JP2008516608A

JP2008516608A - Enzyme cycling based assay for α-methylacyl-CoA racemase

Info

Publication number: JP2008516608A
Application number: JP2007536931A
Authority: JP
Inventors: チョン−シェンユアン，
Original assignee: ジェネラルアトミクス
Priority date: 2004-10-15
Filing date: 2005-10-14
Publication date: 2008-05-22
Also published as: EP1805322A4; AU2005295677A1; WO2006044633A1; CA2583546A1; EP1805322A1

Abstract

本発明は、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性をアッセイする方法を提供する。このアッセイでは、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有するサンプル、またはα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルを、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡと接触させる。α−メチルアシルＣｏＡラセマーゼが、サンプル中に存在している場合、（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡは、（２Ｓ）−メチルアシル−ＣｏＡに変換される。本方法は、次に、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性に対応する検出可能なシグナルを発生する、（２Ｓ）−メチルアシルＣｏＡとトランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡとの間の循環反応系を利用する。同じ原理に基づく、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするためのキットもまた、提供される。The present invention provides a method for assaying α-methylacyl-CoA racemase activity. In this assay, a sample containing α-methylacyl-CoA racemase or a sample suspected of containing α-methylacyl-CoA racemase is contacted with (2R) -2-methylacyl-CoA. If α-methylacyl CoA racemase is present in the sample, (2R) -2-methylacyl CoA is converted to (2S) -methylacyl-CoA. The method then utilizes a cyclic reaction system between (2S) -methylacyl CoA and trans-2,3 dehydroacyl-CoA that generates a detectable signal corresponding to α-methylacyl-CoA racemase activity. To do. A kit for assaying α-methylacyl-CoA racemase based on the same principle is also provided.

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年１０月１５日に出願された米国特許出願第１０／９６６，９８３号の一部継続出願である、２００４年１２月３日に出願された、米国特許出願第１１／００４，４７７号に関連する（これらの出願は、その全体が参考として援用される）。 (Cross-reference of related applications)
This application is a continuation-in-part of US patent application Ser. No. 10 / 966,983, filed Oct. 15, 2004, and is filed on Dec. 3, 2004, US patent application Ser. No. 11/004. , 477 (these applications are incorporated by reference in their entirety).

（発明の分野）
本発明は、概してα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ検出の分野に関する。特に、本発明は、サンプル中でα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするための方法およびキットを提供する。 (Field of Invention)
The present invention relates generally to the field of α-methylacyl-CoA racemase detection. In particular, the present invention provides methods and kits for assaying α-methylacyl-CoA racemase in a sample.

（発明の背景）
α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）は、食餌中の分枝鎖脂肪酸およびＣ２７−胆汁酸中間体のペルオキシソームでのβ酸化において鍵となる役割を演じる、特色づけのよくなされた酵素である。（非特許文献１）。ＡＭＡＣＲは、（Ｒ）−α−メチル分枝鎖脂肪アシル−ＣｏＡエステルをこれらの（Ｓ）立体異性体へ変換するのを触媒する。（非特許文献２；非特許文献３）。ＡＭＡＣＲは、ヒト肝臓から４７ｋＤａのモノマーとして単離され、そして主にペルオキシソームに局在化し、少量はミトコンドリアでも検出される。（非特許文献３；非特許文献４）。ヒト肝臓から単離されたＡＭＡＣＲの等電点は、ｐＨ６．１であり、そしてこの酵素はｐＨ７とｐＨ８の間で最適活性を示す。 (Background of the Invention)
α-Methylacyl-CoA racemase (AMACR) is a well-characterized enzyme that plays a key role in peroxisomal β-oxidation of branched-chain fatty acids and C27-bile acid intermediates in the diet. (Non-Patent Document 1). AMACR catalyzes the conversion of (R) -α-methyl branched chain fatty acyl-CoA esters to their (S) stereoisomers. (Non-patent document 2; Non-patent document 3). AMACR is isolated from human liver as a 47 kDa monomer and is mainly localized to peroxisomes, with small amounts also being detected in mitochondria. (Non-patent document 3; Non-patent document 4). The isoelectric point of AMACR isolated from human liver is pH 6.1 and the enzyme shows optimal activity between pH 7 and pH 8.

ＡＭＡＣＲ発現の上昇は、前立腺、結腸直腸、卵巣、乳房、膀胱、肺、腎細胞癌腫、リンパ腫、および黒色腫などの、いくつかのタイプの癌のバイオマーカーであることが示されている。（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。研究はまた、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ酵素活性が前立腺癌組織標本において上昇していることも示す。（非特許文献８）。特許文献１および特許文献２は、前立腺癌を有する患者または前立腺癌を発生する危険性のある患者、および前立腺癌が別の組織に転移することから生じる癌を有する患者または癌を発生する危険性のある患者を、ＡＭＡＣＲの発現または活性を測定することによって同定する方法を記載している。 Increased AMACR expression has been shown to be a biomarker for several types of cancer, including prostate, colorectal, ovarian, breast, bladder, lung, renal cell carcinoma, lymphoma, and melanoma. (Non-patent document 5; Non-patent document 6; Non-patent document 7). Studies also show that α-methylacyl-CoA racemase enzyme activity is elevated in prostate cancer tissue specimens. (Non-patent document 8). Patent Literature 1 and Patent Literature 2 describe a patient having prostate cancer or a patient at risk of developing prostate cancer, and a patient having cancer resulting from metastasis of prostate cancer to another tissue or risk of developing cancer. Describes a method for identifying certain patients by measuring AMACR expression or activity.

ＡＭＡＣＲの酵素活性をアッセイするためのいくつかの方法が報告されている。非特許文献４は、２−メチル［２-（３）Ｈ］アシル−ＣｏＡを基質として用いる、ＡＭＡＣＲ酵素活性の放射アッセイを記載している。非特許文献９は、ＡＭＡＣＲが、２Ｒ−メチル−ペンタデカノイル−ＣｏＡと結合される、ＡＭＡＣＲの代替の酵素アッセイを記載している。反応生成物の２Ｓ異性体は、過剰量の添加オキシダーゼ（プリスタノイルＣｏＡオキシダーゼ）によって不飽和化され、これは過酸化水素の生成をもたらす。この過酸化水素は、適切な水素供与体の存在下でペルオキシダーゼによってモニターされる。しかし、サンプル中のＡＭＡＣＲ酵素活性をアッセイするための（例えば、癌の診断のために）、信頼性がありそして感受性のある方法が、未だ、必要とされている。
国際公開第０２／２７３２４号パンフレット米国特許出願公開第２００２／０１２３０８１号Ｆｅｒｄｉｎａｎｄｕｓｓｅら，Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．（２０００）４１：ｌ８９０−１８９６Ｃｕｅｂａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００２）３６３：８０１−８０７Ｓｃｈｍｉｔｚら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５）２３１：８１５−８２２Ｓｃｈｍｉｔｚら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４）２２２：３１３−２３Ｒｕｂｉｎら，ＪＡＭＡ（２００２）２８７：１６６２−１６７０Ｌｕｏら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（２００２）６２：２２２０−２２２６Ｓｒｅｅｋｕｍａｒら，ＪＮａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．（２００４）９６：８３４−８４３Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｈａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００４）１６４：７８７−９３Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９７）１３４７：６２−６８ Several methods have been reported for assaying the enzymatic activity of AMACR. Non-Patent Document 4 describes a radioassay for AMACR enzyme activity using 2-methyl [2- (3) H] acyl-CoA as a substrate. Non-Patent Document 9 describes an alternative enzyme assay for AMACR in which AMACR is coupled with 2R-methyl-pentadecanoyl-CoA. The 2S isomer of the reaction product is desaturated by an excess of added oxidase (pristanoyl CoA oxidase), which results in the production of hydrogen peroxide. This hydrogen peroxide is monitored by peroxidase in the presence of a suitable hydrogen donor. However, there is still a need for reliable and sensitive methods for assaying AMACR enzyme activity in samples (eg, for cancer diagnosis).
International Publication No. 02/27324 Pamphlet US Patent Application Publication No. 2002/0123081 Ferdinandse et al., J. MoI. Lipid Res. (2000) 41: 1890-1896 Cuebas et al., Biochem. J. et al. (2002) 363: 801-807 Schmitz et al., Eur. J. et al. Biochem. (1995) 231: 815-822 Schmitz et al., Eur. J. et al. Biochem. (1994) 222: 313-23 Rubin et al., JAMA (2002) 287: 1662-1670. Luo et al., Cancer Res. (2002) 62: 2220-2226 Sreekumar et al., J Natl. Cancer Inst. (2004) 96: 834-843 Kumar-Sinha et al., Am. J. et al. Pathol. (2004) 164: 787-93 Veldhoven et al., Biochem. Biophys. Acta (1997) 1347: 62-68.

（発明の簡単な要旨）
本発明は、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするための方法を提供する。該方法は、以下：ａ）α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルと（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡとを接触させ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを発生させる工程；ｂ）工程ａ）からの該（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを、発生した場合、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第一の電子アクセプターの存在下で、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡに変換し、これによって第一の電子アクセプターの還元型が発生される工程；該トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡを、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素および還元型の第２の電子アクセプターの存在下で、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡに再変換し、循環反応系を形成させ、これによって第２の電子アクセプターの酸化型が発生される工程；ここで第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターは異なる工程；およびｃ）該循環反応系において、第１の電子アクセプターの還元型もしくは酸化型の濃度変化または第２の電子アクセプターの還元型もしくは酸化型の濃度変化を評価し、これによって、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの、存在、非存在および／または量が測定される工程、を包含する、方法を提供する。 (Simple Summary of Invention)
The present invention provides a method for assaying α-methylacyl-CoA racemase in a sample. The method includes the following steps: a) contacting a sample suspected of containing α-methylacyl-CoA racemase with (2R) -2-methylacyl-CoA to generate (2S) -2-methylacyl-CoA; b ) When generated, the (2S) -2-methylacyl-CoA from step a) is trans-2 in the presence of (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and an oxidized first electron acceptor. , 3-dehydroacyl-CoA, whereby a reduced form of the first electron acceptor is generated; the trans-2,3-dehydroacyl-CoA is converted to trans-2,3-dehydroacyl-CoA In the presence of a converting enzyme and a reduced second electron acceptor, it is reconverted to (2S) -2-methylacyl-CoA to form a circulating reaction system. Wherein the oxidized form of the second electron acceptor is generated; wherein the first electron acceptor and the second electron acceptor are different; and c) the reduced form of the first electron acceptor or Assessing changes in the concentration of the oxidized form or the reduced or oxidized form of the second electron acceptor, thereby measuring the presence, absence and / or amount of α-methylacyl-CoA racemase in the sample A method comprising the steps of:

いくつかの実施形態では、該（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、アシル基の鎖長がＣ（４）〜Ｃ（３０）までの、Ｃ（８）〜Ｃ（２５）までの、またはＣ（１０）〜Ｃ（２５）までの、（２Ｒ）−２−メチル−分枝アシル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｒ）−プリスタノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは（２５Ｒ）−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コレスタノイル−ＣｏＡである。 In some embodiments, the (2R) -2-methylacyl-CoA has an acyl group chain length of C (4) to C (30), C (8) to C (25), or (2R) -2-methyl-branched acyl-CoA from C (10) to C (25). In some embodiments, (2R) -2-methylacyl-CoA is (2R) -pristanoyl-CoA. In some embodiments, (2R) -2-methylacyl-CoA is (25R) -3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholestanoyl-CoA.

