラーゼを使用してin vitroで転写し、そして翻訳してもよい。
原核生物中でのタンパク質の発現は、融合もしくは非融合いずれかのタンパク質の発現を指図する構成的もしくは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌(E.coli)中で最も多く行われる。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、通常は該組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは1もしくは複数の目的すなわち:1)組換えタンパク質の発現を増大させる;2)組換えタンパク質の溶解性を増大させる;3)アフィニティ精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助する;4)タンパク質の検出および/もしくは精製を補助するためのエピトープ標識を提供する;かつ/または5)タンパク質の検出を補助するためのマーカー(例えばβ−ガラクトシダーゼ融合物を使用する色マーカー)を提供する、にかなう可能性がある。しばしば、融合発現ベクターにおいてタンパク質分解性切断部位が融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入され、融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。そのような酵素およびそれらのコグネイト認識配列は、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質もしくはプロテインAをそれぞれ融合するpGEX(ファルマシアバイオテック社(Pharmacia Biotech Inc.);Smith,D.B.and Johnson,K.S.(1988)Gene 67:31−40)、pMAL(ニューイングランドバイオラブス(New England Biolabs)、マサチューセッツ州ビバリー)およびpRIT5(ファルマシア(Pharmacia)、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を含む。また組換えタンパク質は、上で検討されたもの同じ目的に融合タンパク質として真核生物細胞中でも発現させることができる。
適切な誘導性の非融合大腸菌(E.coli)発現ベクターの例には、pTrc(Amann et al.,(1988)Gene 69:301−315)およびpET 11d(Studier et al.,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185、アカデミック プレス(Academic Press)、カリフォルニア州サンディエゴ(1990)60−89)を含む。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp−lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼの転写に依存する。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されるウイルスRNAポリメラーゼ(T7 gnl)により媒介されるT7 gn10−lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスのポリメラーゼはlacUV 5プロモーターの転写制御下にT7 gnl遺伝子をもつ常在性λプロファージから宿主株BL21(DE3)もしくはHMS174(DE3)により供給される。
大腸菌(E.coli)中での組換えタンパク質発現を最大にする1つの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する損なわれた能力をもつ宿主細菌中で該タンパク質を発現することである(Gottesman,S.,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185、アカデミックプレス(Academic Press)、カリフォルニア州サンディエゴ(1990)119−128)。別の方法は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌(E.coli)で優先的に利用されるものとなるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである(Wada et al.,(1992)Nuc.Acids Res.20:2111−2118)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的DNA合成技術により実施可能である。
別の態様において、T−bet発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母、ビール酵母菌(S.cerevisae)中での発現のためのベクターの例には、pYepSec1(Baldari et al.,(1987)EMBO J.6:229−234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz、(1982)Cell 30:933−943)、pJRY88(Schultz et al.,(1987)Gene 54:113−123)およびpYES2(インビトロジェンコーポレーション(Invitrogen Corporation)、カリフォルニア州サンディエゴ)を含む。
あるいは、T−betはバキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現させることができる。培養された昆虫細胞(例えばSf9細胞)中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、pAc系列(Smith et al.,(1983)Mol.Cell Biol.3:2156−2165)およびpVL系列(Lucklow,V.A.and Summers,M.D.,(1989)Virology 170:31−39)を含む。
さらに別の態様では、本発明の核酸は哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、pMex−NeoI、pCDM8(Seed,B.,(1987)Nature 329:840)およびpMT2PC(Kaufman et al.,(1987)、EMBO J.6:187−195)を含む。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの調節要素により提供される。例えば、通常に使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびSV40由来である。
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指図することが可能である(例えば核酸を発現させために組織特異的調節要素を使用する)。組織特異的調節要素は当該技術分野で既知である。適する組織特異的プロモーターの非限定的例には、リンパ組織特異的プロモーター(Calame and Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235−275)、とりわけT細胞受容体(Winoto and Baltimore(1989)EMBO J.8:729−733)および免疫グロブリン(Banerji et al.,(1983)Cell 33:729−740;Queen and Baltimore(1983)Cell 33:741−748)のプロモーター、アルブミンプロモーター(肝特異的;Pinkert et al.,(1987)Genes Dev.1:268−277)、ニューロン特異的プロモーター(例えば神経細糸プロモーター;Byrne and Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473−5477)、膵特異的プロモーター(Edlundら(1985)Science 230:912−916)ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば乳ホエイプロモーター;米国特許第4,873,316号明細書および欧州特許出願公開第264,166号明細書)を含N。発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスhoxプロモーター(Kessel and Gruss(1990)Science 249:374−379)およびα−フェトプロテインプロモーター(CampesとTilghman(1989)Genes Dev.3:537−546)もまた包含される。
さらに、哺乳動物細胞中で使用するための誘導性の調節系、例えば遺伝子発現が重金属イオン(例えばMayo et al.,(1982)Cell 29:99−108;Brinster et al.,(1982)Nature 296:39−42;Searle et al.,(1985)Mol.Cell Biol.5:1480−1489を参照されたい)、熱ショック(例えばNouer et al.,(1991)Heat Shock Response、Nouer,L.編、CRC、フロリダ州ボカレイトン中、pp167−220を参照されたい)、ホルモン(例えばLee et al.,(1981)Nature 294:228−232;Hynes et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2038−2042;Klock et al.,(1987)Nature 329:734−736;Israel and Kaufman(1989)Nucl.Acids.Res.17:2589−2604;およびPCT国際公開第O 93/23431号パンフレットを参照されたい)、FK−506関連分子(例えばPCT国際公開第O 94/18317号パンフレットを参照されたい)、もしくはテトラサイクリン(Gossen,M.and Bujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547−5551;Gossen,M.et al.,(1995)Science 268:1766−1769;PCT国際公開第94/29442号パンフレット;およびPCT国際公開第96/01313号パンフレットを参照されたい)により調節される系が当該技術分野で既知である。従って別の態様では、本発明はT−bet DNAが誘導性の真核生物プロモーターに操作可能に連結されてそれにより真核生物細胞中でのT−betタンパク質の誘導性発現を可能にする組換え発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、発現ベクターにアンチセンスの向きでクローン化された本発明のDNA分子を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。すなわち、DNA分子はT−bet
mRNAに対しアンチセンスであるRNA分子の(DNA分子の転写による)発現を可能とする様式で制御配列に操作可能に連結される。多様な細胞型でのアンチセンスRNA分子の継続的発現を指図する、アンチセンス方向でクローン化された核酸に操作可能に連結された制御配列を選ぶことができ、例えばアンチセンスRNAの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的発現を指図するウイルスプロモーターおよび/もしくはエンハンサーまたは制御配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、高効率の制御領域の制御下にアンチセンス核酸が生産される組換えプラスミド、ファジェミドもしくは弱毒化ウイルスの形態にあることができ、その活性はベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考についてはWeintraub,H.et al.,遺伝子分析用の分子ツールとしてのアンチセンスRNA(Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis)、Reviews−Trends in Genetics、Vol.1(1)1986を参照されたい。
本発明の別の観点は、本発明のベクター、好ましくは組換え発現ベクターが導入されている組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は任意の原核生物もしくは真核生物細胞でよい。例えば、T−betタンパク質は大腸菌(E.coli)のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母もしくは哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)もしくはCOS細胞のような)中で発現させることができる。他の適する宿主細胞が当業者に既知である。ベクターDNAは通常の形質転換もしくはトランスフェクション技術を介して原核生物もしくは真核生物細胞中に導入し得る。本明細書で使用される用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、DEAE−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔法を含め、宿主細胞中に外来核酸(例えばDNA)を導入するための多様な技術的に認識される技術を指すことを意図している。宿主細胞の適切な形質転換もしくはトランスフェクション方法は、Sambrook et al.(モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory press)(1989))および他の実験室手引き書に見出すことができる。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小部分のみがそれらのゲノム中に外来DNAを組込み得ることが既知である。これらの組込み体を同定かつ選択するために、選択可能なマーカー(例えば抗生物質に対する耐性)をコードする遺伝子を一般に目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーはG418、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような化合物に対する耐性を賦与するものを含む。選択可能なマーカーをコードする核酸は、T−betをコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入してよく、または別個のベクター上で導入してよい。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は化合物選択により同定可能である(例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組込んだ細胞は生き残ることができる一方、他の細胞は死ぬ)。
培養物中の原核生物もしくは真核生物宿主細胞のような本発明の宿主細胞を使用して、T−betタンパク質を生産(すなわち発現)させることができる。従って本発明はさら
に、本発明の宿主細胞を使用したT−betタンパク質の製造方法を提供する。1つの態様では、この方法は本発明の宿主細胞(T−betをコードする組換え発現ベクターが導入されている)をT−betが生産されるまで適する培地中で培養することを含んでなる。別の態様では、この方法は培地もしくは宿主細胞からT−betを単離することをさらに含んでなる。自然な形態で、T−betタンパク質は細胞内タンパク質であり、従って組換えT−betタンパク質は組換え宿主細胞中で細胞内で発現され得、そして次いで例えば宿主細胞を溶解すること、そしてライセートから組換えT−betタンパク質を回収することにより宿主細胞から単離することができる。あるいは、組換えT−betタンパク質はタンパク質が宿主細胞から分泌されるように、タンパク質のアミノ末端に異種シグナル配列を操作可能に連結することにより細胞外タンパク質として調製することができる。この場合、組換えT−betタンパク質は細胞を培養する培地基から回収可能である。
本発明のある宿主細胞は非ヒトトランスジェニック動物を作出するためにもまた使用可能である。例えば1つの態様において、本発明の宿主細胞は、T−betコーディング配列が導入されている受精卵母細胞もしくは胚幹細胞である。次いでそのような宿主細胞を使用して、外因性のT−bet配列がそれらのゲノム中に導入されている非ヒトトランスジェニック動物、もしくは内因性のT−bet配列が変えられている相同的組換え動物を作出し得る。こうした動物はT−betの機能および/または活性を研究するため、ならびにT−bet活性の調節物質を同定かつ/または評価するために有用である。従って本発明の別の観点は、T−betタンパク質もしくはT−betタンパク質の一部分をコードする導入遺伝子を運ぶ細胞を含有する非ヒトトランスジェニック動物に関する。本発明のトランスジェニック動物の一下位態様(subembodiment)において、導入遺伝子は内因性のT−betタンパク質をコードする内因性遺伝子を改変する(例えば、内因性のT−bet遺伝子が機能的に破壊もしくは「ノックアウト」されているか、または内因性のT−bet遺伝子のヌクレオチド配列が突然変異されているか、または内因性のT−bet遺伝子の転写制御領域が改変されている相同的組換え動物)。
本発明のトランスジェニック動物は、T−betをコードする核酸を例えば微小注入法により受精卵母細胞の雄性前核中に導入すること、そしてこの卵母細胞を偽妊娠の雌性育成動物中で発生させることにより作出し得る。配列番号1もしくは3のT−betヌクレオチド配列を導入遺伝子として非ヒト動物のゲノム中に導入することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現の効率を増大させるために導入遺伝子ン中に包含し得る。組織特異的調節配列(1もしくは複数)をT−bet導入遺伝子に操作可能に連結してT−betタンパク質の発現を特定の細胞に向かわせることが可能である。胚操作および微小注入を介するトランスジェニック動物、とりわけマウスのような動物の作出方法は当該技術分野で常法となっており、そして例えば、双方ともLeder et al.,による米国特許第4,736,866号および同第4,870,009号明細書、Wagner et al.,による米国特許第4,873,191号明細書、ならびにHogan,B.、マウス胚の操作(Manipulating the Mouse Embryo)、(コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986)に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の作出で使用する。トランスジェニック創始体動物はそのゲノム中のT−bet導入遺伝子の存在および/または動物の組織もしくは細胞中でのT−bet mRNAの発現に基づき同定することができる。次いでトランスジェニック創始体動物を使用して導入遺伝子を運搬するさらなる動物を繁殖させることができる。さらに、T−betをコードする導入遺伝子を運搬するトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を運搬する他のトランスジェニック動物とさらに交配させることができる。
相同的組換え動物を作出するために、欠失、付加もしくは置換が導入され、それにより
内因性のT−bet遺伝子を改変する、例えば機能的に破壊する、T−bet遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを調製する。1つの態様では、相同的組換えに際して内因性のT−bet遺伝子が機能的に破壊される(すなわちもはや機能的タンパク質をコードしない;「ノックアウト」ベクターともまた称される)ように、相同的組換えベクターを設計する。あるいは相同的組換えに際して内因性のT−bet遺伝子が該T−bet遺伝子で置き換えるためにベクターを設計することができる。相同的組換えベクターにおいて、T−bet遺伝子の改変された部分は、その5’および3’端でT−bet遺伝子のさらなる核酸により隣接され、該ベクターにより運搬される外因性のT−bet遺伝子と胚幹細胞中の内因性のT−bet遺伝子との間で相同的組換えを起こさせる。さらなる隣接するT−bet核酸は内因性遺伝子との成功裏の相同的組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接DNA(5’および3’双方の端で)がベクター中に包含される(例えば、相同的組換えベクターの記載についてThomas,K.R.and Capecchi,M.R.(1987)Cell 51:503を参照されたい)。ベクターを(例えば電気穿孔法により)胚幹細胞系に導入し、そして導入されたT−bet遺伝子が内因性のT−bet遺伝子と相同的に組換わった細胞を選択する(例えばLi,E.et al.(1992)Cell 69:915を参照されたい)。次いで選択された細胞を動物(例えばマウス)の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成させる(例えば、Bradley,A.、奇形ガンおよび胚性幹細胞:実践的取り組み(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach)、E.J.Robertson編(IRL、オックスフォード、1987)中、pp.113−152を参照されたい)。次いでキメラ胚を適する偽妊娠雌性育成動物に埋植しかつ胚を分娩までもたらし得る。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたDNAをもつ子孫を使用して、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同的に組換えられたDNAを含有する動物を繁殖することができる。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Bradley,A.(1991)Current Opinion in Biotechnology 2:823−829ならびにLe Mouellec et al.による国際公開第90/11354号パンフレット;Smithies et al.による同第91/01140号パンフレット;Zijlstra et al.による同第92/0968号パンフレット;およびBerns et al.による同第93/04169号パンフレットにさらに記載されている。
前述に加え、当業者は相同的組換えのための当該技術分野で既知の他の取り組みが本発明に適用し得ることを認識するであろう。酵素支援型の部位特異的組込み系が当該技術分野で既知であり、そして第二の標的DNA分子中の予め決められた位置にDNA分子を組込むために応用可能である。こうした酵素支援型の組込み系の例は、Creリコンビナーゼ−lox標的系(例えばBaubonis,W.and Sauer,B.(1993)Nucl.Acids Res.21:2025−2029;およびFukushige,S.and Sauer,B.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7905−7909に記載されているような)、ならびにFLPリコンビナーゼ−FRT標的系(例えばDang,D.T.and Perrimon,N.(1992)Dev.Genet.13:367−375:およびFiering,S.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8469−8473に記載されているような)を含む。PCT公開第WO94/29442号パンフレットおよびPCT公開第WO96/01313号パンフレットに記載されるようなテトラサイクリン調節型の誘導性の相同的組換え系もまた使用し得る。
別の態様では、T−betが例えばCD4エンハンサーを使用して全T細胞中で発現されるトランスジェニック動物を作出し得る(Zheng,W−P.& Flavell,R.A.1997.Cell 89、587)。最近の研究は,CD2エンハンサーもま
た使用し得ることを示唆している。事実、それはT細胞中での高レベル発現を達成するためにさらに有力であり、発現は変動せず、しかも導入遺伝子発現はコピー数依存性である(Zhumabekov,T.et al.,1995.J.Immunol.Meth.185、133;Sharp,L.L.et al.,1997.Immunity 7,609)。T−bet RNAの高レベル発現を伴うマウス(導入遺伝子に駆動されるT−bet RNAを内因性のT−betと識別するためのプローブとしてヒト成長ホルモンイントロンを使用する)は、十分な数の創始体をスクリーニングすることにより同定可能である。
別の取り組みにおいて、ドミナントリプレッサー(dominant repressor)トランスジェニックを作出し得る。例えば、ドミナントリプレッサーのT−betは近位lckエンハンサーを使用することにより作成することができ(Alberola−Ila,J.ら1996 J.Exp.Med.184、9)、T−betおよびengrailedの融合の駆動を作成することができる(Taylor,D.,1996.Genes Dev.10,2732;Li,J.,Thurm,H.et al.1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:10885)。この構築物は多量体化したT−betレポーターのT−betトランス活性化を特異的に抑制し、しかもNFAT依存性のレポーターのトランス活性化に影響を及ぼさない。
