JP2008512088A - IGFR経路のモディファイヤーとしてのGALNTsおよび使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2004年6月21日出願の米国特許仮出願第60/581,696号の優先権を主張するものである。先行出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
PTEN(第10番染色体上で欠損されたホスファターゼ及びテンシン相同体)遺伝子の体細胞突然変異は、様々なヒト組織に腫瘍を生じさせることが知られている。加えて、PTENの生殖細胞系列変異は、乳癌及び甲状腺癌の危険の増大に関連付けられるヒトの疾病(カウデン病及びBannayan-Zonana症候群)の原因である(Nelen MR等 (1997) Hum Mol Genet, 8:1383-1387; Liaw D等 (1997) Nat Genet, 1:64-67; Marsh DJ等 (1998) Hum Mol Genet, 3:507-515)。PTENは、二次メッセンジャーであるホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸エステル(PIP3)により複数のシグナル伝達経路を制御することにより、腫瘍抑制因子として作用すると考えられる。PTENは、PIP3のD3位置を脱リン酸化し、PIP3のレベルに応じてシグナル伝達イベントを下方制御する(Maehama T及びDixon JE (1998) J Biol Chem, 22, 13375-8)。特に、インスリン様成長因子(IGF)経路の下流の生存促進性経路は、PTEN活性によって制御される。IGF経路の刺激、又はPTEN機能の欠如は、PIP3のレベルを上昇させ、腫瘍形成に関する生存促進性経路を活性化する(Stambolic V等 (1998) Cell, 95:29-39)。このモデルと呼応して、インスリン様成長因子I及びIIレベルの増大は、癌の危険の増大(Yu H等 (1999) J Natl Cancer Inst 91:151-156)及び予後不良(Takanami I等、1996、J Surg Oncol 61(3):205-8)と相関する。加えて、Akt及びPI(3)キナーゼ等のIGF経路のポジティブエフェクターのレベル又は活性の増大は、複数種のヒトの癌に関係しているとみなされている(Nicholson KM及びAnderson NG (2002) Cellular Signalling, 14:381-395)。
脊椎動物と同様に、キイロショウジョウバエのインスリン成長因子レセプター(IGFR)経路は、ポジティブエフェクターであるPI(3)キナーゼ、Akt及びPDKと、阻害薬であるPTENとを含む。これらのタンパク質は、細胞の成長及び大きさ、並びに細胞分裂及び生存の制御を含む多数のプロセスに関連があるとみなされている(Oldham S及びHafen E. (2003) Trends Cell Biol. 13:79-85; Garafolo RS. (2002) Trends Endocr. Metab. 13:156-162; Backman SA等 (2002) Curr. Op. Neurobio. 12:1-7; Tapon N等 (2001) Curr Op. Cell Biol. 13:731-737)。ショウジョウバエのこの経路の活性化により、細胞の大きさ、細胞数、及び器官の大きさが増大し得る(Oldham S等 (2002) Dev. 129:4103-4109;Prober DA及びEdgar BA. (2002) Genes&Dev. 16:2286-2299; Potter CJ等 (2001) Cell 105:357-368; Verdu J等 (1999) Cell Biol. 1:500-506)。
GALNT1(UDP-N-ACETYL-ALPHA-D-GALACTOSAMINE:POLYPEPTIDE N-ACETYLGALACTOSAMINYL TRANSFERASE 1)は、O連鎖性オリゴ糖生合成の第1ステップにおいて、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)をセリン又はスレオニン残基に移行させる。GALNT1は、酵素のUDP−N−アセチル−α−D−ガラクトサミン:ポリペプチドNアセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(GalNAc−T)ファミリーのメンバーである。GalNAc−Tは、標的タンパク質上のセリン及びスレオニン残基へのGalNAcの移行を触媒することにより、ゴルジ体でムチン型のO連鎖性グリコシル化を開始する。その特徴は、N末端膜貫通ドメイン、基幹領域、GT1モチーフ及びGal/GalNAcトランスフェラーゼモチーフを含む管腔触媒ドメイン、並びにC末端リシン/レクチン様ドメインである。GalNAc−Tsは、これと異なるが、重複する基質特性と発現パターンを有する。別のポリAシグナルを利用するこの遺伝子由来の転写物変異体は文献に既知である。GALNT13(UDP−N−アセチル−α−D−ガラクトサミン:ポリペプチドN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ13;GalNAc−T13)は、UDP−N−アセチル−α−D−ガラクトサミン:ポリペプチドN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼファミリーの別のメンバーであり、セリン又はスレオニン残基へのα連鎖を利用して、まずN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)を移行させることにより、ムチンのO連鎖性グリコシル化を開始する。
特許、特許出願、公開公報、及び参照したGenbank識別番号における配列情報を含めた本明細書中で引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
本発明者らは、ショウジョウバエの細胞でIGFR経路を改変させる遺伝子を発見し、ヒトにおけるそのオルソログを同定し、本明細書中では以降これをUDP−N−ACETYL−ALPHA−D−GALACTOSAMINE:POLYPEPTIDE N−ASETYLGALACTOSAMINYLTRANSFERASE(GALNT)と呼ぶ。本発明は、これらのIGFRモディファイヤー遺伝子およびポリペプチドを利用して、IGFR機能及び/又はGALNT機能の欠陥又は不全に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるGALNT調節剤を同定する方法を提供する。好ましいGALNT調節剤(modulating agent)は、GALNTポリペプチドに特異的に結合してIGFR機能を修復する。他の好ましいGALNT調節剤は、アンチセンスオリゴマーやRNAiなど、例えば対応する核酸(すなわちDNAまたはmRNA)に結合してそれを阻害することによってGALNT遺伝子発現または生成物の活性を抑制する核酸モジュレーターである。
GALNT調節剤は、GALNTポリペプチドまたは核酸との分子相互作用のための任意の都合のよいインビトロまたはインビボのアッセイによって評価することができる。一実施態様では、GALNTポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を用いて候補GALNT調節剤を試験する。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる作用剤は、候補IGFR調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。GALNT調節剤には、GALNT関連タンパク質(例えばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬);GALNTに特異的な抗体;GALNTに特異的なアンチセンスオリゴマーおよび他の核酸モジュレーター;GALNTと特異的に結合するか相互作用する、または(例えばGALNT結合パートナーに結合することにより)GALNT結合パートナーと競合する化学剤が含まれる。特定の一実施態様では、トランスフェラーゼアッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施態様では、スクリーニングアッセイ系は、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、細胞増殖アッセイ、血管新生アッセイ、および低酸素誘発アッセイから選択される。
本発明はさらに、哺乳動物細胞をGALNTポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のGALNT機能及び/又はIGFR経路を調節する方法を提供する。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体であってよく、IGFR経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
ショウジョウバエを用いて優性機能喪失スクリーニングを行うことにより、IGFRシグナル伝達経路と相互作用するか、又は該経路を調節する遺伝子を同定した。IGFR経路のモディファイヤー及びそのオルソログが同定された。CG9152遺伝子が、IGFR経路のモディファイヤーとして同定された。したがって、このモディファイヤーの脊椎動物のオルソログ、好ましくはヒトのオルソログであるGALNT遺伝子(すなわち核酸およびポリペプチド)は、癌などのIGFRシグナル伝達経路の欠陥に関連する病変の治療における魅力的な薬剤標的である。
本発明では、GALNT機能を評価するインビトロおよびインビボの方法を提供する。GALNTまたはその対応する結合パートナーの変調は、正常状態および病態におけるIGFR経路とそのメンバーとの関連性を理解し、IGFRに関連する病状の診断方法および治療様式を開発するのに有用である。本発明で提供する方法を使用して、直接的または間接的に、例えば酵素学的(触媒的)又は結合活性などのGALNT機能に影響を与えてGALNTの発現を阻害または亢進することによって作用するGALNT調節剤を同定することができる。GALNT調節剤は、診断、治療、および製薬の開発に有用である。
本発明で使用することができるGALNT核酸及びポリペプチドに関連する配列は、核酸についてはGI#13124890(配列番号1)、GI#1136284(配列番号2)、GI#2292903(配列番号3)、GI#1699343(配列番号4)、GI#42741666(配列番号5)、GI#20535693(配列番号6)、GI#29730439(配列番号7)、及びGI#27530992(配列番号8)、ポリペプチド配列についてはGI#13124891(配列番号9)、及びGI#42741667(配列番号10)として、Genbankに開示されている(Genbank識別(GI)番号により参照)。