いくつかの実施形態では、最初に、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第１の電子アクセプターがサンプルに添加され、そして次に、このサンプルは（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素、および還元型の第２の電子アクセプターに接触される。いくつかの実施形態では、α-メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、酸化型の第１の電子アクセプターと接触される。他の実施形態では、α-メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、酸化型の第１の電子アクセプター、トランス−２，３−デヒドルアシル−ＣｏＡ変換酵素、および酸化型の第２の電子アクセプターと接触される。 In some embodiments, first, (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and oxidized first electron acceptor are added to the sample, and then the sample is (2R) -2-methylacyl. -CoA, trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme, and reduced second electron acceptor. In some embodiments, the sample suspected of containing α-methylacyl-CoA racemase comprises (2R) -2-methylacyl-CoA, (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme, oxidized first Contacted with an electronic acceptor. In other embodiments, the sample suspected of containing α-methylacyl-CoA racemase is (2R) -2-methylacyl-CoA, (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme, oxidized first electron Contact is made with an acceptor, trans-2,3-dehydracyl-CoA converting enzyme, and an oxidized second electron acceptor.

いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は異なる。 In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are different.

いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、そして第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、チオ−ＮＡＤ^＋、チオ−ＮＡＤＰ^＋、アセチル−ＮＡＤ^＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ^＋からなる群から選択される。 In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is an acyl-CoA dehydrogenase and the first electron acceptor is NAD ⁺ , NADP ⁺ , thio-NAD ⁺ , thio-NADP ^+. , Acetyl-NAD ⁺ , and acetyl-NADP ⁺ .

いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼであり、第１の電子アクセプターはＯ_２である。 In some embodiments, (2S)-2-methylacyl -CoA converting enzyme is an acyl -CoA oxidase, the first electronic acceptor is _{O 2.}

いくつかの実施形態では、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される。 In some embodiments, the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase and the second electron acceptor is NADH, NADPH, thio-NADH, thio- Selected from the group consisting of NADPH, acetyl-NADH, and acetyl-NADPH.

いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素とは、同じである。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである。酸化型の第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、チオ−ＮＡＤ^＋、チオ−ＮＡＤＰ^＋、アセチル−ＮＡＤ^＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ^＋からなる群から選択され得、還元型の第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択され得る。 In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are the same. In some embodiments, both (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are acyl-CoA dehydrogenases. In some embodiments, both (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are trans-2-enoyl-CoA reductases. First electron acceptor oxidized ^form, NAD +, NADP ^+, thio-NAD ^+, thio-NADP ^+, acetyl-NAD ^+, and is selected from the group consisting of acetyl-NADP ⁺ resulting, reduced form second of The electron acceptor may be selected from the group consisting of NADH, NADPH, thio-NADH, thio-NADPH, acetyl-NADH, and acetyl-NADPH.

前記循環反応系における還元型もしくは酸化型の第１の電子アクセプターの濃度変化、または還元型もしくは酸化型の第２の電子アクセプターの濃度変化は、光度測定法（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ）によって評価され得る。 The concentration change of the reduced or oxidized first electron acceptor or the concentration change of the reduced or oxidized second electron acceptor in the circulation reaction system can be evaluated by a photometric method.

本発明の方法は、さらに、酸化型もしくは還元型の第１の電子アクセプターまたは還元型もしくは酸化型の第２の電子アクセプターを、還元型もしくは酸化型の第１の電子アクセプターの濃度変化または還元型もしくは酸化型の第２の電子アクセプターの濃度変化を評価するための、発色試薬に結合させる工程を包含し得る。ここで、この酸化型もしくは還元型の第１の電子アクセプターの濃度変化または還元型もしくは酸化型の第２の電子アクセプターの濃度変化は、比色測定法（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ）によって評価される。 The method of the present invention further provides an oxidized or reduced first electron acceptor or a reduced or oxidized second electron acceptor, a concentration change or reduced type of the reduced or oxidized first electron acceptor. Alternatively, a step of binding to a coloring reagent for evaluating a change in the concentration of the oxidized second electron acceptor may be included. Here, the change in the concentration of the oxidized or reduced first electron acceptor or the change in the concentration of the reduced or oxidized second electron acceptor is evaluated by a colorimetric method.

本発明の方法によってアッセイされ得るサンプルは、生物学的サンプルを含む。いくつかの実施形態では、この生物学的サンプルは、血液、血清、血漿、および尿などの生物学的流体である。いくつかの実施形態では生物学的サンプルは、前立腺、結腸、卵巣、乳房、膀胱、肺、腎臓、リンパ球からなる群から選択される。 Samples that can be assayed by the methods of the present invention include biological samples. In some embodiments, the biological sample is a biological fluid such as blood, serum, plasma, and urine. In some embodiments, the biological sample is selected from the group consisting of prostate, colon, ovary, breast, bladder, lung, kidney, lymphocyte.

本発明の方法は、個体における癌の予後および／または診断のために使用され得る。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、血液サンプル（例えば、全血、血漿、および血清）中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性をアッセイすることによって、個体における前立腺癌の予後および／または診断のために使用され得る。 The methods of the invention can be used for the prognosis and / or diagnosis of cancer in an individual. In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of prostate cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer, lung cancer, kidney cancer, lymphoma, and melanoma. In some embodiments, the methods of the invention can be used to assess prognosis and / or prostate cancer in an individual by assaying α-methylacyl-CoA racemase activity in blood samples (eg, whole blood, plasma, and serum). Can be used for diagnosis.

いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、個体からのサンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの量と、あらかじめ決められた値とを比較する工程を含み、これによって、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの量の増加は、個体が癌を有しているまたは癌を発生させる危険性があることを示す。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される。 In some embodiments, the method further comprises comparing the amount of α-methylacyl-CoA racemase in the sample from the individual to a predetermined value, whereby α-methylacyl-CoA. An increase in the amount of racemase indicates that the individual has cancer or is at risk of developing cancer. In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of prostate cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer, lung cancer, kidney cancer, lymphoma, and melanoma.

本発明はまた、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするためのキットを提供する。該キットは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、酸化型の第１の電子アクセプター、酸化型の第１の電子アクセプターの存在下において、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡのトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡへの変換を触媒する（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、還元型の第２の電子アクセプター、および還元型の第２の電子アクセプターの存在下において、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡの（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡへの変換を触媒するトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素を備え、ここで第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターは異なる。 The present invention also provides a kit for assaying α-methylacyl-CoA racemase in a sample. In the presence of (2R) -2-methylacyl-CoA, oxidized first electron acceptor, oxidized first electron acceptor, (2S) -2-methylacyl-CoA trans-2, Trans-2 in the presence of a (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme, a reduced second electron acceptor, and a reduced second electron acceptor that catalyses the conversion to 3-dehydroacyl-CoA , 3-dehydroacyl-CoA comprising a trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme that catalyzes the conversion of (2S) -2-methylacyl-CoA to a first electron acceptor and a second electron Acceptor is different.

いくつかの実施形態では、この（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、アシル基の鎖長がＣ（４）〜Ｃ（３０）までの、Ｃ（８）〜Ｃ（２５）までの、またはＣ（１０）〜Ｃ（２５）までの、（２Ｒ）−２−メチル−分枝アシル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｒ）−プリスタノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは（２５Ｒ）−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コレスタノイル−ＣｏＡである。 In some embodiments, the (2R) -2-methylacyl-CoA has an acyl group chain length of C (4) to C (30), C (8) to C (25), or (2R) -2-methyl-branched acyl-CoA from C (10) to C (25). In some embodiments, (2R) -2-methylacyl-CoA is (2R) -pristanoyl-CoA. In some embodiments, (2R) -2-methylacyl-CoA is (25R) -3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholestanoyl-CoA.

いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は異なる。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、そして第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、チオ−ＮＡＤ^＋、チオ−ＮＡＤＰ^＋、アセチル−ＮＡＤ^＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ^＋からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼであり、第１の電子アクセプターはＯ_２である。いくつかの実施形態では、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される。 In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are different. In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is an acyl-CoA dehydrogenase and the first electron acceptor is NAD ⁺ , NADP ⁺ , thio-NAD ⁺ , thio-NADP ^+. , Acetyl-NAD ⁺ , and acetyl-NADP ⁺ . In some embodiments, (2S)-2-methylacyl -CoA converting enzyme is an acyl -CoA oxidase, the first electronic acceptor is _{O 2.} In some embodiments, the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase and the second electron acceptor is NADH, NADPH, thio-NADH, thio- Selected from the group consisting of NADPH, acetyl-NADH, and acetyl-NADPH.

いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、同じである。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、酸化型の第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、チオ−ＮＡＤ^＋、チオ−ＮＡＤＰ^＋、アセチル−ＮＡＤ^＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ^＋からなる群から選択され、還元型の第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される。 In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are the same. In some embodiments, both (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are acyl-CoA dehydrogenase or trans-2-enoyl-CoA reductase , first electronic acceptor oxidized ^form, NAD +, NADP ^+, thio-NAD ^+, thio-NADP ^+, acetyl-NAD ^+, and is selected from the group consisting of acetyl-NADP ^+, the second of reduced The electron acceptor is selected from the group consisting of NADH, NADPH, thio-NADH, thio-NADPH, acetyl-NADH, and acetyl-NADPH.

