JP2008504226A

JP2008504226A - 癌疾患修飾抗体

Info

Publication number: JP2008504226A
Application number: JP2007500024A
Authority: JP
Inventors: ヤング、デイヴィッド、エス．、エフ．; ハーン、スーザン、イー．; セチェット、リサ、エム．
Original assignee: アリアスリサーチ、インコーポレイテッド
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2008-02-14
Also published as: US7348413B2; US20050191306A1; EP1718736A1; CN1934247A; WO2005083063A1; AU2005217007A1; NZ549408A; EP1718736A4; CA2557091A1; US20090074659A1

Abstract

本発明は、新規スクリーニング規範を用いて患者の癌疾患修飾抗体を生産する方法に関する。癌細胞の細胞傷害性を用いて抗癌抗体を分離することで、このプロセスは治療および診断目的のための抗癌抗体の産生を可能にする。抗体は、癌の病気分類および診断の補助に用いることができ、また原発腫瘍および腫瘍転移の処置に用いることができる。抗癌抗体を毒素、酵素、放射性化合物、および血液原細胞とコンジュゲートさせることができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の単離および生産と、治療および診断プロセスでの該ＣＤＭＡＢ（必要に応じて1種類以上の化学療法薬と組み合わせて）の使用とに関する。本発明はさらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。

癌を呈する各々の患者を他の患者と比べ得るものではなく、その患者の個性と同様に他の癌とは異なる癌を有する。これにもかかわらず、現行の治療は癌の種類が同じ全ての患者に対して、同一病期で同一の方法による処置をおこなう。これらの患者の少なくとも３０％は一次治療に失敗して、その上の病期の治療に至り、治療の失敗、転移、および究極的には死亡する確率が高くなる。優れた処置対策として、特定個人に対応した治療にカスタマイズさせることであると考えられる。カスタマイズ化に向く唯一の現行の治療法は、手術である。化学療法および放射線療法は患者に合わせて調整することはできず、さらに手術そのものも、ほとんどの場合、治癒をもたらすには不十分である。

モノクローナル抗体の出現で、各々の抗体が単一のエピトープを対象とすることから、カスタマイズされた治療のための方法を開発する可能性はより現実的になった。さらに、特定のヒトの腫瘍を独特に特徴づける一連のエピトープを対象とする抗体の組み合わせを生産することが可能である。

悪性変換細胞に特異的である抗原を癌細胞が含むということが癌細胞と正常細胞との著しい違いであると認められたことで、科学界では、これらの抗原に対して特異的に結合することによって悪性変換細胞を特異的に標的とするようにモノクローナル抗体を設計することができると長い間考えられていた。このことから、モノクローナル抗体が癌細胞を除去するための「魔法の弾丸」として働き得るという考えが生じた。

即時開示された発明の技術に基づいて単離されるモノクローナル抗体は、患者にとって有益であるかたちで、例えば全身腫瘍組織量を減少させることで、癌疾患を修飾することが示されており、本明細書では癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）または「抗癌」抗体として様々にいわれる。

現時点では、癌患者は一般に処置の選択肢をほとんど持たない。癌治療に対する規格化された取り込みによって、全体的な生存率および罹患率の改善がもたらされた。しかし、特定の個人にとっては、これらの改善された統計値は、個人的状況の改善と必ずしも相関しているわけではない。

したがって、もし開業医が同一コホートで他の患者とは独立して各々の腫瘍を処置することを可能とする方法論が出されるならば、これによって、まさにその一人に合うように治療を調整する独特なアプローチが可能となるだろう。そのような治療の経過は、理想的には、治癒率を高め、より良好な結果を生み出し、それによって以前から感ぜられた必要性が満たされる。

歴史的にみて、ポリクローナル抗体の使用は、ヒト癌の処置に用いても大した成功をもたらすこともなくおこなわれてきた。リンパ腫および白血病に対しては、ヒト血漿による処置が施されていたが、長期寛解または反応がほとんどなかった。さらにまた、再現性が乏しく、化学療法と比較して付加的な利点は得られなかった。乳癌、黒色腫、および腎細胞癌等の固形腫瘍に対しても、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿、およびウマ血清による処置が施されていたが、結果は予測不可能であり、効果があるものではなかった。

固形腫瘍に対するモノクローナル抗体の臨床試験が数多くなされている。１９８０年代では、少なくとも４種類のヒト乳癌臨床試験がおこなわれたが、特定の抗原に対する抗体または組織選択性に基づく抗体を用いて少なくとも４７人の患者からたった一人の応答者が得られたのみである。シスプラチンと併用したヒト化抗Ｈｅｒ２抗体による臨床試験は、１９９８年まで成功していなかった。この治験では、３７人の患者に対して応答が調べられ、そのうちの約４分の１が部分的緩解率を示し、ほかの半分で軽度または安定した疾患進行が見られた。