あるいは、無発現変異をES細胞中での標的を定めた突然変異誘発により生成し得る(Ranger,A.M.et al.1998.Nature 392、186;Hodge,M.R.et al.1996.Immunity 4:1.、144;Grusby,M.J.et al.1991.Science 253、1417;Reimold,A.M.et al.,1996.Nature 379:262;Kaplan,M.H.、1996.Immunity:313;Kaplan,M.H.et al.1996.Nature 382、174;Smiley,S.T.et al. 1997.Science 275、977)。例えば当該技術分野で既知である技術を使用して、ゲノムT−betクローンをゲノムライブラリーから単離し、イントロン−エキソンの構成を描き、そして第一のエキソンおよび上流のプロモーター配列の450bpが欠失されているはずであるcre−loxベクター(下の検討を参照されたい)中のターゲッティング構築物を作成することができる。本構築物をES細胞系中に電気穿孔しそしてサザンブロット分析により二重化合物耐性(例えばネオマイシン、ガンシクロビル)クローンを同定することができる。次いでT−bet遺伝子座に相同的組換え事象をもつクローンを同定し、そして第3.5日のBALB/c妊娠マウスから得られた胚盤胞に注入することができる。次いでキメラマウスを作出することができ、そして野性型BALB/cマウスと交配して破壊されたT−bet遺伝子の生殖系列伝達を生成できる。
別の態様では、RAG−2欠損胚盤胞中への埋植(Chen,J.et al.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90、4528)もしくはcre−lox誘導性の欠失取り組みを使用して、免疫系中でのみT−betを欠いているマウスを発生させることができる。例えば、ターゲッティング構築物をcre−loxベクター中で作成し得る。胚盤胞補完系を使用してNFATc(胚の致死的表現型)が研究されている(Ranger,A.M.ら1998.Immunity 8:125)。この取り組みはES細胞中の双方の染色体上のT−bet遺伝子を破壊させることを必要とし、それは例えば記載されている(Chen,J.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90;4528)とおり、変異体ネオマイシン遺伝子を使用すること、およびES培養物中のG418濃度を上昇させることにより、あるいはneo遺伝子にcre−lox部位を隣接させることにより達成することができる。第二の対立遺伝子を破壊するために、ESクローンをcreリコンビナーゼでトランスフェクトすることによりネオマイシン遺伝子を欠失させることができ、次いでESクローンを同一のターゲッティング構築物で再トランスフェクトして双方の対立遺伝子上にT−bet欠失を伴うクローンを選択し得る。creリコンビナーゼでの第三のトランスフェクションが所望の二重欠損ES細胞を生じる。次いでそのような二重にターゲッティングしたES細胞をRAG2胚盤胞に埋植し、そしてこのように生成させたキメラマウスのリンパ系器官は移入されたES細胞により完全にコロニー形成される。これはT−betの不存在が致死性を引き起こすかもしれない他の器官系に影響を及ぼすことなくリンパ系の細胞に対するT−betの不存在の影響の評価を可能にする。
cre−lox系を使用する条件消失(conditional ablation)の取り組みもまた使用可能である。簡単に説明すると、欠失されるべきエキソンに隣接するイントロン領域中に、lox組換え配列が置かれているターゲッティング構築物を生成する。次いでこの構築物をES細胞にトランスフェクトし、そして変異体マウスを上記のとおり作出する。生じる変異体マウスは次いで、誘導性プロモーターにより駆動されるcreリコンビナーゼに関してトランスジェニックのマウスと交配させる。creが発現される場合にそれはT−bet遺伝子中に導入されたlox部位間の組換えを誘導し、従って遺伝子機能を効果的に破壊する。このアプローチの重要な特徴は、creリコンビナーゼを活性化することにより、成体動物中で随意に遺伝子破壊を誘導し得ることである。
組織特異的プロモーターは免疫系の外の器官の異常を回避するために使用することができる。creを発現する導入遺伝子は誘導可能なプロモーターにより駆動され得る。いくつかの誘導性の系が現在cre−lox組換え法で使用されており、最も一般的なものはテトラサイクリンおよびエクダイソン系である。T−betヌルマウスで胚の致死性が存在する場合には、組織特異的な誘導性プロモーターの使用が可能である。
代替的取り組みは、調節されたT−bet遺伝子をもつトランスジェニックマウスを作出し(例えばテトラサイクリンオフプロモーターを使用して;例えばSt−Onge et al.1996.Nuc.Acid Res.24、3875−3877)、次いでこのトランスジェニックをT−bet欠損マウスと交配させることである。この取り組みは正常なT−bet機能をもつマウスの作出を可能にし;テトラサイクリンを成体動物に投与して末梢T細胞でのT−bet機能の破壊を誘導することができ、次いでT−bet欠損の影響を長期間にわたり検査することができる。化合物(テトラサイクリン)の供給およびその後の除去の反復周期が、T−bet遺伝子のスイッチを随意に入れるおよび切ることを可能にする。
III.単離されたT−betタンパク質および抗T−bet抗体
本発明の別の局面は単離されたT−betタンパク質に関する。好ましくは、T−betタンパク質は配列番号1もしくは3によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様において、該タンパク質は配列番号2もしくは4のアミノ酸配列を含んでなる。他の態様において、該タンパク質は配列に番号2もしくは4に示されるアミノ酸配列と最低60%のアミノ酸同一性、より好ましくは70%のアミノ酸同一性、より好ましくは80%、およびなおより好ましくは90%もしくは95%のアミノ酸同一性を有する。
他の態様において、本発明はT−betタンパク質の単離された部分を提供する。例えば、本発明はTボックスドメインを含むT−betのアミノ末端部分をさらに包含する。多様な態様において、このアミノ末端部分はヒトT−betの少なくともアミノ酸138〜327、またはマウスT−betの少なくともアミノ酸137〜326を包含する。本発明により提供されるT−betの別の単離された部分は、チロシンリン酸化部位を包含する一部分である。この部分はT−betの少なくとも約20、少なくとも約50、少なくとも約100、または少なくとも約200アミノ酸を含んでなり、またヒトT−betの少なくともアミノ酸Tyr76、Tyr119および/もしくはTyr531、または
マウスT−betのアミノ酸Tyr525を含む。本明細書で提供されるT−betのなお別の単離された部分は、ヒトT−betのアミノ酸498〜501、またはマウスT−betの493〜496に示される核局在化配列を包含する一部分である。
本発明のT−betタンパク質は好ましくは組換えDNA技術により製造される。例えば、タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクター(上記のような)にクローン化し、発現ベクターを宿主細胞(上記のような)に導入し、そしてT−betタンパク質を宿主細胞中で発現させる。次いで標準的タンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによりT−betタンパク質を細胞から単離することができる。組換え発現に代わり、標準的ペプチド合成技術を使用してT−betポリペプチドを化学的に合成し得る。さらに、天然のT−betタンパク質は例えば抗T−bet抗体を使用する免疫沈降により細胞(例えばT細胞)から単離することができる。
本発明はT−betアゴニスト(模倣物)もしくはT−betアンタゴニストのいずれかとして機能するT−betタンパク質のバリアントにもまた関する。T−betタンパク質のバリアントはT−betタンパク質の突然変異誘発、例えば別個の点突然変異もしくは短縮により生成させることができる。すなわち制限された機能のバリアントでの処置により特異的な生物学的影響を誘導することができる。1つの態様において、自然に生じる形態のタンパク質の生物学的活性の1サブセットを有する変異体での個体の処置は、天然に存在する形態のT−betタンパク質での処置に比べて個体中でより少ない副作用を有する。1つの態様において、本発明は酸化、還元もしくは当該技術分野で既知の他の誘導体化方法によりT−betの少なくとも1個のアミノ酸残基を修飾することにより形成し得るT−betの誘導体に関する。
1つの態様において、T−betアゴニスト(模倣物)もしくはT−betアンタゴニストのいずれかとして機能するT−betタンパク質のバリアントは、T−betタンパク質の突然変異体、例えば短縮突然変異体のコンビナトリアルライブラリーを、T−betタンパク質アゴニストもしくはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。1つの態様において、T−betバリアントの多様なライブラリーは核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により生成され、そして多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。T−betバリアントの多様なライブラリーは例えば潜在的なT−bet配列の縮重組を個々のポリペプチドとしてあるいはその中にT−bet配列の組を含有する一組のより大きい融合タンパク質(例えばファージディスプレイのために)として発現可能となるように、遺伝子配列中に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することにより製造し得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的T−betバリアントのライブラリーを製造するために使用できる多様な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は自動DNA合成装置で行い、そして合成遺伝子をその後に適切な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重組の使用は所望の組の潜在的T−bet配列をコードする配列の全部の一混合物での供給を可能とする。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該技術分野で既知である(例えばNarang,S.A.、1983、Tetrahedron 39:3;Itakura et al.、1984、Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura et al.、1984 Science 198:1056;Ike et al.、1983、Nucleid Acid Res.11:477を参照されたい)。
加えて、T−betタンパク質コーディング配列のフラグメントのライブラリーを使用して、T−betタンパク質のバリアントのスクリーニングおよびその後の選択のためにT−betフラグメントの多様な集団を生成させることができる。1つの態様において、ニッキングが1分子あたり約1回のみ起こる条件下で、T−betコーディング配列の二本鎖PCRフラグメントをヌクレアーゼで処理すること、二本鎖DNAを変性させること
、DNAを再生させて多様なニックの生成物からセンス/アンチセンス対を包含し得る二本鎖DNAを形成させること、再形成された二重鎖からS1ヌクレアーゼでの処理により一本鎖部分を除去すること、および生じるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、コーディング配列のフラグメントのライブラリーを生成させることができる。この方法により、多様な大きさのT−betタンパク質のN末端、C末端および内的フラグメントをコードする発現ライブラリーを生成することができる。
点突然変異もしくは短縮により作成したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該技術分野で既知である。そのような技術はT−betタンパク質のコンビナトリアル突然変異誘発により生成させた遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適応可能である。大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高処理量分析に応じやすい最も広範に使用される技術には、典型的には遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローン化すること、生じたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを包含する。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を高める新たな技術である再帰アンサンブル突然変異誘発(recursive ensemble mutagenesis)(REM)を、T−betバリアントを同定するためのスクリーニングアッセイとともに使用し得る(Arkin and Yourvan、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7811−7815;Delgrave et al.,1993、Protein Engineering 6(3):327−331)。
本発明はまたT−bet融合タンパク質も提供する。本明細書で使用するように、T−bet「融合タンパク質」はT−bet以外のポリペプチドに操作可能に連結されたT−betポリペプチドを含んでなる。「T−betポリペプチド」はT−betタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはT−betタンパク質に独特であるそのペプチドフラグメントを指す一方、「T−bet以外のポリペプチド」は別のタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。融合タンパク質内で、「操作可能に連結される」という用語はT−betポリペプチドおよび他のポリペプチドが相互に同じ読み枠で融合されることを示すことを意図している。他のポリペプチドはT−betポリペプチドのN末端もしくはC末端に融合されてよい。例えば、1つの態様において、融合タンパク質はT−bet配列がGST配列のC末端に融合されているGST−T−bet融合タンパク質である。別の態様において融合タンパク質は、T−bet配列がインフルエンザヘマグルチニンエピトープ標識に同じ読み枠で融合されているようなpCEP4−HAベクター(Herrscher,R.F.et al.,(1995)Genes Dev.9:3067−3082)のようなベクター中に、T−betヌクレオチド配列が挿入されるT−bet−HA融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は組換えT−betの精製を促進することができる。
好ましくは、本発明のT−bet融合タンパク質は標準的組換えDNA技術により製造する。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントを、通常の技術(例えば連結のための平滑端もしくはねじれ型の(stagger)端にされた末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切なように付着端を埋めること、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および酵素的連結を使用すること)に従って一緒に同じ読み枠で連結する。別の態様では、融合遺伝子は自動DNA合成装置を含む通常技術により合成し得る。あるいは、2種の連続した遺伝子フラグメント間で相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子フラグメントのPCR増幅を実施することができ、これはその後アニーリングし、そして再増幅してキメラ
遺伝子配列を生成することができる(例えば分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、Ausubel et al.,編、ジョンワイリーアンドサンズ(John Wiley & Sons):1992を参照されたい)。さらに、融合部分(例えばGSTポリペプチドもしくはHAエピトープ標識)を既にコードしている多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。T−betをコードする核酸は、融合部分がT−betタンパク質に同じ読み枠で連結されているようなこうした発現ベクターにクローン化し得る。
単離されたT−betタンパク質もしくはそのフラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的技術を使用して、T−betに特異的に結合する抗体を生成させるための免疫原として使用可能である。T−betタンパク質を使用して抗体を生成することができる。例えばポリクローナル抗血清は、完全長の組換えの細菌で生産されたT−betを免疫原として使用してウサギで生産することができる。この同じ免疫原を使用してマウスを免疫感作し、そして免疫感作したマウスから脾細胞を取り出すことによりmAbを製造することができる。T−betに対する免疫応答が高まったマウスからの脾細胞を、骨髄腫細胞例えばSP2/O−Ag14骨髄腫に融合することができる。付属として付けられる実施例に記述されるとおり、本方法を使用してT−betに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体が作成された。1つの態様では、該抗体はT−betノックアウト動物のようなT−betを発現しない動物中で生産され得る。別の態様では、抗体は例えば戻し交雑することにより達成されるとおり、特定の遺伝的バックグラウンドを有する非ヒト動物中で生成することができる。
あるいは、T−betの抗原性ペプチドフラグメントを免疫原として使用することができる。T−betの抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号2もしくは4に示されるアミノ酸配列の少なくとも8アミノ酸残基を典型的に含んでなり、そしてペプチドに対し生じた抗体がT−betと特異的免疫複合体を形成するようなT−betのエピトープを包含する。好ましくは抗原性ペプチドは少なくとも10アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも15アミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも20アミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも30アミノ酸残基を含んでなる。抗原性ペプチドにより包含される好適なエピトープはタンパク質の表面(例えば親水性領域)上に位置し、そしてT−betに独特であるT−betの領域である。1つの態様では、そのようなエピトープはマウスもしくはヒトのような1種からのT−betタンパク質に特異的であり得る(すなわち、種を横断して保存されないT−betの一領域にわたる抗原性ペプチドを免疫原として使用する;こうした保存されない残基は本明細書に提供されるもののような整列を使用して決定可能である)。T−betタンパク質の標準的疎水性分析を実施して親水性領域を同定することができる。
T−bet免疫原は、典型的には適切な個体(例えばウサギ、ヤギ、マウスもしくは他の哺乳動物)を該免疫原で免疫することにより抗体を調製するのに使用する。適切な免疫原性調製物は、例えば組換え的に発現されたT−betタンパク質もしくは化学的に合成されたT−betペプチドを含有し得る。該調製物はフロイントの完全もしくは不完全アジュバントのようなアジュバント、または類似の免疫賦活剤をさらに含むことができる。免疫原性T−bet調製物での適する個体の免疫感作は、ポリクローナル抗T−bet抗体応答を誘導する。
従って、本発明の別の観点は抗T−bet抗体に関する。ポリクローナル抗T−bet抗体は上記のように適する個体をT−bet免疫原で免疫することにより調製可能である。免疫鑑査された個体中での抗T−bet抗体力価は、固定化したT−betを使用する酵素結合免疫吸着法(ELISA)を用いるような標準的技術により長期間にわたって監視することができる。所望の場合は、T−betに対し向けられた抗体分子を哺乳動物から(例えば血液から)単離し、そしてIgG画分を得るためプロテインAクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製することができる。免疫感作後の適切な時点で、例えば抗T−bet抗体力価が最高である時に、抗体生産細胞を個体から得、そしてKohler and Milstein(1975、Nature 256:495−497)により元々は記述されたハイブリドーマ技術(Brown et al.(1981)J.Immunol 127:539−46;Brown et al.(1980)J Biol Chem 255:4980−83;Yeh et al.(1976)PNAS 76:2927−31;およびYehら(1982)Int.J.Cancer 29:269−75もまた参照されたい)、より最近ではヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al.(1983)Immunol Today 4:72)、EBV−ハイブリドーマ技術(Cole et al.(1985)、モノクローナル抗体および癌療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)、アランR.リス社(Alan R.Liss,Inc.)、pp.77−96)もしくはトリオーマ技術のような標準的技術によりモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマの製造技術は周知である(全般的に、モノクローナル抗体:生物学的分析における新規ひろがり(Monoclonal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses)、プレナム出版社(Plenum Publishing Corp.)、ニューヨーク州ニューヨーク(1980)中、R.H.Kenneth;E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.,54:387−402;M.L.Gefter et al.,(1977)Somatic Cell Genet.、3:231−36を参照されたい)。簡単に説明すると、不死化細胞系(典型的には骨髄腫)を上記のT−bet免疫原で免疫感作した哺乳動物からのリンパ球(典型的には脾細胞)と融合し、そして生じるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、T−betに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定する。
リンパ球および不死化細胞系を融合するのに使用される多くの公知のプロトコールのいずれも、抗T−betモノクローナル抗体を生成させる目的上応用することができる(例えば、G.Galfre et al.(1977)Nature 266:55052;Gefter et al. Somatic Cell Genet.、同上に引用される;Lerner、Yale J.Biol.Med.、同上;Kenneth、モノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies)、同上を参照されたい)。さらに当業者はこうした方法の多くの変法が存在し、それらもまた有用であると考えるであろう。典型的には、不死細胞系(例えば骨髄腫細胞系)はリンパ球と同じ哺乳動物種由来である。例えばマウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫感作したマウスからのリンパ球を、不死化マウス細胞系と融合することにより作成し得る。好適な不死化細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地(「HAT培地」)に対し感受性であるマウス骨髄腫細胞系である。多数の任意の骨髄腫細胞系、例えばP3−NS1/1−Ag4−1、P3−x63−Ag8.653もしくはSp2/O−Ag14骨髄腫系統を標準的技術に従って融合パートナーとして使用してよい。これらの骨髄腫系統はアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)、メリーランド州ロックビルから入手可能である。典型的にはHAT感受性のマウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール(「PEG」)を使用してマウス脾細胞に融合する。融合から生じるハイブリドーマ細胞をその後、融合されていない、および非生産的に融合された骨髄腫細胞を殺すHAT培地を使用して選択する(融合されない脾細胞は形質転換されていないためそれらは数日後に死亡する)。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的ELISAアッセイを使用してT−betに結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