用語「GALNT核酸」とは、GALNTポリペプチドをコードするDNAまたはRNA分子を言う。好ましくは、このGALNTポリペプチドまたは核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、ヒトGALNTと少なくとも70%の配列同一性、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは85%、さらに好ましくは90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するオルソログまたはその誘導体でもよい。オルソログの同定方法は当技術分野において既知である。通常、異なる種のオルソログは、1つ以上のタンパク質モチーフの存在および/または3次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイトシーケンスを使用し、BLAST分析のようなシーケンス相同分析により同定される。フォワードBLAST結果のうち最も合致するシーケンスが、リバースBLASTの元のクエリシーケンスを取り出すのであれば、シーケンスを潜在的オルソログとして指定する(Huynen MAおよびBork P, Proc Natl Acad Sci、1998年、95:5849-5856; Huynen MA他、Genome Research、2000年、10:1204-1210)。CLUSTAL(Thompson JD他、1994年、Nucleic Acids Res 22:4673-4680)など、多重シーケンス整列のためのプログラムを使用して、オルソログのタンパク質の保存域および/または残基をハイライトし、系統樹を作製してもよい。多様種の多重相同シーケンス(例えばBLAST分析により取り出されたもの)を表す系統樹において、2種のオルソログシーケンスは、それら2種のそれ以外の全シーケンスに対し、系統樹中最も接近して現われる。構造のスレッディング、またはタンパク質の折りたたみのその他分析法(例えばProCeryon(バイオサイエンス、オーストリア国ザルツブルク)を使用したもの)により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子重複が起こるとき、ショウジョウバエなど単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子に対応する場合がある(パラログ)。本明細書において、「オルソログ」という表現は、パラログも含む。対象配列または対象配列の特定の一部分に関して本明細書中で使用する「パーセント(%)配列同一性」とは、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合はすべての検索パラメーターを初期値に設定したプログラムWU−BLAST−2.0a19(Altschul等、J.Mol.Biol.、1997年、215:403-410)によって作製されたギャップを導入した後の、対象配列(またはその特定の一部分)中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸の割合として定義される。HSP SおよびHSP S2パラメーターは動的値であり、プログラム自体により、具体的な配列の組成と、検索されている目的配列に対する個々のデータベースの組成とに応じて確定される。%同一性値は、一致する同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント(%)アミノ酸配列類似性」は、%アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。
あるいは、核酸配列のアラインメントは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズムによって提供される(SmithおよびWaterman、1981年、Advances in Applied Mathematics、2:482-489;database:European Bioinformatics Institute ; SmithおよびWaterman、1981年、J.of Molec.Biol.、147:195-197; Nicholas他、1998年、「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(www.psc.edu)およびこれに引用される参考文献であるW. R. Pearson、1991年、Genomics、11:635-650)。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され(Dayhoff:Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、5suppl.、3:353-358、National Biomedical Research Foundation、米国ワシントンD.C.)、Gribskovによって正規化された(Gribskov、1986年、Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763)スコアマトリックス(scoring matrix)を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのに初期パラメーターを用いたSmith−Watermanアルゴリズムを使用することができる(例えば、ギャップ隙間ペナルティー(gap open penalty)12、ギャップ伸張ペナルティー(gap extension penalty)2)。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
他の実施態様では、35%のホルムアミド、5×SSC、50mMのTris−HCl(pH7.5)、5mMのEDTA、0.1%のPVP、0.1%のフィコール、1%のBSA、および500μg/mlの変性サケ精子DNAを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを6時間、40℃で前処理し;35%のホルムアミド、5×SSC、50mMのTris−HCl(pH7.5)、5mMのEDTA、0.02%のPVP、0.02%のフィコール、0.2%のBSA、100μg/mlのサケ精子DNA、および10%(重量/体積)のデキストラン硫酸を含む溶液中で、18〜20時間、40℃でハイブリダイゼーションを行い;次いで、2×SSCおよび0.1%のSDSを含む溶液で2度、1時間55℃で洗浄する、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する。
あるいは、20%のホルムアミド、5×SSC、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト溶液、10%のデキストラン硫酸、および20μg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、8時間〜終夜、37℃でインキュベートし;同じ緩衝液中で18〜20時間、ハイブリダイゼーションを行い;1×SSCで、約37℃で1時間洗浄する、低いストリンジェントな条件を使用することができる。
GALNT核酸およびポリペプチドは、GALNT機能を調節する薬剤の同定および試験、ならびにIGFR経路におけるGALNTの関与に関連する他の用途に有用である。GALNT核酸ならびにその誘導体およびオルソログは、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。例えば、DNAライブラリをスクリーニングすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することによって、目的のcDNAまたはゲノムDNA配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、および精製方法の詳細が規定される。例えば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニングまたは抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない(例えば融合タンパク質の生成)。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などGALNT機能を評価するのに使用するアッセイのためのGALNTタンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、および精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる(例えば、Higgins SJおよびHames BD編、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク)。具体的な実施態様では、組換えGALNTは、欠陥IGFR機能を有することで知られている細胞系で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞に基づくスクリーニングアッセイ系で使用する。
GALNTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入することができる。プロモーター/エンハンサーエレメントを含めて必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、ネイティブGALNT遺伝子および/またはそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス(例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)で感染させた哺乳動物細胞系;ウイルス(例えばバキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系;酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNAで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現系が利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、および/または特異的にプロセッシングする単離された宿主細胞系を使用することができる。
例えば精製または検出を促進するために、GALNTタンパク質、断片、またはその誘導体を、任意選択で融合体またはキメラタンパク質産物(すなわち、GALNTタンパク質が異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合されている)として発現させることができる。標準の方法を使用して所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートさせ、キメラ産物を発現させることによって、キメラ産物を作製することができる。また、タンパク質合成技術、例えばペプチド合成機の使用(Hunkapiller他、Nature、1984年、310:105-111)によってキメラ産物を作製することもできる。