結直腸癌を調べる臨床試験は、糖タンパク質および糖脂質の両方を標的とする抗体を必要とする。腺癌に対してある程度特異性がある１７−１Ａ等の抗体に対して第二相臨床試験を実施したところ、６０人以上の患者うち患者一人だけが部分寛解を呈した。他の治験では、１７−１Ａを用いた場合、シクロホスファミドをさらに用いるプロトコルで５２人の患者のうち、完全寛解が１人、軽度の寛解が２人だけであった。類似の結果が１７Ａ−１Ａが関与する他の治験で得られた。最初に可視化が承認されたヒト化マウス・モノクローナル抗体を使用しても腫瘍退縮を生じなかった。現在までのところ、結腸直腸癌に有効である抗体は存在していない。同様に、肺癌、脳癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、および胃癌に対しても一様に好ましくない結果であった。黒色腫に対する抗ＧＤ３モノクローナル抗体の使用では、ある程度の成功が得られた。このように、ヒト臨床試験の必要条件である小動物研究での成功にもかからず、試験された抗体のほとんどで効果が得られなかったことが分かる。

先行特許：
特許文献１は、患者の腫瘍から得た細胞が該患者から得た細胞または組織からクローニングされたＭＨＣ遺伝子によってトランスフェクトされるプロセスを開示している。その後、これらのトランスフェクション細胞は、患者へのワクチン投与に用いられる。

特許文献２は、哺乳類の腫瘍細胞および正常細胞の細胞内構成要素（細胞外構成要素ではない）に対して特異的であるモノクローナル抗体を得るステップと、そのモノクローナル抗体を標識するステップと、標識抗体と腫瘍細胞を殺す治療を受けた哺乳類の組織とを接触させるステップと、変質している腫瘍細胞の細胞内構成要素に対する上記標識抗体の結合を測定することで治療の効果を決定するステップとを有するプロセスを開示している。ヒト細胞内抗原に対する抗体の調製で、特許権者は悪性細胞がそのような抗原の好都合な供給源であることを認識している。

特許文献３は、新規抗体とその生産方法とを提供する。具体的には、その特許はヒト腫瘍（例えば、大腸および肺の腫瘍）に結合したタンパク質抗原に対して強く結合し、その一方で正常細胞に対してはかなり少ない程度に結合する特性を持つモノクローナル抗体の形成を教示している。

特許文献４は、外科的にヒト癌患者から腫瘍組織を除くステップと、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処置するステップと、腫瘍細胞に放射線を照射し、生存可能ではあるが非腫瘍形成性にするステップと、該細胞を用いて、原発腫瘍の再発を抑制することが可能であり、その一方で同時に転移を阻害するワクチンを調製するステップとを有する癌治療方法を提供する。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原と反応するモノクローナル抗体の開発を教示する。以下参照する４段目４５行に記載されているように、この特許権者はヒト新形成で活発な特異的免疫療法を発現しているモノクローナル抗体の発現で、自所性腫瘍細胞を利用する。

特許文献５は、ヒト癌腫に特有であり、起源の上皮組織に依存していない糖タンパク質抗原を教示している。

特許文献６は、Ｈｅｒ２発現細胞でアポトーシスを誘発する抗Ｈｅｒ２抗体と、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株と、そのような抗体を用いた癌の処置方法と、そのような抗体を含む医薬組成物とを開示している。

特許文献７は、腫瘍および非腫瘍組織供給源から精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体産生のための新規ハイブリドーマ細胞株を記載している。

特許文献８は、所望の抗原に対して特異的な抗体を産生するヒト・リンパ球を生成するための方法と、モノクローナル抗体を産生するための方法と、同様に該方法によって産生されたモノクローナル抗体とを開示している。この特許は、特に癌の診断および治療に有用な抗ＨＤヒト・モノクローナル抗体の産生に関する。

特許文献９は、ヒト・抗体、抗体フラグメント、抗体コンジュゲート、および単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体機能が２倍となるメカニズムは、分子がヒト・カルシノーマの表面に上に存在する細胞膜抗原に対して反応する点で、さらに、上記抗体がカルシノーマ細胞内に内在化する能力を有し、結合後、特に抗体−薬物コンジュゲートおよび抗体−毒素コンジュゲートに対して特に有用であるという点である。それらの修飾形態では、上記抗体は特定の濃度で細胞傷害性を表す。

特許文献１０は、腫瘍の治療および予防のための自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、老いた哺乳類に由来する抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見つかる、ある種の自然抗体であると言われる。自己抗体が「老いた哺乳類」に由来することから、処置されている患者から実際に由来する自己抗体であることを必要としない。また、この特許は老いた哺乳類から天然およびモノクローナル抗核自己抗体とモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株とを開示する。

米国特許第５，７５０，１０２号米国特許第４，８６１，５８１号米国特許第５，１７１，６６５号米国特許第５，４８４，５９６号米国特許第５，６９３，７６３号米国特許第５，７８３，１８６号米国特許第５，８４９，８７６号米国特許第５，８６９，２６８号米国特許第５，８６９，０４５号米国特許第５，７８０，０３３号

本発明者らは、以前に「個々の患者に対して特異的な抗癌抗体」と題された米国特許６，１８０，３５７号の付与を受けており、この特許は癌疾患の処置に有用である個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択するためのプロセスに関する。

この出願は、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するためのするための‘３５７特許に教示されたとおりの患者特異的抗癌抗体を産生するための方法を利用する。これらの抗体を、一つの腫瘍に対して特異的に作ることができるので、癌治療をカスタマイズすることが可能となる。この出願のコンテクストの範囲内で、細胞殺害（細胞傷害性）特性または細胞増殖阻害（細胞分裂停止）特性のいずれかを持つ抗癌抗体を以下、細胞傷害性と呼ぶ。これらの抗体を、癌の病期分類および診断の補助に使用することができ、また腫瘍転位の処置に用いることができる。