こうした方法を使用してT−betに対する数種の抗体が生成されてきた。完全長の組換えの細菌に生産されたT−betタンパク質に対するモノクローナルおよびポリクローナル双方の抗体が生成された。3D10抗体はIgGサブタイプのものであり、また4B10抗体はSP2/0−Ag14骨髄腫へのマウス脾細胞の融合により製造され、そしてIgGサブタイプのものである。39D抗体はヒトおよびマウス双方のT−betを認識する。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製することに代わり、モノクローナル抗T−bet抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば抗体ファージディスプレイライブラリー)をT−betでスクリーニングしてそれによりT−betを結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することにより同定かつ単離可能である。ファージディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするためのキットが市販されている(例えばファルマシア(Pharmacia)の組換えファージ抗体系(Recombinant Phage Antibody System)、カタログ番号27−9400−01;およびストラタジーン(Stratagene)のSurfZAP(商標)ファージディスプレイキット(Pharge Display Kit)、カタログ番号240612)。加えて、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにおける使用にとりわけ応じやすい方法および試薬の例は、例えばLadner et al.米国特許第5,223,409号明細書;Kang et al. 国際公開第 92/18619号明細書;Dower et al.国際公開第 91/17271号明細書;Winter et al.国際公開第92/20791号明細書;Markland et al.国際公開第92/15679号明細書;Breitling et al.国際公開第93/01288号明細書;McCafferty et al.国際公開第92/01047号明細書;Garrard et al.国際公開第92/09690号明細書;Ladner et al.国際公開第90/02809号明細書;Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370−1372;Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81−85;Huse et al.(1989)Science 246:1275−1281;Griffiths et al.(1993)EMBO J 12:725−734;Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226:889−896;Clarkson et al.(1991)Nature 352:624−628;Gram et al.(1992)PNAS 89:3576−3580;Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9:1373−1377;Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19:4133−4137;Barbas et al.(1991)PNAS 88:7978−7982;およびMcCafferty et al.Nature(1990)348:552−554に見出すことができる。
加えて、標準的組換えDNA技術を使用して作成し得るヒトおよび非ヒト双方の部分を含んでなるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗T−bet抗体が本発明の範囲内にある。こうしたキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えDNA技術により、例えばRobinson et al.国際特許公開第PCT/US86/02269号明細書;Akira et al.欧州特許出願第184,187号明細書;Taniguchi,M.欧州特許出願第171,496号明細書;Morrison et al.欧州特許出願第173,494号明細書;Neuberger et al.PCT出願第WO 86/01533号明細書;Cabilly et al.米国特許第4,816,567号明細書;Cabilly et al.欧州特許出願第125,023号明細書;Better et al.(1988)Science 240:1041−1043;Liu et al.(1987)PNAS 84:3439−3443;Liu et al.(1987)J.Immunol.139:3521−3526;Sun et al.(1987)PNAS 84:214−218;Nishimura et al.(1987)Canc.Res.47:999−1005;Wood et al.(1985)Nature 314:446−449;およびShaw et al.(1988)J.Natl Cancer Inst.80:1553−1559);Morrison,S.L.(1985)Science 229:1202−1207;Oi et al.(1986)BioTechniques 4:214;Winter 米国特許第5,225,539号明細書;Jonesら(1986)Nature 321:552−525;Verhoeyanら(1988)Science 239:1534;ならびにBeidler et al.(1988)J.Immunol.141:4053−4060に記述される方法を使用して製造可能である。
別の態様において、完全にヒトの抗体を当該技術分野で既知である技術を使用して作成することができる。例えば、特定の1抗原に対する完全にヒトの抗体は、抗原対抗に応答してこうした抗体を生産するよう修飾されているが、その内因性の遺伝子座が不能にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することにより調製することができる。抗体を作成するために使用できる例示的技術は米国特許第6,150,584号;同第6,458,592号;同第6,420,140号明細書に記載されている。他の技術は当該技術分野で既知である。
抗T−bet抗体(例えばモノクローナル抗体)を使用して、アフィニティークロマトグラフィーもしくは免疫沈降法のような標準的技術によりT−betを単離することができる。抗T−bet抗体は細胞からの天然のT−betおよび宿主細胞中で発現された組換え的に生産されたT−betの精製を促進する可能性がある。さらに、抗T−bet抗体を使用して(例えば細胞ライセートもしくは細胞上清中の)T−betタンパク質を検出できる。検出可能な基質に抗体をカップリング(すなわち物理的に連結)することにより検出が促進されうる。従って、1つの態様において、本発明の抗T−bet抗体を検出可能な基質で標識する。検出可能な物質の例には、多様な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質および放射活性物質を含む。適する酵素の例は西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはアセチルコリンエステラーゼを含み;適する補欠分子団複合体の例にはストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンを含み;適する蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンを含み;発光物質の一例はルミノールを含み;そして適する放射活性物質の例は125I、131I、35SもしくはHを含む。
さらに別の本発明の観点は:
(a)免疫原性のT−betタンパク質もしくはT−betタンパク質に独特のその免疫原性の部分で動物を免疫感作し;そして
(b)動物からT−betタンパク質に特異的に結合する抗体を単離する
ことを含んでなる方法により得られる抗T−bet抗体に関する。
免疫感作および特異的抗T−bet抗体の回収方法は上にさらに記載されている。
さらに別の観点では、本発明はT−betイントラボディ(intrabody)に関する。イントラボディは細胞の内側の標的、例えばT−betのような細胞内タンパク質に対し向けられた細胞内で発現される抗体構築物、通常は一本鎖Fv(scFv)抗体である(Graus−Porta,D.et al.(1995)Mol.Cell Bi
ol.15(1):182−91)。例えば、イントラボディ(例えばおよびscFv)は柔軟性リンカーにより連結され、そして単一遺伝子から発現された重鎖および軽鎖の可変領域を含むことができる。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、scFvの特異性を決定する親抗体の相補性決定領域(CDR)すなわち主抗原結合ドメインを含む。scFv遺伝子を細胞中に移入することができ、ここでscFvタンパク質発現はその標的例えばT−betの特性を調節することができる。従って1つの態様では、本発明は例えば細胞
をこうしたイントラボディを発現するよう改変するin vivoもしくはex vivoの取り組みにおいて、細胞中でT−bet活性を防止するためのこうしたT−betイントラボディの使用方法を提供する。1つの特定の態様において、本発明のT−betイントラボディを使用してT−bet活性を直接阻害することができる。別の態様において、T−betイントラボディを使用してT−betおよびT−betが相互作用するタンパク質の相互作用を阻害することができる。このように本発明のT−betイントラボディは、T−betが関与するシグナリング経路の調節において有用である。
T−betイントラボディは当該技術分野で既知の技術を使用して製造可能である。例えば、ファージディスプレイ技術を使用してscFvをライブラリーから単離できる(Lowman,HB et al.(1991)Biochemistry 30(10):832−8)。特定の抗原に結合するscFvを選択するために、scFvを外被タンパク質、典型的には繊維状M13ファージのpIII(g3p)に融合する。固定化された抗原に結合するファージ上のscFvが、結合、溶出および増幅の連続周期の間に濃縮される。別の例において、リボソームディスプレイを使用してT−betイントラボディを調製できる(Hanes,J.et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94(1):937−44)。リボソームディスプレイはペプチドを遺伝情報(mRNA)に直接連結するin vitroの方法である。転写翻訳系を使用してscFv CDNAライブラリーをin vitroで発現させる。翻訳されたScFvを、コーディングmRNAに連結されたリボソームに閉入する。次いで固定された抗原にscFvを結合させ、そして非特異的リボソーム複合体を徹底的な洗浄により除去する。残存する複合体を溶出し、そしてRNAを単離し、cDNAに逆転写し、そしてその後PCRにより再増幅する。さらに別の例では、タンパク質フラグメント補完アッセイ(Protein Fragment Complementation Assay)(PCA)を使用して本発明のT−betイントラボディを調製できる(Pelletier,JN et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95(12):141−6.)これはマウスタンパク質(mDHFR)による大腸菌(E.coli)中の変異体ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の補完に基づく細胞選択手順である。マウスDHFRを2部分に切断し、これらを潜在的に相互作用性のペプチドとの融合タンパク質として発現させる。融合タンパク質の相互作用がmDHFRの酵素活性、および従って細菌増殖を復帰させる。抗体および抗原の特定の1相互作用のみがscFvの選択に応じやすい系を作成するDHFRの機能補完を可能にする(Mossner,E.et al.(2001)J Mol.Biol.308:115−22)。
IV.製薬学的組成物
本発明の調節物質(例えば、Th2細胞系譜コミットメントを直接刺激するか、または減少する)は、投与に適する製薬学的組成物中に組込むことができる。そのような組成物は典型的に調節剤および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる。本明細書で使用する用語「製薬学的に許容され得る担体」は、製薬学的投与と適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含することを意図している。製薬学的に活性な物質のためのこうした媒体および作用物質の使用は当該技術分野で周知である。通常の媒体もしくは作用物質が活性化合物と不適合性である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が企図されている。補助的な活性化合物もまた組成物中に組込むことができる。
本発明の製薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように配合される。例えば、非経口、皮内もしくは皮下適用に使用される溶液もしくは懸濁剤には、以下の成分;すなわち注射用水、生理的食塩水溶液、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒のような滅菌の希釈剤;ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤;アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩のような緩衝剤および塩化ナトリウムもしくはデキトロースのような張性の調節のための作用物質を含むことができる。pHは塩酸もしくは水酸化ナトリウムのような酸もしくは塩基で調節できる。非経口調製物はガラスもしくはプラスチックから作成されるアンプル、使い捨てシリンジもしくは多回用量バイアル中に封入し得る。
注入可能な使用に適する製薬学的組成物には、滅菌の水性溶液(水に可溶性の場合)もしくは分散剤、および滅菌の注入可能な溶液もしくは分散剤の即座の調製のための無菌粉末を包含する。静脈内投与に適する担体は、生理学的生理的食塩水、静菌水、Cremophor EL(商標)(BASF、ニュージャージー州パーシッパニー)もしくはリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)を包含する。すべての場合で、組成物は滅菌でなくてはならず、そして容易なシリンジ操作性(syringability)が存在する程度まで流動性であるべきである。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなくてはならず、しかも細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対し保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびにそれらの適する混合物を含有する溶媒もしくは分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用、分散剤の場合は必要とされる粒子径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は多様な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合で等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に包含することが好ましい。注入可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に包含することによりもたらすことができる。
滅菌の注入可能な溶液は、必要とされ上で挙げた成分の1種もしくは組合せを含む適切な溶媒中に、必要とされる量の活性化合物を包含し、次いで濾過滅菌により調製することができる。一般に、分散剤は上で挙げられたものからの基礎分散媒質および必要とされる他の成分を含有する滅菌賦形剤中に活性化合物を包含することにより調製する。滅菌の注入可能な溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好適な調製方法は真空乾燥、および以前に滅菌濾過されたその溶液からのさらなる所望の成分に加えて活性化合物の粉末を生じる凍結乾燥である。
経口組成物は一般に不活性希釈剤もしくは可食担体を含む。それらはゼラチンカプセル中に封入し得るか、または錠剤に圧縮し得る。経口の治療的投与の目的に、活性化合物を賦形剤と包含し、そして錠剤、トローチ剤もしくはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はマウスウォッシュとしての使用のため液体担体を使用しても調製可能であり、ここでは液体担体中の化合物を口腔に適用し、そして音をたてかつ喀出もしくは嚥下する。製薬学的に適合性の結合剤および/もしくは補助物質を組成物の一部として包含し得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分もしくは類似の性質の化合物:すなわち微晶質セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンのような結合剤;デンプンもしくは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル(Primogel)もしくはトウモロコシデンプンのような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス(Sterotes)のような滑沢剤;コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤;ショ糖もしくはサッカリンのような甘味料;またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料のような香味料のいずれかを含有することができる。
1つの態様において、活性化合物はインプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤のような身体からの迅速な排泄に対し化合物を保護することができる担体とともに調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性の生体適合性ポリマーを使用できる。こうした製剤の調製方法は当業者に明らかであろう。物質はまたアルザコーポレーション(Alza Corporation)およびノバファーマシューティカルズ社(Nova Pharmaceuticals,Inc.)から商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁剤(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞に標的を定めたリポソームを包含する)もまた製薬学的に許容できる担体として使用可能である。これらは例えば米国特許第4,522,811号明細書に記述されるところの当業者に既知の方法に従い調製できる。
1つの態様において、調節剤を含んでなる組成物はT−betにより影響を受ける細胞応答を調節するために有用な第二の作用物質を含んでなることができる。例えば1つの態様において、Th2系譜コミットメントをダウンイジュレートする作用物質を、液性免疫応答をダウンレギュレートする第二の作用物質と組み合わせて投与することができる。あるいは例えば別の態様で、Th2系譜コミットメントをアップモジュレートする作用物質を、細胞性免疫応答をダウンモジュレートする作用物質と一緒に投与することができる。こうした作用物質はT−bet調節剤と同じ製薬学的組成物の一部として投与してもよく、または別個の投与のために配合してよい。
V.本発明の方法
A.診断アッセイ/予後アッセイ
本発明の別の観点は、本発明の多様なT−bet組成物の使用方法に関する。例えば、本発明は生物学的サンプル中のT−bet活性の存在の検出方法を提供する。そのようなアッセイは、Th2細胞系譜コミットメントを調節することが望ましい可能性がある細胞の同定に有用となり得る。この方法はT−bet活性の存在が生物学的サンプル中で検出されるようなT−betタンパク質もしくはT−bet mRNAのようなT−bet活性を検出することが可能な作用物質と生物学的サンプルを接触させることが関与する。
T−bet mRNAの検出のための好ましい作用物質は、T−bet mRNAに特異的にハイブリダイズすることが可能な標識核酸プローブである。核酸プローブは例えば長さが少なくとも約500、600、800、900、1000、1200、1400もしくは1600ヌクレオチドで、しかもストリンジェントな条件下でT−bet mRNAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのような、配列番号1もしくは3のT−bet DNAであることができる。
T−betタンパク質の検出のための好ましい作用物質は、T−betタンパク質に結合することが可能な標識抗体である。抗体はポリクローナルもしくはより好ましくはモノクローナルであり得る。無傷の抗体またはそのフラグメント(例えばFabもしくはF(ab’))を使用することができる。プローブもしくは抗体に関して「標識」という用語は、検出可能な物質をプローブもしくは抗体にカップリング(すなわち物理的に連結)することによるプローブもしくは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブもしくは抗体の間接標識を包含することを意図している。間接標識の例は蛍光標識二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るようなビオチンでのDNAプローブの末端標識を包含する。「生物学的サンプル」という用語は組織、細胞および生物学的流体を包含することを意図している。例えばT−bet mRNAの検出のための技術には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびin situハイブリダイゼーションを包含する。T−betタンパク質の検出のための技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を包含する。
こうしたアッセイは発生欠陥を特徴とする症候群の検出において有用である。例えばヒトTボックス遺伝子TBX5およびTBX3(マウスTbx5およびTbx3のオルソログ)中の突然変異はそれぞれ常染色体優性遺伝疾患ホールト−オーラム症候群および尺骨乳腺症候群の原因である(Bamshad,M.et al.1997.Nature Genetics 16:311;Basson,C.T.et al.1997.Nature Genetics 15:30;Li,Q.Y.et al.1997.Nature Genetics 15:21;Spranger,S.et al.1997.J.Med.Genet.3:978)。これらの症候群は発生欠陥を特徴とし、そしてそれぞれTbx5およびTbx3の発現のパターンにより予測されていたかもしれない。ホールト−オーラム症候群は心および上肢を冒す一方、尺骨乳腺症候群は四肢、アポクリン腺、歯および生殖器の発生に影響を及ぼす。双方の症候群は発生欠陥を特徴とし、そしてそれぞれTbx5およびTbx3の発現のパターンにより予測されていたかもしれない。これらの患者における突然変異はTボックス遺伝子中の一対立遺伝子のみを関わらせ、従ってTbx3およびTbx5のハプロ不全(haploinsufficiency)がこれら2疾患を引き起こすと仮定されている。最近、発生中のニワトリ胚へのTbx4およびTbx5の供給が肢芽の同一性(identity)を制御することが示された(Rodriguez−Esteban et al.,1999;Takeuchi et al.,1999)。これらの発見は脊椎動物の発生におけるこのファミリーの決定的な重要性を強調する。
加えて、多くの種におけるT−bet遺伝子相同物の存在は、中胚葉発生に関与する今のところは未知の一組の標的遺伝子を調節する転写因子としてのその機能に関する強力な証拠を提供する。Tボックスファミリーの最近の突出は、ヒト疾患においてTボックス突然変異により最も劇的に例示される多彩な発生過程におけるその明らかな重要性から生じる。胸腺細胞幹細胞からの成熟T細胞およびナイーブな前駆細胞からの分化したTh細胞の生成もまた厳格に調節される発生過程としてみることができる。T−betがTh1系列の発生を司るというこの発見は、リンパ系におけるこの最新のTボックスファミリーメンバーの重要な役割を示している。
B.スクリーニング法
本発明はさらに、Th2系譜コミットメントを直接的に調節、例えば増加または減少させ、かつ/またはTh2サイトカイン生産を直接的に調節、例えば増加または減少させる化合物、すなわち候補または試験化合物または作用物質(例えばペプチド模造物、低分子(例えば低有機分子または他の薬剤))を同定する方法を提供する。Th2系譜コミットメントの調節物質は知ることができ(例えばT−bet活性のドミナントネガティブインヒビター、GATA3または1もしくは複数のTecキナーゼ、アンチセンスT−bet、GATA3またはTecキナーゼ、T−betを妨害する細胞内抗体、またはTecキナーゼ活性、T−bet、GATA3またはTecキナーゼに由来するペプチドインヒビター)、核酸もしくはタンパク質T−bet、GATA3もしくはTecキナーゼ分子、キナーゼのアクチベーターまたはインヒビター(例えばチロシンキナーゼアクチベーターもしくはインヒビター)、あるいは本明細書に記載する方法を使用して同定することができる。
例えば1つの態様では、相互作用、例えばT−betのキナーゼ分子、例えばTecキナーゼへの結合を調節する分子を同定することができる。例えばTecキナーゼ、例えば
ItkはT−betとGATA3との相互作用を媒介し、したがって任意のこれらの分子を本スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。以下のこの章および他の章で記載する特定の態様は、例としてこれら分子の1つを挙げるが、T−betが関与するシグナル伝達経路と相互作用し、かつ/または関与する他の分子も本スクリーニングアッセイに使用することができる。
1つの態様では、化合物がT−betとTecキナーゼとの間の複合体の形成を直接調節する、例えば増加するかまたは安定化する、または不安定化(destabilize)する能力を測定する。別の態様では、T−betの翻訳後修飾(例えばリン酸化)またはItkもしくはT−betの発現および/または活性が、本発明のスクリーニングアッセイを使用して指標組成物中で測定される。さらに別の態様では、GATA3とT−betとの間の複合体の形成が測定される。さらなる態様では、Th2サイトカイン生産が測定される。