キットは、さらに、これらに限られるわけではないが、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、および黒色腫を含む癌の予後および／または診断のための使用を示す使用説明書を含み得る。 The kit is further for prognosis and / or diagnosis of cancer including but not limited to prostate cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer, lung cancer, kidney cancer, lymphoma, and melanoma. Instructions indicating the use of can be included.

（発明の詳細な説明）
本発明は、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性をアッセイする方法を提供する。このアッセイでは、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有するサンプルまたはα−メチルアシル−ＣｏＡを含有する疑いのあるサンプルを、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡと接触させる。酵素的に活性なα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼがサンプル中に存在する場合、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡに変換される。本方法は、次に（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡおよびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡの間の循環反応系を利用して、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの酵素活性に対応する検出可能なシグナルを発生させる。本明細書において記載される方法は、癌を診断するために使用され得る。例えば、本方法は、血液サンプルを使用して、生検なしで、前立腺癌を診断するために使用され得る。 (Detailed description of the invention)
The present invention provides a method for assaying α-methylacyl-CoA racemase activity. In this assay, a sample containing α-methylacyl-CoA racemase or a sample suspected of containing α-methylacyl-CoA is contacted with (2R) -2-methylacyl-CoA. When enzymatically active α-methylacyl-CoA racemase is present in the sample, (2R) -2-methylacyl-CoA is converted to (2S) -2-methylacyl-CoA. The method then utilizes a cyclic reaction system between (2S) -2-methylacyl-CoA and trans-2,3-dehydroacyl-CoA to detect corresponding to the enzymatic activity of α-methylacyl-CoA racemase. Generate possible signals. The methods described herein can be used to diagnose cancer. For example, the method can be used to diagnose prostate cancer using a blood sample without a biopsy.

開示を明確にするために、そして限定するつもりはないが、本発明の詳細な説明は、以下に続くサブセクションに分けられる。 For clarity of disclosure and not by way of limitation, the detailed description of the invention is divided into the subsections that follow.

（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって、一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において参照される、全ての特許、特許出願、公開公報および他の出版物は、参考としてその全体が援用される。このセクションで記載される定義が、参考として本明細書において援用される、特許、特許出願、公開公報および他の出版物において示される定義と相容れないまたはさもなくば矛盾する場合は、このセクションにおいて示される定義を、参考として本明細書において援用される定義より優先させる。 (A. Definition)
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. All patents, patent applications, publications and other publications referenced herein are incorporated by reference in their entirety. In the event that the definitions set forth in this section are incompatible or otherwise inconsistent with the definitions set forth in patents, patent applications, publications and other publications incorporated herein by reference, they will be indicated in this section. To the definition incorporated herein by reference.

本明細書において使用されるときは、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。 As used herein, “a” or “an” means “at least one” or “one or more”.

本明細書において使用されるときは、「α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ」または「ＡＭＡＣＲ」（ＥＣ５．１．９９．４）とは、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡと（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡの間の変換を触媒する酵素をいう。その活性を実質的には変更しない、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの誘導体、改変体、および類似体を含むことが意図される。α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼは、ヒト、マウス、ウシ、ラット、ショウジョウバエ（ｆｒｕｉｔｆｌｙ）、その他などのいかなる供給源からも得られ得る。 As used herein, “α-methylacyl-CoA racemase” or “AMACR” (EC 5.11.99.4) refers to (2S) -2-methylacyl-CoA and (2R) -2- An enzyme that catalyzes the conversion between methylacyl-CoA. It is intended to include derivatives, variants, and analogs of α-methylacyl-CoA racemase that do not substantially alter its activity. The α-methylacyl-CoA racemase can be obtained from any source such as human, mouse, cow, rat, fruit fly, etc.

本明細書において使用されるときは、「（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素」とは、酸化型の電子アクセプターの存在下において、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡからのトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡの形成を触媒する酵素をいう。その活性を実質的には変更しない（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素の誘導体、改変体、および類似体を含むことが意図される。 As used herein, “(2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme” refers to trans-2 from (2S) -2-methylacyl-CoA in the presence of an oxidized electron acceptor. , 3-dehydroacyl-CoA refers to an enzyme that catalyzes the formation of CoA. It is intended to include derivatives, variants, and analogs of (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme that do not substantially alter its activity.

本明細書において使用されるときは、「トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素」とは、還元型の電子アクセプターの存在下において、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡからの（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡの形成を触媒する酵素をいう。その活性を実質的には変更しないトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の誘導体、改変体、および類似体を含むことが意図される。 As used herein, “trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme” refers to (from trans-2,3-dehydroacyl-CoA in the presence of a reduced electron acceptor. 2S) refers to an enzyme that catalyzes the formation of 2-methylacyl-CoA. It is intended to include derivatives, variants, and analogs of trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme that do not substantially alter its activity.

本明細書において使用されるときは、用語「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」は、反応系中に存在する分析物の量または濃度の絶対値を得るという意味での、および反応系中の分析物のレベルを示す、指標、比、パーセンテージ、視覚的値または他の値をも得るという意味での、量的測定および質的測定を含むことを意図する。評価は、直接でも間接でもよく、そして実際に検出される化学種は、当然分析物それ自身である必要はなく、例えばそれらの誘導体または何かのさらなる物質であり得る。 As used herein, the term “assessing” means to obtain an absolute value of the amount or concentration of analyte present in the reaction system, and of the analyte in the reaction system. It is intended to include quantitative and qualitative measurements in the sense of obtaining indicators, ratios, percentages, visual values or other values indicating levels. Assessment can be direct or indirect, and the chemical species actually detected need not of course be the analyte itself, but can be, for example, a derivative thereof or some additional substance.

本明細書において使用されるときは、「サンプル」とは、分析物アッセイが望まれる分析物を含有し得る全てのものをいう。サンプルは、生物学的流体または生物学的組織のような生物学的サンプルであり得る。生物学的流体の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが挙げられる。生物学的組織は、通常、特定の種類の、それらの細胞間物質を伴った、細胞の集合であり、ヒト、動物、植物、細菌、真菌またはウイルス構造体の構造材料の一つを形成する。これらとしては、結合組織、上皮組織、筋肉組織および神経組織が挙げられる。生物学的組織の例としては、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞もまた挙げられる。 As used herein, “sample” refers to anything that can contain an analyte for which an analyte assay is desired. The sample can be a biological sample such as a biological fluid or a biological tissue. Examples of biological fluids include urine, blood, plasma, serum, saliva, semen, stool, sputum, cerebrospinal fluid, tears, mucus, amniotic fluid, and the like. A biological tissue is a collection of cells, usually with certain types of their intercellular substances, forming one of the structural materials of a human, animal, plant, bacterial, fungal or viral structure . These include connective tissue, epithelial tissue, muscle tissue and nerve tissue. Examples of biological tissues also include organs, tumors, lymph nodes, arteries and individual cells.

本明細書において使用されるときは、「血液サンプル」としては、全血、血清、および血漿が挙げられる。 As used herein, “blood sample” includes whole blood, serum, and plasma.

本明細書において使用されるときは、「血清」とは、フィブリン血塊と血球とを取り除いた後に得られる血液の液体部分をいい、循環血液中の血漿とは区別される。 As used herein, “serum” refers to the liquid portion of blood obtained after removal of fibrin clots and blood cells and is distinct from plasma in the circulating blood.

本明細書において使用されるときは、「血漿」とは、血液の流体、非細胞部分をいい、血液凝固の後に得られる血清とは区別される。 As used herein, “plasma” refers to the fluid, non-cellular portion of blood, and is distinguished from serum obtained after blood clotting.

本明細書において使用されるときは、「流体」とは、流れ得る任意の組成物をいう。従って流体は、このように、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のこのような組成物の形態である組成物を含む。 As used herein, “fluid” refers to any composition that can flow. Thus, fluids thus include compositions that are in the form of pastes, solutions, aqueous mixtures, gels, lotions, creams and other such compositions.

本明細書において使用されるときは、「疾患または障害」とは、例えば、感染または遺伝的欠陥によりもたらされ、そして同定可能な症状によって特色付けられる、生物における病理学的状態をいう。 As used herein, “disease or disorder” refers to a pathological condition in an organism resulting from, for example, an infection or genetic defect and characterized by identifiable symptoms.

本明細書において使用されるときは、「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」とは、２つ以上の成分を一緒にすることを意味する。「接触させる」は、全ての成分を流体混合物中または半流体混合物中で、混合することによって達成され得る。「接触させる」は、１つ以上の成分を１つ以上の他の成分と、固体組織切片または基板などの固体表面上で接触させる場合もまた達成され得る。 As used herein, “contacting” means bringing two or more components together. “Contacting” can be accomplished by mixing all the components in a fluid mixture or a semi-fluid mixture. “Contacting” can also be accomplished when one or more components are contacted with one or more other components on a solid surface, such as a solid tissue section or substrate.

本明細書において使用されるときは、「循環反応系（ｃｙｃｌｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）」とは、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡをトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡへ変換する過程、およびトランス−２，３−デヒドロアシルＣｏＡから逆に（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡへと、変換する過程をいう。 As used herein, “cycling reaction system” refers to the process of converting (2S) -2-methylacyl-CoA to trans-2,3-dehydroacyl-CoA, and trans This refers to the process of converting 2,3-dehydroacyl CoA back to (2S) -2-methylacyl-CoA.