本発明の方法では、GALNTまたはIGFR経路に関連する他の遺伝子の発現が変化するように(異常発現されるように)操作した細胞を使用することもできる。本明細書中で使用する異常発現とは、異所性発現、過剰発現、過少発現、および無発現(例えば遺伝子のノックアウトまたは通常は正常に引き起こされる発現の遮断による)を包含する。
候補IGFR調節剤の活性を試験するため、または細胞死や細胞増殖などIGFR経路のプロセスにおけるGALNTの役割をさらに評価するために、GALNTの発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、インビボアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したGALNTの発現により、正常なGALNT発現を有する対照動物に比べて低減または上昇した細胞増殖、血管新生、または細胞死のレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、IGFR発現が変化していてもよい(例えばIGFRノックアウト)。好ましい遺伝子改変動物は、特に、霊長類、げっ歯類(好ましくはマウス又はラット)などの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫(C.elegans)、およびショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸配列をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物(例えば、Jakobovits、1994年、Curr. Biol.、4:761-763によって記載されている技術参照)、または異種核酸が生殖系列DNA内(すなわち細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列中)に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸は、例えば宿主動物の胚または胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。
トランスジェニック動物を作製する方法は当分野で周知である(トランスジェニックマウスには、Brinster他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、82:4438-4442、1985年、どちらもLeder他による米国特許第4,736,866号および第4,870,009号、Wagner他による米国特許第4,873,191号、ならびにHogan, B.、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年参照;パーティクルボンバードメントについては、Sandford他による米国特許第4,945,050号参照;トランスジェニックショウジョウバエについては、RubinおよびSpradling、Science、1982年、218:348-53および米国特許第4,670,388号参照;トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.他、A Universal GALNTer for Transgenic Insects、1999年、Nature、402:370-371参照;トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S.、Transgenic Zebrafish、Methods Mol Biol.、2000年、136:375-3830参照);魚、両生類卵および鳥でのマイクロインジェクションについては、HoudebineおよびChourrout、Experientia、1991年、47:897-905参照;トランスジェニックラットについては、Hammer他、Cell、1990年、63:1099-1112参照;胚性幹(ES)細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム/DNA沈降、直接注入などの方法を使用してDNAをES細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製には、例えばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、1987年参照)。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる(Wilmut, I.他、1997年、Nature、385:810-813;PCT国際公開公報97/07668および国際公開公報97/07669参照)。
別の実施態様では、このトランスジェニック動物は、例えばGALNTの追加のコピーを導入することによって、またはGALNT遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を作用可能に挿入することによって、GALNT遺伝子の発現の変化(例えば発現の増大(異所性の増大を含む)や低減)をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーターおよびエンハンサーエレメントが含まれる。このノックインは、ホモ接合性またはヘテロ接合性であることができる。
遺伝学の研究において欠陥IGFR機能に関係する疾病および疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のインビボ試験のために、遺伝子改変動物を使用してIGFR経路をさらに解明することができる。この候補治療剤をGALNT機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物および/または候補治療剤を与えたGALNT発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
本発明は、GALNTの機能および/またはIGFR経路と相互作用しおよび/またはこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。本方法により同定された調節剤もまた本発明の一部である。このような作用剤は、IGFR経路に関連する様々な診断および治療用途、ならびにGALNTタンパク質およびIGFR経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、GALNT相互作用剤または調節剤を投与することによってGALNT活性を特異的に調節する工程を含む、IGFR経路を調節する方法も提供する。
ここで使用する「GALNT調節剤」とは、GALNT機能を調節する任意の薬剤、例えば、GALNTと相互作用してGALNT活性を阻害又は増強するか、或いは正常なGALNT機能にその他の影響を与える薬剤である。GALNT機能への影響は、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含め、いかなるレベルでもよい。好ましい実施態様では、GALNT調節剤はGALNTの機能を特異的に調節する。表現「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などは、本明細書中では、GALNTポリペプチドまたは核酸に直接結合し、好ましくはGALNTの機能を阻害、増強、または他の形で変化させる調節剤を言うために使用する。また、これらの用語は、(例えば、GALNTの結合パートナーと、またはタンパク質/結合パートナー複合体と結合してGALNT機能を変化させることによって)GALNTと結合パートナー、基質、またはコファクターとの相互作用を変化させる調節剤も包含する。さらに好ましい実施態様では、GALNT調節剤はIGFR経路のモジュレーターであり(例えばIGFR機能を回復させる及び/又は上方制御する)、よってIGFR調節剤でもある。
好ましいGALNT調節剤には、小分子化合物;GALNT相互作用タンパク質(抗体および他の生物療法物質を含む);およびアンチセンスやRNA阻害剤などの核酸調節剤が含まれる。調節剤を、例えば組合せ療法などにおけるような他の活性成分および/または適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、薬剤組成物中に配合してもよい。化合物を配合または投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第19版に出ている。
小分子は多くの場合、酵素機能を有しおよび/またはタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が10,000以下、好ましくは5,000以下、より好ましくは1,000以下、最も好ましくは500ダルトン以下である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、例えばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知または推定GALNTタンパク質の特性に基づいて合理的に設計または同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてGALNT調節活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である(Schreiber SL、Science、2000年、151:1964-1969; Radmann JおよびGunther J、Science、2000、151:1947-1948)。
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、IGFR経路に関連する病状を処置するのに有用であるかもしれない。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する反復性の二次的な機能検証、構造決定、および候補モジュレーターの改変および試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的および薬理的特性に特に注意を払って作製される。例えば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、インビトロおよびインビボアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
特異的なGALNT相互作用タンパク質は、IGFR経路および関連疾患に関連する様々な診断上および治療上の用途、ならびに他のGALNT調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施態様では、GALNT相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含めた正常なGALNT機能に影響を与える。別の実施態様では、GALNT相互作用タンパク質は、癌などIGFRに関連する疾患に関連性があるので、GALNTタンパク質の機能に関する情報を検出および提供するのに有用である(例えば診断上の手段用)。
