JP2008504523A - Mtp活性の蛍光アッセイ法 - Google Patents
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Abstract
【課題】MTP活性を阻害するが、リポタンパク質の分泌には顕著な影響を与えない化合物の、主としてMTPの脂質輸送活性の阻害能に基づいたスクリ−ニング方法の提供。特に自動化やハイスル−プットスクリ−ニングに適した、簡便、迅速かつ高感度なMTP活性のアッセイ方法の提供。
【解決手段】ミクロソ−ムのトリグリセリド輸送タンパク質(MTP)のアッセイ法であって、自動化及びハイスル−プットのスクリ−ニングに適する方法。上記方法は、細胞及び組織のホモジェネ−トにおけるMTP活性並びに精製MTPの活性の測定に使用可能である。MTPにより輸送される脂質のレベルの測定法もまた提供される。また、MTPの脂質輸送活性を調節する化合物の同定法が提供される。更に、MTPの脂質輸送活性又はMTPによる正味の脂質輸送を測定するキットも提供される。
【選択図】なし
【解決手段】ミクロソ−ムのトリグリセリド輸送タンパク質(MTP)のアッセイ法であって、自動化及びハイスル−プットのスクリ−ニングに適する方法。上記方法は、細胞及び組織のホモジェネ−トにおけるMTP活性並びに精製MTPの活性の測定に使用可能である。MTPにより輸送される脂質のレベルの測定法もまた提供される。また、MTPの脂質輸送活性を調節する化合物の同定法が提供される。更に、MTPの脂質輸送活性又はMTPによる正味の脂質輸送を測定するキットも提供される。
【選択図】なし
Description
本発明は、ミクロソームのトリグリセリド輸送タンパク質(MTP)のアッセイ法であって、自動のハイスループットスクリーニングに適する方法に関する。また、MTPにより輸送される脂質のレベルのアッセイ法に関する。また、MTPの脂質輸送活性を調節する化合物の同定法に関する。更に、MTPの脂質輸送活性又はMTPによる正味の脂質輸送を測定するキットに関する。
ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質(MTP)は、アポリポタンパク質B(apoB)リポタンパク質の会合に専ら必要なシャペロンである(総説については非特許文献1から6を参照)。MTPは、小胞体内の新生apoBに脂質を輸送して始原リポタンパク質粒子を形成することにより、apoBを分泌可能にすると言われている(総説については非特許文献1から9を参照)。apoB分泌におけるMTPの脂質輸送活性の重要性は、三つの独立した方法により明らかにされている。すなわち、第一に、MTPの突然変異が、無β−リポタンパク質血症(低比重β−リポタンパク欠損症)におけるapoBリポタンパク質の欠如に関係していたこと(非特許文献10、11);第二に、in vitroでMTPの脂質輸送活性を阻害するアンタゴニストが、in vivoにおいてもapoBの分泌を減少させることが示されたこと(非特許文献12から14);第三に、MTPとapoBの共発現が、apoBとMTPを発現しない細胞においてapoBの分泌を促進することが証明されたこと(非特許文献15、16)、である。MTPは、その脂質輸送活性に加えて、apoBと物理的に相互作用することが知られている(非特許文献1、2)。また最近、MTPは細胞質から小胞体内腔へのトリアシルグリセロール類(TAGs)の移入に関連することが示唆されている(非特許文献17から19)。以上より、MTPは、細胞内小器官内おけるTAGの輸送及びその細胞からの分泌に重要な役割を演じる多機能タンパク質(非特許文献2)であると考えられる。
MTPは放射性同位体アッセイにより、WetterauとZilversmit(非特許文献20、21)により同定、精製された。このアッセイにおいては、放射線標識TAGが、ホスファチジルコリン(PC)及びカルジオリピンからなるドナー小胞に取り込まれている。これらの小胞は、MTPの存在下にアクセプター小胞とインキュベートされる。更に1時間から3時間のインキュベート後に、カルジオリピンを含有するドナー小胞をDE52に結合させ、遠心分離により除去される。上清に残存する放射線をシンチレーションカウンターにより定量する。ただしこの方法は多大な労力と時間を要する。また、カルジオリピンのような負荷電の脂質は、MTPの脂質輸送活性を阻害することが知られている(非特許文献22)。また、この方法には多くの工程が含まれるため、自動化が困難である。したがって、簡便かつ一段階工程によるMTP活性の測定方法は有用である。このような方法は、例えば、MTPの活性を部分的に阻害し、それによりリポタンパク質の会合及び分泌を減少させる化合物の同定に有用である。同定された化合物は、血漿のコレステロール及び細胞内のトリグリセリドのレベルを低下させる薬剤として望ましい。
製薬企業数社が、MTP活性を阻害するアンタゴニストを同定している(非特許文献12から14、及び23)。これらの企業により採られた一般的な手法は、HepG2細胞によるapoB分泌を減少させる化合物を同定し、次いでそれらのMTP活性の阻害能を測定する手法である(非特許文献3、23)。ここで、apoB分泌の阻害による一次スクリーニングが、複数段階の放射線アッセイを用いてMTP活性を阻害する多数の化合物を評価する際、困難性の原因となっていることが示唆された(非特許文献20、21)。この二段階スクリーニングにより、MTP活性を阻害してapoB分泌を減少させる化合物が同定されている。ただし、驚くべきことに、種々の企業により同定されたそれぞれの化合物が構造的に非常に類似していることが明らかとなった(非特許文献23)。また、不運にもこれらの化合物は、細胞内にTAGの顕著な蓄積を引き起こし、ゆえにその選抜された化合物がapoB分泌の潜在的阻害剤ともなり得る。
Hussain,M.ら、2003.Microsomal triglyceride transfer protein and its role in apolipoprotein B−lipoprotein assembly.J.Lipid Res.44:22−32. Hussain,M.ら、2003.Microsomal triglyceride transfer protein:a multifunctional protein.Front.Biosci.8:S500−S506. Bakillah,A.ら、2003.The role of microsomal triglyceride transfer protein in lipoprotein assembly:an update.Front.Biosci.8:D294−D305. Shelness,G.S.ら、2001.Very−low−density lipoprotein assembly and secretion.Curr.Opin.Lipidol.12:151−157. Gordon,D.A.ら、2000.Progress towards understanding the role of microsomal triglyceride transfer protein in apolipo−protein−B lipoprotein assembly.Biochim.Biophys.Acta.1486:72−83. Wetterau,J.R.ら、1997.Microsomal triglyceride transfer protein.Biochim.Biophys.Acta.1345:136−150. Hussain,M.M.ら、2000.A proposed model for the assembly of chylomicrons.Atherosclerosis.148:1−15. Davis,R.A.ら、1999.Cell and molecular biology of the assembly and secretion of apolipoprotein B−containing lipoproteins by the liver.Biochim.Biophys.Acta.1440:1−31. Fisher,E.A.ら、2002.Complexity in the secretory pathway: the assembly and secretion of apolipoprotein B−containing lipoproteins.J.Biol.Chem.277:17377−17380. Wetterau,J.R.ら、1992:Absence of microsomal triglyceride transfer protein in individuals with abetalipoproteinemia.Science.258:999−1001. Shoulders,C.C,ら、1993.Abetalipoproteinemia is caused by defects of the gene encoding the 97 kDa subunit of a microsomal triglyceride transfer protein.Hum.Mol.Genet.2:2109−2116. Jamil,H.ら、1996.An inhibitor of the microsomal triglyceride transfer protein inhibits apoB secretion from HepG2 cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:11991−11995. Haghpassand,M.ら、1996.Inhibition of apolipoprotein B and triglyceride secretion in human hepatoma cells (HepG2).J.Lipid Res.37:1468−1480. Benoist,F.ら、1997.Co−translational degradation of apolipoprotein B100 by the proteasome is prevented by microsomal triglyceride transfer protein−synchronized translation studies on HepG2 cells treated with an inhibitor of microsomal triglyceride transfer protein.J.Biol.Chem.272:20435−20442. Gordon,D.A.ら、1994.Secretion of apolipoprotein B−containing lipoproteins from HeLa cells is dependent on expression of the microsomal triglyceride transfer protein and is regulated by lipid availability.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:7628−7632. Leiper,J.M.ら、1994.Microsomal triglyceride transfer protein, the abetalipoproteinemia gene product, mediates the secretion of apolipoprotein B−containing lipoproteins from heterologous cells.J.Biol.Chem.269:21951−21954. Raabe,M.ら、1999.Analysis of the role of microsomal triglyceride transfer protein in the liver of tissue−specific knockout mice.J.Clin.Invest.103:1287−1298. Wang,Y.W.ら、1999.The activity of microsomal triglyceride transfer protein is essential for accumulation of triglyceride within microsomes in McA−RH7777 cells − a unified model for the assembly of very low density lipoproteins.J.Biol.Chem.21A:27793−27800. Kulinski,A.ら、2002.Microsomal triacylglycerol transfer protein is required for lumenal accretion of triacylglycerol not associated with Apo B, as well as for Apo B lipidation.J.Biol.Chem.277:31516−31525. Wetterau,J.R.ら、1984.A triglyceride and cholesteryl ester transfer protein associated with liver microsomes.J.Biol.Chem.259:10863−10866. Wetterau,J.R.ら、1985.Purification and characterization of microsomal triglyceride and cholesteryl ester transfer protein from bovine liver microsomes.Chem.Phys.Lipids.38:205−222. Jamil,H.ら、1995.Microsomal triglyceride transfer protein. Specificity of lipid binding and transport.J.Biol.Chem.270:6549−6554. Chang,G.ら、2002.Microsomal triglyceride transfer protein(MTP) inhibitors: discovery of clinically active inhibitors using high−throughput screening and parallel synthesis paradigms.Curr.Opin.Drug Discov.Dev.5:562−570. Hussain,M.M.ら、1997.Apolipoprotein B binding to microsomal triglyceride transfer protein decreases with increases in length and lipidation:implications in lipoprotein bio−synthesis.Biochemistry.36:13060−13067. Hussain,M.M.ら、1998.Amino acids 430−570 in apolipoprotein B are critical for its binding to microsomal triglyceride transfer protein.J.Biol.Chem.273:25612−25615. Bakillah,A.ら、1998.Lysine and arginine residues in the N−terminal 18% of apolipoprotein B are critical for its binding to microsomal triglyceride transfer protein.Biochemistry.37:3727−3734. Bakillah,A.ら、2000.Decreased secretion of apoB follows inhibition of apoB−MTP binding by a novel antagonist.Biochemistry.39:4892−4899. Bakillah,A.ら、2001.Binding of microsomal triglyceride transfer protein to lipids results in increased affinity for apolipoprotein B:Evidence for stable microsomal MTP−lipid complexes.J.Biol.Chem.276:31466−31473. Tietge,U.J.F.ら、1999.Hepatic overexpression of microsomal triglyceride transfer protein (MTP) results in increased in vivo secretion of VLDL triglycerides and apolipoprotein B.J.Lipid Res.40:2134−2139. Wetterau,J.R.ら、1991.Structural properties of the microsomal triglyceride−transfer protein complex.Biochemistry.30:4406−4412. Atzel,A.ら、1993.Mechanism of microsomal triglyceride transfer protein catalyzed lipid transport.Biochemistry.32:10444−10450. Atzel,A.ら、1994.Identification of two classes of lipid molecule binding sites on the microsomal triglyceride transfer protein.Biochemistry.33.15382−15388. Bradford,M.M.1976.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein−dye binding.Anal.Biochem.72:248−254. Chang,T.Y.ら、1981.A simple and efficient procedure for the rapid homogenization of cultured animal cells grown in monolayer.Anal.Biochem.116:298−302. Athar,H.ら、2004.A simple,rapid,and sensitive fluorescence assay for microsomal triglyceride transfer protein.J.Lipid Res.45:764−772. Routt,S.M.ら、2004.Biological functions of phosphatidylinositpi transfer proteins,Biochem.Cell Biol.82:254−262. Wetterau,J.R.ら、1986.Localization of intracellular triacylglycerol and cholesteryl ester transfer activity in rat tissue.Biochim.Biophys.Acta875:610−617.
Hussain,M.ら、2003.Microsomal triglyceride transfer protein and its role in apolipoprotein B−lipoprotein assembly.J.Lipid Res.44:22−32. Hussain,M.ら、2003.Microsomal triglyceride transfer protein:a multifunctional protein.Front.Biosci.8:S500−S506. Bakillah,A.ら、2003.The role of microsomal triglyceride transfer protein in lipoprotein assembly:an update.Front.Biosci.8:D294−D305. Shelness,G.S.ら、2001.Very−low−density lipoprotein assembly and secretion.Curr.Opin.Lipidol.12:151−157. Gordon,D.A.ら、2000.Progress towards understanding the role of microsomal triglyceride transfer protein in apolipo−protein−B lipoprotein assembly.Biochim.Biophys.Acta.1486:72−83. Wetterau,J.R.ら、1997.Microsomal triglyceride transfer protein.Biochim.Biophys.Acta.1345:136−150. Hussain,M.M.ら、2000.A proposed model for the assembly of chylomicrons.Atherosclerosis.148:1−15. 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Benoist,F.ら、1997.Co−translational degradation of apolipoprotein B100 by the proteasome is prevented by microsomal triglyceride transfer protein−synchronized translation studies on HepG2 cells treated with an inhibitor of microsomal triglyceride transfer protein.J.Biol.Chem.272:20435−20442. Gordon,D.A.ら、1994.Secretion of apolipoprotein B−containing lipoproteins from HeLa cells is dependent on expression of the microsomal triglyceride transfer protein and is regulated by lipid availability.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:7628−7632. Leiper,J.M.ら、1994.Microsomal triglyceride transfer protein, the abetalipoproteinemia gene product, mediates the secretion of apolipoprotein B−containing lipoproteins from heterologous cells.J.Biol.Chem.269:21951−21954. Raabe,M.ら、1999.Analysis of the role of microsomal triglyceride transfer protein in the liver of tissue−specific knockout mice.J.Clin.Invest.103:1287−1298. Wang,Y.W.ら、1999.The activity of microsomal triglyceride transfer protein is essential for accumulation of triglyceride within microsomes in McA−RH7777 cells − a unified model for the assembly of very low density lipoproteins.J.Biol.Chem.21A:27793−27800. Kulinski,A.ら、2002.Microsomal triacylglycerol transfer protein is required for lumenal accretion of triacylglycerol not associated with Apo B, as well as for Apo B lipidation.J.Biol.Chem.277:31516−31525. Wetterau,J.R.ら、1984.A triglyceride and cholesteryl ester transfer protein associated with liver microsomes.J.Biol.Chem.259:10863−10866. Wetterau,J.R.ら、1985.Purification and characterization of microsomal triglyceride and cholesteryl ester transfer protein from bovine liver microsomes.Chem.Phys.Lipids.38:205−222. Jamil,H.ら、1995.Microsomal triglyceride transfer protein. Specificity of lipid binding and transport.J.Biol.Chem.270:6549−6554. Chang,G.ら、2002.Microsomal triglyceride transfer protein(MTP) inhibitors: discovery of clinically active inhibitors using high−throughput screening and parallel synthesis paradigms.Curr.Opin.Drug Discov.Dev.5:562−570. Hussain,M.M.ら、1997.Apolipoprotein B binding to microsomal triglyceride transfer protein decreases with increases in length and lipidation:implications in lipoprotein bio−synthesis.Biochemistry.36:13060−13067. Hussain,M.M.ら、1998.Amino acids 430−570 in apolipoprotein B are critical for its binding to microsomal triglyceride transfer protein.J.Biol.Chem.273:25612−25615. Bakillah,A.ら、1998.Lysine and arginine residues in the N−terminal 18% of apolipoprotein B are critical for its binding to microsomal triglyceride transfer protein.Biochemistry.37:3727−3734. Bakillah,A.ら、2000.Decreased secretion of apoB follows inhibition of apoB−MTP binding by a novel antagonist.Biochemistry.39:4892−4899. Bakillah,A.ら、2001.Binding of microsomal triglyceride transfer protein to lipids results in increased affinity for apolipoprotein B:Evidence for stable microsomal MTP−lipid complexes.J.Biol.Chem.276:31466−31473. Tietge,U.J.F.ら、1999.Hepatic overexpression of microsomal triglyceride transfer protein (MTP) results in increased in vivo secretion of VLDL triglycerides and apolipoprotein B.J.Lipid Res.40:2134−2139. Wetterau,J.R.ら、1991.Structural properties of the microsomal triglyceride−transfer protein complex.Biochemistry.30:4406−4412. Atzel,A.ら、1993.Mechanism of microsomal triglyceride transfer protein catalyzed lipid transport.Biochemistry.32:10444−10450. Atzel,A.ら、1994.Identification of two classes of lipid molecule binding sites on the microsomal triglyceride transfer protein.Biochemistry.33.15382−15388. Bradford,M.M.1976.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein−dye binding.Anal.Biochem.72:248−254. Chang,T.Y.ら、1981.A simple and efficient procedure for the rapid homogenization of cultured animal cells grown in monolayer.Anal.Biochem.116:298−302. Athar,H.ら、2004.A simple,rapid,and sensitive fluorescence assay for microsomal triglyceride transfer protein.J.Lipid Res.45:764−772. Routt,S.M.ら、2004.Biological functions of phosphatidylinositpi transfer proteins,Biochem.Cell Biol.82:254−262. Wetterau,J.R.ら、1986.Localization of intracellular triacylglycerol and cholesteryl ester transfer activity in rat tissue.Biochim.Biophys.Acta875:610−617.