個別的抗癌処置が期待されることで、患者を管理する方法に変化がもたらされる。可能性がある臨床シナリオは、提示時に腫瘍試料を採取して保存しておくことである。この試料によって、腫瘍の類型を既存の癌疾患修飾抗体パネルから調べる。患者は従来通りに病期分類されるが、利用可能な抗体を用いることでさらに患者を病期分類することができる。患者は既存の抗体を用いて即時治療を受けることができ、腫瘍に特有の抗体のパネルを、本明細書中に概説される方法を用いて、または本明細書中に開示されるスクリーニング法と併用してファージ提示ライブラリーを用いることにより、作ることができる。他の腫瘍が処置されているものと同じエピトープの一部を有する可能性があることから、産生される全ての抗体は抗癌性抗体のライブラリーに加えられる。この方法によって産生される抗体は、これらの抗体と結合する癌が、かなりの数の患者において、癌疾患の処置に有用である。

抗癌抗体に加えて、患者は、多様な処置療法の一部として現在推奨された治療を受けることを選択することができる。本方法論を介して単離された抗体が相対的に非癌細胞に対して非毒性であるという事実から、高濃度で抗体の組み合わせを、単独または従来の治療と併用して用いることが可能である。治療指数が高いことは、処置耐性菌の出現可能性を減少させなければならない短い時間的尺度上で、再処置も可能にする。

さらに、本発明の範囲内である標準的な化学療法の様式（例えば、放射性核種）を本発明のＣＤＭＡＢとコンジュゲートさせることで、上記化学療法の使用に焦点が当てられる。

もし患者が治療の初期経過に対して不応性であるか、または転移が生じる場合、腫瘍に対する特異的抗体を生ずるプロセスを、再処置するために繰り返すことができる。さらにまた、その患者から得た赤血球に抗癌抗体をコンジュゲートさせ、転移処置を目的として再注入することができる。転移癌に対する効果的処置はほとんどなく、転移は一般に死に至る転帰不良の前兆となる。しかし、転移癌は通常、十分に血管化しており、赤血球による抗癌抗体の送達によって、腫瘍部位に抗体を集中させる効果が得られる。転移に先立っても、ほとんどの癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存しており、また赤血球に結合した抗癌抗体も同様に原位置（ｉｎｓｉｔｕ）腫瘍に対して効果がある。あるいは、このような抗体を、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞等の他の血液原細胞に結合させてもよい。

抗体には５つの種類があり、各々がその重鎖によって与えられる機能と関連している。裸の抗体によって癌細胞を殺すことは、抗体依存型細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存型細胞傷害性（ＣＤＣ）のいずれかを介して調節されると一般に考えられる。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は補体系のＣ−１成分が結合することでヒト補体型を活性化させることができ、それによって腫瘍細胞溶解を導くことができる補体活性化の古典経路が活性化される。ヒト抗体に関して、最も効果的な補体活性化抗体は、一般にＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３イソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、および特定のリンパ球によって細胞殺害に導くＦｃレセプターを持つ細胞傷害性細胞を動員することで効果的である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３イソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣを仲介する。

抗体媒介癌殺害をおこなうための可能性のある他の機構として、細胞膜およびその関連糖タンパク質もしくは糖脂質での種々の化学結合の加水分解を触媒するために働く抗体（いわゆる触媒抗体）の使用を介するものが考えられる。

制癌剤の臨床有用性は、患者に対する許容リスク・プロフィールのもとでの薬物の効能に基づく。癌治療において、生存は通常、効能の次に最も求められている。しかし、延命に加えて、よく認識された効能がほかにもいくつかある。処置が生存に対して悪影響を及ぼさないこれらの他の効能として、症状寛解、有害事象に対する防御、再発または疾患のない生存の時間延長および進行の時間延長が挙げられる。これらの判定基準は一般に認められており、それらの効能を生ずる薬物が米国食品医薬品局（Ｆ．Ｄ．Ａ）等の規制団体によって承認されている。
（Hirschfeld et al. Critical Reviews
inOncology/Hematolgy 42: 137-143 2002）
これらの基準に加えて、これらの種類の効能を予測することが可能な他の評価項目（エンド・ポイント）があることが十分認識されている。１つには、米国Ｆ．Ｄ．Ａが許可した促進的承認プロセスでは患者の利点を予測すると思われる代用物があることが認める。年末（２００３）より、このプロセス中で承認される薬剤が１６種類あり、これらのうちの４種類が完全承認に移行した。すなわち、追跡調査によって、代わりの評価項目（エンド・ポイント）によって予測されたとおりの患者に対する直接的な効能が示された。固形腫瘍で薬物効果を決定するための１つの重要な評価項目（エンド・ポイント）は、処置に対する反応の測定による全身腫瘍組織量の評価である。
（Therasse., Journal of the National Cancer
Institute 92 (3): 205-216 2000）
そのような評価のための臨床判定基準（ＲＥＣＩＳＴ判定基準）は、固体腫瘍反応評価基準研究グループ（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group）（国際的癌専門家集団）によって広められた。全身腫瘍組織量に対する示された効果を持つ薬物は、ＲＥＣＩＳＴ判定基準に従う客観的な反応で示されるように、最終的に、適当な対照と比較して、患者に対して直接的な効能を生ずる傾向にある。前臨床設定では、一般に、全身腫瘍組織量がより直接的に評価および記録される。前臨床試験を上記臨床設定として解釈し得るという点で、前臨床モデルで生存を延ばす薬物は最も予想された臨床的有用性を持つ。臨床処置に対して肯定応答を生ずることに類似して、前臨床設定で全身腫瘍組織量を減少させる薬物もまた疾患に対して有意に直接的な影響を及ぼすことも可能である。生存の延長が制癌剤処置による臨床転帰後に最も求められるものではあるが、臨床有用性を持つ他の効能があり、全身腫瘍組織量もまた、直接的な効能につながることもでき、また臨床的影響もあることは明らかである。
（Eckhardt et al., Developmental
Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted
Compounds; ASCO Educational Book, 39^th Annual Meeting, 203, pages
209-219）

したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞株と、該ハイブリドーマ細胞株がコードされた対応する単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントとを単離するために、癌細胞に関して細胞傷害性であり、同時に非癌細胞に対しては相対的に非毒性である特定の個人に由来する細胞からＣＤＭＡＢを生産する方法を利用することである。

本発明の別の目的は、ＣＤＭＡＢとその抗原結合フラグメントとを教示することである。

本発明のさらなる目的は、細胞傷害性が抗体依存型細胞傷害性を介して仲介されるＣＤＭＡＢを生産することである。

本発明のさらに別の目的は、細胞傷害性が補体依存型細胞傷害性を介して仲介されるＣＤＭＡＢを産生することである。

本発明のさらなる目的は、細胞傷害性が細胞の化学結合の加水分解を触媒する能力の機能である癌疾患修飾抗体を産生することである。

本発明のさらなる目的は、癌の診断、予後、およびモニタリングのための結合アッセイに有用であるＣＤＭＡＢを生産することである。

この明細書の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。ここで、例証および例示を目的として、本発明のいくつかの実施形態を説明する。
図１は、いくつかの癌および非癌細胞株に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３および抗ＥＧＦＲ抗体の典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図２は、細胞株ＰＣ−３、ＬｎＣａｐ、およびＣＣＤ−２７ｓｋに対するハイブリドーマ上清の細胞傷害性率と結合レベルとの比較である。
図３は、ＡＲ４０Ａ６０３．１３の細胞傷害性と陽性および陰性対照との比較である。
図４は、抗ＥＧＦＲ対照と対比させたＡＲ４０Ａ６０３．１３の結合を示し、アイソタイプ対照を上回る平均蛍光強度増加倍率を表にしたものである。結果は、イソタイプ対照を上回る蛍光強度増加倍率の平均値を定量的に示すもので、１．５ないし５（＋）、５ないし２５（＋＋）、２５ないし５０（＋＋＋）、および５０を超える（＋＋＋＋）として結果を表す。
図５は、ＳＷ１１１６大腸癌モデルでの腫瘍増殖に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３の効果を示す。縦軸は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。
図６は、ＳＷ１１１６大腸癌モデルでの体重に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３の効果を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。
図７は、ＰＣ−３大腸癌モデルでの腫瘍増殖に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３の効果を示す。縦軸は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。
図８は、ＰＣ−３前立腺モデルでの体重に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３の効果を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。

ハイブリドーマ生産−ハイブリドーマ細胞株ＡＲ４０Ａ６０３．１３

ブタベスト条約に従って、ハイブリドーマ細胞株ＡＲ４０Ａ６０３．１３を寄託番号２８０１０４−０４として２００４年１月２８日、カナダ国際寄託機関（ＩＤＡＣ）（カナダ保健省微生物局（Bureau of Microbiology, Health
Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada, R3E3R2）に寄託した。
３７ＣＦＲ１．８０８にもとづいて、寄託者は、寄託材料の公開に対する有効性にかかるすべての制限が特許の付与によって即座に取り除かれることを確信する。

抗癌抗体ＡＲ４０Ａ６０３．１３を産生するハイブリドーマを作るために、凍結ヒト前立腺腫瘍組織（Genomics Collaborative,
Cambridge,MA）由来の単一細胞懸濁液をＰＢＳで調製した。
ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ（商標）（Qiagen,
Venlo, Netherlands）アジュバントを、穏やかに混合することで、使用のために調製した。５ないし７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、２００万細胞を含む抗原アジュバント５０マイクロリットルを皮下注射することによっておこなった。新たに調製した抗原アジュバントを用いて、初回免疫から２および５週間後、２００万細胞を含む５０マイクロリットルで免疫化マウスの追加免疫に用いた。最終免疫の３日後、融合に脾臓を用いた。単離した脾細胞をＮＳＯ−１骨髄腫パートナーと融合してハイブリドーマを調製した。融合から得た上清をハイブリドーマのサブクローニングについて試験した。

ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体がＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであるかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を２．４マイクログラム／ｍＬの濃度で含むコーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．２〜９．６）を４℃、１００マイクロリットル／ウエルで、ＥＬＩＳＡプレートに一晩加えた。このプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのブロッキング緩衝液（５％ミルク含有洗浄緩衝液）を上記プレートに、室温で１時間添加し、次に洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのハイブリドーマ懸濁液を添加し、プレートを１時間、室温でインキュベートした。このプレートを洗浄液で３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ複合体（コンジュゲート）の１／１００，０００希釈物（５％ミルク含有ＰＢＳで希釈）１００マイクロリットル／ウエルを添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＰ溶液を室温で１〜３分間インキュベートした。２ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００マイクロリットル／ウエル添加することで呈色反応を停止させ、プレートを４５０ｎｍでパーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置で読み取った。図２に示すように、ＡＲ４０Ａ６０３．１３ハイブリドーマは、主にＩｇＧイソタイプの抗体を分泌した。

限界希釈を１回繰り返した後、細胞ＥＬＩＳＡアッセイで標的細胞に結合した抗体についてハイブリドーマ上清を試験した。２種類のヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ−３およびＬｎＣａｐ）と１種類のヒト正常皮膚細胞株（ＣＣＤ−２７ｓｋ）とをそれぞれ試験した。使用に先立って、平板培養された細胞を、使用前に固定した。室温で、プレートをＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２を含有するＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳで希釈した２％パラホルムアルデヒド１００マイクロリットルを各ウエルに室温で１０分間添加し、その後捨てた。プレートを再びＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２を含有するＰＢＳで再び洗浄した。ブロッキングを、５％ミルク含有洗浄液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を１００マイクロリットル／ウエルを用いて、室温で１時間実施した。プレートを洗浄液で３回洗浄し、ハイブリドーマ上清を１００マイクロリットル／ウエル、室温で１時間添加した。このプレートを洗浄液で３回洗浄し、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭの１／２５，０００希釈物（５％ミルク含有ＰＢＳで希釈）を１００マイクロリットル／ウエル添加した。室温で１時間インキュベートした後、室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＢ基質を室温で１〜３分インキュベートした。反応を１００マイクロリットル／ウエルの２ＭＨ_２ＳＯ_４で停止させ、このプレートを、パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置を用いて４５０ｎｍで読み取った。図２に集計したように、試験した細胞株に結合しないことが既に示されている抗ＩｇＧイソタイプ対照と比較しその際のバックグラウンドを上回る倍数で、結果を表した。ＡＲ４０Ａ６０３．１３ハイブリドーマ由来の抗体は、前立腺癌細胞株ＬｎＣａｐに対してかなりの結合を示し、続いて別の前立腺癌細胞株ＰＣ−３に対して結合を示した。ＡＲ４０Ａ６０３．１３は、正常ヒト細胞株ＣＣＤ−２７ｓｋに対する結合の度合いが低かった。

抗体結合に関する試験と同時に、ハイブリドーマ上清の細胞傷害効果について、同じ乳癌細胞株（ＰＣ−３、ＬｎＣａｐ、およびＣＣＤ−２７ｓｋ）を用いて試験した。生／死細胞傷害性アッセイをモレキュラー・プローブ（Molecuclar Probes）（Ｅｕ、ＯＲ）から得た。このアッセイを、以下に示す変更を加えて製造元の指示にしたがって実施した。細胞を、予め定められた適当な密度で上記アッセイ前に、平板培養した。２日後、ハイブリドーマ・マイクロタイター・プレートから１００μｌの上清を細胞プレートに移し、５日間にわたって５％ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。陽性対照としてあるウエルを、空になるまで吸引し、１００マイクロリットルのアジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）またはシクロヘキシミドを添加した。処置５日後、上記プレートを逆さまにして空にし、拭き取り乾燥させた。ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２を含む室温ＤＰＢＳ（ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水）をマルチチャンネル・スクイーズ・ボトルから各ウエルに分配し、軽く３回叩き、反転させて空にし、さらに拭き取り乾燥させた。ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２含有ＤＰＢＳで希釈した蛍光カルセイン染料５０マイクロリットルを各ウエルに添加し、３７℃、３０分間、５％ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。プレートをパーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置で読み取り、そのデータをマイクロソフト・エクセル（Microsoft Excel）で分析した。結果を図２に集計した。ＡＲ４０Ａ６０３．１３ハイブリドーマは、ＰＣ−３およびＬｎＣａｐ細胞の両方で特異的細胞傷害性が１３パーセント生じ、これは陽性対照アジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドにより、それぞれＰＣ−３細胞で得られた細胞傷害性の２４および２２パーセントであり、同様にＬｎＣａｐ細胞での１６および４２パーセントであった。図２の結果は、ＡＲ４０Ａ６０３．１３の細胞傷害性が２種類の癌細胞種での結合レベルに比例しないことを示した。ＬｎＣａｐおよびＰＣ−３細胞では同レベルの細胞傷害性が生じた。しかし、ＰＣ−３細胞に対して、ＬｎＣａｐ細胞に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３の結合が少なくとも３倍増加した。図２に表されるように、ＡＲ４０Ａ６０３．１３は、ＣＣＤ−２７ｓｋ正常細胞株に対する実質的な結合があるにもかかわらず、これらの細胞で細胞傷害性を生じなかった。細胞傷害性を一般に生ずる既知の非特異的細胞傷害性剤であるシクロヘキシミドおよびＮａＮ_３は、一般に予測通りの細胞傷害性を生じた。