指標組成物は、T−betタンパク質またはT−betと相互作用する分子またはT−betが関与するシグナル伝達経路の分子を発現する細胞、例えば自然に発現される細胞、さらに好ましくはタンパク質をコードする発現ベクターを細胞に導入することによりタンパク質を発現するように工作された細胞であり得る。好ましくは細胞は哺乳動物細胞、例えばヒトの細胞である。1つの態様では、細胞はT細胞である。1つの好適な態様では、細胞はT細胞系譜コミットメントを有する(committed)。別の好適な態様では、細胞は未だT細胞系譜コミットメントをもたない。別の態様では細胞はB細胞である。さらに別の態様では、細胞はNK細胞である。あるいは指標組成物は、タンパク質(例えば細胞抽出物または例えば精製された天然もしくは組換えタンパク質のいずれかを含む組成物)を含む無細胞組成物である。
Th2系譜コミットメントを直接調節する化合物の能力は、例えばTh2特異的サイトカインの生産を測定することにより決定することができる。また化合物がTh2系譜コミットメントを直接調節する能力は、例えばItkの発現および/または活性を測定することにより決定することができる。例えばItkは、T−betのような標的分子を、T−betのチロシン残基525(Y525)でリン酸化、例えばチロシンリン酸化するTecキナーゼである。さらに化合物がTh2系譜コミットメントを直接調節する能力は、例えばT−betの発現および/または活性を測定することによっても決定することができる。例えばT−betは転写因子であり、したがってDNAに結合し、そして遺伝子、例えばサイトカイン遺伝子の発現を実施例に教示するように調節する。したがって本発明のスクリーニング法の具体的態様では、T−betポリペプチドがDNAまたは他の標的分子(例えばGATA3、Tecキナーゼ、またはIL−2もしくはIFN−γプロモーター)に結合する能力を活用して、遺伝子発現を調節する(例えばIL−2遺伝子、IFN−γ遺伝子のトランス活性化を抑制することにより例えばTh1関連サイトカイン遺伝子の発現を調節するか、あるいはTh2関連サイトカイン遺伝子、例えばIL−4遺伝子またはIL−10遺伝子の発現を調節するか(例えばGATA3がDNAに結合する能力を下げることにより)、あるいは他の遺伝子の発現を調節する(例えばTGF−βまたはTLR6のようなToll−様受容体遺伝子を抑制することにより))。
1つの態様において、本発明は調節物質、すなわちT−betポリペプチドに結合する;T−bet発現に刺激または阻害効果を有する;T−betプロセシング;T−bet翻訳後修飾(例えばグリコシル化、ユビキチン化もしくはリン酸化);またはT−bet活性;あるいはT−bet結合パートナーまたは標的分子の発現、プロセシングもしくは活性に刺激もしくは阻害効果を有する候補もしくは試験化合物もしくは作用物質(例えば酵素、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、リボザイムもしくはT−betアンチセンス分子)の同定方法を提供する。
1つの好適な態様では、本発明はT細胞分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に増加する化合物の同定法を特徴とし、この方法は化合物の存在下で、T−betおよびTecキナーゼ分子をキナーゼ分子とT−betとの相互作用を可能とする条件下で接触させ;そしてT−betおよびキナーゼ分子の相互作用を検出することを含んでなり、ここでT細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に増加する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示される。
別の態様では、本発明はT細胞分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に減少する化合物の同定法を特徴とし、この方法は化合物の存在下で、T−betおよびTecキナーゼ分子をキナーゼ分子とT−betとの相互作用を可能とする条件下で接触させ;そしてT−betおよびキナーゼ分子の相互作用を検出することを含んでなり、ここでT細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に減少する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の上昇により示される。
別の好適な態様では、T細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に調節(例えば増加または減少)するために有用な化合物の同定方法を特徴とし;
a)ITK、T−betおよびGATA3を含んでなる指標組成物を準備し;
b)指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ;
c)試験化合物のライブラリーから、T−betおよびGATA3のITKが媒介する相互作用を調節する(例えば減少または増加)目的化合物(1もしくは複数)を選択し、これによりTh2系譜コミットメントを直接的に調節する化合物を同定することを含んでなる。
さらに別の好適な態様では、T細胞中のT−betとGATA3との相互作用を調節する化合物の同定方法を特徴とし、この方法は化合物およびITKの存在下で、T−betおよびGATA3を、ITK媒介型のT−betのGATA3への結合により複合体を形成することを可能とする条件下で接触させ;そしてT−betとGATA3との複合体の形成を検出することを含んでなり、ここでITKおよび化合物の存在下でT−betとGATA3との間の相互作用を調節(例えば増加または減少)する化合物の能力が、ITKおよび化合物の不存在下で形成される複合体の量と比べた複合体の形成の調節に示される。
さらに別の好適な態様では、本発明はT細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接調節(例えば増加または減少)する方法を特徴とし、この方法はT細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントが直接調節されるように、T細胞中でITK媒介型のT−betおよびGATA3結合を直接する(例えば減少または増加)する作用物質と細胞を接触させることを含んでなる。
本明細書に記載するアッセイを使用して同定される化合物は、異常なT−bet発現、プロセシング、翻訳後修飾、またはT細胞系譜コミットメントの活性、調節、サイトカイン生産の調節、TGF−β媒介型シグナリングの調節、Jak1/STAT−1経路の調節、IgGクラススイッチングの調節、Bリンパ球機能の調節に関連する障害を処置するために有用となり得る。
T−betとGATA3および/またはキナーゼとの間の複合体の形成および/または安定性を減少させることによりTh2サイトカイン生産のアップモジュレーションから利益を得ることができる状態には、特定の免疫不全障害の障害またはTh1サイトカインの生産が高すぎる可能性がある障害を含む。
T−betとGATA3および/またはキナーゼとの間の複合体の形成および/または安定性を増加させることによりTh2サイトカイン生産のダウンレギュレーションから利益を得る可能性がある状態には:糖尿病、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物の咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、化合物発疹、らい境界反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴覚障害、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーヴス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)ならびに間隙性肺線維症を包含する自己免疫障害を包含する。
個体のスクリーニングアッセイを他の作用物質の存在もしくは非存在下で実施することができる。例えば、スクリーニングされている細胞の活性化状態を調節する様々な作用物質の存在下で個体のアッセイを実施することができる。例えば1つの態様において、T細胞受容体を介してシグナルを伝達する作用物質が含まれる。別の態様において、サイトカインもしくはサイトカイン受容体に対する抗体が含まれる。別の態様では、リン酸化、例えばチロシンリン酸化を阻害する作用物質も含まれる。
別の観点では、本発明は本明細書に記載する2以上のアッセイの組合せに関する。例えば、細胞に基づくもしくは無細胞アッセイを使用して調節剤を同定することができ、そして系列への分離を調節する作用物質の能力を、in vivoで、例えば多発性硬化症(EAE)、慢性関節リウマチもしくは感染症の動物モデルのような動物で確認し得る。
さらに本明細書に記載するように同定されたTh2系譜コミットメントおよび/またはTh2サイトカイン生産の調節物質(例えばドミナントネガティブT−bet、GATA3もしくはTecキナーゼ分子、T−bet、GATA3もしくはTecキナーゼ核酸もしくはポリペプチド分子、アンチセンスT−bet、GATA3もしくはTecキナーゼ核酸分子、T−bet、GATAもしくはTecキナーゼ特異的抗体、または低分子)を動物モデルで使用して、こうした調節物質での処置の効力、毒性もしくは副作用を決定し得る。あるいは本明細書に記載するように同定された調節物質を動物モデルで使用して、そのような調節物質の作用機序を決定することができる。
別の態様において、類似のスクリーニングアッセイを使用して、例えば上記のようなスクリーニングアッセイを行うが、しかしT−betが相互作用する分子、すなわちTecキナーゼまたはGATA3のようなシグナル伝達経路中でT−betの上流もしくは下流いずれかで作用する分子を使用することにより、Th2系列への分化を調節する化合物を同定することができる。
従って以下に記載するように、本発明はT−betおよびTボックス結合領域(例えばIL−2もしくはIFN−γ遺伝子制御領域のようなサイトカイン遺伝子制御領域)の相互作用、あるいはGATA3(またはT−betとGATA3およびTecキナーゼとの間の複合体)がDNAに結合する能力を調節する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。標的DNA配列とのDNA結合タンパク質の相互作用を検出するアッセイは当該技術分野で既知である(例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、DNアーゼIフットプリンティングアッセイ等)。試験化合物の存在および不存在下でそのようなアッセイを行うことにより、これらのアッセイを使用してその標的DNA配列とのDNA結合タンパク質の相互作用を調節する(例えば阻害するもしくは高める)化合物を同定し得る。
本発明の細胞に基づくおよび無細胞アッセイを以下により詳細に記載する。
i.細胞に基づくアッセイ
本発明の指標組成物は、T−betポリペプチド(および/またはTecキナーゼ、例えばItkのような1もしくは複数の非−T−betポリペプチド)を発現する細胞、例えば内因性のT−betを天然に発現する細胞、またはより好ましくは該ポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞中に導入することにより外因性のT−betポリペプチドを発現するよう工作されている細胞であり得る。あるいは、指標組成物はT−betおよび/またはTecキナーゼ、例えばItkのような非T−betポリペプチドを含む無細胞組成物(例えばT−bet発現細胞からの細胞抽出物または精製されたT−bet(天然もしくは組換えいずれかのポリペプチド)を包含する組成物)であり得る。
Th2系譜コミットメントおよび/またはTh2サイトカインの生産を調節、例えば直接する化合物は、様々な「読み出し」を使用して同定することができる。
例えば、指標細胞をT−bet発現ベクターでトランスフェクトし、試験化合物の存在および非存在下でインキュベートし、そして分子の発現またはT−betにより調節される生物学的応答に対する化合物の影響を測定することができる。T−betの生物学的活性は、標準的技術に従ってin vivoもしくはin vitroで測定される活性を含む。T−bet活性はT−bet標的分子(例えばサイトカイン遺伝子またはポリペプチド、例えばキナーゼ(例えばTecキナーゼ)または転写因子(GATA3)の転写制御領域のようなT−betが結合する核酸分子)と、T−betとの会合のような直接の活性であり得る。あるいはT−bet活性は、T−betポリペプチドとT−bet標的分子との相互作用の下流で起こる細胞のシグナル伝達活性、またはその相互作用により誘発されたシグナリングカスケードの結果として起こる生物学的影響のような下流の活性である。例えば、本明細書に記載されるT−betの生物学的活性は:例えばサイトカインの生産を直接的に調節することによるT細胞系譜コミットメントの調節、生産されたサイトカインの下流への効果の調節を含む。T−betの多様な生物学的活性は当該技術分野で既知である技術を使用して測定可能である。例示的技術は実施例により詳細に記載する。
試験化合物がサイトカイン発現を調節するかどうかを決定するために、in vitro転写アッセイを行うことができる。そのようなアッセイを実施するために、サイトカインの完全長のプロモーターおよびエンハンサー(またはその一部)をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)もしくはルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に操作可能に連結し、そして宿主細胞中に導入することができる。
本明細書で互換的に使用する用語「操作可能に連結される」および「効果的に連結される」とは、ヌクレオチド配列が宿主細胞中での(もしくは細胞抽出物による)このヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御配列に連結されていることを意味することを意図している。制御配列は技術的に認識され、かつ適切な宿主細胞中での所望のポリペプチドの発現を指図するように選択し得る。制御配列という用語はプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび他の発現制御要素を包含することを意図している。そのような制御配列は当業者に既知であり、そしてGoeddel、遺伝子発現技術(Gene Expression Technology):Methods in Enzymology 185、アカデミックプレス(Academic Press)、カリフォルニア州サンディエゴ(1990)に記載されている。発現ベクターの設計はトランスフェクトされるべき宿主細胞の選択および/または発現されるべき所望のポリペプチドの型および/または量のような因子に依存しうることが理解されるべきである。
多様なレポーター遺伝子が当該技術分野で既知でありかつ本発明のスクリーニングアッセイでの使用に適する。適するレポーター遺伝子の例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはルシフェラーゼをコードするものを含む。これらの遺伝子産物の活性の標準的測定方法は当該技術分野で既知である。
様々な細胞型が該スクリーニングアッセイでの指標細胞としての使用に適する。好ましくは、Th2細胞クローンもしくはノックアウト動物からの細胞のような通常はT−betを発現しない細胞系を使用する。HepG2肝癌細胞株のような非リンパ系細胞系もまた指標細胞として使用可能である。酵母細胞もまた指標細胞として使用可能である。
本アッセイで使用する細胞は、真核生物または原核生物起源であり得る。例えば、1つの態様では細胞は細菌細胞である。別の態様では細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。別の態様において細胞は脊椎動物細胞、例えばトリ細胞または哺乳動物細胞である。好適な態様では、細胞はヒトの細胞である。
1つの態様において、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルは、試験化合物の不存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより高く、そして該試験化合物はT−betの発現を刺激する化合物と同定される。別の態様では、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルは、試験化合物の不存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより低く、そして該試験化合物はT−betの発現を阻害する化合物と同定される。
1つの態様において、本発明はT−betが関与する細胞応答を調節する化合物の同定方法を提供する。
標的分子へのT−bet結合を調節する、またはT−betに結合する試験化合物の能力もまた測定し得る。標的分子(例えば結合パートナー)へのT−bet結合を調節する試験化合物の能力を測定することは、例えば複合体中の標識T−bet標的分子を検出することによりT−betへのT−bet標的分子の結合が測定可能であるように、放射性同位元素、酵素もしくは蛍光標識とT−bet標的分子をカップリングすることにより達成し得る。あるいは、T−betを放射性同位元素、酵素もしくは蛍光標識とカップリングして、複合体中のT−bet標的分子へのT−bet結合を調節する試験化合物の能力を監視することができる。T−betを結合する試験化合物の能力を測定することは、例えば複合体中の標識T−bet化合物を検出することによりT−betへの化合物の結合が測定可能であるように、放射性同位元素、酵素もしくは蛍光標識と化合物をカップリングすることにより達成することができる。例えば、T−bet標的は直接もしくは間接のいずれかで125I、35S、14CもしくはHで標識可能であり、そして放射能発射の直接計数もしくはシンチレーション計数により放射性同位元素を検出できる。あるいは化合物を例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはルシフェラーゼで酵素的に標識可能でき、そして適切な基質の産物への転換の測定により酵素標識を検出し得る。
相互作用体のいずれの標識も伴わずに、T−betと相互作用する化合物の能力を測定することもまた本発明の範囲内にある。例えば、微小生理機能測定器を使用して化合物もしくはT−betいずれの標識も伴わずにT−betとの化合物の相互作用を検出することができる(McConnell,H.M.et al.(1992)Science
257:1906−1912)。本明細書で使用されように「微小生理機能測定器」(例えばサイトセンサー(Cytosensor))は、光接近可能な電位測定センサー(LAPS)を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物とT−betとの間の相互作用の指標として使用できる。
別の態様において、T−betの上流もしくは下流で作用する、T−betが関与する経路中で作用する異なる(すなわち非T−bet)分子を、スクリーニングアッセイでの使用に指標組成物中に含むことができる。こうした分子を使用するスクリーニングアッセイで同定される化合物もまた、間接的にではあろうともT−bet活性の調節において有用となり得る。T−betが相互作用する例示的一分子はTecキナーゼ、例えばITKもしくはRLKおよび/またはGATA3を包含する。
本発明の細胞は内因性のT−bet(もしくはT−betが関与するシグナリング経路中の別のポリペプチド)を発現し得るか、またはそうするように工作してもよい。T−betポリペプチドまたはT−betの上流もしくは下流で作用する非T−betポリペプチドを発現するよう工作されている細胞は、T−betポリペプチドもしくはT−betの上流もしくは下流で作用する非T−betポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞中に導入することにより生成することができる。
指標細胞中でT−betポリペプチドまたはT−betの上流もしくは下流で作用するT−betポリペプチドまたは非T−betポリペプチドの発現に使用し得る組換え発現ベクターは、当該技術分野で既知である。1つの態様では、発現ベクター内で指標細胞中でのT−betの誘導性または構成的発現を可能にする制御配列(例えばサイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサーのようなウイルス制御配列を使用できる)にT−betコーディング配列を効果的に連結する。指標細胞中でのT−betの誘導性または構成的発現を可能にする組換え発現ベクターの使用が、T−betの活性を高めるもしくは阻害する化合物の同定に好ましい。代替の一態様において、発現ベクター内でT−betコーディング配列を内因性のT−bet遺伝子の制御配列(すなわち内因性のT−bet遺伝子由来のプロモーター制御領域)に操作可能に連結する。T−bet発現が内因性制御配列により制御される組換え発現ベクターの使用は、T−betの転写発現を高めるもしくは阻害する化合物の同定に好ましい。
Th1関連サイトカイン遺伝子を(例えばレポーター遺伝子として、またはT−bet活性を評価するための読み取りとして)利用する方法では、好ましくはTh1関連サイトカインがインターフェロン−γもしくはIL−2である。添付する実施例に記載されるとおり、T−betはIL−2プロモーターに結合するその能力に基づく酵母1ハイブリッドスクリーニングアッセイで単離した。従って、1つの態様では、本発明の一方法は近位IL−2プロモーターのこの領域、最も好ましくはIL−2プロモーターのヌクレオチド−240ないし−220を含有するレポーター遺伝子構築物を利用する。使用し得る他の配列は:コンセンサスTボックス部位、ヒトIL−2プロモーター、マウスIL−2プロモーター、ヒトIFN−γイントロンIII、マウスIFN−γ近位プロモーター中の2個の結合部位を包含する。(Szabo et al.2000.Cell 100:655−669)。
1つの態様では、誘導性の系を構築し、そして高処理量の細胞に基づくスクリーニングに使用して、T−betの発現および/もしくは活性に影響を及ぼす標的化合物を同定かつ特徴づけることができる。誘導性の系は、例えば、エクダイソンに駆動されるT−bet発現プラスミドとコトランスフェクトしたエクダイソン受容体およびIFN−γプロモータールシフェラーゼレポーターを発現する接着性293Tヒト胚腎細胞株のサブクローンを使用することにより、通常はIFN−γを生産しない細胞株を使用して構築可能である。(Wakita et al.2001.Biotechniques 31:414;No et al.Proceedings of the National Academy of Sciences USA 93:3346;Graham.2002 Expert Opin.Biol.Ther.2:525)。昆虫ホルモンエクジソンでの処理に際してT−betが発現され、IFN−γレポーターが活性化され、そしてルシフェラーゼ活性が生成される。この系において、T−betは細胞株に内因性のIFN−γを産生する能力を与える。
ii.無細胞アッセイ
別の態様において、指標組成物は無細胞組成物である。宿主細胞もしくは培地中で組換え法により発現されたT−betが関与する経路においてT−betの上流もしくは下流で作用するT−betもしくは非T−betポリペプチドを、ポリペプチドの標準的精製方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびT−betに特異的な抗体との免疫親和性精製を使用して宿主細胞もしくは細胞培地から単離して無細胞組成物中で使用できるタンパク質を生成することが可能である。あるいは、無細胞組成物として使用するために、T−betもしくは非T−bet発現細胞の抽出物を調製することができる。
1つの態様では、T−bet活性を特異的に調節する化合物は、T−betが結合する標的分子とT−betとの相互作用を調節するそれらの能力に基づき同定される。標的分子はDNA分子、例えばサイトカイン遺伝子の制御領域のようなT−bet応答性要素)、またはポリペプチド分子、例えばTecキナーゼであり得る。タンパク質−タンパク質相互作用(例えば免疫沈降、蛍光偏光もしくはエネルギー伝達、2ハイブリッドアッセイ等)の検出を可能とする、または標的DNA配列とDNA結合タンパク質との間の相互作用の検出を可能とする(例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、DNアーゼIフットプリンティングアッセイ等)適切なアッセイが当該技術分野で既知である。試験化合物の存在および不存在下でそのようなアッセイを行うことにより、これらのアッセイを使用して標的分子とT−betとの相互作用を調節する(例えば阻害するもしくは高める)化合物を同定することができる。
1つの態様において、試験化合物の存在下での標的分子へのT−betの結合の量は、試験化合物の不存在下での標的分子へのT−betの結合の量より大きく、この場合は試験化合物がT−betの結合を高める、または安定化する化合物と同定される。別の態様では、試験化合物の存在下での標的分子へのT−betの結合の量は、試験化合物の不存在下での標的分子へのT−betの結合の量より少なく、この場合は試験化合物がT−betの結合を阻害する、または不安定化する化合物と同定される。
T−betポリペプチドへの試験化合物の結合は、上記のように直接もしくは間接的いずれかで測定できる。試験化合物に結合するT−betポリペプチドの能力を測定することはまた、リアルタイム生体分子相互作用分析(Biomolecular Interaction Analysis)(BIA)のような技術を使用しても達成し得る(Sjolander,S.and Urbaniczky,C.(1991)Anal.Chem.63:2338−2345;Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699−705)。本明細書で使用されるところの「BIA」は相互作用体のいずれも標識することなくリアルタイムで生物特異的相互作用を研究するための技術である(例えばバイアコア(BIAcore))。表面プラスモン共鳴(SPR)の光学的現象の変化を、生物学的分子間のリアルタイム反応の表示として使用することができる。