ゆえに、MTP活性を阻害するが、リポタンパク質の分泌には顕著な影響を与えない化合物が望ましい。そのためには、主としてMTPの脂質輸送活性の阻害能に基づいた、化合物のスクリ−ニング方法を開発することが望ましい。本発明は、自動化やハイスル−プットスクリ−ニングに適した、簡便、迅速かつ高感度なMTP活性のアッセイ方法を提供するものである。
本発明は、MTP活性を測定するための方法及び組成物を提供する。本発明の一態様において、(a)蛍光標識脂質を内部に含有するドナ−小胞を調製し;(b)アクセプタ−小胞を調製し;(c)MTPを含有する細胞ホモジェネ−ト又は単離されたMTPを、標識された脂質がドナ−からアクセプタ−小胞へと輸送される間、上記蛍光標識脂質がMTPと結合するのに十分な時間及び条件の下で、上記アクセプタ−小胞及び標識された上記ドナ−小胞をインキュベ−トし;(d)上記MTPに結合した上記蛍光標識脂質の蛍光を測定する;段階からなる、MTPレベルの測定法が提供される。上記の細胞ホモジェネ−トには、MTPを発現する肝細胞、腸細胞、心臓細胞又は他のいずれかの細胞が含まれ、動物(ヒトを含む)、昆虫及び微生物の細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明に使用される蛍光標識脂質は、トリグリセリド、コレステロ−ルエステル(CE)又はリン脂質を含むが、これらに限定されるものではない。蛍光標識のトリアシルグリセロ−ルの一例は、1,2−ジオレイル−3−NBDグリセロ−ル(NBD−TAG)である。小胞は、望ましくは小型の単層の小胞、多層の小胞、apoBリポタンパク質の小胞、他のリポタンパク質若しくはホスファチジルコリン(PC)の小胞である。
本発明はまた、MTPの脂質輸送活性を調節する化合物の同定法を提供する。その方法は、(a)蛍光標識脂質をドナ−小胞に取り込む段階、(b)アクセプタ−小胞を調製する段階、(c)上記アクセプタ−小胞と標識された前記ドナ−小胞の一定量を、既知又は未知のMTP調節物質である試験化合物と混合する段階、(d)MTPを含む細胞のホモジェネ−ト又は単離されたMTPを、上記ドナ−小胞、上記アクセプタ−小胞及び上記試験化合物を含有する混合物に添加する段階、(e)上記アクセプタ−小胞、上記標識ドナ−小胞、上記試験化合物及び上記MTP(第一試薬)を、上記ドナ−小胞から上記アクセプタ−小胞への標識脂質の輸送の間に、上記蛍光標識脂質がMTPと結合するのに十分な時間と条件下にてインキュベ−トする段階、(f)上記アクセプタ−小胞、上記標識ドナ−小胞及び上記MTP(第二試薬)を、上記ドナ−小胞から上記アクセプタ−小胞への上記標識脂質の輸送の間に、上記蛍光標識脂質がMTPと結合するのに十分な時間と条件下にてインキュベ−トする段階、(g)上記の段階(e)及び段階(f)において得られた、MTPに結合した上記蛍光標識脂質の蛍光を測定する段階、並びに、(h)上記の段階(e)で得られた蛍光の増加と段階(f)で得られた蛍光とを比較し、それをMTPの脂質輸送活性を増加する化合物の指標として関連付け、一方、段階(e)で得られた蛍光の減少と段階(f)で得られた蛍光とを比較し、MTPの脂質輸送活性を減少させる化合物の指標として関連付ける段階からなる。
本発明はまた、ミクロソ−ムのトリグリセリド輸送タンパク質(MTP)の脂質輸送活性の定量法を提供する。本法は、(a)蛍光標識脂質を内部に含有するドナ−小胞を調製する段階、(b)アクセプタ−小胞を調製する段階、(c)MTPを含む細胞のホモジェネ−ト又は単離されたMTPを、上記アクセプタ−小胞及び上記の標識ドナ−小胞と、上記標識脂質が上記ドナ−小胞から上記アクセプタ−小胞に輸送される間、上記蛍光標識された脂質がMTPと結合するのに十分な時間及び条件下にてインキュベ−トする段階、並びに、(d)MTPと結合した上記蛍光標識脂質の蛍光を測定する段階からなる。
本発明はまた、MTPにより輸送される脂質レベルの測定法(すなわち、MTPによる脂質の正味の輸送の測定法)を提供する。上記の方法は、(a)蛍光標識脂質を内部に含有する負荷電のドナ−小胞を調製する段階、(b)アクセプタ−小胞を調製する段階、(c)MTPを含む細胞のホモジェネ−ト又は単離されたMTPを、上記アクセプタ−小胞及び上記の標識ドナ−小胞と、上記標識脂質が上記ドナ−小胞から上記アクセプタ−小胞に輸送される間に、上記蛍光標識脂質がMTPと結合するのに十分な時間及び条件下にてインキュベ−トする段階、(d)上記の負荷電のドナ−小胞及びMTPを、上記段階(c)のインキュベ−ト混合物から除去する段階、並びに、(e)上記アクセプタ−小胞に輸送された上記蛍光標識脂質を測定する段階、からなる。
本発明はまた、MTPの脂質輸送活性及び/又はMTPにより輸送された脂質(脂質の正味の輸送)のレベルを測定するキットを提供する。上記キットは、アクセプタ−小胞及び蛍光標識されたドナ−小胞からなる。望ましくは、上記キットの蛍光標識されたドナ−小胞は、トリグリセリド、コレステロ−ルエステル又はリン脂質からなる。上記キットに包まれる小胞は、小型の単層小胞、多層小胞、apoBリポタンパク質の小胞又はホスファチジルコリン(PC)の小胞であってもよい。上記キットに含まれる小胞は、適切な緩衝液と混合されることが望ましく、またBSAのような安定剤を含んでもよい。上記キット内のMTPによる脂質の正味の輸送を測定するためのドナ−小胞は、負電荷を有することが望ましい。
MTP活性の測定は、従来、精製MTP又は細胞ホモジェネ−トを放射性標識脂質を含むドナ−小胞と1〜3時間インキュベ−トし、ドナ−小胞を沈降させ、アクセプタ−小胞に輸送された放射線を測定することにより行われる。
本発明により、新規、簡便、迅速かつ高感度のMTPのアッセイ法が提供される。本発明の第一の実施態様において、MTPのレベルを測定する方法及び/又はMTPの脂質輸送活性を定量する方法が提供される。本発明のもう一つの実施形態において、MTPにより輸送される脂質のレベル(すなわち、脂質の正味の輸送)を測定する方法が提供される。これらの方法は、個々の脂質輸送活性に対する特異的阻害剤の同定、これらの脂質の輸送に関与する種々のドメインの特徴付け、及び脂質を結合するが輸送をすることができない変異体の単離に有用である。
第一の実施形態において、アクセプタ−小胞の存在下で、脂質と結合し更にその脂質を膜から抽出するMTPの活性が測定される。脂質が単層(単一のリン脂質二重層)膜の小胞内にある場合、蛍光が消失する。そこでMTPと会合すると、脂質の蛍光標識試薬は消失せず、蛍光光度計により検出される。このアッセイ法によるMTP活性の測定は、時間及び濃度依存的であるため、この方法が他のアンタゴニストの同定にも利用可能であることを示唆する。
更なる実施形態において、蛍光脂質のアクセプタ−小胞への正味の輸送が測定される。この方法において、アクセプタ−小胞に蓄積した蛍光脂質は、陰イオン交換樹脂によるMTP及びドナ−小胞の除去後に定量される。本発明のこの実施形態は、アクセプタ−小胞をドナ−小胞及びMTPから分離する段階が追加されている。加えて、負荷電の脂質がドナ−小胞内に取り込まれると、上記アッセイの感度が低下する。そのため、このアッセイ法は脂質の正味の輸送の測定が必要な場合に望ましい。ル−チンとしてのMTP活性の測定には、ここで開示される、MTPのレベルを測定、又はMTPの脂質輸送活性を定量する方法が望ましい。
上記アッセイにおいては、単離及び/若しくは精製されたMTP、又は細胞ホモジェネ−トを、消光された蛍光標識脂質(例えば、トリグリセリド、コレステロ−ルエステル、及び/又はリン脂質)を含むドナ−小胞及び種々のタイプのアクセプタ−小胞とインキュベ−トする。上記の細胞ホモジェネ−トは、MTPを発現するいずれかの細胞から調製可能である。望ましくは、上記細胞は動物の肝細胞、腸細胞又は心臓細胞である。上記動物細胞はラット、マウス、サル又はヒトのような動物由来が望ましい。あるいは、上記の細胞ホモジェネ−トは昆虫又は微生物由来の細胞でもよい。
本発明において、蛍光標識脂質にはトリグリセリド、コレステロ−ルエステル(CE)又はリン脂質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に使用されるトリグリセリドの一例は、トリアシルグリセロ−ル(TAG)である。本発明に使用されるリン脂質の一例は、ホスファチジルエタノ−ルアミンである。
上記脂質の標識に使用される可能性のある種々のタイプの蛍光化合物の例には、7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾ−ル(NBD)、ピレン又はBODIPY(登録商標)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの蛍光化合物を用いて脂質を標識する方法は当業者に公知であり、調製済の蛍光標識脂質もまた容易に入手可能である。本発明での使用にあたり、上記の脂質は少なくとも一つの蛍光標識をいずれの位置に含んでもよい。例えば、トリアシルグリセリドは少なくとも一つのNBDをいずれかの位置に含み、一方でその他の位置に脂肪酸を含んでもよい。
ピレンにより標識された脂質の例として、Molecular Probes社(ユ−ジン、OR)から以下のものが入手可能であり、以下のとおりオンラインカタログに一覧が示されている:
B−3782
1,2−ビス−(1−ピレネデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン
C−212
コレステリル−1−ピレネブチレ−ト
D−6562
1,2−ジオレオイル−3−(1−ピレネドデカノイル)−rac−グリセロ−ル
H−361
1−ヘキサデカノイル−2−(1−ピレネデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−py−C10−HPC)
H−3784
1−ヘキサデカノイル−2−(1−ピレネデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン(β−py−C10−HPE)
H−3809
1−ヘキサデカノイル−2−(1−ピレネデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロ−ル、アンモニウム塩(β−py−C10−PG)
H−3810
1−ヘキサデカノイル−2−(1−ピレネデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホメタノ−ル、ナトリウム塩(β−py−C10−HPM)
H−3818
1−ヘキサデカノイル−2−(1−ピレネヘキサノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−py−C6−HPC)
P−58
N−(1−ピレネスルホニル)−1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩(pyS DHPE)
B−3782
1,2−ビス−(1−ピレネデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン
C−212
コレステリル−1−ピレネブチレ−ト
D−6562
1,2−ジオレオイル−3−(1−ピレネドデカノイル)−rac−グリセロ−ル
H−361
1−ヘキサデカノイル−2−(1−ピレネデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−py−C10−HPC)
H−3784
1−ヘキサデカノイル−2−(1−ピレネデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン(β−py−C10−HPE)
H−3809
1−ヘキサデカノイル−2−(1−ピレネデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロ−ル、アンモニウム塩(β−py−C10−PG)
H−3810
1−ヘキサデカノイル−2−(1−ピレネデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホメタノ−ル、ナトリウム塩(β−py−C10−HPM)
H−3818
1−ヘキサデカノイル−2−(1−ピレネヘキサノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−py−C6−HPC)
P−58
N−(1−ピレネスルホニル)−1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩(pyS DHPE)
BODIPY標識された脂質の例には以下のものが存在し、それらはMolecular Probes社から入手可能であり、以下のとおりオンラインカタログに一覧が示されている:
B−7701
1,2−ビス−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ウンデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(ビス−BODIPY(登録商標) FL C11−PC)
B−3794
2−(5−ブチル−4,4−ジフルオロ−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ノナノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−C4−BODIPY(登録商標) 500/510 C9−HPC)
C−3927
コレステリル−4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノエ−ト(コレステリル BODIPY(登録商標) FL C12)
C−12680
コレステリル−4,4−ジフルオロ−5−(4−メトキシフェニル)−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ウンデカノエ−ト(コレステリル BODIPY(登録商標) 542/563 C11)
C−12681
コレステリル−4,4−ジフルオロ−5−(2−ピロリル)−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ウンデカノエ−ト(コレステリル BODIPY(登録商標) 576/589 C11)
D−3792
2−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−BODIPY(登録商標) FL C12−HPC)
D−3803
2−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ペンタノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−BODIPY(登録商標) FL C5−HPC)
D−3800
N−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオニル)−1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩(BODIPY(登録商標) FL DHPE)
P−12656
N−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオニル)−1,2−ジヘキサノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩(BODIPY(登録商標) FL ジカプロイル PE)
D−3813
2−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン(β−BODIPY(登録商標) 530/550 C12−HPE)
D−3815
2−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ペンタノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−BODIPY(登録商標) 530/550 C5−HPC)
D−3799
N−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオニル)−1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩(BODIPY(登録商標) 530/550 DHPE)
D−3793