GALNT相互作用タンパク質は、GALNT発現、局在化、および/または活性を調節するGALNT経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちGALNTと自然に遺伝学的または生化学的に相互作用するものであってよい。GALNTモジュレーターには、GALNT相互作用タンパク質およびGALNTタンパク質自体のドミナントネガティブの形が含まれる。酵母ツーハイブリッドおよび変異体スクリーニングにより、内因性GALNT相互作用タンパク質を同定する好ましい方法が提供されている(Finley, R.L.他、1996年、DNA Cloning-Expression Systems:A Practical Approach、Glover D.およびHames B.D編、Oxford University Press、英国オックスフォード、ページ169-203; Fashema SF他、Gene、2000年、250:1-14; Drees BL、Curr Opin Chem Biol、1999、3:64-70; Vidal MおよびLegrain P、Nucleic Acids Res、1999年、27:919-29;米国特許第5,928,868号)。タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法は、質量分析である(例えば、Pandley AおよびMann M、Nature、2000年、405:837-846;Yates JR 3rd、Trends Genet、2000年、16:5-8の総説)。
好ましい実施態様では、GALNT相互作用タンパク質はGALNTタンパク質に特異的に結合する。好ましい代替実施態様では、GALNT調節剤はGALNT基質、結合パートナー、またはコファクターと結合する。
別の実施態様では、このタンパク質モジュレーターはGALNTに特異的な抗体アゴニストまたはアンタゴニストである。この抗体は治療上および診断上の用途を有しており、GALNTモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞応答ならびにGALNTの通常のプロセッシングおよび成熟を担当するGALNT経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
周知の方法を使用してGALNTポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はGALNTポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトGALNTに、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAbs)、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、FAb発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。例えば、GALNTのアミノ酸配列に対する抗原性を探すための通常のGALNTポリペプチドスクリーニングによって、またはこれに対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を施用することによって、特に抗原性であるGALNTのエピトープを選択することができる(HoppおよびWood、1981年、Proc. Nati.Acad. Sci. U.S.A.、78:3824-28;HoppおよびWood、1983年、Mol. Immunol.、20:483-89; Sutcliffe他、1983年、Science、219:660-66)。記載の標準手順によって、108M−1、好ましくは109M−1〜1010M−1、またはそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる(HarlowおよびLane、上掲;Goding、1986年、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(第2版)、Academic Press、ニューヨーク;米国特許第4,381,292号;米国特許第4,451,570号;米国特許第4,618,577号)。GALNTの粗細胞抽出物または実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。GALNT断片を使用する場合は、これらは、好ましくはGALNTタンパク質の少なくとも10個、より好ましくは少なくとも20個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施態様では、GALNTに特異的な抗原および/または免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。例えば、対象ポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化されている。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。
異なる動物種由来の異なる部分を含む、GALNTポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。例えば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はマウス断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をマウスmAbの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることによってキメラ抗体を作製する(Morrison他、Proc. Natl. Acad. Sci.、1984、81:6851-6855; Neuberger他、Nature、1984、312:604-608;Takeda他、Nature、1985、31:452-454)。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えDNA技術によって(Riechmann LM他、1988年、Nature、323:323-327)マウス抗体の相補性決定領域(CDR)をヒトフレームワーク領域および定常領域のバックグラウンドに移植することによって(Carlos, T.M.、J.M.Harlan、1994年、Blood、84:2068-2101)作製することができる。ヒト化抗体は10%以下のマウス配列および90%以下のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下または排除される(Co MSおよびQueen C.、1991年、Nature、351:501-501; Morrison SL.、1992年、Ann. Rev. Immun.、10:239-265)。ヒト化抗体およびそれらを産生させる方法は当分野で周知である(米国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号、および第6,180,370号)。
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をインビトロで、抗原ポリペプチド、または代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリに曝すことを含む(Huse他、Science、1989年、246:1275-1281)。本明細書中で使用するT細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲内に含まれる(HarlowおよびLane、1988年、上掲)。
患者で治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、または静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量および投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の重量1kgあたり約0.1mg〜約10mgである。非経口投与には、薬学的に許容されるベヒクルを含む単位用量の注射可能な形態(例えば溶液、懸濁液、乳濁液)で抗体を配合する。このようなベヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例えば、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、および5%のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、またはリポソーム担体などの非水性ベヒクルを使用してもよい。ベヒクルには、等張性や化学的安定性を高めるまたは他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなベヒクル中の抗体濃度は、通常約1mg/ml〜約10mg/mlである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている(米国特許第5,859,206;国際公開公報0073469号)。
他の好ましいGALNT調節剤としては、一般的にGALNT活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖RNA(dsRNA)などの核酸分子が含まれる。好ましい核酸モジュレーターは、DNAの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのGALNT RNAの転位、GALNT RNAからのタンパク質の翻訳、GALNT RNAをスプライシングして1つまたは複数のmRNA種を得ること、またはGALNT RNAに関与しまたはそれによって促進され得る触媒活性など、GALNT核酸の機能を妨げる。
一実施態様では、このアンチセンスオリゴマーは、好ましくは5’非翻訳領域に結合することによってGALNT mRNAと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。GALNTに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも6〜約200個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも10、15、または20ヌクレオチド長である。他の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは50未満、40、または30ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNA、あるいはそのキメラ混合物や誘導体またはそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖を改変してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによってトリガされる切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