T−betポリペプチドと標的分子との間の相互作用を調節する試験化合物を同定する
本発明の方法において、完全長のT−betポリペプチドを方法で使用することができ、あるいはT−betの部分のみを使用することができる。T−betポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度は、例えばポリペプチドの一方を検出可能な物質(例えば放射標識)で標識し、非標識ポリペプチドを単離し、そして非標識ポリペプチドと会合するようになった検出可能な物質の量を定量することにより測定可能である。このアッセイを使用してT−betタンパク質と標的分子との間の相互作用を刺激もしくは阻害するいずれかの試験化合物を同定することができる。T−betポリペプチドと標的分子との間の相互作用を刺激する試験化合物は、試験化合物の不存在下での相互作用の程度と比較して、T−betポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度を増大させるその能力に基づいて同定される。T−betポリペプチドと標的分子との間の相互作用を阻害する試験化合物は、化合物の不存在下での相互作用の程度と比較して、T−betポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度を減少させるその能力に基づいて同定される。
本発明の上記アッセイ方法の1より多くの態様において、例えば複合体形成されない形態のポリペプチドの一方もしくは双方からの複合体形成された形態の分離を促進するため、またはアッセイの自動化に適応させるために、T−betもしくはT−bet標的分子のいずれか、例えばキナーゼのいずれかを固定することが望ましいかもしれない。試験化合物の存在および不存在下での試験化合物のT−betポリペプチドへの結合、またはT−betポリペプチドのT−bet標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器中で行うことができる。こうした容器の例にはマイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管を含む。1つの態様において、ポリペプチドの一方もしくは双方をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/T−bet融合タンパク質もしくはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(シグマケミカル(Sigma Chemical)、ミズーリ州セントルイス)もしくはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、これらは次いで試験化合物または試験化合物および吸着されない標的ポリペプチドもしくはT−betポリペプチドのいずれかと組合せ、そして混合物を複合体形成に伝導性の条件下で(例えば塩およびpHについて生理学的条件で)インキュベーションする。インキュベーション後にビーズもしくはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄していかなる未結合の化合物も除去し、ビーズの場合はマトリックスを固定し、そして例えば上記のような直接もしくは間接的のいずれかで複合体形成を測定する。あるいは複合体をマトリックスから解離させ、そして標準的技術を使用してT−bet結合もしくは活性のレベルを測定できる。
マトリックス上にポリペプチドを固定するための他の技術もまた本発明のスクリーニングアッセイで使用可能である。例えば、T−betポリペプチドもしくはT−bet標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化T−betポリペプチドもしくは標的分子を、当該技術分野で既知の技術(例えばビオチニル化キット、ピアスケミカルズ(Pierce Chemicals)、イリノイ州ロックフォード)を使用してビオチン−NHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)から調製することができ、そしてストレプトアビジン被覆96ウェルプレート(ピアス ケミカル)のウェル中に固定化することができる。あるいは、T−betポリペプチドもしくは標的分子と反応性であるが、しかしT−betポリペプチドのその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、そして未結合の標的もしくはT−betポリペプチドを抗体結合によりウェル中で捕捉する。そのような複合体の検出方法は、GST固定化複合体について上記のものに加え、T−betポリペプチドもしくは標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびにT−betポリペプチドもしくは標的分子と関連する酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを含む。
本発明のさらに別の観点では、T−betに結合するかもしくはそれと相互作用し(「T−bet結合タンパク質」もしくは「T−bet」)、そしてT−bet活性に関与する他のポリペプチドを同定するための2ハイブリッドアッセイもしくは3ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号明細書;Zervos et al.(1993)Cell 72:223−232;Madura et al.(1993)J.Biol.Chem.268:12046−12054;Bartel et al.(1993)Biotechniques 14:920−924;Iwabuchi et al.(1993)Oncogene 8:1693−1696;およびBrent 第WO94/10300号明細書を参照されたい)において、T−betポリペプチドもしくはそのフラグメントを「餌(bait)タンパク質」として使用することができる。そのようなT−bet結合タンパク質もまた、例えばT−bet媒介型のシグナリング経路の下流の要素としてT−betポリペプチドもしくはT−bet標的によるシグナルの伝播に関与していると思われる。あるいは、そのようなT−bet結合ポリペプチドはT−betインヒビターであるらしい。
2ハイブリッド系は、分離可能なDNA結合および活性化ドメインよりなる大部分の転写因子のモジュールの性質に基づく。簡単に説明すると、このアッセイは2種の異なるDNA構築物を利用する。1つの構築物において、T−betポリペプチドをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えばGAL−4)のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。もう1つの構築物において、未同定のタンパク質(「餌食(prey)」もしくは「サンプル」)をコードするDNA配列のライブラリーからのDNA配列を既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「餌」および「餌食」タンパク質はin vivoで相互作用することが可能であり、T−bet依存性の複合体を形成し、転写因子のDNA結合および活性化ドメインが近い近接にもたらされる。この近接が、転写因子に応答性の転写調節部位に操作可能に連結されているレポーター遺伝子(例えばLacZ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、そして機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離することができ、そしてT−betポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローン化された遺伝子を得るのに使用することができる。
別の態様において、T−bet標的遺伝子を単離するための発現差解析法(representational difference analysis)(RDA)およびマイクロチップDNAアレイ分析。例えば、減算(subtracted)もしくは未減算プローブを使用するPCRと結合したディファレンシャルディスプレイもしくはサブトラクション法(RDA;例えばHubank,M.and Schatz,D.G.1994.Nuc.Acid Res.22、5640−5648;Chang,Y.et al.1994.Science 266、1865;von Stein,O.D.et al.1997.Nuc.Acid Res.25、2598;Lisitsyn,N.and Wigler,M.1993.Science 259、946を参照されたい)、またはより最近ではDNAマイクロチップアレイハイブリダイゼーション(Welford et al.1998.Nucl.Acids.Res.15:3059)を使用することができる。こうしたアッセイの実施において多様な細胞を使用でき、例えば正常細胞、T−betを発現するよう工作された細胞、またはT−betを欠くもしくはT−betを過剰発現するマウスから(例えばトランスジェニック非ヒト動物から)の細胞を使用することができる。
さらに別の態様において、T−bet標的タンパク質を記載するためのプロテオミクスのアプローチを実施することができる。例えば、減算分析、発現パターンの分析、タンパク質レベルでの遺伝子型変異の同定およびタンパク質同定ならびに翻訳後修飾の検出を、
例えばWang et al.(2002)J.Chromatogr.B.Technol.Biomed Life Sci.782(1−2):291−306;Lubman et al.(2002)J.Chromatogr.B.Technol.Biomed Life Sci.782(1−2):183−96;およびRai et al.(2002)Arch.Pathol.Lab.Med.126(12):1518−26に記載されているとおりに行うことができる。
C.T−bet欠損細胞を使用するアッセイ
別の態様において、本発明はT−betが欠損の細胞を使用したT−betの生物学的影響を調節する化合物の同定方法を提供する。前に記載したとおり、B細胞における(例えばT−bet遺伝子の破壊による)T−bet活性の阻害は、IgG2a産生の欠損をもたらす。従ってT−betが欠損の細胞を使用して、T−betそれ自身を調節すること以外の手段によりT−betにより調節される生物学的応答を調節する作用物質を同定し得る(すなわちT−bet欠損表現型を「救助する」化合物)。あるいは、T−bet遺伝子が条件付様式で非機能的にされている「条件付ノックアウト」系を使用して、スクリーニングアッセイでの使用のためのT−bet欠損細胞を作成し得る。例えば国際公開第94/29442号明細書および米国特許第5,650,298号明細書に記載されている遺伝子の条件付破壊のためのテトラサイクリンに調節される系を使用して細胞もしくはそれから細胞を単離可能であるT−bet欠損動物を作出することができ、それらは細胞と接触するテトラサイクリン濃度の調節を介して制御された様式でT−bet欠損にされることができる。T−betの他の生物学的効果に関するアッセイに、類似の条件付破壊の取り組みを使用することができ、あるいはRAG−2欠損胚盤胞補完系を使用して、T−bet遺伝子のホモ接合性突然変異を伴う胚幹細胞から生じるリンパ系器官をもつマウスを作出することができる。こうした動物からのT−bet欠損リンパ系細胞(例えば胸腺、脾および/もしくはリンパ節細胞)または精製されたT−bet欠損B細胞をスクリーニングアッセイで使用し得る。
スクリーニング法では、T−betが欠損の細胞を試験化合物と接触させ、そしてT−betにより調節される生物学的応答を監視する。T−bet欠損細胞における応答の調節(例えば未処理細胞もしくは対照作用物質で処理した細胞のような適切な対照と比較した)が、試験化合物をT−betに調節される応答の調節物質と同定する。
1つの態様において、試験化合物を非ヒトT−bet欠損動物、好ましくはマウス(例えばT−bet遺伝子が上記の手段により条件付で破壊されているマウス、もしくはリンパ系器官が上記のようT−betが欠損であるキメラマウス)に直接投与して、T−betが欠損の細胞のin vivo応答を調節する試験化合物を同定する。別の態様では、T−betが欠損の細胞を非ヒトT−bet欠損動物から単離し、そしてex vivoで試験化合物と接触させてT−betが欠損の細胞中でT−betにより調節される応答を調節する試験化合物を同定する。
T−betが欠損の細胞はT−betが欠損であるように作出された非ヒト動物から得ることができる。好適な非ヒト動物にはサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジを含む。好適な態様では、T−bet欠損動物はマウスである。T−betが欠損のマウスは実施例に記述されるとおり作出し得る。特定の1遺伝子産物が欠損の非ヒト動物は、典型的には相同的組換えにより作出する。簡単に説明すると、欠失、付加もしくは置換が導入され、それにより内因性のT−bet遺伝子を変える、例えば機能的に破壊するT−bet遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを調製する。T−bet遺伝子は好ましくはマウスT−bet遺伝子である。例えば、マウスT−bet遺伝子はマウスT−bet cDNAをプローブとして使用してマウスゲノムDNAライブラリーから単離し得る。次いでマウスT−bet遺伝子を使用してマウスゲノム中の内因性のT−bet遺伝子を改変するのに適する相同的組換えベクターを構築し得る。好適な態様では、相同的組換えに際して内因性のT−bet遺伝子が機能的に破壊されるようなベクターを設計する(すなわち、機能的ポリペプチドをもはやコードしない;「ノックアウト」ベクターともまた称される)。あるいは相同的組換えに際して、内因性のT−bet遺伝子が突然変異されるか、またはそうではなく改変されるがしかし機能的ポリペプチドをなおコードするようなベクターを設計し得る(例えば上流の制御領域を変えてそれにより内因性のT−betポリペプチドの発現を変えることができる)。相同的組換えベクターにおいて、T−bet遺伝子の改変部分はその5’および3’端でT−bet遺伝子の付加的な核酸により隣接されて、該ベクターにより運ばれ外因性のT−bet遺伝子と胚幹細胞中の内因性のT−bet遺伝子との間で相同的組換えを可能とする。付加的な隣接するT−bet核酸は内因性遺伝子との成功裏の相同的組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接DNA(5’および3’双方の端で)がベクターに包含される(例えば、相同的組換えベクターの記述についてThomas,K.R. and Capecchi,M.R.(1987)Cell 51:503を参照されたい)。ベクターを胚幹細胞株に(例えば電気穿孔法により)導入し、そして導入されたT−bet遺伝子が内因性のT−bet遺伝子と相同的に組換わった細胞を選択する(例えばLi,E.et al.(1992)Cell 69:915を参照されたい)。次いで選択された細胞を動物(例えばマウス)の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成させる(例えば、奇形ガンおよび胚性幹細胞:実践的取り組み(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach)、E.J.Robertson編(IRL、オックスフォード、1987)中、Bradley,A.、pp.113−152を参照されたい)。次いでキメラ胚を適する偽妊娠雌性育成動物中に埋植し、そして胚を分娩までもたらすことができる。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたDNAをもつ子孫を使用して、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同的に組換えられたDNAを含有する動物を繁殖し得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Bradley,A.(1991)Current Opinion in Biotechnology 2:823−829ならびにLe Mouellec et al.によるPCT国際公開第90/11354号明細書;Smithies et al.による同第91/01140号明細書;Zijlstra et al.による同第92/0968号明細書;およびBerns et al.による同第93/04169号明細書にさらに記載されている。
別の態様において、野性型およびT−betヌル双方のマウスからのドナー骨髄細胞のレトロウイルス形質導入を、照射されたRAGレシピエントを再構成するためにDNすなわちドミナントネガティブ構築物を用いて行うことができる。これは、そのリンパ系細胞がドミナントネガティブバージョンのT−betのみを発現するマウスの生産をもたらすことができる。次いでこれらのマウスからのB細胞を、T−betにより調節される生物学的応答を調節する化合物について試験することができる。
スクリーニングアッセイの1つの態様において、T−betにより調節される生物学的応答を調節するそれらの能力について試験された化合物を、非ヒトT−bet欠損動物に試験化合物をin vivoで投与することによりT−bet欠損細胞と接触させ、そして該動物における応答に対する該試験化合物の影響を評価する。試験化合物は製薬学的組成物として非ヒトT−bet欠損動物に投与できる。こうした組成物は、典型的には試験化合物および製薬学的に許容し得る担体を含んでなる。本明細書で使用する用語「製薬学的に許容できる担体」は、製薬学的投与と適合性のありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌性化合物、等張および吸収を遅らせる化合物等を含むことを意図している。製薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および化合物の使用は当該技術分野で周知である。任意の通常の媒体もしくは化合物が有効成分と不適合性である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が企図されている。補助的に活性な化合物もまた組成物中に包含することが可能である。
D.試験化合物
本明細書に記載するスクリーニングアッセイを使用して、種々の試験化合物を評価することができる。ある態様では、試験されるべき化合物はライブラリーに由来することができる(すなわち化合物の1ライブラリーのメンバーである)。ペプチドのライブラリーの使用が当該技術分野で十分に確立されている一方、ベンゾジアゼピン(Bunin et
al.(1992).J.Am.Chem.Soc.114:10987;DeWitt et al.(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909)ペプトイド(Zuckermann.(1994).J.Med.Chem.37:2678)オリゴカルバメート(Cho et al.(1993).Science.261:1303−)、およびヒダントイン(DeWitt et al.上記)のような他の化合物の混合物の製造を可能にした新たな技術が開発された。104〜105の多様性をもつ低有機分子の分子ライブラリーの合成のための1つの取り組みが記載されている(Carell et al.(1994).Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059−;Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061−)。
本発明の化合物は:生物学的ライブラリー;空間的に接近可能な平行固相もしくは液相ライブラリー、デコンヴォリューションを必要とする合成ライブラリー法、「1ビーズ1化合物(one−bead one−compound)」ライブラリー法およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の取り組みのいずれを使用しても得ることができる。生物学的ライブラリーの取り組みは、ペプチドのライブラリーに制限される一方、他の4つの取り組みは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは低分子ライブラリーに応用可能である(Lam,K.S.(1997)Anticancer Compond Des.12:145)。分子ライブラリーの他の例示的合成方法は当該技術分野において、例えば:Erbら(1994).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422−;Horwellら(1996)Immunopharmacology 33:68−;およびGallopら(1994);J.Med.Chem.37:1233−に見出し得る。
化合物のライブラリーは、溶液中(例えばHoughten(1992)Biotechniques 13:412−421)、またはビーズ(Lam(1991)Nature 354:82−84)、チップ(Fodor(1993)Nature 364:555−556)、細菌(Ladner 米国特許第5,223,409号明細書)、スポア(Ladner 米国特許第’409号)、プラスミド上(Cull et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:1865−1869)もしくはファージ上(Scott and Smith(1990)Science 249:386−390);(Devlin(1990)Science 249:404−406);(Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378−6382);(Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301−310)に提示されているかもしれない;さらに別の態様において、コンビナトリアルポリペプチドはcDNAライブラリーから作成される。
活性についてスクリーニングできる例示的化合物は、限定するわけではないがペプチド、核酸、炭水化物、低有機分子および天然産物抽出物ライブラリーを含む。
候補/試験化合物は、例えば、1)Ig尾部をつけられた(tailed)融合ペプチ
ドならびにD−および/もしくはL−配置アミノ酸より作成されるランダムペプチドライブラリー(例えばLam,K.S.et al.(1991)Nature 354:82−84;Houghten,R.ら(1991)Nature 354:84−86を参照されたい)およびコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバーを包含する可溶性ペプチドのようなペプチド;2)ホスホペプチド(例えば無作為かつ部分的に縮重の定方向ホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えばSongyang,Z.et al.(1993)Cell 72:767−778を参照されたい);3)抗体(例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラおよび一本鎖抗体ならびにFab、F(ab’)、Fab発現ライブラリーフラグメントおよび抗体のエピトープ結合フラグメント);4)低有機および無機分子(例えばコンビナトリアルおよび天然産物のライブラリーから得られる分子);5)酵素(例えばエンドリボヌクレアーゼ、加水分解酵素、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、合成酵素、異性化酵素、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、酸化還元酵素およびATPアーゼ)、ならびに6)変異体の形態もしくはT−bet分子、例えばドミナントネガティブ突然変異体の形態の分子を含む。
本発明の試験化合物は:生物学的ライブラリー;空間的に接近可能な平行固相もしくは液相ライブラリー;デコンヴォリューションを必要とする合成ライブラリー法;「1ビーズ1化合物(one−bead one−compound)」ライブラリー法:およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の取り組みのいずれを使用しても得ることができる。生物学的ライブラリーの取り組みはペプチドのライブラリーに制限される一方、他の4つの取り組みは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは低分子ライブラリーに応用可能である(Lam,K.S.(1997)Anticancer Compond Des.12:145)。
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野で例えば:DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909;Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422;Zuckermannら(1994)J.Med.Chem.37:2678;Cho et al.(1993)Science 261:1303;Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;およびGallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233に見出し得る。