2−(4,4−ジフルオロ−5−メチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−BODIPY(登録商標) 500/510 C12−HPC)
D−3795
2−(4,4−ジフルオロ−5−オクチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ペンタノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−C8−BODIPY(登録商標) 500/510 C5−HPC)
D−3806
2−(4,4−ジフルオロ−5−(4−フェニル−1,3−ブタジエニル)−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ペンタノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−BODIPY(登録商標) 581/591 C5−HPC)
B−7701
1,2−ビス−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ウンデカノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(ビス−BODIPY(登録商標) FL C11−PC)
B−3794
2−(5−ブチル−4,4−ジフルオロ−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ノナノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−C4−BODIPY(登録商標) 500/510 C9−HPC)
C−3927
コレステリル−4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノエ−ト(コレステリル BODIPY(登録商標) FL C12)
C−12680
コレステリル−4,4−ジフルオロ−5−(4−メトキシフェニル)−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ウンデカノエ−ト(コレステリル BODIPY(登録商標) 542/563 C11)
C−12681
コレステリル−4,4−ジフルオロ−5−(2−ピロリル)−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ウンデカノエ−ト(コレステリル BODIPY(登録商標) 576/589 C11)
D−3792
2−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−BODIPY(登録商標) FL C12−HPC)
D−3803
2−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ペンタノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−BODIPY(登録商標) FL C5−HPC)
D−3800
N−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオニル)−1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩(BODIPY(登録商標) FL DHPE)
P−12656
N−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオニル)−1,2−ジヘキサノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩(BODIPY(登録商標) FL ジカプロイル PE)
D−3813
2−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン(β−BODIPY(登録商標) 530/550 C12−HPE)
D−3815
2−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ペンタノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−BODIPY(登録商標) 530/550 C5−HPC)
D−3799
N−(4,4−ジフルオロ−5,7−ジフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオニル)−1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩(BODIPY(登録商標) 530/550 DHPE)
D−3793
2−(4,4−ジフルオロ−5−メチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ドデカノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−BODIPY(登録商標) 500/510 C12−HPC)
D−3795
2−(4,4−ジフルオロ−5−オクチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ペンタノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−C8−BODIPY(登録商標) 500/510 C5−HPC)
D−3806
2−(4,4−ジフルオロ−5−(4−フェニル−1,3−ブタジエニル)−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ペンタノイル)−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(β−BODIPY(登録商標) 581/591 C5−HPC)
NBD標識脂質はまた、Molecular Probes社によりカスタム合成されたものが使用可能であり、例えばD−16408:1,3−ジオレイン,2−NBD−Xエステルの注文合成、又はB−1800:NBD標識コレステロ−ルオレイン酸エステル(コレステロ−ルエステル)のカスタム合成がその例である。
更に、以下の化合物はMolecular Probes社から購入可能であり、注文合成の必要はない:
N−00360(NBD−PE) N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾ−ル−4−イル)−1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−ル−3−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム;
N−03786(NBD C6−HPC) 2−(6−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾ−ル−4−イル)アミノ)ヘキサノイル−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;及び
N−03787(NBD C12−HPC) 2−(12−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾ−ル−4−イル)アミノ)ドデカノイル−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン。
N−00360(NBD−PE) N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾ−ル−4−イル)−1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−ル−3−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム;
N−03786(NBD C6−HPC) 2−(6−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾ−ル−4−イル)アミノ)ヘキサノイル−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;及び
N−03787(NBD C12−HPC) 2−(12−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾ−ル−4−イル)アミノ)ドデカノイル−1−ヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン。
本発明に使用可能な小胞の例としては、小型の単層小胞、多層小胞、apoBリポタンパク質の小胞又はホスファチジルコリン(PC)の小胞が挙げられる。本明細書において、また当業者に公知のように、「単層小胞」は、一つのリン脂質二重層を有する小胞(リポソ−ム)を意味する。「多層小胞」は、数個のリン脂質二重層を有する小胞(リポソ−ム)を意味する。図8は、二重の脂質層膜に埋め込まれた標識トリグリセリドであるNBD−TGを含有する、単層小胞を模式的に示した図である。アクセプタ−小胞の製法は公知であり、例えば非特許文献20、21及び30から32に記載が存在する。ドナ−小胞の製法も公知であり、例えば非特許文献20、21及び30から32に記載が存在する。本発明において、主題のドナ−小胞を調製する場合、カルジオリピンを除外してもよく、また、放射線標識TAGを蛍光標識TAGで置換することも可能である。
ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞のいずれも、トリス−塩酸(pH約7.4)のような適切な緩衝液と混合されることが望ましい。ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞は別々に保存することが可能である。他の方法として、これらの小胞を一緒に保存し、ドナ−小胞/アクセプタ−小胞の混合物を直接本発明のアッセイ又はキットに使用してもよい。ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞が一緒に保存される場合、ドナ−小胞:アクセプタ−小胞の比は約1:4〜約1:10の範囲であることが望ましい。最も望ましくは、ドナ−小胞:アクセプタ−小胞の比は約1:6である。調製された小胞は、NaCl及びBSAをそれぞれ最終濃度約150mM及び1mg/mlにて添加することにより、更に安定化させることが可能である。
MTPは、公知の方法を用いて種々の供給源から分離・精製することが可能であり、例えば非特許文献20及び21に記載が存在する。例えば、MTPは前述のようにウシの肝臓から単離可能である(非特許文献20及び21)。また、ヒトのMTPは、非特許文献15に記載のように培養細胞をMTPのコ−ド配列を含む発現ベクタ−で培養細胞をトランスフェクションすることにより調製が可能である。これらの非特許文献及び全ての他の非特許文献は、参照により全ての内容が本明細書に援用される。
本発明において、MTPにより仲介される脂質輸送による蛍光の増加は、短時間経過の後に測定可能である。本明細書において提供される方法を用い、MTP発現プラスミドでトランスフェクションされたHepG2、Caco−2細胞及びCOS細胞において、MTP活性の測定が可能となった。更に本発明により提供される方法は、細胞内MTP及び精製MTPの、そのアンタゴニストによる阻害を解析する際に有用である。これらの方法は自動化に適しており、容易にハイスル−プットスクリ−ニングに適用することができる。
更に本発明は、例えば同定、調節、診断等の種々の目的で、特定のサンプルにおけるMTPのアッセイを可能にする方法を提供する。例えば、これらの方法は、精製MTPサンプルの活性や、細胞株、組織等に存在するMTPをアッセイするのに使用可能である。本発明により提供されるアッセイは非常に用途が広く、蛍光標識を含む何らかの脂質のMTPによる輸送が測定可能である。更に、本明細書に提供されるMTP測定方法は簡便かつ迅速である。これらの方法は、ドナ−小胞とアクセプタ−小胞間の脂質輸送の間に生じる、蛍光標識試薬とMTPとの結合に起因する蛍光の増加を測定することに基づく。
本発明の方法は、MTPの発現が確認されている細胞において、活性を正確に測定するが、MTPを発現しない細胞においては活性が測定されない(表1)。更に、これらの方法は、先行技術における放射性同位元素によるアッセイを用いて同定されたアンタゴニストと同様の阻害特性を表す(図7)。MTPはアクセプタ−小胞の存在下で、有意に高い活性を示す(図4)。アクセプタ−小胞の非存在下でのMTPの低い脂質結合活性は、脂質輸送過程における種々のアクセプタ−小胞の機能を理解するための特徴的な機会を提供する。
本明細書により提供される、MTPにより輸送される脂質のレベル(脂質の正味の輸送)を測定する方法において、上記方法はMTPによる、実際にアクセプタ−小胞における蛍光標識脂質の正味の蓄積を測定する。
このように本発明は、MTP活性を測定するための簡便かつ迅速な蛍光アッセイ法を提供する。この新規方法の利点としては、簡便性、迅速性、高感度、負荷電脂質使用の回避、精製されたMTP及び細胞のMTPによる種々の脂質輸送活性の解析における汎用性、アンタゴニストの阻害活性の測定への応用及び放射線使用の未然防止、等が挙げられる。本発明により提供される蛍光アッセイは自動化が容易であり、大規模のハイスル−プットスクリ−ニングに使用可能である。この方法は、部分的にMTP活性を阻害し、かつ細胞におけるTAG蓄積に結びつく望ましくない副作用を最小にする候補化合物の同定に有用である。MTPは、リポタンパク質構築シャペロン以外の機能を有する多機能タンパク質であると考えられる。本明細書において提供される蛍光アッセイ法に基づくスクリ−ニングにより同定される化合物は、MTPが有する、リポタンパク質の構築及び分泌とは無関係の他の機能の同定に有用と考えられる。
本発明におけるMTPのアッセイ法は、基本的に三つの成分、すなわちドナ−小胞、アクセプタ−小胞及びMTPからなる。本発明により提供される方法は、アッセイ混合物の上記三成分全て、及び時間との間で直線的な関係を示す(図1から4)。
典型的なアッセイは、以下に概説するとおり実施される。以下に列挙される種々の化合物の量は、これら化合物間の比率が相対的に同一に保たれる限り当然ながら変更可能である。各アッセイにおいては4種の異なる条件(ブランク試験区、総蛍光区、陽性対照区及び試験区)の採用が推奨される。全てのアッセイにおいて、反応は最終的なMTP源の添加により開始される。約3μlずつのアクセプタ−小胞及びドナ−小胞を、蛍光マイクロタイタ−(黒)プレ−トにピペットで添加する。2mM EDTAを含む10mMトリス(pH7.4)を約10μl、及び1%BSAの1.5M NaCl溶液10μlを添加する。本明細書に記載のアッセイに使用する小胞の正確な数を、ル−チン的に定量することは困難である。しかしながら、種々の調製済み小胞に存在するリン脂質及びトリグリセリドを測定することにより、小胞のより容易な定量が可能となる。すなわち、上記3μlのドナ−小胞は、1ml当たり約450nmolのホスファチジルコリン(PC)及び約14nmolのトリグリセリドに相当する。ドナ−小胞は、ある一定の濃度範囲で使用することが可能である。望ましい範囲は、例えば、約200〜約600nmolのホスファチジルコリン(PC)、及び7〜20nmolのトリグリセリドの範囲のいずれかである。上記の3μlのアクセプタ−小胞は、約2,400nmol PC/mlに対応する。しかしながら、小胞の濃度範囲は、例えば約1,400〜約3,400nmol PC/mlの範囲でよい。
ブランク試験においては、必要量の対照緩衝液(陽性対照区及び試験区においてはMTP源を含む)を添加し、更に水を添加して液量を約100μlにする。陽性対照においては、所定量のMTP源を添加して、更に水を添加して液量を約100μlにする。試験試料においては、未知の試料を添加して最終アッセイ液量にする。総蛍光アッセイの混合物については、約3μlのドナ−小胞及び97μlのイソプロパノ−ルのみを添加する。上記混合物を約37℃において約30分間インキュベ−トする。蛍光単位を、それぞれ、460から470nm及び530から550nmの励起及び発光波長を用いて測定する。輸送活性が低い場合、インキュベ−トの時間を増加してもよい。実際は、同じタイタ−プレ−トを数回使用して蛍光の増加を経時的に測定してもよい。しかしながら、上記フルオロフォア(蛍光標識試薬)は、イソプロパノ−ル中では長期間安定に維持することが困難である。したがって、30分以上のときは、30分又はそれ以前に測定された数値を使用すべきである。アッセイにて使用される構成成分は、小胞及び陽性対照を含め、本明細書に記載のとおり調製することが可能であり、又はChylos社(ウッドベリ−、ニュ−ヨ−ク州)からも入手可能である。