（Ｂ．α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイする方法）
本発明は、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするための方法を提供する。該方法は、以下：ａ）α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルと（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡとを接触させ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを発生させる工程；ｂ）工程ａ）からの該（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを、発生した場合、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第一の電子アクセプターの存在下で、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡに変換し、これによって第一の電子アクセプターの還元型が発生される工程；該トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡを、トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素および還元型の第２の電子アクセプターの存在下で、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡに再変換し、循環反応系を形成させ、これによって第２の電子アクセプターの酸化型が発生される工程；ここで第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターは異なる工程；およびｃ）該循環反応系において、第１の電子アクセプターの還元型もしくは酸化型の濃度変化または第２の電子アクセプターの還元型もしくは酸化型の濃度変化を評価し、これによって、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの、存在、非存在および／または量が測定される工程、を包含する。いくつかの実施形態では、工程ｃ）で発生した検出可能シグナルは、該循環反応系における、還元型もしくは酸化型の第１の電子アクセプター、または還元型もしくは酸化型の第２の電子アクセプターの濃度変化である。いくつかの実施形態では、サンプルは、血液サンプル（例えば、全血、血清、および血漿）である。 B. Method for assaying α-methylacyl-CoA racemase
The present invention provides a method for assaying α-methylacyl-CoA racemase in a sample. The method includes the following steps: a) contacting a sample suspected of containing α-methylacyl-CoA racemase with (2R) -2-methylacyl-CoA to generate (2S) -2-methylacyl-CoA; b ) When generated, the (2S) -2-methylacyl-CoA from step a) is trans-2 in the presence of (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and an oxidized first electron acceptor. , 3-dehydroacyl-CoA, whereby a reduced form of the first electron acceptor is generated; the trans-2,3 dehydroacyl-CoA is converted to a trans-2,3 dehydroacyl-CoA converting enzyme And re-converted to (2S) -2-methylacyl-CoA in the presence of a reduced second electron acceptor to form a cyclic reaction system, A step in which an oxidized form of the second electron acceptor is generated; a step in which the first electron acceptor and the second electron acceptor are different; and c) a reduced form of the first electron acceptor in the circulation reaction system. Or assessing the concentration change of the oxidized form or the reduced or oxidized form of the second electron acceptor, thereby measuring the presence, absence and / or amount of α-methylacyl-CoA racemase in the sample. The process. In some embodiments, the detectable signal generated in step c) is a concentration of a reduced or oxidized first electron acceptor or a reduced or oxidized second electron acceptor in the circulating reaction system. It is a change. In some embodiments, the sample is a blood sample (eg, whole blood, serum, and plasma).

（工程ａ）：α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼによる（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡの（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡへの変換）
本発明においてα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイする方法は、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼによって触媒される酵素活性を測定することに基づいている。α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼは、（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡを（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡへ変換するする反応を触媒する。従って、サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの存在または非存在および量は、これらの反応において発生した（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡを測定することによって決定され得る。それゆえ、本発明の工程ａ）の例示的反応スキームは：
（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ →
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ（１）
である。 (Step a): Conversion of (2R) -2-methylacyl CoA to (2S) -2-methylacyl-CoA by α-methylacyl-CoA racemase)
The method for assaying α-methylacyl-CoA racemase in the present invention is based on measuring the enzyme activity catalyzed by α-methylacyl-CoA racemase. α-Methylacyl-CoA racemase catalyzes the reaction converting (2R) -2-methylacyl CoA to (2S) -2-methylacyl-CoA. Thus, the presence or absence and amount of α-methylacyl-CoA racemase in the sample can be determined by measuring (2S) -2-methylacyl-CoA generated in these reactions. Therefore, an exemplary reaction scheme for step a) of the present invention is:
(2R) -2-methylacyl-CoA →
(2S) -2-methylacyl-CoA (1)
It is.

アッセイされるα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの基質であれば、どんな（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡも使用され得る。アシル基は、どんな脂肪酸からも由来し得る。アシル基は、鎖長が少なくともＣ（４）の、少なくともＣ（６）の、少なくともＣ（８）の、少なくともＣ（１０）またはそれを超える、分枝アシル（例えば脂肪酸アシル）であり得る。例えば、鎖長は、Ｃ（４）〜Ｃ（３０）、Ｃ（４）〜Ｃ（１６）、Ｃ（８）〜Ｃ（２５）、Ｃ（８）〜Ｃ（１８）、Ｃ（１０）〜Ｃ（２５）、またはＣ（１２）〜Ｃ（２５）であり得る。アシル基としては、芳香族化合物（例えば、イブプロフェン）およびトリヒドロキシコプロスタノイル−ＣｏＡなどの胆汁酸中間体が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｒ）−プリスタノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡは（２Ｒ，６Ｒ，１０）−トリメチルウンデカノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡは、（２Ｒ，６）−ジメチルヘプタノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシルＣｏＡは、（２Ｒ）−メチル−ペンタデカノイル−ＣｏＡである。いくつかの実施形態では、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２５Ｒ）−３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コレスタノイル−ＣｏＡである。 Any (2R) -2-methylacyl-CoA can be used as long as it is a substrate for the α-methylacyl-CoA racemase assayed. Acyl groups can be derived from any fatty acid. The acyl group can be a branched acyl (eg, fatty acyl) having a chain length of at least C (4), at least C (6), at least C (8), at least C (10) or more. For example, the chain lengths are C (4) to C (30), C (4) to C (16), C (8) to C (25), C (8) to C (18), C (10) -C (25), or C (12) -C (25). Acyl groups can include bile acid intermediates such as aromatic compounds (eg, ibuprofen) and trihydroxycoprostanoyl-CoA. In some embodiments, (2R) -2-methylacyl-CoA is (2R) -pristanoyl-CoA. In some embodiments, (2R) -2-methylacyl CoA is (2R, 6R, 10) -trimethylundecanoyl-CoA. In some embodiments, (2R) -2-methylacyl CoA is (2R, 6) -dimethylheptanoyl-CoA. In some embodiments, (2R) -2-methylacyl CoA is (2R) -methyl-pentadecanoyl-CoA. In some embodiments, (2R) -2-methylacyl-CoA is (25R) -3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholestanoyl-CoA.

工程ａ）の（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ反応のために適切であり、そしてサンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの活性に依存する、任意の濃度であり得る。例えば、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡの濃度は、約０．０１ｍＭから約１００ｍＭ、約０．０５ｍＭから約５０ｍＭ、約０．５ｍＭから約１０ｍＭ、または約１ｍＭから約５ｍＭである。酵素反応は、概して、酵素反応の完了に適切な条件（例えば緩衝液および温度など）の下で行われる。α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ酵素反応のために適切な、当該分野で公知の任意の緩衝液が使用され得る。例えば、緩衝液は、約６から約８のｐＨのリン酸緩衝液、約７から約９のｐＨのトリス−ＨＣｌ緩衝液、または約６から約９のｐＨのＧｏｏｄ緩衝液であり得る。例えば、反応は、約３０℃から３７℃の間の温度下で５分間、１０分間、１５分間、３０分間、または６０分間、行われ得る。この反応は、次の工程の前に終了され得る。 The (2R) -2-methylacyl-CoA in step a) is suitable for the α-methylacyl-CoA racemase reaction and is at any concentration depending on the activity of the α-methylacyl-CoA racemase in the sample. obtain. For example, the concentration of (2R) -2-methylacyl-CoA is about 0.01 mM to about 100 mM, about 0.05 mM to about 50 mM, about 0.5 mM to about 10 mM, or about 1 mM to about 5 mM. Enzymatic reactions are generally performed under conditions suitable for completion of the enzymatic reaction (eg, buffers and temperature). Any buffer known in the art suitable for the α-methylacyl-CoA racemase enzyme reaction may be used. For example, the buffer may be a phosphate buffer at a pH of about 6 to about 8, a Tris-HCl buffer at a pH of about 7 to about 9, or a Good buffer at a pH of about 6 to about 9. For example, the reaction can be performed at a temperature between about 30 ° C. and 37 ° C. for 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 30 minutes, or 60 minutes. This reaction can be terminated before the next step.

本発明を用いて、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する任意のサンプルまたはα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのある任意のサンプルがアッセイされ得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、血液（全血、血清および血漿が挙げられる）または尿である。いくつかの実施形態では、サンプルは組織サンプル（例えば、前立腺、結腸、卵巣、乳房、膀胱、肺、腎臓、およびリンパ球）である。いくつかの実施形態では、組織サンプルをホモジェナイゼーションにかけ、アッセイを行う前に粗組織ホモジェネートを得る。 Using the present invention, any sample containing α-methylacyl-CoA racemase or any sample suspected of containing α-methylacyl-CoA racemase can be assayed. In some embodiments, the sample is blood (including whole blood, serum and plasma) or urine. In some embodiments, the sample is a tissue sample (eg, prostate, colon, ovary, breast, bladder, lung, kidney, and lymphocytes). In some embodiments, the tissue sample is homogenized to obtain a crude tissue homogenate prior to performing the assay.

いくつかの実施形態では、サンプルは、アッセイが行われる前に、前処理される。例示的処理工程としては、遠心分離、抽出／洗浄、細胞溶解、凍結／融解、および音波破砕が挙げられる。サンプルはまた、アッセイの前に、希釈され得る。 In some embodiments, the sample is pretreated before the assay is performed. Exemplary processing steps include centrifugation, extraction / wash, cell lysis, freeze / thaw, and sonication. The sample can also be diluted prior to the assay.

（工程ｂ）：（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ／トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ循環反応系）
本発明の工程ｂ）では、第１の電子アクセプター（その酸化型）の存在下において、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素の作用を介して、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡをトランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡに変換し、そして次に、第２の電子アクセプター（その還元型）の存在下において、トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の作用を介して、トランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡを（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡに逆変換する。第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターは異なる電子アクセプターである。工程ｂ）は、このように循環反応系を形成し、還元型の第１の電子アクセプターの増加および酸化型の第１の電子アクセプターの減少、ならびに、酸化型の第２の電子アクセプターの増加および還元型の第２の電子アクセプターの減少を生じる。特定の型の電子アクセプターの増加または特定の型の電子アクセプターの減少が測定され得る。いくつかの実施形態では、特定の型の電子アクセプターが蓄積され、そしてその蓄積が評価される。 (Step b): (2S) -2-methylacyl-CoA / trans-2,3 dehydroacyl-CoA circulation reaction system)
In step b) of the present invention, (2S) -2-methylacyl-CoA is converted through the action of (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme in the presence of the first electron acceptor (its oxidized form). Trans-2,3 dehydroacyl-CoA and then trans-2,3 dehydroacyl-CoA converting enzyme via the action of a trans-2,3 dehydroacyl-CoA converting enzyme in the presence of a second electron acceptor (its reduced form). -2,3 Dehydroacyl-CoA is converted back to (2S) -2-methylacyl-CoA. The first electronic acceptor and the second electronic acceptor are different electronic acceptors. Step b) thus forms a cyclic reaction system, increasing the reduced first electron acceptor and decreasing the oxidized first electron acceptor, and increasing the oxidized second electron acceptor and This results in a reduction of the reduced second electron acceptor. An increase in a particular type of electron acceptor or a decrease in a particular type of electron acceptor can be measured. In some embodiments, specific types of electron acceptors are accumulated and the accumulation is evaluated.

いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素とは異なる。いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、第２の電子アクセプターと交差反応しないかまたは第２の電子アクセプターに第１の電子アクセプターに対するよりも低い親和性でしか結合しない、および／あるいはトランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、第１の電子アクセプターと交差反応しないかまたは第１の電子アクセプターに第１の電子アクセプターに対するよりも低い親和性で結合する。 In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is different from the trans-2,3 dehydroacyl-CoA converting enzyme. In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme does not cross-react with the second electron acceptor or has a lower affinity for the second electron acceptor than for the first electron acceptor. The trans-2,3 dehydroacyl-CoA converting enzyme does not cross-react with the first electron acceptor or binds to the first electron acceptor with a lower affinity than for the first electron acceptor. To do.

酸化型の電子アクセプターの存在下において、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡからのトランス−２，３デヒドロアシル−ＣｏＡの形成を触媒する、任意の（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素が使用され得る。 Any (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme that catalyzes the formation of trans-2,3 dehydroacyl-CoA from (2S) -2-methylacyl-CoA in the presence of an oxidized electron acceptor. Can be used.

いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．１．８）である。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｂ７０７１９（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のアミノ酸配列を有する任意のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．１．８）、またはＣｖｅｔａｎｏｖｉｃら（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪ．２２７：４９−５６（１９８５））、Ｄｏｍｍｅｓら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２５：３３５−３４１（１９８２））、およびＳｅｕｂｅｒｔら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１６４：４９８−５１７（１９６８））によって記載された任意のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．１．８）が使用され得る。 In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is an acyl-CoA dehydrogenase (EC 1.3.1.8). For example, any acyl-CoA dehydrogenase (EC 1.3.1.8) having the amino acid sequence of GenBank accession number B70719 (Mycobacterium tuberculosis) below, or Cvetanovic et al. (Biochemical J. 227: 49-56 (1985) ), Dommes et al. (Eur. J. Biochem. 125: 335-341 (1982)), and Sebert et al. (Biochim. Biophys. Acta 164: 498-517 (1968)), any acyl-CoA dehydrogenase ( EC 1.3.1.8) may be used.

他の実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＥＣ１．３．３．６）である。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｔ５２１２１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）、Ｔ５２１２０（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）、Ｉ３８０９５（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）、Ｓ６４２２４（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ａ５４９４２（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）、ＯＸＲＴＡ２（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｑｉｃｕｓ）、ＯＸＲＴＡ１（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｑｉｃｕｓ）、ＯＸＣＫＸ５（ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のアミノ酸配列を有する、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＥＣ１．３．３．６）が使用され得る。 In other embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is acyl-CoA oxidase (EC 1.3.3.6). For example, the following GenBank accession numbers: T52121 (Arabidopsis thaliana), T52120 (Arabidopsis thaliana), I38095 (Homo sapiens), S64224 (Sacromamyces cerevisiae), A5422 Acyl-CoA oxidase (EC 1.3.3.6) having the amino acid sequence of OXCKX5 (candida tropicalis) can be used.

さらに他の実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３８）である。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｓ７２４００（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｌｌｉｎｕｓ）のアミノ酸配列を有する任意のトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３８）、またはＭｉｚｕｇａｋｉら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１６４９−１６５４（１９８２））およびＰｒａｓａｄら（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３７：５３５−５４４（１９８５））によって記載された任意のトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３８）が使用され得る。 In yet another embodiment, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase (EC 1.3.1.38). For example, any trans-2-enoyl-CoA reductase having the amino acid sequence of the following GenBank accession number: S72400 (Streptomyces collinus) (EC 1.3.1.38), or Mizugaki et al. (J. Biochem. 92: 1649-1654 (1982)) and any trans-2-enoyl-CoA reductase (EC 1.3.1.38) described by Prasad et al. (Arch. Biochem. Biophys. 237: 535-544 (1985)). Can be used.

還元型の電子アクセプターの存在下において、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡからの（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡの形成を触媒する、任意のトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素が使用され得る。 Any trans-2,3-dehydroacyl-CoA conversion that catalyzes the formation of (2S) -2-methylacyl-CoA from trans-2,3-dehydroacyl-CoA in the presence of a reduced electron acceptor Enzymes can be used.

いくつかの実施形態では、このトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３８）である。当該分野で公知でありそして本明細書において記載される、任意のトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼが使用され得る。 In some embodiments, the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase (EC 1.3.1.38). Any trans-2-enoyl-CoA reductase known in the art and described herein can be used.

他の実施形態では、このトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．１．８）である。当該分野で公知でありそして本明細書において記載される、任意のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが使用され得る。 In other embodiments, the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is an acyl-CoA dehydrogenase (EC 1.3.1.8). Any acyl-CoA dehydrogenase known in the art and described herein can be used.

いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素とは同じである。一つの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。他の実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の両方が、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである。当該分野で公知でありそして本明細書において記載される、任意のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび任意のトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素が使用され得る。 In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are the same. In one embodiment, both the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are acyl-CoA dehydrogenases. In other embodiments, both the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are trans-2-enoyl-CoA reductases. Any acyl-CoA dehydrogenase and any trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme known in the art and described herein may be used.

第１および第２の電子アクセプターは、第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターとが異なるとの条件で、反応のために選択される酵素と適合性がある、任意の電子アクセプターであり得る。 The first and second electron acceptors can be any electron acceptor that is compatible with the enzyme selected for the reaction, provided that the first and second electron acceptors are different. .

いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、そして第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、チオ−ＮＡＤ^＋、チオ−ＮＡＤＰ^＋、アセチル−ＮＡＤ^＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ^＋からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼであり、そして第１の電子アクセプターはＯ_２である。いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして第１の電子アクセプターは、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、チオ−ＮＡＤ^＋、チオ−ＮＡＤＰ^＋、アセチル−ＮＡＤ^＋、およびアセチル−ＮＡＤＰ^＋からなる群から選択される。 In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is an acyl-CoA dehydrogenase and the first electron acceptor is NAD ⁺ , NADP ⁺ , thio-NAD ⁺ , thio-NADP. Selected from the group consisting of ⁺ , acetyl-NAD ⁺ , and acetyl-NADP ⁺ . In some embodiments, the (2S)-2-methylacyl -CoA converting enzyme is an acyl -CoA oxidase, and the first electronic acceptor is _{O 2.} In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase and the first electron acceptor is NAD ⁺ , NADP ⁺ , thio-NAD ^+. , Thio-NADP ⁺ , acetyl-NAD ⁺ , and acetyl-NADP ⁺ .

いくつかの実施形態では、このトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、そして第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、このトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、そして第２の電子アクセプターは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ−ＮＡＤＨ、チオ−ＮＡＤＰＨ、アセチル−ＮＡＤＨ、およびアセチル−ＮＡＤＰＨからなる群から選択される。 In some embodiments, the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase and the second electron acceptor is NADH, NADPH, thio-NADH, thio Selected from the group consisting of -NADPH, acetyl-NADH, and acetyl-NADPH. In some embodiments, the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is an acyl-CoA dehydrogenase and the second electron acceptor is NADH, NADPH, thio-NADH, thio-NADPH, acetyl. Selected from the group consisting of -NADH and acetyl-NADPH.

いくつかの実施形態では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アッセイにおいて発生するシグナルを増幅する、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡとトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡとの間の循環反応を、集合的に触媒し得る。この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、異なる電子アクセプターを使用し得、そして他方の酵素によって使用される電子アクセプターと交差反応（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔ）しないかまたは低い親和性でしか反応しない。代替として、これらの２つの酵素は、同じ電子アクセプターを認識し得る。十分な量の酸化型の第１の電子アクセプターおよび十分な量の還元型の第２の電子アクセプターが、両反応を駆動させ、そして十分なシグナルが発生されるまで循環がつづけられることを可能にするために、循環反応に添加され得る。 In some embodiments, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme amplify the signal generated in the assay. The cyclic reaction between CoA and trans-2,3-dehydroacyl-CoA can be catalyzed collectively. The (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme can use different electron acceptors and cross-react with the electron acceptor used by the other enzyme. -React) or react only with low affinity. Alternatively, these two enzymes can recognize the same electron acceptor. A sufficient amount of oxidized first electron acceptor and a sufficient amount of reduced second electron acceptor drive both reactions and allow circulation to continue until a sufficient signal is generated. Can be added to the circulation reaction.

工程ｂ）のための２つの以下の例示的反応スキームでは、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素とトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素とは異なる。例えば、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．１．８）であり、そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３８）である。このように、工程ｂ）のための例示的反応スキームは以下である：
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋チオ−ＮＡＤＰ^＋＋Ｈ_２Ｏ →
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋チオ−ＮＡＤＰＨ＋Ｈ^＋（２ａ）
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ^＋ →
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤ^＋＋Ｈ_２Ｏ（２ｂ）
反応（２ａ）は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される反応を表し、そして反応（２ｂ）は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼによって触媒される反応を表す。例として、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｓ）−プリスタノイル−ＣｏＡであり、そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡは、トランス−２，３−デヒドロプリスタノイル−ＣｏＡである。十分なチオ−ＮＡＤＰ^＋およびＮＡＤＨが、循環反応を発生させるために反応物に添加され得る。これはチオ−ＮＡＤＰＨの蓄積をもたらす。 In the following two exemplary reaction schemes for step b), (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are different. For example, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is acyl-CoA dehydrogenase (EC 1.3.1.8) and trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans- 2-Enoyl-CoA reductase (EC 1.3.1.38). Thus, an exemplary reaction scheme for step b) is as follows:
(2S) -2-methylacyl-CoA + thio-NADP ⁺ + H ₂ O →
Trans-2,3-dehydroacyl-CoA + thio-NADPH + H ⁺ (2a)
Trans-2,3-dehydroacyl-CoA + NADH + H ⁺ →
(2S) -2-Methylacyl-CoA + NAD ⁺ + H ₂ O (2b)
Reaction (2a) represents a reaction catalyzed by acyl-CoA dehydrogenase and reaction (2b) represents a reaction catalyzed by trans-2-enoyl-CoA reductase. As an example, (2S) -2-methylacyl-CoA is (2S) -pristanoyl-CoA and trans-2,3-dehydroacyl-CoA is trans-2,3-dehydropristanoyl-CoA. is there. Sufficient thio-NADP ⁺ and NADH can be added to the reaction to generate a circulating reaction. This leads to accumulation of thio-NADPH.