化合物のライブラリーは、溶液中(例えばHoughten(1992)Biotechniques 13:412−421)またはビーズ(Lam(1991)Nature 354:82−84)、チップ(Fodor(1993)Nature 364:555−556)、細菌(Ladner 米国特許第5,223,409号明細書)、スポア(Ladner 米国特許第’409号)、プラスミド(Cull et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:1865−1869)もしくはファージ上(Scott and Smith(1990)Science 249:386−390;Devlin(1990)Science 249:404−406;Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378−6382;Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301−310;Ladner 上記)に提示されているかもしれない。
主題のスクリーニングアッセイで同定される化合物は、T−betにより調節される生物学的応答の1もしくは複数の調節方法で使用することができる。こうした化合物(1も
しくは複数)を細胞と接触させる前にそれらを製薬学的組成物(上記のような)として配合することが望ましいかもしれないことが理解されるであろう。
T−bet発現および/もしくは活性を直接もしくは間接的に調節する試験化合物が、上記の多様な方法の1つによりいったん同定されれば、選択された試験化合物(もしくは「目的の化合物」)を次いで例えばin vivo(例えば目的の化合物を個体に投与することにより)もしくはex vivo(例えば個体から細胞を単離し、そして単離された細胞を目的の化合物と接触させることにより、あるいは目的の化合物を細胞株と接触させることにより)のいずれかで細胞と目的の化合物を接触させること、および適切な対照(未処理の細胞または生物学的応答を調節しない対照化合物もしくは担体で処理した細胞のような)と比較して細胞に対する目的の化合物の影響を決定することにより、細胞に対するその影響についてさらに評価することができる。目的の化合物はまた当該技術分野で既知の技術を使用した構造に基づく薬物設計を使用しても同定可能である。
また本発明は上のアッセイで同定される化合物に関する。
VI.T−betにより調節される生物学的応答の調節方法
本発明の別の観点は、細胞中でのT−bet発現および/または活性の調節方法に関する。本発明の調節方法は、Th2細胞系譜コミットメントが調節されるようなTh2細胞系譜コミットメントを調節する作用物質と細胞を接触させることが関与する。T−bet発現および/または活性が細胞中で調節されるために、T−betの発現および/または活性を調節するのに十分な量の調節剤と細胞を接触させる。
1つの態様では、本発明の調節方法はin vitroで行われる。別の態様では、本発明の調節方法はin vivoで、例えばTh2細胞系譜コミットメントの調節から利益を得る障害もしくは状態を有する個体中で実施される。
作用物質は、(例えば、細胞を例えばそれが相互作用する分子へのT−betの結合を妨害する、T−betの結合特異性を変える、またはT−betを翻訳後修飾する作用物質と接触させることにより)細胞中でのT−betポリペプチドの活性、または(例えばT−bet遺伝子の転写もしくはT−bet mRNAの翻訳を調節することにより)T−betもしくは結合パートナーの発現を調節することにより作用することができる。
従って本発明は、生物学的応答が調節されるように、調節物質と細胞を接触させることによる、Th2細胞系譜コミットメントを調製する方法を特徴とする。
別の態様では、T−betにより転写が直接調節される遺伝子を、本発明の方法を使用して調節することができる。1つの態様では、本方法はin vitroで実施し得る。好ましい態様では、T−betはin vitroで細胞中で調節可能であり、次いで処理された細胞を個体に投与することができる。
また主題の発明はTh2細胞系譜コミットメントの調節から利益を得る多様な状態もしくは障害を治療するためにも使用することができる。Th2細胞系譜コミットメントの調節によって利益を得る例示的障害を本明細書で説明する。1つの態様において本発明は、障害を処置または防止するように、T細胞中でItk媒介型のT−betおよびGATA3の結合を減少させる調節から利益を得る障害を持つ個体に、治療に有効な量の作用物質を投与することによりin vivoでのTh2サイトカイン生産の直接的調節を提供する。例えば、自己免疫障害もしくは免疫不全を処置するためにTh2サイトカイン生産を調節することができる。
「個体」という用語は免疫応答を導き出すことができる生存生物体を含むことを意図している。好ましい個体は哺乳動物である。とりわけ好ましい個体はヒトである。個体の他の例はサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ならびに他の家畜および同伴動物を含む。ヒトならびに家畜の応用におけるT−bet発現および/または活性の調節は多様な疾患状態において異常なT−bet発現および/もしくは活性から生じる障害を調節する手段を提供し、そして本発明により包含される。
化合物のような調節剤は製薬学的組成物として個体に投与し得る。こうした組成物は典型的に調節剤および製薬学的に許容し得る担体を含んでなる。本明細書で使用する用語「製薬学的に許容し得る担体」とは、製薬学的投与と適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを包含することを意図している。製薬学的に活性な物質のためのこうした媒体および作用物質の使用は、当該技術分野で周知である。任意の通例の媒体もしくは作用物質が活性化合物と不適合性である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が企図されている。補助的な有効成分もまた組成物中に包含することができる。製薬学的組成物は上の小区分IVで記載されたとおり調製できる。
本明細書に記載するTh1細胞の発生の、およびTh2表現型の直接的抑制における重要な調節物質としてのT−betの同定は、本発明の調節方法を使用する多様な臨床状況におけるT細胞サブセットの選択的操作を可能とする。本発明の1つの方法は(すなわち、Tbet/GATA3/Tecキナーゼ間の複合体の形成または安定性を上げる方法)、Th2サイトカインの生産の減少、すなわちTh2応答のダウンモジュレーションをもたらす。対照的に本発明の別の方法では(すなわちT−bet/GATA3/Tecキナーゼ間の複合体の形成または安定性を下げる方法)、Th2サイトカインの生産が上昇し、これによりTh2応答が促進する。このようにTh2応答が有害な疾患状態を処置するために、Th2応答がダウンレギュレートされるような複合体の形成を安定化または増す方法(刺激法)が選択される。あるいはTh2応答が有益である疾患状態を処置するために、Th2応答が促進されるような複合体の安定性を下げ、または形成を下げる方法(阻害法)が選択される。疾患または状態の処置に対する本発明の方法の適用は、該状態の治癒、長期もしくは短期いずれかの該状態と関連する症状のタイプもしくは数の減少(すなわち状態の軽減)または単純に個体に対して一過性の有益な効果をもたらすかもしれない。
優勢なTh1もしくはTh2型応答を伴う多数の疾患もしくは状態が同定されており、そして疾患状態に罹っている個体に高まった応答の型の調節によって利益を得ることができる。こうした疾患もしくは状態への本発明の免疫調節方法の応用を下にさらに詳細に記述する。
A.アレルギー
アレルギーは、その生産がTh2細胞の活性およびそれにより生産されるサイトカインにより調節されるIgE抗体により媒介される。アレルギー反応では、IL−4がTh2細胞により生産され、これはIgE抗体の生産およびアレルギー反応を媒介する細胞すなわち肥満細胞および好塩基球の活性化をさらに刺激する。またIL−4は好酸球媒介性の炎症反応でも重要な役割を演じる。従って病原となるIgE抗体の生産をダウンレギュレートする手段として、アレルギー患者におけるTh2関連サイトカインおよびとりわけIL−4の生産を阻害するために本発明の刺激方法を使用し得る。刺激剤は個体に直接投与でき、または細胞(例えばThp細胞もしくはTh2細胞)を個体から得、ex vivoで刺激剤と接触させ、そして個体への再投与を必要とする可能性がある。さらに、ある状況においては、刺激剤、もしくはアレルゲン特異的応答を阻害(例えば脱感作)するよう刺激剤で処理した細胞と一緒にアレルゲンを個体に共投与することが有益であるかもしれない。処置は、Th1型応答をさらに刺激するのに十分な量のサイトカインIL−12もしくはTh2関連サイトカインに対する抗体(例えば抗IL−4抗体)のような他のTh1促進剤をアレルギーの個体に投与することによりさらに高められるかもしれない。
B.癌
Th2を促進するサイトカインの発現が癌患者で上昇されることが報告されており(例えばYamamura,M.et al.(1993)J.Clin.Invest.91:1005−1010;Pisa,P.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7708−7712を参照されたい)、そして悪性疾患は疾患の経過の悪化と一緒にTh1型応答からTh2型応答への移動をしばしば伴う。従って本発明の刺激方法は、Th1からTh2への移動を打ち消し、そしてそれにより癌患者における進行中のTh1応答を促進して疾患の経過を改善する手段として、癌患者におけるTh2関連サイトカインの生産を阻害するために使用することができる。この刺激方法は、癌を有する個体への刺激剤の直接投与、または個体から得られた細胞(例えばThpもしくはTh2細胞)の刺激剤でのex vivo処置、次いで細胞の個体への再投与のいずれかを必要とする可能性がある。処置は、Th1型応答をさらに刺激するのに十分な量のIL−12またはTh2関連サイトカインに対する抗体(例えば抗IL−4抗体)のような他のTh1促進剤をレシピエントに投与することによりさらに高められるかもしれない。
C.感染性疾患
またTh2を促進するサイトカインの発現は、HIV感染症、結核、リーシュマニア症、住血吸虫病、糸状線虫感染症および腸管寄生線虫感染症を包含する多様な感染性疾患の間に増大することも報告されており(例えば;Shearer,G.M.and Clerici,M.(1992)Prog.Chem.Immunol.54:21−43;Clerici,M.and Shearer,G.M.(1993)Immunology Today 14:107−111;Fauci,A.S.(1988)Science 239:617−623;Locksley,R.M.and Scott,P.(1992)Immunoparasitology Today 1:A58−A61;Pearce,E.J.et al.(1991)J.Exp.Med.173:159−166;Grzych,J−M.et al.(1991)J.Immunol.141:1322−1327;Kullberg,M.C.et al.(1992)J.Immunol.148:3264−3270;Bancroft,A.J.et al.(1993)J.Immunol.150:1395−1402;Pearlman,E.et al.(1993)Infect.Immun.61:1105−1112;Else,K.J.et al.(1994)J.Exp.Med.179:347−351を参照されたい)、そしてこうした感染性疾患もまた免疫応答のTh1からTh2への移動を伴う。従って、本発明の刺激方法は、Th1からTh2への移動を打ち消し,そしてそれにより患者における進行中のTh1応答を促進して疾患の経過を改善する手段として感染性疾患を有する個体におけるTh2関連サイトカインの生産を阻害するために使用することができる。この刺激方法は、感染性疾患を有する個体への阻害剤の直接投与、または個体から得られた細胞(例えばThpもしくはTh2細胞)の刺激剤でのex vivo処置、次いで細胞の個体への再投与のいずれかが関与し得る。処置は、Th1型応答をさらに刺激するのに十分な量のサイトカインIL−12もしくはTh2関連サイトカインに対する抗体(例えば抗IL−4抗体)のような他のTh1促進剤をレシピエントに投与することによりさらに高められるかもしれない。
D.自己免疫疾患
本発明の阻害方法は、Th2型の機能不全を伴う自己免疫疾患の処置において治療的に使用することができる。多くの自己免疫障害は自己組織に対し反応性であり、シかモ疾患
の病理に関与するサイトカインおよび自己抗体の生産を促進するT細胞の不適切な活性化の結果である。Tヘルパー型応答の調節は自己免疫疾患の経過に対する影響を有する可能性がある。例えば、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)において、疾患の誘導の時点でのIL−4の投与によるTh2型応答の刺激は、自己免疫疾患の強度を減少させる(Paul,W.E.et al.(1994)Cell 76:241−251)。さらに、疾患からの動物の回復は、Th2特異的サイトカインの増大により示されるTh2型応答の増大を伴うことが示された(Koury,S.J.et al.(1992)J.Exp.Med.176:1355−1364)。さらに、EAE分抑制し得るT細胞はTh2特異的サイトカインを分泌する(Chen,C.et al.(1994)Immunity 1:147−154)。EAEにおけるTh2型応答の刺激は疾患に対する保護効果を有するため、多発性硬化症(EAEはそのモデルである)を有する個体におけるTh2応答の刺激は治療上有益であると思われる。本発明の阻害方法はそのような減少を遂げるために使用し得る。
同様にマウスのI型糖尿病におけるTh2型応答の刺激は、疾患に対する保護効果を提供する。事実、IL−4(Th2応答を促進する)でのNODマウスの処置は、これらのマウスで通常発症するI型糖尿病の発症を予防するかもしくは遅らせる(Rapoport,M.J.et al.(1993)J.Exp.Med.178:87−99)。従って、糖尿病に罹患しているか、もしくはそれに罹患し易い個体において、例えば複合体のインヒビターを使用したTh2応答の刺激は、疾患の影響を改善するかもしくは疾患の発症を抑制するかもしれない。
Th2型応答の刺激が有益であるかもしれないさらに別の自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ(RA)である。研究は慢性関節リウマチを持つ患者が滑膜組織中で顕著にTh1細胞を有することを示した(Simon,A.K.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8562−8566)。RAを伴う個体においてTh2応答を刺激することにより、有害なTh1応答が同時にダウンレギュレートされ、それにより該疾患の影響を改善する可能性がある。
従って本発明の阻害方法を使用して、Th2型応答が疾患の経過に対し有益である自己免疫疾患に罹患しているか、もしくはそれに罹患し易い個体におけるTh2関連サイトカインの生産を刺激することができる。該阻害方法には、個体への阻害剤の直接投与、または個体から得られた細胞(例えばThp、Th1細胞、B細胞、非リンパ系細胞)の阻害剤でのex vivo処置、次いで細胞の個体への再投与のいずれかを必要とする可能性がある。該処置は、Th2型応答をさらに刺激するのに十分な量のIL−4それ自体、またはTh1関連サイトカインに対する抗体のような他のTh2促進剤を個体に投与することによりさらに高められるかもしれない。
Th2応答が望ましい上記の自己免疫疾患と対照的に、他の自己免疫疾患はTh1型応答により改善されるかもしれない。そのような疾患は本発明の刺激剤(癌および感染性疾患について上記したような)を使用して治療することができる。該処置は、Th1型応答をさらに刺激するのに十分な量のTh1を促進するサイトカイン(例えばIFN−γ)を個体に投与することによりさらに高められるかもしれない。
自己免疫疾患を治療するための作用物質の効力は、上記のヒト疾患の動物モデル(例えば多発性硬化症のモデルとしてのEAEおよび糖尿病のモデルとしてのNODマウス)、またはヒト自己免疫疾患の他の十分に特徴づけられた動物モデルで試験することができる。こうした動物モデルは紅斑性狼瘡のモデルとしてのmrl/lpr/lprマウス、慢性関節リウマチのモデルとしてのマウスコラーゲン誘発性関節炎およびマウス実験的重症筋無力症を含む(Paul編、基礎免疫学(Fundamental Immunology)、レイバンプレス(Raven Press)、ニューヨーク、1989、pp.840−856を参照されたい)。本発明の調節(すなわち刺激もしくは阻害)剤を試験動物に投与し、そして該試験動物における疾患の経過を、次いで使用されている特定のモデルについての標準的方法により監視する。調節剤の効力は、未処理の動物(もしくは対照作用物質で処理された動物)と比較して、作用物質で処理された動物における疾患状態の改善により示される。
本発明に従い処置されうる自己免疫成分を有する自己免疫疾患、障害および状態の非制限的例には、糖尿病、関節炎(慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む)、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎(アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む)、乾癬、シェーグレン症候群に続発性の乾性角結膜炎を包含するシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物の咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、化合物発疹、らい境界反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴覚障害、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーヴス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎ならびに間隙性肺線維症がある。
特定の態様において、本発明の方法により治療され得る疾患、障害および状態は、ヒトにおける炎症性腸疾患(IBD)の2つの主要な形態であるクローン病および潰瘍性大腸炎を含む。Tリンパ球により生産されるサイトカインが慢性の腸の炎症を開始かつ永続させるようである。クローン病はIFN−γおよびTNFのようなTヘルパー1(Th1)型サイトカインの増大された生産を伴う。潰瘍性大腸炎は一般に大量のTh2型サイトカインを生産するT細胞を伴い、そして本明細書で「Th2媒介型大腸炎」と称される。「Th1媒介型大腸炎」は、クローン病のプロファイルならびに潰瘍永大腸炎で起こり得るTh1型応答を指す。Th1媒介型大腸炎においてはT−betの活性を阻害する作用物質が保護効果を提供する。Th2媒介型大腸炎においてはT−betの活性を刺激する作用物質が保護効果を提供する。
別の特定の態様において、本発明の方法により治療され得る疾患、障害および状態は喘息を包含し、これはこれらの気道の狭窄を特徴とする気管支管もしくは肺の気道の疾患である。IL−4、IL−5およびIL−13の生産が喘息様表現型の発生と関連づけられている。従って、T−betの活性を刺激する本発明の作用物質は、喘息に対する保護効果を提供する。
E.移植
移植片拒絶もしくは移植片受容は、移植片レシピエントにおけるの特定のT細胞サブセット(すなわちTh1もしくはTh2細胞)の作用に独占的に帰されないかもしれないが(論考について、Dallman,M.J.(1995)Curr.Opin.Immunol.7:632−638を参照されたい)、一方、多数の研究が長期の移植片生存における優勢なTh2応答または移植片拒絶における優勢なTh1応答と結び付けられてきた。例えば、移植片受容はTh2サイトカインパターンの生産を伴い、かつ/もしくは移植片拒絶はTh1サイトカインパターンの生産を伴う(例えばTakeuchi,T.et al.(1992)Transplantation 53:1281−1291;Tzakis,A.G.et al.(1994)J.Pediatr.Surg.29:754−756;Thai,N.L.et al.(1995)Transplantation 59:274−281を参照されたい)。加えて、Th2サイトカイン表現型を有する細胞の養子移入は皮膚移植片の生存を延長させ(Maeda,H.ら(1994)Int.Immunol.6:855−862)、しかも対宿主性移植片病を低下させる(Fowler,D.H.et al.(1994)Blood 84:3540−3549;Fowler,D.H.et al.(1994)Prog.Clin.Biol.Res.389:533−540)。さらに、Th2分化を促進するIL−4の投与は心同種移植片の生存を延長させる(Levy,A.E.and Alexander,J.W.(1995)Transplantation 60:405−406)一方、抗IL−10抗体(Th1分化を促進する)と共にIL−12の投与は皮膚同種移植片の拒絶を高める(Gorczynski,R.M.et al.(1995)Tlansplantation 60:1337−1341)。
従って、本発明の阻害方法を使用して、移植レシピエントにおけるTh2関連サイトカインの生産を刺激して移植片の生存を延長させることができる。該阻害方法は充実性臓器移植および骨髄移植(例えば対宿主性移植片病を阻害するための)の双方で使用し得る。この阻害方法は、移植レシピエントへの阻害剤の直接投与、または個体から得られた細胞(例えばThp、Th1細胞、B細胞、非リンパ系細胞)の阻害剤でのex vivo処置、続いて細胞の個体への再投与のいずれかを必要とする可能性がある。この処置は、Th2型応答をさらに阻害するのに十分な量のIL−4それ自身もしくはTh1関連サイトカインに対する抗体のような他のTh2促進剤をレシピエントに投与することによりさらに高められるかもしれない。
前記の疾患状況に加え、本発明の調節方法は他の目的にもまた有用である。例えば、本発明の刺激方法(すなわち刺激剤を使用する方法)を使用して、Th1を促進するサイトカイン(例えばインターフェロン−γ)の商業的生産のためにin vitroでのこれらのサイトカインの生産を刺激し得る(例えば、細胞をin vitroで刺激剤と接触させてインターフェロン−γ生産を刺激することができ、そして、インターフェロン−γを培養上清から回収し、必要な場合はさらに精製しかつ商業的使用のため包装できる)。
さらに、本発明の調節方法は個体における目的の抗原に対するTh1もしくはTh2いずれかの応答を促進するためのワクチン接種に応用可能である。すなわち、本発明の作用物質はTh1応答もしくはTh2応答いずれかに対するワクチンに免疫応答を向けるためのアジュバントとして作用し得る。例えば、目的の抗原に対する抗体応答を促進するために(すなわちワクチン接種の目的上)、本発明の抗原および阻害剤を個体に共投与して、個体における抗原に対するTh2応答を促進することが可能である。Th2応答は効率的なB細胞援助(help)を提供し、しかもIgG1生産を促進するためである。あるいは、目的の抗原に対する細胞性免疫応答を促進するために、本発明の抗原および刺激剤を個体に共投与して個体における抗原に対するTh1応答を促進することが可能である。Th1応答は細胞媒介性免疫応答(例えば遅延型過敏性応答)の発生に好都合であるためである。目的の抗原および調節剤は一緒に単一の製薬学的組成物に、または別個の組成物に配合することができる。好ましい態様では、目的の抗原および調節剤は個体に同時に投与する。あるいは特定の状況では、抗原を最初に、次いで調節剤を投与することが望ましいかもしれないか、もしくは逆もまた真である(例えば、Th1応答を天然に惹起する抗原の場合、最初に該抗原を単独で投与してTh1応答を刺激し、そしてその後阻害剤を単独でもしくは抗原の追加免疫と一緒に投与して免疫応答をTh2応答に移動させることが有益であるかもしれない)。
VII.本発明のキット
本発明の別の観点は、本発明のスクリーニングアッセイ、調節方法または診断アッセイを行うためのキットに関する。例えば、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットには、T−betを含有する指標組成物、読み取り(例えばポリペプチド分泌)
を測定するための手段、およびT−betの生物学的影響の調節物質を同定するためのキットの使用説明書を含むことができる。別の態様において、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットは、T−bet欠損細胞、読み出しを測定するための手段およびT−betの生物学的影響の調節物質を同定するためのキットの使用説明書を含んでなる。
別の態様において、本発明は本発明の調節方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、例えばT−betの生物学的影響を調節するための調節物質の使用説明書とともに、適する担体中および適する容器中に包装された本発明の調節剤(例えばT−bet阻害もしくは刺激剤)を包含し得る。
本発明の別の観点は、個体におけるT−betの生物学的活性と関連する障害を診断するためのキットに関する。このキットは、T−betの発現を測定するための試薬(例えばT−bet mRNAを検出するための核酸プローブまたはT−betポリペプチドの検出のための抗体)、個体の結果を比較する対照および診断目的上の該キットの使用説明書を包含し得る。
VIII.免疫調節組成物
Th2細胞系譜コミットメントを調節する作用物質は、免疫調節組成物での使用にもまた適切である。本発明の刺激または阻害剤は、個体における免疫応答をアップもしくはダウンレギュレートするのに使用可能である。好適な態様において、体液性免疫応答が調節される。
Th2細胞系譜コミットメントを調節する作用物質は、単独で、またはそれに対する高められた免疫応答もしくは低下した免疫応答が望ましい抗原とともに投与し得る。