本発明の望ましい実施形態において、ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞は共に、貯蔵又は上記のように混合して使用することが可能である。この実施態様においてアッセイを行う場合、これらの小胞(ドナ−及びアクセプタ−の両方)の必要なピペット操作は1回のみである。
上記小胞は、トリス塩酸(pH約7.4)のような適切な緩衝液と混合するのが望ましい。またリン酸緩衝液又はHEPESのような他の緩衝液を使用してもよい。望ましい実施態様においては、NaClを最終濃度約150mMまで添加する。NaClの原液(例えば3M)を調製し、その後希釈して最終濃度にしてもよい。KCl又はMgCl2のような他の塩類もまた使用可能である。BSAを最終濃度約1mg/mlとなるように添加して上記小胞を安定化するのが望ましい。原液(例えば、20mg BSA/ml)を作成し、その後希釈して最終濃度にしてもよい。なお、更なる実施態様において、インキュベ−トを室温で行ってもよい。
蛍光脂質を含むドナ−小胞及びアクセプタ−小胞は、実施例1に記載のよう調製が可能である。望ましい実施態様においては、同液量のドナ−小胞及びアクセプタ−小胞を混合する。典型的なアッセイ方法を以下に記す。
(i)下表記載のように、蛍光マイクロタイタ−(黒)プレ−トにピペットで小胞を3回添加する。
(ii)水、試料等を添加する。約5分間、これらの成分が室温に達するまで静置する。
(iii)対照区及び試験区にMTPを加えて反応を開始させ、またイソプロパノ−ルを総蛍光区に加える。
(iv)室温で30分間インキュベ−トする。
MTP活性の測定:460〜470nmの励起波長、及び530〜550nmの発光波長をそれぞれ用い、蛍光単位(FU)を測定する。
MTP活性の計算:
対照区における輸送%(C):(対照区のFU−ブランク試験区のFU)/(総蛍光区のFU−ブランク試験区のFU)×100
試験区における輸送%(D):(試験区のFU−ブランク試験区のFU)/(総蛍光区のFU−ブランク試験区のFU)×100
(i)下表記載のように、蛍光マイクロタイタ−(黒)プレ−トにピペットで小胞を3回添加する。
(ii)水、試料等を添加する。約5分間、これらの成分が室温に達するまで静置する。
(iii)対照区及び試験区にMTPを加えて反応を開始させ、またイソプロパノ−ルを総蛍光区に加える。
(iv)室温で30分間インキュベ−トする。
MTP活性の計算:
対照区における輸送%(C):(対照区のFU−ブランク試験区のFU)/(総蛍光区のFU−ブランク試験区のFU)×100
試験区における輸送%(D):(試験区のFU−ブランク試験区のFU)/(総蛍光区のFU−ブランク試験区のFU)×100
本発明により、MTPの脂質輸送活性を調節する化合物の同定法もまた提供される。上記の方法は、以下の段階から構成される:(a)蛍光標識脂質をドナ−小胞に取り込む段階;(b)アクセプタ−小胞を調製する段階;(c)アクセプタ−小胞と標識ドナ−小胞の一定量を、既知又は未知のMTP調節剤である試験化合物と混合する段階;(d)MTPを含む細胞のホモジェネ−ト又は分離されたMTPを、ドナ−小胞、アクセプタ−小胞及び試験化合物を含む上記の混合物に添加する段階;(e)アクセプタ−小胞、標識ドナ−小胞、試験化合物及びMTPの混合液(第一試薬)を、ドナ−小胞からアクセプタ−小胞への標識脂質輸送の間に蛍光標識脂質がMTPと結合するのに十分な時間及び条件下でインキュベ−トする段階;(f)アクセプタ−小胞、標識ドナ−小胞及びMTPの混合液(第二試薬)を、ドナ−小胞からアクセプタ−小胞への標識脂質輸送の間に蛍光標識脂質がMTPと結合するのに十分な時間及び条件下でインキュベ−トする段階;(g)上記(e)と(f)において得られた、MTPに結合した蛍光標識脂質の蛍光を測定する段階;並びに、(h)上記(e)で得られたMTPに結合する蛍光標識脂質の蛍光の増加を、上記(f)で得られたMTPに結合する蛍光標識脂質の蛍光と比較し、MTPの脂質輸送活性を増加する化合物の指標として関連付け、一方、段階(e)で得られたMTPに結合する蛍光標識脂質の蛍光の減少を、段階(f)で得られたMTPに結合する蛍光標識脂質の蛍光と比較し、MTPの脂質輸送活性を減少させる化合物の指標として関連付ける段階;である。
本発明の他の実施態様において、MTPの脂質輸送活性測定用のキットが提供される。上記キットは上記のように、アクセプタ−小胞及び蛍光標識ドナ−小胞を含む。上記蛍光標識ドナ−小胞は、トリグリセリド、コレステロ−ルエステル、又はリン脂質からなることが望ましい。別の望ましい実施形態において、上記トリグリセリドは、1,2−ジオレイル−3−NBDグリセロ−ル(NBD−TAG)のようなNBD標識を含むいずれかのトリアシルグリセロ−ルである。他の望ましい実施形態において、上記リン脂質はホスファチジルエタノ−ルアミンである。
上記小胞は、トリス−HCl(pH7.4付近)のような適切な緩衝液と混合されることが望ましい。リン酸緩衝液又はHEPESのような他の緩衝液もまた使用可能である。
キットの構成物であるアクセプタ−小胞及び/又はドナ−小胞は、小さな単層小胞、多層小胞、apoB−リポタンパク質の小胞、又はホスファチジルコリン(PC)の小胞を含んでもよい。これらの小胞は、BSAの添加により安定化させることが可能である。
本発明はまた、ミクロソ−ムのトリグリセリド輸送タンパク質(MTP)の脂質輸送活性の定量法を提供する。上記方法は、(a)蛍光標識脂質を内部に含有するドナ−小胞を調製する段階;(b)アクセプタ−小胞を調製する段階;(c)MTPを含む細胞ホモジェネ−ト又は単離されたMTPを、アクセプタ−小胞及び標識ドナ−小胞と、標識脂質がドナ−小胞からアクセプタ−小胞へと輸送される間に蛍光標識脂質がMTPと結合するのに十分な時間及び条件下でインキュベ−トする段階;並びに、(d)MTPに結合した蛍光標識脂質の蛍光を測定する段階;からなる。
本発明により、MTPにより輸送される脂質のレベルの測定法(すなわち、MTPによる脂質の正味の輸送を測定する方法)も提供される。上記の方法は、(a)蛍光標識脂質を内部に含有する負荷電のドナ−小胞を調製する段階;(b)アクセプタ−小胞を調製する段階;(c)MTPを含む細胞ホモジェネ−ト又は単離されたMTPを、アクセプタ−小胞及び標識ドナ−小胞と、蛍光標識脂質がMTPと結合し、ドナ−小胞からアクセプタ−小胞への蛍光標識脂質の輸送が行われるのに十分な時間及び条件下にてインキュベ−トする段階;(d)段階(c)のインキュベ−ト混合物から負荷電のドナ−小胞及びMTPを除去する段階;並びに、(e)アクセプタ−小胞に輸送された蛍光標識脂質を測定する段階;からなる。
ドナ−小胞は、実施例に記載のように、カルジオリピンのような負荷電の脂質の添加により負に荷電することが可能である。他の負荷電の脂質を使用してもよく、ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシト−ルが含まれるが、これらに限定されない。負荷電のドナ−小胞及びMTPは遠心分離により沈降させ、除去することが可能である。例えば、段階(c)の混合物を約10,000から12,000rpmで遠心するのが望ましい。アクセプタ−小胞は上清に残存する。
本発明はまた、MTPにより輸送される脂質の正味の輸送の測定に有用なキットを提供する。上記キットは、アクセプタ−小胞及び負荷電の蛍光標識ドナ−小胞を含む。上記蛍光標識ドナ−小胞は、トリグリセリド、コレステロ−ルエステル又はリン脂質から構成されるのがよい。上記キットに含まれるトリグリセリドの一例は、NBD標識を含むいずれかのトリアシルグリセロ−ルである。例えば、上記トリアシルグリセロ−ルは1,2−ジオレオイル3−NBDグリセロ−ル(NBD−TAG)が使用可能である。ドナ−小胞を構成するリン脂質の一例は、ホスファチジルエタノ−ルアミンである。上記キットに使用されるアクセプタ−小胞は、小型の単層小胞、多層小胞、apoB−リポタンパク質の小胞又はホスファチジルコリン(PC)の小胞であってよい。上記キットに含まれる小胞を、BSAの添加により安定化させることが可能である。
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明の範囲をいささかも限定するものではない。
材料及び方法
材料
MTPを、放射線アッセイ(非特許文献20、21)を用いてウシの肝臓から精製した。この方法は上記の文献(非特許文献24から29)においても使用されている。PC及びTAGは、Avanti Lipids社(アラバスタ−、アラバマ州)から購入した。蛍光(ニトロベンゾキサジアゾ−ル)標識TAGは、Molecular Probes社(ユ−ジン、オレゴン州)から入手した。蛍光標識コレステリルエステル(CE)及びリン脂質(PL)は、それぞれRoar Biochemical社(ニュ−ヨ−ク、ニュ−ヨ−ク州)及びCardiovascular Target社(ニュ−ヨ−ク、ニュ−ヨ−ク州)から購入した。イソプロパノ−ル及び他の化合物は、Sigma Chemical社(セントルイス、ミズ−リ州)から購入した。アクセプタ−小胞は、Wetterauらによる文献(非特許文献20、21、30から32)に記載のとおり調製した。ドナ−小胞もまた、カルジオリピンを用いず、放射線標識TAGを蛍光標識TAGで置換した以外は彼らの方法に従って調製した。既知量の蛍光脂質をイソプロパノ−ルで希釈して標準曲線を作成し、イソプロパノ−ルで小胞を破砕した後に小胞内の標識脂質の量を測定した。小胞中のトリオレインの量を、比色アッセイ(Infinity(商標)トリグリセリド試薬キット、Sigma社)により定量した。MTP阻害剤であるBMS200150(ジフェニル−プロピル−ピペリジニル−ジヒドロイソ−インド−ル)については非特許文献12に記載が存在し、ブリストルマイヤ−ズ スクイブ社(プリンストン、ニュ−ジャ−ジ−州)のHaris Jamil博士から寄贈された。
材料
MTPを、放射線アッセイ(非特許文献20、21)を用いてウシの肝臓から精製した。この方法は上記の文献(非特許文献24から29)においても使用されている。PC及びTAGは、Avanti Lipids社(アラバスタ−、アラバマ州)から購入した。蛍光(ニトロベンゾキサジアゾ−ル)標識TAGは、Molecular Probes社(ユ−ジン、オレゴン州)から入手した。蛍光標識コレステリルエステル(CE)及びリン脂質(PL)は、それぞれRoar Biochemical社(ニュ−ヨ−ク、ニュ−ヨ−ク州)及びCardiovascular Target社(ニュ−ヨ−ク、ニュ−ヨ−ク州)から購入した。イソプロパノ−ル及び他の化合物は、Sigma Chemical社(セントルイス、ミズ−リ州)から購入した。アクセプタ−小胞は、Wetterauらによる文献(非特許文献20、21、30から32)に記載のとおり調製した。ドナ−小胞もまた、カルジオリピンを用いず、放射線標識TAGを蛍光標識TAGで置換した以外は彼らの方法に従って調製した。既知量の蛍光脂質をイソプロパノ−ルで希釈して標準曲線を作成し、イソプロパノ−ルで小胞を破砕した後に小胞内の標識脂質の量を測定した。小胞中のトリオレインの量を、比色アッセイ(Infinity(商標)トリグリセリド試薬キット、Sigma社)により定量した。MTP阻害剤であるBMS200150(ジフェニル−プロピル−ピペリジニル−ジヒドロイソ−インド−ル)については非特許文献12に記載が存在し、ブリストルマイヤ−ズ スクイブ社(プリンストン、ニュ−ジャ−ジ−州)のHaris Jamil博士から寄贈された。
輸送アッセイ
アッセイを、ミクロフルオ−ル(登録商標)2黒「U」型底マイクロタイタ−プレ−ト(Thermo Labsystems社、フランクリン、マサチュ−セッツ州)にて行った。ウエルに、3μlのドナ−小胞(1ml当たり450nmolのPC及び14nmolのTAG)、3μlのアクセプタ−小胞(2,400nmol PC/ml)、10μlの10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)、2mM EDTA、150mM NaCl溶液、最終アッセイ液量を100μlにするための蒸留水、及び精製MTP(0.1〜1.5μg)を、3回、添加した。いくつかの実験において、NaCl及びBSAを添加して最終濃度をそれぞれ150mM及び1mg/mlにした。プレ−トを37℃又は室温で異なる時間インキュベ−トし、蛍光プレ−トリ−ダ−(7620蛍光マイクロプレ−トリ−ダ−、ケンブリッジテクノロジ−社、ウオ−タ−タウン、マサチュ−セッツ州)を用い、460nmの励起波長及び530nmの発光波長にて測定した。ブランク値を決定するときはMTPをウエルから省いた。ドナ−小胞における総蛍光量は、97μlのイソプロパノ−ルを3μlのドナ−小胞に添加したものを用い決定した。MTP阻害を解析する際、MTP添加前に種々の濃度のBMS200150を反応混合物に添加した。MTP活性(輸送の%表示)を次の式により計算した:輸送パ−セント=(アッセイウエルの任意の蛍光単位−ブランク試験値)/(総蛍光単位−ブランク試験値)×100。比活性を1μg当たり、1時間当たりの輸送パ−セントとして表わす。
アッセイを、ミクロフルオ−ル(登録商標)2黒「U」型底マイクロタイタ−プレ−ト(Thermo Labsystems社、フランクリン、マサチュ−セッツ州)にて行った。ウエルに、3μlのドナ−小胞(1ml当たり450nmolのPC及び14nmolのTAG)、3μlのアクセプタ−小胞(2,400nmol PC/ml)、10μlの10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)、2mM EDTA、150mM NaCl溶液、最終アッセイ液量を100μlにするための蒸留水、及び精製MTP(0.1〜1.5μg)を、3回、添加した。いくつかの実験において、NaCl及びBSAを添加して最終濃度をそれぞれ150mM及び1mg/mlにした。プレ−トを37℃又は室温で異なる時間インキュベ−トし、蛍光プレ−トリ−ダ−(7620蛍光マイクロプレ−トリ−ダ−、ケンブリッジテクノロジ−社、ウオ−タ−タウン、マサチュ−セッツ州)を用い、460nmの励起波長及び530nmの発光波長にて測定した。ブランク値を決定するときはMTPをウエルから省いた。ドナ−小胞における総蛍光量は、97μlのイソプロパノ−ルを3μlのドナ−小胞に添加したものを用い決定した。MTP阻害を解析する際、MTP添加前に種々の濃度のBMS200150を反応混合物に添加した。MTP活性(輸送の%表示)を次の式により計算した:輸送パ−セント=(アッセイウエルの任意の蛍光単位−ブランク試験値)/(総蛍光単位−ブランク試験値)×100。比活性を1μg当たり、1時間当たりの輸送パ−セントとして表わす。
Cos−7細胞のトランスフェクション
Cos−7細胞は、10%のウシ胎児血清と1%の抗生物質−抗真菌剤(ライフテクノロジ−ズ社、ロックビル、ミズ−リ州)を添加したDMEM培地(セルグロメディアテック社、ヘ−ンドン、ヴァ−ジニア州)中で培養した(37℃、5%CO2、加湿インキュベ−タ−内)。トランスフェクションの24時間前に、細胞を75cm2のフラスコに1×106個ずつ分注した。トランスフェクション時に細胞は約50〜60%の集密状態であった。MTP発現ベクタ−(非特許文献15)pRc−hMTP(7μg、サイトメガロウイルスプロモ−タ−の制御下にてヒトのMTPを発現する)を、21μlのFuGENE−6トランスフェクション試薬(ロッシュダイアグノスティックス社、インディアナポリス、インディアナ州)とコンジュゲ−トし、Cos−7細胞に導入した。細胞を、7mlの培地中で37℃、5%CO2の条件下で約72時間培養した。またCos−7細胞をFuGENE−6のみでも処理し(模擬トランスフェクション)、対照区として使用した。