好ましい代替GALNT核酸モジュレーターは、RNA干渉(RNAi)を媒介する二本鎖RNA種である。RNAiは、動物および植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖RNA(dsRNA)によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、およびヒトで遺伝子をサイレンシングするためのRNAiの使用に関する方法は、当分野で周知である(Fire A他、1998年、Nature、391:806-811; Fire, A.、Trends Genet.、15、358-363、1999年; Sharp, P.A.、RNA interference 2001.、Genes Dev.、15、485-490、2001年; Hammond, S.M.他、Nature Rev.Genet.、2、110-1119、2001年;Tuschl, T.、Chem.Biochem.、2、239-245、2001年;Hamilton, A.他、Science、286、950-952、1999年;Hammond, S.M.他、Nature、404、293-296、2000年;Zamore, P.D.他、Cell、101、25-33、2000年;Bernstein, E.他、Nature、409、363-366、2001; Elbashir, S.M.他、Genes Dev.、15、188-200、2001年;国際公開公報0129058号;国際公開公報9932619号;Elbashir SM他、2001年、Nature、411:494-498; Novina CD及びSharp P. 2004 Nature 430:161-164; Soutschek J等 2004 Nature 432:173-178; Hsieh AC等 (2004) NAR 32(3):893-901)。
核酸モジュレーターは一般的に、研究試薬、診断薬、治療薬として使用される。例えば、遺伝子の発現を厳密な特異性で阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される(例えば、米国特許第6,165,790号参照)。また、核酸モジュレーターは、例えば生体経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。例えば、アンチセンスオリゴマーは、病態の動物および人の処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた(Milligan JF他、Current Concepts in Antisense Drug Design、J Med、Chem.、1993年、36:1923-1937;Tonkinson JL他、Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents、Cancer Invest.、1996年、14:54-65)。したがって、本発明の一態様では、IGFR経路におけるGALNTの役割、および/またはGALNTとこの経路の他のメンバーとの関係をさらに解明するためのアッセイで、GALNTに特異的な核酸モジュレーターを使用する。本発明の別の態様では、IGFRに関連する病態を処置する治療剤として、GALNTに特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。
本発明は、GALNT活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系およびスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出および/または測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、GALNT核酸またはタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果または分子効果を同定または確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたGALNT調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がIGFR経路に関連する方式でGALNTに影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、GALNTモジュレーターを直接二次アッセイで試験する。
好ましい実施態様では、スクリーニング方法は、候補剤が存在しなければスクリーニング方法で検出される特定の分子事象に基づく対照活性(例えばトランスフェラーゼ活性)が系によってもたらされる条件下で、GALNTポリペプチド又は核酸を含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がGALNT活性を、したがってIGFR経路を調節することが示される。アッセイに使用するGALNTポリペプチド又は核酸は、上述の核酸又はポリペプチドのいずれを含んでもよい。
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせるまたは保持する無細胞系を使用してもよい(Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384-91および付随の参考文献に総説がある)。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく(細胞ベースの)」とは、生細胞、死滅細胞、または膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質(内因性または組換えによって生成された)、部分的に精製したまたは粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−DNA相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用(例えば受容体−リガンド結合)、転写活性(例えばレポーター遺伝子)、酵素活性(例えば基質の特徴を介するもの)、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、および細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、および電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、GALNTを組換えによって発現する系および個々のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母ツーハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニングおよび質量分析は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、小分子モジュレーターを同定するスクリーニングにGALNT相互作用タンパク質を使用する場合、GALNTタンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、基質による処理(例えば候補GALNTに特異的に結合する作用剤の、GALNT発現性細胞におけるネガティブエフェクターとして機能する能力)、結合平衡定数(通常少なくとも約107M−1、好ましくは少なくとも約108M−1、より好ましくは少なくとも約109M−1)、免疫原性(例えばマウス、ラット、ヤギまたはウサギなどの異種宿主中でGALNTに特異的な抗体を誘発する能力)など様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素および受容体について、結合はそれぞれ基質およびリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
GALNTモジュレーターを探すためのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいスクリーニングアッセイはハイスループットまたはウルトラハイスループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリをスクリーニングする、自動化された費用効果の高い手段を提供する(Fernandes PB、Curr Opin Chem Biol、1998年、2:597-603; Sundberg SA、Curr Opin Biotechnol、2000年、11:47-53)。好ましい一実施態様では、スクリーニングアッセイで、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質−タンパク質またはDNA−タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する(例えば、Selvin PR、Nat Struct Biol、2000年、7:730-4;Fernandes PB、上掲;Hertzberg RPおよびPope AJ、Curr Opin Chem Biol、2000年、4:445-451)。
グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシル化のパターンの変化を媒介し、このパターンの変化は次いで、糖タンパク質及び/又は糖脂質の機能に影響し、更に下流において発達、分化、形質転換及び細胞−細胞認識に影響し得る。グリコシルトランスフェラーゼのアッセイでは、シンチレーション法を使用して、放射標識した糖−ヌクレオチドドナーから、ポリアクリルアミドに連結させ、プラスチック製のマイクロタイタープレート上にコーティングした合成グリコポリマー受容器への炭水化物の移行を測定する(Donovan RS等、Glycoconj J (1999) 16:607-615)。