別の例では、循環反応で、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＥＣ１．３．３．６）は（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素として使用され、そしてトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３８）がトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素として使用される。例示的反応スキームは以下である：
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋Ｏ_２ →
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋Ｈ_２Ｏ_２（３ａ）
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ^＋ →
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰ^＋＋Ｈ_２Ｏ（３ｂ）
反応（３ａ）は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼによって触媒される反応を表し、そして反応（３ｂ）は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼによって触媒される反応を表す。例として、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｓ）−プリスタノイル−ＣｏＡであり、そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡは、トランス−２，３−デヒドロプリスタノイル−ＣｏＡである。十分な量のＯ_２およびＮＡＤＰＨが、循環反応を発生させるために反応物に添加され得る。これはＮＡＤＰ^＋およびＨ_２Ｏ_２の蓄積をもたらす。 In another example, in a cyclic reaction, acyl-CoA oxidase (EC 1.3.3.6) is used as a (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and trans-2-enoyl-CoA reductase (EC 1.3.1.38) is used as a trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme. An exemplary reaction scheme is as follows:
(2S) -2-methylacyl-CoA + O ₂ →
Trans-2,3-dehydroacyl-CoA + H ₂ O ₂ (3a)
Trans-2,3-dehydroacyl-CoA + NADPH + H ⁺ →
(2S) -2-methylacyl-CoA + NADP ⁺ + H ₂ O (3b)
Reaction (3a) represents a reaction catalyzed by acyl-CoA oxidase and reaction (3b) represents a reaction catalyzed by trans-2-enoyl-CoA reductase. As an example, (2S) -2-methylacyl-CoA is (2S) -pristanoyl-CoA and trans-2,3-dehydroacyl-CoA is trans-2,3-dehydropristanoyl-CoA. is there. Sufficient amounts of O ₂ and NADPH can be added to the reaction to generate a circulating reaction. This results in the accumulation of NADP ⁺ and _H 2 _{O 2.}

以下は、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素が同じである場合の、例示的反応スキームである。一つのこのような例示的反応スキームは以下である：
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋チオ−ＮＡＤＰ^＋＋Ｈ_２Ｏ →
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋チオ−ＮＡＤＰＨ＋Ｈ^＋（４ａ）
トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ^＋ →
（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤ^＋＋Ｈ_２Ｏ（４ｂ）
反応（４ａ）および（４ｂ）の両方は、同じ酵素によって触媒され、この酵素はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．１．８）またはトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３８）である。例として、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡは、（２Ｓ）−プリスタノイル−ＣｏＡであり、そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡは、トランス−２，３−デヒドロプリスタノイル−ＣｏＡである。十分なチオ−ＮＡＤＰ^＋およびＮＡＤＨが、循環反応中で両反応を駆動させるために反応混合物に添加し得る。循環反応はチオ−ＮＡＤＰＨの蓄積をもたらす。 The following is an exemplary reaction scheme where the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are the same. One such exemplary reaction scheme is as follows:
(2S) -2-methylacyl-CoA + thio-NADP ⁺ + H ₂ O →
Trans-2,3-dehydroacyl-CoA + thio-NADPH + H ⁺ (4a)
Trans-2,3-dehydroacyl-CoA + NADH + H ⁺ →
(2S) -2-Methylacyl-CoA + NAD ⁺ + H ₂ O (4b)
Both reactions (4a) and (4b) are catalyzed by the same enzyme, which is acyl-CoA dehydrogenase (EC 1.3.1.8) or trans-2-enoyl-CoA reductase (EC 1.3. 1.38). As an example, (2S) -2-methylacyl-CoA is (2S) -pristanoyl-CoA and trans-2,3-dehydroacyl-CoA is trans-2,3-dehydropristanoyl-CoA. is there. Sufficient thio-NADP ⁺ and NADH can be added to the reaction mixture to drive both reactions in a cyclic reaction. The cyclic reaction results in the accumulation of thio-NADPH.

同じ循環効果を達成するのに、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素およびトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素の任意の他の組み合わせが使用され得る。 Any other combination of (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme can be used to achieve the same cycling effect.

工程ａ）および工程ｂ）の酵素反応は、概して、酵素反応の完了のために適切な条件（例えば、緩衝液および温度）下で行われる。本明細書において記載される工程ｂ）および工程ａ）のための緩衝液は、同じでものであっても異なるものであってもよい。工程ａ）および／またはｂ）における特定の酵素反応のために適切な、当該分野で公知の任意の緩衝液が使用され得る。例えば、緩衝液は、約６から約８のｐＨのリン酸緩衝液、約７から約９のｐＨのトリス−ＨＣｌ緩衝液、または約６から約９のｐＨのＧｏｏｄ緩衝液であり得る。 The enzymatic reaction of step a) and step b) is generally performed under conditions (eg, buffer and temperature) appropriate for completion of the enzymatic reaction. The buffers for step b) and step a) described herein may be the same or different. Any buffer known in the art suitable for the particular enzymatic reaction in steps a) and / or b) can be used. For example, the buffer may be a phosphate buffer at a pH of about 6 to about 8, a Tris-HCl buffer at a pH of about 7 to about 9, or a Good buffer at a pH of about 6 to about 9.

工程ｂ）の温度は、工程ａ）と同じであっても異なっていてもよい。工程ｂ）の温度は、好ましくは、約２５℃から約３７℃の間である。 The temperature of step b) may be the same as or different from step a). The temperature of step b) is preferably between about 25 ° C and about 37 ° C.

いくつかの実施形態では、本明細書において記載される１つ以上の工程が、別々の反応混合物中で行われる。例えば、反応の１つ以上の工程の最終生成物が、次の工程のための試薬が添加される前に、反応混合物から部分的または完全に分離され得る。 In some embodiments, one or more steps described herein are performed in separate reaction mixtures. For example, the final product of one or more steps of the reaction can be partially or completely separated from the reaction mixture before the reagents for the next step are added.

いくつかの実施形態では、本明細書において記載される工程ａ）およびｂ）は、単一の反応混合物中で行われる。いくつかの実施形態では、次の工程のための酵素、基質、または電子アクセプターは、前の工程の終わりに同じ反応混合物に、連続して添加される。いくつかの実施形態では、前の工程の反応は、次の工程のための試薬が添加される前に、終了される。いくつかの実施形態では、１つを超える数の工程のためのいくつかの試薬または全ての試薬が、反応混合物に同時に添加される。いくつかの実施形態では、工程ａ）およびｂ）のための試薬が、同時にサンプルと混合される。これらの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、および酸化型の第１の電子アクセプター、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素、および還元型の第２の電子アクセプターと接触される。いくつかの実施形態では、工程ａ）のための試薬および工程ｂ）のための試薬のいくつかが、同時にサンプルと混合される。これらの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを含有する疑いのあるサンプルは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、酸化型の第１の電子アクセプターと接触される。 In some embodiments, steps a) and b) described herein are performed in a single reaction mixture. In some embodiments, the enzyme, substrate, or electron acceptor for the next step is added sequentially to the same reaction mixture at the end of the previous step. In some embodiments, the reaction of the previous step is terminated before the reagent for the next step is added. In some embodiments, some or all reagents for more than one step are added to the reaction mixture simultaneously. In some embodiments, the reagents for steps a) and b) are mixed with the sample at the same time. In these embodiments, the sample suspected of containing α-methylacyl-CoA racemase is (2R) -2-methylacyl-CoA, (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme, and oxidized first Contact is made with an electron acceptor, trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme, and a reduced second electron acceptor. In some embodiments, the reagents for step a) and some of the reagents for step b) are mixed with the sample at the same time. In these embodiments, samples suspected of containing α-methylacyl-CoA racemase are (2R) -2-methylacyl-CoA, (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme, oxidized first electron. Contacted with an acceptor.

いくつかの実施形態では、工程ｂ）のための試薬のいくつかがサンプルと最初に混合され、そして工程ａ）のための試薬および工程ｂ）のための他の試薬が後に添加される。いくつかの実施形態では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第１の電子アクセプターが、サンプルに最初に添加され、そして次にサンプルは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素、および還元型の第２の電子アクセプターと接触される。いくつかの実施形態では、このサンプルは（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素および酸化型の第１の電子アクセプターと共にインキュベートされ、サンプル中の（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡのトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡへの変換を可能にする。これらの実施形態は、実施例１および実施例２に詳細に記載されている。 In some embodiments, some of the reagents for step b) are first mixed with the sample, and the reagents for step a) and other reagents for step b) are added later. In some embodiments, (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and an oxidized first electron acceptor are first added to the sample, and then the sample is (2R) -2-methylacyl- Contacted with CoA, trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme, and a reduced second electron acceptor. In some embodiments, the sample is incubated with (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and an oxidized first electron acceptor, and trans-2 of (2S) -2-methylacyl-CoA in the sample. , Allowing conversion to 3-dehydroacyl-CoA. These embodiments are described in detail in Example 1 and Example 2.

（工程ｃ）：工程ｂ）において発生したシグナルの評価）
サンプル中のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの定量は、工程ｂ）において発生したシグナルの減ずる差または加えられる差をモニターすることによって達成され得る。評価は、連続的にまたは異なる時点で行い得る。 (Step c): Evaluation of signal generated in step b))
Quantification of α-methylacyl-CoA racemase in the sample can be achieved by monitoring the decreasing or added difference in the signal generated in step b). The assessment can be performed continuously or at different times.

いくつかの実施形態では、還元型または酸化型の第１の電子アクセプターの濃度変化が評価される。いくつかの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの活性は、還元型の第１の電子アクセプターの濃度の増加を評価することによって決定される。いくつかの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの活性は、酸化型の第１の電子アクセプターの濃度の減少を評価することによって決定される。 In some embodiments, the concentration change of the reduced or oxidized first electron acceptor is evaluated. In some embodiments, the activity of α-methylacyl-CoA racemase is determined by assessing an increase in the concentration of reduced first electron acceptor. In some embodiments, the activity of α-methylacyl-CoA racemase is determined by assessing a decrease in the concentration of oxidized first electron acceptor.