Cos−7細胞は、10%のウシ胎児血清と1%の抗生物質−抗真菌剤(ライフテクノロジ−ズ社、ロックビル、ミズ−リ州)を添加したDMEM培地(セルグロメディアテック社、ヘ−ンドン、ヴァ−ジニア州)中で培養した(37℃、5%CO2、加湿インキュベ−タ−内)。トランスフェクションの24時間前に、細胞を75cm2のフラスコに1×106個ずつ分注した。トランスフェクション時に細胞は約50〜60%の集密状態であった。MTP発現ベクタ−(非特許文献15)pRc−hMTP(7μg、サイトメガロウイルスプロモ−タ−の制御下にてヒトのMTPを発現する)を、21μlのFuGENE−6トランスフェクション試薬(ロッシュダイアグノスティックス社、インディアナポリス、インディアナ州)とコンジュゲ−トし、Cos−7細胞に導入した。細胞を、7mlの培地中で37℃、5%CO2の条件下で約72時間培養した。またCos−7細胞をFuGENE−6のみでも処理し(模擬トランスフェクション)、対照区として使用した。
細胞ホモジェネ−ト中のMTP活性の測定
細胞ホモジェネ−ト中のMTP活性を、Jamilら(非特許文献21)に記載の方法により決定した。集密細胞の単層を氷冷した無菌のPBS、pH7.4で洗浄し、5mlのPBS中に懸濁させ、15mlの円錐管に移し、遠心分離(2,500rpm、10分、室温)によりペレット状に沈降させた。この段階で、細胞ペレットは70℃で保存することが出来る。750μlのホモジェネ−トバッファ−(50mMのトリス−塩酸、pH7.4、50mM KCl、及び5mM EDTA)及び7.5μlのプロテア−ゼ阻害剤カクテル(カタログ番号P2714、シグマ社)を上記細胞ペレットに添加し、ホモジェネ−トした。次に細胞を3mlのシリンジに装着された注射針(29G、1.5インチ(3.81cm))を通して反復吸引して懸濁させ、氷冷下にてボ−ルベアリング付きホモジナイザ−(間隙0.253インチ(0.64cm)、10回通過)内でホモジナイズした。細胞ホモジェネ−トを氷上に置き、タンパク質濃度をブラッドフォ−ド法(非特許文献33)によりクマシ−プラス試薬(ピア−ス社、ロックフォ−ド、イリノイ州)を用い、BSAを標準物質として測定した。細胞ホモジェネ−トをホモジェネ−トバッファ−により1.5mg/mlのタンパク質濃度まで希釈した。MTPをミクロソ−ムからデオキシコ−ル酸処理(非特許文献12)により放出させた。ここにおいて、上記細胞ホモジェネ−トに、その10分の1容の0.54%デオキシコ−ル酸ナトリウム(pH7.4)を添加して0.054%デオキシコ−ル酸塩濃度に調整し、時折混合しながら氷上に30分間放置した。続いて細胞膜をSW55 Tiロ−タ−を用い50,000rpm、1時間、10℃にて遠心除去した。上清を12〜14kDa除去の透析バッグに充填し、15mMのトリス−塩酸(pH7.4)、40mM NaCl、1mM EDTA及び0.02% NaN3溶液により透析し、1時間後に1回目の透析液交換を、2時間後に2回目を行い、更に一晩透析した。細胞ホモジェネ−トを透析バッグから取り出し、タンパク質測定とMTPアッセイに使用した。阻害の解析の際は、HepG2細胞を種々の濃度のMTP阻害剤であるBMS200150と24時間インキュベ−トし、上記細胞から得られた細胞ホモジェネ−トをMTPアッセイに使用した。
細胞ホモジェネ−ト中のMTP活性を、Jamilら(非特許文献21)に記載の方法により決定した。集密細胞の単層を氷冷した無菌のPBS、pH7.4で洗浄し、5mlのPBS中に懸濁させ、15mlの円錐管に移し、遠心分離(2,500rpm、10分、室温)によりペレット状に沈降させた。この段階で、細胞ペレットは70℃で保存することが出来る。750μlのホモジェネ−トバッファ−(50mMのトリス−塩酸、pH7.4、50mM KCl、及び5mM EDTA)及び7.5μlのプロテア−ゼ阻害剤カクテル(カタログ番号P2714、シグマ社)を上記細胞ペレットに添加し、ホモジェネ−トした。次に細胞を3mlのシリンジに装着された注射針(29G、1.5インチ(3.81cm))を通して反復吸引して懸濁させ、氷冷下にてボ−ルベアリング付きホモジナイザ−(間隙0.253インチ(0.64cm)、10回通過)内でホモジナイズした。細胞ホモジェネ−トを氷上に置き、タンパク質濃度をブラッドフォ−ド法(非特許文献33)によりクマシ−プラス試薬(ピア−ス社、ロックフォ−ド、イリノイ州)を用い、BSAを標準物質として測定した。細胞ホモジェネ−トをホモジェネ−トバッファ−により1.5mg/mlのタンパク質濃度まで希釈した。MTPをミクロソ−ムからデオキシコ−ル酸処理(非特許文献12)により放出させた。ここにおいて、上記細胞ホモジェネ−トに、その10分の1容の0.54%デオキシコ−ル酸ナトリウム(pH7.4)を添加して0.054%デオキシコ−ル酸塩濃度に調整し、時折混合しながら氷上に30分間放置した。続いて細胞膜をSW55 Tiロ−タ−を用い50,000rpm、1時間、10℃にて遠心除去した。上清を12〜14kDa除去の透析バッグに充填し、15mMのトリス−塩酸(pH7.4)、40mM NaCl、1mM EDTA及び0.02% NaN3溶液により透析し、1時間後に1回目の透析液交換を、2時間後に2回目を行い、更に一晩透析した。細胞ホモジェネ−トを透析バッグから取り出し、タンパク質測定とMTPアッセイに使用した。阻害の解析の際は、HepG2細胞を種々の濃度のMTP阻害剤であるBMS200150と24時間インキュベ−トし、上記細胞から得られた細胞ホモジェネ−トをMTPアッセイに使用した。
細胞のMTPをアッセイするより迅速な方法を開発するため、Chang、Limanek及びChang(非特許文献34)に記載の方法を、細胞破砕を行うために評価した。この方法においては、先ず細胞を低張の緩衝液に浸し、次いでプレ−トからかき取る。低張の緩衝液への浸漬の結果、上記細胞は膨潤し、かき取りによりこれらの細胞が破砕される。細胞の単層を氷冷PBSで2回、5mlの1mMトリス−HCl(pH7.6)、1mM EGTA及び1mM MgCl2溶液により4℃で1回洗浄した。次いで細胞を5mlの氷冷1mM トリス−塩酸(pH7.6)、1mM EGTA及び1mM MgCl2溶液に添加し、室温で2分間インキュベ−トした。緩衝液を吸引し、0.5mlの同じ緩衝液を細胞に添加した。細胞をかき取り、氷冷チュ−ブに集め、ボルテックスし、遠心分離(SW55 Tiロ−タ−、50,000rpm、10℃、1時間)し、その上清をMTP活性のアッセイ及びタンパク質測定に使用した。
ラットの肝ミクロソ−ムにおけるMTP活性の測定
ラットの肝ミクロソ−ムを、Wetterau及びZilversmit(非特許文献20、21)に記載の方法に若干の修正を加えた方法にて調製した。その概要は以下のとおりである。2gのラット肝を小片に切断し、氷冷PBSで2回洗浄した。これらの小片を次いで2mlの50mMトリス−塩酸(pH7.4)、5mM EDTA、250mMショ糖及び0.02%のアジ化ナトリウム中で、ポリトロンホモジナイザ−を用いてホモジナイズして遠心した(ベックマン社の微量遠心機、10,900rpm、30分、4℃)。上清を回収し、濃塩酸でpH5.1に調整し、冷所で30分間撹拌して遠心した(ベックマン社の微量遠心機、13,000rpm、30分、4℃)。ペレットを2mlの1mMトリス−HCl(pH7.6)、1mM EGTA及び1mM MgCl2溶液に懸濁し、振とう撹拌し、超遠心(SW55 Tiロ−タ−、50,000rpm、10℃、1時間)を行い、得られた上清をMTPアッセイ及びタンパク質測定に使用した。
ラットの肝ミクロソ−ムを、Wetterau及びZilversmit(非特許文献20、21)に記載の方法に若干の修正を加えた方法にて調製した。その概要は以下のとおりである。2gのラット肝を小片に切断し、氷冷PBSで2回洗浄した。これらの小片を次いで2mlの50mMトリス−塩酸(pH7.4)、5mM EDTA、250mMショ糖及び0.02%のアジ化ナトリウム中で、ポリトロンホモジナイザ−を用いてホモジナイズして遠心した(ベックマン社の微量遠心機、10,900rpm、30分、4℃)。上清を回収し、濃塩酸でpH5.1に調整し、冷所で30分間撹拌して遠心した(ベックマン社の微量遠心機、13,000rpm、30分、4℃)。ペレットを2mlの1mMトリス−HCl(pH7.6)、1mM EGTA及び1mM MgCl2溶液に懸濁し、振とう撹拌し、超遠心(SW55 Tiロ−タ−、50,000rpm、10℃、1時間)を行い、得られた上清をMTPアッセイ及びタンパク質測定に使用した。
アッセイ条件の最適化
MTPの蛍光アッセイを標準化するために、TAGを小さな単層のPC小胞(ドナ−小胞)に取り込んだ。上記の封入の結果、フルオロフォア(蛍光標識試薬)が消光することが期待された。実際、イソプロパノ−ルによりドナ−小胞の破砕の量が増加した結果、蛍光の測定値が増加した(図1A、総蛍光)。これは上記小胞に存在するフルオロフォア(蛍光標識試薬)の総蛍光量を表す。破砕前には、この蛍光は小胞内で消光されるために検出されない。ドナ−小胞が安定で、MTPの非存在下ではフルオロフォア(蛍光標識試薬)を放出しないこともまた予測された。上記安定性を測定するため、ドナ−小胞をアクセプタ−小胞と混合し、MTP非存在下で30分後に蛍光を測定した(図1A、ブランク試験)。ブランク試験の蛍光値の範囲は、総蛍光量の13%と19%の間であった(15.7±2.7%(平均値±SD、n=3))。ブランク試験の蛍光値は、おそらくフルオロフォア(蛍光標識試薬)の小規模な漏出によるものと考えられる。ゆえに、輸送の際の、MTPによるドナ−小胞からのTAGの抽出は、蛍光の検出値の増加として表れると仮定される。一定量のMTPとアクセプタ−小胞を、漸増量のドナ−小胞とインキュベ−トした結果、蛍光の検出量が増加し、MTPによるTAGの輸送が示唆された(図1A、輸送)。「輸送」は、小胞間でMTPによりTAGが輸送された量を表す。輸送の間、MTPに結合したフルオロフォア(蛍光標識試薬)はおそらく水性環境に曝され、それにより蛍光測定器により検出される。蛍光単位はブランク試験値よりも40〜47%高かった。次に、上記デ−タを用いてTAGの輸送パ−セントを計算した(図1B)。輸送パ−セントにより表される活性は、ドナ−小胞(28pmolのTAG)が2μlとなるまで増加し、その後飽和したと思われる。次に、種々の濃度のアクセプタ−小胞の効果を検討した。これらの試験において、一定量のMTPとドナ−小胞を、種々の量のアクセプタ−小胞とインキュベ−トした(図1C)。輸送されるTAGの量は、アクセプタ−小胞の量の増加と共に増加し、2μlで飽和した。アクセプタ−小胞のより低濃度における輸送の増加は、これらの小胞がそのアッセイ条件において律速となることを示した。しかしながら、2μl以上において、アッセイ結果はアクセプタ−小胞の濃度に依存しなくなった。アクセプタ−小胞の濃度をそれ以上増加させても、蛍光の減少が検出されないことに留意すべきである。このことは、MTPはこれら小胞間で脂質を輸送するが、アクセプタ−小胞内への一方的な脂質の蓄積が生じないことを示している。このような条件下では、MTPはドナ−小胞内に存在する総TAGの20%を輸送する反応に関与していた(図1D)。以後の試験においては、3μlのアクセプタ−小胞を使用した。
MTPの蛍光アッセイを標準化するために、TAGを小さな単層のPC小胞(ドナ−小胞)に取り込んだ。上記の封入の結果、フルオロフォア(蛍光標識試薬)が消光することが期待された。実際、イソプロパノ−ルによりドナ−小胞の破砕の量が増加した結果、蛍光の測定値が増加した(図1A、総蛍光)。これは上記小胞に存在するフルオロフォア(蛍光標識試薬)の総蛍光量を表す。破砕前には、この蛍光は小胞内で消光されるために検出されない。ドナ−小胞が安定で、MTPの非存在下ではフルオロフォア(蛍光標識試薬)を放出しないこともまた予測された。上記安定性を測定するため、ドナ−小胞をアクセプタ−小胞と混合し、MTP非存在下で30分後に蛍光を測定した(図1A、ブランク試験)。ブランク試験の蛍光値の範囲は、総蛍光量の13%と19%の間であった(15.7±2.7%(平均値±SD、n=3))。ブランク試験の蛍光値は、おそらくフルオロフォア(蛍光標識試薬)の小規模な漏出によるものと考えられる。ゆえに、輸送の際の、MTPによるドナ−小胞からのTAGの抽出は、蛍光の検出値の増加として表れると仮定される。一定量のMTPとアクセプタ−小胞を、漸増量のドナ−小胞とインキュベ−トした結果、蛍光の検出量が増加し、MTPによるTAGの輸送が示唆された(図1A、輸送)。「輸送」は、小胞間でMTPによりTAGが輸送された量を表す。輸送の間、MTPに結合したフルオロフォア(蛍光標識試薬)はおそらく水性環境に曝され、それにより蛍光測定器により検出される。蛍光単位はブランク試験値よりも40〜47%高かった。次に、上記デ−タを用いてTAGの輸送パ−セントを計算した(図1B)。輸送パ−セントにより表される活性は、ドナ−小胞(28pmolのTAG)が2μlとなるまで増加し、その後飽和したと思われる。次に、種々の濃度のアクセプタ−小胞の効果を検討した。これらの試験において、一定量のMTPとドナ−小胞を、種々の量のアクセプタ−小胞とインキュベ−トした(図1C)。輸送されるTAGの量は、アクセプタ−小胞の量の増加と共に増加し、2μlで飽和した。アクセプタ−小胞のより低濃度における輸送の増加は、これらの小胞がそのアッセイ条件において律速となることを示した。しかしながら、2μl以上において、アッセイ結果はアクセプタ−小胞の濃度に依存しなくなった。アクセプタ−小胞の濃度をそれ以上増加させても、蛍光の減少が検出されないことに留意すべきである。このことは、MTPはこれら小胞間で脂質を輸送するが、アクセプタ−小胞内への一方的な脂質の蓄積が生じないことを示している。このような条件下では、MTPはドナ−小胞内に存在する総TAGの20%を輸送する反応に関与していた(図1D)。以後の試験においては、3μlのアクセプタ−小胞を使用した。
アッセイ内での変動係数(CV)を決定するため、輸送アッセイを、0.5gのMTP、3μlのドナ−小胞、及び3μlのアクセプタ−小胞を用いて10本の試験管内で行った。観察された輸送パ−セントは、19.9±1.8(平均値±標準偏差、n=10)であり、アッセイ内CVは0.09であった。同様に、アッセイ間変動を評価した。1μgのMTPを使用して3回行われた7つの異なる独立した測定を比較し、0.19のアッセイ間変動係数(CV)が得られた。これらの実験において観察された輸送パ−セントは、34.5±3.0であった。
図1は、種々の量のドナ−小胞及びアクセプタ−小胞の、ミクロソ−ムのトリグリセリド輸送タンパク質(MTP)によるトリアシルグリセロ−ル(TAG)の輸送に及ぼす効果を示す。
A:総蛍光量。種々の表示された量のドナ−小胞が100μlのイソプロパノ−ルの添加により破砕され、蛍光単位が直ちに測定された。この値は上記小胞に存在する蛍光標識試薬の総蛍光量を表し、「ブランク試験」及び「輸送アッセイ」の蛍光値の単純和ではないことに留意すべきである。
ブランク:種々の量のドナ−小胞と3μlのアクセプタ−小胞を、実施例1の材料及び方法の項目に記載されるようにアッセイバッファ−(100μl)中でインキュベ−トし、37℃で30分のインキュベ−ト後に蛍光単位を測定した。
輸送:これらの試料が更に0.5gの精製MTPを含むこと以外は、そのインキュベ−トは上記のブランク試験と同様であった。ここにおいて、所定の時点でMTPにより脂質が輸送された量を表す。輸送の間、MTPに結合した蛍光標識脂質は、おそらく水性の環境に曝され、蛍光測定器により検出される。
B:Aからのデ−タを用い、材料及び方法の項に記載のようにTAGの輸送パ−セントを計算した。ドナ−小胞内のTAG濃度は14pmol/mlであった。
C:ドナ−小胞(3μl)を、0.5gの精製MTPと共に種々の量のアクセプタ−小胞とインキュベ−トした(30分、37℃)。蛍光単位を、アッセイチュ−ブにおいて観察された単位からブランク試験の蛍光単位を減算することにより得た。
D:Cからのデ−タを用い、実施例1の材料及び方法の項に記載のように輸送パ−セントを計算した。ここにおいて、ブランク試験及び総蛍光量の蛍光単位を、実施例1の材料及び方法の項に記載のように3回で同時に測定した。線グラフと誤差バ−は、平均値±標準偏差(n=3)を表す。
A:総蛍光量。種々の表示された量のドナ−小胞が100μlのイソプロパノ−ルの添加により破砕され、蛍光単位が直ちに測定された。この値は上記小胞に存在する蛍光標識試薬の総蛍光量を表し、「ブランク試験」及び「輸送アッセイ」の蛍光値の単純和ではないことに留意すべきである。