抗体生産

ハイブリドーマを週２回収集および再播種しながらＣＬ−１０００フラスコ
（BD Biosciences,Oakville, ON）で培養することで、ＡＲ４０Ａ６０３．１３モノクローナル抗体を生産した。
その後、プロテインＧセファローズ４ファースト・フロー（Amersham Biosciences, Baie d’Urfe, QC）による標準的な抗体精製手順をおこなった。ヒト化、キメラ化、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。

ＡＲ４０Ａ６０３．１３を、細胞傷害性アッセイで、いくつかの陽性（抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ１、カッパ、５μｇ／ｍＬ、Cedarlane, Hornby, ON）、シクロヘキシミド（ＣＨＸ、０．５μＭ、Sigma,Oakville,
ON）、およびＮａＮ_３（０．１％、Sigma, Oakville, ON））対照ならびに陰性（１０７．３（抗ＴＮＰ）、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０μｇ／ｍＬ、BD Bioscience, Oakville, ON）、およびＩｇＧ緩衝液（３％））対照のいくつかと比較した（図３）。乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）、ＮＣＩ−ＭＣＦ−７（ＭＣＦ−７））、大腸癌（ＤＬＤ−１、Ｌｏｖｏ、ＳＷ１１１６）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−３）、膵臓（ＢｘＰＣ−３）、および前立腺（ＰＣ−３、ＬｎＣａｐ、ＤＵ−１４５）癌、ならびに非癌皮膚細胞株（ＣＣＤ−２７ｓｋ）および肺細胞株（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）を試験した（すべてＡＴＣＣ（Manassas, VA）から入手）。生／死細胞傷害性アッセイは、モレキュラー・プローブ（Molecular Probes, Eugene, OR）から入手した。アッセイは以下に概説する変更を加えて製造元の指示に従っておこなった。細胞を、予め定められた適当な密度で上記アッセイ前に、平板培養した。２日後、１００μｌの精製抗体または対照を培地に希釈して細胞プレートに移し、５日間にわたって８％ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。上記プレートを逆さまにして空にし、拭き取り乾燥した。ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２を含む室温ＤＰＢＳをマルチチャンネル・スクイーズ・ボトルから各ウエルに分配し、軽く３回叩き、反転して空にし、さらに拭いて乾燥させた。ＭｇＣｌ_２およびＣａＣｌ_２含有ＤＰＢＳで希釈した蛍光カルセイン染料を各ウエルに５０μｌ添加し、３７℃、３０分間、５％ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。プレートをパーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置で読み取り、そのデータをマイクロソフト・エクセル（Microsoft Excel）で分析した。結果を図３に集計した。データは、３重反復試験した４回の実験の平均を表し、以下の様式で定量的に示した。すなわち、３／４ないし４／４の実験がバックグラウンドを１５％上回る細胞傷害性を持つ場合（＋＋＋＋）、２／４の実験がバックグラウンドを１５％上回る細胞傷害性を持つ場合（＋＋＋）、少なくとも２／４の実験がバックグランドを１０〜１５％上回る細胞傷害性を持つ場合（＋＋）、少なくとも２／４実験が８〜１０％上回る細胞傷害性を持つ場合（＋）、バックグラウンドよりも７％高い細胞傷害性を持つ場合（＋／−）とした。図３中の無印の細胞は、不定または閾値細胞傷害性よりも低い効果を示した。ＡＲ４０Ａ６０３．１３抗体は、イソタイプおよび緩衝液陰性対照と比べて、ＳＷ１１１６大腸癌細胞株、ＭＣＦ−７乳癌細胞株株、ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞株、ＬｎＣａｐ前立腺細胞株、およびＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞で細胞傷害性を生じた。重要なことは、ＡＲ４０Ａ６０３．１３は、陰性対照（ＣＣＤ−２７ｓｋまたはＨｓ８８８．Ｌｕ等の非癌細胞株に対して）よりも著しい細胞傷害性を示さなかったことであり、抗体が癌細胞に対して特異性を有していることが示された。細胞傷害性化学剤は、期待通りの非特異的細胞傷害性を誘導した。

癌および正常細胞株の上記パネルに対するＡＲ４０Ａ６０３．１３の結合をフロー・サイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。最初に細胞単層をＤＰＢＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含まず）で洗浄して、ＦＡＣＳ用に細胞を調製した。次に、細胞解離緩衝液（INVITROGEN, Burlington, ON）を用いて、３７℃で細胞培養プレートから細胞を取り除いた。遠心および回収後、細胞をＭａｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、および２パーセント牛胎児血清を含むＤＰＢＳ（４℃、染色培地）に再懸濁し、計数し、適当な細胞密度に等分し、遠心して細胞をペレットにし、さらに試験抗体（ＡＲ４０Ａ６０３．１３）または対照抗体（イソタイプ対照、抗ＥＧＦＲ）を２０マイクログラム／ｍｌ含む染色培地（４℃）に、氷上、３０分間、再懸濁した。アレクサ・フルーア（Alexa Fluor）４８８結合二次抗体を細胞に添加することに先立って、細胞を染色培地で１回洗浄した。染色培地に含まれるアレクサ・フルーラ４８８接合抗体を次に３０分間添加した。続いて細胞を最終時間に対して洗浄し、固定培地（１．５％パラホルムアルデヒドを含む染色培地）に再懸濁した。
フローサイトメトリーによる細胞の獲得を、セルクエスト（CellQuest）ソフトウエア（BD Biosciences,Oakville,ON）を用いてＦＡＣスキャン（FACScan）上に試料を流すことで、評価した。
細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）の設定を、ＦＳＣＣおよびＳＳＣ検出器の電圧および振幅利得を調製することでおこなった。蛍光（ＦＩＴＣ）チャンネル用検出器の調整を、細胞が約１〜５単位の中央値蛍光強度で均一のピークを持つようにして、アレクサ・フルーア（Alexa Fluor）４８８結合二次抗体のみで染色した細胞を流すことで、おこなった。各試料について、分析用に約１０，０００個の染色固定細胞を取得し、その結果を図４に示した。