別の態様において、既知のアジュバントである作用物質を主題の調節剤とともに投与可能である。現時点で、ヒトで広範に使用されている唯一のアジュバントはミョウバン(リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム)である。サポニンおよびその精製された成分Quil A、フロイントの完全アジュバントならびに研究および獣医学の応用で使用される他のアジュバントが、ヒトワクチンにおける潜在的使用を有する。しかしながらムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドA、Goodman−Snitkoff et al.J.Immunol.147:410−415(1991)により記載されるもののようなリン脂質複合物、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤、酵素阻害剤は膵トリプシンインヒビターを含み、フルオロリン酸ジイソプロピル(DEP)およびトラシロールのような新たな化学的に定義された製剤もまた使用し得る。抗原が投与される態様においては、抗原は例えばMiller et al.,J.Exp.Med.176:1739−1744(1992)により記載され、そして本明細書で引用することにより編入されるプロテオリポソーム内に、もしくはノバソーム(Novasome)TM脂質小胞(マイクロベシキュラーシステムズインク(Micro Vesicular Systems,Inc.)、ニューハンプシャー州ナシュア)のような脂質小胞中に被包化して免疫応答をさらに高めることができる。
1つの態様において、Th2細胞系譜コミットメントをコードする核酸分子をDNAワクチンとして投与する。これはレポーターもしくは治療用遺伝子の送達に用いられるものに類似するプラスミドDNA構築物を使用して行うことができる。そのような構築物は、好ましくは、大量の該プラスミドDNAの増幅を可能にする細菌の複製起点;原核生物の選択可能なマーカー遺伝子;T−betポリペプチドもしくはその部分をコードする核酸配列;宿主細胞中での遺伝子発現を指図する真核生物転写調節要素;および発現されるm
RNAの適切な終了を確実にするポリアデニル化配列を含んでなる(Davis.1997.Curr.Opin,Biotechnol.8:653)。DNA免疫感作に使用されるベクターは場合によってはシグナル配列を含んでもよい(Michel et al.1995.Proc.Natl.Acad.Sci USA.92:5307;Donnelly et al.1996.J.Infect Dis.173:314)。DNAワクチンは多様な手段により、例えば注入により(例えば、筋肉内、皮内、もしくは皮膚中に粒子を注入するのに粒子加速器もしくは加圧ガスを使用する遺伝子銃を用いる表皮中へのDNA被覆された金粒子の微粒子銃注入(Haynes et al.1996.J.Biotechnol.44:37))投与し得る。あるいは、DNAワクチンは非侵襲的手段により投与することができる。例えば純粋なもしくは脂質で処方されたDNAは、呼吸器系に送達し得るか、もしくはDNAの経口送達により別の場所に(例えばPeyers貼付剤)標的を定めることができる(Schubbert.1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:961)。弱毒化微生物は粘膜表面への送達に使用することができる。(Sizemore et al.1995.Science.270:29)。
1つの態様において、DNAワクチン接種のためのプラスミドは、Th2細胞系譜コミットメントを調節する作用物質、ならびに望ましい免疫応答に対する抗原を発現し得るか、またはリンホカイン遺伝子もしくは共刺激分子のような免疫応答の調節物質をコードし得る(Iwasaki et al.1997.J.Immunol.158:4591)。
別の態様では、レトロウイルスベクターもまたT−bet免疫調節組成物の発現に適切である。組換えレトロウイルスベクターは宿主細胞ゲノム中への導入遺伝子の組込みを可能とする。分裂細胞に形質導入するために、レンチウイルスベクターを免疫調節組成物として使用することができ、そして、本発明により包含することを意図している。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、それらのより高レベルの複雑さに基づけば、潜伏感染の経過でのように非増殖細胞のゲノム中に組込み、そしてそれらの生活環を調節することができる。これらのウイルスにはHIV−1、HIV−2、SIV、FIVおよびEIVを含む。他のレトロウイルスと同様、レンチウイルスはgagpolおよびenv遺伝子を有し、それらは2個の末端反復配列(LTR)の配列により隣接される。これらの遺伝子のそれぞれは、最初は1個の前駆体ポリタンパク質として発現される複数のポリペプチドをコードする。gag遺伝子は内的構造(マトリックスキャプシドおよびヌクレオキャプシド)ポリペプチドをコードする。pol遺伝子はRNAに指図されるDNAポリメラーゼ(逆転写酵素、組込み酵素およびプロテアーゼ)をコードする。env遺伝子はウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードし、そして付加的にウイルスRNAの核輸出を司るシス作用性エレメント(RRE)を含有する。
5’および3’LTRはビリオンRNAの転写およびポリアデニル化を促進するよう働き、そしてウイルス複製に必要な全ての他のシス作用性配列を含む。ゲノムの逆転写(tRNAプライマー結合部位)およびウイルスRNAの粒子中への効率的な被包化(Psi部位)に必要な配列が5’LTRに隣接する。被包化(すなわちレトロウイルスRNAの感染性ビリオンへのパッケージング)に必要な配列がウイルスゲノムから欠けている場合、その結果はゲノムRNAの被包化を予防するシス欠損である。しかしながら、生じる突然変異体は全ビリオンタンパク質の合成を指図することがなお可能である。HIVのようなレンチウイルスの包括的な総説は例えばField’s Virology(レイバンパブリッシャーズ(Raven Publishers))、B.N.Fields et al.編、1996に提供されている。
本発明は以下の実施例によりさらに具体的に説明され、これらは制限すると解釈される
べきでない。本出願を通じて引用される全部の参考文献、特許および公開特許出願の内容、ならびに図および配列表は引用することにより本明細書に編入する。
pJG4−5ベクターのEcoRI部位にクローン化されたマウスT−bet cDNAを含んでなる核酸分子を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(バージニア州、マナッサス)に、1999年11月9日に寄託し、そして寄託番号PTA−930を得たPCR2.1−TOPOベクターにクローン化されたヒトT−bet cDNA(ヒトTh1クローンROT−10に由来するRNAから調製した)を含んでなる核酸分子を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(バージニア州、マナッサス)に、2000年1月28日に寄託し、そして寄託番号PTA−1339を得た。両寄託ともブダペスト条約の下になされた。
実施例1.新規転写因子T−betのクローニング
IL−2プロモーターのTh1特異的領域は十分に限局されているため(Brombacher,F.et al.1994.Int.Immunol.6:189−197;Rooney,J.et al.1995.Mol.Cell.Biol.15、6299−6310;Lederer,J.A.et al.1994.J.Immunol.152、77−86;Durand,D.et al.1988.Mol.Cell.Biol.8、1715−1724;Hoyos,B.et al.1989.Science 244、457−450)、Th1特異的転写因子を同定するためにIL−2プロモーター−レポーター、およびOF6 Th1クローンから作成したcDNAライブラリーを使用する酵母1ハイブリッドアプローチを選んだ。この取り組みを検証するために、IL−4プロモーターのTh2特異的領域を酵母中で発現させ、そしてc−Mafの導入によりトランス活性化されることが示されたが、しかし数種の他の転写因子(例えばNFAT)によってはされなかった。c−Maf応答因子(MARE)を突然変異させた場合にc−Mafのトランス活性化は起こらなかった。すなわち酵母1ハイブリッドアプローチを利用した。
EGY48酵母株をIL−2プロモーター/ヒスチジン構築物で安定に組込み、そして抗CD3で活性化したTh1細胞クローンOF6から作成したcDNAライブラリーで形質転換した。スクリーニングした5.6×10クローンのうち488個が一次スクリーニングで陽性であった。二次スクリーニング中に試験した210クローンのうち72個がIL−2プロモーターに特異的であることが判明した。陽性クローンの数を減少させるため、我々はTh1およびTh2細胞株で差別的に発現されたcDNAと酵母クローンcDNAをハイブリダイズさせた。これらのTh1−Th2およびTh2−Th1 cDNAは、放射標識し、かつ16個の最も強く陽性の酵母クローンをスクリーニングするためのパイロット実験で最初に使用したクロンテック(Clontech)PCR選択キットを使用して作成した。それら16クローンのうち8個がTh1(PL17)特異的cDNA産物プローブで陽性であり、そしてTh2(D10)特異的cDNA産物プローブで陽性でなかった。IL−2、IFN−γおよびIL−4へのプローブの対照ハイブリダイゼーションを用いた16個の陽性クローンでのTh1−Th2プローブを用いる発現差解析法(RDA;例えばLisitsyn.1993.Science.259:946;O’Neil and Sinclair.1997.Nucleic Acids Res.25:2681;Hubank and Schatz.1994.Nucleic Acids Research.22:5640;Welford et al.1998.Nucleic Acids Research.26:3059)を実施した。Th1およびTh2を減算したcDNAプローブの特異性はIL−4に対するそれぞれIL−2およびIFN−γのそれらの検出により示される。
制限酵素分析およびシークエンシングデータは、全部で8個のクローンが関係づけられたことを示した。それらは5’および3’非翻訳領域中の差異に基づき3つのグループ分けに入り、これらの範疇のそれぞれは独立したcDNA分子を表した。これらのクローンの配列をNCBI GenBank配列データベースと比較することにより、転写因子のTボックスファミリーとの相同性を生じた。図1にはT−betのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が示されている。
実施例2.T−betはTボックスファミリーのメンバーT−brainおよびエオメソデルミン(eomesodermin)と相同な1領域を共有する
BrachyuryもしくははTボックスと呼ばれる200アミノ酸のDNA結合ドメインを共有する転写因子の1ファミリーの創設メンバーである((Smith,J.1997.Current Oppinion in Genetics & Development 7、474−480;Papaioannou and Silver.1998.Bioessay.20:9;Meisler,M.H.1997.Mammalian Genome 8、799−800に総説される。)。Brachyury(「短い尾」のギリシア語)突然変異は、短いわずかにもつれた尾部を有したヘテロ接合性の変異体動物で1927年に最初に記載された(Herrmann,B.G.、1990.Nature 343、617−622)。マウスでBrachyuryを包含せずに今や8種のTボックス遺伝子が存在する。これらはTbx1−6、T−brain−1(Tbr−1)および今やT−betを包含し、それぞれまるで異なり、しかも通常は複雑な発現パターンをもつ。転写因子のTボックスファミリーはDNA結合ドメイン中のファミリーメンバーの相同性により定義される。T−bet DNA結合ドメイン(マウスT−betの残基138〜327)は、マウスT−brainおよびアフリカツメガエル(Xenopus)エオメソデルミンのTボックスドメインに最も類似し、従ってT−betをTボックス遺伝子ファミリーのTbr1サブファミリーに置く。マウスT−betタンパク質のヒト相同物はマウスT−betにおよそ88%同一である。図1AはLipman−Pearsonのタンパク質アライメント(4に設定されたGペナルティ(G penalty)および12に設定されたギャップ長ペナルティ(gap length penalty)で)を使用して得た。類似性指数は86.6であると計算され;ギャップ数(gap number)2、ギャップ長(gap length)5およびコンセンサス長(consensus length)535)。T−betはTボックスファミリーメンバーのT−brainおよびエオメソデルミンと相同な1領域を共有する。マウスT−bet DNA結合ドメインは、マウスT−brainおよびアフリカツメガエル(Xenopus)エオメソデルミンのTボックスドメインに最も類似である。3種のTボックス領域間におよそ69%のアミノ酸の同一性が存在する。T−betはTボックスドメイン以外では他のTボックスファミリーメンバーに対する配列の相同性をもたない。
実施例3.TecキナーゼによるT−betのリン酸化
T−betタンパク質はリン酸化される。T−betをリン酸化するキナーゼはチロシンキナーゼのTecファミリーの1メンバーとして同定されている。ITKおよびRlk/TxkがT細胞中で発現されるチロシンキナーゼの優勢なTecファミリーである。図2はTecファミリーメンバーの保存された構造を示す。Tecファミリーキナーゼはサイトカイン分泌において重要であることが示されている。Rlk/itkはThy特異的であり、しかもIFN−γ生産の制御である役割を演じている。Itk−/−マウスは減少したIL−4産生を有する一方、rlk/itk−/−マウスは減少したTh1およびTh2サイトカインを示した。RIBPはrlkおよびitkを結合するアダプタータンパク質である。RIBP−/−マウスは減少されたIFN−γおよびIL−2を表す。
ITKおよびRlk/txk双方のキナーゼがin vitroでT−betをリン酸
化することが見出されている。ヒトT−betの予測されるチロシンリン酸化部位を図3に示す。修飾された形態のT−betタンパク質を作成し、そしてin vitroキナーゼアッセイで基質として使用した(図4)。ITKおよびRlk双方がin vitroキナーゼアッセイでT−betのN末端およびC末端をリン酸化したが、しかしDNA結合領域はしなかった(図5)。
Tecキナーゼの重要性をさらに示す、T−betの縮小されたチロシンリン酸化がITKノックアウト動物で観察された。B6、Balb/C、ITKノックアウトおよびRLKノックアウト動物に由来するT細胞からT−betを免疫沈降させた。免疫沈降物のウェスタンブロットを抗ホスホチロシン抗体もしくは抗T−bet抗体いずれかでプロービングした。図6に示されるとおり、T−betはITKノックアウト動物のT細胞中に存在するとは言え、その分子のチロシンリン酸化は低減される。対照的に、T−betはRlkノックアウトT細胞中で過剰リン酸化され(hyperphosphorylated)、T−betチロシンリン酸化の阻害におけるRlkの役割を示す。
実施例4.T−betはチロシンリン酸化される
リン酸化、ユビキチン化またはメチル化による転写因子の翻訳後修飾はそれらの活性化を導くことができ、そしてしばしば表面受容体からのシグナリングにより開始される。チロシンの可逆的リン酸化は、細胞周期の制御、成長および分化のような多くの基本的生理学的プロセス、ならびに遺伝子転写を調節する(Chernoff,J.(1999)J
Cell Physiol 180:173−81;Hunter,T.(1998)Harvey Lect 94:81−119)。T細胞では、TCRを介する刺激が細胞タンパク質のチロシンリン酸化を生じ、活性化を導く。T−betはTCRの下流に位置し、したがってTCRとの結び付きがT−betタンパク質の修飾を生じるのかどうかが決定された。組換えヒトIL−2(200U/ml)を含むRPMI−1640で維持したAE7Th1クローンまたは対照D10Th2クローンからの全細胞ライゼートを、抗−CD3(1μg/ml)で(+)または無しで(−)一晩刺激し、そして全ライゼートが調製される前の15分間、過バナジウム酸塩で処理した。全ライゼートをモノクローナル抗T−bet抗体(4B10)と免疫沈降させ、そして免疫複合体を7.5%のTris−グリシンゲルで解析した。これらの複合体をSDS−PAGEで分離し、ニトロセルロースに移し、そして抗−ホスホチロシンmAb4G10(アップステートUSA社(Upstate USA,Inc.)、シャーロッテスビル)でプローブを付け、そして化学発光をアッセイした(アマシャムバイオサイエンス(Amersham Bioscience)、ピスカタウェイ)。暴露後、ブロットを小片とし、そして抗−T−bet抗血清で再度プローブを付けた。ブロットの視覚による調査は、D10細胞中には存在しないAE7細胞中の特異的なリン酸化免疫反応種を明らかとし、これは抗−CD3処理により誘導された(図7A)。
T−betは初期のTh1分化で迅速に誘導され、そして後期に次第に減少する(図7B、下パネル)。分化しているTh細胞におけるT−betチロシンリン酸化の時期を調査した。CD4+Thp細胞はリンパ節および脾臓から単離し、そしてIL−2(1ng/ml)および抗−IL−4(10μg/ml)の存在下で、プレートに結合した抗−CD3(2μg/ml)、抗−CD28(1μg/ml)およびIL−2(100U/ml)を用いて刺激した。全細胞抽出物は、初回刺激から0、2、3、4日後および2回目の刺激から1日後に調製した。過バナジウム酸塩(100mM)を細胞の溶解の15分前に加えた。T−betのチロシンリン酸化は、TCRとの結合で初代Thp細胞で起こり、そして分化の初期で最も顕著となり(2日目)、4日目までに下降し、そして2回目の刺激では検出できなかった(図37B)。報告されているように、チロシンリン酸化は過バナジウム酸塩の存在下で強化されたが、過バナジウム酸塩の不存在下でも抗−CD3/CD28で48時間、in vitroにて刺激した初代Th細胞でも明らかに検出された(図7C)。CD4+Thp細胞由来の全細胞ライゼートは、抗−CD3/抗−CD28で48時間刺激し、そして7Bに記載したように調製した。したがってT−betはThp分化において早期にチロシンリン酸化され、これはTh祖先細胞におけるこの修飾に関する規則と一致し、系譜コミットメントが決定する分化の段階である。
TCRはシグナル伝達カスケードを、細胞質PTK、Lck、FynおよびZAP−70の少なくとも3つと相互作用し、そして活性化することにより開始し(Alberola−I1a,J.,et al.(1997)Am.Rev.Immunol.15:125−154)、その合わせた作用がIL−2誘導性T細胞チロシンキナーゼ(ITK)、ホスホリパーゼ−Cγ1、Vav原癌遺伝子およびアダプタータンパク質SLP−76のような下流の細胞物質のチロシンリン酸化をもたらす(Iwashima,M.et al.(1994)Science 263,1136−1139;Chan A.C.,et al.(1992)Cell 71,649−62;Cooke,M.P.et al.(1991)Cell 65,281−291;Wu,J.,et al.(2002)J Cell Sci 115,3039−48)。抗−CD3で刺激したTh1細胞の核および細胞質画分のウエスタンブロット分析では、T−betが構成的に核にあることが明らかとなった。このようにT−betリン酸化の原因となるチロシンキナーゼは、T細胞で同定される大変少ない核のチロシンキナーゼの1つであるにちがいない。これらにはc−Ab1キナーゼおよびTecキナーゼファミリーのメンバーであるITK、静止リンパ球キナーゼ(resting lymphocyte kinase:RLK)およびTECがある(Takesone,A.,et al.(2002)J Cell Sci 115,3039−48;Lucas,J.A.et al.(2003)Immunol Rev 191,119−38)。特異的なプロテインキナーゼによりリン酸化されると思われるタンパク質内の残基を同定するために設計されたスカンジット(scansite)プログラムは(Yaffe,M.B.et al.(2001)Nat Biotechnol 19,348−53)、T−bet(Y525)のC−末端、ヒトとマウスのT−bet間で保存されたモチーフ、ならびに3つの保存されたc−Ab1部位(Y76、Y107およびY117)にITKリン酸化部位を予想した。In vitroキナーゼアッセイを、短縮化GST−融合T−betタンパク質およびPTKおよびc−Ab1をインキュベーションし、続いて抗−PTKまたはc−Ab1 Abs、および10μCiの(γ−32P)ATP(6000Ci/mM)と免疫沈降することにより行った。エノラーゼは陽性対照の外因性基質として使用した。反応混合物はSDS−PAGEにより解析し、そして生じたゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーにかけた。これらのin vitroキナーゼアッセイは、当初はT−betがこれらのキナーゼに基質として役立つことを確認するために行ったものであったが、T−bet、NおよびC末端フラグメントの両方(しかしDNA結合ドメインではない)がc−Ab1ではなくTecキナーゼ、ITKおよびRLKによりリン酸化されることができたことを示した(図7D)。しかし293T細胞中でPTKとT−betの同時発現は、in vitroキナーゼアッセイよりも信頼性がある読み取りであり、TECまたはRLKによるよりもITKによるT−betのより効率的なリン酸化を明らかにした(図7E)。これはT−betとTecキナーゼであるTEC、ITKまたはRLKの293T細胞中でのコートランスフェクションにより測定され、そして全細胞ライゼートは、過バナジウム酸塩と15分間インキュベーションした後に調製された。
ITKが関連するキナーゼであることのより決定的な証拠は、ITKもしくはRLKまたは二重ITK/RLK欠損マウスから単離した初代CD4T細胞の分析から来たものであった(Schaeffer,E.M.,et al.,(2001)Nat.Immunol.2,1183−1188)。キナーゼ欠損マウスのリンパ節から単離したCD4+T細胞は、Th1−歪み(skewing)条件下で2日間、抗−CD3/抗−CD28処置の組み合わせにより刺激した。T−betは免疫沈降により単離し、そしてチロシンリン酸化状態は4G10を用いたウエスタンブロットにより評価した。T−betのチロシンリン酸化は、ITKまたはITKとRLKの両方を欠く細胞で大きく縮小したが、RLKのみの不存在では正常であった(図7F)。これらのデータはITKが初代T細胞においてT−betの上流のチロシンキナーゼであることを示す。それにもかかわらず、少量のT−betの残存リン酸化がItk−/−CD4細胞で観察される。これは他のTecキナーゼまたは他のチロシンキナーゼによるリン酸化を反映しているのかもしれない。スカンジットにより予想されるように、ITKによるリン酸化がT−bet中のチロシン残基525に特異的であるかどうかを決定するために、チロシン残基525ならびに対照チロシン残基437をフェニルアラニンに変異させ、そしてこれらの変異体がITKによりリン酸化される能力を評価した。293T細胞中の野生型(wt)または変異体T−betのみの全細胞ライゼートを使用したウエスタンブロットにより検出されるような発現は、検出可能なチロシンリン酸化を生じなかったが、ITKとの同時発現でwtT−betのリン酸化、およびY525F変異体の顕著に縮小されたリン酸化が生じた。さらに対照変異体Y437FのITKによるリン酸化は減少しなかった(図7G)。したがってITKはT−betを残基Y525でリン酸化する。
実施例5.T−betのチロシンリン酸化は、Th2サイトカイン生産の最適な抑制に必要である。
幾つかの転写因子の活性は細胞での局在化により制御され、これは次いでリン酸化により調節される(NFAT、スタッツ(Stats))(Wen,Z.,et al.(1995)Cell 82,241−250;Winslow,M.M.,et al.(2003)Curr Opin Immunol 15,299−307)。しかしT−betの細胞下の局在化は、内因性のT−betがItk−/−細胞中の核にあり、そしてY525F変異体が構成的に核にあったので、チロシンリン酸化により影響を受けない。ITK誘導型のT−betリン酸化の機能を評価するために、T−bet wt(RV−T−bet)およびY525F(RV−T−bet Y525F)変異体GFPレトロウイルスを、抗CD3および抗−CD28で刺激したCD4T−bet−/−Thp細胞に24〜36時間形質導入し、そしてTh2歪み条件下で培養した。GFP陽性細胞は5日で分類し、さらに2日間、IL−2の存在下で拡大し、抗−CD3で再刺激し、そして24時間後、サイトカイン生産をELISAにより評価した。wtおよび変異体T−betの発現を、FACS(図8A)により、および抗−T−betmAb、4B10(図8B)を使用したウエスタンブロット分析により測定し、形質導入した細胞中のwtおよびY525FT−betの均等な発現を明らかにした。GFPを発現する分類された細胞の割合は、98%を越えた。予想どおり、wtT−betで形質導入したT−bet−/−Thp細胞は、IL−2生産の抑制により、および対照のRVベクターで形質導入した細胞に比べて100倍までのIFNγ生産の誘導により証明されるように、T−bet−/−Th細胞でT−bet機能を保存した(図8C)。Y525FT−betはwt T−betと同様にIL−2の抑制およびIFNγ生産の誘導に効果的であった。しかし驚くことに、wtT−betはTh2サイトカイン生産の有意な抑制を現したが(図8D)、Y525FT−betはIL−4、IL−5およびIL−13のようなTh2サイトカインの発現の抑制にはwtT−betよりも効果が一層低かった(図8D)。6回の独立した実験で、wtT−betによるIL−4生産の抑制は、29〜56%の範囲であり、平均は41%であった。対照的に、Y525F変異体によるIL−4の抑制は、1〜22%であり、11%の平均であり、これは0.0002のP値で統計的に有意であった。同様な差異がwtとY525FT−betとの間でIL−5およびIL−13について見られた。IL−5についてwtの抑制は39〜87%(平均63%)であり、一方変異体T−betは−18〜38%抑制し(平均11.5%)、0.0074のP値で統計的に有意であった。IL−13について、wtの抑制は6回の実験で34〜71%の範囲であり(平均53%)、一方Y525F変異体の抑制は2〜40%の範囲であり(平均22%)、0.002のP値であった。細胞内サイトカイン分析はELISAの結果と一致し、そして類似の結果がペプチドおよびAPCで刺激したTCRトランスジェニックDO11.10/T−bet−/−CD4+T細胞を使用した形質導入実験で得られた。