ブランク:種々の量のドナ−小胞と3μlのアクセプタ−小胞を、実施例1の材料及び方法の項目に記載されるようにアッセイバッファ−(100μl)中でインキュベ−トし、37℃で30分のインキュベ−ト後に蛍光単位を測定した。
輸送:これらの試料が更に0.5gの精製MTPを含むこと以外は、そのインキュベ−トは上記のブランク試験と同様であった。ここにおいて、所定の時点でMTPにより脂質が輸送された量を表す。輸送の間、MTPに結合した蛍光標識脂質は、おそらく水性の環境に曝され、蛍光測定器により検出される。
B:Aからのデ−タを用い、材料及び方法の項に記載のようにTAGの輸送パ−セントを計算した。ドナ−小胞内のTAG濃度は14pmol/mlであった。
C:ドナ−小胞(3μl)を、0.5gの精製MTPと共に種々の量のアクセプタ−小胞とインキュベ−トした(30分、37℃)。蛍光単位を、アッセイチュ−ブにおいて観察された単位からブランク試験の蛍光単位を減算することにより得た。
D:Cからのデ−タを用い、実施例1の材料及び方法の項に記載のように輸送パ−セントを計算した。ここにおいて、ブランク試験及び総蛍光量の蛍光単位を、実施例1の材料及び方法の項に記載のように3回で同時に測定した。線グラフと誤差バ−は、平均値±標準偏差(n=3)を表す。
次の試験では、MTP活性に必要な時間、温度及びNaCl濃度の効果を測定した(図2)。種々の表示された量のMTPを、実施例1の材料及び方法の項に記載のようにドナ−小胞及びアクセプタ−小胞とインキュベ−トした。適切な総蛍光量アッセイ及びブランク試験も、実施例1の材料及び方法の項に記載のように含まれる。蛍光強度を、表示の時点において3回、マイクロプレ−トリ−ダ−を用いて測定した。TAGの輸送パ−セントを時間に対してプロットした。
B:温度。二枚の異なるマイクロタイタ−プレ−ト上で試験を行った。精製MTP(0.25g/ウエル)をドナ−及びアクセプタ−の小胞と3回、インキュベ−トした。一方のプレ−トは37℃でインキュベ−トし、他方のプレ−トは室温に静置した。種々の時点で、室温(22℃)にて蛍光強度を測定した。
C:NaClの効果。ドナ−小胞(3μl)、アクセプタ−小胞(3μl)及びMTP(1μg)を、3回、30分間、1mMのトリス−塩酸(pH7.4)及び2mMのEDTAを含む溶液中で種々の表示された濃度のNaClの存在下にてインキュベ−トした。線グラフ及び誤差バ−は、平均値±標準偏差を表す。
B:温度。二枚の異なるマイクロタイタ−プレ−ト上で試験を行った。精製MTP(0.25g/ウエル)をドナ−及びアクセプタ−の小胞と3回、インキュベ−トした。一方のプレ−トは37℃でインキュベ−トし、他方のプレ−トは室温に静置した。種々の時点で、室温(22℃)にて蛍光強度を測定した。
C:NaClの効果。ドナ−小胞(3μl)、アクセプタ−小胞(3μl)及びMTP(1μg)を、3回、30分間、1mMのトリス−塩酸(pH7.4)及び2mMのEDTAを含む溶液中で種々の表示された濃度のNaClの存在下にてインキュベ−トした。線グラフ及び誤差バ−は、平均値±標準偏差を表す。
使用されたMTPの種々の濃度の全てにおいて、TAG輸送活性は、試験開始後30分までは時間と共に増加した(図2A)。その時間経過後、輸送活性は飽和し始めた。輸送活性に及ぼす温度の効果を検討した(図2B)。MTPの脂質輸送活性は、室温(22℃)と37℃において同等であり、活性に対して何ら有意の温度効果を示さなかった。これらの結果は、MTPが22℃が活性にとって最適なことを示すと考えられる。また、MTP活性に及ぼすNaClの効果も測定した(図2C)。NaCl濃度を150mMまで増加させて添加した結果、MTPの活性が増加した。また、これより高濃度のNaClは輸送活性を阻害すると考えられる。以上より、30分間のインキュベ−ト及び150mMのNaClがMTP活性の測定に最適であると決定した。
次に、TAG輸送に関する、種々の濃度の精製MTP及びBSAを用い、アッセイの特異性を解析した(図3)。ドナ−小胞(3μl、1ml当たり450nmolのホスファチジルコリン(PC)及び14nmolのTAG)及びアクセプタ−小胞(3μl、2,400nmolのPC/ml)を、表示された種々の量のMTP又はBSAと、3回、30分間インキュベ−トして、得られた結果を図3Aに示す。蛍光単位を、アッセイチュ−ブの値からブランク試験の値を差し引いて算出した。これらのMTPに関する結果デ−タを用い(図3A)、輸送パ−セント活性が決定された。BSAについてはこれらの値は負であり、プロットされなかった。また、BSA(0.1%)の非存在下又は存在下にて、表示された種々の量の精製MTPによりアッセイを行った(図3C)。線グラフ及び誤差バ−は平均値±標準偏差(SD)を表す。
MTP添加量を増加させた結果、蛍光の増加が検出された(図3A)。対照的に、BSAの存在により蛍光の検出量が減少し、これは放出された蛍光のBSAによる消光、又はBSAによるドナ−小胞の安定化による基礎的な蛍光標識試薬の漏出の防止効果を表すと考えられる。図3Bにおいて、デ−タを変換して小胞間で受けるTAGの輸送パ−セントを測定した。これらの実験条件下において、輸送されるTAGの量は2μgのMTPで飽和に達した。飽和状態において、総TAGの40%は輸送過程にあり、これは、MTPの最大結合活性を表すと考えられる。
ブランク試験試料において、BSAにより蛍光単位が減少したため、BSAはMTPアッセイに対してプラス効果を発揮する可能性があると推論された。更に、BSAの存在により、MTP及び小胞のチュ−ブの表面への付着による損失が減少すると考えられる。この仮説を検証するために、BSA(1mg/ml)を用いたアッセイを行った。図3Cに示されるように、BSAの存在下で測定された活性は、BSAの非存在下で観察された活性のちょうど2倍であった。これは主に、BSAの存在下におけるブランク試験値の減少によるものであった。BSAの存在下又は非存在下におけるブランク試験値は、総蛍光量の12.5±0.7%及び18.5±0.5%(n=3)であった。すなわち、BSAを添加するとアッセイの感度が改善され、おそらくドナ−小胞からの蛍光標識試薬の漏出が防止されることによると考えられる。
続いて、放射線標識アッセイ及び蛍光アッセイにより測定されたMTPの比活性を比較した。放射線標識アッセイを用いた種々の調製品における比活性(1mg当たり1時間の輸送パ−セント)は12.5±2.4(n=27)であった。BSAの非存在下における蛍光法による比活性は92.6±19.7(n=20)であったが、一方、BSAの存在下において測定された比活性は204.4±33.1(n=7)であった。このように、蛍光アッセイにより測定された比活性は、放射線標識アッセイを用いて観察された比活性よりも高かった。この高い比活性は、本アッセイの高い感度によると考えられる。この差異のもう一つの理由は、これら二つのアッセイにおいて使用された異なるパラメ−タ−であると考えられる。放射線標識アッセイにおいては、アクセプタ−小胞に輸送されたTAGの量が測定されるが、一方で本実施例に記載の蛍光アッセイは、MTPにより輸送されるTAGの量が測定される。
アクセプタ−小胞の役割
MTPアッセイは3種の構成成分、すなわちドナ−小胞、アクセプタ−小胞及びMTPから構成される。言うまでもなく、ドナ−小胞とMTPは必要である。MTPは脂質をドナ−小胞間で輸送することができるため、アクセプタ−小胞は活性の測定には必要ではない可能性が考えられた。この仮説を検証するため、種々の量のドナ−小胞(1ml当たり450nmolのPC及び14nmolのTAG)を、アクセプタ−小胞及びMTP無し(DVのみ)、0.5gの精製MTP添加(DV+MTP)、3μlのアクセプタ−小胞添加(DV+AV)、又は3μlのアクセプタ−小胞(2,400nmolのPC/ml)及び0.5μgの精製MTP添加(DV+AV+MTP)の条件により、アッセイ緩衝液(100μl)中でインキュベ−トした。蛍光単位を、37℃、30分間のインキュベ−トの後に測定した。デ−タを図4Aのとおりプロットした。
MTPアッセイは3種の構成成分、すなわちドナ−小胞、アクセプタ−小胞及びMTPから構成される。言うまでもなく、ドナ−小胞とMTPは必要である。MTPは脂質をドナ−小胞間で輸送することができるため、アクセプタ−小胞は活性の測定には必要ではない可能性が考えられた。この仮説を検証するため、種々の量のドナ−小胞(1ml当たり450nmolのPC及び14nmolのTAG)を、アクセプタ−小胞及びMTP無し(DVのみ)、0.5gの精製MTP添加(DV+MTP)、3μlのアクセプタ−小胞添加(DV+AV)、又は3μlのアクセプタ−小胞(2,400nmolのPC/ml)及び0.5μgの精製MTP添加(DV+AV+MTP)の条件により、アッセイ緩衝液(100μl)中でインキュベ−トした。蛍光単位を、37℃、30分間のインキュベ−トの後に測定した。デ−タを図4Aのとおりプロットした。
図4Aに示されたデ−タを使用し、材料及び方法の項に記載のように輸送パ−セントを算出した。線グラフ及び誤差バ−は、平均値±SD(標準偏差)を表す。
ドナ−小胞の量を増加させつつ、アクセプタ−小胞と(DV+AV)、又はアクセプタ−小胞なしで(DVのみ)インキュベ−トした結果、同様の蛍光測定値が得られ、MTPの非存在下ではTAGの輸送がほとんど生じないことが示された(図4A)。これらのデ−タは、図1Aにおけるブランク試験と一致している。ドナ−小胞の量を増加させつつMTPとインキュベ−ト(DV+MTP)した結果、蛍光が若干増加し、脂質の若干の輸送が示された。一方、アクセプタ−小胞が反応混合物に包含される場合(DV+AV+MTP)、蛍光の有意な増加が観察された。次に、これらのデ−タを用いてTAGの輸送パ−セントを算出した(図4B)。アクセプタ−小胞の非存在下(DV+MTP)において、TAG輸送は4%と16%の間の範囲であった。しかしながら、アクセプタ−小胞の存在下(DV+AV+MTP)において、MTPはドナ−小胞に存在するTAGの約40%の輸送を媒介した。これらのデ−タにより、アクセプタ−小胞の存在が、輸送プロセスに大きな役割を果たすことが明らかとなった。
MTPによる、種々のアクセプタ−への異なる脂質の輸送
MTPによる、種々の脂質の輸送に対する、種々のアクセプタ−小胞の効果を検討した。先ず、PC又はPC/TAG小胞をアクセプタ−として使用した。これらのアクセプタ−を用い、3度、輸送パ−セントを解析した結果、それぞれ33±2.6及び30.9±1.3であり、アクセプタ−小胞にTAGが存在しなくても輸送活性に何ら有意の効果として表れないことが示された。
MTPによる、種々の脂質の輸送に対する、種々のアクセプタ−小胞の効果を検討した。先ず、PC又はPC/TAG小胞をアクセプタ−として使用した。これらのアクセプタ−を用い、3度、輸送パ−セントを解析した結果、それぞれ33±2.6及び30.9±1.3であり、アクセプタ−小胞にTAGが存在しなくても輸送活性に何ら有意の効果として表れないことが示された。
MTPはTAG以外の他の脂質を輸送することが知られている(非特許文献20)。そこで、TAG以外にもCE類及びPL類の輸送を解析する試験を行い、本アッセイ法の適性を評価した(図5)。この試験において、小さな単層の小胞(PC/TAG小胞)、apoBリポタンパク質(VLDL及びLDLの両方を含有)、及びHDLをアクセプタ−として使用し、脂質輸送を4時間にわたり解析した。この試験は、図2に記載の条件の最適化の前に行われた。この予備試験において、輸送活性を測定する前にインキュベ−トを長時間行った。
TAG(AからC)、コレステリルエステル(DからF)、又はリン脂質(GからI)を含む3種の異なるタイプのドナ−小胞(3μl)を使用した。アクセプタ−小胞(3μl、2,400nmol PC/ml)には、小さな単層の小胞(PC/TAG小胞;A、D及びG)、アポリポタンパク質B(apoB)(VLDL及びLDL;B、E、及びH)、並びにHDL類(10mgタンパク質/ml;C、F、及びI)を使用した。種々のドナ−小胞及びアクセプタ−小胞を、1μgの精製MTPを含まない(対照)又は含む(MTP)条件において3度、表示された時間インキュベ−トし、材料及び方法の項に記載のように蛍光を測定した。線グラフ及び誤差バ−は平均値±SD(標準偏差)を表す。
試験の結果、MTPは、ドナ−小胞を、小さな単層のPC/TAG小胞(図5A)及びapoBリポタンパク質(図5B)とインキュベ−トした場合にTAGを輸送するが、HDLとインキュベ−トした場合には輸送しないことを示した。この輸送の結果、4時間のインキュベ−ト後に蛍光単位が109から172%に増加した(図5A、B)。同様に、MTPはPC/TAG小胞(図5D)及びapoBリポタンパク質(図5E)の存在下でCEを輸送したが、HDLの存在下では輸送しなかった(図5F)。MTPは、ドナ−小胞がPC/TAG小胞とインキュベ−トされた場合にPL類を輸送することが可能となり、蛍光の増加は4時間後の時点で186%となった(図5G)。しかしながら、アクセプタ−としてapoBリポタンパク質を存在させた場合は、MTPによるPL輸送については解釈が困難であった(図5H)。なぜなら、MTPの非存在下でドナ−小胞がapoBリポタンパク質とインキュベ−トされた場合のバックグラウンドの蛍光が、有意に大きかったためである(図5G、Hの対照と比較のこと。並びにこれらのパネルにおけるy値の相違に留意すべきである。)。予想通り、HDLがアクセプタ−として使用された場合には、MTPはPLを輸送しなかった(図5I)。これらの結果は、小さな単層小胞及びapoBリポタンパク質がアクセプタ−として使用される場合、MTPの活性により、TAG又はCEのような中性脂質が輸送されることを示す。
細胞におけるMTP活性の測定
次に、本アッセイが細胞におけるMTP活性の測定に使用可能か否かを解析した(表1)。ミクロソ−ムのMTPは、Jamilら(非特許文献12)に記載のデオキシコ−ル酸塩処理により放出された。Cos−7細胞へのMTP発現ベクタ−によるトランスフェクションの有無により、MTPアッセイの特異性を解析した(表1)。予想どおり、モックをトランスフェクトしたCos−7細胞においてはMTP活性が検出できなかった。しかしながら、MTP発現ベクタ−によるトランスフェクションの結果、Cos−7細胞におけるMTP活性が増加し、他の報告と一致した(非特許文献15、29)。同様に、MTP活性はHepG2細胞又は分化したCaco−2細胞の細胞ホモジェネ−トにおいても測定することができた。これらの結果により、本新規の方法が細胞のMTP活性の測定に使用可能であることが示された。デオキシコ−ル酸法は簡便でなく、数段階を経るため、少なくとも2日を要する。この方法を簡便にするため、Chang、Limanek及びChangの方法(非特許文献34)を評価した。この方法は低張の緩衝液による細胞破砕の工程を含み、アッセイ用の細胞抽出液の調製に要する時間は遥かに少ない。
次に、本アッセイが細胞におけるMTP活性の測定に使用可能か否かを解析した(表1)。ミクロソ−ムのMTPは、Jamilら(非特許文献12)に記載のデオキシコ−ル酸塩処理により放出された。Cos−7細胞へのMTP発現ベクタ−によるトランスフェクションの有無により、MTPアッセイの特異性を解析した(表1)。予想どおり、モックをトランスフェクトしたCos−7細胞においてはMTP活性が検出できなかった。しかしながら、MTP発現ベクタ−によるトランスフェクションの結果、Cos−7細胞におけるMTP活性が増加し、他の報告と一致した(非特許文献15、29)。同様に、MTP活性はHepG2細胞又は分化したCaco−2細胞の細胞ホモジェネ−トにおいても測定することができた。これらの結果により、本新規の方法が細胞のMTP活性の測定に使用可能であることが示された。デオキシコ−ル酸法は簡便でなく、数段階を経るため、少なくとも2日を要する。この方法を簡便にするため、Chang、Limanek及びChangの方法(非特許文献34)を評価した。この方法は低張の緩衝液による細胞破砕の工程を含み、アッセイ用の細胞抽出液の調製に要する時間は遥かに少ない。
ラット肝のミクロソ−ムを低張の緩衝液処理に浸漬し、放出された内容物をMTP活性測定に使用した。肝ミクロソ−ム内容物におけるMTPの比活性(1μg当たり、1時間における輸送パ−セント)は、0.498±0.09(平均値±標準偏差、n=9)であった。