いくつかの実施形態では、還元型または酸化型の第２の電子アクセプターの濃度変化が評価される。いくつかの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの活性は、還元型の第２の電子アクセプターの濃度の減少を評価することによって決定される。いくつかの実施形態では、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの活性は、酸化型の第２の電子アクセプターの濃度の増加を評価することによって決定される。 In some embodiments, the concentration change of the reduced or oxidized second electron acceptor is evaluated. In some embodiments, the activity of α-methylacyl-CoA racemase is determined by assessing a decrease in the concentration of the reduced second electron acceptor. In some embodiments, the activity of α-methylacyl-CoA racemase is determined by assessing an increase in the concentration of oxidized second electron acceptor.

本明細書において記載される電子アクセプターの濃度変化は、当該分野で公知の方法を用いて評価され得る。例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度変化は、３４０ｎｍの吸収を測定することによって、分光光度測定的に決定され得る。チオ−ＮＡＤＰＨの濃度変化は、４０５ｎｍの吸収を測定することによって、分光光度測定的に決定され得る。 The change in concentration of the electron acceptor described herein can be evaluated using methods known in the art. For example, NADH or NADPH concentration change can be determined spectrophotometrically by measuring absorption at 340 nm. The concentration change of thio-NADPH can be determined spectrophotometrically by measuring the absorption at 405 nm.

いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度変化は、電子輸送色原体（ｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）を用いる比色測定法によって測定され得る。電子輸送色原体としては、塩化３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム、臭化３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム、３，３’−（４，４’−ビフェニレン）−ビス（塩化２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）−ビス［塩化２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］（＝ニトロ−テトラゾリウム：ＮＴＢ）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’ビフェニレン）−ビス［塩化２，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）−ビス（塩化２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）、および２，６−ジクロロフェノール−インドフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい例は、水溶性テトラゾリウム塩およびジアホラーゼまたはフェナジンメトスルフェートとの組み合わせである。これらの電子輸送色原体は、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨのための電子アクセプターであり、着色したホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎｅ）色素を形成し、そして形成される色素は、それらの最大吸収において比色測定的に測定される。 In some embodiments, the change in NADH or NADPH concentration can be measured by a colorimetric method using an electron transport chromogen. Electron transporting chromogens include 3- (p-iodophenyl) -2- (p-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium chloride, 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl bromide) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium, 3,3 '-(4,4'-biphenylene) -bis (2,5-diphenyl-2H-tetrazolium chloride), 3,3'-(3,3'- Dimethoxy-4,4′-biphenylene) -bis [2- (p-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium chloride] (= nitro-tetrazolium: NTB), 3,3 ′-(3,3′- Dimethoxy-4,4′biphenylene) -bis [2,5-bis (p-nitrophenyl) -2H-tetrazolium chloride], 3,3 ′-(3,3′-dimethoxy-4,4′-biphenylene)- Screw( Of 2,5-diphenyl -2H- tetrazolium), and 2,6-dichlorophenol - but indophenol include, but are not limited to. A preferred example is a combination of a water soluble tetrazolium salt and diaphorase or phenazine methosulfate. These electron transporting chromogens are electron acceptors for NADP or NADPH, forming colored formazan dyes, and the dyes formed are measured colorimetrically at their maximum absorption. The

ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのためのさらなるアッセイ方法は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰＨが、リザズリン（ｒｅｓａｚｕｌｉｎ）などの蛍光試薬の存在下にジアホラーゼで処理される、蛍光光度測定法である。 A further assay method for NADH or NADPH is a fluorometric method in which NAD or NADPH is treated with diaphorase in the presence of a fluorescent reagent such as resazurin.

本明細書において記載される還元型および／または酸化型の電子アクセプターの濃度の測定は、当該分野において公知である。たとえば、消費されたＯ_２または形成されたＨ_２Ｏ_２の量は、電子センサー（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓｅｎｓｏｒ）の使用によってアッセイされ得る。非常に多くの還元−酸化指示器（ｒｅｄ−ｏｘｉｎｄｉｃａｔｏｒ）が、この目的のために使用され得、そして溶液中のＨ_２Ｏ_２およびＯ_２をアッセイするために、広範囲の方法が文献中に記載されている。発生したＨ_２Ｏ_２はまた、指示薬とＨ_２Ｏ_２を反応させることによって、検出可能生成物として測定され得る。指示薬の例は、分光光度測定的方法によって測定され得る試薬、カラー指示薬（ｃｏｌｏｒｉｎｄｉｃａｔｏｒ）、蛍光試薬または発光試薬である。例えば、Ｈ_２Ｏ_２は、ぺルオキシオキザレートおよびアクリジニウムエステルの非酵素的化学発光反応を使用して評価され得る。 The measurement of the concentration of reduced and / or oxidized electron acceptors described herein is known in the art. For example, the amount of O ₂ consumed or formed H ₂ O ₂ can be assayed by use of an electronic sensor. A large number of red-ox indicators can be used for this purpose, and a wide range of methods are available in the literature for assaying H ₂ O ₂ and O ₂ in solution. Are listed. The generated H ₂ O ₂ can also be measured as a detectable product by reacting the indicator with H ₂ O ₂ . Examples of indicators are reagents that can be measured by spectrophotometric methods, color indicators, fluorescent reagents or luminescent reagents. For example, H ₂ O ₂ can be evaluated using a non-enzymatic chemiluminescent reaction of peroxyoxalates and acridinium esters.

アッセイは、ポジティブおよびバックグラウンドの対照（ｐｏｓｉｔｉｖｅａｎｄｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｃｏｎｔｒｏｌｓ）を伴う、二重で行い得る。既知の量の、既知の活性のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを使用することによって、標準曲線が得られ得る。それぞれのサンプルのα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼのレベルは、次に、測定されるそれぞれのシグナルをこの標準曲線と比較することによって測定され得る。 The assay can be performed in duplicate, with positive and background controls. By using known amounts of known active α-methylacyl-CoA racemase, a standard curve can be obtained. The level of α-methylacyl-CoA racemase in each sample can then be measured by comparing each measured signal to this standard curve.

（Ｃ．本方法の使用）
本発明は、血液サンプルなどのサンプル中に存在するα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼを検出するための増加した感度を有するアッセイを提供する。本発明の方法は、このように、変更されたα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼのレベルと関係する状態を検出するための実用的手段、および個体においてα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼレベルをモニターするための実用的手段を提供する。本方法は、被験体における、不適当な量もしくは活性のα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ、またはこれの効果もしくは活性と関係する任意の疾患の予後または診断のために使用され得る。このような疾患の例としては、これらに限られるわけではないが、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、および黒色腫などの癌が挙げられる。 (C. Use of this method)
The present invention provides an assay with increased sensitivity for detecting α-methylacyl-CoA racemase present in a sample such as a blood sample. The method of the present invention thus provides a practical means for detecting conditions associated with altered α-methylacyl-CoA racemase levels, and a practical method for monitoring α-methylacyl-CoA racemase levels in an individual. Provide a means of learning. The method may be used for the prognosis or diagnosis of an inappropriate amount or activity of α-methylacyl-CoA racemase, or any disease associated with its effect or activity, in a subject. Examples of such diseases include, but are not limited to, cancers such as prostate cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer, lung cancer, kidney cancer, lymphoma, and melanoma.

本発明の酵素アッセイは、生物学的過程および種々の病理学的状態におけるα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの役割を探求するための研究道具もまた提供する。 The enzyme assay of the present invention also provides a research tool for exploring the role of α-methylacyl-CoA racemase in biological processes and various pathological conditions.

（Ｄ．α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼをアッセイするためのキット）
本発明は、診断キットなどの、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ活性をアッセイするためのキットもまた提供する。このようなキットは、本発明の方法を行うために、本明細書において記載される、１つ以上の基質、酵素試薬および電子アクセプターを包含する。いくつかの実施形態では、キットは、（２Ｒ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素、酸化型の第１の電子アクセプター、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素、および還元型の第２の電子アクセプターを含み、ここで第１の電子アクセプターと第２の電子アクセプターとは異なる。本明細書において記載される任意の基質、酵素、および電子アクセプターが、キットに含まれ得る。キットはまた、ポジティブおよび／またはネガティブの対照標準も含み得、同様に、例えば比色測定アッセイを行うための試薬などの、工程ｂ）によって発生されるシグナルを評価するために必要な試薬を含み得る。キットはまた、本発明の方法を行うためのおよび／または加工のためにサンプルを診断試験所まで移動させるための、器具または容器、ならびに本発明の方法を行うための適切な使用説明書も含み得る。 (D. Kit for assaying α-methylacyl-CoA racemase)
The present invention also provides kits for assaying α-methylacyl-CoA racemase activity, such as diagnostic kits. Such kits include one or more substrates, enzyme reagents, and electron acceptors described herein to perform the methods of the invention. In some embodiments, the kit comprises (2R) -2-methylacyl-CoA, (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme, oxidized first electron acceptor, trans-2,3-dehydroacyl- It includes a CoA converting enzyme and a reduced second electron acceptor, wherein the first electron acceptor is different from the second electron acceptor. Any substrate, enzyme, and electron acceptor described herein can be included in the kit. The kit can also include positive and / or negative controls, as well as reagents necessary to assess the signal generated by step b), such as reagents for performing colorimetric assays, for example. obtain. The kit also includes an instrument or container for carrying out the method of the invention and / or transferring a sample to a diagnostic laboratory for processing, and appropriate instructions for carrying out the method of the invention. obtain.

本発明のキットは、任意の適切な包装状態であり得る。例えば、診断システムに関連して本明細書において論じられる包装は、診断システムにおいて習慣的に利用されるものである。このような包装は、自動分析器において使用するために適切な容器を含む。 The kit of the present invention can be in any suitable packaging. For example, the packaging discussed herein in connection with a diagnostic system is customarily utilized in a diagnostic system. Such packaging includes suitable containers for use in automated analyzers.

（Ｅ．実施例）
以下の実施例は、例示的目的にのみのために含められ、そして本発明の範囲を限定する意図はない。 (E. Examples)
The following examples are included for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention.

（実施例１．アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼを使用するα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）アッセイ）
この研究では、この（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり；そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである。この研究において使用される試薬は、以下の表１および表２に示される。 Example 1. α-Methylacyl-CoA racemase (AMACR) assay using acyl-CoA dehydrogenase and trans-2-enoyl-CoA reductase
In this study, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is an acyl-CoA dehydrogenase; and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is a trans-2-enoyl-CoA reductase . The reagents used in this study are shown in Tables 1 and 2 below.