Y525FT−bet変異体はIFNγ生産の保存においてはwtT−betのように効果的となるようだが、正式にはIFNγにおける大変小さい差異がしっかりとした(robustness)Th2分化に影響を及ぼすかもしれない。さらにTh2分化の阻害におけるIFNγの効果を排除するために、これらの同じ実験をT−bet−/−xIFNγ−/−CD4+Th細胞で行い、そして類似の結果を得た(図8E:結果はRV対照のパーセントとして表す。IFNγ生産については対数尺度を使用していることに留意されたい)。このようにTh2サイトカインの抑制におけるT−betのチロシンリン酸化の役割は、IFNγから独立している。サイトカイン転写産物もwtまたはY525F変異体T−betレトロウイルスでの形質導入後に測定し、そしてTh2サイトカインmRNAの抑制において後者の同様な減損が観察された。故にT−betの2つの主要な機能は生化学的には分離可能である:ITKによるY525のリン酸化は、Th2分化のT−betの抑制に選択的に必要とされるが、サイトカインのプロファイルにより測定されるように、Th1系統への分化能の発生にその機能は必要とされない。
実施例6.T−betはITKと物理的に相互作用する
ITKは、Src相同(SH)、SH2、SH3、キナーゼ(SH1)、Tec相同(TH)およびプレクストリン相同(PH)ドメインを含むモジュラー72kDaのタンパク質である(Lucas,J.A.et al.(2003)Immunol Rec 191,119−38)。T細胞の活性化で、ITKはアダプタータンパク質LATおよびSLP76と会合し、Lckによりトランスリン酸化され、自己リン酸化し、そして細胞膜にTCRとそのPHドメインを介して局在する(Bunnell,S.C.,et al.(2000)J Biol Chem 275,2219−30;Su,Y.W.,et al.(1999)Eur J Immunol 29,3702−11)。しかしITKはT−betが位置する核にも存在する。したがってITKがT−betと物理的に会合するのかどうかを決定した。T−betとエピトープ標的付きTecキナーゼとの同時発現(ITK−FLAG、RLK−MYCまたはTEC−HA)、続いて抗−FLAG、MYCまたはHA抗体との免疫沈降、そして免疫複合体を7.5%Tris−グリシンゲルで解像した。生じたタンパク質ブロットに抗−T−betAbでプローブを付けた。T−betまたはTECキナーゼの発現は、全細胞ライゼートを使用したウエスタンブロットによりアッセイした。データはITKとT−betとの選択的な会合を明らかにした(図9A)。同様のアッセイでそれらがT−betをリン酸化できないことと一致して、RLKもTECもT−betと同時に免疫沈降しなかった(図9Bおよび9C)。一連のITK変異体を使用したマッピング実験では、T−betとの相互作用の部位がITK SH1ドメインであることが明らかとなった。FLAG−標識ITK短縮物をT−betと293T細胞にコートランスフェクトし、そして抗−FLAG Abと免疫沈降させた。免疫複合体中のT−betの存在は、抗−T−bet Abでアッセイした。SH1ドメインのみ、またはSH1、SH2およびSH3ドメインのいずれかを含むTK短縮物は、T−betならびに完全長のITKと会合し、PHおよびITHドメインは必要ではなかったが、SH1ドメインはT−betとの相互作用に必要であったことを示す(図9D)。さらにFLAG−標識ITKと、T−betのwtまたはチロシン変異体(Y525FまたはY437F)との同時発現、FLAG−M2アガロース(シグマ、セントルイス)で免疫沈降、そして続いて解像したタンパク質ブロットの抗−T−bet Abでのプロービングブにより示されるように、ITK/T−betの相互作用は、T−bet中のチロシン525の存在に大きく依存した。これらの実験の結果は、ITKがY525F T−bet変異体とそれほどよくは同時免疫沈降しないことを示した(図9E)。T−betタンパク質およびITKの同様の発現レベルが30μgの全細胞ライゼートで検出された。
最も重要であるのは、初代胸腺細胞における内因性の関連を決定することによりITKがT−betと生理学的条件下で相互作用するかどうかを決定したことである。単一細胞懸濁液をBALB/c wt,T−bet−/−およびITK−/−マウスの胸腺から得、そして核抽出物を製造元の使用説明に従いNE−PER(ピアス、ロックホールド)を用いて調製した。2mgの核抽出物を抗−T−bet mAb、4B10と150mM NaCl中でインキュベーションした。免疫複合体を解像し、そしてストリップ後に抗−ITK mAb(2F12)、そして順次4B10でプローブを付けた。ITK発現は30μgの核抽出物中でアッセイした。TCR刺激から24および48時間後にナイーブなThp細胞中の同時免疫沈降実験を行う初期の試みは失敗し、恐らくこの初期時点での低レベルの内因性T−bet発現および活性化細胞中で起こっているリン酸化および脱リン酸化の競合プロセスの両方から派生するものだろう。しかしBALB/c wt,T−bet−/−およびITK−/−胸腺細胞の核抽出物に由来するT−betの免疫沈降、続いて抗−ITK抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、T−bet−/−またはITK−/−胸腺細胞ではなくBalb/c wtからの免疫複合体中の内因性ITKの存在が明らかとなった(図9F)。このデータはITKのキナーゼドメインがT−betとチロシン525依存的様式で相互作用し、T−betのリン酸化および引き続いてTh2サイトカイン生産の調節をもたらすことを示す。
理論に結び付けられることは望まないが、上記結果の1つの説明は、T−betが直接的または間接的にチロシン525に依存する様式でThpからTh2系譜コミットメントを支配することが知られている1もしくは複数の転写因子の発現を阻害するということである。IL−4サイトカイン発現と比べて、さらに顕著なT−betY525のTh2IL−5およびIL−13に及ぼす効果は、Th2−特異的転写因子であるGATA−3の機能の記憶(reminiscent)であった(Zheng,W.−P.and R.A.Flavell(1997)Cell 89,587−596;Das,J.,et
al.(2001)Nat.Immunol.2,45−50)。しかしwt T−betまたはY525F変異体で形質導入されたThp細胞中で、GATA−3またはc−Maf、JunB、Stat6またはNFATのような他のTh2関連転写因子のmRNA発現レベルに差異は観察されず、そしてT−betは一時的なレポーターアッセイにおいてGATA−3プロモーターを抑制しなかった。他の潜在的なメカニズムは、T−betがGATA−3のようにTh2転写因子と物理的に会合して、Th2サイトカイン座中でGATA−3がその標的部位への接近を制御し、そしてこの会合が残基525により調節されるということであった。最近の報告は他のGATAファミリーメンバーであるGATA−4とTBX5(症候性の心中隔欠損のサブセットの原因であるT−ボックスタンパク質の1つ)との相互作用を記載する(Garg,V.,et al.(2003)Nature 424,443−7)。FLAG−標識GATA−3およびT−betを293T細胞中で同時発現し、続いて抗−FLAGアガロースでのIP、そして全細胞ライゼートの抗T−betmAb、4B10でのウエスタンブロットの初期の実験では、2つのタンパク質の物理的相互作用を明らかにしたが、T−betとc−MafまたはNFATc2との相互作用は検出されなかった(図10A)。興味深いことに、Y525FT−betは、wtまたはY437FT−betに比べて低い結合親和性でGATA−3と相互作用した(図10A)。T−betとGATA−3短縮変異体との同時発現は、GATA−3のN−末端(257aa)ドメインがT−betと特異的に相互作用したことを明らかにした(図10B)。これはMYC−標識GATA−3短縮物をT−betとコートランスフェクションし、そしてMYC−AG結合体と沈殿させることにより証明された(サンタクルズバイオテック社(Santa Cruz Biotech Inc.)、サンタクルズ)。タンパク質ブロットは抗−T−betAbでプローブをつけた。GATA−3短縮物は抗−MYCmAbで検出された(9E10)。
内因性のT−bet/GATA−3会合を直接試験するために、T−betおよびGATA−3の両方を発現する胸腺細胞を調査した。B6wtおよびT−bet−/−の胸腺から単離した核抽出物を、抗−GATA−3mAb、HG3−31とインキュベーションし、そして続いてプロテインA/Gアガロースとインキュベーションした。免疫複合体を解像し、そして抗−T−betAbでプローブを付けた。GATA−3発現は抗−GATA−3mAbで検出した。胸腺細胞ライゼートと抗−GATA−3 Abとの免疫沈降、続いて抗−T−betmAbでのウエスタンブロットは、wtでは2つのタンパク質がin vivoで会合するが、T−bet−/−胸腺では会合せず、この相互作用の部位が生理学的にも意味があるのかもしれないことを明らかにした(図10C)。この会合にはITKの存在が必要であることは注目に値し(これはItk−/−胸腺中には検出されなかったので)(図10D、レーン3)(過剰発現実験ではITKの不存在下でT−betおよびGATA−3は相互作用できたが)、T−betとGATA−3との会合はITKにより助長されることを示す。
T−betとGATA−3との内因的会合も調査した。ナイーブなThp細胞を抗−CD3および抗−CD28で24時間刺激し、そして核抽出を免疫沈降のために調製した。LexA AbをGATA−3 Abの同位体対照として使用した。BALB/C wt、T−bet−/−およびItk−/−マウスからのナイーブなThpを、抗−CD3に抗−CD28およびIL−2を加えたものと24時間、rIL−4およびrIFNγおよび上記のような核調製物と培養し、そして免疫沈降およびイムノブロット分析も上記のように行った。結果は24時間の培養中、抗CD3/CD28およびrIL−2のみで処理したThp細胞中でT−betとGATA−3の内因性の会合があり(図10E)、そしてIL−4およびIFNγの存在下で上記のように24時間処置したThpではT−betおよびGATA−3のより高い発現が誘導された(図10F)。さらに内因性T−bet/GATA−3会合は、両タンパク質を発現することが知られているヒトナチュラルキラー細胞株YTで検出された(図10G)。
Thp由来細胞におけるこのItk媒介型のT−bet/GATA−3相互作用をさらに調査するために、再構成されたT−bet−/−をwtまたはY525FT−betとThp細胞に導入した。IFNγがGATA−3発現に及ぼす効果を排除し、そしてITKに関する要件が相互作用に重要であるのかどうかを調査するために、wtおよびY525F変異体T−betを形質導入したT−bet−/−xIFNγ−/−およびT−bet−/−xItk−/−マウスからのCD4+Thp細胞もそれぞれ単離した。形質導入した細胞は抗−CD3および抗−CD28でTh2−歪み条件下で刺激し、そしてライゼートをGATA−3abと免疫沈降させ、次いでT−betmAbでウエスタンブロッティングした。対照、wtまたはY525FT−betレトロウイルスで形質導入したTh細胞中で、比較可能なGATA−3の発現が観察された。胸腺細胞ですでに観察したように、Y525F変異体ではなくwtT−betがGATA−3と会合し、そしてこの相互作用にはTh細胞中でITKの存在が必要であった(図10H)。
T−betがTh2因子のGATA−3との相互作用を介してTh2系譜コミットメントを制御するならば、これはTh2サイトカイン座中の結合部位からGATA−3を封鎖することによりそうするだろう。EL4細胞をwt、Y525FまたはY437FT−betでトランスフェクトし、そして核抽出物をIL−5プロモーターからの放射標識GATA−3結合部位とインキュベーションするか、または放射標識SPI結合部位とインキュベーションし、未変性6%ポリアクリルアミドゲルで解析し、そしてオートラジオグラフィーにかけた。実際にこれらのEMSA分析は、GATA−3の規範的GATA−3標的配列への、およびIL−5プロモーター中のGATA−3標的配列への縮小した結合を明らかとした(図10)。対照的に、T−betY525F変異体の発現はGATA−3/DNA複合体の形成に影響を及ぼさなかった(図10I、左パネル)。これら同じ抽出物の対照SP1プローブへの結合は均等であった(図10I、右パネル)。wt、Y525FおよびY437FT−betの発現レベルは比較可能であり、そして内因性GATA−3発現はwt、Y525FまたはY437FT−betの発現により実質的な影響の受けず(図10J)、GATA−3/DNA複合体の低下した量は、減少したGATA−3タンパク質によるものではないことを示す。エフェクターTh2細胞からの核抽出物をGATA−3タンパク質の陽性対照として使用した。GATA−3およびT−betタンパク質のレベルについて制御された一過性のレポーター遺伝子アッセイは(図10L)、EL4細胞をGATA−3およびT−bet cDNAと、ならびにβ−galレポーター遺伝子を含むIL−5プロモーターレポーター遺伝子でコートランスフェクトし、そして誘導倍数で表されるβ−ガラクトシダーゼ活性で標準化した相対的ルシフェラーゼ活性をアッセイすることにより行い、Y525FT−betではなくT−betがGATA−3依存的なIL−5プロモーターの活性を抑制することを示し、この仮定を支持し(図10K)、そしてT−betY525F変異体が初代Th細胞でのTh2サイトカイン生産の抑制に失敗したことと一致する。
これらのデータとITKを欠くマウスの表現型を記載する以前の報告との関連は複雑である。ITKは、ホスホリパーゼCγ1のリン酸化を介してTCR誘導型の細胞内Ca+の可動化を調節する(Schaeffer,E.M.,et al.(2000)J Exp Med 192,987−1000;Schaeffer,E.M.,et al.(1999)Science 284,638−641)。ITKを欠くマウスは減損したT細胞の活性化があり、Ca++の可動化が低下し、PLC−γおよびMAPキナーゼの活性化はNFATおよびAP−1転写因子の減損した活性化を導く。かなりの研究がCD4+Tヘルパー細胞分化の支配にITKおよびRLKを結び付けてきた。しかし様々な実験およびモデル系を1つの一体化したモデルに組み込むことは複雑であり、しかも問題が多い(Wen,Z.,et al.(1995)Cell 82,241−250;Schaeffer,E.M.,et al.(1999)Science 284,638−641;Fowell,D.J.et al.(1999)Immunity 11,399−409)。ITK欠失CD4+T細胞は、リーシュマニア(L.Major)、N.ストロンギロイデス(N.Strongyloides)および喘息のモデルに対するそれらの免疫応答で観察されるように、in vitroおよびin vivoで減損したTh2分化能を有することが報告された(Schaeffer,E.M.,et al.(2001)Nat.Immunol.2,1183−1188;Fowell,D.J.,et al.(1999)Immunity 11,399−409;Mueller,C.and A.August(2003)J Immunol 170,5056−63)。Itk−/−マウスはマンソン住血吸虫(S.Mansoni)感染後に肉芽腫も発生できなかった(Schaeffer,E.M.,et al.(2001)Nat.Immunol.2,1183−1188)。明らかにこれらの知見は、Th2応答のT−bet媒介型阻害の促進におけるITKの役割と矛盾する。しかしItk−/−マウスは休止している好酸球尿症および上昇したレベルのIgEを表し、明確な抗原刺激前の強化されたTh2発生を示唆し(Schaeffer,E.M.,et al.(2001)Nat.Immunol.2,1183−1188)、そしてItk−/−記憶細胞は実際に上昇したレベルのTh2サイトカインを生産する。さらにITKおよびRLKの両方が2倍欠失したマウスは、wtおよびRlk−/−対(counterpart)に匹敵するTh2媒介型の肉芽腫を形成する(Schaeffer,E.M.,et al.(2001)Nat.Immunol.2,1183−1188)。このような後者の観察は、T−betリン酸化の不存在により説明することができた。最後に、ヒトIL−2の存在下で、抗−CD3/CD28で刺激したItk−/−Balb/cマウスに由来するナイーブなThpを使用した我々の未だ報告していない実験では、わずかに減少したIL−4レベルが観察されただけで、そしてこれまでの報告とは対照的に、対照wtThpと比べてIL−5およびIL−13のレベルが減少よりもむしろ上昇した。これはT細胞よりはむしろ非T細胞からのTh2サイトカインの生産がItk−/−マウスのin vivo表現型に貢献するのかもしれない。
理論に結び付けられることは望まないが、これらのデータは、シグナルの強度がTヘルパー細胞の発生を調節する1つのメカニズムを提供することができ、これはTecキナーゼが欠損しているマウスの分析からの結果と矛盾する可能性がある説明として示唆された(August,A.et al.(2002)Int J Biochem Cell
Biol.34,1184−1189)。主に細胞質ゾルではあるが、ITKは休止T細胞の核に見い出される。この核にある集団は、おそらくT−betのリン酸化を介して休止(check)中の基本的Th2活性を維持するために役立つことができる。いったん有力で、しかも持続的な抗原性刺激状態が生じれば、PLCγ誘導型のCa2+流入およびNFAT活性化のようなITKに依存的であるものを含め多くの因子がT−bet抑制をくつがえし、そしてTh2発生を促進する。
等価物
当業者は日常的な実験を行うだけで、本明細書に記載する本発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるだろう。そのような等価物は特許請求の範囲に包含されることを意図している。
図1Aおよび1Bは、Lipman Pearsonのタンパク質アライメントプログラムを使用して準備したマウスおよびヒトT−betのアミノ酸配列アライメントを示す。図1CはマウスおよびヒトT−betの核酸配列アライメントを示す。アライメントはALIGNプログラムを使用して準備した。T−ボックス配列は太字で示す。チロシンリン酸化部位に下線を付す。核局在化部位に矢印を付ける。 Tecファミリーメンバーの保存された構造を示す。 ヒトT−betの予想されるチロシンリン酸化部位を示す。 in vitroキナーゼアッセイで基質として作成し、そして使用したT−betの修飾形を示す。 in vitroキナーゼアッセイで、ITKおよびRlkの両方がN−末端およびC−末端がリン酸化されたが、T−betのDNA結合領域はリン酸化されていないことを示す。 T−betはITKノックアウト動物に由来するT細胞に存在するが、分子のチロシンリン酸化は減少していることを示す。対照的に、T−betはR1kノックアウトT細胞で過リン酸化された。 7A〜7GはT−betがチロシンリン酸化されることを示す。 8A〜8EはT−betのチロシンリン酸化がTh2サイトカイン生産の最適な抑制に必要であることを示す。 9A〜9FはTh2が物理的にITKと相互作用することを示す。 10A〜10LはT−betが標的DNAへの結合からGATA−3を直接封鎖することを示す。

Claims (29)

  1. T細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に増加させる化合物の同定方法であって、化合物の存在下で、T−betおよびTecキナーゼ分子をキナーゼ分子とT−betとの相互作用を可能とする条件下で接触させ;そしてT−betとキナーゼ分子との相互作用を検出することを含んでなり、T細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に増加させる化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示される、上記同定方法。
  2. T−betおよびキナーゼ分子の相互作用がT−betとキナーゼとの間の複合体の形成を測定することにより決定される請求項1に記載の方法。
  3. T−betとキナーゼ分子の相互作用がT−betのリン酸化を測定することにより決定される請求項1に記載の方法。
  4. T−betのリン酸化がT−betのアミノ酸525(Y525)位のチロシン残基のリン酸化を測定することにより決定される請求項3に記載の方法。
  5. キナーゼ分子がITKである請求項1に記載の方法。
  6. T細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に増加させるために有用な化合物の同定方法であって、
    a)ITK、T−betおよびGATA3を含んでなる指標組成物を準備し;
    b)指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ;
    c)試験化合物のライブラリーから、ITK媒介型のT−betとGATA3との相互作用を減少させる目的化合物を選択し、これによりTh2系譜コミットメントを直接的に増加させる化合物を同定する上記同定方法。
  7. 相互作用がT細胞によるTh2サイトカイン生産を測定することにより決定される、請求項6に記載の方法。
  8. サイトカインがIL−4、IL−5およびIL−10からなる群から選択される請求項7に記載の方法。
  9. ITK−媒介型のT−betとGATA3との相互作用が、T−betとGATA3との間の複合体の形成を測定することにより決定される請求項6に記載の方法。
  10. ITK媒介型のT−betとGATA3との相互作用が、DNAへのGATA3の結合の低下を測定することにより決定される、請求項6に記載の方法。
  11. 指標組成物が、T−betポリペプチドを発現する細胞である請求項6に記載の方法。
  12. 細胞がT細胞系譜コミットメントを有する請求項11に記載方法。
  13. 細胞が未だT細胞系譜コミットメントを持たない請求項11に記載の方法。
  14. T細胞中のT−betとGATA3との相互作用を調節する化合物の同定方法であって、化合物およびITKの存在下で、T−betおよびGATA3を、ITK媒介型のT−betのGATA3への結合により複合体を形成することを可能とする条件下で接触させ;そしてT−betとGATA3との複合体の形成を検出することを含んでなり、ここでITKおよび化合物の存在下でT−betとGATA3との間の相互作用を阻害する化合物の能力が、ITKおよび化合物の不存在下で形成される複合体の量と比べた時の複合体の形成の低下により示される、上記同定方法。
  15. 化合物が複合体の形成または安定性を上昇させる請求項14に記載の方法。
  16. 化合物が複合体の形成または安定性を減少させる請求項14に記載の方法。
  17. T細胞による少なくとも1つのTh2サイトカインの生産を直接的に増加させるために有用な化合物の同定法であって、
    a)ITK、T−betおよびGATA3を含んでなる指標組成物を準備し;
    b)指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ;
    c)試験化合物のライブラリーから、ITK媒介型のT−betとGATA3との相互作用を減少する目的化合物を選択し、これにより少なくとも1つのサイトカインの生産を直接的に上昇させる化合物を同定する、
    ことを含んでなる上記方法。
  18. T−betとGATA3との相互作用が少なくとも1つのサイトカインの生産を測定することにより決定される、請求項17に記載の方法。
  19. T−betとGATA3との相互作用が1より多くのサイトカインの生産を測定することにより決定される、請求項17に記載の方法。
  20. 細胞がT細胞、B細胞およびNK細胞からなる群から選択される請求項17に記載の方法。
  21. T細胞によるTh2サイトカインの生産を直接的に増加させる作用物質を用いた処置から利益を受ける障害を処置または防止する方法であって、障害を処置または防止するように、該障害を持つ個体にT細胞においてITK媒介型のT−betとGATA3との結合を減少させる作用物質を投与することを含んでなる上記方法。
  22. 作用物質がT−betのチロシンリン酸化を阻害する請求項21に記載の方法。
  23. T細胞がThp細胞である、請求項21に記載の方法。
  24. T細胞によるTh2サイトカイン生産を直接的に増加させる方法であって、T細胞によるTh2サイトカイン生産が直接的に増加するように、T細胞中におけるITK媒介型のT−betとGATA3との結合を減少させる作用物質と細胞を接触させることを含んでなる上記方法。
  25. 作用物質がT−betのチロシンリン酸化を阻害する請求項24に記載の方法。
  26. T細胞がThp細胞である、請求項24に記載の方法。
  27. T細胞の分化の間中のTh2系譜コミットメントを直接的に増加させる方法であって、T細胞分化間中のTh2系譜コミットメントが直接的に増加するような、T細胞中でのITK媒介型のT−betとGATA3との結合を減少させる作用物質と細胞を接触させることを含んでなる上記方法。
  28. 作用物質がT−betのチロシンリン酸化を阻害する請求項27に記載の方法。
  29. T細胞がThp細胞である請求項28に記載の方法。
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