40〜50gの細胞タンパク質を使用し1時間、3度、輸送アッセイにより活性を測定した。図6及び10に示すように、両方法とも同様のMTP活性が観察された。以上より、低張処理は所要時間が短く、かつ必要となる操作が少ないため、細胞のMTP活性の測定に適する方法である。
MTP活性の阻害
次に、MTP活性に対するMTPアンタゴニストの効果を測定する試験を行った(図7)。ここにおいて、Jamilらにより報告されたMTP阻害剤、BMS200150(非特許文献12)を使用した。精製MTP(1g)を、ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞と共に、表示された濃度のMTP阻害剤BMS200150の存在下で30分間インキュベ−トした。図7Aに示すように、BMS200150の濃度を増加した結果、精製MTPの活性が用量依存的に阻害された。IC50は0.08Mであり、他の研究者により報告された範囲内であった(非特許文献12)。
次に、MTP活性に対するMTPアンタゴニストの効果を測定する試験を行った(図7)。ここにおいて、Jamilらにより報告されたMTP阻害剤、BMS200150(非特許文献12)を使用した。精製MTP(1g)を、ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞と共に、表示された濃度のMTP阻害剤BMS200150の存在下で30分間インキュベ−トした。図7Aに示すように、BMS200150の濃度を増加した結果、精製MTPの活性が用量依存的に阻害された。IC50は0.08Mであり、他の研究者により報告された範囲内であった(非特許文献12)。
次に、HepG2細胞を、種々の濃度の上記阻害剤と24時間インキュベ−トし、そのホモジェネ−トをデオキシコ−ル酸法(非特許文献12)を用いて調製し、MTP活性を測定した。細胞を洗浄し、細胞溶解物を材料及び方法の項に記載されたデオキシコ−ル酸法を用いて調製した。輸送アッセイには、40〜50gの細胞タンパク質が、3度、使用された。図7Bに示すように、BMS200150の濃度を増加すると、細胞のMTP活性を減少させる結果となった。約1.3Mに及ぶIC50値は、公表された先行技術(非特許文献12)と一致する。精製MTPと細胞溶解物にて得られるIC50値に差異が生じたが、これは細胞溶解物中に他のタンパク質が存在し、それが上記阻害剤と相互作用してその効力を減少させることが原因と考えられる。以上の試験により、上記アッセイがMTP活性及びアンタゴニストによるその阻害の測定に有用であることが示される。
材料及び方法
材料:
放射性同位元素アッセイ(非特許文献7、19)を用い、ウシの肝臓からMTPを精製し、またキット(Chylos社、ウッドベリ−、ニュ−ヨ−ク州)を用いてラットの肝臓からも精製した。蛍光(ニトロベンゾキサジアゾ−ル)で標識されたホスファチジルコリン(PC)及び非標識のPCは、Avanti Polar Lipids社(アラバスタ−、アラバマ州)から購入した。ニトロベンゾキサジアゾ−ルで標識されたCE、PE並びにTAGはMolecular Probes社(ユ−ジン、オレゴン州)から購入した。黒色の96ウエルのマイクロタイタ−プレ−トは、Thermo Labsystems(フランクリン、マサチュ−セッツ州)から供給されたものを使用した。イソプロパノ−ル及び他の化学薬品はシグマケミカル社(セントルイス、ミズ−リ州)から購入した。
材料:
放射性同位元素アッセイ(非特許文献7、19)を用い、ウシの肝臓からMTPを精製し、またキット(Chylos社、ウッドベリ−、ニュ−ヨ−ク州)を用いてラットの肝臓からも精製した。蛍光(ニトロベンゾキサジアゾ−ル)で標識されたホスファチジルコリン(PC)及び非標識のPCは、Avanti Polar Lipids社(アラバスタ−、アラバマ州)から購入した。ニトロベンゾキサジアゾ−ルで標識されたCE、PE並びにTAGはMolecular Probes社(ユ−ジン、オレゴン州)から購入した。黒色の96ウエルのマイクロタイタ−プレ−トは、Thermo Labsystems(フランクリン、マサチュ−セッツ州)から供給されたものを使用した。イソプロパノ−ル及び他の化学薬品はシグマケミカル社(セントルイス、ミズ−リ州)から購入した。
蛍光PE及びCEを含むリン脂質小胞の調製:
ホスファチジルコリン(PC)のアクセプタ−小胞を、Wetterauらによる記載(非特許文献20から22、31)に従い調製した。同様にしてドナ−小胞も上記文献(非特許文献20から22、31、35)に従い、音波処理により調製した。大まかには以下のとおりである。非標識のホスファチジルエタノ−ルアミン(PE)及び蛍光PEを蒸発させ、4℃、窒素気流中にて45分間で超音波処理した。CEドナ−小胞も同様に蛍光標識CE及び非標識のPCを用いて調製した。遠心(約12,000rpm、10分、卓上遠心機)分離により回収された小胞は1ヶ月間安定であることが判明した。所定量の蛍光標識脂質をイソプロパノ−ルで希釈して標準曲線を作成し、ドナ−小胞に取り込まれた蛍光脂質のモル数を測定した。
ホスファチジルコリン(PC)のアクセプタ−小胞を、Wetterauらによる記載(非特許文献20から22、31)に従い調製した。同様にしてドナ−小胞も上記文献(非特許文献20から22、31、35)に従い、音波処理により調製した。大まかには以下のとおりである。非標識のホスファチジルエタノ−ルアミン(PE)及び蛍光PEを蒸発させ、4℃、窒素気流中にて45分間で超音波処理した。CEドナ−小胞も同様に蛍光標識CE及び非標識のPCを用いて調製した。遠心(約12,000rpm、10分、卓上遠心機)分離により回収された小胞は1ヶ月間安定であることが判明した。所定量の蛍光標識脂質をイソプロパノ−ルで希釈して標準曲線を作成し、ドナ−小胞に取り込まれた蛍光脂質のモル数を測定した。
脂質輸送活性の測定:
黒色の96ウエルのマイクロタイタ−プレ−トを用い、3度、アッセイを行った(非特許文献35)。最終反応混合物(100μl)は、10mMトリス(pH7.4)、0.1% BSA、150mM NaCl緩衝液中に、3μlのドナ−小胞(種々の蛍光脂質を含む1.2nmolのPC又はPE)、3μlのアクセプタ−小胞(7.2nmolのPC)及びMTP源を添加して調製した。上記マイクロタイタ−プレ−トを37℃でインキュベ−トし、所定の時点にて試料を、Victor3複合蛍光/発光測定装置(パ−キンエルマ−社)を用い、485nmで励起して蛍光発光を550nmにおいて測定した。脂質輸送パ−セントの測定は、MTP源を含まない(ブランク試験)対照アッセイから得られた蛍光値を試料アッセイの蛍光値から差し引いた数値を、小胞に存在する総蛍光値からブランク値(ブランク試験値)を減じた数値で割って算出した。ブランクの値は、種々の調製品において総蛍光値の10〜25%の範囲であった。総蛍光値は、3μlのドナ−小胞を97μlのイソプロパノ−ルと5分間インキュベ−トして測定した。
黒色の96ウエルのマイクロタイタ−プレ−トを用い、3度、アッセイを行った(非特許文献35)。最終反応混合物(100μl)は、10mMトリス(pH7.4)、0.1% BSA、150mM NaCl緩衝液中に、3μlのドナ−小胞(種々の蛍光脂質を含む1.2nmolのPC又はPE)、3μlのアクセプタ−小胞(7.2nmolのPC)及びMTP源を添加して調製した。上記マイクロタイタ−プレ−トを37℃でインキュベ−トし、所定の時点にて試料を、Victor3複合蛍光/発光測定装置(パ−キンエルマ−社)を用い、485nmで励起して蛍光発光を550nmにおいて測定した。脂質輸送パ−セントの測定は、MTP源を含まない(ブランク試験)対照アッセイから得られた蛍光値を試料アッセイの蛍光値から差し引いた数値を、小胞に存在する総蛍光値からブランク値(ブランク試験値)を減じた数値で割って算出した。ブランクの値は、種々の調製品において総蛍光値の10〜25%の範囲であった。総蛍光値は、3μlのドナ−小胞を97μlのイソプロパノ−ルと5分間インキュベ−トして測定した。
正味の脂質蓄積の測定:
正味の脂質蓄積を測定するために、蛍光標識−TAGを含む負荷電のドナ−小胞が調製された(非特許文献23)。負の電荷を導入するため、音波処理の前に67.5nmのカルジオリピン(総脂質の約7%まで)を添加した(非特許文献20から22、31)。種々の量のMTP、並びに3μlのドナ−小胞及び3μlのアクセプタ−小胞を上記のようにインキュベ−トした。所定の時点で蛍光の測定値を記録し、TAGの輸送を定量した。次に、上記反応混合物を100μlのDE52(1:1(v:v)にて15mMトリス−塩酸(pH7.4)、1mM EDTA及び0.02%のアジ化ナトリウムからなる緩衝液で平衡化)溶液を含む微量遠心管に移し、4℃で5分間遠心分離(12,000rpm、5分、4℃)した。アクセプタ−小胞のみを含む上清(10μl)をマイクロタイタ−プレ−トに移し、90μlのイソプロパノ−ルを添加後、蛍光を5分間隔で測定した。20分の時点で得られた測定値を算出に用いた。MTPの非存在下で得られたブランク値を試料の測定値から差し引いた数値を、ブランク値を引いた総蛍光値で割り、100を掛けることにより、アクセプタ−小胞に蓄積した脂質のパ−セントを決定した。
正味の脂質蓄積を測定するために、蛍光標識−TAGを含む負荷電のドナ−小胞が調製された(非特許文献23)。負の電荷を導入するため、音波処理の前に67.5nmのカルジオリピン(総脂質の約7%まで)を添加した(非特許文献20から22、31)。種々の量のMTP、並びに3μlのドナ−小胞及び3μlのアクセプタ−小胞を上記のようにインキュベ−トした。所定の時点で蛍光の測定値を記録し、TAGの輸送を定量した。次に、上記反応混合物を100μlのDE52(1:1(v:v)にて15mMトリス−塩酸(pH7.4)、1mM EDTA及び0.02%のアジ化ナトリウムからなる緩衝液で平衡化)溶液を含む微量遠心管に移し、4℃で5分間遠心分離(12,000rpm、5分、4℃)した。アクセプタ−小胞のみを含む上清(10μl)をマイクロタイタ−プレ−トに移し、90μlのイソプロパノ−ルを添加後、蛍光を5分間隔で測定した。20分の時点で得られた測定値を算出に用いた。MTPの非存在下で得られたブランク値を試料の測定値から差し引いた数値を、ブランク値を引いた総蛍光値で割り、100を掛けることにより、アクセプタ−小胞に蓄積した脂質のパ−セントを決定した。
細胞及び組織におけるMTP活性の測定:
T175フラスコに集密状態にまで生育したHepG2細胞をPBSで洗浄し、次に低張の緩衝液(1mMトリス−塩酸(pH7.4)、1mM MgCl2、及び1mM EGTA)(非特許文献34、35)中、室温で2分間インキュベ−トして膨潤させた。上記緩衝液を吸引し、細胞を750μlのプロテア−ゼ阻害剤を含む氷冷低張緩衝液中にかき取り、ホモジナイズ(21ゲ−ジの注射針を20回通す)し、細胞溶解物を遠心分離(50,000rpm、4℃、1時間、SW55 Tiロ−タ−)し、得られた上清を脂質輸送アッセイとタンパク質測定(非特許文献25)に使用した。肝ミクロソ−ムの調製には、マウスの肝臓小片をPBSで洗浄し、ポリトロンホモジナイザ−を用いて50mMトリス−塩酸(pH7.4)、5mM EDTA、250mMスクロ−ス(ショ糖)、及び0.02%アジ化ナトリウムからなる緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離(10,900rpm、30分、4℃、ベックマン微量遠心機)した。上清を濃塩酸でpH5.1に調整し、冷却下にて30分間混合し、遠心分離(13,000rpm、30分、4℃、ベックマン微量遠心機)した。ペレットを1mMトリス−塩酸(pH7.6)、1mM EGTA、及び1mM MgCl2に再懸濁し、振とう撹拌し、4℃で30分間インキュベ−トし、超遠心(SW55 Tiロ−タ−、50,000rpm、4℃、1時間)を行い、得られた上清を脂質輸送アッセイ及びタンパク質測定に使用した。
T175フラスコに集密状態にまで生育したHepG2細胞をPBSで洗浄し、次に低張の緩衝液(1mMトリス−塩酸(pH7.4)、1mM MgCl2、及び1mM EGTA)(非特許文献34、35)中、室温で2分間インキュベ−トして膨潤させた。上記緩衝液を吸引し、細胞を750μlのプロテア−ゼ阻害剤を含む氷冷低張緩衝液中にかき取り、ホモジナイズ(21ゲ−ジの注射針を20回通す)し、細胞溶解物を遠心分離(50,000rpm、4℃、1時間、SW55 Tiロ−タ−)し、得られた上清を脂質輸送アッセイとタンパク質測定(非特許文献25)に使用した。肝ミクロソ−ムの調製には、マウスの肝臓小片をPBSで洗浄し、ポリトロンホモジナイザ−を用いて50mMトリス−塩酸(pH7.4)、5mM EDTA、250mMスクロ−ス(ショ糖)、及び0.02%アジ化ナトリウムからなる緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離(10,900rpm、30分、4℃、ベックマン微量遠心機)した。上清を濃塩酸でpH5.1に調整し、冷却下にて30分間混合し、遠心分離(13,000rpm、30分、4℃、ベックマン微量遠心機)した。ペレットを1mMトリス−塩酸(pH7.6)、1mM EGTA、及び1mM MgCl2に再懸濁し、振とう撹拌し、4℃で30分間インキュベ−トし、超遠心(SW55 Tiロ−タ−、50,000rpm、4℃、1時間)を行い、得られた上清を脂質輸送アッセイ及びタンパク質測定に使用した。
結果
リン脂質輸送活性
実施例1及び2は、MTPのTAG輸送活性(非特許文献35)を測定するための簡便、迅速でかつ高感度のアッセイ法を例示したものである。実施例3においては、同じ方法がMTPのリン脂質(PL)輸送活性の定量に使用し得るか否かを解析した(図9A、9B)。種々の量のMTPを、蛍光標識PEを含むドナ−小胞及びアクセプタ−小胞とインキュベ−トした結果、蛍光は時間依存的に増加し、更に飽和した(図9A)。各濃度においてMTP依存的な蛍光の増加を示す特異的な曲線が形成され、このことは、種々のMTP量に関する1時間のデ−タをプロットすることにより確認された(図9B)。PLの輸送は、MTPが0.1から0.3μgの間で直線的に増加し、それより高い量で飽和に達した。本アッセイの再現性は、アッセイ内及びアッセイ間の変動係数を決定することにより確認された。0.3μgのMTPを用いた6つの独立して測定した試料により得られた輸送活性は11.9±1.4%であり、変動係数は0.12であった。0.25μgのMTPを用いた三つの独立した試験における平均活性は9.9±0.96%であり、変動係数は0.097であった。これらの結果は、精製MTPのPL輸送活性が本アッセイ法を用いて測定可能であることを示す。
リン脂質輸送活性
実施例1及び2は、MTPのTAG輸送活性(非特許文献35)を測定するための簡便、迅速でかつ高感度のアッセイ法を例示したものである。実施例3においては、同じ方法がMTPのリン脂質(PL)輸送活性の定量に使用し得るか否かを解析した(図9A、9B)。種々の量のMTPを、蛍光標識PEを含むドナ−小胞及びアクセプタ−小胞とインキュベ−トした結果、蛍光は時間依存的に増加し、更に飽和した(図9A)。各濃度においてMTP依存的な蛍光の増加を示す特異的な曲線が形成され、このことは、種々のMTP量に関する1時間のデ−タをプロットすることにより確認された(図9B)。PLの輸送は、MTPが0.1から0.3μgの間で直線的に増加し、それより高い量で飽和に達した。本アッセイの再現性は、アッセイ内及びアッセイ間の変動係数を決定することにより確認された。0.3μgのMTPを用いた6つの独立して測定した試料により得られた輸送活性は11.9±1.4%であり、変動係数は0.12であった。0.25μgのMTPを用いた三つの独立した試験における平均活性は9.9±0.96%であり、変動係数は0.097であった。これらの結果は、精製MTPのPL輸送活性が本アッセイ法を用いて測定可能であることを示す。
コレステロ−ルエステル輸送活性
CE輸送を解析するため、蛍光CEを含むドナ−PC小胞を、アクセプタ−小胞及び精製MTPとインキュベ−トした(図10A〜10C)。CEの輸送は、使用されたMTPの各濃度につき、最初は時間の経過と共に増加し、次いで飽和に達した(図10A)。また、この濃度依存的かつ直線的なCE輸送の増加及びそれに続く飽和は、MTPの量を増加させた場合にも観察された(図10B)。0.2μgのMTPを使用したアッセイ内での変動係数は0.09(n=6)であり、この条件において観察された1時間当たりの輸送%は、17.4±1.6%であった。0.15μgのMTPを用いて三つの独立した試験のデ−タを比較たところ、輸送は15.0±1.9%(n=9)であり、アッセイ間の変動係数は0.127であることが判明した。これらの結果は、上記測定方法が精製MTPのCE輸送活性の決定に適していることを示すものである。