また、ヒストンH3のリン酸化による有糸分裂が起こった細胞集団を同定するホスホ−ヒストンH3染色によって細胞増殖をアッセイする。セリン10におけるヒストンH3のリン酸化は、ヒストンH3のセリン10残基のリン酸化形態に特異的な抗体を用いて検出される(Chadlee, D.N. 1995, J. Biol. Chem 270:20098-105)。また、[3H]−チミジンの取り込みを使用して細胞増殖を検査することもできる(Chen, J.、1996年、Oncogene、13:1395-403; Jeoung, J.、1995年、J. Biol. Chem.、270:18367-73)。このアッセイにより、S期のDNA合成の定量的な特徴づけが可能になる。このアッセイでは、DNAを合成している細胞が新しく合成されるDNA中に[3H]−チミジンを取り込む。その後、シンチレーション計数器(例えば、Beckman LS 3800液体シンチレーション計数器)による放射性同位元素の計数など標準の技術によって取り込みを測定することができる。別の細胞増殖アッセイでは、染料アラマーブルー(Biosource Internationalより入手可能)を使用する。これにより、生存細胞が減少した際には、蛍光発光させて細胞数を間接的測定値を提供する(Voytik-Harbin SL他, 1998, In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46)。また別の増殖アッセイであるMTSアッセイは、インビトロでの化成物の細胞障害性の評価に基づき、可溶性のテトラゾリウム塩であるMTSを使用する。MTSアッセイとして例えばPromega CellTiter96(登録商標)水溶性非放射性細胞増殖アッセイ(Cat.#G5421)などが市販されている。
細胞増殖は代謝的活性細胞の指標としてATPレベルを測定することによってもアッセイできる。このようなアッセイとしては、Promega社による発光同種アッセイであるCell Titer−Glo(登録商標)などが市販されている。
フローサイトメトリーによって細胞周期における遺伝子の関与をアッセイすることができる(Gray JW他、1986年、Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med、49:237-55)。GALNTで形質移入させた細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、細胞周期の異なる段階における細胞の蓄積を示すフローサイトメトリー(Becton Dickinsonから入手可能)で評価することができる。
したがって、細胞増殖または細胞周期アッセイ系は、GALNTを発現する細胞、および任意選択で欠陥IGFR機能を有する(例えば、野生型細胞に比べてIGFRが過剰発現または過少発現されている)ものを含むことができる。このアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞増殖または細胞周期の変化により候補IGFR調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、無細胞アッセイ系など別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補IGFR調節剤を試験する二次アッセイとして、細胞増殖または細胞周期アッセイを使用することができる。また、GALNT機能が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすかどうかを試験するために細胞増殖アッセイを使用することもできる。例えば、野生型細胞に比べてGALNTを過剰発現または過少発現する細胞で細胞増殖または細胞周期アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した増殖または細胞周期の差により、GALNTが細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすことが示唆される。
細胞−細胞接着アッセイでは、天然で生じたリガンドとの細胞接着タンパク質の結合を調節する作用剤の能力を測定する。これらのアッセイには、天然にまたは組換えによって選択した接着タンパク質を発現する細胞を使用する。例示的なアッセイでは、細胞接着タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレートのウェル内に植え付ける。リガンドを発現している細胞をBCECFなど膜透過性蛍光色素で標識し、候補剤の存在下で単層に接着させる。結合しなかった細胞を洗い流し、蛍光プレート読取装置を使用して結合した細胞を検出する。
ハイスループット細胞接着アッセイも記載されている。このようなアッセイの1つでは、マイクロアレイスポッターを使用して小分子リガンドおよびペプチドを顕微鏡スライドの表面に結合させ、その後、未処置の細胞をスライドと接触させ、結合しなかった細胞を洗い流す。このアッセイでは、細胞系に対するペプチドおよびモジュレーターの結合特異性が決定されるだけでなく、付着した細胞の機能的細胞シグナル伝達も、マイクロチップ上で免疫蛍光技術をインサイツで使用して測定される(Falsey JR他、Bioconjug Chem.、2001年5-6月、12(3):346-53)。
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、GALNTタンパク質に対する抗体の親和性および特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性および特異性を試験する方法は当分野で周知である(HarlowおよびLane、1988年、1999年、上掲)。GALNTに特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)である。他の方法には、FACSアッセイ、ラジオイムノアッセイ、および蛍光アッセイが含まれる。
場合によっては、小分子モジュレーターについて記載したスクリーニングアッセイも、抗体モジュレーターを試験するために使用できる。
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがGALNT遺伝子の発現、好ましくはmRNAの発現を阻害または増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下または非存在下の細胞の類似集団(例えば、内因的にまたは組換えによってGALNTを発現する2種の細胞プール)中のGALNT発現を比較することが含まれる。mRNAおよびタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。例えば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、RNA分解酵素保護、定量的RT−PCR(例えばTaqMan(登録商標)、PE Applied Biosystemsを使用)、またはマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でGALNT mRNAの発現が低減していることを確認することができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112-125; Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142-147; Blohm DHおよびGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41-47)。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはGALNTタンパク質または特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体または抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ELISA、インサイツ検出を含めた様々な手段が利用可能である(Harlow EおよびLane D、1988年および1999年、上掲)。
場合によっては、特にGALNT mRNA発現を伴うアッセイ系において、小分子モジュレーターについて記載したスクリーニングアッセイも核酸モジュレーターを試験するために使用できる。
調節剤がIGFR経路に関連する様式でGALNTに影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したGALNT調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するGALNT調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物または他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的または生化学的経路における調節剤の活性、あるいは調節剤がGALNTと相互作用する特異性を試験することもできる。
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーター存在下または非存在下において、細胞や動物の類似集団(例えば、内因的にまたは組換えによってGALNTを発現する2種の細胞プール)を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補GALNT調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない(あるいはモック処置またはプラシーボ処置)細胞や動物と比較してIGFR経路に変化がもたらされるかどうかを試験する。特定のアッセイでは、「感作させた遺伝的バックグラウンド」を使用する。本明細書中で使用する「感作させた遺伝的バックグラウンド」とは、IGFRまたは相互作用する経路における遺伝子の発現が変化するように操作した細胞や動物を表す。
細胞に基づいたアッセイでは内因性IGFR経路活性を検出するか、あるいはこれはIGFR経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入するまたは任意の他の有効な手段によって送達してもよい。
候補GALNTモジュレーターを試験するために、正常または欠陥のあるIGFR経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥IGFR経路のモデルでは、IGFR経路に関与する遺伝子が異常発現される(例えば過剰発現または発現が欠けている)ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。
好ましい実施態様では、新脈管形成および血管新生をモニターすることによってIGFR経路の活性を評価する。Matrigel(登録商標)アッセイにおける、GALNTに対する候補モジュレーターの影響を試験するために、欠陥のあるIGFRおよび正常なIGFRを有する動物モデルを使用する。Matrigel(登録商標)は基底膜タンパク質の抽出物であり、主にラミニン、コラーゲンIV、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される。これは、4℃の無菌的な液体として提供されるが、37℃で迅速にゲルを形成する。液体のMatrigel(登録商標)を、bFGFおよびVEGFなど様々な血管新生剤、またはGALNTを過剰発現するヒト腫瘍細胞と混合する。その後、激しい血管性応答をサポートするためにこの混合物を雌の無胸腺ヌードマウス(Taconic、ニューヨーク州ジャーマンタウン)に皮下注入(SC)する。Matrigel(登録商標)ペレットを有するマウスに、経口(PO)、腹腔内(IP)、または静脈内(IV)経路で候補モジュレーターを投薬してもよい。注入後5〜12日にマウスを安楽死させ、ヘモグロビン分析のためにMatrigel(登録商標)ペレットを回収する(Sigma plasma hemoglobin kit)。ゲルのヘモグロビン含有量は、ゲル中の新脈管形成の程度と相関していることが判明した。