この研究では、２６０μｌの試薬１を２０μｌのサンプル（血清または血漿）に加える。２５℃または３７℃下での５分間のインキュベーションの後、６０μｌの試薬２を、反応混合物に加える。４０５ｎｍの吸収変化を、８分間から１０分間の間モニターする。４０５ｎｍでの増加速度を、ＡＭＡＣＲキャリブレーターから発生される速度に対して、サンプル中のＡＭＡＣＲ活性をキャリブレーションするため使用する。

In this study, 260 μl of reagent 1 is added to a 20 μl sample (serum or plasma). After 5 minutes incubation at 25 ° C. or 37 ° C., 60 μl of reagent 2 is added to the reaction mixture. The absorbance change at 405 nm is monitored for 8 to 10 minutes. The increasing rate at 405 nm is used to calibrate AMACR activity in the sample against the rate generated from the AMACR calibrator.

（実施例２．アシル−ＣｏＡオキシダーゼおよびトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼを使用するα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）アッセイ）
この研究では、（２Ｓ）−２−メチルアシル−ＣｏＡ変換酵素は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼであり；そしてトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ変換酵素は、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼである。この研究において使用される試薬は、以下の表３および表４に示される。 Example 2. α-Methylacyl-CoA racemase (AMACR) assay using acyl-CoA oxidase and trans-2-enoyl-CoA reductase
In this study, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is acyl-CoA oxidase; and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase. The reagents used in this study are shown in Tables 3 and 4 below.

この研究では、２６０μｌの試薬１を２５μｌのサンプル（血清または血漿）の中へ加える。２５℃または３７℃下での５分間のインキュベーションの後、６０μｌの試薬２を、反応混合物に加える。５５０ｎｍの吸収変化を、８分間から１０分間の間モニターする。サンプル中のＡＭＡＣＲ活性を、ＡＭＡＣＲキャリブレーターを用いてキャリブレーションする。

In this study, 260 μl of reagent 1 is added into a 25 μl sample (serum or plasma). After 5 minutes incubation at 25 ° C. or 37 ° C., 60 μl of reagent 2 is added to the reaction mixture. The change in absorbance at 550 nm is monitored for 8 to 10 minutes. AMACR activity in the sample is calibrated using an AMACR calibrator.

上記の実施例は、例示的目的のみのために包含され、そして本発明の範囲を限定する意図はない。上に記載されるものの多くの変形形態が可能である。上記の実施例の変更形態および変形形態が、当該分野の当業者には明白であるので、本発明は添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることが意図される。 The above examples are included for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention. Many variations of those described above are possible. Since modifications and variations of the examples described above will be apparent to those skilled in the art, the present invention is intended to be limited only by the scope of the appended claims.

Claims

A method for assaying α-methylacyl-CoA racemase in a sample, the method comprising:
a) contacting a sample suspected of containing α-methylacyl-CoA racemase with (2R) -2-methylacyl-CoA to generate (2S) -2-methylacyl-CoA;
b) When generated, the (2S) -2-methylacyl-CoA from step a) is trans-in the presence of (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and an oxidized first electron acceptor. Converting to 2,3-dehydroacyl-CoA, whereby a reduced form of the first electron acceptor is generated; trans-2,3 dehydroacyl-CoA is converted to trans-2,3 dehydroacyl -In the presence of a CoA converting enzyme and a reduced second electron acceptor, it is reconverted to (2S) -2-methylacyl-CoA to form a cyclic reaction system, whereby the oxidized form of the second electron acceptor is A step in which the first electron acceptor is different from the second electron acceptor; and c) a first electron acceptor in the cyclic reaction system. The concentration change of the reduced or oxidized form of the second or the concentration change of the reduced or oxidized form of the second electron acceptor, whereby the presence, absence and / or presence of α-methylacyl-CoA racemase in the sample is evaluated. Or determining the amount.

The method of claim 1, wherein the (2R) -2-methylacyl-CoA is (2R) -2-methyl-branched acyl-CoA having a chain length from C (4) to C (30). .

The method of claim 1, wherein the (2R) -2-methylacyl-CoA is (2R) -2-methyl-branched acyl-CoA having a chain length from C (8) to C (25). .

The method of claim 1, wherein the (2R) -2-methylacyl-CoA is (2R) -pristanoyl-CoA.

The method of claim 1, wherein the (2R) -2-methylacyl-CoA is (25R) -3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholestanoyl-CoA.

First, the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the oxidized first electron acceptor are added into the sample, and then the sample is (2R) -2-methylacyl-CoA, trans- 2. The method of claim 1, wherein the method is contacted with a 2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme and the reduced second electron acceptor.

The method according to claim 1, wherein the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are different.

The (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is an acyl-CoA dehydrogenase, and the first electron acceptor is NAD ⁺ , NADP ⁺ , thio-NAD ⁺ , thio-NADP ⁺ , acetyl-NAD ⁺ , and 8. The method of claim 7, wherein the method is selected from the group consisting of acetyl-NADP ⁺ .

The (2S)-2-methylacyl -CoA converting enzyme acyl -CoA oxidase, and the first electronic acceptor is _{O 2,} The method of claim 7.

The trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase and the second electron acceptor is NADH, NADPH, thio-NADH, thio-NADPH, acetyl-NADH, and 8. The method of claim 7, wherein the method is selected from the group consisting of acetyl-NADPH.

The trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase and the second electron acceptor is NADH, NADPH, thio-NADH, thio-NADPH, acetyl-NADH, and 9. The method of claim 8, wherein the method is selected from the group consisting of acetyl-NADPH.

The trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase and the second electron acceptor is NADH, NADPH, thio-NADH, thio-NADPH, acetyl-NADH, and 10. The method of claim 9, wherein the method is selected from the group consisting of acetyl-NADPH.

The method of claim 1, wherein the (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are the same.

14. The (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme and the trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme are both acyl-CoA dehydrogenase or trans-2-enoyl-CoA reductase. The method described.

Said oxidized electron acceptor is selected from the group consisting of NAD ⁺ , NADP ⁺ , thio-NAD ⁺ , thio-NADP ⁺ , acetyl-NAD ⁺ , and acetyl-NADP ⁺ ; 15. The method of claim 14, wherein the second electron acceptor is selected from the group consisting of NADH, NADPH, thio-NADH, thio-NADPH, acetyl-NADH, and acetyl-NADPH.

The method of claim 1, wherein the concentration change is evaluated by photometric method.

2. The method according to claim 1, further comprising, after step c), the oxidized or reduced first electron acceptor or the reduced or oxidized second electron acceptor. A change in the concentration of the oxidized or reduced first electron acceptor or the change in the concentration of the reduced or oxidized second electron acceptor is a colorimetric measurement. Method, evaluated by law.

The method of claim 1, wherein the sample is a biological sample.

The method of claim 18, wherein the biological sample is a blood sample.

20. The method of claim 19, wherein the blood sample is selected from the group consisting of whole blood, serum, and plasma.

19. The method of claim 18, wherein the biological sample is selected from the group consisting of prostate, colon, ovary, breast, bladder, lung, kidney, lymphocyte.

2. The method of claim 1, wherein the method is used for the prognosis and / or diagnosis of cancer in an individual.

23. The method of claim 22, further comprising the step of comparing the amount of α-methylacyl-CoA racemase in the sample from the individual with a predetermined value, A method wherein an increase in the amount of α-methylacyl-CoA racemase indicates that the individual has cancer or is at risk of developing cancer.

23. The method of claim 22, wherein the cancer is selected from the group consisting of prostate cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer, lung cancer, kidney cancer, lymphoma, and melanoma.

A kit for assaying α-methylacyl-CoA racemase in a sample, comprising: (2R) -2-methylacyl-CoA, oxidized first electron acceptor, oxidized first electron (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme catalyzing the conversion of (2S) -2-methylacyl-CoA to trans-2,3-dehydroacyl-CoA in the presence of an acceptor, reduced second electron Trans-2,3-dehydroacyl that catalyzes the conversion of trans-2,3-dehydroacyl-CoA to (2S) -2-methylacyl-CoA in the presence of the acceptor and the reduced form of the second electron acceptor A kit comprising a CoA converting enzyme, wherein the first electron acceptor and the second electron acceptor are different.

26. The kit of claim 25, wherein the (2R) -2-methylacyl-CoA is (2R) -2-methyl-branched acyl-CoA having a chain length from C (4) to C (30). .

26. The kit of claim 25, wherein the (2R) -2-methylacyl-CoA is (2R) -2-methyl-branched acyl-CoA having a chain length from C (8) to C (25). .

26. The kit of claim 25, wherein the (2R) -2-methylacyl-CoA is (2R) -pristanoyl-CoA.

26. The kit of claim 25, wherein the (2R) -2-methylacyl-CoA is (25R) -3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholestanoyl-CoA.

The (2S) -2-methylacyl-CoA converting enzyme is an acyl-CoA dehydrogenase, and the first electron acceptor is NAD ⁺ , NADP ⁺ , thio-NAD ⁺ , thio-NADP ⁺ , acetyl-NAD ⁺ , and 26. The kit of claim 25, selected from the group consisting of acetyl-NADP ⁺ .

The (2S)-2-methylacyl -CoA converting enzyme acyl -CoA oxidase, and the first electronic acceptor is _{O 2,} kit of claim 25.

The trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase and the second electron acceptor is NADH, NADPH, thio-NADH, thio-NADPH, acetyl-NADH, and 26. The kit of claim 25, selected from the group consisting of acetyl-NADPH.

The trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase and the second electron acceptor is NADH, NADPH, thio-NADH, thio-NADPH, acetyl-NADH, and 32. The kit of claim 30, wherein the kit is selected from the group consisting of acetyl-NADPH.

The trans-2,3-dehydroacyl-CoA converting enzyme is trans-2-enoyl-CoA reductase and the second electron acceptor is NADH, NADPH, thio-NADH, thio-NADPH, acetyl-NADH, and 32. The kit of claim 31, wherein the kit is selected from the group consisting of acetyl-NADPH.

26. The kit of claim 25, further comprising instructions for use indicating prognosis and / or diagnosis for cancer.

36. The kit of claim 35, wherein the cancer is selected from the group consisting of prostate cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer, lung cancer, kidney cancer, lymphoma, and melanoma.