CE輸送を解析するため、蛍光CEを含むドナ−PC小胞を、アクセプタ−小胞及び精製MTPとインキュベ−トした(図10A〜10C)。CEの輸送は、使用されたMTPの各濃度につき、最初は時間の経過と共に増加し、次いで飽和に達した(図10A)。また、この濃度依存的かつ直線的なCE輸送の増加及びそれに続く飽和は、MTPの量を増加させた場合にも観察された(図10B)。0.2μgのMTPを使用したアッセイ内での変動係数は0.09(n=6)であり、この条件において観察された1時間当たりの輸送%は、17.4±1.6%であった。0.15μgのMTPを用いて三つの独立した試験のデ−タを比較たところ、輸送は15.0±1.9%(n=9)であり、アッセイ間の変動係数は0.127であることが判明した。これらの結果は、上記測定方法が精製MTPのCE輸送活性の決定に適していることを示すものである。
細胞ホモジェネ−ト及び肝ミクロソ−ムにおいて測定された蛍光脂質の輸送
次に、これらのアッセイ法を用い、細胞及び組織のホモジェネ−トにおける脂質輸送活性を解析した。全ての脂質の輸送活性(TAG、CE及びPL)が、HepG2細胞のホモジェネ−トにおいて測定できた(図11A)。脂質輸送活性は、時間依存的な増加を示し、20から30分のインキュベ−トの間に最高値に達した。CEが輸送される速度及びCEが輸送される最大値は、TAGにおいて観察された速度や最大値よりも低かった。PL輸送のプロファイルはCE及びTAG輸送のプロファイルに類似していた。主な違いは、PL輸送活性の場合、最大輸送値が有意に低いことであった。
次に、これらのアッセイ法を用い、細胞及び組織のホモジェネ−トにおける脂質輸送活性を解析した。全ての脂質の輸送活性(TAG、CE及びPL)が、HepG2細胞のホモジェネ−トにおいて測定できた(図11A)。脂質輸送活性は、時間依存的な増加を示し、20から30分のインキュベ−トの間に最高値に達した。CEが輸送される速度及びCEが輸送される最大値は、TAGにおいて観察された速度や最大値よりも低かった。PL輸送のプロファイルはCE及びTAG輸送のプロファイルに類似していた。主な違いは、PL輸送活性の場合、最大輸送値が有意に低いことであった。
次いで、マウスの肝ミクロソ−ムに存在する脂質輸送活性を測定した(図11B)。3種の全ての脂質輸送活性は、これらのアッセイ法を用いてミクロソ−ム試料において測定することが出来た。ここでも主要な活性が観察されたのはTAGの輸送であり、CE及びPLの輸送活性がこれに続いた。TAGが輸送される初速度及び最大量はCE及びPLの初速度及び最大量よりも有意に高かった。これらの結果は、マウスの肝ミクロソ−ムにおいて、脂質輸送の効率がTAGに対して最大であり、CE及びPLの輸送効率がこれに続くことを示している。
MTPによる脂質輸送の相対活性
続いて、MTP精製品並びに細胞及び組織のホモジェネ−トにおいて測定された、TAG、CE及びPLの輸送活性について、それらの間の関係を比較した(表2)。精製されたウシ及びラットのMTP製品において、CE及びPLの輸送活性は、それぞれTAG輸送活性に対して59〜60%及び6〜5%であった。これらの活性は、Wetterauらにより精製されたウシのMTPにおいて放射線アッセイを用いて記録された相対活性と同様であった(非特許文献20、21)。HepG2細胞の溶解物及び肝ミクロソ−ムにおいては、CE及びPLの(輸送)活性は、TAG輸送活性と比較し、それぞれ42〜55%及び13〜27%であった。このように、マウスの肝ミクロソ−ムにおける相対的なCE輸送活性は、精製(MTP)タンパク質と同等であったが、一方HepG2細胞の溶解物は、精製MTP調製品と比較して小さいCE輸送活性を示した。これは、細胞又は組織におけるタンパク質又は他の可溶性因子が、この輸送に干渉する可能性を示唆している。対照的に、HepG2細胞及び肝ミクロソ−ムにおいて観察された相対的PL輸送活性は、精製MTP製品において認められた活性よりも2倍から4倍高かった。これは、細胞又は組織に、ホスファチジルコリン及びホスファチジルイノシト−ルの輸送タンパク質(非特許文献36)のような他のリン脂質輸送タンパク質が存在し、これらが蛍光PEの輸送に関与していることによると考えられる。
続いて、MTP精製品並びに細胞及び組織のホモジェネ−トにおいて測定された、TAG、CE及びPLの輸送活性について、それらの間の関係を比較した(表2)。精製されたウシ及びラットのMTP製品において、CE及びPLの輸送活性は、それぞれTAG輸送活性に対して59〜60%及び6〜5%であった。これらの活性は、Wetterauらにより精製されたウシのMTPにおいて放射線アッセイを用いて記録された相対活性と同様であった(非特許文献20、21)。HepG2細胞の溶解物及び肝ミクロソ−ムにおいては、CE及びPLの(輸送)活性は、TAG輸送活性と比較し、それぞれ42〜55%及び13〜27%であった。このように、マウスの肝ミクロソ−ムにおける相対的なCE輸送活性は、精製(MTP)タンパク質と同等であったが、一方HepG2細胞の溶解物は、精製MTP調製品と比較して小さいCE輸送活性を示した。これは、細胞又は組織におけるタンパク質又は他の可溶性因子が、この輸送に干渉する可能性を示唆している。対照的に、HepG2細胞及び肝ミクロソ−ムにおいて観察された相対的PL輸送活性は、精製MTP製品において認められた活性よりも2倍から4倍高かった。これは、細胞又は組織に、ホスファチジルコリン及びホスファチジルイノシト−ルの輸送タンパク質(非特許文献36)のような他のリン脂質輸送タンパク質が存在し、これらが蛍光PEの輸送に関与していることによると考えられる。
正味の脂質蓄積の測定
アクセプタ−小胞における脂質の正味の蓄積を測定するため、アッセイ混合物に存在するドナ−小胞及びMTPからアクセプタ−小胞を分離する方法が必要となった。Wetterauらはこれを行うため、彼らの放射線標識アッセイ(非特許文献20から22、31)においてカルジオリピン及びDE52を使用した。まず、カルジオリピンの付加がドナ−小胞におけるTAGの取り込みに影響しないことを確認した。取り込まれた総蛍光量は、カルジオリピンの有無で、ドナ−小胞に対してそれぞれ17,821±112及び17,202±1,162であった。第二に、ドナ−小胞及びMTPの99%以上が、DE52とのインキュベ−ト後に反応混合物から除外され得ることを確認した。第三に、MTPのTAG輸送活性に及ぼす、ドナ−小胞内に存在するカルジオリピン存在の効果を測定した。ここにおいて、カルジオリピンの有無による、ドナ−小胞によるTAG輸送の測定を並行して行った(図12A)。両アッセイとも、同量のアクセプタ−小胞及びドナ−小胞、並びにMTPを含有するにも拘わらず、MTPによるカルジオリピンを含むドナ−小胞からのTAG輸送は、カルジオリピンを含まないドナ−小胞により得られるTAG輸送と比較して50%少なく、公知の試験結果と一致していた(非特許文献6、20、37)。
アクセプタ−小胞における脂質の正味の蓄積を測定するため、アッセイ混合物に存在するドナ−小胞及びMTPからアクセプタ−小胞を分離する方法が必要となった。Wetterauらはこれを行うため、彼らの放射線標識アッセイ(非特許文献20から22、31)においてカルジオリピン及びDE52を使用した。まず、カルジオリピンの付加がドナ−小胞におけるTAGの取り込みに影響しないことを確認した。取り込まれた総蛍光量は、カルジオリピンの有無で、ドナ−小胞に対してそれぞれ17,821±112及び17,202±1,162であった。第二に、ドナ−小胞及びMTPの99%以上が、DE52とのインキュベ−ト後に反応混合物から除外され得ることを確認した。第三に、MTPのTAG輸送活性に及ぼす、ドナ−小胞内に存在するカルジオリピン存在の効果を測定した。ここにおいて、カルジオリピンの有無による、ドナ−小胞によるTAG輸送の測定を並行して行った(図12A)。両アッセイとも、同量のアクセプタ−小胞及びドナ−小胞、並びにMTPを含有するにも拘わらず、MTPによるカルジオリピンを含むドナ−小胞からのTAG輸送は、カルジオリピンを含まないドナ−小胞により得られるTAG輸送と比較して50%少なく、公知の試験結果と一致していた(非特許文献6、20、37)。
次に、アクセプタ−小胞への正味の脂質蓄積を測定した。ここにおいて、ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞、並びにMTPを種々の時間インキュベ−トし、蛍光の測定値からTAGの輸送を測定した。次に反応を停止させ、ドナ−小胞及びMTPをDE52の添加により沈降させ、アクセプタ−小胞に蓄積したTAGを定量した。TAG輸送は時間と共に徐々に増加し(図12B)、カルジオリピン存在下で観察されたTAG輸送(図12A)に類似していた。蛍光TAGのアクセプタ−小胞への正味の蓄積は120分間増加し、そこから180分まで変化しなかった。飽和点において、上記TAGの約50%から60%までがアクセプタ−小胞に蓄積していた。
次に、アクセプタ−小胞への種々の脂質の正味の脂質蓄積を測定した。蛍光TAG、CE又はPE、並びにカルジオリピンを含むドナ−小胞を調製した(図12C)。アクセプタ−小胞への正味の蓄積は、ドナ−小胞及びMTPの除去後に測定された。相対的活性は、TAG、CE及びPCに関して、それぞれ100±4.8%、71.0±8.5%、及び13.5±5.2%であった。これらの相対値は、脂質輸送測定に基づく数値(表3)と類似している。以上より、両アッセイは、脂質輸送の相対活性に関して同様の結果を与えるものであった。
図2から4と同様に、蛍光脂質を用いて脂質輸送アッセイを行った。次に、各アッセイ値が直線状となる時点について、特異的活性(輸送パ−セント/mgタンパク質/時間)を算出した。脂質輸送の絶対速度(輸送された脂質のnmol/mgタンパク質/時間)を、蛍光を標準曲線と比較することにより決定した。問題となる脂質輸送の特異的活性をTAG輸送の特異的活性で割り、100を掛けることにより、相対的活性(括弧内)を算出した。
Claims (32)
- ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質(MTP)の脂質輸送活性を定量する方法であり、以下の段階、すなわち:
(a)蛍光標識脂質を内部に含有するドナー小胞を調製し;
(b)アクセプター小胞を調製し;
(c)MTPを含有する細胞ホモジェネート又は単離されたMTPを、前記アクセプター小胞及び標識された前記ドナー小胞と、標識された脂質が前記ドナー小胞から前記アクセプター小胞へと輸送される間、前記蛍光標識脂質がMTPと結合するのに十分な時間及び条件の下でインキュベートし;
(d)MTPに結合した前記蛍光標識脂質の蛍光を測定する;
段階を含む方法。 - 前記細胞ホモジェネートが、MTPを発現する動物細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞ホモジェネートが、MTPを発現する昆虫又は微生物由来の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記の蛍光標識脂質が、トリグリセリド、コレステロールエステル(CE)又はリン脂質である、請求項1に記載の方法。
- 前記トリグリセリドが、トリアシルグリセロール(TAG)である、請求項4に記載の方法。
- 前記の蛍光標識されたTAGが、TAGのいずれかの位置で少なくとも一つのNBDを含み、その他の位置に脂肪酸が位置する、請求項5に記載の方法。
- 前記の蛍光標識されたトリアシルグリセロールが、1,2−ジオレオイル−3−NBDグリセロール(NBD−TAG)である、請求項5に記載の方法。
- 前記の蛍光標識されたCEが、NBD−CEである、請求項4に記載の方法。
- 前記の蛍光標識されたリン脂質が、NBD−PEである、請求項4に記載の方法。
- 前記アクセプター小胞が、小型の単層小胞、多層小胞、apoB−リポタンパク質小胞又はホスファチジルコリン(PC)小胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記ドナー小胞が、NBD標識された脂質を含むホスファチジルコリン(PC)小胞である、請求項1に記載の方法。
- MTPにより輸送される脂質の正味の輸送の測定方法であり、以下の段階、すなわち:
(a)蛍光標識脂質を内部に含有する、負に荷電したドナー小胞を調製し;
(b)アクセプター小胞を調製し;
(c)MTPを含有する細胞ホモジェネート又は単離されたMTPを、前記アクセプター小胞及び標識された前記ドナー小胞と、標識された脂質が前記ドナー小胞から前記アクセプター小胞へと輸送される間、前記蛍光標識脂質がMTPと結合するのに十分な時間及び条件の下でインキュベートし;
(d)ステップ(c)にてインキュベートされた混合液から、負に荷電したドナー小胞及びMTPを除去し;
(e)アクセプター小胞に輸送された蛍光標識脂質を測定する;
段階を含む方法。 - 前記の負に荷電したドナー小胞及びMTPが、陰イオン交換樹脂との混合及びそれに続く沈降により除去される、請求項12に記載の方法。
- 前記トリグリセリドが、NBDを含むトリアシルグリセロール(TAG)である、請求項4又は5に記載の方法。
- 前記リン脂質が、NBDを含むいずれかのリン脂質である、請求項4に記載の方法。
- 前記アクセプター小胞が、小型の単層小胞、apoB−リポタンパク質小胞又はホスファチジルコリン(PC)小胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記ドナー小胞が、NBD標識された脂質を含む小型の単層小胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞ホモジェネートが、MTPを発現する動物細胞を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞ホモジェネートが、MTPを発現する昆虫又は微生物由来の細胞を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記蛍光標識脂質が、トリグリセリド、コレステロールエステル又はリン脂質である、請求項12に記載の方法。
- 前記トリグリセリドが、NBD標識されたいずれかのトリアシルグリセロールである、請求項12に記載の方法。
- 前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項20に記載の方法。
- 前記アクセプター小胞が、小型の単層小胞、多層小胞、apoB−リポタンパク質小胞又はホスファチジルコリン(PC)小胞である、請求項12に記載の方法。
- 前記ドナー小胞が、ホスファチジルコリン(PC)小胞、小型の単層小胞又は多層小胞である、請求項12に記載の方法。
- MTPにより輸送された脂質の正味の輸送を測定するためのキットであり、アクセプター小胞及び負に荷電した蛍光標識されたドナー小胞を含むキット。
- 蛍光標識されたドナー小胞が、トリグリセリド、コレステロールエステル又はリン脂質を含む、請求項25に記載のキット。
- 前記のトリグリセリドが、NBD標識を含むいずれかのトリアシルグリセロールである、請求項26に記載のキット。
- 前記トリアシルグリセロールが、1,2−ジオレオイル−3−NBDグリセロール(NBD−TAG)である、請求項27に記載のキット。
- 前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項26に記載のキット。
- 前記アクセプター小胞が、小型の単層小胞、多層小胞、apoB−リポタンパク質小胞又はホスファチジルコリン(PC)小胞である、請求項25に記載のキット。
- 前記ドナー小胞が、小型の単層小胞、多層小胞、apoB−リポタンパク質小胞又はホスファチジルコリン(PC)小胞である、請求項25に記載のキット。
- 前記の小胞が、BSAの添加により安定化されている、請求項25に記載のキット。
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