別の好ましい実施態様では、ホローファイバーアッセイを使用して腫瘍形成能をモニターする。ホローファイバーアッセイは米国特許第5,698,413号に開示されている。要約すると、本方法は、実験動物に対し、標的細胞を含む生体適合性の半透明なカプセル封入器を埋め込むこと、実験動物を候補調節剤で処置すること、及び候補モジュレーターに対する反応について標的細胞を評価することを含む。埋め込まれる細胞は、通常、既存の腫瘍又は腫瘍細胞系由来のヒト細胞である。適当な時間、通常約6日を置いて、埋め込んだ細胞を回収し、候補モジュレーターの評価に使用する。腫瘍形成能とモジュレーターの有効性は、マクロカプセル中に存在する生細胞の量をアッセイすることにより評価してもよく、これは、当技術分野において既知の試験、例えばMTT染色変換アッセイ、ニュートラルレッド染色取り込み、トリパンブルー染色、生細胞計算、軟寒天中に形成されたコロニーの数、細胞の回復能及びインビトロでの複製能等により決定できる。
別の好ましい実施態様では、腫瘍形成能アッセイは、組織特異的な制御配列の制御の下で、優性オンコジーン、又は腫瘍サプレッサー遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物、通常マウスを使用する。これらのアッセイは通常トランスジェニック腫瘍アッセイと呼ばれる。好ましい用途では、トランスジェニックモデルにおける腫瘍の進行の特徴づけ又は制御が良好に行われる。例示的なモデルでは、「RIP1−Tag2」導入遺伝子は、インスリン遺伝子制御領域の制御の下でSV40大型T抗原オンコジーンを有し、膵臓β細胞に発現し、結果的に島細胞悪性腫瘍となる(Hanahan D, 1985, Nature 315:115-122; Parangi S等, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:2002-2007; Bergers G等, 1999, Science 284:808-812)。通常過剰増殖性の島細胞のサブセット中の静止毛細血管が血管新生性となるので、「血管新生スイッチ(angiogenic switch)」は、約5週目に起こる。RIP1−TAG2マウスは14週で死亡する。候補モジュレーターは、血管新生スイッチの直前(例えば腫瘍予防のモデルの場合)、小規模腫瘍の成長期(例えば処置のモデルの場合)、又は大規模及び/又は浸潤性腫瘍の成長期(例えば退行のモデルの場合)を含め、様々な段階において投与できる。腫瘍形成能及びモジュレーターの有効性は、腫瘍の数、腫瘍の大きさ、腫瘍の形態、血管密度、アポトーシス指数などを含め、寿命延長及び/又は腫瘍特性の評価であってもよい。
特異的なGALNT調節剤は、疾病または疾病予後が血管新生、アポトーシス、または細胞増殖性疾患などIGFR経路の欠陥に関連している様々な診断および治療用途に有用である。したがって、本発明は、GALNT活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与する工程を含む、細胞、好ましくはIGFR機能の欠陥又は不全(例えば、IGFRの過剰発現、過少発現、又は誤発現、或いは遺伝子突然変異による)を有することが事前に確定されている細胞におけるIGFR経路を調節する方法も提供する。好ましくは、調節剤は細胞中に検出可能な表現型の変化を生じさせ、これにより、IGFR機能が修復されたことが示される。本明細書で使用する「機能が修復された」という表現、及びそれと同等の表現は、所望の表現型が達成されたか、又は未処理の細胞と比較した場合に正常に近づいたことを意味する。例えば、IGFR機能が修復されると、細胞増殖及び/又は細胞周期の進行が正常化するか、又は未処理の細胞と比較した場合に正常に近づく。本発明はまた、IGFR経路を調節するGALNT調節剤の治療的有効量を投与することによる、IGFR機能不全に関連する疾患又は疾病の治療方法を提供する。さらに本発明は、GALNT調節剤を投与することによる、細胞、好ましくはGALNT機能の欠陥又は不全を有することが事前に決定されている細胞において、GALNT機能を調節する方法を提供する。これらに加えて、本発明は、GALNT調節剤の治療的有効量を投与することによる、GALNT機能不全に関連する疾患又は疾病の治療法を提供する。
GALNTがIGFR経路に関係しているという発見により、IGFR経路の欠陥を伴う疾病および疾患の診断および予後評価、ならびにこのような疾病および疾患の素因を有する対象の同定に使用可能な様々な方法が提供される。
例えばGALNTオリゴヌクレオチドなどの試薬、およびGALNTに対する抗体を利用して、上に記載した(1)GALNT遺伝子変異の存在の検出、または疾患でない状態と比較したGALNT mRNAの過剰発現または過少発現のいずれかの検出、(2)疾患でない状態と比較したGALNT遺伝子産物の過剰存在または過少存在のいずれかの検出、ならびに(3)GALNTに媒介されたシグナル伝達経路における摂動または異常の検出のために、様々な他の診断方法を実施することができる。
したがって、特定の実施態様では、本発明は、(a)患者から生体試料を得て、(b)試料をGALNT発現用のプローブと接触させ、(c)工程(b)からの結果を対照と比較し、そして(d)工程(c)が疾病又は疾患の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、GALNT発現の変化と結び付けられる患者の疾病又は疾患を診断する方法を対象としている。好ましくは、この疾病は癌であり、最も好ましくは表1に示す癌である。プローブは、DNAまたは抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
ショウジョウバエで、優性機能喪失スクリーニングを行い、IGFRシグナル伝達経路と相互作用するか、又はIGFRシグナル伝達経路を調節する遺伝子を同定した。ショウジョウバエの眼の初期発生段階におけるIGFRの過剰発現による経路の活性化は、細胞数の増大を引き起こし、その結果成虫の眼が大きく且つ粗くなる(Potter CJ他 (2001) Cell 105:357-368; Huang他、1999. Dev. 126:5365-5372)。本発明者は、IGFRの過剰発現により拡大した眼を持つハエのストックをつくり、この表現型のモディファイヤーを同定した。次いで、そのモディファイヤーのヒトオルソログを同定した。
スクリーニングのストックは2つの導入遺伝子を有していた。この表現型は以下の通りである。
+;+;P{DmIGFR−pExp−UAS}P{Gal4−pExp−1Xey}/TM6B
上記表現型のスクリーニングによるストックのメスを、3種類のトランスポゾン(piggyBacベース)からなる集団のオスに交雑した。その結果得られた、導入遺伝子とトランスポゾンとを含む子孫を、次いで眼過成長表現型に対するトランスポゾンの影響についてスコア化した(亢進、抑制又は影響無し)。全てのデータを記録し、元の交雑をもう一度行ってモディファイヤーの全てを再度試験した。CG9152は眼の表現型のエンハンサーであった。モディファイヤーのオルソログを本明細書ではGALNTと呼ぶ。
タンパク質の様々なドメイン、シグナル、及び機能的サブユニットを、PSORT(Nakai K.及びHorton P.、Trends Biochem Sci、1999年、24:34-6; Kenta Nakai、Protein sorting signals and prediction of subcellular localization, Adv. Protein Chem. 54, 277-344、2000年)、PFAM(Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260-2)、SMART(Ponting CP他、SMART: identification and annotation of domains from signaling and extracellular protein sequences. Nucleic Acids Res.、1999年1月 1;27(1):229-32)、TM−HMM(Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne、及びAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, P175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press、1998年)、及びクラスト(clust)(Remm M及びSonnhammer E. Classification of transmembrane protein families in the Caenorhabditis elegans genome and identification of human orthologs. Genome Res. 2000年11月;10(11):1679-89)プログラムを使用して分析した。例えば、GI#13124891及び42741667(それぞれ配列番号9及び10)のGALNTのリシン型βシロツメクサレクチンドメイン(PFAM00652)は、概ね、アミノ酸残基430−548及び429−547にそれぞれ位置している。同様に、同じ配列のグリコシルトランスフェラーゼドメインは、概ね、アミノ酸残基119−303及び118−302にそれぞれ位置している。
蛍光標識したGALNTペプチド/基質を、試験緩衝液(10mMのHEPES、10mMのNaCl、6mMの塩化マグネシウム、pH7.6)中の試験剤と共に96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Fluorolite FPM−2 Fluorescence Polarization Microtiter System(Dynatech Laboratories,Inc)を用いて決定した蛍光偏光の対照値に対する変化により、試験化合物がGALNT活性の候補モディファイヤーであることが示される。
試験剤と共にアッセイ緩衝液(100mMのKCl、20mMのHEPES pH7.6、1mMのMgCl2、1%のグリセロール、0.5%のNP−40、50mMのβ−メルカプトエタノール、1mg/mlのBSA、プロテアーゼ阻害剤の反応混液)中の33P標識のGALNTペプチドを、Neutralite−アビジンでコーティングしたアッセイプレートのウェルに加え、25℃で1時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、1時間インキュベートした。PBSで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いない対照に比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補IGFR調節剤として同定された。