図４は、イソタイプ対照を上回る蛍光強度増加倍率の平均値を示し、定量的に、１．５ないし５（＋）、５ないし２５（＋＋）、２５ないし５０（＋＋＋）、および５０を超える（＋＋＋＋）として表した。ＡＲ４０Ａ６０３．１３抗体の典型的なヒストグラムを図１用に編集した。ＡＲ４０Ａ６０３．１３は、試験した細胞株の全てに対する結合を示した。試験データは、試験した細胞のタイプ全てに対して明らかな結合があったことを示したが、ＳＷ１１１６、ＭＣＦ−７、ＯＶＣＡＲ−３、ＬｎＣａｐ、およびＢｘＰＣ−３癌細胞型と関連した細胞傷害性のみがあった。対照的に、抗ＥＧＦＲ抗体は、非癌表皮由来細胞株ＣＣＤ−２７ｓｋであるようなそのような例で、結合と細胞傷害性との間に高い相関が示された。ＡＲ４０Ａ６０３．１３もまた、抗ＥＧＦＲによる影響を受けないいくつかの癌細胞株（ＳＷ１１６、ＢｘＰＣ−３、およびＭＣＦ−７が挙げられる）でも有効であった。

生体内（ｉｎｖｉｖｏ）ＳＷ１１１６腫瘍実験
図５および６に関連して、週齢４ないし８週のメスＳＣＩＤマウスに対して、５００万個のヒト大腸癌細胞（ＳＷ１１１６）を含む１００マイクロリットル生理食塩水をマウスの首筋に皮下注射することで、該細胞を移植した。マウスを、各群５匹からなる２つの処置群に、無作為に分けた。２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ４０Ａ６０３．１３試験抗体または緩衝液対照を、２．７ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ｍＭＮａＣｌ、および２０ｍＭＮａ_２ＨＰ０_４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。次に、抗体の投与を７週間にわたって週に１回、同じ様式でおこなった。腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、最大８週間あるいは個々の動物がカナダ動物飼育評議会（Canadian Council for Animal Care; CCAC）の評価項目（エンド・ポイント）に達するまで測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。

ＡＲ４０Ａ６０３．１３は、ヒト大腸癌の生体内（in vivo）モデルで、腫瘍増殖を抑制し、かつ全身腫瘍組織量を減少させた。移植後５０日目（最終処置投薬後５日目）で、ＡＲ４０Ａ６０３．１３での平均腫瘍容積は、緩衝液対照処置群の腫瘍容積の７１％であった（ｐ＝０．０４９３、ｔ−検定、図５）。

毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通して見られなかった。無作為に週間隔で計量される体重は、健康および発達障害の代用となった。図６に示すように、処置期間の終了時に群間の体重による有意差を認められなかった（ｐ＝０．１１５２、ｔ−試験）。郡内で、緩衝液処置対照動物の体重は、研究期間開始時と終了時とで有意な差はなかった（ｐ＝０．２８２５、ｔ−試験）。一方、ＡＲ４０Ａ６０３．１３処置群の体重は、平均値が１７．８０から１９．８０ｇへとわずかに有意な増加が見られた（ｐ＝０．０３４５、ｔ−試験）。したがって、ＡＲ４０Ａ６０３．１３は耐容性が高く、大腸癌異種移植モデルで全身腫瘍組織量を減少させた。

生体内（in vivo）ＰＣ−３腫瘍発現

図７および８を参照すると、４ないし８週齢のオスＳＣＩＤマウスに対して、１００万個の前立腺癌細胞（ＰＣ−３）を含む１００マイクロリットルの生理食塩水を該マウスの首筋に皮下注射することによって、該細胞の移植をおこなった。マウスを、各群５匹ずつ２つの処置群に、無作為に分けた。移植の翌日に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ４０Ａ６０３．１３試験抗体または緩衝液対照を、２．７ｍＭＫＣＩ、１ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ｍＭＮａＣｌ、および２０ｍＭＮａ_２ＨＰ０_４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。次に、抗体の投与を試験期間中、週に１回、同じ様式でおこなった。腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いておこなった。研究は、６回の注射後に完了した（４１日間）。なぜなら、大きな潰瘍の病変のために動物がカナダ動物飼育評議会（Canadian Council for Animal Care; CCAC）の評価項目（エンド・ポイント）に達したからである。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。