形質移入させたタンパク質の共沈では、GALNTタンパク質を含む3×106個の適切な組換え細胞を10cmのディッシュにまき、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入での総DNA量を一定に保った。24時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、50mMのHepes、pH7.9、250mMのNaCl、20mMのグリセロホスフェート、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、5mMのp−ニトロフェニルリン酸、2mMのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤(complete、Roche Molecular Biochemicals)、および1%のノニデットP−40を含む溶解緩衝液1ml中、氷上で20分間溶解させた。15,000×g、15分間の遠心分離2回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を25μlのM2ビーズ(Sigma)と共に2時間、4℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
溶解緩衝液でよく洗浄した後、SDS試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、二フッ化ビニリデン樹脂膜に移し、上記の抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合した西洋わさびペルオキシダーゼおよび高感度化学発光(ECL)ウエスタンブロッティング検出システム(Amersham Pharmacia Biotech)によって、反応性のあるバンドを可視化させた。
以下の実験で使用したすべての細胞系はNCI(米国立癌センター)の系であり、ATCC(アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス、20110〜2209)から入手可能である。正常組織および腫瘍組織は、Impath、UC Davis、Clontech、Stratagene、Ardais、Genome CollaborativeおよびAmbionから得た。
様々な試料中における開示した遺伝子の発現レベルを評価するために、TaqMan(登録商標)分析を使用した。
TaqMan(登録商標)プロトコルならびに以下の基準に従って、TaqMan(登録商標)アッセイ(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)を使用した発現分析用のプライマーを調製した。その基準は、a)ゲノムの混入を排除するために、イントロンにまたがるようにプライマーの対を設定すること、およびb)各プライマーの対が1つの産物のみを生成することである。発現分析は7900HT機器を使用して行った。
それぞれの発現分析について、腫瘍組織試料を、同一患者からの対応する正常組織と比較した。対応する正常試料と比べて腫瘍中の遺伝子発現レベルが2倍以上高い場合に、ある遺伝子は腫瘍中で過剰発現されているとみなされる。正常組織が入手可能でない場合は、cDNA試料のユニバーサルプールを代わりに使用する。これらの場合では、腫瘍試料と同じ組織タイプからのすべての正常試料の平均との発現レベルの差が、すべての正常試料の標準偏差の2倍を超える場合(すなわち、腫瘍−平均(すべての正常試料)>2×STDEV(すべての正常試料))に、遺伝子は腫瘍試料中で過剰発現されているとみなされる。
表1
RNAi実験を行い、干渉RNA(siRNA, Elbashir等、上掲)を用いて様々な細胞系のGALNT(配列番号1)の発現をノックダウンした。
細胞増殖及び成長に対するGALNT RNAiの影響。上述のように、BrdU及びCell Titer−Glo(登録商標)アッセイを用いて細胞増殖におけるGALNT発現の低下の影響を研究した。これら実験の結果は、配列番号1のGALNTのRNAiが、231T乳癌細胞、PC3前立腺癌細胞、及びU87MG膠芽細胞腫細胞における増殖を低減することを示すものであった。更に、配列番号1のGALNTのRNAiは、正常なコントロールと比較して、A549肺癌細胞の細胞数も低減した。
PTEN/IGF経路への関与:GALNT FOXO核転位置アッセイ。上述のように、FOXO核転位置アッセイを用いて、PTEN/IGF経路へのGALNTの関与を評価した。これらの実験では、RNAiによってGALNTの発現が低減している細胞に、GFP−タグ付きFOXOを発現するプラスミドを過渡的に形質移入した。次に核及び細胞質等の細胞成分の自動画像化を行い、FOXOの転位置を評価した。別法では、細胞に、GALNTに方向付けたsiRNAを、FOXOを含むプラスミド、及びプロモーター、FOXO応答エレメント、及びルシフェラーゼを含むカセットと共に同時形質移入した。次いで、細胞をルシフェラーゼ活性について分析し、siRNAを含まない細胞と比較した。その結果、配列番号1のGALNTの発現低下により、A2780卵巣癌細胞及びPC3前立腺癌細胞におけるPTENの喪失に類似した、細胞質へのFOXOの転位置が起こることが示された。これらの結果により、IGFR経路へのGALNTの関与が示唆される。
本発明者は、実験の一部に基質として4EBP1を使用した。この基質の場合、AKT経路を阻害すると、細胞質の染色が低減し、一方核染色が増大した。細胞を96ウェルプレートに蒔き、配列番号1のGALNTのRNAiを形質移入し、固定し、4EBP1抗体で処理し、染色した。測定は、ネガティブ又はポジティブコントロール細胞と比較して核/細胞質染色比が増大したか、又は低減した細胞の数の割合に基づいて行った。この実験の結果、GALNTの発現低下が、231T及びPC3細胞におけるホスホ4EBP1タンパク質のレベルを変更することが示された。これもまた、IGFR経路への関与を示唆するものである。
Claims (25)
- (a)GALNTポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を提供する工程と、
(b)試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させる工程と、
(c)試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤を候補IGFR経路調節剤として同定する工程と
を含む、候補IGFR経路調節剤を同定する方法。 - アッセイ系がGALNTポリペプチドを発現する培養細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 培養細胞がさらに欠陥IGFR機能を有する、請求項2に記載の方法。
- アッセイ系がGALNTポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項1に記載の方法。
- アッセイがトランスフェラーゼアッセイである、請求項4に記載の方法。
- アッセイ系が、アポトーシスアッセイ系、細胞増殖アッセイ系、血管形成アッセイ系、および低酸素誘発アッセイ系からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- アッセイ系がGALNTポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項1に記載の方法。
- アッセイ系がGALNT核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項1に記載の方法。
- 核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項8に記載の方法。
- 核酸モジュレーターがPMOである、請求項8に記載の方法。
- (d)(c)で同定された候補IGFR経路調節剤を、IGFR機能に欠陥がある細胞を含むモデル系に投与し、IGFR機能が修復されたことを示すモデル系における表現型の変化を検出する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - モデル系が欠陥IGFR機能を有するマウスモデルである、請求項11に記載の方法。
- IGFR機能に欠陥がある細胞を、GALNTポリペプチドに特異的に結合する候補モジュレーターと接触させることを含み、それによりIGFR機能が修復される、細胞のIGFR経路を調節する方法。
- IGFR機能の欠陥に起因する疾病または疾患を有することが事前に確定されている脊椎動物に候補モジュレーターを投与する、請求項13に記載の方法。
- 候補モジュレーターが抗体および小分子からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- (d)GALNTを発現している非ヒト動物または培養細胞を含む二次アッセイ系を提供する工程と、
(e)二次アッセイ系を(b)の試験剤またはそれから誘導した作用剤と、試験剤またはそれから誘導した作用剤が存在しない場合に二次アッセイ系により対照活性がもたらされる条件下で接触させる工程と、
(f)作用剤の影響を受けた第2アッセイ系の活性を検出する工程
をさらに含み、作用剤の影響を受けた第2アッセイ系の活性と対照活性との差により試験剤またはそれから誘導した作用剤が候補IGFR経路調節剤であることが同定される方法であり、
ここでの第2アッセイが作用剤の影響を受けたIGFR経路における変化を検出する、請求項1に記載の方法。 - 二次アッセイ系が培養細胞を含む、請求項16に記載の方法。
- 二次アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項16に記載の方法。
- 非ヒト動物がIGFR経路の遺伝子を異常発現する、請求項18に記載の方法。
- 哺乳動物の細胞をGALNTポリペプチドまたは核酸と特異的に結合する作用剤と接触させることを含む、哺乳動物細胞内のIGFR経路を調節する方法。
- IGFR経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に作用剤を投与する、請求項20に記載の方法。
- 作用剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体である、請求項20に記載の方法。
- (a)患者から生体試料を得て、
(b)試料をGALNT発現用のプローブと接触させ、
(c)工程(b)からの結果を対照と比較し、そして
(d)工程(c)が疾病の可能性を示しているかどうかを決定する
ことを含む、患者の疾病を診断する方法。 - 前記疾病が癌である、請求項23に記載の方法。
- 前記癌が、表1に示すように25%より高い発現レベルを有する癌である、請求項24に記載の方法。
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