ＡＲ４０Ａ６０３．１３は、ヒト大腸癌の生体内（in vivo）モデルで、腫瘍増殖を抑制し、かつ全身腫瘍組織量を減少させた。移植後４１日目（最終処置投薬後５日目）で、ＡＲ４０Ａ６０３．１３での平均腫瘍容積は、緩衝液対照処置群の腫瘍容積の６０％であった（ｐ＝０．０５５、ｔ−検定、図７）。

ＰＣ−３前立腺癌異種移植モデルでは、体重は疾患進行の代わりの指標として使用し得る。（Wang et al.Int J Cancer, 2003）
図８に見られるように、試験終了（４１日目）までに、対照動物は試験開始から体重が２７％減少したことを示した。
対照的に、ＡＲ４０Ａ６０３．１３による処置群は、対照群と比べて有意に体重が高かった（ｐ＝０．０４６５、ｔ−検定）。
全体的に、ＡＲ４０Ａ６０３．１３処置群は緩衝液対照群よりも３６％少ない体重に落とした。したがって、ＡＲ４０Ａ６０３．１３は、耐容性が高く、前立腺癌異種移植モデルで全身腫瘍組織量を減少させた。

参考文献
Wang
Z,Corey E, Hass GM, et al. Expression of the human cachexia-associated protein
(HCAP) in prostate cancer and in a prostate cancer animal model of cachexia.
Int J Cancer.
2003; 105 (1) : 123-9.

いくつかの癌および非癌細胞株に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３および抗ＥＧＦＲ抗体の典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。細胞株ＰＣ−３、ＬｎＣａｐ、およびＣＣＤ−２７ｓｋに対するハイブリドーマ上清の細胞傷害性率と結合レベルとの比較である。ＡＲ４０Ａ６０３．１３の細胞傷害性と陽性および陰性対照との比較である。抗ＥＧＦＲ対照と対比させたＡＲ４０Ａ６０３．１３の結合を示し、アイソタイプ対照を上回る平均蛍光強度増加倍率を表にしたものである。結果は、イソタイプ対照を上回る蛍光強度増加倍率の平均値を定量的に示すもので、１．５ないし５（＋）、５ないし２５（＋＋）、２５ないし５０（＋＋＋）、および５０を超える（＋＋＋＋）として結果を表す。ＳＷ１１１６大腸癌モデルでの腫瘍増殖に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３の効果を示す。縦軸は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。ＳＷ１１１６大腸癌モデルでの体重に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３の効果を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。ＰＣ−３大腸癌モデルでの腫瘍増殖に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３の効果を示す。縦軸は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。ＰＣ−３前立腺モデルでの体重に対するＡＲ４０Ａ６０３．１３の効果を示す。データ点は、平均値±ＳＥＭを表す。

Claims

寄託番号２８０１０４−０４としてＩＤＡＣに寄託されたクローンによってコードされる、単離されたモノクローナル抗体。
ヒト化されている請求項１記載の抗体。
キメラ化されている請求項１記載の抗体。
寄託番号２８０１０４−０４としてＩＤＡＣに寄託されたクローンによってコードされる、単離されたモノクローナル抗体。
ヒト腫瘍から選択される組織試料に含まれる癌細胞の抗体誘発細胞傷害性をイニシエートする方法であって、
前記ヒト腫瘍から組織試料を得ること、
寄託番号２８０１０４−０４としてＩＤＡＣに寄託されたクローンによってコードされる単離されたモノクローナル抗体または該単離されたモノクローナル抗体の細胞傷害性誘発抗原結合フラグメントを得ること、および
前記単離されたモノクローナル抗体または前記細胞傷害性誘発抗原結合フラグメントと前記組織試料とを接触させること、を含む方法。
前記ヒト腫瘍の組織試料が、大腸、卵巣、前立腺、膵臓、および乳房組織からなる群から選択される組織に由来する腫瘍から得たものである請求項５記載の方法。
請求項１記載の前記単離されたモノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
請求項２記載の前記ヒト化された抗体の抗原結合フラグメント。
請求項３記載の前記キメラ化された抗体の抗原結合フラグメント。
細胞傷害性成分、酵素、放射性化合物、および血行性細胞からなる群から選択される構成要素とコンジュゲートする請求項１、２、３、７、８、または９のいずれか一項記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
ほ乳類で抗体誘発細胞傷害性に対して感受性を持つヒト腫瘍であり、寄託番号２８０１０４−０４としてＩＤＡＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の細胞傷害性誘発特性を持つモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の細胞傷害性誘発性の抗原結合フラグメントに対して特異的に結合する抗原を発現する前記ヒト腫瘍を、処置する方法であって、
細胞傷害性を誘発するのに有効な量の前記モノクローナル抗体または前記モノクローナル抗体の前記抗原結合フラグメントを前記ほ乳類に対して投与することで前記ほ乳類の全身腫瘍組織量を減少させることを含む方法。
前記単クローン抗体が細胞傷害性成分とコンジュゲートしている請求項１１記載の方法。
前記細胞傷害性部分が放射性同位元素である請求項１２記載の方法。
前記モノクローナル抗体が補体を活性化させる請求項１１記載の方法。
前記モノクローナル抗体が抗体依存型細胞傷害性を媒介する請求項１１記載の方法。
前記モノクローナル抗体がヒト化されている請求項１１記載の方法。
前記モノクローナル抗体がキメラ化されている請求項１１記載の方法。